WO2011107611A2 - Méthode d'évaluation du potentiel irritant d'un composé test - Google Patents

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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating the irritating potential of a test compound and to a kit for carrying out said method.
  • the perfume, cosmetics and pharmacy industries must remain competitive and efficient and continue to offer new products on a regular basis, with the constraint of meeting the safety standards for humans and their environment attached to their use.
  • Irritation is a reversible inflammation of living tissue by chemical action at the site of contact. It is recognized by edema following an influx of fluids into the tissues, redness, heat and / or pain.
  • epidermal keratinocytes and fibroblasts of the dermis are stimulated and will release into the skin cytokines IL1, TNF alpha, IL6, IL8, as well as mediators such as prostaglandins (PGE2) which will initiate the inflammatory response.
  • the inventors have demonstrated that the epidermis is a sufficient model to demonstrate specific biomarkers of sensitization and / or irritation in humans and in mice, and that it is not necessary to add other cell types if the analysis of the identified genes is performed at a given time.
  • the EPISKIN model can thus be the reference tissue for evaluating the sensitizing nature of a test component.
  • Some genes are known to exhibit differential expression following treatment with irritants. However, this differential expression may vary depending on the irritants, and some markers may exhibit differential expression after contacting a non-irritating compound. Also, the markers of irritation identified to date have not allowed the development of a method for evaluating the irritating potential of a test compound having both good specificity and good sensitivity. The Applicant has identified new genes whose level of expression makes it possible to evaluate the irritating potential of a test compound. These new genes have the advantage of allowing an evaluation of the irritating potential of a compound with increased specificity while maintaining a good sensitivity with respect to the markers known from the prior art.
  • 4.1 BBL TNF superfamily member 9
  • COL7A1 collagen, type VII, alpha 1
  • CTSD cathepsin D
  • FDXR ferredoxin reductase
  • GAA glucosidase, alpha; acid
  • HAS1 hyaluronan synthase 1
  • RELT Member 19 of the TNF superfamily of the receptor
  • the method according to the present invention may further comprise a step c) of determining the irritating potential of a test compound.
  • biological sample refers to any solid or liquid sample from a subject.
  • test compound may be a compound of varied nature, structure and origin, including a biological compound, a chemical compound, synthetic compound, etc.
  • the present invention is particularly suitable for the identification of a large number of compounds. This simple and effective screening can be accomplished in one lapse very short time.
  • the described methods can be partially automated, thus enabling efficient and simultaneous screening of various and diverse compounds, either as a mixture or in separate form.
  • the level of expression of said gene is determined by measuring the level of expression of the polypeptide encoded by said gene or a fragment thereof, or by measuring the level of expression of the gene. mRNA of said gene or fragment thereof.
  • the level of expression of said at least one gene is performed by analyzing the expression of mRNA transcripts or mRNA precursors, such as native RNA, of said gene.
  • the "level of expression in the absence of said test compound” or "normal level” is the level of expression of said gene in a control sample potentially corresponding to the biological sample of a patient not exhibiting irritation or, preferably, at the average level of expression of said gene in different control samples.
  • a test compound is irritating
  • the determination of the level of expression of said at least one gene in the presence of the test compound will make it possible to evaluate the irritating force of the test compound.
  • step b) is carried out between 1 and 24 hours after step a), more preferably between 4 and 18 hours after step a), particularly preferably between 5 and 7 hours after step a) and preferably every 6 hours after step a).
  • the tissue degradation is then too great, even with a contact time limited to 15 minutes, the amount the collected RNA is then too weak to be analyzed by RT-PCR. Typically this amount is 2 (g / cm 2, the analysis is not performed if this rate is less than 15 ⁇ / ⁇ 2 skin.

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Abstract

L'invention se rapporte à une méthode d'évaluation du potentiel irritant d'un composé test et à une trousse pour la mise en œuvre de ladite méthode.

Description

Méthode d'évaluation du potentiel irritant d'un composé test.
