WO2002000932A2

WO2002000932A2 - Diagnose von bedeutenden genetischen parametern innerhalb des mhc

Info

Publication number: WO2002000932A2
Application number: PCT/IB2001/001501
Authority: WO
Inventors: Alexander Olek; Christian Piepenbrock; Kurt Berlin
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 2000-06-30
Filing date: 2001-06-29
Publication date: 2002-01-03
Anticipated expiration: 2002-12-30
Also published as: US20030186277A1; DE10032529A1; EP1358351A2; AU2001277653A1; JP2004511217A; WO2002000932A3

Abstract

Die vorliegende Erfindung beschreibt Nukleinsäuren zur Diagnose von einem Satz genetischer Parameter innerhalb des Major Histocompatibility Complexes (MHC), umfassend einen mindestens 20 Basenpaare langen revers komplementären oder identischen Abschnitt einer chemisch vorbehandelten genomischen DNA sowie einen Satz Oligomersonden (Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere), die zur Detektion des Cytosin-Metylierungszustandes in Nukleinsäuren dienen. Diese Sonden sind für die Diagnose von genetischen Parametern innerhalb des MHC besonders geeignet.

Description

Diagnose von bedeutenden genetischen Parametern innerhalb des MHC

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, Oligo- nukleotide, PNA-Oligomere und ein Verfahren zur Diagnose von bedeutenden genetischen Parametern innerhalb des Major Histocompatibility Complex (MHC) .

Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebenen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschal- tet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene bzw. des Genoms korrelierbar . Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem veränderten Methylierungsmuster einzel- ner Gene oder des Genoms.

Der Major Histocompatibility Complex (MHC) beschreibt eine Gruppe von Genen mit immunologischen und nichtimmunologischen Funktionen und wird bei allen Vertebraten gefunden ("Both man & bird & beast": comparative organi- zation of MHC genes. 1995, Trowsdale J, Immunogenetics; 41: 1-17; Evolving views of the ajor histocompatibility complex. 1997, Gruen JR and Weissman SM, Blood; 90: 4252- 4265) . Beim Menschen erstreckt er sich über einen Bereich von 3,6 Millionen Basenpaaren auf dem kurzen Arm von

Chromosom 6 (6p21.3) und ist wesentlich an der Immunantwort beteiligt. Er ist komplett sequenziert, hoch poly- morph und weist die höchste Gendichte im ganzen menschlichen Genom auf. So werden von den insgesamt auf Chromosom 6 geschätzten 3500 Genen 224 identifizierte Genloci dem MHC zugerechnet, was bedeutet, dass 3 mal so viele Gene ω O M IV) M M cn o Cn o cn O cn

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Es gibt Untersuchungen, die belegen, dass die Expression von MHC Genen an die Methylierung von CpG Dinukleotiden gekoppelt ist, was die Transkription negativ beeinflussen kann. Entweder direkt, indem sich die Transkriptionsfak- toren nicht an die DNA anlagern können oder indirekt, durch Repressormoleküle, die an methylierte CpGs binden (How does DNA methylation repress transcription?, 1997; Kass SU et al., Trends Genet; 11:444-449).

Verschiedene Ergebnisse belegen den Zusammenhang zwischen immunologischen Erkrankungen und Methylierung. Die Bezie- hung zwischen der Expression von HLA-DR Antigenen und der Methylierung des Gens HLA-DR alpha wurde bei systemischem Lupus erythematodes, einer generalisierten Autoimmunerkrankung, untersucht (Low expression of human histocompa- tibility leukocyte antigen-DR is associated with hyper- methylation of human histocompatibility leukocyte antigen-DR alpha gene regions in B cells from patients with systemic lupus erythematosus . 1985; Sano H et al., J Clin Invest, 76(4) .1314-1322) . Die Beteiligung der DNA Methy- lierung an der aberranten MHC class II Genexpression wurde bei Patienten mit MHC class II Defizienz Syndrome untersucht (The MHC class II deficiency syndrome: heteroge- neity at the level of the response to 5-azadeoxycytidine. 1990; Lambert M et al., Res Immunol. 141 (2) : 129-140) . Ein Beweis für die Regulierung von MHC Genen wurde anhand eines epigenetischen Mechanismus erbracht (Methylation of class II trans-activator promoter IV: a novel mechanism of MHC class II gene control. 2000, Morris AC et. al . , J Immunol; 16 (8) : 143-4149) . Die Expression von MHC-Genen wird inhibiert, wenn Transkriptionsfaktoren nicht an den class 2 trans activator (CIITA) Promotor binden. Die Inhibierung basiert hier auf der Methylierung der CpG Di- nukleotide in dem pIV Promotor, dagegen führt die Inhibierung der Methylierung zu einer Re-Expression der CIITA Gene. Außerdem konnte die Expression in einem transienten Transfektionsversuch nicht durch methylierte pIV DNA stimuliert werden. Diese Ergebnisse belegen eine epigenetische Regulierung von CIITA und lassen weiterhin den Schluß zu, dass diese epigenetische Kontrolle prinzipiell für Gene der MHC Klasse II gilt.

