WO2002021138A2 - Die m30-genfamilie und ihre verwendung - Google Patents

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WO2002021138A2
WO2002021138A2 PCT/EP2001/010366 EP0110366W WO0221138A2 WO 2002021138 A2 WO2002021138 A2 WO 2002021138A2 EP 0110366 W EP0110366 W EP 0110366W WO 0221138 A2 WO0221138 A2 WO 0221138A2
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cells
seq
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Holger Hiemisch
Moritz Rossner
Matthias Klugmann
Jomana Naim
Gisela Eisenhardt
Rohini Kuner
Anthony Lanahan
Paul Worley
Daniela Spielvogel
Sigrid Scheek
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
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    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders

Definitions

  • the present invention relates to the M30 gene family and the use of the genes and gene products.
  • the stroke is first diagnosed today by a thorough neurological examination. Common symptoms are: paralysis, speech disorder, visual disturbance. This is followed by a radiological examination using computed tomography (CT) or magnetic resonance imaging (MR). The latter investigation prevails despite higher costs, since it allows a higher resolution and the determination of additional parameters. Diffusion and perfusion-weighted images are particularly interesting for stroke diagnostics.
  • CT computed tomography
  • MR magnetic resonance imaging
  • BEST ⁇ TIGU ⁇ GSKOPIE It is therefore an object of the present invention to provide a protein marker for the cerebrospinal fluid, which comprehensively indicates the extent of neuronal damage and is suitable as a diagnostic marker for the stroke. Another object of the invention is to offer a diagnostic marker for cancer, in particular ovarian cancer.
  • Another object of the invention is to show strategies for the therapy of neurodegenerative diseases.
  • a ner driving for the diagnosis of neurodegenerative diseases characterized in that the concentration of a protein having one of the sequences SEQ ID ⁇ O 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, or one A mammalian homologue of this protein or a natural mammalian mutein of this protein, which has a sequence identity with one of the sequences of over 60% over a range of 50 amino acids of its amino acid sequence, is determined in a body sample.
  • mammalian homologue means that the protein is naturally (that is to say non-recombinant) present in a mammalian organism and has one of the sequences SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 over a range of
  • 60 amino acids has a sequence identity of over 60%. This preferably indicates
  • the natural mammalian mutein preferably has a sequence identity of 60%, 70%, 80% or 90% over a range of 60, 80, 100, 189, 300, 400 amino acids or over its entire length.
  • sequence identity refers to the amino acid sequence and is based on the algorithm of Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990, in particular on the Megalign program (DNAstar, Lasergene, Madison, Wisc. USA ), the following
  • Proteins comprising one of the sequences SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, or a mammalian homologue of this protein or a> natural mammalian mutein of this protein, which has a range of 50 amino acids Amino acid sequence one
  • a gene is to be understood in the broadest sense throughout the present invention.
  • a gene is the section on the genome that codes for a protein, the primary gene product, and that provides information for tissue specificity,
  • the term gene encompasses the promoter which controls the transcription of the sequence of the primary gene product and, if appropriate, further regulatory sequences (such as enhancers).
  • the term gene encompasses all nucleic acids which arise from splicing the gene and their cDNA transcripts produced by means of reverse transcriptase.
  • the term gene encompasses the fully spliced, optionally polyadenyated mRNA and the resulting cDNA.
  • the gene thus has coding and non-coding sequence sections which, depending on whether they are in front of or behind the open reading frame of the primary gene product in 5 '->3' orientation, are called 5 'non-translated or 3' non-translated regions.
  • the open reading frame of a gene's primary gene product is also referred to as a structural gene.
  • RNA products of the M30 gene were increasingly expressed and could be cloned using a modified differential cloning system (suppression subtractive hybridization SSH).
  • SSH suppression subtractive hybridization
  • M30 expression is also induced by stimuli associated with neuronal damage. Induction of the M30 transcript level in the rat hippocampus was also observed after administration of kainate, a substance that leads to overexcitation of glutamatergic synapses and can trigger cell death. The amount of M30 transcript after mouse focal ischemia, which is triggered in mice, is also increased in order to simulate a stroke.
  • M30 protein or the M30 transcript it is not correct to speak of the M30 protein or the M30 transcript, rather there are four different transcripts, each comprising different exons (variant A and B or variant C and D each code for the same protein ).
  • other proteins M31, M32 and M33 belong to the same protein family as the sequence of the sequences shows.
  • M30 the other homologues of the M30 gene family according to the invention show a very similar expression pattern to M30 and that they are upregulated equally after MECS stimulation, kainatin injection or after induction of focal ischemia.
  • M31 differs from the other representatives of the same gene family in that it also shows a very high expression in ovarian tumors.
  • the body sample to be examined as part of the method according to the invention is preferably the cerebrospinal fluid, which is relatively non-invasive
  • the body sample may also be blood.
  • the blood-brain barrier prevents the proteins from entering the bloodstream.
  • neurodegenerative diseases are sometimes accompanied by a partial permeability of the blood-brain barrier.
  • brain biopsies can also be performed
  • the preparation will usually be examined histologically, so that the status of the overexpression rather than the protein concentration is determined by immunocytochemical staining of the protein or its transcript in comparison with samples from healthy people.
  • the concept of determining the protein concentration is within the scope of the invention
  • cerebrospinaHs cerebrospinal fluid can only detect those members of the M30 gene family that were present in the CNS of the patient before the neurodegenerative process began. If the patient is a human, only the concentration of human homologues or, if appropriate, pathological or non-pathological muteins of these human homologues can be the subject of the investigations.
  • the concentration of the members of the M30 gene family in the cerebrospinal fluid is carried out using customary methods, for example using polyclonal, monoclonal or recombinant antibodies, for example in the context of an ELISA experiment (enzyme-linked immunosorbent assay) or an FIA experiment (flow induction analysis) or another biosensor (Chemical Sensors and Biosensors for Medical and Biological Applications. Ursula E. Spichiger-Keller (1998) Wiley / VCH, Weinh .; ISBN: 3527288554; Biosensoren (Biotechnologie) Elizabeth AH Hall (1994) Springer-Verlag Berlin, Heidelberg ; ISBN: 3540574786) or by quantitative analytical affinity chromatography or quantitative affinity capillary electrophoresis.
  • Another approach is to take advantage of the ability of the members of the M30 gene group to form supramolecular complexes with other interaction partners to determine the concentration.
  • M30 is able to form a heterodimer with M32. This property could be exploited in the context of quantitative analytical affinity chromatography by immobilizing one interaction partner or the sequence section important for the interaction with the other partner on a column.
  • quantitative affinity capillary electrophoresis be carried out by covalently connecting an interaction partner or the sequence section which is important for the interaction with the other partner with the capillary matrix.
  • the concentration of the protein in question can also be measured indirectly by measuring the concentration of the transcript coding for the protein, since
  • Protein and transcript concentrations are usually correlated. Problems may arise due to the limited stability of the transcripts in cerebrospinal fluid result. However, depending on the type of neurodegenerative disease, these are more or less significant; this method can be used at least for acute neurodegenerative diseases such as stroke.
  • the easiest way to determine the transcript concentration is with quantitative PCR (polymerase chain reaction). Consequently, the term determination of the concentration of a protein in the cerebrospinal fluid includes the determination of the concentration of the transcript coding for the protein.
  • the diagnosis is made in the context of the method according to the invention by comparing the concentration of the protein to be examined in the body sample with the value from samples of healthy people without any findings.
  • the higher the determined value the higher the extent of the neurodegenerative cell damage.
  • the method according to the invention consequently makes it possible to monitor the course, that is to say to track the extent of neurodegenerative damage in real time or with only a slight delay.
  • the method according to the invention is therefore particularly suitable for adapting the therapy of intensive care patients to the course of the disease.
  • the method according to the invention is also suitable for checking the effect of pharmaceuticals for the treatment of neurodegenerative diseases either directly on the patient being treated or in an animal model. Accordingly, the method according to the invention relates both to body samples from animals and to body samples from humans.
  • the animals will be mammals, especially mammals that have established themselves as experimental animals (rats, mice, rabbits, dogs, etc.).
  • neurodegenerative disease is to be understood in the broadest sense. It also includes neuroinflammatory diseases if they are associated, if only temporarily, with the loss of neurons.
  • Neurodegenerative diseases are consequently chronic diseases such as Fragile X syndrome, Huntigton's disease and other diseases from the type of triplet expansion diseases (trinucleotide repeat expansion abnormalities; Kirkwood SC et al, Arch Neurol 2000 Jul; 57 (7): 1040-4; Oharal K, et al., Psychiatry Res 2000 M 17; 94 (3): 257-62), ALS (Amyotrophic Lateral Sclerosis), olivo-ponto-cerebellar degeneration Alzheimer's disease, Parkinson's disease and multiple sclerosis.
  • these diseases the progress of the neurodegeneration can be observed with the aid of the method according to the invention, which enables a corresponding adaptation of the therapy. This is all the more easily possible since CSF samples are often taken anyway in these diseases.
  • Neurodegenerative diseases are also acute diseases such as strokes or traumatic brain injuries as well as inflammatory diseases of the brain such as meningitis or epilepsy. What these diseases have in common is that they go hand in hand with the demise of neurons. This demise can be diagnosed reliably with the method according to the invention and can be tracked over time.
  • Another object of the invention is a protein, having a sequence SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10 12, 14, 16, 18 or a homologue or mutein thereof, which has a sequence identity with one of the 189 amino acids over a range Sequences SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10 12, 14, 16, 18 of greater than 55%, preferably with SEQ ID NO 16 of greater than 81% or with SEQ ID NO 14 of greater than 69%, or a fusion protein of one represents such protein with another protein.
  • the homolog is a natural (i.e. non-recombinant) protein which is present in an organism and has a sequence identity with one of the sequences of greater than 55% (in particular 60%, 65%, 70) over a range of 189 amino acids %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%), preferably with sequence SEQ ID 16, has a sequence identity of greater than 81% or with SEQ ID NO 14 of greater than 69%.
  • the homologue preferably has a sequence identity with sequence SEQ ID 16 of 83%, 85%, 90% or 95% or with sequence SEQ ID 14 of greater than 69%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%.
  • the range that is used in the calculation of the sequence identity is 189, 250, 300, 350 or 400 amino acids or the entire length of the amino acid sequence.
  • the mutein is a natural or recombinant protein which is present in an organism and, over a range of 189 amino acids, has a sequence identity with one of the sequences of greater than 55% (in particular 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%), preferably with sequence SEQ ID 16, has a sequence identity of greater than 81% or with SEQ ID NO 14 of greater than 69%.
  • the mutein preferably has a sequence identity with sequence SEQ ID 16 of 83%, 85%, 90% or 95% or with sequence SEQ ID 14 of greater than 69%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%.
  • the range that is used in the calculation of the sequence identity is 189, 250, 300, 350 or 400 amino acids or the entire length of the amino acid sequence.
  • the fusion protein is a protein having a sequence SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10 12, 14, 16, 18 or a homologue or mutein according to the aforementioned definition which is linked to another protein such as the GFP (GenBank Accesion Number BAB11884) or an oligopeptide such as a hexahistidine anchor. This is usually done using known recombinant methods.
  • the sequences SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10 12, 14, 16, 18 are new.
  • the Drosophila protein Pellino (GenBank Accesion Number, AF091624) may be a homologue of these proteins that has been identified due to its association with the protein pelle (Grosshans et al, Mech Dev, 81, 127-38, (1999). Pelle associated with the Toll / Dorsal signal transduction pathway, which has its analogue in the mammalian interleukin-1 signal transduction pathway (Auron, Cytokine Growth Factor Rev, 9, 221-37, 1998).
  • a protein is also known which is different from the M30 protein , D (SEQ ID NO 10) by an amino acid (GenBank Accesion Number, AJ278859) This protein was previously thought to be the human homologue of Pellino.
  • Another object of the invention is a protein, the transcript of which hybridizes with a probe comprising a sequence region from the sequences SEQ ID NO 17, 15, 13, 11, 9, 7, 5, 3, 1 under stringent conditions.
  • the transcript means the mRNA or cDNA belonging to the corresponding protein.
  • the transcript of the protein according to the invention hybridizes under stringent standard conditions with a probe which comprises a sequence region from the sequences SEQ ID NO 17, 15, 13, 11, 9, 1, 5, 3, 1.
  • a probe which comprises a sequence region from the sequences SEQ ID NO 17, 15, 13, 11, 9, 1, 5, 3, 1.
  • short oligonucleotides of approximately 17 to 20 base pairs in length are to be used as probes. These probes should encompass the conserved regions of the sequences SEQ ID NO 17, 15, 13, 11, 9, 7, 5, 3, 1. It However, it is not necessary and, as a rule, not particularly advantageous for the probe molecules used for a hybridization experiment to have a uniform sequence.
  • They can also be formed by primer extension of restriction fragments using primers with random sequences and a polymerase (such as Klenow DNA polymerase) and have a length of 17 to 20 base pairs on average.
  • a polymerase such as Klenow DNA polymerase
  • the use of single-stranded RNA or DNA probes or double-stranded DNA probes is possible within the aforementioned stringent conditions.
  • the use of the aforementioned probes from primer extension reactions is preferred.
  • Hybridization under stringent standard conditions means in the context of the invention:
  • the hybridization takes place in modified Church buffer (EDTA 1 mM, NaH 2 PO 4 pH 7.2, 0.5 M, SDS 7%), -
  • the DNA is on a nylon membrane (eg ZetaProbe from BioRad) ,
  • the nylon membrane is prehybridized for approx. 30 min.
  • Hybridization takes place at 65 ° C (if the sequence of the probe comes from the same organism as the DNA to be searched) or at 60 ° C (if the sequence of the probe comes from a different organism than the one to be searched for
  • the membrane is washed at the same temperature as hybridization, i.e. at 65 ° C or 60 ° C for 20 min in 5xSSC buffer, 0.1% SDS (SSC: see Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology) for 20 min in lxSSC / 0.1% SDS buffer, for 10 min in 0.5xSSC / 0.1% SDS buffer.
  • SSC see Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology
  • Hybridization is essentially preserved. Hybridization can be obtained from the
  • Another object of the invention is an antibody against a protein of the M30 gene family, in particular against a protein comprising one of the sequences SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18.
  • antibody encompasses both polyclonal, monoclonal, human or humanized or recombinant antibodies or antibody fragments, single chain antibodies or synthetic antibodies of all immunoglobulin classes such as IgM, IgG, IgD, IgE, IgA or their subclasses.
  • IgG and its subclasses such as IgGl, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 or IgGM are preferred.
  • the IgG subtypes IgGl / k or IgG2b / k are particularly preferred.
  • antibody fragments encompasses all protein constructs derived from antibodies with one or two binding sites complementary to the antigen, such as antibody parts with one binding site formed by the light and heavy chain, such as Fv, Fab or F (ab ') 2 fragments or single-strand fragments. Shortened double-strand fragments such as Fv, Fab or F (ab ') 2 are preferred. These fragments can be obtained, for example, enzymatically by cleaving off the Fc part of the antibodies with enzymes such as papain or pepsin, by chemical oxidation or by genetic engineering manipulation of the antibody genes.
  • one can already be immunized with the antigen or a fragment thereof Cells run out, amplify the variable and possibly the constant regions and insert the sequence obtained into a vector which contains the remaining constant sequences still required, so that the recombinant antibody produced with the aid of the vector represents a fusion protein, a chimera.
  • These cells can be hybridomas from the Kohler & Milstein method or lymphocytes obtained from an animal after immunization. At least in the latter case, the antibody with the highest affinity has to be searched for in order to obtain a monoclonal (overview: Harlow, E. and Lane, D. 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY; Ausubel et al.
  • Antibody-producing cells are attracted and the mRNA, provided the optical density of the cells is sufficient, is increased by cell lysis with guanidinium thiocyanate, acidification with sodium acetate, extraction with phenol, chloroform / isoamyl alcohol, precipitation with isopropanol and washing isolated with ethanol from the cells in a known manner. Then the reverse transcriptase is used to synthesize cDNA from the mRNA.
  • the cDNA can be inserted directly or after genetic manipulation, for example by targeted mutagenesis, introduction of insertions, inversions, deletions or base exchanges into suitable animal, fungal, bacterial or viral vectors and expressed in the corresponding host organisms.
  • Bacterial or yeast vectors such as pBR322, pUC18 / 19, pACYC184, lambda or yeast mu vectors for cloning the genes and expression in bacteria such as E. coli or in yeast such as Saccharomyces cerevisiae are preferred.
  • Another method is to search a natural or synthetic antibody library.
  • a natural or synthetic antibody library can be created, for example, by the method according to US Pat. No. 5,840,479, for example by trinucleotide synthesis of the variable regions.
  • Another object of the invention is the use of a protein of the M30 gene family to search for ligands that bind to these proteins, as well as these ligands themselves.
  • a ligand is a molecule with a molecular weight of up to 100 to 100,000 Da, which is linked to a protein of the M30 gene family with a Dissociation constant of less than 1 ⁇ M binds. It can therefore be a small organic molecule of 200 to 1000 Da or a considerably larger polymer, such as an oligopeptide, polypeptide or protein with a molecular weight of 1000 to 100000 Da, in particular from 40,000 to 60,000 Da.
  • the dissociation constant of the ligand-protein complex is preferably less than 100 ⁇ M, especially less than 10 nM, in particular less than InM, the binding generally being based on a Scatchard binding equilibrium (CR Cantor and PR Schimmel, Biophysical Chemistry, WH Freeman and Company, San Francisco, Vol. III, Chapters 15-3 and 15-4; also Scatchard, G, 1949, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660).
  • the dissociation constant is determined using known methods. Either the ligand is marked (e.g. radioactive) and the setting of the binding equilibrium is measured directly or the displacement of a second ligand is measured, the dissociation constant of which is known, and then back to the dissociation constant of the first ligand using known mathematical relationships.
  • M30 binds to M32 or M33.
  • the disintegration or other structural changes of the supramolecular M30 / M32 complex or the M30 / M33 complex upon addition of a putative ligand can also be followed using conventional physical measurement methods (e.g. NMR, circular dichroism, light scattering; see Cantor and Schimmel, at the stated location, vol .
  • ligand Additional proteins which are interaction partners of M30 or other members of the M30 gene family and which are included in the term ligand can be determined using the yeast two-hybrid system (as described in an example for M32). The use of the yeast two hybrid system for the determination of ligands is also the subject of the invention.
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • M30 and its interaction partner could fuse with mutants of the Green Fluorescent Protein (GFP) [e.g. BFP (blue fluorescent protein) GFP, CFP or YFP (green fluorescent protein, S65T mutant) (Mahajan, et al, Not Biotechnol, 16, 547-52, (1998)].
  • BFP and GFP are selected below as examples.
  • fusion proteins are expressed and purified in bacteria or other expression systems (baculoviruses, yeasts), for example via a polyhistidine marker using nickel columns.
  • the two proteins are combined in a concentration in the range of 100 nM.
  • BFP is the donor (excitation at 389 nm) and GFP the acceptor (emission at 511 nm)
  • the FRET effect occurs when the two proteins approach 50 - 10 angstroms.
  • the protein mixture can be pipetted into microtiter plates n, and incubated with substances from a chemical bank. It may also be advantageous to preincubate the M30 fusion protein with the chemical substance first and then to add the interaction partner.
  • An inhibition of the interaction can then be determined by a decrease in the FRET effect (measurement with photomultipliers or a spectrophotometer).
  • An implementation of a high-throughput screening system using the FRET effect is described in (Mere, et al, Drug Discov Today, 4, 363-369, (1999)). In principle, this test system can also be carried out in cells; this may be necessary.
  • the search for new ligands could also be carried out as part of an HTS system (High Throughput System) using the SPA (Scintillation Proximity Assay) (from Amersham).
  • a peptide from the putative interaction partner of M30 or another representative of the M30 gene family is coupled to SPA-beads.
  • a fusion protein from M30 or another member of the M30 gene family and the consensus phosphorylation site of protein kinase-A (sequence RRASV) and a purification day (eg polyhistidine day) is produced and purified.
  • the M30 fusion protein is labeled with 33 P by incubation with protein kinase A and 33 P-ATP.
  • the SPA beads can be incubated in microtiter format with substances from a combinatorial library. After adding the fusion protein, the radioactive signal, which is caused by the binding of the P-labeled fusion protein to the SPA- bead is formed, measured. The addition of a ligand would reduce the radioactivity which can be measured on the SPA beads after the washing steps have been carried out.
  • Ligands of the proteins of the M30 gene family can be identified.
  • a yeast two-hybrid method can be used, for example, using the matchmaker system from Clontech Laboratories GmbH Heidelberg, DE.
  • a nucleic acid coding for a protein of the M30 gene family is cloned into a so-called bait vector (e.g. pGBTIO).
  • a library of a so-called Prey vector and various gene pieces contained therein can then be searched for an interaction partner (see e.g. (Kuner, etal, Science, 283, 74-7, ( 1999))).
  • the task with regard to new therapeutic strategies for the therapy of neurodegenerative diseases is further achieved in that for the first time the interaction between M30 and protein kinases of the IRAK family M30 and its homologues is functionally associated with signal transduction pathways which ultimately lead to cell death.
  • Example 7 shows further evidence of a connection between M30 and these signal transduction pathways, in which a comparative apoptosis assay for M30-transfected or non-M30-transfected cells is carried out. When M30 was overexpressed in the cell, apoptosis under the influence of staurosporine was clearly increased compared to the non-overexpressing control cells.
  • Certain ligands of M30 are therefore suitable for the production of medicaments for the therapy of neurodegenerative diseases because, by increasing or preventing the interaction between M30 and IRAK kinases, they influence certain signal transduction pathways which can trigger and intensify apoptosis processes.
  • Such ligands for the production of medicaments for the therapy of neurodegenerative diseases are therefore the subject of this invention.
  • Another object of this invention is the use of the interaction of M30 with protein kinases, preferably with protein kinases from the IRAK gene family and their homologues and derivatives, for the production of a medicament for the therapy of neurodegnerative diseases.
  • Derivatives of protein kinases from the IRAK gene family are understood to mean, in particular, those members of the family that have been post-translationally modified.
  • the invention furthermore also relates to medicaments comprising a functional inhibitor of M30 or a homologue of M30.