La présente invention se rapporte à une méthode d'évaluation du potentiel irritant d'un composé test et à une trousse pour la mise en œuvre de ladite méthode. Les industries de la parfumerie, de la cosmétique et de la pharmacie se doivent de rester compétitives et performantes et continuer à proposer régulièrement des produits nouveaux, avec comme contrainte de répondre aux normes de sécurité pour l'homme et son environnement attachées à leur utilisation. L'irritation est une inflammation réversible des tissus vivants par action chimique au site de contact. Celle-ci se reconnaît par un œdème consécutif à un afflux de fluides dans les tissus, une rougeur, de la chaleur et/ou de la douleur. En réponse à une agression chimique, les kératinocytes de l'épidémie et les fïbroblastes du derme sont stimulés et vont libérer dans la peau des cytokines IL1, TNF alpha, IL6, IL8, ainsi que des médiateurs comme les prostaglandines (PGE2) qui vont initier la réponse inflammatoire.
Les effets délétères causés par un agent chimique comme l'irritation cutanée est d'une importance majeure en dermatologie et peut s'avérer être un frein à la mise sur le marché de produits nouveaux.
Les nouvelles contraintes européennes imposent désormais l'utilisation de méthodes n'utilisant pas d'animaux et il est donc indispensable de mettre au point des méthodes alternatives permettant de déterminer si une composition nouvelle ou un produit nouveau est susceptible de représenter un risque pour l'homme par ses propriétés irritantes.
D'un point de vue histologique les dermatites de contact sensibilisantes et irritantes sont très voisines. Pour autant, les conséquences cliniques ne sont pas similaires et il est important de posséder des méthodologies fiables permettant de les distinguer. Une approche prédictive originale est d'autant plus nécessaire qu'actuellement aucune corrélation claire n'a été mise en évidence entre une structure moléculaire donnée et son pouvoir irritant et/ou sensibilisant.
Les méthodes actuelles permettant de prédire le potentiel irritant d'un composé sont d'une part, basées sur l'utilisation d'animaux ce qui est dorénavant interdit, d'autre part ne sont pas quantitatives et ne permettent par conséquent pas d'évaluer la force irritante d'une molécule.
Les industriels des filières parfum et cosmétiques sont demandeurs de méthodologies permettant de distinguer les irritants faibles des irritants forts ce qui leur permettrait de mener avec beaucoup plus de précision des stratégies de mise sur le marché de leurs produits.
De manière surprenante, les Inventeurs ont mis en évidence que la réponse consécutive à l'action d'une substance irritante se fait directement sur la peau sans l'intervention de cellules immunocompétentes, et que le degré d'irritation d'une molécule peut être déterminé grâce à l'utilisation de biomarqueurs spécifiques de l'irritation.
Les Inventeurs ont mis en évidence que l'épiderme constitue un modèle suffisant pour mettre en évidence des biomarqueurs spécifiques de la sensibilisation et/ou de l'irritation chez l'homme et chez la souris, et qu'il n'est pas nécessaire d'ajouter d'autres types cellulaires si l'analyse des gènes identifiés est réalisée à un temps donné. Le modèle EPISKIN peut ainsi être le tissu de référence pour évaluer le caractère sensibilisant d'un composant test.
Il est connu que certains gènes présentent une expression différentielle suite à un traitement avec des irritants. Cependant, cette expression différentielle peut varier en fonction des irritants, et certains marqueurs peuvent présenter une expression différentielle après mise en contact d'un composé non irritant. Aussi, les marqueurs de l'irritation identifiés jusqu'à ce jour n'ont pas permis la mise au point d'une méthode d'évaluation du potentiel irritant d'un composé test présentant à la fois une bonne spécificité et une bonne sensibilité. La Demanderesse a identifié de nouveaux gènes dont le niveau d'expression permet d'évaluer le potentiel irritant d'un composé test. Ces nouveaux gènes présentent l'avantage de permettre une évaluation du potentiel irritant d'un composé avec une spécificité accrue tout en conservant une bonne sensibilité par rapport aux marqueurs connus de l'art antérieur.
Ainsi, la présente invention se rapporte à une méthode d'évaluation du potentiel irritant d'un composé test, comprenant les étapes de:
a) mise en contact d'un composé test avec un échantillon biologique;
b) détermination du niveau d'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 4.1 BBL (Membre 9 de la superfamille du TNF), COL7A1 (collagène, type VII, alpha 1), CTSD (cathepsine D), FDXR (ferredoxine réductase), GAA (glucosidase, alpha; acide), HAS1 (hyaluronane synthase 1) et RELT (Membre 19 de la superfamille du TNF récepteur).