5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkripti- on, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5- Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR-

Amplifikation die epigenetische Information, welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.

Eine relativ neue und die mittlererweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-

Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5- Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewandelt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden kann, jetzt durch „normale" molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur an einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek, A. et al . , Nucl . Acids. Res . 1996, 24,

5064-5066) . Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine glo- bale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen Methylierungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.

Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten, 5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Ü- bersichtsartikel entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.

Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zechnigk, M. et al., Eur. J. Hum. Gen. 1997, 5, 94-98) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifziert und entweder komplett se- quenziert (Olek, A. und Walter, J. , Nat. Genet. 1997, 17, 275-276) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine „Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo, M. L. und Jones, P. A., Nucl. Acids Res. 1997, 25, 2529-2531, WO-Patent 9500669) oder einen Enzymschnitt (Xiong, Z. und Laird, P. W., Nucl. Acids. Res. 1997, 25, 2532-2534) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99 28498).

Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bi- sulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei einzelnen

Genen befassen, sind: Xiong, Z. und Laird, P. W. (1997),

Nucl. Acids Res. 25, 2532; Gonzalgo, M. L. und Jones, P.

A. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2529; Grigg, S. und

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45560.

Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations-

Massenspektrometrie (MALDI-TOF) ist eine sehr leistungs- CO CO IV) IV) M M

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durch einfache Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut, I. G. und Beck, S. (1995), A procedu- re for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 23: 1367-1373). Die Kopplung eines „Charge tags" an diese modifizierte DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit um den gleichen Betrag, wie er für Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von „Charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate stark erschweren.

Genomische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zeil-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen. Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laborato- ry Manual, 1989.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Oligonukleoti- de und/oder PNA-Oligomere zur Detektion von Cytosin- Methylierungungen und ein Verfahren bereitzustellen, welches sich zur Diagnose von genetischen und epigenetischen Parametern innerhalb des MHC besonders eignet.

Die Aufgabe wird gelöst durch Nukleinsäuren zur Diagnose von einem Satz genetischer Parameter innerhalb des Major Histocompatibility Complexes (MHC) , umfassend einen mindestens 20 Basenpaare langen revers komplementären oder identischen Abschnitt der chemisch vorbehandelten genomischen DNA gemäß SEQ ID-NO:l oder SEQ ID-N0:2.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Oligonukleotide zur Detektion des Cytosin-Methylierungs- zustandes in vorbehandelter genomischer DNA, umfassend jeweils mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von mindestens 13 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der Basensequenzen gemäß SEQ ID-NO:l oder SEQ ID-NO:2 ist, der mindestens ein CpG Di- nukleotid enthält.

Dabei ist bevorzugt, dass das Cytosin des CpG Dinukleo- tids das 5. - 9. Nukleotid vom 5 ' -Ende des 13 mers ist.

Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass für jedes der CpG Dinukleotide aus einer der SEQ ID-NO:l oder SEQ ID-NO.-2 ein Oligonukleotid vorhanden ist.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind PNA (Pep- tide Nucleic Acid) Oligomere zur Detektion des Cytosin- Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomischer DNA, umfassend mindestens eine PNA Basensequenz mit einer Länge von mindestens 9 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der Basensequenzen gemäß SEQ ID-NO:l oder SEQ ID-NO:2 ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist hierbei, dass das Cytosin des CpG Dinukleotids das 4. - 6. Nukleotid vom 5 ' -Ende des 9 mers ist.

Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass für jedes der CpG Dinukleotide aus einer Basensequenz gemäß SEQ ID- NO:l oder SEQ ID-NO:2 ein Oligonukleotid vorhanden ist.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Satz von Oligomersonden zur Detektion des Cytosin- Methylierungszustandes und/oder von Single Nucleotide Po- lymorphismen in chemisch vorbehandelter genomischer DNA, umfassend mindestens 10 der erfindungsgemäßen Oligonukleotid oder PNA Sequenzen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine Anordnung von unterschiedlichen erfindungsgemäßen Oligo- O O to IV) M M n o cn o cn O Cn

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d) man detektiert und visualisiert die hybridisierten Amplifikate.

Bevorzugt ist erfindungsgemäß dabei, dass mehr als zehn unterschiedliche Fragmente_ amplifiziert werden, die 100 - 2000 Basenpaare lang sind. Weiterhin ist bevorzugt, dass man die chemische Behandlung mittels einer Lösung eines Bisulfits, Hydrogensulfits oder Disulfits durchführt. Besonders bevorzugt ist auch, dass die Polymerase eine hit- zebeständige DNA-Polymerase ist.

Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt wird. Bevorzugt ist auch, dass die an den Amplifikaten angebrachten Markierungen an jeder Position der Festphase, an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet, identifizierbar sind. Weiterhin ist besonders erfindungsgemäß bevorzugt, dass man eine erfindungsgemäße Anordnung verwendet und dass die Festphasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht.

Weiterhin ist bevorzugt, dass die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten in einem Reaktionsgefäß durchge- führt wird. Bevorzugt ist erfindungsgemäß auch, dass die Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen sind. Weiterhin ist bevorzugt, dass die Markierungen der Amplifikate Radionuklide sind. Bevorzugt ist auch, dass die Markierungen der Amplifikate ablösbare Molekülfrag- mente mit typischer Masse sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden. Besonders bevorzugt ist es erfindungsgemäß , dass die Amplifikate oder Fragmente der Amplifikate im Massenspektrometer nachgewiesen werden. Hierzu ist es erfindungsgemäß vorteilhaft, dass zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen.

Erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugt ist es, dass man die Detektion mittels Matrix assistierter Laser Desorpti- ons/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (.ESI) durchführt und vi- sualisiert.

Bevorzugt ist das Verfahren, wobei die genomische DNA aus einer DNA-Probe erhalten wurde, wobei Quellen für DNA z. B. Zelllinien, Biopsien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologi- sche Objektträger und alle möglichen Kombinationen hiervon umfasst.

Bevorzugt ist auch ein Verfahren, zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse .für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mit Methylie- rungsmustern innerhalb des MHC in Zusammenhang stehen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Ver- wendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei man bedeutende genetische Parameter innerhalb des MHC diagnostiziert.

Schließlich ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Kit, bestehend aus einem. Bisulfit enthaltenden Reagenz, Sätze von erfindungsgemäßen Primern zur Herstellung der erfindungsgemäßen Amplifikate, Oligo- nukleotide und/oder PNA-Oligomere sowie eine Anleitung zur Durchführung und Auswertung eines erfindungsgemäßen Verfahrens. CO CO to IV) M

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rens sind alle in den Sequenzen vorhandenen CpG Dinukleotide zu untersuchen.

In einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Ver- fahrens sind die Oligonukleotide oder PNA-Oligomere an definierten Stellen an eine Festphase gebunden.

Bevorzugt sind unterschiedliche Amplifikate auf der ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagona- len Gitters angeordnet.

Die Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere werden vorzugsweise zur Diagnose von rheumatischer Arthritis, Diabetes, hereditärer Hämochromatose, Schizophre- nie, Multipler Sklerose, Systemischem Lupus Erythematodes, Sarkoidose, Zirrhose, Myositis, Psoriasis, Nephritis, Krebs, insbesondere Hals- oder Kopfkrebs, IgA Neph- ropathie, Bluthochdruck, Behcets Krankheit, Gee-Heubner- Herter-Thaysen-Krankheit, Myasthenia gravis, Spondy- larthropathia, Tuberkulose, hypertropher Kardiomyopathie, Basedow-Krankheit, juveniler chronischer Arthritis, Epilepsie, idiopathischer generalisierter Epilepsie oder von juveniler myoklonischer Epilepsie, der Takayasu- Krankheit, multiplen immunopathologischen Krankheiten, für die Suszeptibilität von Lepra, für die Suszeptibili- tät von Malaria und/oder für die Suszeptibilität von Leishmania durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC verwendet.