  • Such inhibitors are understood to be ligands which bind to M30 and which influence the function of M30.
  • the invention furthermore relates to a screening method for the identification and / or characterization of functional inhibitors of M30 or a homologue of M30, comprising the following steps:
  • the yeast two hybrid system is used for cotransformation experiments to detect a protein / protein interaction between m30 and protein kinases of the 111 signal transduction pathway.
  • M30 was cloned into the so-called Prey vector, while either the protein kinase pelle from Drosophila or the human IRAK1 receptor (interleukin-receptor-associated-kinase 1) was cloned into the Bait vector.
  • Protein / protein interactions could be detected using the yeast two hybrid assay between m30 and pelle.
  • the interaction of M30 with IRAK-1 is weaker than that with pelle and can only be detected with the N-terminal two thirds of the M30 reading frame. This suggests that the true interaction partner of m30 is either a post-translationally modified version of IRAK-1 or a kinase homologous to IRAK-1.
  • the interaction of M30 with IRAK-like protein kinases according to the invention generally influences the function of the IRAK-like protein kinases by influencing the interaction of these kinases with other proteins, for example phosphorylation targets, or by influencing the activation of the kinase function.
  • the described dimerization function of M30 family members enables, for example, activation of the kinases by approximation and mutual phosphorylation.
  • the M30 ligands pelle and their human analogs from the IRAK family, as well as their derivatives, but especially IRAKl, are thus also the subject of the present invention.
  • the ligands according to the invention generally influence the function of the proteins of the M30 gene family by changing the conformation of the proteins and protein complexes or masking binding sites for other ligands (for example by steric hindrance or by changing the hydrophobicity behavior of a domain or the entire protein or protein complex or by electrostatic repulsion). This influence can be accompanied by an inhibition or activation of certain functions of the proteins of the M30 gene family.
  • the ligands found in this way can be used for the production of medicaments which can be used against neurodegenerative diseases and / or diseases of the immune system and / or against carcinomas or sarcomas.
  • Immune system diseases include, in particular, autoimmune diseases, atopies and allergies, in particular with lung involvement such as bronchial asthma, infection by HIV or by other immunotropic viruses, acute and chronic lymphatic leukemia, acute and chronic myeloid or lymphatic leukemia, primarily chronic polyathritis, Crohn's disease, colitis to understand ulcerosa.
  • Carcinomas or sarcomas are in particular bronchial carcinomas, colon carcinomas, leukaemias, cervical and uterine carcinomas and especially ovarian cancers.
  • Another object of the invention is a DNA construct comprising nucleic acid coding for a protein of the M30 gene family and a promoter operatively linked to it.
  • the promoters which precede the nucleotide sequences coding for proteins of the M30 gene family and which regulate their transcription can by one or more nucleotide exchanges have been changed by insertion (s) and / or deletion (s), but without the functionality or effectiveness of the promoters being impaired. Furthermore, the effectiveness of the promoters can be increased by changing their sequence or completely replaced by more effective heterologous or synthetic promoters. Promoters can regulate the transcription of a nucleic acid section coding for one or more proteins. In the latter case, internal ribosome binding sites (IRES) are generally used in eukryotic host cell systems.
  • IVS internal ribosome binding sites
  • the nucleic acid segments coding for a protein of the M30 gene family are usually functionally linked to genetic regulatory elements such as transcription and translation signals. Depending on the desired application, this linkage can lead to an increase or decrease in gene expression.
  • genetic regulatory elements such as transcription and translation signals.
  • this linkage can lead to an increase or decrease in gene expression.
  • host organisms are subsequently transformed.
  • the natural regulation of these sequences may still be present before the actual structural genes and may have been genetically modified so that the natural regulation has been switched off and the expression of the genes increased.
  • the construct can also have a simpler structure, that is to say that no additional regulation signals are inserted in front of the sequences and the natural promoter is not removed.
  • the natural regulatory sequence is mutated so that regulation no longer takes place and gene expression is increased.
  • Additional advantageous regulatory elements can also be inserted at the 3 'end of the nucleic acid sequences.
  • the open reading frames can be contained in one or more copies in the gene construct, or localized on separate gene constructs.
  • Advantageous regulatory sequences for the method according to the invention are, for example, in promoters such as cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq, T7, T5, T3 contain, gal, trc, ara, SP6, 1-PR or in the 1-PL promoter, which are advantageously used in gram-negative bacteria.
  • regulatory sequences are, for example, in the gram-positive promoters such as amy and SPO2, in the yeast promoters such as ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH or in mammalian promoters such as CaM-Kinasell, CMV, Nestin, L7, BDNF, NF, MBP, NSE, beta-globin, GFAP, GAP43, tyrosine hydroxylase, kainate receptor subunit 1, glutamate receptor subunit B included.
  • all natural promoters with their regulatory sequences like those mentioned above can be used.
  • synthetic promoters can also be used advantageously.
  • the gene is only expressed or overexpressed after induction, or that it is expressed and / or overexpressed immediately.
  • the regulatory sequences or factors can preferably have a positive influence on the expression and thereby increase it.
  • the regulatory elements can advantageously be strengthened at the transcription level by using strong transcription signals such as promoters and / or "enhancers".
  • an increase in translation is also possible, for example, by improving the stability of the mRNA.
  • Enhancers are understood to mean, for example, DNA sequences which bring about increased expression via an improved interaction between RNA polymerase and DNA.
  • locus control regions, silencers or respective partial sequences thereof may be mentioned as further regulatory sequences, these sequences being chosen such that tissue-specific expression is possible.
  • a preferred embodiment is the use of a 5'-promoter from the open reading frame, optionally with further regulation signals such as 3'-terminators or polyadenylation signals or enhancers.
  • the sequence coding for a protein of the M30 gene family is cloned into a framework vector which has all the necessary regulatory sequences and has the possibility of self-replication in a host organism. Suitable vectors are well known to those skilled in the art and can be found, for example, in the book Cloning Vectors (Eds. Pouwels PH et al.
  • vectors are also understood to mean all other vectors known to the person skilled in the art, such as phages, viruses such as SV40, CMV, baculovirus, adenovirus, Sindbis virus, transposons, IS elements, phasmids, phagemids, cosmids, linear or circular DNA. These vectors can be replicated autonomously in the host organism or replicated chromosomally. Linear DNA is advantageous for integration into Mammalia used.
  • nucleic acid sequences according to the invention or of the recombinant nucleic acid construct can advantageously be increased by increasing the number of gene copies and / or by increasing regulatory factors which have a positive influence on gene expression.
  • regulatory elements can preferably be strengthened at the transcription level by using stronger transcription signals such as promoters and enhancers.
  • an increase in translation is also possible, for example, by improving the stability of the mRNA or increasing the reading efficiency of this mRNA on the ribosomes.
  • the nucleic acid sequences or homologous genes can be incorporated, for example, into a nucleic acid fragment or into a vector which preferably contains the regulatory gene sequences assigned to the respective genes or promoter activity with an analogous effect.
  • nucleic acid sequences according to the invention can be cloned together with the sequences coding for interacting proteins into a common vector and then expressed in the desired organism.
  • each of the potentially interacting nucleic acid sequences and the sequences coding for a member of the M30 gene family can each be brought into a single vector and these can be introduced separately into the respective organism using conventional methods such as transformation, transfection, transduction, electroporation or particle gun.
  • Vector systems or oligonucleotides can be used which extend the nucleic acids or the nucleic acid construct by certain nucleotide sequences, that is to say generate a fusion protein, in order to be able to purify the protein more easily.
  • tags are known in the literature, for example, hexa-histidine anchors or epitopes that can be recognized as antigens of various antibodies (Studier et al., Meth. Enzymol., 185, 1990: 60-89 and Ausubel et al. (eds.) 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York).
  • Another object of the invention is therefore the use of an inhibitor for
  • M30 or one of its homologues for the manufacture of a medicament for the therapy of neurodegenerative diseases with reduction of neuronal cell death.
  • Another object of the invention is a DNA construct comprising a promoter and a sequence operatively linked to the promoter for controlling the resynthesis of the protein of the M30 gene family in a cell. This is done by complex formation with the corresponding mRNA.
  • This construct is used to control the resynthesis of the M30 gene protein protein in a cell.
  • a gene sequence which is inversely complementary to a sequence of a gene of the M30 gene family or a part thereof is cloned in front of a promoter so that the transcription of the sequence is under the control of this promoter.
  • the construct is introduced into a cell, the transcript of the gene sequence which is complementary to a sequence of a gene of the M30 gene family or a part thereof is optionally formed after induction of the promoter. Together with the transcript of the relevant gene of the M30 gene family, this transcript forms an RNA-RNA hybrid helix which is degraded more rapidly by nucleases of the cell.
  • the transcript of the inverse complementary sequence thus reduces the lifespan of the transcripts to which it binds.
  • constructs according to the invention are useful for throttling the transcription frequency of genes of the M30 gene family in the cells which have the construct and, in extreme cases, completely suppressing them.
  • Constructs that increase or decrease the amount of protein in a cell of a member of the M30 gene family can also be used in gene therapy to heal cells that have a pathological amount of the protein in question. This can be done as part of a therapy for neurodegenerative diseases or, for example, to fight cancer, that is, sarcomas and carcinomas.
  • Such use of both types of constructs mentioned is also the subject of the invention.
  • cells which contain one of the aforementioned constructs are also an object of the present invention.
  • These cells can be prokaryotic or eukaryotic.
  • all organisms that allow expression of the constructs according to the invention are conceivable as cells.
  • Cells are understood to mean, for example, bacteria, fungi, yeasts, plant or animal cells.
  • Preferred organisms are bacteria such as Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus or Pseudomonas, eukaryotic microorganisms such as Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, higher eukaryotic cells from humans or animals, for example COS, Heia HEK293, Sf9 or CHO cells.
  • a common way of influencing transcript and thus protein amounts of M30 is by using short nucleic acid sequences or oligonucleotides. This includes all nucleic acid fragments in the range from 10 to 200 bp, synthetically generated, or can be obtained in some other way.
  • these are antisense oligonucleotides directed against partial sequences of the M30 mRNA, or also nucleic acids in the sense of RNAI inhibition.
  • the nucleic acids used can also be chemically modified, for example phosphothioate oligonucleotides, or they can be hybrids of ribo- and deoxyribonucleic acids.
  • These oligonucleotides can also be introduced into cells in different application forms, e.g. with liposome preparations, with parts of the VS V virus or similar preparations.
  • Another object of the invention is a transgenic non-human being, comprising cells with an altered gene in the genome of the cell in question, which preferably replaces the wild-type gene, the wild-type of the gene coding for a protein of the M30 gene family.
  • Transgenic non-human beings are transgenic animals or plants.
  • Transgenic beings are genetically modified so that their cells have a modified amount of a protein of the M30 gene family compared to the wild type or in which the wild-type form of a gene of the M30 gene family is replaced by another gene, preferably by homologous recombination, which differs from the wild-type gene in the open reading frame or in the regulatory sequences which regulate the transcription of the primary gene product (promoter, enhancer, etc.), differ. Accordingly, the transgenic being has another protein of the M30 gene family and / or the amount of this protein is permanently or temporarily changed in all or part of the cells of the being.
  • Transgenic beings can also be mosaic with respect to the mutated gene, the mutated gene can be present in only a part of the somatic cells, it is not conceptually necessary for the mutation to be manifest in the germ cells. In this respect, certain people who have successfully undergone gene therapy can also be counted among the transgenic beings. For this reason, the addition of the term "non-human” explicitly excludes protection.
  • the mutated gene of the transgenic being can also be a knock-out gene (Ausubel et al. (Eds.) 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York and Torres et al., (Eds.) 1997, Laboratory protocols for conditional gene targeting, Oxford University Press, Oxford).
  • Transgenic animals can be, for example, mice, rats, sheep, cattle or pigs.
  • Transgenic plants are also conceivable in principle, although the method of homo-geneous recombination for their production will generally be ruled out, since the evolutionary differences between plants and mammals will generally not allow this.
  • transgenic plants for expression of large amounts of protein can be used for a method of searching for ligands that bind to a protein of the M30 gene family (see Luhring, H., Witzemann, V., FEBS Lett, 1995, 361 (1): 65- 9) can be used.
  • Animal models produced in this way can provide test systems for evaluating novel therapeutic agents for pharmaceuticals for the treatment of neurodegenerative diseases.
  • Another object of the invention is a method for diagnosing a neurodegenerative disease or the susceptibility to this disease, characterized by the sequence deviation in a gene which codes for a protein of the M30 gene family compared to the wild type.
  • the genes of the M30 gene family have been found to play an important role in neurodegenerative conditions. This suggests that the occurrence of, or at least the susceptibility to, these conditions in certain cases is due to a mutation in a protein of the M30 gene family.
  • a method for diagnosing a neurodegenerative hereditary disease or the susceptibility to this disease is thus specified, which includes the determination of sequence deviations in relation to one or more genes of the M30 gene family from the corresponding wild-type gene.
  • sequence deviations can be, for example, single nucleotide polymorphisms (SNP).
  • SNP single nucleotide polymorphisms
  • the method according to the invention can also be used to make the diagnosis in a patient who is already ill. Methods for determining sequence deviations are known to the person skilled in the art. In addition to the polymerase chain reaction (PCR) with subsequent sequencing of the amplification products, a number of similar methods have become established, especially if it is already known where the sequence deviations are to be expected.
  • PCR polymerase chain reaction
  • chromosomal locus in humans chromosome 2 in M30; chromosome 11 in M31, in each case in human straining
  • certain hereditary diseases could also enable a new diagnostic method for hereditary diseases (e.g. from the form of atopies or other diseases of the immune system).
  • the invention further relates to a method for diagnosing carcinomas or sarcomas, in particular ovarian cancer, characterized by the detection of the overexpression of a protein according to SEQ ID NO 14 in a body sample.
  • a protein according to SEQ ID NO 14 ie M31
  • the overexpression can thus be determined either by determining the transcript amount or the M31 protein amount of the cell and, if the overexpression is present, a malignant degeneration of the cell in question can be concluded.
  • the overexpression is determined by comparing the sample with a control sample which has no cancer cells, preferably histologically using antibodies to determine the amount of protein or in situ probes to determine the amount of transcript. Otherwise, the transcript can also be detected using PCR methods.
  • Some cancer markers are already known, for example from WO94 / 12881 and WO94 / 17414, DE-A19829473, the disclosure of which is incorporated in full in relation to the detection protocols.
  • the cancer markers already known can only detect a subset of cancer cells. So there are still types of cancer that cannot be detected with the known markers. In this respect, there is still a need to provide new cancer markers.
  • FIG. 1 shows the genomic organization of the M30 locus in humans
  • FIG. 2 shows a sequence compilation of some members of the M30 gene family
  • FIG. 3 shows the tissue-specific expression of M30, rat
  • FIG. 4 shows the up-regulation of the synthesis of the M30 transcript by kainate (M30, rat)
  • FIG. 5 shows the localization of M30 in the rat brain after administration of kainate
  • FIG. 6 shows the up-regulation of the synthesis of the M30 transcript by focal cerebral ischemia ( M30, mouse)
  • Fig. 7 molecular functions of M30 in the I ⁇ _ ⁇ l system
  • FIG. 8 shows the sequence identities which human representatives of the M30 gene family have among one another
  • FIG. 9 sequence identities which represent representatives of the M30 gene family from humans and rats in the
  • Fig. 1 shows the genomic organization of the M30 locus in humans.
  • the 4 cDNA species of M30 found in humans and their genomic origin are shown in FIG. 1.
  • the exons are marked with large Arabic numerals. It is not excluded that the clones extend further to 5 '. The proportions are not to scale. Dashes indicate unclear intron lengths.
  • the designations hm30_A, hm30_B, hm30_C and hm30_E) correspond to M30, A, B, C, D (see Table 1).
  • Fig. 2 shows an alignment of some members of the M30 gene family.
  • M30 protein sequences from rat (rat) and human (human (D) corresponds to M30, D) were compared with homologues from other species according to homology areas (MegAlign).
  • 3 shows the tissue-specific expression of M30 (rat).
  • a Northern blot with RNA from different tissues was hybridized with a specific probe for M30.
  • RNA from rat hippocampal tissue was obtained after various times of treatment with PBS (phosphate buffered saline), kainate, or pentylene tetrazole (PTZ). A Northern blot with this RNA was hybridized with an M30-specific sample. There is ubiquitous expression in all examined tissues.
  • Fig. 5 shows the localization of M30 in the rat brain after administration of kainate. In situ hybridization of the hippocampal region in the rat 1.5 h after administration of kainate (10 mg / kg ip). Explanation in the text of the examples FIG.
  • M30 focal cerebral ischemia
  • the quantity of M30 transcripts after focal cerebral ischemia was determined with quantitative PCR.
  • the relative values are normalized for cyclophilin.
  • FIG. 7 shows molecular functions of M30 in the IL-1 system. Components of the IL-1 receptor signaling pathway. Possible sites of action of M30 are indicated by arrows.
  • FIG. 8 shows the sequence identities, the human representatives of the M30 gene family with one another. M32 and M33 are very closely related, M31 diverges the most.
  • FIG. 9 shows sequence identities, the representatives of the M30 gene family from humans and rats in comparison with the Pellino sequence from Drosophila have (upper triangle of the matrix) or the corresponding deviations (lower triangle of the matrix). The homology relationships are also shown in the form of a dendrogram.
  • M30, D is most similar at 55.5% sequence identity, followed by M33 (54.8% o) and then M31, which is the most distant (48.3%).
  • FIG. 10 shows a Western blot of protein extracts from cos 1 cells that had either remained untreated (A) or previously transiently transfected with m30 (D) or with various negative controls (EGFP (C); blank vector (B)), and subsequently exposed to the apoptosis-inducing substance staurosporine or had not been exposed.
  • a specific antibody for the PARP protein clearly shows the apoptosis-inducing effect of m30 under the influence of stress from staurosporine.
  • EGFP alone also has minimal apoptosis-inducing effects.
  • Example 11 shows the position of the m30 fragments at the nucleotide level which were used for the cotransformation experiments described in Example 14. The interactions of these m30 fragments with pelle are described in Table 2.
  • M30 was then identified as positive by "reverse northern blot" filter hybridization with RNA from the MECS-stimulated animals.
  • the protocol is described in detail in Lanahan et al., 1997 (Lanahan, et al, JNeurosci, 17, 2876-85, (1997)).
  • a total of 3 independent cDNA clones of M30 (m30_5, m30_17, m30_26) were sequenced using a transposon insertion method (GPS-1, New England Biolabs, Beverly, MA; USA), and the sequences were carried out using the SeqMan program (Lasergene, Madison, WI , USA) assembled.
  • the obtained sequence of the clone m30_26 was 2736 base pairs long and contained a polyA tail at the 3 'end and a region of highly repetitive sequence at the 5' end, which is certainly attributable to the 5 'untranslated region, so that it could be assumed that this clone encompasses the complete M30 cDNA.
  • sequence of clone m30-26 is in SEQ ID NO. 1 and represents the longest of the 3 sequenced cDNA sequences.
  • a polymorphism was found at position 2078: two of the M30 clones contained C at this point, and one clone found A.
  • Homologs of the protein in other species have not been obtained.
  • Rats M30 cDNA hybridized By sequencing several clones, two were found in the
  • oligonucleotide primers were selected from these sequences.
  • areas were the disordered human genomic sequence (see below), the region homologous to the rat cDNA in the 5 ', selected for PCR primers: hm30_new_sl aaagcaccagtaaaatatggtg hm30_nn_s2 tggttgaatatactcatgacag hm30_nn_s3 aaatggcgatagaggaaggagg hm30_nn_s4 tcacacactggcacctggtatg hm30_n_s5 agcctaggcaacagagcaagactc hm30_nn_s6 gaggtaggagaaccacttgaacc HM30 nn_s7 ttaaactgaaacgaattgttcac hm30_nn_s8 gtttgcat
  • the differential regulation of M30 gene expression may depend on defined physiological or pathophysiological situations, e.g. Seizures because the rat cDNA was identified. So far, only one isoform has been found in the rat. Preliminary data from a cosmid with the genomic mouse sequence suggest strong conservation of the exon-intron structure and the intron lengths, which could also indicate the presence of several isoforms in mice and rats.
  • Protein sequence in humans The derived protein sequence resulted in the human cDNA sequences M30, A and M30, B around the sequence “MFS PDQ ENH PSK APV KYG ELI VLG YNG SLP NGD RGR RKS RFA LFK RPK ANG VKP STV HIA CTP QAA KAI SNK DQH SIS YTL SRA QTV VVE YTH DSN TD "protein franked in the amino terminus region, but in the remaining region has identical sequences to the M30 rat protein sequence. The only exception is an amino acid exchange at position 195 of the rat sequence (D (rat) -» N (human)) ,
  • a database search with the human sequence revealed a strong homology with a new disordered genomic sequence of the human genome project in the emblnew database (accession number AC012368; date 26-OCT-1999 (Rel. 61, Created); 02-NON-1999; (Rel. 61, Last updated, Version 2); description: Homo sapiens chromosome 2 clone ⁇ H0547M24 map unknown, WORKING DRAFT SEQUENCE, in unordered pieces.)
  • the disordered contigs of chromosome 2 contain all sequences found in the human cDNA, so that the probable exon-intron structure could be determined after three of the contigs, which were in the wrong orientation to one another, were rearranged.
  • Chromosome 2 contains some disease loci that may are interesting for M30, of course you need a subchromosomal localization. Among these are e.g. a susceptibility focus for Parkinson’s disease (Gasser, et al, Nat Genet, 18, 262-5, (1998)), a disease characterized by neuronal damage and death. It is also interesting to couple multiple sclerosis, a classic neuroimmunological disease, to chromosome 2 (Ebers, et al, Nat Genet, 13, 472-6, (1996)).
  • Chromosome 2 has a susceptibility locus for asthma-associated phenotypes (Cookson, Nature, 402, B5-11, (1999, Wjst, et al, Genomics, 58, 1-8, (1999, Hizawa, et al, J Allergy Clin Immunol, 102, 436-42, (1998, Nat Genet, 15, 389-92, (1997)).