De préférence, la méthode selon la présente invention est une méthode in vitro.
De préférence, la méthode selon la présente invention peut comprendre en outre une étape c) de détermination du potentiel irritant d'un composé test.
Préférentiellement, ladite étape c) peut consister en une étape de sélection dudit composé comme présentant un potentiel irritant si le niveau d'expression dudit gène est supérieur à une valeur seuil. Avantageusement, ladite étape c) permet d'évaluer la force irritante dudit composé test.
Tel qu'utilisé ici, le terme « échantillon biologique » se réfère à tout échantillon solide ou liquide issu d'un sujet.
De préférence, ledit échantillon biologique est un échantillon de peau. De façon particulièrement préférée, l'échantillon de peau est un échantillon de peau reconstruite in vitro, comme par exemple le modèle EpiSkin (EPISKIN, Lyon France), EpiDerm™ (MATEK Corporation, Ashland, MA) ou SkinEthic™ RHE (SKINETHIC, Nice, France). De préférence, ledit échantillon de peau reconstruite in vitro comprend en outre une couche de kératine.
De manière encore préférée, l'échantillon de peau ne comprend que l'épidémie et ne comprend pas l'addition d'autres types cellulaires supplémentaires, et encore préférentiellement pas de cellules de Langerhans supplémentaires.
Le composé test peut être un composé de nature, structure et origine variées, notamment un composé biologique, un composé chimique, synthétique, etc.
Le composé test peut être tout produit qui se présente sous une forme isolée ou en mélange avec d'autres produits. Le composé test peut être défini en termes de structure et/ou de composition ou être défini sur le plan fonctionnel. Le composé test peut, par exemple, être un produit isolé et structurellement défini, un produit isolé de structure indéfinie, un mélange de produits connus et caractérisés ou une composition comprenant un ou plusieurs produits. Un ou plusieurs composés peuvent ainsi être testés, en mélange ou de manière séparée.
De telles compositions peuvent être, par exemple, des échantillons d'un produit cosmétique ou dermatologique.
De préférence, ledit composé test est apte à être utilisé sur la peau et peut être utilisé dans une composition cosmétique ou dermatologique. On entend par « potentiel irritant », le risque pour le composé test de provoquer une inflammation réversible des tissus vivants par action chimique au site de contact.
De préférence, ledit au moins un gène est choisi dans le groupe constitué par : 4- 1BBL, COL7A1, HAS1 et RELT.
La présente invention est particulièrement adaptée à l'identification d'un nombre important de composés. Ce criblage simple et efficace peut être accompli en un laps de temps très court. Les méthodes décrites peuvent en particulier être partiellement automatisées, autorisant ainsi le criblage efficace et simultané de composés divers et nombreux, soit sous forme de mélange soit sous forme séparée. De préférence, dans la méthode selon la présente invention, le niveau d'expression dudit gène est déterminé par mesure du niveau d'expression du polypeptide codé par ledit gène ou un fragment de celui-ci, ou par mesure du niveau d'expression de l'ARNm dudit gène ou d'un fragment de celui-ci. Dans un mode de réalisation préféré, le niveau d'expression dudit au moins un gène est effectuée par analyse de l'expression de transcrits d'ARNm ou de précurseurs d'ARNm, tel qu'un ARN natif, dudit gène. Ladite analyse peut être réalisée en préparant l'ARNm/ADNc de cellules d'un échantillon biologique d'un patient, et hybridation de l'ARNm /ADNc avec un polynucléotide de référence. L'ARNm/ADNc préparé peut être utilisé dans une analyse par hybridation ou amplification qui inclut, sans s'y limiter, les analyses Southern et Northen, les analyses par PCR (« polymerase chain reaction »), telle que la PCR quantitative (Taqman) et l'utilisation de sondes (« probes arrays ») telles que les matrices ADN GeneChip® (AFFYMETRIX) .