Auch die im Anhang aufgelisteten Nukleinsäuren gemäß SEQ ID-NO:l oder SEQ ID-NO:2 werden vorzugsweise verwendet für die Diagnose von genetischen und epigenetischen Parametern innerhalb des Major Histocompatibility Complexes (MHC) verwendet. Ferner wird ein Verfahren zur Diagnose von bedeutenden genetischen Parametern innerhalb des MHC durch Analyse von Cytosin-Methylierungen und Single Nucleotide Poly- morphismen in genomischen DNA-Proben beschrieben. Dazu geht man in folgenden Schritten vor:

Im ersten Verfahrensschritt wird eine genomische DNA Probe derart chemisch behandelt, dass an der 5' -Position un- methylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymin oder eine an- dere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base verwandelt werden.

Die zu analysierende genomische DNA wird bevorzugt aus den üblichen Quellen für DNA erhalten, wie z. B. Zellli- nien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks- Flüssigkeit, in Paraffin einbettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische Objektträger und alle möglichen Kombinationen hiervon.

Bevorzugt wird dazu die oben beschriebene Behandlung genomischer DNA mit Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) und anschließender alkalischer Hydrolyse verwendet, die zu einer Umwandlung nicht methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil führt.

Im zweiten Verfahrensschritt werden aus der chemisch vorbehandelten genomischen DNA Fragmente unter Verwendung von Primeroligonukleotiden amplifiziert .

Bevorzugt werden mehr als 10 unterschiedliche Fragmente amplifiziert, die 100 - 2000 Basenpaare lang sind.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens führt man die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durch, wobei vorzugsweise eine thermostabile DNA- Polymerase verwendet wird.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten in einem Reaktionsgefäß durchführt wird.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens umfasst der Satz von Primeroligonukleotiden mindestens zwei Oligo- nukleotide, deren Sequenzen jeweils revers komplementär oder identisch zu einem mindestens 18 Basenpaare langen Abschnitt der Basensequenzen gemäß SEQ ID-NO:l oder SEQ ID-N0:2 sind. Die Primeroligonukleotide sind vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass sie kein CpG Dinukleotid enthalten.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass bei der Amplifikation mindestens ein Primer an eine Festphase gebunden ist.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist ferner, dass unterschiedliche Oligonukleotid und/oder PNA-Oligomersequenzen auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind.

Die Festphasenoberfläche besteht bevorzugt aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold.

Im dritten Verfahrensschritt hybridisiert man die Amplifikate an einen Satz von mind. 10 Oligonukleotid oder PNA-Oligomer Sonden.

Die genannten Oligonukleotide umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 13 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das Cytosin des CpG Dinukle- otids ist das 5. bis 9. Nukleotid vom 5 ' -Ende des 13 mers aus betrachtet. Für jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligo- nukleotid vorhanden.

Die genannten PNA-Oligomere umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 9 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der Basen- Sequenzen gemäß SEQ ID-NO:l oder SEQ ID-NO:2 ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 4. bis 6. Nukleotid vom 5 ' -Ende des 9 mers aus gesehen. Für jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden.

Im vierten Verfahrensschritt entfernt man die nicht hybridisierten Amplifikate.

Im letzten Verfahrensschritt detektiert man die hybridi- sierten Amplifikate.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass an den Amplifikaten angebrachte Markierungen an jeder Position der Festphase, an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet, identifizierbar sind.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass die Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen sind.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass die Markierungen der Amplifikate Radionuklide sind.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass die Markierungen der Amplifikate ablösbare Molekülfragmente mit typischer Masse sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden. Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass die Amplifikate, Fragmente der Amplifikate oder zu den Amplifikaten komplementäre Sonden im Massenspektrometer nachgewiesen er- den.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass zur besseren De- tektierbarkeit im Massenspektrometer die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass man die Detektion mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführt und visualisiert .