  • a probe from the M30 cDNA (from clone m30-17) was used to hybridize a Northern blot to various rat tissues (Fig. 3). There is an ubiquitous presence of the specific M30 band, which corresponds in size to the cDNA length of clone m30-26 (approx. 2.8 kb).
  • the normalization of the applied RNA amounts with a probe for the ribosomal protein S26 shows that the expression in the lungs is strongest; however, the differences in abundance in the other tissues examined (brain, liver, heart, kidney, skeletal muscle, small intestine, testicles) are not particularly pronounced.
  • PBS phosphate buffer
  • PTZ pentylene tetrazole
  • This experiment confirms the view of m30 as an immediate early gene that can be regulated by neuronal excitation.
  • RNA transcripts were produced with T7 and T3 RNA polymerases with the incorporation of digoxigenin-coupled UTP (Roche Diagnostics). cRNA samples were hydrolyzed with NaOH to an average fragment size of 200-500 bp. 15 ⁇ m gem sections were cut with a cryostat at -20 °, mounted on poly-L-lysine-coated slides, fixed in 4% paraformaldehyde in PBS (pH 7.4). 5 shows an up-regulation of M30 transcript in neurons of the dentate gyrus, the CA1 and CA4 region. Neurons in the CA1 region are particularly susceptible to delayed neuronal death (apoptosis) after damage (e.g.
  • the dentate gyrus is associated with new neuron formation after pathological stimuli (Takagi, et al, Brain Res, 831, 283-7, (1999)) (Parent, et al, J Neurosci, 17, 3727-38, (1997)) ,
  • This in-situ localization confirms a connection between M30 and neuronal cell death, neurogenesis and plasticity.
  • the animal model of focal cerebral ischemia represents a valid model for human ischemic stroke.
  • the regulation of gene expression plays a decisive role in the course and extent of neuronal damage in cerebral ischemia iCoz ' st ⁇ 20 and Hokfelt, Neuroreport, 8, i-viii, (1997, Schneider, et al, Nat Med, 5, 554 -9, (1999)).
  • Irnrnediate early genes in particular play a role here (Atkins, et al, Stroke, 27, 1682-1687, (1996)), such as cox-2, (Nogawa, et al, J. Neurosci, 17, 2746-2755, ( 1997)), which was cloned in a similar screening process to M30. (Yamagata, et al, Neuron, 11, 371-86, (1993)).
  • a quantitative PCR was carried out using the LightCycler TM system (Röche Diagnostics, Mannheim). The cDNA content of the samples was normalized for the expression of cyclophilin.
  • Primers used to amplify cyclophilin were: cyc5 accccaccgtgttcttcgac acyc300 catttgccatggacaagatg and for the amplification of mouse M30 mouse_m30_s3 tactcacgacagcaacactg mouse_m30_a4 gttttttgatgaatcaaatcc. (SEQ ID NO 43 to SEQ ID NO 46)
  • SEQ ID NO 43 to SEQ ID NO 46 In fact, an up-regulation by a factor of 2 of M30-RNA is shown on the ischemic (left) hemisphere 2 hours after the ischemic event (FIG. 5). After 24 hours (in a permanent model), however, no difference could be determined.
  • the downstream transcription factor NF-kappaB appears to play a central role in cell death (Schneider, et al, Nat Med, 5, 554-9, (1999, Clemens, et al, Strafe, 28, 1073-1081, (1997, Lipton, Nature Med, 3, 20-22, (1997)).
  • M30 should play an important role in the pathogenesis of stroke.
  • the upregulation of M30 could either play a protective role here, e.g. in the desensitization of the IL-1 receptor system in a situation of IL-1 oversupply, such as in cerebral ischemia, or have a cell-damaging effect by increasing the activation of downstream systems (e.g. NF-kappaB, JNK, p38).
  • downstream systems e.g. NF-kappaB, JNK, p38
  • PARP is a substrate of the caspases that trigger death (caspase-3), and the degree of cleavage of P ARP by caspase-3 is regarded as a specific indicator of final steps in cell apoptosis (Konopleva M, Zhao S, Xie Z, Segall H, Younes A, Claxton DF, Estrov Z, Kornblau SM, Andreeff M (1999) Apoptosis. Molecules and mechanisms. Adv Exp Med Biol 457: 217-236 .; Duriez PJ, Shah GM (1997) Cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase: a sensitive parameter to study cell death. Biochem Cell Biol 75: 337-349).
  • the coding region of the m30 cDNA was cloned into the expression vector pCMVtag2 from Stratagene.
  • the N-terminus of the m30 cDNA was provided "in reading frame" with a flag epitope label.
  • an amplicon was generated on the plasmid m30-26 with the primers m30_Es_sl (GATC GAATTC TTT TCT CCT GAT CAA GAA; Seq ID NO 19) and m30_Sa_al (GATC GTCGAC GTC TAG AGG TCC TTG GAA; Seq ID NO 24), which was cut with the restriction enzymes EcoR ⁇ and Sall, and ligated into the pCMVtag2 vector. Subsequent sequencing demonstrated that the sequence of the flag-labeled m30 cDNA contained no undesired mutations.
  • COS-1 cells were removed from the culture dishes with trypsin and centrifuged. The cell pellets were resuspended in 300 ⁇ l electroporation buffer and then 7.5 ⁇ l IM MgSO 4 solution was added. Each 300 ⁇ l of this cell suspension was transferred to 1-5 ⁇ g plasmid DNA in 4 mm electroporation cuvettes (PEQLAB). The electroporation was carried out using a Gene-Pulser II (BIORAD) at 500 ⁇ F / 230V. The cells were then incubated with 5 ml of COS-1 medium in the incubator.
  • COS and PC12 cells were transiently transfected with the expression vector pCMVtag2, in which the cDNA had been cloned for m30.
  • the cells were exposed to 0 or 0.2 ⁇ M for five hours
  • the membranes were first blocked with 5% skimmed milk powder (fela Reform, NEUFORM) in PBS / 0.02% Tween20, then washed 3x 5min with PBS / 0.02% Tween20 and incubated for one hour at room temperature with the first antibody (COS cells: anti-cleaved PARP antibody, PROMEGA, 1: 800; PC12 cells: anti-cleaved PARP antibody (rat), CELL SIGNAL, 1: 1000). After washing three times with PBS / Tween 20, the blots were incubated with the second antibody (anti-rabbit antibody HRP-coupled, Dianova, 1: 5000) for one hour at room temperature. The detection was carried out with the SuperSignal chemiluminescence system from PIERCE according to the manufacturer's instructions on Hyperfilm-ECL (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH).
  • the proteins belonging to the m30 gene family are therefore not only specific
  • the cloning-compatible (EcoRI / XhoI) double-stranded cDNA fragments were size-selected (according to Hertseller / Stratagene) and ligated into the plasmid vector pBluescript SKII (Stratagene). The ligation was transformed by electroporation into E. coli (DH10B, Gibco) and amplified on LB ampicillin agar plates. The plasmid DNA was isolated by means of alkaline lysis and ion exchange chromatography (QIAfilter kit, from Qiagen). The complexity of single clones was 7 million for the murine brain cDNA library and 4 million for the fetal human brain cDNA library.
  • Oligonucleotides used to isolate the murine cDNAs mM31-bio25
  • Oligonucleotides used to isolate the human cDNAs are:
  • the method used is based on a hybridization of biotin-labeled human or murine 9B5 oligonucleotides with 5 ⁇ g alkaline denatured plasmid DNA. In addition, 5 'and 3' located 40mer OHgonucleotides are hybridized. As a result, individual plasmid molecules were specifically labeled biotin, which contained either murine or human cDNAs.
  • the hybridization conditions were adopted by Sheperd and Rae ((NAR 1997 25 nol5 p3183-3185)).
  • the biotin-labeled plasmid molecules were enriched with magnetic streptavidin-coupled beads (according to the manufacturer's instructions, Dynal). After multiple washing steps, the m31-enriched plasmids were thermally detached from the magnetic beads (80 ° C., 2 min) and electrotransformed in E. coli (DH10B, Gibco). Transformant colonies were pooled and plasmid DNA isolated (QIAprep Mini Spin Columns, Qiagen). Plasmids containing M31 cDNA were repeatedly enriched by hybridization with the corresponding oligonucleotides.
  • Plasmid DNA was isolated from 36 each of the bacterial colonies of the second-round transformants and sequenced with primers flanking cDNA insert (T3 and T7 primers, pBluescript SK II, Stratagene). The cDNA inserts of plasmids containing m.31 mRNA sequence were completely sequenced with specific primers.
  • the derived murine mm31 mRNA sequences were created from a total of 3 overlapping cDNA clones, the corresponding human mRNA sequences (hm31) from five independent cDNA clones.
  • M31 is very homologous to M30 (see FIG. 8, alignment of M30 and m31 from rat or
  • the M30 cDNA sequence was used to perform a yeast two hybrid screen. This serves to detect those proteins that interact with the protein in question, the so-called bait protein (Fields et al. (1998), Nature 340, pp. 245-246).
  • a screen with the carboxy-terminal third of M30 (rat sequence) as bait protein was carried out using the ⁇ tc / zm ⁇ fer system from Clontech.
  • an M30 fragment from the rat clone m30-17 was amplified by PCR (fragment 3; Primer: m30ES-s3 GATC GAATTC TTC CCC AGC ATG AAG AGG and primer m30Sa al GATC GTCGAC GTC TAG AGG TCC TTG GAA) and in the vector pGBTIO ("bait vector") via the cloning sites EcoRI and Sall.
  • the screen was cloned with the " pretransformed human brain library "in the vector pACT2 (" Prey vector ”) (cat # HY4004AH). The mating method according to the manufacturer's instructions was used to transform the bait construct.
  • M32 SEQ ID NO 17
  • M30 interacts with M32 and possibly fulfills its function as a heterodimer.
  • Heterodimerization as a prerequisite for protein function has been demonstrated in many examples and can also be assumed here.
  • Designed oligonucleotides These amplified a fragment of the expected size, but it turned out to be a different sequence from M32 when sequenced.
  • a blast search (nucleotide search) of the EMBL database revealed several genomic disordered sequences which contained parts of M33.
  • the genomic sequences used were: AL355073, AC022462, HSC6461,
  • TM-pred predicts that M33 (human) is not a transmembrane protein.
  • the chromosomal location of M33 is on chromosome 14.
  • M33 also very likely interacts with M30, since the sequences are actually identical (at least in the carboxy-terminal area that should interact).
  • M33 is also able to form heterodimers with M30 and is most likely important for its function.
  • pellino was due to its interaction with pelle identifies Gr05 , 5 , / ⁇ n5 ', et al, Mech Dev, 81, 127-38, (1999)).
  • Pelle is a protein in the signal receptor cascade of the toll receptor that plays an important role in the embryonic development of Drosophila (centralization) fSe / v and Anderson, Annu Rev Cell Dev Biol, 12, 393-416, (1996)).
  • Pelle activates the ⁇ F-kB homolog dorsally in Drosophila.
  • the toll receptor system has developed from a system with few (known) components to a complex regulatory system in the mammal (Be / v and Anderson, Annu Rev Cell Dev Biol, 12, 393-416, (1996)). There are several great homologous receptors in the mammal (IL-1, IL-18, TLR-1, ). The most important receptor system is the interleukin-1 receptor, which plays a role in many pathological processes (Auron, Cytokine Growth Factor Rev, 9, 221-37, (1998)). Activation of this receptor also leads to activation of the transcription factor ⁇ F-kB, but via a signal transduction cascade with several proteins.
  • IRAK-1, IRAK-2, ⁇ RAK-M interleukin receptor-associated kinases
  • pellino is associated with pelle in the Drosophila system
  • the members of the M30 gene family should play an important role in mammals IL-1 signal transduction cascades play.
  • a functional influencing of the interleukin receptor-associated kinases IRAK-1, IRAK-2, IRAK-M
  • M30 can act on events located further downstream in the signal transduction cascade, which have a direct effect on the activation of the transcription factor ⁇ F-kB.
  • Possible sites of action are - the ⁇ IK kinase or IKK kinases (X «rz ' « , J Biol Chem, 274, 27339-42, (1999)).
  • M30 The signal transduction path and possible sites of action of M30 are shown schematically in FIG. 6. It is also conceivable that M30 is involved in a new signal path from the IL-1 or IL-18 receptor to MAP kinases (eg p38). This signal path has so far been less well characterized. Activation of the Jun ⁇ -terminal kinase (J ⁇ K) by IL-1 / IRAK is also discussed.
  • J ⁇ K Jun ⁇ -terminal kinase
  • NF-kappaB has also received special attention, as well as processes that activate it.
  • the cloning of the I-kappaB kinases was pursued with the aim of finding specific inhibitors for NF-kappaB-mediated gene transcription.
  • the pharmacological importance of NF-kappaB lies primarily in the fields of immune diseases, cancer, and neurological diseases.
  • the signal system II-1 / NF-kappaB can be influenced at the end points, the binding of the ligand to the II-1 receptor, for example, or the activation of NF-kappaB itself. A large number of molecular steps between these two points are essential for the functioning of the system and are also suitable for pharmacological interference.
  • Previously unknown molecules such as M30 can be of essential importance for the functioning of this system, as they are present, for example, in the common assays (eg cell transfection studies).
  • Transcriptional regulation i.e. Regulation of the amount of mRNA of a gene in the cell is an essential step for the cell's response to stimuli, in addition to protein phosphorylation, protein degradation, etc. M30 is obviously subject to very rapid regulation by transcriptional activation, as we have shown above. Such rapidly regulated genes often have critical key positions for cellular processes.
  • M30 can be pharmacologically influenced by the following approaches:
  • Protein interaction partners of M30 can be identified with the help of common interaction screening methods (eg yeast-two-hybrid system, screening of expression libraries with the lambda-gtll system, co-immunoprecipitations).
  • yeast-two-hybrid screen can be used, for example, using the Matchmaker system from Clontech.
  • the cDNA of M30 is cloned into a so-called bait vector (eg pGBTIO).
  • a library in the so-called Prey vector e.g. a fetal brain bank
  • Prey vector e.g. a fetal brain bank
  • Expression banks in the phage system can be screened using common protocols (Ausubel et al., Protocols in Molecular Biology, New York, 1997). After finding such a partner, an assay for a high-throughput screening system (HTS) can be set up. This can be used to find inhibitors for the interaction of M30 with its partner, which can reduce or deactivate the function of M30.
  • HTS high-throughput screening system
  • M30 and its interaction partner are cloned in fusion with mutants of green fluorescent protein (GFP), e.g.
  • GFP green fluorescent protein
  • BFP blue fluorescent protein
  • GFP green fluorescent protein, S65T mutant
  • CFP and YFP can also be used.
  • These fusion proteins are expressed in bacteria or other expression systems (baculoviruses, yeasts) and purified, for example via a polyhistidine tag and nickel columns. The two proteins are combined in a concentration in the range of 100 nM.
  • BFP is the donor (excitation at 389 nm) and GFP is the acceptor (emission at 511 nm).
  • the FRET effect occurs when the two proteins approach 50-10 angstroms.
  • the protein mixture can be pipetted into microtiter plates and incubated with substances from a chemical bank. It may also be advantageous to first pre-incubate the M30 fusion protein with the chemical substance and then to add the interaction partner. An inhibition of the interaction can then be determined by a decrease in the FRET effect (measurement with photomultipliers or spectrophotometer).
  • FRET effect measure with photomultipliers or spectrophotometer.
  • An implementation of a high-throughput screening system using the FRET effect is described in (Mere, et al, Drug Discov Today, 4, 363-369, (1999)). In principle, this test system can also be carried out in cells; this may be necessary. In principle, an HTS system can also be established using the SPA (scintillation proximity assay) (from Amersham).
  • a peptide from the interaction partner of M30 would be coupled to SPA beads.
  • a fusion protein from M30 and the consensus phosphorylation site of protein kinase-A (sequence RRASV) and a purification day (eg polyhistidine day) can be produced and purified.
  • the M30 fusion protein can be labeled with 33P by incubation with protein kinase A and 33P-ATP.
  • the SPA beads can be incubated in microtiter format with substances from a combinatorial library. After the addition of the M30 fusion protein, the scintillation that results from the binding of the 33P-labeled M30 fusion protein to the SPA bead can be measured. An inhibitor of the interaction would suppress the scintillation effect.
  • Similar assays which are based on the principle of an interaction inhibition, are in principle equivalent and can also be used.
  • these assay systems can be used to find inhibitors of heterodimerization of M30 family members (e.g. M30 and M32).
  • PCR reactions were carried out with the following primer pairs using the plasmid m30-26 as a template:
  • the oligonucleotide pair was used for the amplification of the fragment m30_l_pGADT7 (n-terminal, Fragl.SEQ in FIG. 11) by means of PCR, which comprises the amino-terminal 525 bp m30_Es _sl (GATC GAATTC TTT TCT CCT GAT CAA GAA; Seq ID NO 19) and m30_Sa_a2 (GATC GTCGAC GGA CGT CTT CCA TTT GGC; Seq ID NO 20).
  • oligonucleotide pair m30_Es_s2 (GATC GAATTC GCC AAA TGG AAG ACG TCC; Seq ID NO 21 ) and m30_Sa_a3 (GATC GTCGAC CCT CTT CAT GCT GGG GAA; Seq ID NO 22).
  • fragment m30_4_pGADT7 full length, Frag4.SEQ in FIG. 11
  • oligonucleotide pair m30_Es_sl GATC GAATTC TTT TCT CCT GAT CAA GAA
  • m30_Sa_al GATC GTCGAC GTC TAG AGG TCC TTG GAA
  • the oligonucleotide pair m30_Es_sl (GATC GAATTC TTT TCT CCT GAT CAA GAA) and m30_Sa_a3 (GATC GTCGAC CCT CTT CAT GCT GGG GAA) used.
  • PCR fragments were purified using the Qiagen-Qiaquick protocol according to the manufacturer's instructions, and after cutting with EcoRI and Sall in the Prey- Nector pGADT7 from Clontech ligated. The error-free sequence of the clones obtained was confirmed by sequencing on both nucleotide strands.
  • the PCR product thus obtained was digested with the restriction enzymes Ncol and EcoRI and ligated into the linearized berit vector pGBKT7.
  • the PCR-generated regions of the construct were sequenced from both sides.
  • the yeast co-transformations in HE7c strains were carried out according to the following protocol:
  • the yeast cells After growth of an ee colony in a final volume of 50 ml YPD at 30 ° C up to an OD 600 of 0.5-0.6, the yeast cells are centrifuged off at 3000 rpm for 5 min. The cell pellet is washed with 25 ml ⁇ 2 O, then the yeast cells are pelleted again. The pellet is washed with 2.5 ml HO and pelleted again. The yeast cells are then washed with 5 ml of lithium solution (100 mM Li acetate in TE buffer (pH 7.6)). The pellet is taken up in 250 ul of the lithium solution.
  • lithium solution 100 mM Li acetate in TE buffer (pH 7.6)
  • Approximately 1 ⁇ g of the bait plasmid is mixed with 1 ⁇ g of the pre-plasmid, 50 ⁇ g of denatured genomic DNA from herring sperm, 50 ⁇ l of the yeast cell suspension, and 300 ⁇ l of a PEG solution (40% PEG MW 3500, 0.1 M LiAcetat, 1 x TE (pH 7.6)) incubated for 30 min at 30 ° C. The mixture is then incubated at 42 ° C. for 10 min and occasionally inverted. After that the Mixture heated to 4 ° C. for 1 min, and then pelleted by centrifugation (10,000 rpm, 20 sec).
  • a PEG solution 50% PEG MW 3500, 0.1 M LiAcetat, 1 x TE (pH 7.6)
  • the pellet is washed twice in 1 ml HO, and then resuspended in 50 ul HO, and then plated on agar selection plates without tryptophan and without leucine (“-trp-leu”) and additionally without histidine (“-trp-leu-his”) ,
  • the ⁇ -galactosidase staining was carried out according to the following protocol:
  • a replica impression is taken from the yeast colonies on a nitrocellulose filter (Schleicher and Schuell). After drying briefly, the filter is transferred to liquid nitrogen to break open the cells. The filters are then incubated at 30 ° C in a solution with X-Gal. Depending on the strength of the interaction, the positive colonies turn blue after a few minutes to a few hours.

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Abstract

Die Erfindung betrifft unter anderem ein Verfahren zur Diagnose neurodegenerativer Erkrankungen, bei dem die Konzentration eines Proteins, das Ähnlichkeiten mit dem Protein Pellino besitzt, oder eines Säugetier-Homologes dieses Proteins oder eines Muteins dieses Proteins, das über einen Bereich von 50 Aminosäuren seiner Aminosäuresequenz eine Sequenzidentität mit einer der Sequenzen von über 60 % aufweist, in einer Körperprobe bestimmt wird. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung von Liganden, die an M30 und seine Homologen binden, sowie die Verwendung von funktionalen Inhibitoren zur Herstellung eines Arzneimittel zur Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen. Desweiteren betrifft die Erfindung ein Screening-Verfahren zur Identifikation und/oder zur Charakterisierung von funktionalen Inhibitoren und/oder von Liganden von M30 oder einem Homologen von M30.

Description

Die M30-Genfamilie und ihre Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft die M30-Genfamilie und die Verwendung der Gene und Genprodukte. Der Schlaganfall wird heute zunächst durch die eingehende neurologische Untersuchung festgestellt. Häufige Symptome sind: Lähmung, Sprachstörung, Sehstörung. Danach erfolgt eine radiologische Untersuchung mit Computertomographie (CT) oder Magnetresonanztomographie (MR). Die letztere Untersuchung setzt sich trotz höherer Kosten durch, da sie eine höhere Auflösung und die Bestimmung zusätzlicher Parameter erlaubt. Besonders für die Schlaganfalldiagnostik interessant sind dabei die Diffusions- und Perfusions-gewichteten Aufnahmen. Diese Techniken erlauben es, neben der akuten Ausdehnung des Schlaganfalls auch das Gebiet zu bestimmen, das unter einer relativen Mangeldurchblutung leidet und wahrscheinlich in der weiteren Ausdehnung des Schlaganfalls liegen wird („area at risk"). Ebenso erlauben die MR- Techniken eine sehr frühe Diagnose des Infarktgebietes, das im CT erst später sicher beurteilbar wird.