Avantageusement, l'analyse du niveau d'expression d'ARNm transcrit dudit au moins un gène implique un procédé d'amplification des acides nucléiques, comme par exemple la RT-PCR (mode de réalisation expérimental décrit dans le Brevet US 4,683,202), la réaction en chaîne par la ligase (BARANY, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.88, p: 189-193, 1991), la réplication de séquences auto-entretenue (« self sustained séquence réplication ») (GUATELLI et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.87, p: 1874-1878, 1990), le système d'amplification transcriptionnelle. (KWOH et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.86, p: 1173-1177, 1989), la « Q-Beta Replicase » (LIZARDI et al., Biol. Technology, vol.6, p: 1197, 1988), la « rolling circle réplication » (U. S. Patent No. 5,854,033) ou toute autre méthode d'amplification d'acides nucléiques, suivie d'une étape de détection des molécules amplifiées par des techniques bien connues de l'homme du métier. Ces modes de détection sont particulièrement utiles pour la détection de molécules d'acides nucléiques en très faibles quantités.
Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, la méthode selon la présente invention comprend une étape supplémentaire d'amplification de l'ARNm ou de l'ADNc dudit gène, de la séquence complémentaire de celle-ci ou d'un fragment de celle-ci.
Telles qu'utilisées ici, les amorces d'amplifications sont définies comme étant une paire de molécules d'acides nucléiques qui peuvent s'apparier respectivement aux régions 3' et 5' d'un gène de façon spécifique (brins positif et négatif, ou inversement) et encadrent une courte région dudit gène. De manière générale, les amorces d'amplification ont une longueur de 10 à 30 nucléotides et permettent l'amplification d'une région d'une longueur comprise entre 50 et 200 nucléotides. Avantageusement, les amorces utilisées dans le cadre de la présente invention sont celles listées dans le tableau 1.
Dans un autre mode de réalisation préféré, la détermination du niveau d'expression dudit au moins un gène est réalisée par mesure du niveau d'expression du polypeptide codé par ledit gène, ou un fragment de celui-ci. Ladite analyse peut être réalisée en utilisant un anticorps (par exemple, un anticorps radiomarqué, marqué avec un chromophore, un fluorophore, ou une enzyme), un dérivé d'anticorps (par exemple un anticorps conjugué à un substrat ou à une protéine ou un ligand d'une protéine d'un couple ligand/protéine (par exemple biotine-streptavidine)) ou un fragment d'anticorps (par exemple un anticorps à une seule chaîne, un domaine hypervariable d'un anticorps isolé, etc.) qui se lie spécifiquement au polypeptide codé par ledit gène. Lesdites analyses peuvent être réalisées par de nombreuses techniques à la portée de l'homme du métier incluant, sans s'y limiter, les tests immunologiques basés sur l'utilisation d'activité enzymatique (« enzyme immunoassay » EIA), les tests immunologiques basés sur l'utilisation d'isotopes radioactifs (RIA), l'analyse par Western blot et les tests ELISA (« enzyme linked immunoabsorbant assay »).
Au sens de la présente invention, on entend par « polypeptide » une séquence comprenant au moins deux acides aminés, et les termes « polypeptide », « peptide » et « protéine » peuvent être indifféremment utilisés.
Par « fragment de l'ARNm ou de l'ADNc », on entend une séquence d'au moins 50 acides nucléiques, à titre d'exemple d'au moins 100 ou 150 acides nucléiques, de préférence d'au moins 200 acides nucléiques, à titre d'exemple d'au moins 250 ou 350 acides nucléiques, et de manière particulièrement préférée un polypeptide d'au moins 400 acides nucléiques. Par « fragment du polypeptide », on entend une séquence d'au moins 50 acides aminés, à titre d'exemple d'au moins 100 ou 150 acides aminés, de préférence d'au moins 200 acides aminés, à titre d'exemple d'au moins 250 ou 350 acides aminés, et de manière particulièrement préférée un polypeptide d'au moins 400 acides aminés. De préférence, la méthode selon la présente invention comprend en outre une étape de comparaison du niveau d'expression dudit gène, avec une valeur de référence. Cette valeur de référence peut servir de contrôle positif et/ou négatif. De préférence, l'étape de comparaison du niveau d'expression dudit gène, avec une valeur de référence est réalisée après l'étape b).
