WO2002002803A2 - Methode de formulation de sondes moleculaires - Google Patents
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Abstract
La présente invention permet le choix et la formulation de sondes moléculaires non contagieuses utilisées pour une détection d'acides nucléiques. Elle révèle une méthode de diagnostic génétique exempte de contamination permettant l'analyse directe quantitative, qualitative et le génotypage d'agents infectieux pathogènes ou non sans extraction préalable d'ARN ou d'ADN. Les sondes fabriquées sont très spécifiques, hautement sensibles et permettent la détection directe d'acides nucléiques dans des coupes de tissus d'organismes procaryotes et eucaryotes vivants ou immobilisés, congelés ou fixés et/ou enrobés et en particulier de particules rétrovirales circulantes dans les fluides biologiques ou présentes dans les cellules.
Claims
1. Un procédé pour la formulation de sondes moléculaires qui tient compte des formes de présentation des organismes acellulaires et cellulaires durant leur cycle de vie, où les formes de présentation sont dépendantes des différents états chimiques, biologiques et physiques des organismes.
2. Un procédé pour la formulation de sondes moléculaires qui tient compte des structures criimiques définies par des régions riches en guanine et cytosine dont la concentration est comprise entre 20% et 70% sur une longueur de séquence comprise entre 10 et 1000 bases et qui sont peu sensibles à la dégradation par des enzymes ou des rayons ionisants et/ou qui sont des régions protectrices d'autres séquences et structures composées d'acides nucléiques lesquelles ont une énergie libre de liaison palindromique comprise entre -300 kCal/mole et -5 kCal/mole.
3. Un procédé pour la formulation de sondes moléculaires constituées d'acides ribonucléiques ou désoxyribonucléiques ou de dérivés d'acides nucléiques synthétiques destinée à l'hybridation d'acides nucléiques d'organismes procaryotes, eucaryotes et viraux complets ou fragmentés, selon lequel les sondes reconnaissent un ou des sites endodogmatiques définissant les modes de présentation biologique; les sites endodogmatiques sont des séquences d'acides nucléiques constitués d'au moins une séquence consensus spécifique à un type, à un génotype, à une espèce ou une famille et conservés au cours des générations d'individus et nécessaires à la détermination de séquences adjacentes d'une longueur comprise entre 3 à 100 bases.
4. Un procédé pour la formulation de sondes moléculaires constituées d'acides ribonucléiques ou désoxyribonucléiques ou de dérivés d'acides nucléiques synthétiques destinée à l'hybridation d'acides nucléiques d'organismes procaryotes, eucaryotes et viraux complets ou fragmentés, selon lequel les sondes reconnaissent des sites exodogmatiques définissant les modes de présentation biologique sont des séquences d'acides nucléiques conservés ou non au cours des générations d'individus et nécessaires ou non à leur reproduction ou à leurs fonctionalités; ces sites exodogmatiques sont eux- mêmes constitués d'au moins une séquence consensus spécifique à un type, à un génotype, à une espèce ou une famille.
5. Un procédé pour la formulation de sondes moléculaires constituées d'acides ribonucléiques ou désoxyribonucléiques ou de dérivés d'acides nucléiques synthétiques destinée à l'hybridation d'acides nucléiques d'organismes procaryotes, eucaryotes et viraux complets ou fragmentés, selon lequel les propriétés physiques sont définies par des structures tridimentionnelles qui intègrent les propriétés chimiques et biologiques de séquences d'acides nucléiques spécifiques.
6. L'utilisation des propriétés chimiques, des caractéristiques biologiques et des propriétés physiques des acides nucléiques telles que décrites dans la réalisation de l'invention pour la formulation, la fabrication et la production, par des procédés naturels ou artificiels, d'anticorps ou de fragments d'anticorps dirigés contre des acides nucléiques, contre des sites endodogmatiques et/ou leurs séquences adjacentes constituées de 3 à 500 bases, contre une suite d'acides aminés naturels ou
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7. L'utilisation des propriétés chimiques, des caractéristiques biologiques et des propriétés physique des acides nucléiques telles que décrites dans la réalisation de l'invention pour la formulation, la fabrication et la production, par des procédés naturels ou artificiels, d'anticorps ou de fragments d'anticorps dirigés contre des sites exodogmatiques et/ou leurs séquences adjacentes constituées de 3 à 500 bases, contre une suite d'acides aminés naturels ou synthétiques traduits à partir des séquences d'acides nucléiques incluant tout ou partie d'au moins un site exodogmatique.