Darüber hinaus wurde festgestellt, daß bestimmte Proteinmarker wie die astrozytären Proteine S100 und GFAP bei Schlaganfall im Liquor cerebrospinalis vermehrt auftreten. Auch die Konzentration des Neurofilaments NFL scheint bei einer Anzahl neurodegenerativer Erkrankungen im Liquor erhöht zu sein. Es sind überdies auch negative Marker bekannt. So korreliert die intrathekale Konzentration einer Anzahl von Peptiden (z. B. Fas, 116, Illbeta) negativ mit der Infarktausdehnung. In jüngster Zeit haben es Fortschritte in den Mikrodialysesonden erlaubt, dieses Hilfsmittel für die Nerlaufsbeurteilung von Patient mit Hirnschädigung auf der Intensivstation einzusetzen. Die bisher bekannten Proteinmarker weisen jedoch den Nachteil auf, daß ihre Konzentration nur bei einem sehr begrenzten Bereich mit der Schwere der Krankheit korreliert, so daß eine Nielzahl von Markern verfolgt werden muß, um zu einer abgesicherten Diagnose des Krankheitsverlaufs zu kommen.
BESTÄTIGUΝGSKOPIE Es ist folglich Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Proteinmarker für den Liquor cerebrospinalis anzugeben, welcher das Ausmaß neuronaler Schädigung umfassend anzeigt und sich als diagnostischer Marker für den Schlaganfall eignet. Weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, einen diagnostischen Marker für Krebs, insbesondere Ovarialkrebs, anzubieten.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung liegt darin, Strategien für die Therapie neurodegenerativer Erkrankungen aufzuzeigen.
Die Aufgabe wird zum einen gelöst durch ein Nerfahren zur Diagnose neurodegenerativer Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration eines Proteins, aufweisend eine der Sequenzen SEQ ID ΝO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, oder eines Säugetier- Homologen dieses Proteins oder ein natürlichen Säugetiermuteins dieses Proteins, das über einen Bereich von 50 Aminosäuren seiner Aminosäuresequenz eine Sequenzidentität mit einer der Sequenzen von über 60 % aufweist, in einer Körperprobe bestimmt wird.
Die Sequenzen ergeben sich gemäß Tabelle 1 aus dem Sequenzprotokoll.
Tabelle 1
Figure imgf000004_0001
(erste Spalte: Nummer gemäß Sequenzprotokoll, zweite Spalte: Bezeichnung des Proteins, dritte Spalte: Variante des Proteins, vierte Spalte: Typ der Sequenz, fünfte Spalte: Organismus, aus welchem die Sequenz stammt).
J Der Begriff des Säugetier-Homologen besagt im vorgenannten Kontext, daß das Protein natürlich (das heißt nicht-rekombinant) in einem Säugetierorganismus vorhanden ist und mit einer der Sequenzen SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 über einen Bereich von
60 Aminosäuren eine Sequenzidentität von über 60 % aufweist. Bevorzugt weist das
Homologe eine Sequenzidentität von 60%, 70%, 80% oder 90% über einen Bereich von
60, 80, 100, 189, 300, 400 Aminosäuren beziehungsweise über seine ganze Länge auf. Der Begriff des natürlichen Säugetiermuteins besagt im vorgenannten Kontext, daß das Protein natürlich in einem Säugetierorganismus vorhanden ist und eine Abwandlung eines Wildtypproteins darstellt (Mutein = imitiertes Protein) und mit einer der Sequenzen SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 über einen Bereich von 60 Aminosäuren eine Sequenzidentität von über 60 % aufweist. Bevorzugt weist das natürliche Säugetiermutein eine Sequenzidentität von 60%, 70%, 80% oder 90% über einen Bereich von 60, 80, 100, 189, 300, 400 Aminosäuren beziehungsweise über seine ganze Länge auf.
Der Begriff der Sequenzidentität bezieht sich auf die Aminosäuresequenz und basiert auf dem Algorithmus von Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990, insbesondere auf dem Programm Megalign (DNAstar, Lasergene, Madison, Wisc. U.S.A.), wobei folgende
Parameter zu verwenden sind: gap penalty 10, gap length penalty 10
Pairwise Alignment
K-tuple 1 gap penalty 3 window 5 diagonals saved 5
Bei dem Berechnung der Sequenzidentität gehen nur Sequenzabschnitte der angegebenen
Größe ein.
Proteine, aufweisend eine der Sequenzen SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, oder ein Säugetier-Homologes dieses Proteins oder ein> natürliches Säugetiermutein dieses Proteins, das über einen Bereich von 50 Aminosäuren seiner Aminosäuresequenz eine
Sequenzidentität mit einer der Sequenzen von über 60 % aufweist, werden im folgenden
Mitglieder der M30-Genfamilie genannt.
Der Begriff des Gens ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgängig im weitesten Sinn zu verstehen. Erstens ist ein Gen der Abschnitt auf dem Genom, der für ein Protein, das primäre Genprodukt, codiert und der Informationen für die Gewebespezifität,
Zellcyclusabhängigkeit und Umfang der Transkription des Genprodukts aufweist. Zur Regulation der Transkription des primären Genproduktes sind abgesehen von den zu dem Gen gehörenden Regulationssequenzen weitere Proteine notwendig, deren Sequenz zum Teil ebenfalls von dem Gen codiert und deren Transkription ebenfalls von Regulationssequenzen des Genes gesteuert werden kann (aber nicht muß). Dies bedeutet, daß der Begriff des Gens den die Transkription der Sequenz des primären Genprodukts steuernden Promotor und gegebenenfalls weitere Regulationssequenzen (wie Enhancer) mitumfaßt. Zweitens umfaßt der Begriff des Gens alle Nukleinsäuren, die durch Spleißen des Gen entstehen sowie ihre vermittels reverser Transkriptase erstellten cDNA- Transkripte. Drittens umfaßt der Begriff des Gens die vollständig gespleißte, gegebenenfalls polyadenyierte mRNA und daraus hervorgehende cDNA. Das Gen weist also codierende und nicht-codierende Sequenzabschnitte auf, die je nach dem, ob sie vor oder hinter dem offenen Leseraster des primären Genproduktes in 5'->3' Orientierung liegen, 5'-nichttranslatierte oder 3'-nichttranslatierte Bereiche heißen. Das offene Leseraster des primären Genprodukts eines Gens wird auch als Strukturgen bezeichnet.
Die RNA-Produkte des Gens M30 werden nach Induktion eines maximalen Elektroschocks (MECS) im Gehirn von Ratten verstärkt exprimiert und konnten durch ein modifiziertes differentielles Klonierungssystem (Suppression Subtractive Hybridization SSH) kloniert werden. Dabei wird ein Elektroschock, der zu einem Krampfanfall führt, insgesamt fünfmal wiederholt; gleichzeitig wird ein Translationsblocker (Cycloheximid) gegeben, der den Regulationseffekt verstärkt. Dieses experimentelle System erlaubt die effiziente Identifikation von sogenannten „immediate early genes", die häufig kritische Regulationselemente in Signaltransduktioftswegen darstellen (wie Lernvorgänge, Gedächtnis, synaptische Transmission, Yamagate et al., Neuron, 11, 371-86, 1993; Xiao, et al., Neuron, 21, 707-16, 1998; Brakeman, et al., Nature, 386, 284-8, 1997; WO 99/40225).
Die Expression von M30 wird ebenfalls durch Stimuli induziert, die mit neuronaler Schädigung assoziiert sind. Eine Induktion der M30-Transkriptmenge im Hippocampus der Ratte wurde ebenfalls nach Gabe von Kainat beobachtet, einem Stoff der zur Übererregung glutamaterger Synapsen führt, und Zelltod auslösen kann. Ebenso wird die M30-Transkriptmenge nach fokaler Ischämie der Maus erhöht, die bei Mäusen ausgelöst wird, um einen Schlaganfall zu simulieren.
Zumindest im Falle des Menschen ist es nicht korrekt von dem M30-Protein bzw. dem M30-Transkript zu sprechen, vielmehr existieren vier verschiedene Transkripte, die jeweils unterschiedliche Exone umfassen (Variante A und B bzw. Variante C und D codieren jeweils für dasselbe Protein). Daneben gehören noch weitere Proteine M31, M32 und M33 zur selben Proteinfamilie wie sich aus der Zusammenstellung der Sequenzen ergibt.
Es ist anzunehmen, daß die erfindungsgemäßen weiteren Homologen der M30-Genfamilie ein sehr ähnliches Expressionsmuster wie M30 zeigen und daß sie nach MECS- Stimulation, Kainatinjektion oder nach Hervorrufen einer fokalen Ischämie gleichermaßen hochreguliert werden. M31 unterscheidet sich von den anderen Vertretern derselben Genfamilie dadurch, daß es darüber hinaus eine sehr hohe Expression in Ovarialtumoren zeigt.
Bei der im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zu untersuchenden Körperprobe handelt es sich bevorzugt um den Liquor cerebrospinaHs, der eine relativ wenig invasive
Messung der Proteinkonzentration ermöglicht. Ferner kann es sich bei der die Körperprobe auch um Blut handeln. Zwar verhindert in der Regel die Blut-Hirn-Schranke den Übertritt der Proteine in die Blutbahn. Neurodegenerative Erkrankungen gehen aber zum Teil mit einer partiellen Durchlässigkeit der Blut-Hirnschranke einher. Abgesehen von der bevorzugten humoralen Analyse können auch Hirn-Biopsien
Gegenstand der Untersuchungen sein. In diesem Fall wird das Präparat in der Regel histologisch untersucht werden, so daß weniger die Proteinkonzentration sondern vielmehr der Status der Überexpression durch immunocytochemisches Anfärben des Proteins oder seines Transkriptes im Vergleich mit Proben gesunder Menschen bestimmt wird. Der Begriff der Bestimmung der Proteinkonzentration ist im Rahmen des erfindungsgemäßen
Verfahrens entsprechend weit zu verstehen. Es ist klar, daß sich im Liquor cerebrospinaHs nur die Mitglieder der M30-Genfamilie nachweisen lassen, die auch vor Eintritt des neurodegenerativen Prozesses im ZNS des jeweiligen Patienten vorhanden waren. Handelt es sich bei dem Patienten um einen Menschen, so können nur die Konzentration von menschlichen Homologen oder gegebenenfalls pathologische oder nicht-pathologische Muteine dieser menschlichen Homologen Gegenstand der Untersuchungen sein. Die Messung der Konzentration der Mitglieder der M30-Genfamilie im Liquor cerebrospinaHs erfolgt durch übliche Methoden, z.B. durch Einsatz polyklonaler, monoklonaler oder rekombinanter Antikörper z.B. im Rahmen eines ELISA-Experiments (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) eines FIA- Experiments (Flow Induction Analysis) oder eines anderen Biosensors (Chemical Sensors and Biosensors for Medical and Biological Applications. Ursula E. Spichiger-Keller (1998) Wiley/VCH, Weinh.; ISBN:3527288554; Biosensoren (Biotechnologie) Elizabeth A.H. Hall (1994) Springer-Verlag Berlin, Heidelberg; ISBN: 3540574786) oder durch im Rahmen quantitativer analytischer Affϊnitätschromatographie bzw. quantitativer Affinitätskapillarelektrophorese .
Ein anderer Ansatz besteht darin, die Fähigkeit der Mitglieder der M30-Genfamüie mit anderen Wechselwirkungspartnern supramolekulare Komplexe zu bilden, zur Konzentrationsbestimmung auszunützen. So ist M30 in der Lage mit M32 ein Heterodimer zu bilden. Diese Eigenschaft könnte im Rahmen einer quantitativen analytischen Affmitätschromatographie ausgenutzt werden, indem man den einen Wechselwirkungspartner oder die für die Interaktion mit dem anderen Partner wichtigen Sequenzabschnitt auf einer Säule immobilisiert. Auf eine ähnliche Weise könnte auch eine quantitative Affinitätskapillarelektrophorese; durchgeführt werden, bei man einen Wechselwirkungspartner oder die für die Interaktion mit dem anderen Partner wichtigen Sequenzabschnitt mit der Kapillarmatrix kovalent verbindet.
Im übrigen kann die Messung der Konzentration des betreffenden Proteins auch indirekt über die Messung der Konzentration des für das Protein codierende Transkript erfolgen, da
Protein- und Transkriptkonzentration in der Regel korreliert sind. Probleme können sich allenfalls aufgrund der begrenzten Stabilität der Transkripte im Liquor cerebrospinaHs ergeben. Diese fallen aber je nach Art der neurodegenerativen Erkrankung mehr oder weniger ins Gewicht; zumindest für akut verlaufende neurodegenerative Erkrankungen wie Schlaganfall ist diese Methode anwendbar. Die Bestimmung der Transkriptkonzentration erfolgt am einfachsten mit quantitativer PCR (Polymerase Chain Reaction). Folglich umfaßt die Ausdruck Bestimmung die Konzentration eines Proteins im Liquor cerebrospinaHs auch die Bestimmung der Konzentration des für das Protein codierenden Transkripts.
Die Diagnose erfolgt im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens durch Vergleich der Konzentration des zu untersuchenden Proteins in der Körperprobe mit dem Wert aus Proben gesunder Menschen ohne Befund. Je höher der ermittelte Wert, desto höher das Ausmaß der neurodegenerativen Zellschädigung. Das erfϊndungsgemäße Verfahren ermöglicht folglich eine Verlaufskontrolle, also die Verfolgung des Ausmaßes neurodegenerativer Schädigung in Echtzeit oder mit nur geringer zeitlicher Verzögerung. Damit eignet sich das erfmdungsgemäße Verfahren insbesondere, um die Therapie von intensivmedizinisch betreuten Patienten dem Krankheitsverlauf anzupassen. Das erfϊndungsgemäße Verfahren eignet sich auch zur Überprüfung der Wirkung von Pharmaka zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen entweder direkt am behandelten Patienten oder im Tiermodell. Dementsprechend bezieht sich das erfindungsgemäße Verfahren sowohl auf Körperproben aus Tieren als auch auf Körperproben auf Menschen. In der Regel wird es sich bei den Tieren um Säugetiere handeln, speziell um Säugetiere die sich als Versuchstier etabliert haben (Ratten, Mäuse, Kaninchen, Hunde usw.).
Der Begriff neurodegenerative Erkrankung ist' im weitesten Sinne zu verstehen. Er umfaßt auch neuroinflammatorische Erkrankungen, wenn sie, wenn auch nur temporär, mit einem Untergang von Neuronen verbunden sind.
Neurodegenerative Erkrankungen sind folglich chronische Krankheiten wie Fragiles X- Syndrom, Morbus Huntigton und anderen Krankheiten aus dem Formenkreis der Tripletexpansionskrankheiten (trinucleotide repeat expansion abnormalities; Kirkwood SC et al, Arch Neurol 2000 Jul; 57(7): 1040-4; Oharal K, et al., Psychiatry Res 2000 M 17; 94(3):257-62), ALS (Amyotrophic Lateral Sclerosis), olivo-ponto-cerebelläre Degeneration Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und Multiple Sklerose. Bei diesen Krankheiten kann mit Hilfe des erfmdungsgemäßen Verfahrens das Fortschreiten der Neurodegeneration beobachtet werden, was eine entsprechende Adaption der Therapie ermöglicht. Dies ist um so einfacher möglich, da bei diesen Krankheiten ohnehin häufig Liquorproben entnommen werden.
Neurodegenerative Erkrankungen sind ferner akut verlaufende Krankheiten wie Schlaganfall oder auch Schädel-Hirn Traumata sowie entzündliche Erkrankungen des Hirns wie Meningitis oder auch Epilepsie. Diesen Krankheiten ist gemeinsam, daß sie mit dem Untergang von Neuronen einhergehen. Dieser Untergang läßt sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sicher diagnostizieren und zeitlich verfolgen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Protein, aufweisend eine Sequenz SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10 12, 14, 16, 18 oder ein Homologes oder Mutein desselben, das über einen Bereich von 189 Aminosäuren eine Sequenzidentität mit einer der Sequenzen SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10 12, 14, 16, 18 von größer 55 %, vorzugsweise mit SEQ ID NO 16 von größer 81 % oder mit SEQ ID NO 14 von größer 69 % aufweist oder ein Fusionsprotein eines solchen Proteins mit einem anderen Protein darstellt.
Bei dem Homologen handelt es sich um ein natürliches (das heißt nicht-rekombinantes) Protein, welches in einem Organismus vorhanden ist und über einen Bereich von 189 Aminosäuren eine Sequenzidentität mit einer der Sequenzen von größer 55 % (insbesondere 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%), vorzugsweise mit Sequenz SEQ ID 16 eine Sequenzidentität von größer 81 % oder mit SEQ ID NO 14 von größer 69 % aufweist. Bevorzugt weist das Homologe eine Sequenzidentität mit Sequenz SEQ ID 16 von 83%, 85%, 90% oder 95% oder mit Sequenz SEQ ID 14 von größer 69%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% auf. Der Bereich, der in der Berechnung der Sequenzidentität eingeht, beträgt 189, 250, 300, 350 oder 400 Aminosäuren oder die ganze Länge der Aminosäuresequenz.
Bei dem Mutein handelt es sich um ein natürliches oder rekombinantes Protein, welches in einem Organismus vorhanden ist und über einen Bereich von 189 Aminosäuren eine Sequenzidentität mit einer der Sequenzen von größer 55 % (insbesondere 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%), vorzugsweise mit Sequenz SEQ ID 16 eine Sequenzidentität von größer 81 % oder mit SEQ ID NO 14 von größer 69 % aufweist. Bevorzugt weist das Mutein eine Sequenzidentität mit Sequenz SEQ ID 16 von 83%, 85%, 90% oder 95% oder mit Sequenz SEQ ID 14 von größer 69%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% auf. Der Bereich, der in der Berechnung der Sequenzidentität eingeht, beträgt 189, 250, 300, 350 oder 400 Aminosäuren oder die ganze Länge der Aminosäuresequenz.
Bei dem Fusionsprotein handelt es sich um ein Protein aufweisend eine Sequenz SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10 12, 14, 16, 18 oder ein Homologes oder Mutein nach der vorgenannten Definition welches mit einem anderen Protein wie dem GFP (GenBank Accesion Number BAB11884) oder einem Oligopeptid wie einem Hexahistidin- Anker fusioniert ist. Dies geschieht in der Regel mit bekannten rekombinanten Methoden.
Die Sequenzen SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10 12, 14, 16, 18 sind neu. Das Protein Pellino aus Drosophila (GenBank Accesion Number, AF091624) stellt möglicherweise ein Homologes dieser Proteine dar, das aufgrund seine Assoziation mit dem Protein pelle identifiziert wurde (Grosshans et al, Mech Dev, 81, 127-38, (1999). Pelle ist assoziiert mit dem Toll / Dorsal Signaltransduktionsweg, der seine analoge Entsprechung im Interleukin-1- Signaltransduktionsweg der Säugetiere hat (Auron, Cytokine Growth Factor Rev, 9, 221- 37, 1998). Ferner ist ein Protein bekannt, das sich von dem Protein M30,D (SEQ ID NO 10) durch eine Aminosäure unterscheidet (GenBank Accesion Number, AJ278859). Dieses Protein wurde bisher für das menschliche Homologe von Pellino gehalten.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Protein, dessen Transkript mit einer Sonde umfassend einen Sequenzbereich aus den Sequenzen SEQ ID NO 17, 15 13, 11, 9, 7, 5, 3, 1 unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
Unter Transkript wird die zu dem entsprechenden Protein gehörende mRNA oder cDNA verstanden. Das Transkript des erfindungsgemäßen Proteins hybridisiert unter stringenten Standardbedingungen mit einer Sonde, die einen Sequenzbereich aus den Sequenzen SEQ ID NO 17, 15 13, 11, 9, 1, 5, 3, 1 umfaßt. Zur Hybridisierung sind kurze Oligonukleotide von etwa 17 bis 20 Basenpaaren Länge als Sonden zu verwenden. Diese Sonden sollten die konservierten Bereiche der Sequenzen SEQ ID NO 17, 15 13, 11, 9, 7, 5, 3, 1 umfassen. Es ist aber nicht nötig und in der Regel nicht besonders vorteilhaft, daß die für ein Hybridisierungsexperiment verwendeten Sondenmoleküle eine einheitliche Sequenz aufweisen. Sie können auch durch Primerextension von Restriktionsfragmenten unter Verwendung von Primern mit Zufallssequenzen und einer Polymerase (wie Klenow-DNA- Polymerase) gebildet werden und im statistischen Mittel eine Länge von 17 bis 20 Basenpaaren aufweisen. Der Einsatz von einzelsträngigen RNA- oder DNA-Sonden oder doppelsträngigen DNA-Sonden ist im Rahmen der vorgenannten stringenten Bedingungen möglich. Der Einsatz der vorgenannten Sonden aus Primerextensionsreaktionen ist bevorzugt.
Hybridisierung unter stringenten Standardbedingungen bedeutet im Rahmen der Erfindung:
Die Hybridisierung erfolgt in modifiziertem Church-Puffer (EDTA 1 mM, NaH2PO4pH 7,2, 0,5 M, SDS 7 %), - Die DNA befindet sich auf einer Nylon-Membran (z.B. ZetaProbe der Fa. BioRad).
Die Nylonmembran wird ca. 30 min prehybridisiert,
Danach wird eine markierte in Puffer gelöste Sonde für 24 h zugegeben,
Die Hybridisierung erfolgt bei 65 °C (wenn die Sequenz der Sonde aus derselben Organismenart entstammt wie die zu suchende DNA) oder bei 60°C (wenn die Sequenz der Sonde aus einer anderen Organismenart entstammt als die zu suchende
DNA),
Das Waschen der Membran erfolgt bei derselben Temperatur wie Hybridisierung, also bei 65°C bzw. 60°C für 20 mim in 5xSSC-Puffer, 0.1% SDS (SSC: siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology), für 20 min in lxSSC/ 0.1% SDS-Puffer, für 10 min in 0.5xSSC/0.1%SDS Puffer.