Un contrôle positif peut par exemple être effectué en comparant le niveau d'expression dudit au moins un gène en présence du composé test avec le niveau d'expression dudit au moins un gène en présence d'un composé connu comme irritant.
Un contrôle négatif peut être réalisé en l'absence du composé test ou en présence d'un composé connu comme non sensibilisant et non irritant comme par exemple l'huile d'olive, le glycérol, le Cétyl trimethylammonium bromide (CTAB) ou le dipropylène glycol. Dans le cadre de la présente invention, on conclura qu'un composé test présente un potentiel irritant si une surexpression dudit gène est observée par rapport à son niveau d'expression en l'absence dudit composé test. On entend par « surexpression », un niveau d'expression significativement plus élevé dudit gène par rapport à son niveau d'expression normal. De préférence, on entend par surexpression un niveau d'expression dans un échantillon biologique qui est supérieur à au moins 20% du niveau normal d'expression dudit gène, de préférence supérieur à au moins 50% du niveau normal d'expression dudit gène, et de manière particulièrement préférée supérieur d'au moins 90% au niveau normal d'expression dudit gène.
Le « niveau d'expression en l'absence dudit composé test » ou « niveau normal » est le niveau d'expression dudit gène dans un échantillon contrôle correspondant potentiellement à l'échantillon biologique d'un patient ne présentant pas d'irritation ou, de préférence, à la moyenne du niveau d'expression dudit gène dans différents échantillons contrôle. De plus, si l'on conclut qu'un composé test est irritant, la détermination du niveau d'expression dudit au moins un gène en présence du composé test permettra d'évaluer la force irritante du composé test.
On entend par « force irritante » le degré d'inflammation des tissus au site de contact. Ainsi, plus la force irritante est importante, plus le degré d'inflammation des tissus au site de contact est important.
Il est ainsi possible de réaliser une analyse quantitative du potentiel irritant d'un composé. A titre d'exemple de composé connu comme irritant, on peut citer le LaurylSulfate de Sodium (SLS), l'acide octanoïque, le cholobenzene, l'acide lactique, le bromo- butane, le méthyl salicylate et le butanol.
De préférence, l'étape b) de la méthode selon la présente invention comprend la détermination du niveau d'expression d'au moins 2, d'au moins 3, d'au moins 4, d'au moins 5, d'au moins 6, d'au moins 7, et encore préférentiellement d'au moins 8 gènes choisis dans le groupe constitué par : 4.1 BBL (Membre 9 de la superfamille du TNF), COL7A1 (collagène, type VII, alpha 1), CTSD (cathepsine D), FDXR (ferredoxine réductase), GAA (glucosidase, alpha; acide), HAS1 (hyaluronane synthase 1), RELT (Membre 19 de la superfamille du TNF récepteur), IL-1A (interleukine l , alpha), IL-7R (Récepteur de l'interleukine 7), IL-8 (Interleukine 8), JUN (oncogene jun), PLAUR (plasminogène activateur, urokinase récepteur) et TNF-A (Facteur de nécrose tumorale), de préférence dans le groupe constitué par : 4.1 BBL (Membre 9 de la superfamille du TNF), COL7A1 (collagène, type VII, alpha 1), CTSD (cathepsine D), FDXR (ferredoxine réductase), GAA (glucosidase, alpha; acide), HAS1 (hyaluronane synthase 1) et RELT (Membre 19 de la superfamille du TNF récepteur).
Ainsi, on pourra conclure qu'un composé test présente un potentiel irritant si une surexpression d'au moins 2, d'au moins 3, d'au moins 4, d'au moins 5, d'au moins 6, d'au moins 7, et encore préférentiellement d'au moins 8 gènes choisis dans le groupe constitué par : 4.1 BBL (Membre 9 de la superfamille du TNF), COL7A1 (collagène, type VII, alpha 1), CTSD (cathepsine D), FDXR (ferredoxine réductase), GAA (glucosidase, alpha; acide), HAS1 (hyaluronane synthase 1), RELT (Membre 19 de la superfamille du TNF récepteur), IL-lA(interleukine 1, alpha), IL-7R (Récepteur de l'interleukine 7), IL-8 (Interleukine 8), JUN (oncogene jun), PLAUR (plasminogène activateur, urokinase récepteur) et TNF-A (Facteur de nécrose tumorale) est observée par rapport à leur niveau d'expression en l'absence dudit composé test.