Wiederum bevorzugt ist ein Verfahren zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mit bedeutenden genetischen Parametern innerhalb des MHC in Zusammenhang stehen.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Verwendung eines Verfahrens zur Diagnose bedeutender genetischer Parameter innerhalb des MHC.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zudem ein Kit, bestehend aus einem Bisulfit enthaltenden Reagenz, einen Satz von Primeroligonukleotiden umfassend mindestens zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils mindestens einen 18 Basenpaaren langen Abschnitt der Basensequenzen gemäß SEQ ID-NO:l oder SEQ ID-NO:2 entsprechen oder zu ihnen komplementär sind zur Herstellung der Amplifikate, Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere sowie eine Anleitung zur Durchführung und Auswertung des beschriebenen Verfahrens. Das folgende Beispiel bezieht sich auf ein Fragment des Gens HLA-A, in dem eine bestimmte CG-Position auf Methylierung untersucht wird.

Im ersten Schritt wird eine genomische Sequenz unter Verwendung von Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) und anschließender alkalischer Hydrolyse umgewandelt. Diese umgewandelte DNA dient dazu, methylierte Cytosine nachzu- weisen. Im vorliegenden Fall werden die Cytosine des Gens HLA-A der Länge 3201 untersucht. Dazu wird mit den spezifischen Primern TTTGGTTTTGATTTAGATTTGG und AAATAAACTCTCTAACTACTC ein definiertes Fragment der Länge 874 amplifiziert. Dieses Amplifikat dient als Probe, die an ein vorher an einer Festphase gebundenem Oligonukleotid hybridisiert, beispielsweise TAGGTCGTTTATA, wobei sich das nachzuweisende Cytosin an Position 487 des Amplifikats befindet. Der Nachweis des Hybridisie- rungsprodukts beruht auf Cy3 und Cy5 fluoreszensmarkier- ten Primern, die für die Amplifikation verwendet wurden. Nur wenn in der Bisulfit behandelten DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt es zu einer Hybridisierungsreaktion der amplifizierten DNA mit dem Oligonukleotid. Somit entscheidet der Methylierungs- Status des jeweiligen zu untersuchenden Cytosins über das Hybridisierungsprodukt .

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:

Beispiel 1: Durchführung der Methylierungsanalyse des in dem MHC lokalisierten Gens DAXX

Das folgende Beispiel (Fig 1) bezieht sich auf ein Fragment des Gens DAXX, in dem eine bestimmte CG-Position auf Methylierung untersucht wird. Im ersten Schritt wird eine genomische Sequenz unter Verwendung von Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) derart behandelt, dass alle nicht an der 5-Position der Base me- thylierten Cytosine so verändert werden, dass eine hin- sichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedliche Base entsteht, während die in 5-Position methylierten Cytosine unverändert bleiben. Wird für die Reaktion Bisulfit verwendet, so findet an den nicht methylierten Cytosinba- sen eine Addition statt. Zudem müssen ein denaturierendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen sein. Eine anschließende alkalische Hydrolyse führt dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin- Nukleobasen in Uracil. Diese umgewandelte DNA dient dazu, methylierte Cytosine nachzuweisen. Im zweiten Verfahrens- schritt verdünnt man die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wässrigen Lösung. Bevorzugt wird anschliessend eine Desulfonierung der DNA durchgeführt. Im dritten Schritt des Verfahrens amplifiziert man die DNA-Probe in einer Polymerasekettenreaktion, bevorzugt mit einer hit- zebeständigen DNA-Polymerase. Im vorliegenden Fall werden Cytosine des Gens DAXX untersucht. Dazu wird mit den spezifischen Primeroligonukleotiden TTAGGTTTTGGTTTGTTGATGAG und CCCTAACTCCTCTAAACCTCA ein definiertes Fragment der Länge 880 bp amplifiziert. Dieses Amplifikat dient als Probe, die an ein vorher an einer Festphase gebundenes Oligonukleotid unter Ausbildung einer Duplexstruktur hybridisiert, beispielsweise TAAAGAGGCGGATTAGTT, wobei sich das nachzuweisende Cytosin an Position 142 des Amplifikats befindet. Der Nachweis des Hybridisie- rungsprodukts beruht auf Cy3 und Cy5 fluoreszenzmarkierten Primeroligonukleotiden, die für die Amplifikation verwendet wurden. Nur wenn in der Bisulfit behandelten DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt es zu einer Hybridisierungsreaktion der ampli- fizierten DNA mit dem Oligonukleotid. Somit entscheidet der Methylierungsstatus des jeweiligen zu untersuchenden Cytosins über das Hybridisierungsprodukt. Im vorliegenden Fall wird für das Oligomer ein nicht methylierter Status nachgewiesen.