Dieses Protokoll kann in einzelnen Punkten abgewandelt werden solange die Stringenz der
Hybridisierung im wesentlichen erhalten bleibt. Informationen zur Hybridisierung kann der
Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Antikörper gegen ein Protein der M30- Genfamilie, insbesondere gegen ein Protein aufweisend eine der Sequenzen SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18.
Der Begriff Antikörper umfaßt sowohl polyklonale, monoklonale, humane oder humanisierte oder rekombinante Antikörper oder Antikörperfragmente, single chain Antikörper oder auch synthetische Antikörper aller Immunoglobulinklassen wie IgM, IgG, IgD, IgE, IgA oder ihrer Subklassen. Bevorzugt sind IgG und seine Subklassen wie beispielsweise IgGl, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 oder IgGM. Besonders bevorzugt sind die IgG Subtypen IgGl/k oder IgG2b/k. Der Begriff Antikörperfragmente umfaßt alle sich von Antikörpern herleitende Proteinkonstrukte mit einer oder zwei dem Antigen- komplementären Bindungsstellen, wie Antikörperteile mit einer den von leichter und schwerer Kette gebildeten Bindungsstelle wie Fv-, Fab- oder F(ab')2-Fragmente oder Einzelstrangfragmente. Bevorzugt sind verkürzte Doppelstrangfragmente wie Fv-, Faboder F(ab')2. Diese Fragmente können beispielsweise auf enzymatischem Wege durch Abspaltung des Fc-Teils der Antikörper mit Enzymen wie Papain oder Pepsin, durch chemische Oxidation oder durch gentechnische Manipulation der Antikörpergene erhalten werden.
Die Herstellung polyklonaler Antikörper durch Immunisierung eines Säugetiers mit dem Antigen oder einem Fragment davon ggfV unter Verwendung eines Adjuvans (wie Freund' sches Adjuvans) ist seit langem bekannt. Gleiches gilt für die aufwendigere Herstellung von monoklonalen Antikörpern aus Maushybridomazellen nach dem Verfahren von Köhler und Milstein (siehe z.B. J Immunol Methods 1995,186(l):17-25). Inzwischen lassen sich auch rekombinante Antiköper routinemäßig herstellen (siehe EP-B 0 368 684; Kipriyanow & Little, Molecular Biotechnology, Vol 12, 1999, 173-201). Es gibt mit fließenden Übergängen zwei Arten der Herstellung rekombinater Antikörper. Zum einen kann man von bereits mit dem Antigen oder einem Fragment davon immunisierten Zellen ausgehen, die variablen und ggf. die konstanten Bereiche amplifizieren und die erhaltene Sequenz in einen Vektor inserieren, der die übrigen noch benötigten konstanten Sequenzen enthält, so daß der mit Hilfe des Vektors produzierte rekombinante Antikörper ein Fusionsprotein, eine Chimäre darstellt. Diese Zellen können Hybridoma aus dem Verfahren nach Kohler & Milstein sein oder Lymphocyten, die aus einem Tier nach Immunisierung erhalten wurden. Zumindest im letzten Fall muß zum Erhalt eines Monoklons noch nach dem Antikörper mit der höchsten Affinität gesucht werden (Überblick: Harlow, E. and Lane, D. 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; Ausubel et al., (eds), 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York). Im einzelnen stellt sich die Isolation von Antikörpergenen wie folgt dar. Es werden Antikörper-produzierende Zellen angezogen und die mRNA bei ausreichender optischer Dichte der Zellen über Zellyse mit Guanidiniumthiocyanat, Ansäuern mit Natriumacetat, Extraktion mit Phenol, Chloroform/Isoamylalkohol, Fällungen mit Isopropanol und Waschen mit Ethanol aus den Zellen in bekannter Weise isoliert. Anschließend wird mit Hilfe der Reversen Transcriptase cDNA aus der mRNA synthetisiert. Die cDNA kann direkt oder nach genetischer Manipulation beispielsweise durch zielgerichtete Mutagenese, Einführung von Insertionen, Inversionen, Deletionen oder Basenaustausche in geeignete tierische, pilzliche, bakterielle oder virale Vektoren inseriert und in den entsprechenden Wirtsorganismen exprimiert werden. Bevorzugt werden bakterielle oder Hefe Vektoren wie pBR322, pUC18/19, pACYC184, Lambda oder Hefe-mu- Vektoren zur Klonierung der Gene und die Expression in Bakterien wie E. coli bzw. in der Hefe wie Saccharomyces cerevisiae.
Ein anderes Verfahren besteht in dem Durchsuchen einer natürlichen oder synthetischen Antikörperbibliothek. Eine solche Bibliothek kann zum Beispiel nach dem Verfahren nach US-A 5 840 479 erstellt werden, zum Beispiel durch Trinukleotidsynthese der variablen Bereiche.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Proteins der M30- Genfamilie zur Suche nach Liganden, die an diese Proteine binden, sowie diese Liganden selbst.
Ein Ligand ist im Rahmen der Erfindung ein Molekül eines Molekulargewichts von bis zu 100 bis 100000 Da, das an ein Protein der M30-Genfamilie mit einer Dissoziationskonstante von kleiner 1 μM bindet. Es kann sich also um ein kleines organisches Molekül von 200 bis 1000 Da handeln oder auch um ein erheblich größeres Polymer, wie ein Oligopeptid, Polypeptid oder Protein mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 100000 Da, insbesondere von 40000 bis 60000 Da. Vorzugsweise ist die Dissoziationskonstante des Ligand-Protein-Komplexes kleiner lOOμM, vor allem kleiner als 10 nM, insbesondere kleiner InM, wobei der Bindung in der Regel ein Bindungsgleichgewicht nach Scatchard zugrunde zu legen ist (C.R. Cantor und P.R. Schimmel, Biophysical Chemistry, W.H.Freeman and Company, San Francisco, Vol. III, Kapitel 15-3 und 15-4; ferner Scatchard, G, 1949, Ann. N. Y. Acad. Sei 51:660). Die Dissoziationskonstante wird mit Hilfe bekannter Methoden bestimmt. Entweder wird der Ligand markiert (z.B. radioaktiv) und es wird die Einstellung des Bindungsgleichgewichts direkt gemessen oder es wird die Verdrängung eines zweiten Liganden gemessen, dessen Dissoziationskonstante bekannt ist, um dann anhand bekannter mathematischer Beziehungen auf die Dissoziationskonstante des ersten Liganden zurückzurechen. Das letztere ist allerdings nur dann möglich, wenn die Dissoziationskonstanten beider Liganden nicht zu weit auseinanderliegen. Ein Testsystem könnte also wie folgt aussehen. M30 bindet an M32 oder an M33. Man könnte folglich eines von beiden Proteinen markieren und das jeweils andere Protein immobilisieren, um dann die Verdrängung des markierten Interaktionspartners messend verfolgen. Der Zerfall oder sonstige Strukturveränderungen des supramolekularen M30/M32-Komplexes oder des M30/M33 -Komplexes bei Zugabe eines putativen Liganden können auch mit üblichen physikalischen Meßverfahren verfolgt werden (z.B. NMR, Circulardichroismus, Lichtstreuung; siehe Cantor und Schimmel, am angegebenen Ort, Vol. II, Kapitel 8 und Galla, H ., Spektroskopische Methoden in der Biochemie, Thieme Verlag, Stuttgart, 1988 Kapitel 8 ). Weitere Proteine, die Wechselwirkungspartner von M30 oder anderen Mitgliedern der M30-Genfamilie darstellen und die von dem Begriff des Liganden mitumfaßt sind, können mit Hilfe des Yeast-Two-Hybrid-Systems ermittelt werden (so wie in einen Beispiel für M32 beschrieben). Die Verwendung des Yeast-Two-Hybrid-Systems zur Ermittlung von Liganden ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Außerdem könnte man die Interaktion beide Proteine im Rahmen des supramolekularen Komplexes mit FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer, siehe auch unter „Förster Theorie des Singlulett-Singulett Energietransfers", Cantor und Schimmel, am angegebenen Ort , Vol. II, Kapitel 8-2). Dies könnte wie folgt geschehen. M30 und sein Interaktionspartner könnten in Fusion mit Mutanten des Green Fluorescent Proteins (GFP) [z.B. BFP (blue fluorescent protein) GFP, CFP oder YFP (green fluorescent protein, S65T Mutante) (Mahajan, et al, Not Biotechnol, 16, 547-52, (1998)] kloniert werden. Im folgenden seien BFP und GFP beispielhaft herausgegriffen. Diese Fusionsproteine werden in Bakterien oder anderen Expressionssystemen (Baculoviren, Hefen) exprimiert und aufgereinigt, z.B. über einen Polyhistidin-Marker unter Verwendung von Nickelsäulen. Die beiden Proteine gibt man in einer Konzentration im Bereich von 100 nM zusammen. BFP ist hierbei der Donor (Excitation bei 389 nm) und GFP der Akzeptor (Emission bei 511 nm). Der FRET Effekt tritt bei Annäherung der beiden Proteine auf 50 - 10 Angström auf. Die Proteinmischung kann in Microtiterplatten pipettiert werden, und mit Substanzen einer chemischen Bank inkubiert werden. Dabei kann es auch von Vorteil sein, zunächst das M30-Fusionsprotein mit der chemischen Substanz vorzuinkubieren, und danach den Interaktionspartner zuzugeben. Eine Inhibition der Interaktion lässt sich dann über eine Abnahme des FRET-Effektes feststellen (Messung mit Photomultipliern oder Spektralphotometer). Eine Implementation eines High-throughput-screening Systems unter Ausnutzung des FRET-Effektes ist in (Mere, et al, Drug Discov Today, 4, 363-369, (1999)) beschrieben. Dieses Testsystem kann prinzipiell auch in Zellen erfolgen, unter Umständen ist dies erforderlich.
Die Suche nach neuen Liganden könnte auch im Rahmen eines HTS-Systems (High Throughput System), unter Benutzung des SPA (Scintillation Proximity Assays) (Fa. Amersham) durchgeführt werden. Dabei wird ein Peptid des putativen Interaktionspartners von M30 oder einem anderen Vertreter der M30-Genfamilie an SPA-beads gekoppelt. Ein Fusionsprotein aus M30 oder einem anderen Vertreter der M30-Genfamilie und der Konsensusphosphorylierungsstelle der Protein-Kinase-A (Sequenz RRASV) und einem Aufreinigungstag (z.B. Polyhistidintag) wird hergestellt und aufgereinigt. Durch Inkubation mit Proteinkinase A und 33P-ATP wird das M30 Fusionsprotein mit 33P markiert. Die SPA-beads können im Microtiterformat mit Substanzen aus einer kombinatorischen library inkubiert werden. Nach Zugabe des Fusionsproteins kann das radioaktive Signal, das durch die Bindung des P-markierten Fusionsproteins an den SPA- bead gebildet wird, gemessen werden. Die Zugabe eines Liganden würde die nach Durchführung der Waschschritte an den SPA-Beads meßbare Radioaktivität herabsetzen.
Auch mit Hilfe gängiger Interaktionsscreeningverfahren wie dem Yeast-Two-Hybrid System (Lottspeich und Zorbas, Bioanalytik, 1998, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg, Kapitel 34), dem Durchsuchen von Expressionsbibliotheken mit dem lambda-gtll -System und Co-Immunpräzipitationsverfahren können weitere Liganden der Proteine der M30-Genfamilie identifiziert werden. Ein Yeast-Two-Hybrid Verfahren kann beispielsweise unter Benutzung des Matchmaker-Systems der Clontech Laboratories GmbH Heidelberg, DE erfolgen. Dazu wird eine Nukleinsäure, codierend für ein Protein der M30-Genfamilie in einen sog. Bait-Vektor kloniert (z.B. pGBTIO). Eine Bibliothek aus einem sog. Prey-Vektor und verschiedenen darin enthaltenen Genstücken (z.B. eine in den Prey-Vektor einklonierte fötale Gehirnbank) kann dann nach einem Interaktionspartner durchsucht werden (siehe z.B. (Kuner, etal, Science, 283, 74-7, (1999))).
Die gestellte Aufgabe bezüglich neuer therapeutischer Strategien zur Therapie neurodegenerativer Erkrankungungen wird weiterhin dadurch gelöst, daß durch die erfindungsgemäße Interaktion zwischen M30 und Proteinkinasen der IRAK-Familie M30 und seine Homologen erstmals funktioneil mit Signaltransduktionswegen in Verbindung gebracht werden, die letztlich zum Zelltod führen. Weitere Beweise für einen Zusammenhang zwischen M30 und diesen Signaltransduktionswegen zeigt Beispiel 7, in dem ein vergleichender Apoptose-Assay für M30-transfizierte bzw. nicht mit M30 transfizierte Zellen durchgeführt wird. Bei einer gleichzeitigen Überexpression von M30 in der Zelle zeigte sich hierbei gegenüber den nicht überexprimierenden Kontrollzellen eine deutlich verstärkte Apoptose unter Einfluß von Staurosporin.
Aus diesen erfindungsgemäßen Daten läßt sich schließen, daß die Interaktion von M30 mit IRAK-1 bzw. seinen Homologen und Derivaten die Funktion dieser Proteinkinasen im Signaltransduktionsweg beeinflussen sollten. Weitere Liganden von M30, die durch ihre Bindung an M30 bestimmte Bereiche von M30 maskieren, könnten die Interaktion von M30 zu diesen Proteinkinasen (IRAK-Familie und ihre Homologen und Derivate) daher beeinträchtigen oder verstärken und somit letzlich das Ausmaß des neuronalen Zelltods unter Streßbedingungen beeinflussen.
Bestimmte Liganden von M30 eignen sich daher zur Herstellung von Arzneimitteln zur Therapie neurodegenerativer Erkrankungen, weil sie durch die Verstärkung bzw. Unterbindung der Interaktion zwischen M30 und IRAK- Kinasen bestimmte Signaltransduktionswege beeinflussen, die Apoptose- Vorgänge auslösen und verstärken können.
Solche Liganden zur Herstellung von Arzneimitteln zur Therapie neurodegenerativer Erkrankungen sind daher Gegenstand dieser Erfindung.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist die Verwendung der Interaktion von M30 mit Proteinkinasen, bevorzugt mit Proteinkinasen der IRAK-Genfamilie und ihrer Homologen und Derivate zur Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie neurodegnerativer Erkrankungen.
Unter Derivaten von Proteinkinasen der IRAK-Genfamilie werden insbesondere solche Mitglieder der Familie verstanden, die posttranslational modifiziert wurden.
Weiterhin sind auch Arzneimittel Gegenstand der Erfindung enthaltend einen funktionalen Inhibitor von M30 oder einem Homologen von M30. Unter solchen Inhibitoren werden Liganden verstanden, die an M30 binden und die die Funktion von M30 beeinflussen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung liegt in einem Screening-Verfahren zur Identifikation und/oder zur Charakterisierung' von funktionalen Inhibitoren von M30 oder einem Homologen von M30, umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellung von Zellen, die M30 oder eines seiner Homologen überexprimieren.
b) Behandlung dieser Zellen mit einer Apoptose-auslösenden Substanz, insbesondere mit Staurosporin, c) Behandlung eines Anteils der Zellen aus b) mit einer Substanz mit vermeintlicher InMbitor-Funktion bezüglich M30 oder bezüglich eines seiner Homologen, während die restlichen Zellen aus b) unbehandelt bleiben, d) Durclrführung eines vergleichenden Apoptose-Assays bei Extrakten aus Zellen, die nach c) mit einem Inhibitor-Kandidaten bzw. nicht mit einem Inhibitor-Kandidat behandelt wurden, wobei die Behandlung der Zellen nach b) gleichzeitig mit der Behandlung nach c) oder die Behandlungen nach b) und c) in beliebiger Reihenfolge nacheinander erfolgen können.
In Beispiel 14 wird das Yeast-Two-Hybrid-System für Kotransformationsexperimente zum Nachweis einer Protein/Protein-Interaktion zwischen m30 mit Proteinkinasen des 111- Signaltransduktionsweges genutzt. M30 wurde hierbei in den sogenannten Prey-Vektor einkloniert, während in den Bait- Vektor entweder die Proteinkinase pelle aus Drosophila oder aber der humane IRAKl -Rezeptor (interleukin-receptor-associated-kinase 1) einkloniert wurde. Protein/Protein-Interaktionen konnten mit Hilfe des yeast-two-hybrid- assays zwischen m30 und pelle detektiert werden. Die Interaktion von M30 mit IRAK-1 ist schwächer als die mit pelle und läßt sich nur mit den N-terminalen zwei Dritteln des M30- Leserasters nachweisen. Das spricht dafür, daß der wahre Interaktionspartner von m30 entweder eine posttranslational modifizierte Version von IRAK-1 oder aber eine zu IRAK- 1 homologe Kinase ist.
Die erfindungsgemäße Interaktion von M30 mit IRAK-ähnlichen Proteinkinasen beeinflusst in der Regel die Funktion der IRAK-ähnlichen Proteinkinasen, indem sie die Interaktion dieser Kinasen mit anderen Proteinen, z.B. Phosphorylierungstargets beeinflussen, oder die Aktivierung der Kinas'e-Funktion beeinflussen können. Durch die beschriebene Dimerisierungsfunktion von M30-Familienmitgliedern ist beispielsweise eine Aktivierung der Kinasen durch Approximierung und gegenseitige Phosphorylierung möglich. Die M30-Liganden pelle und deren humane Analoga aus der IRAK-Familie, sowie deren Derivate, insbesondere aber IRAKl, sind somit ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Das Durchsuchen von Expressionsbanken im lambda-gtll -System und anderen Phagensystemen kann anhand gängiger Protokolle (Ausubel et al., Protocols in Molecular Biology, New York, 1997) erfolgen. Ähnliche Assays, die auf dem Prinzip einer Interaktionsinhibiton beruhen, sind für den hier verfolgten Ansatz gleichwertig, und können ebenfalls eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Liganden, insbesondere die Liganden pelle und die Proteinkinasen der IRAK-Familie, beeinflussen in der Regel die Funktion der Proteine der M30- Genfamilie, indem sie die Konformation der Proteine und Proteinkomplexe verändern oder Bindungsstellen für andere Liganden maskieren (z.B. durch sterische Hinderung oder durch Änderung des Hydrophobizitätsverhaltens einer Domäne bzw. des ganzen Proteins oder Proteinkomplexes oder durch elektrostatische Abstoßung). Diese Beeinflussung kann mit einer Inhibierung oder Aktivierung bestimmter Funktionen der Proteine der M30- Genfamilie einhergehen. Die auf diese Weise gefundenen Liganden, insbesondere aber die Liganden pelle und die Proteinkinasen der IRAK-Familie, können für die Herstellung von Medikamenten benutzt werden, die gegen neurodegenerative Erkrankungen und/oder Erkrankungen des Immunsystems und/oder gegen Karzinome oder Sarkome einsetzbar sind. Unter Erkrankungen des Immunsystems sind insbesondere Autoimmunerkrankungen, Atopien und Allergien, insbesondere mit Lungenbeteiligung wie Asthma bronchiale, Infektion durch HIV oder durch andere immunotrope Viren, akute und chronische lymphatische Leukämien, akute und chronische myeloische oder lymphatische Leukämien, primär chronische Polyathritis, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa zu verstehen. Karzinome oder Sarkome sind insbesondere Bronchialkarzinome, Colonkarzinome, Leukämien, Cervix- und UterusKarzinome und vor allem Ovarialk rzinome.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein DNA-Konstrukt, umfassend Nukleinsäure codierend für ein Protein der M30-Genfamilie und einen operativ damit verknüpften Promotor.
Die Promotoren, die den für Proteine der M30-Genfamilie codierenden Nukleotidsequenzen vorgeschaltet sind und deren Transkription regulieren, können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) verändert sein, ohne daß aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere heterologe oder auch synthetische Promotoren ausgetauscht werden. Promotoren können die Transkription eines für ein oder für mehrere Proteine codierenden Nukleinsäureabschnitts regulieren. Im letzteren Fall kommen bei Eukryonten Wirtszellsytemen in der Regel interne Ribosomenbindungsstellen (IRES) zum Einsatz.