8. Un procédé selon lequel des sondes moléculaires sont formulées de telle sorte qu'elles se trouvent en partie dans une boucle de l'épingle à cheveux de la séquence cible et dont la suite d'acides nucléiques de la tige contient 80% ou moins de bases G et C et dont la structure spatiale tri-dimensionnelle fait que de part et d'autre de la séquence des sondes moléculaires un ARN ou un ADN simple brin existe et dont la spatialité sert à la reconnaissance de séquences d'acides nucléiques d'une longueur de 10 à 10000 bases et comprenant au moins un site endodogmatique et constitué d'au moins une séquence consensus spécifique à un type, à un génotype, à une espèce ou une famille.
9. Un procédé selon lequel des sondes moléculaires sont formulées de telle sorte qu'elles se trouvent en partie dans une boucle de l'épingle à cheveux de la séquence cible et dont la suite d'acides nucléiques de la tige contient 80% ou moins de bases G et C et dont la structure spatiale tri-dimensionnelle fait que de part et d'autre de la séquence des sondes moléculaires un ARN ou un ADN simple brin existe et dont la spatialité sert à la reconnaissance de séquences d'acides nucléiques d'une longueur de 10 à 10000 bases et comprenant au moins un site exodogmatique et constitué d'au moins une séquence consensus spécifique à un type, à un génotype, à une espèce ou une famille.
10. Un procédé selon lequel des sondes moléculaires sont marquées par des molécules fluorescentes ou par une biotine ou par des particules denses aux électrons ou par des haptènes ou par des enzymes ou marquées par au moins une substance radioactive.
11. Un procédé selon les revendications là 10, pour la formulation de sondes moléculaires destinées à la détection d'ARN ou d'ADN d'origine virale, y compris les oncogènes, ou bactérienne reconnus ou non par le système immunitaire humain, animal ou végétal.
12. Un procédé selon les revendications 1 à 10, selon lequel des sondes moléculaires sont formulées pour l'hybridation in situ ou la détection d'acides nucléiques.
13. Un procédé selon les revendications 1 à 5 selon lequel des amorces sont formulées pour l'utilisation dans une réaction de polymérase en chaîne (PCR®).
14. Un procédé selon les revendications 1 à 10, selon lequel en découle une automatisation du procédé de détection d'acides nucléiques viraux ou bactériens ou autres microrganismes, avec ou sans extraction préalable d'acides nucléiques et à partir de fluides biologiques tels que plasma, sérum, composants du sang, sperme, urine ainsi que des échantillons comprenant des cellules, des composants cellulaires et des tissus humains, animaux ou végétaux.
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15. Un procédé selon les revendications 1 à 9, selon lequel des sondes moléculaires sont formulées pour la reconnaissance des site endodogmatiques ou de séquences adjacentes entourant au moins un site endodogmatique par réaction de polymérase en chaîne, par détection avec des anticorps ou des ribozymes, par hybridation d'acides nucléiques avec ou sans digestion préalable avec une protéase spécifique ou non spécifique de tissus vivants ou morts, de cellules, de fluides biologiques tels que plasma, sérum, composants du sang, sperme, urine.
16. Un procédé selon les revendications 1 à 9, selon lequel des sondes moléculaires ou des anticorps ou fragments d'anticorps sont formulés pour le blocage de la reproduction d'agents pathogènes ou d'organismes vivants et/ou leur utilisation dans un but thérapeutique.
17. Un procédé selon les revendications 1 à 9, selon lequel des ribozymes sont formulés pour la digestion ou à la fragmentation d'acides nucléiques naturels ou synthétiques.
18. Un procédé selon les revendications 8 et 9, selon lequel des sondes moléculaires sont formulées pour l'hybridation et/ou la détection d'acides nucléiques dans le but de déterminer la présence et ou le génotype au moyen de microplaques ou des supports solides miniaturisés utilisés en nanotechnologie sur lesquels sont fixés des acides nucléiques synthétiques ou naturels.
Un programme informatique pour le choix et la formulation de sondes moléculaires spécifiques et/ou pour la détection d'acides nucléiques et/ou pour une utilisation selon les revendications 1 à 18, intégrant la fonctionnalité d'une conformation spatiale des acides nucléiques (propriétés physiques) dont la spatialité sert à la reconnaissance d'une énergie spécifique ou des sites endodogmatiques et ou des séquences entourant au moins un site endodogmatique (propriétés biologiques) la thermodynamique des liaisons entre nucléotides et les paramètres d'une structure secondaire (propriétés chimiques).
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