De préférence, l'étape b) est réalisée entre 1 et 24 heures après l'étape a), de manière encore préférée entre 4 et 18 heures après l'étape a), de manière particulièrement préférée entre 5 et 7 heures après l'étape a) et de manière préférée entre toute 6 heures après l'étape a).
Selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à l'utilisation d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 4.1 BBL (Membre 9 de la superfamille du TNF), COL7A1 (collagène, type VII, alpha 1), CTSD (cathepsine D), FDXR (ferredoxine réductase), GAA (glucosidase, alpha; acide), HAS1 (hyaluronane synthase 1) et RELT (Membre 19 de la superfamille du TNF récepteur) pour l'évaluation in vitro du potentiel irritant et/ou la force irritante d'un composé test.
La présente invention se rapporte également à une trousse pour la mise en œuvre de la méthode selon la présente invention, comprenant des moyens de détermination du niveau d'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 4.1 BBL (Membre 9 de la superfamille du TNF), COL7A1 (collagène, type VII, alpha 1), CTSD (cathepsine D), FDXR (ferredoxine réductase), GAA (glucosidase, alpha; acide), FIAS1 (hyaluronane synthase 1) et RELT (Membre 19 de la superfamille du TNF récepteur).
De préférence, ladite trousse comprendra au moins une paire d'amorces permettant l'amplification d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par 4.1 BBL (Membre 9 de la superfamille du TNF), COL7A1 (collagène, type VII, alpha 1), CTSD (cathepsine D), FDXR (ferredoxine réductase), GAA (glucosidase, alpha; acide), HAS1 (hyaluronane synthase 1) et RELT (Membre 19 de la superfamille du TNF récepteur). De manière particulièrement préférée, ladite au moins une paire d'amorce est choisie dans le tableau 1.
Exemples
1) Mise en évidence de bio marqueurs selon le protocole Skinethic
Les peaux, 1,07 cm2, ont été achetées chez EPISKIN. Les différentes substances ont été appliquées soit sous forme liquide (30μ1 à différentes concentrations) soit sous forme solide (30μ1 PBS ou huile d'olive + 3C^g ou moins pour évaluer différentes concentrations de poudre) sur les peaux. Après une incubation de 15mn à température ambiante les peaux ont été lavées avec du PBS (25 ml) et incubées 3h, 6h ou 18h à 37°C dans une étuve à CO2. Après incubation les peaux ont été prélevées avec un punch et séparées du support en collagène. Elles ont ensuite été directement placées dans une solution de « Tri Reagent » (Ambion) (1 ml) et immédiatement dissociées mécaniquement. Préparation de l 'ADNc
Les tissus ont été placés dans une solution de «Tri Reagent» (Ambion) et broyés mécaniquement. L'ARN a été préparé suivant le protocole décrit par le fabriquant avec une précipitation à Pisopropanol. Pour la préparation de l'ADNc, les ARN totaux sont traités avec une DNAse pour retirer les ADN génomiques contaminants. On utilise pour le traitement 1 à 5 μg d'ARN total avec de la DNAse RNAse free, de la RNAsin (Ιμΐ) et des random primers (3 μg). On ajoute ensuite de la superscipt III RT (1,5 μΐ à 200υ/μ1). Les cDNA sont ensuite testés par RT-PCR.
PCR quantitative
La PCR quantitative en temps réel a été réalisée en utilisant la technologie SYBR Green des appareils LC480 de chez Roche. Les amorces ont été conçues pour couvrir les jonctions intron-exon pour prévenir d'éventuelles traces d'amplification de l'ADN génomique. L'amplification donne des amplicons entre 100 et 150 pb. Toutes les paires d'amorces ont été qualifiées par digestion avec des enzymes de restriction et analysées par électrophorèse. La PCR a été réalisée dans 10 μΐ en utilisant le mix PCR Sybr green 2X mix PCR de Roche dans des plaques PCR de chez Roche. L'expression des gènes cibles a été mesurée après normalisation de l'ARN grâce à quatre gènes de ménage, et les valeurs sont exprimées en utilisant la méthode des CT, et exprimés en taux d'expression supplémentaire par rapport à un zéro théorique (user bulletin no. 2, Applied Biosystems, December 1997).