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen DNA-Konstrukte werden üblicherweise die für ein Protein der M30-Genfamilie codierenden Nukleinsäureabschnitte mit genetischen Regulationselementen wie Transkriptions- und Translationssignalen funktioneil verknüpft. Diese Verknüpfung kann je nach gewünschter Anwendung zu einer Erhöhung oder Erniedrigung der Genexpression führen. Mit den solchermaßen hergestellten rekombinanten Nukleinsäurekonstrukten werden anschließend Wirtsorganismen transformiert. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so daß die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Konstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt, es werden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Sequenzen inseriert und der natürliche Promotor wird nicht entfernt. Stattdessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, daß keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird. Auch am 3 '-Ende der Nukleinsäure-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte regulatorische Elemente inseriert werden. Die offenen Leseraster können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein, oder auf getrennten Genkonstrukten lokalisiert sein. Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, 1-PR- oder im 1-PL- Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den grampositiven Promotoren wie amy und SPO2, in den Hefepromotoren wie ADC1, MFa , AC, P-60, CYC1, GAPDH oder in Mammaliapromotoren wie CaM-Kinasell, CMV, Nestin, L7, BDNF, NF, MBP, NSE, beta-Globin, GFAP, GAP43, Tyrosin Hydroxylase, Kainat- Rezeptor-Untereinheit 1, Glutamat-Rezeptor-Untereinheit B enthalten. Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten verwendet werden. Darüberhinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden. Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Nukleinsäuresequenzen und die Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird. Unter "Enhancer" sind beispielsweise DNA-Sequenzen zu verstehen, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA eine erhöhte Expression bewirken. Als weitere Regulationssequenzen seien beispielhaft die Locus-Control-Regions, Silencer oder jeweilige Teilsequenzen davon genannt, wobei diese Sequenzen so gewählt werden, daß eine gewebespezifische Expression möglich ist. Eine bevorzugte Ausführungsform ist die Verwendung eines Promotors 5'-wärts vom offenen Leseraster, gegebenenfalls mit weiteren Regulationssignalen wie 3'-wärts gelegene Terminatoren oder Polyadenylierungssignale oder Enhancer. In der Regel wird die für ein Protein der M30-Genfamilie codiernde Sequenz in einen Framework-Vektor einkloniert, der alle benötigten regulativen Sequenzen aufweist und die Möglichkeit zur Selbstreplikation in einem Wirtsorganismus besitzt. Geeignete Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York- Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Sindbisvirus, Transposons, IS- Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Für die Integration in Mammalia wird vorteilhaft lineare DNA verwendet. Die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen bzw. des rekombinanten Nukleinsäurekonstrukts kann vorteilhaft durch Erhöhen der Genkopienzahl und/oder durch Verstärkung regulatorischer Faktoren, die die Genexpression positiv beeinflussen, erhöht werden. So kann eine Verstärkung regulatorischer Elemente vorzugsweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem stärkere Transkriptionssignale wie Promotoren und Enhancer verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert, oder die Ableseeffizienz dieser mRNA an den Ribosomen erhöht wird. Zur Erhöhung der Genkopienzahl können die Nukleinsäuresequenzen oder homologe Gene, beispielsweise in ein Nukleinsäurefragment bzw. in einen Vektor eingebaut werden, der vorzugsweise die den jeweiligen Genen zugeordnete, regulatorische Gensequenzen oder analog wirkende Promotoraktivität enthält. Insbesondere werden solche regulatorische Sequenzen verwendet, die die Genexpression verstärken. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können zusammen mit den für interagierende Proteine kodierenden Sequenzen in einen gemeinsamen Vektor kloniert werden und anschließend in dem gewünschten Organismus exprimiert werden. Alternativ kann auch jede der potentiell interagierenden Nukleinsäuresequenzen und die für ein Mitglied der M30-Genfamilie kodierenden Sequenzen in je einen einzelnen Vektor gebracht und diese getrennt in den jeweiligen Organismus über übliche Methoden wie Transformation, Transfektion, Transduktion, Elektroporation oder Partikel-Gun eingebracht werden. Es können Vektorsysteme oder Oligonukleotide verwendet werden, die die Nukleinsäuren oder das Nukleinsäurekonstrukt um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern, also ein Fusionsprotein erzeugen, um das Protein leichter reinigen zu können. Als solche „Tags" sind in der Literatur z. B. Hexa-Histidin -Anker bekannt oder Epitope, die als Antigene verschiedener Antikörper erkannt werden können (Studier et al., Meth. Enzymol., 185, 1990: 60 - 89 und Ausubel et al. (eds.) 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York).
Es konnte weiterhin gezeigt werden, daß M30 unter Streßbedingungen eine zelltodfordemde Wirkung besitzt (Beispiel 7). Diese Erkenntnis ließ sich aus der
Durchführung vergleichender quantitativer Apoptose-Assays an Zellen, die M30 überexprimieren bzw. nicht überexprimieren, schließen. Demnach wird die Expression der Gene der M30-Familie unter Streßbedingungen - z.B. unter den Bedingungen eines
Schlaganfalls- nicht nur hochreguliert, sondern die M30-Genprodukte sind vermutlich auch an den Folgen des Schlaganfalls, die zum neuronalen Zelltod führen, beteiligt.
Diese erfindungsgemäße Erkenntnis unterstreicht die Bedeutung der Proteine der M30-
Familie als pharmakologische Targets bzw. die Anwendung von funktionalen M30-
Inhibitoren bei der Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung liegt daher in der Verwendung eines Inhibitors für
M30 oder für eines seiner Homologen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen unter Reduktion des neuronalen Zelltods.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein DNA-Konstrukt, umfassend einen Promotor und eine mit dem Promotor operativ verknüpfte Sequenz zur Kontrolle der Neusynthese des Proteins der M30-Genfamilie in einer Zelle. Dies erfolgt durch Komplexbildung mit der korrespondierenden mRNA.
Dieses Konstrukt dient der Kontrolle der Neusynthese des Proteins der M30-Genfan ilie in einer Zelle. Dazu wird eine Gensequenz, die zu einer Sequenz eines Gens der M30- Genfamilie oder einem Teil davon invers komplementär ist, vor einen Promotor kloniert, so daß die Transkription der Sequenz unter der Kontrolle dieses Promotors steht. Wird das Konstrukt in eine Zelle eingebracht, dann wird gegebenenfalls nach Induktion des Promotors das Transkript der zu einer Sequenz eines Gens der M30-Genfamilie oder einem Teil davon invers komplementären Gensequenz gebildet. Dieses Transkript bildet mit dem Transkript des betreffenden Gens der M30-Genfamilie eine RNA-RNA-Hybridhelix, die durch Nucleasen der Zelle beschleunigt abgebaut wird. Das Transkript der invers komplementären Sequenz bewirkt also ^eine Herabsetzung der Lebensdauer der Transkripte, an die es bindet. Solche erfindungsgemäßen Konstrukte sind nützlich, um die Transkriptionsfrequenz von Genen der M30-Genfamilie in den Zellen, die das Konstrukt aufweisen, zu drosseln und im Extremfall gänzlich zu unterdrücken. Konstrukte, die die in einer Zelle vorhandene Menge an Protein eines Mitglieds der M30- Genfamilie erhöhen oder herabsetzen, können auch im Rahmen der Gentherapie verwendet werden, um Zellen, die eine pathologische Menge des betreffenden Proteins aufweisen, zu heilen. Dies kann im Rahmen einer Therapie neurodegenerativer Erkrankungen geschehen oder zum Beispiel auch zur Bekämpfung von Krebs, das heißt von Sarkomen und Karzinomen. Eine solche Verwendung beider erwähnter Arten von Konstrukten ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Es versteht sich von selbst, daß Zellen, die eines der vorgenannten Konstrukte enthalten, ebenfalls ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind. Diese Zellen können prokaryotisch oder eukaryotisch sein. Als Zellen sind prinzipiell alle Organismen denkbar, die eine Expression der erfindungsgemäßen Konstrukte ermöglichen. Unter Zellen sind beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen zu verstehen. Bevorzugte Organismen sind Bakterien wie Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryotische Mikroorganismen wie Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, höhere eukaryotische Zellen aus Mensch oder Tier, beispielsweise COS-, Heia- HEK293-, Sf9- oder CHO-Zellen.
Eine gängige Möglichkeit zur Beeinflussung von Transkript- und damit Proteinmengen von M30 besteht im Einsatz von kurzen Nukleinsäuresequenzen oder Oligonukleotiden. Darunter zu verstehen sind alle Nukleinsäurefragmente im Bereich von 10 bis 200 bp, synthetisch erzeugt, oder auf andere Weise zu erhalten. Im Besonderen sind dies antisense- Oligonukleotide gerichtet gegen Teilsequenzen der M30 mRNA, oder auch Nukleinsäuren im Sinne von RNAI Inhibierung. Die eingesetzten Nukleinsäuren können auch chemisch modifiziert sein, beispielsweise Phosphothioat-Oligonukleotide, oder sie können Hybride aus Ribo- und Desoxyribonukleinsäuren sein. Diese Oligonukleotide können auch in unterschiedlichen Applikationsformen in Zellen eingebracht werden, z.B. mit Liposomen- Präparationen, mit Anteilen des VS V- Virus oder ähnlicher Präparationen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein transgenes nichtmenschliches Wesen, aufweisend Zellen mit einem veränderten Gen in dem Genom der betreffenden Zelle, das das Wildtypgen vorzugsweise ersetzt, wobei der Wildtyp des Gens für ein Protein der M30-Genfamilie codiert. Transgene nichtmenschliche Wesen sind transgene Tiere oder Pflanzen.
Transgene Wesen sind genetisch so verändert, daß ihre Zellen eine im Vergleich zum Wildtyp veränderte Menge eines Proteins der M30-Genfamilie aufweisen oder bei denen die Wildtyp-Form eines Gens der M30-Genfamilie durch ein anderes Gen vorzugsweise durch homologe Rekombination ersetzt wird, das sich vom Wildtyp-Gen im offenen Leseraster oder in den Regulationssequenzen, die die Transkription des primären Genproduktes regulieren (Promotor, Enhancer usw.), unterscheiden. Dementsprechend weist das transgene Wesen ein anderes Protein der M30-Genfamilie auf und/oder die Menge an diesem Protein ist in allen Zellen oder einem Teil der Zellen des Wesens dauerhaft oder vorübergehend verändert. Transgene Wesen können auch in bezug auf das mutierte Gen Mosaikwesen sein, das mutierte Gen kann in nur einem Teil der somatischen Zellen vorliegen, es ist begriffsmäßig nicht erforderlich, daß die Mutation in den Keimzellen manifest ist. Insoweit können bestimmte Menschen, die erfolgreich einer Gentherapie unterzogen wurden, unter Umständen auch zu den transgenen Wesen gezählt werden. Aus diesem Grund erfolgt durch den Zusatz des Begriffs „nichtmenschlich" ein expliziter Ausschluß vom Schutz. Das mutierte Gen des transgenen Wesens kann auch ein Knock-out Gen sein (Ausubel et al. (eds.) 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York und Torres et al., (eds.) 1997, Laboratory protocols for conditional gene targeting, Oxford University Press, Oxford).
Transgene Tiere können zum Beispiel Mäuse, Ratten, Schafe, Rinder oder Schweine sein. Auch transgene Pflanzen sind im Prinzip denkbar, wenn auch das Verfahren der homoigen Rekombination zur deren Erzeugung in der Regel ausscheiden wird, da die evolutionsbedingten Unterschiede zwischen Pflanzen und Säugetieren dies in der Regel nicht zulassen werden. Zum Beispiel können transgene Pflanzen zur Expression großer Mengen von Protein für ein Verfahren zur Suche von Liganden, die an ein Protein der M30-Genfamilie binden (siehe Luhring, H., Witzemann, V., FEBS Lett, 1995, 361(1):65- 9) herangezogen werden.
Über transgene Überexpression oder genetische Mutation (Nullmutation oder spezifische
Deletionen, Insertionen oder Veränderungen) durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen kann man Tiermodelle erzeugen, die wertvolle weitere
Informationen über die (Patho-)Physiologie der Gene der M30-Genfamilie liefern. Solchermaßen hergestellte Tiermodelle können Testsysteme zur Evaluierung neuartiger Therapeutika für Pharmaka zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen liefern.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Diagnose einer neurodegenerativen Krankheit oder der Anfälligkeit gegenüber dieser Krankheit, gekennzeichnet durch die Sequenzabweichung in einem Gen, das für ein Protein der M30- Genfamilie codiert, gegenüber dem Wildtyp. Es wurde gefunden, daß die Gene der M30-Genfamilie bei neurodegenerativen Zuständen eine wichtige Rolle spielen. Dies legt nahe, daß das Auftreten dieser Zustände oder zumindest die Anfälligkeit dafür in bestimmten Fällen auf eine Mutation in einem Protein der M30-Genfamilie zurückzufuhren ist. Es wird also ein Verfahren zur Diagnose einer neurodegenerativen Erbkrankheit oder der Anfälligkeit gegenüber dieser Krankheit angegeben, das die Ermittlung von Sequenzabweichungen in bezug auf ein oder mehrere Gene der M30-Genfamilie von dem jeweils korrespondierenden Wildtyp-Gen einschließt. Diese Sequenzabweichungen können zum Beispiel Single-Nucleotide-Polymorphisms (SNP) sein. Je mehr und je gravierender die Abweichungen sind, desto eher wird der betreffende Patient an einer neurodegenerativen Erkrankung erkranken. Auch kann man das erfindungsgemäße Verfahren anwenden, um die Diagnose bei einem bereits erkrankten Patienten zu stellen. Verfahren zur Ermittlung von Sequenzabweichungen sind dem Fachmann bekannt. Neben der Polymerasekettenreaktion (PCR) mit anschließender Sequenzierung der Amplifikationsprodukte haben sich einige ähnliche Verfahren etabliert, speziell, wenn bereits bekannt ist, wo die Sequenzabweichungen zu erwarten sind. Die Korrelation des chromosomalen Locus beim Menschen (Chromosom 2 bei M30; Chromosom 11 bei M31, jeweils beim Menseihen) zu bestimmten erblichen Erkrankungen könnte außerdem ein neues Diagnoseverfahren für erbliche Erkrankungen (z.B. aus dem Formenkreis der Atopien oder anderer Erkrankungen des Immunsystems) ermöglichen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Diagnose von Karzinomen oder Sarkomen, insbesondere von Ovarialkrebs, gekennzeichnet durch den Nachweis der Überexpression eines Proteins nach SEQ ID NO 14 in einer Körperprobe. Es wurde gezeigt, daß das Protein nach SEQ ID NO 14, also M31, in Sarkomen und/oder Karzinomen überexprimiert wird, was sich in einer erhöhten Menge des Transkripts des Proteins in den Zellen äußert. Man kann also die Überexpression entweder durch Bestimmung der Transkriptmenge oder der M31 -Proteinmenge der Zelle feststellen und bei Vorliegen der Überexpression auf eine maligne Entartung der betreffenden Zelle schließen. Die Bestimmung der Überexpression erfolgt durch den Vergleich der Probe mit einer Kontrollprobe, die keine Krebszellen ausweist und zwar bevorzugt histologisch unter Einsatz von Antikörpern zur Bestimmung der Proteinmenge oder von in situ-Sonάen zur Bestimmung der Transkriptmengen. Im übrigen kann der Nachweis des Transkripts auch mit PCR- Verfahren erfolgen. Es sind schon einige Krebsmarker zum Beispiel aus WO94/12881 und WO94/17414, DE-A19829473 bekannt, deren Offenbarung in bezug auf die Nachweisprotokolle vollinhaltlich aufgenommen wird. Die bereits bekannten Krebsmarkern können nur eine Untergruppen von Krebszellen nachweisen. Es gibt also immer noch Krebsarten, die sich nicht mit den bekannten Markern nachweisen lassen. Insofern besteht nach wie vor ein Bedürfnis an der Bereitstellung neuer Krebsmarker.
Die Erfindung wird durch die nachfolgende Zeichnung näher beschrieben, wobei Fig. 1 die genomische Organisation des M30 Lokus beim Menschen, Fig. 2 eine Sequenzzusammenstellung einiger Mitglieder der M30-Genfamilie, Fig. 3 die gewebespezifische Expression von M30, Ratte,
Fig. 4 die Hochregulation der Sythese des M30-Transkripts durch Kainat (M30, Ratte), Fig. 5 die Lokalisation von M30 im Rattenhirn nach Verabreichung von Kainat, Fig. 6 die Hochregulation der Synthese des M30-Transkripts durch fokale cerebrale I schämie (M30, Maus), Fig. 7 molekulare Funktionen von M30 im Iϊ_~l System,
Fig. 8 die Sequenzidentitäten, die humanen Vertreter der M30-Genfamilie untereinander aufweisen, Fig. 9 Sequenzidentitäten, die Vertreter der M30-Genfamilie aus Mensch und Ratte im
Vergleich mit der Pellino-Sequenz aus Drosophila aufweisen. Fig. lOWestemblot von cosl-ZeUen, die mit m30 und verschiedenen Kontrollen (EGFP;
Leervektor) transfiziert wurden, unter Staurosporin-Einfluß bzw. ohne
Staurosporin-Einfluß. Fig. HPosition der m30-Fragmente, die für die in Beispiel 14 beschriebenen
Kotransformationsexperimente benutzt wurden, auf Nukleotidebene. zeigt.
Fig. 1 zeigt die genomische Organisation des M30 Lokus beim Menschen. Dargestellt sind in Fig. 1 die 4 gefundenen cDNA-Spezies von M30 beim Menschen, und ihre genomische Herkunft. Die Exons sind mit großen arabischen Ziffern gekennzeichnet. Es ist nicht ausgeschlossen, dass die Klone noch weiter nach 5' extendieren. Die Größenverhältnisse sind nicht masstabsgetreu. Querstriche bezeichnen unklare Intronlängen. Die Bezeichnungen hm30_A, hm30_B, hm30_C und hm30_E) entsprechen jeweils M30,A,B,C,D (siehe Tabelle 1). Fig. 2 zeigt ein Alignment einiger Mitglieder der M30- Genfamilie. M30 Proteinsequenzen aus Ratte (rat) und Mensch (human (D) entspricht M30, D) wurden mit Homologen aus anderen Spezies nach Homologiebereichen verglichen (MegAlign). Fig. 3 zeigt die gewebespezifische Expression von M30 (Ratte). Ein Northernblot mit RNA aus verschiedenen Geweben wurde mit einer spezifischen Sonde für M30 hybridisiert. Eine RNA-Spezies mit ca. 2.8 kb wird delektiert, (brain = Gehirn; liver = Leber; hing = Lunge; heart = Herz; kidney = Niere; Ski. muscle = Skelettmuskulatur; small intestine = Dünndarm; testis = Hoden, rat m30 = M30, Rattus) Fig. 4 zeigt die Hochregulation der Synthese des M30-Transkripts durch Kainat (rat m30 = M30, Ratte). RNA aus Hippocampusgewebe der Ratte wurde nach verschiedenen Zeiten einer Behandlung mit PBS (Phosphate Buffered Saline), Kainat, oder Pentylentetrazol (PTZ) gewonnen. Ein Northernblot mit dieser RNA wurde mit einer M30-spezifischen Probe hybridisiert. Es zeigt sich eine ubiquitäre Expression in allen untersuchten Geweben. Erklärung im Text der Beispiele Fig. 5 zeigt die Lokalisation von M30 im Rattenhirn nach Verabreichung von Kainatgabe. In-situ Hybridisierung der Hippocampusregion in der Ratte 1.5 h nach Gabe von Kainat (10 mg/kg i.p.).Erklärung im Text der Beispiele Fig. 6 zeigt die Hochregulation der Synthese des M30-Transkripts durch fokale cerebrale Ischämie (M30, Maus). Mit Hilfe des LightCycler Systems wurde mit quantitativer PCR die M30-Transkriptmenge nach einer fokalen cerebralen Ischämie bestimmt. Es zeigt sich eine schnelle Hochregulation von M30 RNA um den Faktor 2 zwei Stunden nach einem Ischämieereignis. Die relativen Werte sind normalisiert für Cyclophilin. (m30 expression after 90 min ischemia 2 h reperfusion = Hochregulation der M30-Transkription nach 90 minütiger Ischämie gefolgt von 2 h Reperfusion; m30 expression after 90 min ischemia 6 h reperfusion = Hochregulation der M30-Transkription nach 90 minütiger Ischämie gefolgt von 6 h Reperfusion; m30 expression after 90 min ischemia 24 h reperfusion = Hochregulation der M30-Transkription nach 90 minütiger Ischämie gefolgt von 24 h Reperfusion; expression normalized to cyclophilin = Die Transkriptmenge wurde auf das Cyclophilin-Transkript bezogen) Fig. 7 zeigt molekulare Funktionen von M30 im IL-1 System. Bestandteile des IL-1 Rezeptor Signalwegs. Mögliche Wirkorte von M30 sind als Pfeile angedeutet.Fig. 8 zeigt die Sequenzidentitäten, die humanen Vertreter der M30- Genfamilie untereinander. M32 und M33 sind sehr stark verwandt, M31 divergiert am stärksten. (hm30_D = M30, D; htn31, hm33, hm32 (frag) = M31, M33, M32 (frag) des Menschen) Fig. 9 zeigt Sequenzidentitäten, die Vertreter der M30-Genfamilie aus Mensch und Ratte im Vergleich mit der Pellino-Sequenz aus Drosophila aufweisen aufweisen (oberes Dreieck der Matrize) beziehungsweise die entsprechenden Abweichungen (unteres Dreieck der Matrize). Die Homologiebeziehungen sind auch in Form eines Dendrogramms dargestellt. M30, D ist mit 55.5% Sequenzidentität am ähnlichsten, danach folgt M33 (54.8%o) und dann M31, das am weitesten entfernt ist (48.3%). Es wurden das Programm Megalign (DNAstar, Lasergene, Madison, Wisc, USA) benutzt. (hm30_D; hm31; hm33 = M30, D; M31; M33 des Menschen; rat m30 - M30 der Ratte). Fig. 10: zeigt einen Westernblot von Proteinextrakten aus cos 1 -Zellen, die entweder unbehandelt geblieben waren (A) oder zuvor mit m30 (D) bzw. mit verschiedenen Negativkontrollen (EGFP (C); Leervektor (B)) transient transfiziert, und anschließend der Apoptose-auslösenden Substanz Staurosporin ausgesetzt bzw. nicht ausgesetzt worden waren. Ein spezifischer Antikörper für das PARP -Protein zeigt deutlich die Apoptose- induzierende Wirkung von m30 unter Streßeinfluß durch Staurosporin. EGFP alleine hat ebenfalls eine minimale Apoptose-induzierende Wirkung.
Fig. 11: zeigt die Position der m30-Fragmente auf Nukleotidebene, die für die in Beispiel 14 beschriebenen Kotransformationsexperimente benutzt wurden. Die Interaktionen dieser m30-Fragmente mit pelle werden in Tab. 2 beschrieben.
Im folgenden werden einige Beispiele angegeben, die die Erfindung illustrieren sollen. Dabei sind die Daten über die Hochregulation der M30-Transkription nach Kainatzugabe, MECS oder fokaler Ischämie auf alle anderen Vertreter der M30-Genfamilie zu übertragen, deren Daten hier nicht gezeigt werden.
Beispiel 1
Klonierung der M30-cDNA aus Ratte (siehe unter Tabelle 1)
Nach Durchführung des Stimulationsprotokolls an Ratten mit MECS (massive electroconvulsive shock) (Worley, et al, JNeurosci, 13, 4776-86, (1993)) in Kombination mit Cycloheximid (Cole, et al, J Neurochem, 55, 1920-7, (1990)) wurde mRNA aus diesen st und aus Kontrolltieren mittels Standardverfahren gewonnen. Danach wurde das „suppression subtraction hybridization protocol" (SSH) (Clontech Lab., Palo Alto, USA) durchgeführt. Es wurde ein ca. 300 bp langes Fragment isoliert. Damit wurde eine Bank hybridisiert, die für lange neuronale IEGs angereichert war. M30 wurde daraufhin durch „reverse northern blot" Filterhybridisierung mit RNA aus den MECS-stimulierten Tieren als positiv identifiziert. Das Protokoll ist im Detail in Lanahan et al., 1997 bescΑUeben(Lanahan, et al, JNeurosci, 17, 2876-85, (1997)).
