WO2001090409A1 - Methode pour le diagnostic de cancers - Google Patents

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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing and / or monitoring the development of various types of cancer, for example after chemotherapy treatment or after an operation.
  • the aim of this invention therefore consists in providing a method of diagnosis and / or monitoring the development of various types of cancer which is on the one hand more precise and more reliable, and on the other hand which is easier to carry out. and not involving invasive testing on patients.
  • the method for diagnosing and / or monitoring the development of cancers comprises the analysis of the ribonucleic component (RNA) of ribonucleoprotein telomerase in plasma or blood serum.
  • RNA ribonucleic component
  • Telomerase is an enzyme of ribonucleoprotein nature which synthesizes repeating telomeric sequences on the ends of chromosomes.
  • telomeres protect the ends of the chromosomes, and with each cell division the telomeres shorten. Telomerase uses one or two segments of its RNA component as a template to synthesize these telomeres. The activity of this enzyme has become an established indicator for the diagnosis and prognosis of most cancerous tumors.
  • Expression of human telomerase RNA (hTR) or RNA telomerase reverse transcriptase enzyme (hTERT) or associated protein (TEP 1) has been determined during the progression of several tumor species , which made it possible to establish a correlation between this expression (the quantity of RNA) and the activity of telomerase. Most cancers and immortalized cell lines have strong telomerase activity, reflecting a mechanism that escapes normal aging regulations.
  • RNA components of telomerase are cellular components, it has been found that, surprisingly, these components are also found in extracellular form in plasma or blood serum.
  • telomeres Unlike the various markers of deoxyribonucleic acid (DNA) already found in plasma or serum, such as mutations of the ras or p53 gene or the numerous microsatellites in the literature, the RNA components of telomerase seem to be able to be used for all kinds tumors. It is a general plasma or serous marker for cancer. Thus for most cancers, the rate of sera carrying RNA components of the telomerase is more important than that obtained by the other nucleic acid markers used until now.
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • the diagnostic method according to the invention consists in extracting the RNA from plasma or blood serum, in purifying and amplifying this RNA, then in establishing the presence and optionally the amount of polymerase reaction reaction reaction chain ( RT PCR) representing the components hTR, hTERT or of TEP 1 this in a comparative way between the plasma or the serum of a presumed sick person and that of a healthy person.
  • RT PCR polymerase reaction reaction reaction reaction chain
  • PCR amplification products of the RNA components transcribed into DNA by means of RT PCR are highlighted and if necessary quantified, for example using gel staining methods. This analysis can also be done differently on other gels or without gel by radioactive immunological technique (RIA), by ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay or by microchips test (gene array). Quantitative amplification on Taq Man (Perkin Elmer Biosystem) or on Light Cycler capillaries (Hofmann-La Roche) improves the precision of the detection of hTR, hTERT and TEP 1.
  • RIA radioactive immunological technique
  • ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
  • microchips test gene array
  • RNA in plasma or serum any technique of extraction, purification and amplification of RNA in plasma or serum can be used.
  • Blood samples (2-3 ml) were taken preoperatively from 18 patients with small breast cancer tumors (T1 or T2) still differentiated (G1 or G2) and in principle without cancer nodules or metastases. The samples were then centrifuged at 900 g for 15 minutes at room temperature and the serum collected. A second centrifugation at 900g for 15 min. was done to get rid of all debris. Serum samples were stored at -70 ° C.
  • SV Total RNA Isolation System from the company Promega Wl, USA
  • RNA reverse transcriptase PCR
  • a Qiagen kit (One Step RT-PCR) was used. 1 mg of serum RNA was introduced into a reaction mixture of 25 ⁇ l RT-PCR containing 400 ⁇ M of each dNTP, omniscript TM reverse transcriptase, sensiscript TM reverse transcriptase, hot-start Taq TM DNA polymerase and 0.15 ⁇ M of primer (primer) namely for hTR (meaning) GAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTTGC and (antisense) GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAGG. The mixture was incubated at 50 ° C for at least 30 min. for reverse transcription, then at 95 ° C for 15 min.
  • CGAGGGTTGTACTTAGCCA 0.3 ⁇ M primer concentrations.
  • control RNA GAPDH and the same conditions as for hTR were also used, with a concentration of primer of
  • AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC All the amino acid sequences mentioned above as examples of primers are known as such, and can for example be consulted on the website of the Genome Database (http://www.gdb.org /).