Beispiel 2 : Durchführung der Methylierungsanalyse des in dem MHC lokalisierten Gens RXRB

Das folgende Beispiel (Fig 2) bezieht sich auf ein Fragment des Gens RXRB, in dem eine bestimmte CG-Position auf Methylierung untersucht wird.

Im ersten Schritt wird eine genomische Sequenz unter Verwendung von Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) derart behandelt, dass alle nicht an der 5-Position der Base me- thylierten Cytosine so verändert werden, dass eine hinsichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedliche Base entsteht, während die in 5-Position methylierten Cytosine unverändert bleiben. Wird für die Reaktion Bisulfit verwendet, so findet an den nicht methylierten Cytosinba- sen eine Addition statt. Zudem müssen ein denaturierendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen sein. Eine anschließende alkalische Hydrolyse führt dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin- Nukleobasen in Uracil. Diese umgewandelte DNA dient dazu, methylierte Cytosine nachzuweisen. Im zweiten Verfahrensschritt verdünnt man die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wässrigen Lösung. Bevorzugt wird anschliessend eine Desulfonierung der DNA durchgeführt. Im dritten Schritt des Verfahrens amplifiziert man die DNA-Probe in einer Polymerasekettenreaktion, bevorzugt mit einer hitzebeständigen DNA-Polymerase. Im vorliegenden Fall werden Cytosine des Gens RXRB untersucht. Dazu wird mit den spezifischen Primeroligonukleotiden ATATTGGTAAAGGTATTAGGG und ACTTAACTCAACTCTATACCTAC ein definiertes Fragment der Länge 385 bp amplifiziert. Dieses Amplifikat dient als Probe, die an ein vorher an einer Festphase gebundenes O CO IV) LO M

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methylierte Cytosine nachzuweisen. Im zweiten Verfahrensschritt verdünnt man die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wässrigen Lösung. Bevorzugt wird anschliessend eine Desulfonierung der DNA durchgeführt. Im dritten Schritt des Verfahrens amplifiziert man die DNA-Probe in einer Polymerasekettenreaktion, bevorzugt mit einer hitzebeständigen DNA-Polymerase. Im vorliegenden Fall werden Cytosine des Gens BAT5 untersucht. Dazu wird mit den spezifischen Primeroligonukleotiden AGAAGAGAATGTGGGTAGGA und AAAACCTACTTATCAAACCAAT ein definiertes Fragment der Länge 539 bp amplifiziert. Dieses Amplifikat dient als Probe, die an vorher an einer Festphase gebundene Oligonukleotide unter Ausbildung einer Duplexstruktur hybridisiert, beispielsweise i) TGAGAAAGCGGTAAAGAG oder ii) ATTTAAGGCGAGGGTAAA, wobei sich das nachzuweisende Cytosin für das Oligomer TGAGAAAGCGGTAAAGAG an Position 211 oder für das Oligomer ATTTAAGGCGAGGGTAAA an Position 431 des Amplifikats befindet. Der Nachweis des Hybridisie- rungsprodukts beruht auf Cy3 und Cy5 fluoreszenzmarkier- ten Primeroligonukleotiden, die für die Amplifikation verwendet wurden. Nur wenn in der Bisulfit behandelten DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt es zu einer Hybridisierungsreaktion der ampli- fizierten DNA mit dem Oligonukleotid. Somit entscheidet der Methylierungsstatus des jeweiligen zu untersuchenden Cytosins über das Hybridisierungsprodukt. Im vorliegenden Fall werden für beide Oligomere in Abbildung A jeweils ein teilweise ethylierter Status und in Abbildung B jeweils ein nicht methylierter Status nachgewiesen.