Insgesamt 3 unabhängige cDNA Klone von M30 (m30_5, m30_17, m30_26) wurden mittels eines Transposon-Insertionsverfahrens (GPS-1, New England Biolabs, Beverly, MA; USA) sequenziert, und die Sequenzen mit dem Programm SeqMan (Lasergene, Madison, WI, USA) assembliert. Die erhaltene Sequenz des Klons m30_26 war 2736 Basenpaare lang und enthielt am 3 '-Ende einen polyA-Schwanz und einen Bereich hochrepetitiver Sequenz am 5 '-Ende, der sicher der 5' untranslatierten Region zuzurechnen ist, so dass davon ausgegangen werden konnte, daß dieser Klon die komplette cDNA von M30 umfaßt. Die Sequenz von Klon m30-26 ist in SEQ ID NO. 1 dargestellt und stellt den längsten der 3 sequenzierten cDNA-Seque'nzen dar. Bei Position 2078 konnte ein Polymorphismus festgestellt werden: zwei der M30 Klone enthielten C an dieser Stelle, bei einem Klon fand sich A.
Von Position 585 bis Position 1841 der Ratten cDNA fand sich ein offenes Leseraster von 1256 bp, das für ein Protein mit 418 Aminosäuren und einem vorhergesagten Molekulargewicht von 46 kDa kodiert (SEQ ID NO 2). Eine Motivsuche ergab keine Signalsequenzen, keine Transmembrandomänen und ein putatives Kemlokalisationssignal (PSMKRK). Demnach handelt es sich bei M30 wahrscheinlich um ein lösliches Protein, wofür auch der Hyprophobizitätsplot nach Kyte-Doolittle Kyte and Doolittle, J Mol Biol,
157, 105-32, (1982)) spricht (nicht gezeigt). Das Kemlokalisationssignal ist jedoch in
Homologen des Proteins in anderen Spezies (z.B. Drosophila, C. elegans) nicht erhalten.
Die Signifikanz dieser Motiworhersage ist daher noch unklar. Zur Identifizierung der humanen Sequenzen der so isolierten cDNA wurde eine humane lambda-zapll Bank (Stratagene) aus Hippocampusgewebe mit einem Xbal-Fragment der
Ratten M30 cDNA hybridisiert. Durch Sequenzieren mehrerer Klone fanden sich zwei im
5'-Bereich divergente cDNA Sequenzen: M30, A und M30, D (SEQ ID NO 3, SEQ ID NO
5). Mehrere Oligonukleotidprimer wurden aus diesen Sequenzen ausgewählt. Zusätzlich wurden Bereiche der ungeordneten humanen genomischen Sequenz (s.u.), die der Ratten- cDNA im 5' Bereich homolog waren, für PCR-Primer ausgewählt: hm30_new_sl aaagcaccagtaaaatatggtg hm30_nn_s2 tggttgaatatactcatgacag hm30_nn_s3 aaatggcgatagaggaaggagg hm30_nn_s4 tcacacactggcacctggtatg hm30_nn_s5 agcctaggcaacagagcaagactc hm30_nn_s6 gaggtaggagaaccacttgaacc hm30 nn_s7 ttaaactgaaacgaattgttcac hm30_nn_s8 gtttgcataatattgtgttcaag hm30_nn_s9 gtaaaatatataatcattattgg hm30_nn_al tgatctcttgcaagaactgcac hm30_nn_a2 gtacaagcaatatgcacagtgc hm30_nn_a3 tgtcatgagtatattcaaccac hm30_nn_a4 ccgtgtcagttactacaaaatc hm30__nn_a5 agacagagtcttgctctgttgc hm30_nn_a6 gaaaaagttaatagcaaaaattag hm30_nn_a7 tgatgagtcaaatcctgcagc.
(Die Sequenzen sind als SEQ ID NO 27-42 aufgeführt) Eine Vielzahl von PCR-Reaktionen mit verschiedenen OHgonukleotid-Kombinationen wurden mit cDNA aus humanem Hirngewebe durchgeführt. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden direkt sequenziert, jeweils aus verschiedenen unabhängigen Reaktionen. Eine Zusammenfugung der o.a. humanen cDNA-Sequenzen und der Sequenzen der PCR- Produkte ergab, dass mindestens 4 im 5 '-Bereich divergente humane M30-mRNA- Sequenzen vorkommen: M30, A bis M30, D. Dabei ist die cDNA M30, C der Ratten cDNA von M30 (SEQ ID NO 1) homolog. Offensichtlich unterliegt das M30-Gen im Menschen Regulationsvorgängen über differentielles Spleißen und/ oder der Benutzung alternativer Promotoren.
Möglicherweise ist die differentielle Regulation der M30 Genexpression von definierten physiologischen oder pathophysiologischen Situationen abhängig, z.B. Krampfanfällen, da in diesen die Ratten cDNA identifiziert wurde. Bislang wurde allerdings nur eine Isoform bei der Ratte gefunden. Vorläufige Daten aus einem Cosmid mit der genomischen Maussequenz sprechen allerdings für eine starke Konservierung der Exon-Intron Struktur und der Intronlängen, was für das Vorkommen mehrerer Isoformen auch bei Maus und Ratte sprechen könnte.
Proteinsequenz beim Menschen Die abgeleitete Proteinsequenz ergab bei den humanen cDNA-Sequenzen M30, A und M30, B ein um die Sequenz „MFS PDQ ENH PSK APV KYG ELI VLG YNG SLP NGD RGR RKS RFA LFK RPK ANG VKP STV HIA CTP QAA KAI SNK DQH SIS YTL SRA QTV VVE YTH DSN TD" im Aminoterminusbereich frankiertes Protein , das im übrigen Bereich jedoch identische Sequenzen zu der M30 Rattenproteinsequenz aufweist. Einzige Ausnahme ist ein Aminosäurenaustausch an Pos. 195 der Rattensequenz (D (Ratte) -» N (Mensch)).
Für die Sequenz von cDNA M30, C und M30, D des Menschen (SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 9) ergibt sich ein der Ratte entsprechendes Protein beim Menschen, mit der angegebenen Abweichung einer Aminosäure.
Beispiel 2
Evolutionäre Konservierung
Eine Datenbanksuche (BLAST 2 (Altschul, et al, Nucleic Acids Res, 25, 3389-402,
(1997))) der EMBL, nrdb und swissprot-Datenbanken erbrachte Verwandte dieses Proteins in C. elegans, Drosophila melanogaster, Danio rerio, Halocynthia roretzi, und Onchocercus volvulus. Ein Alignment der Proteine zeigt Fig. 2. Insgesamt findet sich eine ungewöhnlich hohe Konservierung über alle Proteinbereiche, was auf eine wichtige funktionelle Aufgabe des Proteins schließen läßt.
Beispiel 3
Genomische Organisation von M30 beim Menschen
Eine Datenbanksuche mit der humanen Sequenz (BLAST2) ergab einen starke Homologie mit einer neuen ungeordneten genomischen Sequenz des humanen Genomprojektes in der emblnew Datenbank (accession number AC012368; date 26-OCT-1999 (Rel. 61, Created); 02-NON-1999 (Rel. 61, Last updated, Version 2); description: Homo sapiens chromosome 2 clone ΝH0547M24 map unknown, WORKING DRAFT SEQUENCE, in unordered pieces.)
Die ungeordneten Contigs von Chromosom 2 enthalten alle Sequenzen, die sich in der humanen cDNA fanden, so dass sich die wahrscheinliche Exon-Intron Struktur bestimmen ließ, nachdem drei der contigs, die in falscher Orientierung zueinander lagen, rearrangiert wurden.
Es finden sich mehrere alternativ gespleißte Exons, so dass mehrere Kombinationsmöglichkeiten des Transkripts entsteht (Fig. 1). Vier dieser Kombinationsmöglichkeiten (Spleißvarianten) wurden in humaner cDNA gefunden (M30, A; M30, B; M30, C; M30, D). Unter Umständen werden auch alternative Promotoren für die Entstehung der unterschiedlichen Varianten benutzt.
Vermutlich haben die differentiellen Splicingvorgänge und gegebenenfalls, die Benutzung eines zweiten und dritten Promotors regulatorische und modifizierende Wirkung für die Proteinfunktion. Durch Benutzung von Exon 3 a und b entsteht ein in-frame Stopcodon, das das humane Protein im Aminoterminus trunkiert (M30, B). Ebenso sind in Exon 2a zwei in-frame Stopcodons (ca. 90 bp 5' von der donor-Splice site, so dass hier ebenfalls nur ein trunkiertes Protein entstehen kann. Wir vermuten, dass die unterschiedlichen Varianten beim Menschen, die in unterschiedlichen Proteinen resultieren, differentiell reguliert sind, und dass dies eine besondere Bedeutung bei zellulären Signalvorgängen spielt. Chromosomale Lokalisation von M30 beim Menschen
Chromosom 2 enthält einige Krankheitsloci, die u.U. für M30 interessant sind, selbstverständlich benötigt man zunächst eine subchromosomale Lokalisation. Unter diesen sind z.B. einen Susceptibilitätslokus für M. Parkinson (Gasser, et al, Nat Genet, 18, 262-5, (1998)), eine Krankheit die durch Neuronenschädigung und -tod gekennzeichnet ist. Ebenfalls interessant ist eine Kopplung von Multipler Sklerose, einer klassischen neuroimmunologischen Erkrankung, zu Chromosom 2 (Ebers, et al, Nat Genet, 13, 472-6, (1996)), interessanterweise finden sich alle Gene für Interleukin 1 Liganden und Rezeptoren auf Chromosom 2, der sog. 11-1 Cluster (ILRN 2ql4; IL-lbeta 2ql4, IL-lalpha 2ql4; IL-1 receptor 2ql2). Auf Chromosom 2 ist ein Susceptibilitätslocus für Asthmaassoziierte Phänotypen (Cookson, Nature, 402, B5-11, (1999, Wjst, et al, Genomics, 58, 1- 8, (1999, Hizawa, et al, J Aller gy Clin Immunol, 102, 436-42, (1998, Nat Genet, 15, 389- 92, (1997)). Dies erscheint besonders interessant im Hinblick auf die starke Expression von M30 in der Lunge. Ebenso liegt ein Susceptibilitätslocus für rheumatoide Arthritis auf Chromosom 2 (Hardwick, et al, J Rheumatol, 24, 197-8, (1997)).
Es ist möglich, dass Mutationen im M30 Gen für einen oder mehrerer dieser Phänotypen verantwortlich sind.
Beispiel 4
Gewebeexpression von M30 bei der Ratte
Eine Sonde aus der M30 cDNA (aus Klon m30-17) wurde benutzt, um einen Northern-Blot mit verschiedenen Geweben der Ratte zu hybridisieren (Fig. 3). Es zeigt sich eine ubiquitäre Präsenz der spezifischen M30-Bande, die von der Grosse mit der cDNA-Länge von Klon m30-26 übereinstimmt (ca. 2.8 kb). Die Normalisierung der aufgetragenen RNA- Mengen mit einer Sonde für das ribosomale Protein S26 zeigt, dass die Expression in der Lunge am stärksten ist; die Abundanzunterschiede in den übrigen untersuchten Geweben (Hirn, Leber, Herz, Niere, Skelettmuskel, Dünndarm, Hoden) sind jedoch nicht besonders stark. Beispiel 5
Regulation von M30 durch Kainat
Gesamt-RNA wurde aus Hippokampusgewebe von Ratten gewonnen, die mit Phosphatpuffer (PBS), Kainat oder Pentylentetrazol (PTZ) intra-peritoneal behandelt wurden. Die Gewebsentnahme geschah nach unterschiedlichen Zeiten nach Gabe der jeweiligen Substanz. Kainat (10 mg/kg Körpergewicht i.p.) und PTZ (50 mg/kg Körpergewicht i.p.) in den verabreichten Dosen lösen Krampfanfälle aus. Auf einem Northernblot von diesen Geweben (Fig. 4) zeigt sich eine spezifische Hochregulation um den Faktor 3 kurze Zeit (1.5 h) nach einem Kainat-induzierten Krampfanfall. Nach längerer Zeit (24 h) finden sich keine erhöhte Expression mehr.
Dieses Experiment bestätigt die Auffassung von m30 als einem immediate early gene, das durch neuronale Excitation reguliert werden kann.
Durch in-situ-Hybridisierung mit der Ratten M30 cDNA (rm30) (benutzt wurde ein Fragment, dem die 5'utr fehlt, da diese aufgrund repetitiver Sequenzen eine unspezifische Hybridisierun auch mit der sense-Probe ergab) konnte die Hochregulation durch Kainat in der hippocampalen Region gezeigt werden (Fig. 5). Im wesentlichen wurde die Digoxigenin-labeling Methode (Fa. Röche Diagnostics) mit Modifikationen nach Kuner et al. (Kuner, et al, Science, 283, 74-7, (1999)) und Rossner et al. (Rossner, et al, Mol Cell Neurosci, 10, 460-75, (1997)) benutzt. Sense und antisense RNA-Transkripte wurden mit T7 und T3 RNA Polymerasen unter Inkorporation von Digoxigenin-gekoppeltem UTP (Fa. Roche-Diagnostics) hergestellt. cRNA Proben wurden mit NaOH hydrolysiert zu einer durchschnittlichen Fragmentgrösse von 200-500 bp. 15 um Gemmschnitte wurden mit einem Kryostat bei -20° geschnitten, auf Poly-L-Lysin-beschichtete Objektträger aufgezogen, in 4% Paraformaldehyd in PBS (pH 7.4) fixiert. Die Fig. 5 zeigt eine Hochregulation von M30 Transkript in Neuronen des Gyrus dentatus, der CA1 und CA4 Region. Neurone der CA1 -Region sind besonders anfällig für verzögerten Neuronentod (Apoptose) nach einer Schädigung (z.B. (Hara, et al, Stroke, 31, 236-8, (2000))), zu einem geringeren Grad ebenfalls Neurone der CA4-Region. Der Gyrus dentatus scheint dagegen eher von einer nekrotischen Schädigung nach Ischämie betroffen (Martin, et al, J Cereb Blood Flow Metab, 20, 153-67, (2000)). Für Kainat sind besonders vulnerable Zellpopulationen CA1 und CA3; der Gyrus dentatus erscheint dagegen weitgehend resistent, z.B. (Becker, et al, Brain Res Mol Brain Res, 67, 172-6, (1999)). Der Gyrus dentatus wird mit Neuronenneubildung nach pathologischen Stimuli in Verbindung gebracht (Takagi, et al, Brain Res, 831, 283-7, (1999)) (Parent, et al, J Neurosci, 17, 3727-38, (1997)).
Diese in-situ Lokalisierung erhärtet einen Zusammenhang von M30 mit neuronalem Zelltod, Neurogenese und Plastizität.
Beispiel 6
Regulation von M30 durch fokale cerebrale Ischämie Das Tiermodell der fokalen cerebralen Ischämie stellt ein valides Modell für den humanen ischämischen Schlaganfall dar. Wir benutzten zur Herbeiführung der fokalen cerebralen Ischmämie das sog. Fadenmodell, bei dem ein beschichteter Nylonfaden durch die A. carotis intema an den Abgang der A. cerebri media vorgeschoben wird und einen ischämischen Schlaganfall induziert (Clark, et al, Neurol Res., 19, 641-648, (1997)). Die Regulation der Genexpression spielt bei der cerebralen Ischämie eine entscheidende Rolle für den Ablauf und das Ausmass des Neuronenschadens iCoz'st α 20 and Hokfelt, Neuroreport, 8, i-viii, (1997, Schneider, et al, Nat Med, 5, 554-9, (1999)). Insbesondere irnrnediate early genes spielen hier eine Rolle (Atkins, et al, Stroke, 27, 1682-1687, (1996)), wie z.B. cox-2, (Nogawa, et al, J. Neurosci, 17, 2746-2755, (1997)), das in einem ähnlichen screening- Verfahren kloniert wurde wie M30. (Yamagata, et al, Neuron, 11, 371-86, (1993)).
Wir untersuchten die M30 Expression nach einer fokalen cerebralen Ischämie in zwei Zeitverläufen: Zum einen in einer transienten Ischämie nach kurzer Reperfusionszeit (90 min Ischämie, 2 h Reperfusion), und zum anderen in einer permanenten Ischämie von 24 h. RNA wurde aus den beiden Hemisphärenhälften von 3-4 Gehirnen ohne Himstamm und Kleinhirn gewonnen. Mit Hilfe des LightCycler™ Systems (Röche Diagnostics, Mannheim) wurde eine quantitative PCR durchgeführt. Der cDNA Gehalt der Proben wurde auf die Expression von Cyclophilin normiert. Benutzte Primer zur Amplifikation von Cyclophilin waren: cyc5 accccaccgtgttcttcgac acyc300 catttgccatggacaagatg und zur Amplifikation von Maus M30 mouse_m30_s3 tactcacgacagcaacactg mouse_m30_a4 gttttttgatgaatcaaatcc. (SEQ ID NO 43 bis SEQ ID NO 46) Tatsächlich zeigt sich eine Hochregulation um den Faktor 2 von M30-RNA auf der ischämischen (linken) Hirnhälfte 2h nach dem ischämischen Ereignis (Fig. 5). Nach 24 h (in einem permanenten Modell) hingegen konnte kein Unterschied mehr festgestellt werden. Dies unterstreicht die Interpretation von M30 als „immediate early Gen". Insbesondere beim Schlaganfall ist die pathophysiologische Bedeutung des IL-1 Pathways sehr gut belegt(Re/tora and Rothwell, Brain Res Bull, 29, 243-6, (1992, Betz, et al, J Cereb Blood Flow Metab, 15, 547-51, (1995, Loddick, et al, Biochem Biophys Res Commun, 234, 211-5, (1997, Betz, et al, Keio J Med, 45, 230-7; discussion 238, (1996)). Der nachgeschaltete Transkriptionsfaktor NF-kappaB scheint eine zentrale Rolle für den Zelluntergang zu spielen (Schneider, et al, Nat Med, 5, 554-9, (1999, Clemens, et al, Strafe, 28, 1073-1081, (1997, Lipton, Nature Med, 3, 20-22, (1997)).
Folglich sollte M30 eine wichtige Rolle in der Pathogenese des Schlaganfalls spielen. Die Hochregulation von M30 könnte hierbei entweder eine protektive Rolle spielen, z.B. in der Desensitisierung des IL-1 Rezeptorsystems in einer Situation des IL-1 Überangebots, wie bei der cerebralen Ischämie, oder eine zeilschädigende Wirkung über eine Verstärkung der Aktivierung nachgeschalteter Systeme (z.B. NF-kappaB, JNK, p38) ausüben.
Beispiel 7:
Nachweis einer proapoptotischen Wirkung von m30 in Säugetierzellen Um einen Einfluss von Mitgliedern der m30-Genfamilie auf Zelltodvorgänge in Säugetierzellen zu nachzuweisen, wurden cos-1 Zellen mit Expressionsvektoren, in denen die cDNA für m30 funktioneil mit einem heterologen Promotor verknüpft ist, transfiziert. Zusätzlich wurden die Zellen einer Stimulation mit einer Apoptose-auslösenden Substanz (Staurosporin) ausgesetzt. Das Ausmaß des darauf erfolgenden apoptotischen Zelltods wurde durch die sogenannte PARP-Spaltung, einem Indikator für apoptotischen Zelltod, mittels eines spezifischen Antikörpers ermittelt. PARP ist ein Substrat der todesauslösenden Caspasen (Caspase-3), und das Ausmaß der Spaltung von P ARP durch die Caspase-3 wird als spezifischer Indikator für Endschritte der Apoptose in Zellen angesehen (Konopleva M, Zhao S, Xie Z, Segall H, Younes A, Claxton DF, Estrov Z, Kornblau SM, Andreeff M (1999) Apoptosis. Molecules and mechanisms. Adv Exp Med Biol 457:217-236.; Duriez PJ, Shah GM (1997) Cleavage of poly(ADP- ribose) polymerase: a sensitive parameter to study cell death. Biochem Cell Biol 75:337- 349).
Der kodierende Bereich der m30 cDNA wurde in den Expressionsvektor pCMVtag2 der Firma Stratagene kloniert. Dabei wurde der N-Terminus der m30 cDNA "im Leseraster" mit einer Flag-Epitop-Markierung versehen. Hierzu wurde mittels PCR mit den Primern m30_Es_sl (GATC GAATTC TTT TCT CCT GAT CAA GAA; Seq ID NO 19) und m30_Sa_al (GATC GTCGAC GTC TAG AGG TCC TTG GAA; Seq ID NO 24) auf das Plasmid m30-26 ein Amplicon generiert, das mit den Restriktionsenzymen EcoRΪ und Sall geschnitten wurde, und in den pCMVtag2 -Vektor ligiert wurde. Mittels anschließender Sequenzierung konnte nachgewiesen werden, daß die Sequenz der Flag-markierten m30 cDNA keinerlei unerwünschte Mutationen enthielt.