  • PCR gave an amplification product of 11 1 bp for hTR, 95 bp for hTERT, 150 bp for TEP 1 and 306 bp for GAPDH of the control RNA. This result was analyzed at 55 ° C on "Elchrom Scientific S-50" gels
  • RNA originating from patients suffering from cancer breast was positive in 25% of cases.
  • hTERT the other RNA component of the enzyme
  • TEP 1 the RNA component of the enzyme

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Abstract

L'invention concerne une méthode pour le diagnostic et/ou le suivi de l'évolution de cancers comprenant l'analyse des composants ARN de l'enzyme télomérase présents dans le plasma ou le sérum sanguin.

Description

METHODE POUR LE DIAGNOSTIC DE CANCERS
La présente invention concerne une méthode de diagnostic et/ou de suivi de l'évolution de divers types de cancers, par exemple après un traitement de chimiothérapie ou après une opération.
On sait que le diagnostic et le suivi de l'évolution des cancers sont effectués, à part l'observation et l'examen direct de tumeurs, par analyse de biopsies ou, dans le cas de cancers du sang, de la moelle osseuse, ce qui implique soit une intervention chirurgicale, soit un test invasif du type biopsie ou aspiration médullaire. Or, en plus du caractère désagréable, voire dangereux, pour les patients de telles méthodes, il a été constaté qu'elles pouvaient en outre être peu précises. En ce qui concerne le cancer du sein, de grands efforts sont faits pour développer le test de détection par mammographie. Bien que plusieurs études indiquent que la mammographie de masse peut être une stratégie utile pour réduire la mortalité due au cancer du sein, cette méthode comporte un certain nombre de désavantages. Parmi ceux-ci, il faut relever un fort taux de faux positifs, des faux négatifs fréquents et d'énormes dépenses pour l'Etat. Ainsi, lorsque les avantages et les désavantages sont comparés, il n'est pas surprenant que cette forme d'examen ait engendré des débats contradictoires animés depuis vingt ans.
Le but de cette invention consiste donc à fournir une méthode de diagnostic et/ou de suivi de l'évolution de divers types de cancers qui soit d'une part plus précise et plus fiable, et d'autre part qui soit plus facile à réaliser et n'impliquant pas de test invasif sur les patients. La méthode de diagnostic et/ou suivi de l'évolution de cancers, objet de l'invention et visant à atteindre le but précité, comprend l'analyse du composant ribonucléique (ARN) de la ribonucléoprotéine télomérase dans le plasma ou le sérum sanguin. La télomérase est une enzyme de nature ribonucléoprotéique qui synthétise des séquences répétées télomériques sur les terminaisons des chromosomes. Les télomères protègent les extrémités des chromosomes, et à chaque division cellulaire les télomères se raccourcissent. La télomérase utilise pour synthétiser ces télomères un ou deux segments de son composant ARN en tant que matrice. L'activité de cette enzyme est devenue un indicateur établi pour le diagnostic et le pronostic de la plupart des tumeurs cancéreuses. L'expression de l'ARN de télomérase humaine (hTR) ou de l'enzyme de transcriptase inverse de l'ARN télomérase (hTERT) ou de la protéine associée (TEP 1) a été déterminée lors de la progression de plusieurs espèces de tumeurs, ce qui a permis d'établir une corrélation entre cette expression (la quantité d'ARN) et l'activité de la télomérase. La plupart des cancers et des lignées cellulaires immortalisées ont une forte activité télomérasique, reflet d'un mécanisme échappant aux régulations normales de vieillissement. Or, et bien que les composants ARN de la télomérase soient des composants cellulaires, il a été constaté que, de manière surprenante, ces composants se retrouvaient également sous forme extra-cellulaire dans le plasma ou le sérum sanguin.