Résultats
Pour cette analyse, une application de 15mn suivi d'un lavage et d'une post incubation de 6h avant collecte des biopsies et d'une analyse de la transcription des gènes ont été réalisés. Les résultats sont présentés dans le tableau 1.
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000014_0001
Tableau 1
2) Analyse quantitative
Les substances du tableau 2 ont été utilisées comme contrôles irritants (SLS, acide octanoique, Cholobenzene, acide lactique, bromo-butane, methyl salicylate, butanol) et non irritants (glycérol, Cetyl trimethylammonium bromide et
Dipropylène Glycol).
( 'lusse Nom ( AS Abréviation
Non -
Irritant Cetyl trimethylammonium bromide 57-09-0 CTAB
Non -
Irritant Dipropylène Glycol 25265-71-8 LG
Non -
Irritant Glycérol 56-81-5 Glyc
Irritant Acide Octanoïque / Acide caprilique 124-07-2 OA
Irritant Acide Lactique 598-82-3 LA
Irritant nButanol- 1 Butanol 71-36-3 But
Irritant LaurylSulfate de Sodium 151-21-3 SLS
Irritant Chlorobenzène 108-90-7 CBZ
Irritant BromoButane 109-65-9 BrBut
Irritant Méthylsalicylate 119-36-8 M
Tableau 2
Le tableau 3 montre le taux d'expression des biomarqueurs de l'irritation pour ces différentes substances. On voit clairement que les irritants induisent de façon forte la plupart des bio marqueurs. On remarque également que dans le cas des bio marqueurs déjà connus (TNF-A, IL- 1, IL7-R, PLAUR, IL-8, JUN), au moins une des substances non irritantes (CTAB, DPG ou Glycérol) induit l'expression de ces gènes ce qui peut conduire à définir des substances faussement positives si on utilise uniquement ces marqueurs.
De plus, pour certains biomarqueurs déjà connus, certaines substances irritantes n'induisent pas une augmentation significative du niveau d'expression. De manière préférée, si au moins 6 gènes testés sont surexprimés par rapport au contrôle non traité et/ou que la moyenne de l'augmentation de l'expression de ces gènes dépasse d'un facteur 2 celle de la moyenne de l'expression de ces gènes lors du contrôle non traité, alors la substance est considérée comme irritante de manière certaine. taux d'expression des gènes spécifiques de l'irritation dans le modèle
Figure imgf000017_0001
Tableau 3
Par ailleurs, pour des substances trop corrosives, comme le SLS à des doses supérieures à 10% ou l'acide lactique supérieur à 1%, la dégradation tissulaire est alors trop importante, même avec un temps de contact limité à 15 mn, la quantité d'ARN recueillie étant alors trop faible pour pouvoir l'analyser par RT-PCR. Typiquement cette quantité est de 2(^g/cm2, l'analyse n'est pas réalisée si ce taux est inférieur à 15μ /αη2 de peau.
Par ailleurs, des analyses de réponses dose-dépendantes avec du SLS ont permis de montrer que l'on pouvait utiliser les biomarqueurs cités dans la présente invention comme bio marqueurs de l'irritation, et en particulier IL-8, 4-lBBL ou col7Al pour quantifier la force de l'irritation, comme le montre la Figure 1.
En effet, la figure 1 montre une linéarité dans le taux d'expression de ces 3 gènes par rapport à la quantité, démontrant ainsi une réaction dose-dépendante.
Il est donc possible, d'utiliser le SLS à différentes doses pour établir une courbe standard pour chaque expérience. Ceci présente un intérêt dans la mesure où l'épaisseur, notamment de la couche cornée, introduit des variations entre les expériences, notamment en ralentissant la vitesse de pénétration, ce qui a une influence sur le taux d'expression observé à 6 h. Cependant, quelque soit les conditions utilisées, une linéarité dans l'expression en fonction de la dose est observée et il est possible de retrouver les mêmes valeurs de force d'irritation, comme le montre le tableau 4 suivant.