Claims

Patentansprüche

Nukleinsäuren zur Diagnose von einem Satz genetischer Parameter innerhalb des Major Histocompatibility Complexes (MHC) , umfassend einen mindestens 20 Basenpaare langen revers komplementären oder identischen Abschnitt der chemisch vorbehandelten genomischen DNA gemäß SEQ ID-NO.l oder SEQ ID-N0.2.

2. Oligonukleotide zur Detektion des Cytosin- Methylierungszustandes in vorbehandelter genomischer DNA, umfassend jeweils mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von mindestens 13 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der Basensequenzen gemäß SEQ ID-NO:l oder SEQ ID-NO:2 ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält.

3. Oligonukleotid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeich- net, dass das Cytosin des CpG Dinukleotids das 5. -

9. Nukleotid vom 5 ' -Ende des 13 mers ist .

4. Satz von Oligonukleotiden nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass für jedes der CpG Dinukleotide aus einer der SEQ ID-NO:l oder SEQ ID-NO:2 ein Oligonukleotid vorhanden ist.

5. PNA (Peptide Nucleic Acid) Oligomere zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbe- handelter genomischer DNA, umfassend mindestens eine PNA Basensequenz mit einer Länge von mindestens 9 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der Basensequenzen gemäß SEQ ID- NO.l oder SEQ ID-NO:2 ist, der mindestens ein CpG Di- nukleotid enthält.

6. PNA Oligomer nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Cytosin des CpG Dinukleotids das 4. - 6. Nukleotid vom 5 ' -Ende des 9 mers ist .

7. Satz von PNA Oligomeren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass für jedes der CpG Dinukleotide aus einer Basensequenz gemäß SEQ ID-NO:l oder SEQ ID-NO:2 ein Oligonukleotid vorhanden ist.

8. Satz von Oligomersonden zur Detektion des Cytosin-

Methylierungszustandes und/oder von Single Nucleotide Polymorphismen in chemisch vorbehandelter genomischer DNA, umfassend mindestens 10 der Oligonukleotid oder PNA Sequenzen der Ansprüche 2 bis 7.

Anordnung von unterschiedlichen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass diese an definierte Stellen einer Festphase gebunden sind.

10. Anordnung von unterschiedlichen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass diese auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagona- len Gitters angeordnet sind.

11. Satz von Primeroligonukleotiden umfassend mindestens zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils mindestens einem 18 Basenpaare langen Abschnitt der Basen- Sequenzen gemäß SEQ ID-NO:l oder SEQ ID-NO:2 entsprechen oder revers komplementär zu i nen sind.

12. Satz von Primeroligonukleotiden nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass diese kein CpG Dinukleotid enthalten.

13. Satz von Primeroligonukleotiden nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Primer an eine Festphase gebunden ist.

1 . Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Autoimmunerkrankungen durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

15. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von rheumatischer Arthritis durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

16. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Diabetes durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

17. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder

PNA-Oligomere nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Diabetes um Typ I Diabetes oder um Insulin abhängige Diabetes mellitus (IDDM) handelt.

18. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von hereditärer Hämochromatose durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

19. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der hereditären Hämochromatose um genetische Hämochromatose (GH) oder die milde Form der Hämochromatose handelt.

20. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Schizophrenie durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

21. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Multipler Sklerose durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

22. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Systemischem Lupus Erythematodes durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

23. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Sarkoidose durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

24. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von primärer Gallenzirrhose durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

25. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Myositis durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

26. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Psoriasis durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

27. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Nephritis durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

28. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Krebs durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

29. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Krebsarten um Hals- oder Kopfkrebs handelt.

30. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von IgA Nephropathie durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

31. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Bluthochdruck durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

32. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Behcets Krankheit durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

33. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von der Gee-Heubner-Herter-Thaysen-Krankheit (Zöliakie) durch Analyse von Methylierungsmustern in- nerhalb des MHC.

34. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Myasthenia gravis durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

35. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Spondylarthropathia durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

36. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Tuberkulose durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

37. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von hypertropher Kardiomyopathie durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

38. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von der Basedow-Krankheit durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

39. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von juveniler rheumatischer Arthritis durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

40. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von Epilepsie durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

41. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Epilepsie um idiopathische generalisierte Epilepsie oder um juvenile myokloni- sehe Epilepsie handelt.

42. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von der Takayasu-Krankheit durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

43. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose von multiplen immunopathologischen Krankhei- ten durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

44. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose für die Suszeptibilität für Lepra durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

45. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose für die Suszeptibilität für Malaria durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

46. Verwendung der Nukleinsäuren, Oligonukleotide oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Diagnose für die Suszeptibilität für Leishmania durch Analyse von Methylierungsmustern innerhalb des MHC.

47. Verwendung der Nukleinsäuren gemäß Anspruch 1 für die Diagnose von bedeutenden genetischen Parametern in- nerhalb des MHC.

48. Verfahren zur Diagnose von bedeutenden genetischen Parametern innerhalb des MHC durch Analyse von Cytosin-Methylierungen in Sätzen von Oligonukleotiden o- der PNA-Oligomeren nach einem der voranstehenden An- Sprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte ausführt:

a) in einer genomischen DNA Probe wandelt man durch chemische Behandlung an der 5-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymidin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base um;

b) aus dieser chemisch vorbehandelten genomischen DNA amplifiziert man Fragmente unter Verwendung von Sätzen von Primeroligonukleotiden gemäss Anspruch 11 o- der 12 und einer Polymerase;

c) man hybridisiert die Amplifikate an einen Satz von Oligonukleotid oder PNA Sonden der Ansprüche 2 bis 8;

d) man detektiert und visualisiert die hybridisierten Amplifikate.

49. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert werden, die 100 - 2000 Basenpaare lang sind.

50. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass man die chemische Behandlung mittels einer Lösung eines Bisulfits, Hydrogensulfits oder Disulfits durchführt .

51. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerase eine hitzebeständige DNA- Polymerase ist.

52. Verfahren nach einem der Ansprüche 48 bis 51, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt wird.

53. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 48 bis 52, dadurch gekennzeichnet, dass die an den Amplifikaten angebrachten Markierungen an jeder Position der Festphase, an der sich eine Oligonukleotid- sequenz befindet, identifizierbar sind.

54. Verfahren nach Ansprüche 53, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Anornung gemäß Anspruch 9 oder 10 verwendet und dass die Festphasenoberfläche aus Silizi- um, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht.

55. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 48 bis 54, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikati- on von mehreren DNA-Abschnitten in einem Reaktionsgefäß durchgeführt wird.

56. Verfahren nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmar- kierungen sind.

57. Verfahren nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen der Amplifikate Radionuklide sind.

58. Verfahren nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen der Amplifikate ablösbare Molekülfragmente mit typischer Masse sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden. 3^'6 '

59. Verfahren nach einem der Ansprüche 48, 49 oder 53, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikate oder Fragmente der Amplifikate im Massenspektrometer nachgewiesen werden.

60. Verfahren nach Anspruch 58 oder 59, dadurch gekennzeichnet, dass zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen.

61. Verfahren nach einem der Ansprüche 58 bis 60 , dadurch gekennzeichnet, dass man die Detektion mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführt und visuali- siert .

62. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche 48 bis 61, wobei die genomische DNA aus einer DNA-Probe erhalten wurde, wobei Quellen für DNA z. B. Zelllinien, Biopsien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn- Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histo- logische Objektträger und alle möglichen Kombinationen hiervon umfasst .

63. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche 48 bi 62 zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Er- eignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mit Methylierungsmustern innerhalb des MHC in Zusammenhang stehen.

64. Verwendung eines Ver ahrens nach einem der Ansprüche 48 bis 63, dadurch gekennzeichnet, dass man bedeuten- de genetische Parameter innerhalb des MHC diagnostiziert.

65. Kit, bestehend aus einem Bisulfit enthaltenden Reagenz, Sätze von Primern gemäß Anspruch 11 oder 12 zur Herstellung der Amplifikate, Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere gemäß einem der Ansprüche 2 bis 8 sowie eine Anleitung zur Durchführung und Auswertung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 48 bis 63.