En effet, les présents inventeurs ont mis en évidence la présence de hTR, de hTERT et de TEP 1 dans le plasma ou le sérum sanguin de personnes souffrant notamment de cancers du sein, de l'ovaire, de l'estomac ou du colon, alors que ces produits sont absents dans le sang de personnes saines. Contrairement aux divers marqueurs d'acide désoxyribonucléique (ADN) déjà retrouvés dans le plasma ou le sérum, tels les mutations du gène ras ou p53 ou les nombreux microsatellites de la littérature, les composants ARN de la télomérase semblent pouvoir être employés pour toutes les sortes de tumeurs. Il s'agit d'un marqueur plasmatique ou séreux général pour le cancer. Ainsi pour la plupart des cancers, le taux de sérums porteurs de composants ARN de la télomérase est plus important que celui obtenu par les autres marqueurs d'acides nucléiques employés jusqu'à maintenant.
Plus particulièrement, la méthode de diagnostic selon l'invention consiste à extraire l'ARN du plasma ou du sérum sanguin, à purifier et à amplifier cet ARN, puis à établir la présence et optionnellement la quantité de produit de réaction polymérase en chaîne reverse (RT PCR) représentant les composants hTR, hTERT ou du TEP 1 ceci de manière comparative entre le plasma ou le sérum d'une personne présumée malade et celui d'une personne en bonne santé.
Les produits d'amplification PCR des composants ARN transcrits en ADN grâce à la RT PCR sont mis en évidence et le cas échéant quantifiés par exemple en utilisant des méthodes à coloration sur gel. Cette analyse peut également se faire différemment sur d'autres gels ou sans gel par technique immunologique radioactive (RIA), par ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay ou par test microchips (gène array). Une amplification quantitative sur Taq Man (Perkin Elmer Biosystem) ou sur capillaires Light Cycler (Hofmann-La Roche) améliore la précision de la détection du hTR, du hTERT et du TEP 1.
De même,' toute technique d'extraction, de purification et d'amplification de l'ARN dans le plasma ou le sérum peut être employée.
La présente invention sera maintenant illustrée de manière non limitative par l'Exemple qui suit, relatif au diagnostic des cancers du sein. Toutefois, il convient de constater que la portée de la présente invention n'est en aucune manière limitée au diagnostic de ce type de cancer. Des tests préliminaires ont en effet démontré également la présence de hTR, hTERT et TEP 1dans le sérum de patients atteints notamment de cancers ovariens ou gastro-intestinaux. On peut en conclure d'ores et déjà que les hTR, hTERT et TEP 1 du plasma ou du sérum sont à même de constituer des marqueurs généraux de nombreux types de cancers. Exemple
Diagnostic du cancer du sein par détection de hTR, de hTERT ou de TEP 1 dans le plasma ou le sérum sanguin.
Des échantillons de sang (2-3 ml) ont été prélevés préopérativement sur 18 patientes, porteuses de petites tumeurs cancéreuses du sein (T1 ou T2) encore différenciées (G1 ou G2) et en principe sans nodules cancéreux ni métastases. Les échantillons ont ensuite été centrifugés à 900 g pendant 15 minutes à température ambiante et le sérum recueilli. Une seconde centrifugation à 900g pendant 15 min. a été effectuée pour se débarrasser de tous débris. Les échantillons de sérum ont été conservés à -70°C.
L'extraction de l'ARN a été effectuée en utilisant une technique usuelle et un kit commercial ("SV Total RNA Isolation System" de la société Promega Wl, USA), selon les instructions du fournisseur. Par rapport à ces instructions une modification a été apportée, consistant plus particulièrement en l'adjonction de 175 μl de tampon "SVRNA Lysis" directement à 100μl de sérum ou de plasma frais (ou du moins n'ayant pas été dégelé plus d'une fois).
Détection de hTR, de hTERT, de TEP 1 et du rRNA (RNA de référence) au moyen de la PCR par transcriptase réverse (RT-PCR) :
Pour la détection de la présence et de la quantité de hTR et de rRNA, on a utilisé un kit Qiagen (One Step RT-PCR). 1 mg d'ARN de sérum a été introduit dans un mélange réactionnel de 25 μl RT-PCR contenant 400μM de chaque dNTP, omniscript ™ reverse transcriptase, sensiscript ™ reverse transcriptase, hot-start Taq™ DNA polymérase et 0,15μM d'amorce (primer) à savoir pour hTR (sens) GAAGGGCGTAGGCGCCGTGCTTTTGC et (antisens) GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAGG. Le mélange a été incubé à 50°C pendant au moins 30 min. pour la transcription reverse, puis à 95°C pendant 15 min. pour activer la "hot-start Taq ™ DNA Polymérase", et 50 cycles à 94°C pendant 30 sec, à 65°C pendant 1 min., à 72°C pendant 1 min., avec une extension finale à 72°C pendant 10 min.