La valeur du SLS 5% a été fixée arbitrairement à 1.
Le methyl salicylate à 10% n'est pas irritant dans le test.
Figure imgf000019_0001
Tableau 4 : analyse quantitative d'irritant

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode d'évaluation du potentiel irritant d'un composé test, comprenant les étapes de:
a) mise en contact d'un composé test avec un échantillon biologique;
b) détermination du niveau d'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 4.1 BBL (Membre 9 de la superfamille du TNF), COL7A1 (collagène, type VII, alpha 1), CTSD (cathepsine D), FDXR (ferredoxine réductase), GAA (glucosidase, alpha; acide), HAS1 (hyaluronane synthase 1) et RELT (Membre 19 de la superfamille du TNF récepteur).
2. Méthode d'évaluation selon la revendication 1, comprenant en outre une étape de comparaison du niveau d'expression dudit au moins un gène avec une valeur de référence.
3. Méthode d'évaluation selon l'une des revendications 1 ou 2, dans laquelle le niveau d'expression dudit au moins un gène est déterminé par mesure du niveau d'expression du polypeptide codé par ledit gène ou un fragment de celui-ci, ou par mesure du niveau d'expression de l'ARNm dudit au moins un gène ou d'un fragment de celui-ci.
4. Méthode d'évaluation selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant une étape supplémentaire d'amplification de l'ARNm ou de l'ADNc dudit au moins un gène, de la séquence complémentaire de celle-ci ou d'un fragment de celle-ci.
5. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'échantillon biologique est un échantillon de peau, de préférence un échantillon de peau reconstruite in vitro.
6. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'étape b) comprend la détermination du niveau d'expression d'au moins 2, d'au moins 3, d'au moins 4, d'au moins 5, d'au moins 6, d'au moins 7, et encore préférentiellement d'au moins 8 gènes choisis dans le groupe constitué par : 4.1 BBL (Membre 9 de la superfamille du TNF), COL7A1 (collagène, type VII, alpha 1), CTSD (cathepsine D), FDXR (ferredoxine réductase), GAA (glucosidase, alpha; acide), HAS1 (hyaluronane synthase 1), RELT (Membre 19 de la superfamille du TNF récepteur), IL-lA(interleukine 1, alpha), IL-7R (Récepteur de l'interleukine 7), IL-8 (Interleukine 8), JUN (oncogene jun), PLAUR (plasminogène activateur, urokinase récepteur) et TNF-A (Facteur de nécrose tumorale).
7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'étape b) est réalisée entre 2 et 24 heures après l'étape a), de manière encore préférée entre 4 et 18 heures après l'étape a), de manière particulièrement préférée entre 5 et 7 heures après l'étape a) et de manière préférée entre toute 6 heures après l'étape a).
8. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant une étape c) d'évaluation de la force irritante dudit composé test.
9. Utilisation d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 4.1 BBL (Membre 9 de la superfamille du TNF), COL7A1 (collagène, type VII, alpha 1), CTSD (cathepsine D), FDXR (ferredoxine réductase), GAA (glucosidase, alpha; acide), HAS1 (hyaluronane synthase 1) et RELT (Membre 19 de la superfamille du TNF récepteur), pour l'évaluation in vitro du potentiel irritant et/ou la force irritante d'un composé test.
10. Trousse pour la mise en œuvre de la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, comprenant des moyens de détermination du niveau d'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 4.1 BBL (Membre 9 de la superfamille du TNF), COL7A1 (collagène, type VII, alpha 1), CTSD (cathepsine D), FDXR (ferredoxine réductase), GAA (glucosidase, alpha; acide), HAS1 (hyaluronane synthase 1) et RELT (Membre 19 de la superfamille du TNF récepteur).
11. Trousse selon la revendication 10, comprenant au moins une paire d'amorces permettant l'amplification d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 4.1 BBL (Membre 9 de la superfamille du TNF), COL7A1 (collagène, type VII, alpha 1), CTSD (cathepsine D), FDXR (ferredoxine réductase), GAA (glucosidase, alpha; acide), HAS1 (hyaluronane synthase 1) et RELT (Membre 19 de la superfamille du TNF récepteur).
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