Les mêmes conditions de RT-PCR ont été utilisées pour la détection de hTERT, avec toutefois une concentration d'amorce de 0,3 μM, les amorces étant les suivantes : (sens) TGACACCTCACCTCACCCAC et (antisens)
CACTGTCTTCCGCAAGTTCAC. Les mêmes conditions ont été utilisées pour la détection du TEP 1 , les amorces étant les suivantes : (sens) CACCTGCGACGATATTTCT et (antisens)
CGAGGGTTGTACTTAGCCA (concentrations amorce 0,3μM). En ce qui concerne le RNA de contrôle, le GAPDH et les mêmes conditions que pour hTR ont également été employées, avec une concentration d'amorce de
0,3 μM; les séquences de l'amorce GAPDH étant les suivantes : (sens)
CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT et (antisens)
AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC. Toutes les séquences d'acides aminés mentionnées ci-dessus à titre d'exemples d'amorces sont connues en tant que telles, et peuvent par exemple être consultées sur le site Internet de la Génome Database (http://www.gdb.org/). La PCR a donné un produit d'amplification de 1 1 1 bp pour le hTR, de 95 bp pour le hTERT de 150 bp pour le TEP 1 et de 306 bp pour GAPDH du RNA de contrôle. Ce résultat a été analysé à 55°C sur gels "Elchrom Scientific S-50"
(Elchrom Scientific, Cham, Suisse) , coloré au "SYBR-gold" (Molecular Probe,
Eugène, OR, USA) pendant 45 min., décoloré 2 fois pendant 30 min. dans de l'eau déionisée à température ambiante et dans l'obscurité.
Résultats :
En mettant en œuvre la technique décrite ci-dessus, il en résulte qu'il est effectivement possible de détecter un produit PCR issu de l'ARN de référence dans tous les échantillons analysés. Quantitativement, tous les échantillons sont semblables, qu'ils proviennent du sérum d'une personne saine ou de celui d'une personne malade.
En ce qui concerne le produit d'amplification obtenu avec les amorces spécifiques de l'hTR, seul l'ARN provenant de patientes souffrant d'un cancer du sein s'est révélé positif dans 25% des cas. Quant à l'autre composant ARN de l'enzyme, hTERT, il a été détecté dans 22% des sérums des patientes malades. En ce qui concerne le TEP 1 , il est détectable dans 20% des cas. La combinaison des trois marqueurs a donc permis de détecter un cancer du sein dans 55% des cas; ce taux est clairement supérieur à celui que l'on peut obtenir avec les techniques actuellement connues, lequel dépasse rarement environ 30%. Par contre, les deux composants ARN de la télomérase sont absents des sérums de contrôle (personnes saines).

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode pour le diagnostic et/ou le suivi de l'évolution de cancers comprenant l'analyse des composants ARN de l'enzyme télomérase présents dans le plasma ou le sérum sanguin.
2. Méthode selon la revendication 1 , caractérisée par le fait qu'on extrait de l'ARN du plasma ou du sérum, qu'on purifie et qu'on amplifie cet ARN, puis qu'on analyse les composants ARN de la télomérase.
3. Méthode selon la revendication 2, dans laquelle les composants ARN de la télomérase analysés sont la matrice ARN hTR , la partie catalytique de l'enzyme hTERT ou l'ARN TEP 1 codant pour la protéine associée.
4. Méthode selon la revendication 2 ou la revendication 3, caractérisée par le fait que l'ARN est amplifié par la technique de transcriptase reverse en chaîne (RT-PCR).
5. Méthode selon la revendication 4, caractérisée par le fait que les composants analysés sont hTR, hTERT, TEP 1 , et un RNA de référence correspondant à l'expression d'un gène codant.
6. Méthode selon la revendication 5, caractérisée par le fait que lesdits composants sont analysés par coloration sur gels, par technique immunologique radioactive (RIA), par test enzyme linked immounosorbent (ELISA) ou par test microchips (gène array), et éventuellement soumis à une quantification.
7. Méthode selon (a revendication 6, caractérisée par le fait que la quantification des composants est effectuée sur "Taq Man" ou sur capillaires "Light Cycler".
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