Zur Transfektion von Säuger-Zellinien können mehrere Techniken verwendet werden, z.B.:
a Calcium-Phosphat-Transfektion von COS-1 Zellen
In Petrischalen kultivierte COS-Zellen wurden zweimal mit dem Puffer TBS gewaschen. Anschließend wurden je 3ml einer Mischung von 500μl DEAE-Dextran-beads (5mg/ml H2O, über Nacht gequollen), 1,5ml 2xTBS, 5Qμl Plasmid-DNA [0,2μg/μl] und 950μl H2O auf die Zellen gegeben. Nach 30 Minuten Inkubation im Brutschrank wurden 5ml Chloroquinelösung (50ml COS-Zellmedium (=DMEM + 10%FCS + l%Pemcilin/Streptomycin) + 500μl lOmM Chloroquine) zugegeben und die Zellen wurden weitere zwei Stunden im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurden die Lösungen abgesaugt. Die Zellen wurden mit 20%igem Glyzerin in COS-Zellmedium versetzt und dann vier Minuten inkubiert. Die Zellrasen wurden zweimal mit je 5ml TBS gewaschen und anschließend mit 10ml COS-1 Medium im Brutschrank inkubiert. b) Elektroporation von COS-1 Zellen
COS-1 Zellen wurden mit Trypsin aus den Kulturschalen gelöst und abzentrifugiert. Die Zellpellets wurden in 300μl Elektroporationspuffer resuspendiert und anschließend mit 7,5μl IM MgSO4-Lösung versetzt. Je 300μl dieser Zellsuspension wurden mit 1-5 μg Plasmid-DNA in 4mm-Elektroporationsküvetten (PEQLAB) überfuhrt. Die Elektroporation erfolgte mittels eines Gene-Pulser II (BIORAD) bei 500μF/230V. Die Zellen wurden anschließend mit 5ml COS-1 Medium im Brutschrank inkubiert.
c Elektroporation von PC12-Zellen
Die PC- 12 Zellen wurden mit Trypsin aus den Kulturschalen gelöst und die Zellzahl mittels Neubauerzählkammer bestimmt. Je Ansatz wurden 3,5 Millionen Zellen in 300μl PC-12-Zellmedium (=DMEM + 10% Horse Serum+ 5%FCS) resuspendiert und mit 10,5 μg Plasmid-DNA in 4mm-Elektroporationsküvetten (PEQLAB) überführt. Die Elektroporation erfolgte mittels eines Gene-Pulser II (BIORAD) bei 950μF/280kV. Die Zellen wurden anschließend mit 5ml PC- 12 Medium im Brutschrank inkubiert.
Zum Nachweis der Spaltung von PARP wurden COS- und PC12-Zellen transient mit dem Expressionsvektor pCMVtag2, in den die cDNA für m30 kloniert worden war, transfiziert.
Am 2. Tag nach der Transfektion wurden die Zellen fünf Stunden mit 0 oder 0,2μM
Staurosporin (CALBIOCHEM) in Medium gestresst. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde
** ι der Überstand abgenommen und die übrigen Zellen wurden mittels Abschaben von den Platten gelöst und in gekühltem (4°C) PBS mit Protease-Inhibitoren (Pepstatin [2,5mg/ml] und Aprotinin, beides SIGMA; 1:1000) aufgenommen. Die Zellen wurden dann abzentrifugiert (4min, 4000rpm) und nochmals mit 1ml PBS mit Protease-Inhibitoren gewaschen. Die erhaltenen Pellets wurden anschließend in einem Volumen 2% SDS aufgenommen und je 5μl Benzonaselösung (40μl lOOmM MgCl2 + 9μl Benzonase, BoEHRiNGER) wurden hinzugegeben. Je lμl jeder Probe wurde für eine Proteinbestimmung (BCA-Test, PIERCE, Durcliführung nach Herstellerangaben) eingesetzt. Für anschließende Westemblot- Analysen wurden je 100 μg Protein eingesetzt und diese mit 5μl 4x Ladepuffer (Laemmli) versetzt. Die Proben wurden 5 min bei 95°C denaturiert und anschließend mittels 8%igen denaturierenden SDS-Polyacrylamidgelen bei 20mA pro Gel aufgetrennt. Die Proteine wurden mittels einer Semi-Dry-Blottingkammer (BIOMETRA) in Transferpuffer (25mM Tris-HCl, 150 mM Glyzin, 10% Methanol, pH 8,3) für 60 min auf Nitrozellulosemembranen (Protan BA79, SCHLEICHER & SCHUELL) transferiert (ca. 150mA/Gel). Die Membranen wurden zunächst mit 5% Magermilchpulver (frema Reform, NEUFORM) in PBS/0,02% Tween20 geblockt, dann 3x 5min mit PBS/0,02% Tween20 gewaschen und eine Stunde bei Raumtemperatur mit dem Erstantikörper inkubiert (COS- Zellen: anti-cleaved-PARP-Antikörper, PROMEGA, 1:800; PC12-Zellen: anti-cleaved- PARP-Antikörper (Ratte), CELL SIGNAL, 1:1000). Nach dreimaligem Waschen mit PBS/Tween 20 wurden die Blots mit dem Zweitantikörper (anti-Kaninchen-Antikörper HRP-gekoppelt, Dianova, 1:5000) eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Detektion erfolgte mit dem SuperSignal Chemiluminiszenssystem von PIERCE nach Herstellerangaben auf Hyperfilm-ECL (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH).
In den COS-1 Zellen, die mit der cDNA für m30 transfiziert wurden, ließ sich - verglichen mit Zellen, die nur mit dem Leervektor transfiziert waren - nach Stimulation mit 0,2μM Staurosporin (CALBIOCHEM) eine vermehrte Spaltung von PARP nachweisen, (siehe Fig. 10). Dies zeigt, daß die Expression von m30 unter Stressbedingungen für Zellen eine zelltodfordemde Wirkung hat.
Die Proteine, die der m30-Genfamilie angehören, werden daher nicht nur spezifisch unter
Streßbedingungen, wie sie z.B. beim Schlaganfall auftreten, exprimiert, sondern sind daher mit großer Wahrscheinlichkeit auch funktioneil an dem Fortschreiten des neuronalen
Zelltods unter diesen Streßbedingungen beteiligt.
J Diese ersten experimentellen Hinweise, die für die Zelltod-fÖrdemde Wirkung der Proteine aus der m30-Familie sprechen, verdeutlichen auch erstinalig die Bedeutung der Proteine der m30-Familie als potentielle pharmakologische Targets. So könnte z.B. die
Verwendung von funktionalen Inhibitoren der m30-Proteine, die die Zelltod-fÖrdemde
Wirkung dieser Proteine hemmen, bei der Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen eine tragende Rolle spielen. Beispiel 8
Verwandte von M30 im Säugetier: m31
Viele wichtige Proteine in Säugetierzellen liegen in mehreren ähnlichen Formen vor, und werden durch sog. Genfamilien kodiert. Diese sind durch Duplikation und andere genomische Rearrangements im Laufe der Evolution entstanden. Der Vorteil dieses Prozesses ist zum einen Redundanz besonders wichtiger Funktionen, zum anderen Diversifizierung existierender basaler Funktionen. Die Hybridisierung einer Ratten cDNA-Bank aus Hippocampus (s.o.) erbrachte keine zusätzlichen ähnlichen cDNA-Klone. Eine alternative Methode zum Auffinden von Verwandten ist ein PCR- Ansatz mit degenerierten Primern (Rossner, et al, Mol Cell Neurosci, 10, 460-75, (1997, Lai and Lemke, Neuron, 6, 691-704, (1991)). Für M30 wurden folgende evolutionär konservierte Peptidbereiche zum Primerdesign benutzt: NCGHVHG und CPFCAHQ. Daraus ergeben sich folgende degenerierte Oligonukleotidsequenzen:
M30ex6deg-s: AAYTGYGGNCAYGTNCANGG; Seq ID NO 47
M30ex6deg-as: TGRTGNGCRCARAANGGRCA; Seq ID NO 48
(SEQ ID NO 47 bis SEQ ID NO 48)
Mit diesen Primem wurden PCR-Ansätze für Maus- und Ratten cDNA (Gesamthirn) und für genomische Maus-DNA unter Benutzung eines Touchdown-Protokolls durchgeführt.
Mehrere erhaltene Banden wurden subkloniert (in den Vektor pcDNA 2.1 TOPO, Fa.
Invitrogen) und sequenziert. Drei identische Klone mit einer neuen homologen Sequenz wurden aus der genomischen Maus-DNA erhalten (Länge 275 bp):
TAAYTGTGGTCATGTTCAYGGCTATCACGGCTGGGGCTGCCGGAGGGAACAAG GCCCCCAGGAGCGAGAGTGTCCTCTCTGCCGCCTTGTGGGACCCTATGTGCCC CTGTGGCTCGGTCAGGAGGCCGGTCTCTGCCTGGACCCTGGGCCACCCAGCCA CGCTTTTGCACCCTGTGGCCACGTCTGTTCTGAGAAGACTGCCCGCTACTGGGC TCAGACACCGCTGCCGCACGGCACCCATGCTTTCCACGCTGCCTGYCCGTTCTG CGCHCACC
Im Leseraster 2 kodiert diese Sequenz für ein Homologes von M30, m31:
...NCGHVHGYHGWGCRREQGPQERECPLCRLVGPYVPLWLGQEAGLCLDPGPPSH
AFAPCGHVCSEKTARYWAQTPLPHGTHAFHAACPFCAH...
Folglich existiert eine M30-Genfamilie.
Beispiel 9
Klonierung der murinen und humanen M31-cDNA (SEQ ID NO 11. SEQ ID NO 13) Herstellung muriner und humaner cDNA-Bibliotheken Mit dem cDNA-Synthese Kit der Fa. Stratagene wurde ausgehend von 2 μg humaner fötaler Gehim-mRNA (Fa. Clontech) und von 5 μg mRNA aus adultem Mausgehim entsprechende cDNA-Bibliotheken hergestellt. Dabei wurde im wesentlichen entsprechend der Angaben des Herstellers verfahren. Zur Synthese der Erststrang cDNA wurde in Abänderung zu den Herstellerangaben ein Oligonukleotid mit z.T. zufälliger Sequenz (Sequenz 5'-GAGAGAGAGAGAGAGAGOTCGAGNNNNNN-3'; Seq ID NO 49) verwendet. Die klonierungskompatiblen (EcoRI/XhoI) doppelsträngigen cDNA-Fragmente wurden größenselektioniert (nach Hertsellerangaben/ Fa. Stratagene) und in den Plasmidvektor pBluescript SKII (Stratagene) ligiert. Die Ligation wurde durch Elektroporation in E.coli (DH10B, Gibco) transformiert und auf LB-Ampizillin Agar- Platten amplifiziert. Die Plasmid-DNA wurde mittels alkalischer Lyse und Ionenaustauscher-Chromatographie isoliert (QIAfilter-Kit, Fa. Qiagen). Die Komplexität an Einzelklonen betrug für die murine Gehirn cDNA-Bank 7 Millionen und für die fetale humane Gehirn cDNA-Bank 4 Millionen. Von jeder cDNA-Bank wurden zufallsmäßig 24 Einzelklone nach Insertgrößen analysiert, die eine Größenverteilung von 800 bp bis zu 4.5 kB zeigten, die durchschnittliche Länge der cDNA-Inserts betrug für die Mausbank ca. 1.5 kB für die humane Bank ca. 1.2 kB.
Isolierung von murinen und humanen cDNA-Plasmidklonen für m31 Die Isolierung muriner und humaner cDNA-Klone für m31 wurde unter Verwendung von m31 -spezifischen biotin-markierten Oligonukleotiden durchgeführt (modifiziertes Protokoll nach Shepard und Rae (NAR 1997 25 nol5 p3183-3185)).
Verwendete Oligonukleotide zur Isolierung der murinen cDNAs: mM31-bio25
CGGTCAGGAGGCCGGTCTCTGCCTG; Seq ID NO 50 mM31-5'40
CTCTCTGCCGCCTTGTGGGACCCTATGTGCCCCTGTGGCT; Seq ID NO 51 mM31-3'40
GACCCTGGGCCACCCAGCCACGCTTTTGCACCCTGTGGCC; Seq lD NO 52
Verwendete Oligonukleotide zur Isolierung der humanen cDNAs:
Biotin Pull 5'M31hum5'40 ACCTGCCCACCCAGGTCCCCACCTCCTGCAGCCCAGAGGG; Seq ID NO 53 5'M31hum-bio25 (EST NEST search ok) AGCTCTGCATGTGGGACACTCCCTG; Seq ID NO 54 5'M31hum3'40 CTGGCACAGCACACCAGATGGACATGTTGGATGGGCTGTG; Seq ID NO 55
(SEQ ID NO 50 bis SEQ ID NO 55) Das verwendete Verfahren beruht auf einer Hybridisierung biotin-markierter humaner oder muriner 9B5 -Oligonukleotide mit 5 μg alkalisch denaturierter Plasmid-DNA. Zusätzlich werden unmittelbar 5' und 3' gelegene 40mer-OHgonukleotide hybridisert. Dadurch wurden einzelne Plasmidmoleküle spezifisch biotin markiert, die entweder murine oder humane cDNAs enthielten. Die Hybridisierungsbedingungen wurden von Sheperd und Rae übernommen ((NAR 1997 25 nol5 p3183-3185)).
Die Anreicherung der biotin-markierten Plasmidmoleküle wurde mit magnetischen Streptavidin-gekoppelten Beads durchgeführt (entsprechend den Herstellerangaben, Fa. Dynal). Nach mehrfachen Waschschritten wurden die m31 -angereicherten Plasmide thermisch von den magnetischen Beads gelöst (80°C, 2min) und in E.coli (DH10B, Gibco) elektrotransformiert. Transformandenkolonien wurden vereinigt und Plasmid-DNA isoliert (QIAprep Mini Spin-Columns, Qiagen). M31-cDNA enthaltende Plasmide wurden wiederholt durch Hybridisierung mit den entsprechenden Oligonukleotiden angereichert. Von jeweils 36 der Bakterien-Kolonien der Zweitrunden-Transformanden wurde Plasmid- DNA isoliert und mit cDNA-Insert-flankierenden Primern (T3 und T7 Primer, pBluescript SK II, Stratagene) sequenziert. Die cDNA Inserts von m.31 mRNA-Sequenz enthaltenden Plasmiden wurden mit spezifischen Primern vollständig sequenziert.
Die abgeleiteten murinen mRNA-Sequenzen mm31 wurden aus insgesamt 3 überlappenden cDNA-Klonen erstellt, die entsprechenden humanen mRNA Sequenzen (hm31) aus fünf unabhängigen cDNA-Klonen.
Charakteristika der Nukleotidsequenz von M31 Eine Datenbanksuche mit der humanen M31 Nukleotidsequenz mit dem Programm BLASTN gegen die EMBL EST Datenbank ergab ESTs in folgenden Geweben: Ovarialtumor, insbesondere (10), Niere: Wilmstumor (metastasierend zu Him), Fetus gesamt 9 Wochen, Placenta (vollentwickelt) (2), Mamma, normales Epithel, Cerebellum, hNT-Neuronen, Frontaler Cortex. Dies lässt darauf schliessen, dass m31 vor allem in Ovarien und Gehirn exprimiert ist. Die erstaunlich hohe Frequenz des Vorkommens in Ovarialtumoren lässt auf eine starke Hochregulation in diesen Tumoren schliessen, und impliziert eine wichtige diagnostische/therapeutische Bedeutung von m31 für diese Tumor gruppe.
Charakteristika der Aminosäuresequenz von M31 Es ergibt sich für hm31 ein offenes Leseraster von 445 Aminosäuren, einem
Molekulargewicht von 48 kD, und einem isoelektrischen Punkt von pH 7,95.
Eine Analyse der Proteinsequenz von hm31 mit dem Programm PSORT II ergibt keine
Hinweise auf intrazelluläre Lokalisation, insbesondere keine Kemlokalisationssequenz.
Eine Analyse mit dem Programm Tmpred zur Vorhersage von Transmembrandomänen ergibt eine mögliche TM-Region am extremen Carboxyterminus (Pos. 414 bis 436), mit dem N-Terminus intrazellulär. Dies ist im biologischen Kontext eher eine unwahrscheinliche Konstellation.
M31 ist sehr homolog zu M30 (siehe Fig. 8, Alignment von M30 und m31 aus Ratte oder
Maus und Mensch). Am N-Terminus unterscheidet es sich durch Insertion einer _ Peptidsequenz von M30. Homologe Proteine unterscheiden sich häufig am stärksten am N-
Terminus.
Eine Datenbanksuche mit der humanen m31 Proteinsequenz mit dem Programm BLASTP gegen die nrdb Datenbank ergab als einzige signifikante Hits #077237 (Drosophila
Pellino) und das bekannte cosmid F25B4 aus c. elegans ( #Q22967). Eine Datenbanksuche mit der humanen M31 Proteinsequenz mit dem Programm
TBLASTN gegen die EMBL EST Datenbank ergab keine wesentlichen neuen Sequenzen im Vergleich mit M30. Es taucht ein neues Homologes in Gallus gallus (AJ393800) und
Anopheles gambiae (AGA280402 ) auf.
Beispiel 10
Durchführung eines veast two-hvbrid-Screens mit M30 der Ratte
Die cDNA-Sequenz von M30 wurde benutzt, um einen yeast-two-hybrid Screen durchzuführen. Dieser dient dazu, solche Proteine zu delektieren, die mit dem fraglichen Protein, dem sogenannten bait protein, interagieren (Fields et al.(1998), Nature 340, S. 245 - 246). Ein Screen mit dem carboxyterminalen Drittel von M30 (Rattensequenz) als bait protein wurde mit Hilfe des αtc/zmαfer-Systems der Fa. Clontech durchgeführt. Dazu wurde mittles PCR ein M30-Fragment aus dem Rattenklon m30-17 amplifiziert (Fragment 3; Primer: m30ES-s3 GATC GAATTC TTC CCC AGC ATG AAG AGG und Primer m30Sa al GATC GTCGAC GTC TAG AGG TCC TTG GAA) und in den Vektor pGBTIO („Baitvektor") über die Klonierungsstellen EcoRI und Sall einkloniert. Der Screen wurde mit der „pretransformed human brain library" im dem Vektor pACT2 ("Prey-Vektor") durchgeführt (cat# HY4004AH). Zur Transformation des Bait-Konstruktes wurde das mating- Verfahren nach den Angaben des Herstellers benutzt. Positive Klone wurden auf Histidin-defizienten Agarplatten zur Detektion der Reportergen-Expression (Expression des His3-Gens) selektioniert. Diese Ergebnisse wurden anschließend durch die Durchfülirung einer ß-Galactosidase-Färbung verifiziert, mit der die Expression eines zweiten Reportergens, nämlich die des ß-Galaktosidase-Gens, delektiert werden kann (nach Angaben des Herstellers).
Aus den positiven Klonen wurden nach Durchführung einer Hefe-Plasmid-Minipräparation mittels PCR die cDNAs amplifiziert, die in die Prey- Vektoren der positiven Klone einkloniert worden waren. Diese cDNAs kodierend für Poteine, die mit dem bait-Protein (hier dem m30-Protein) interagieren, wurden anschließend sequenziert und durch den Vergleich mit elektronischen Datenbanken identifiziert. Von ca. 50 sequenzierten Produkten fielen 2 identische Sequenzen auf, die Ähnlichkeit zu M30 hatten:
Dieses Protein wurde M32 (SEQ ID NO 17) genannt. Aus diesem Ergebnis kann geschlossen werden, daß M30 mit M32 interagiert, und seine Funktion möglicherweise als Heterodimer erfüllt. Eine Heterodimerisierung als Voraussetzung für eine Proteinfunktion ist in vielen Beispielen belegt und ist auch hier zu vermuten.
Die Interaktion von m30 mit m32 wurde durch Kotransformationsexperimente bestätigt, wobei m30 als bait, der carboxyterminale Teil von m32 als prey fungierte. Dabei erfolgte ein Wachstum der kotransformierten Kolonien auf Histidin-defizienten Medien, allerdings keine deutlich positive ß-Galaktosidase-Färbung, so dass von einer eher schwachen Interaktion zwischen m30 und m32 auszugehen ist. Beispiel 11
Klonierung von M33 fSEO ID NO 15)
Zur fuU-length Klonierung des Klons M32 wurden für die PCR-Klonierungsmethode
Oligonukleotide entworfen. Diese amplifizierten ein Fragment der erwarteten Größe, das sich jedoch beim Sequenzieren als eine von M32 verschiedene Sequenz herausstellte.
Diese Sequenz wurde als weiteres Homologes M33 bezeichnet.
Bei einer Blast-suche (Nukleotidsuche) der EMBL-Datenbank ergaben sich mehrere genomische ungeordnete Sequenzen, die Teile von M33 enthielten.
Durch Benutzung von Informationen zu konservierten Proteinbereichen in M30 und M31, sowie der Kenntnis der Exon-Struktur, konnte die kodierende cDNA-Sequenz voll erhalten werden.
Die benutzten genomischen Sequenzen waren dabei: AL355073, AC022462, HSC6461,
CNSO1DX0, AQ473307.
Die folgende Exon-Intton Struktur ergab sich hierbei:
Exonl :
...cggcggaggcggcggcgtcggcggcggcgtcggcggccgagcggggctccAtgttttcccctggccaggaggaacactg cgcccccaataaggagccagtgaaatacggggagctggtggtgctcgg Splice e/i: Gtgctcgg//gtgagtcc
Exon 2: splice i/e ctctgtttctag//gtacaatggt gtacaatggtgctttacccaatggagatagaggacggaggaaaagtagatttgccctctacaagcggcccaaggcaaa tggtgtcaaacccagcaccgtccatgtgatatccacgccccaggcatccaag splice e/i ggcatccaag//gtaggtgggtctgtc Exo 3: splice i/e tttattattag//gctatcagctg gctatcagctgcaaaggtcaacacagtatatcctacactttgtcaaggaatcagactgtggtggtggagtacacacatga taaggatacggatatgtttcag splice e/i ggatatgtttcag//gtaata1ttttcttttttaata
Exon 4: splice i/e tttgatttacttag//gtgggcagatcaac gtgggcagatcaacagaaagccctatcgacttcgttgtcacagacacgatttctggcagccagaacacggacgaagccca gatcacacagagcaccatatccaggttcgcctgcaggatcgtgtgcgacaggaatgaaccttacacagcacggatattcg ccgccggatttgactcttccaaaaacatatttcttgga splice e/i aacatatttcttgga//gtaagtactgt
Exon 5:
splice i/e tgctgtgttctctccag//gaaaaggcagcaaagtgg gaaaaggcagcaaagtggaaaaaccccgacggccacatggatgggctcactactaatggcgtcctggtgatgcatccacg agggggcttcaccgaggagtcccagcccggggtctggcgcgagatctctgtctgtggagatgtgtacaccttgcgagaaa ccaggtcggcccagcaacgaggaaagctg splice e/i cgaggaaagctg//gtgagtgtgcttcac
Exon 6: splice i/e: aacttgttgtag//gtggaaagtgagaccaa gtggaaagtgagaccaacgtcctgcaggacggctccctcattgacctgtgtggggccactctcctctggagaacagcagatgggc tttttcatactccaactcagaagca catagaagccctccggcaggagattaacgccgcccggcctcagtgtcctgtggggctcaacaccctggccttccccagca tcaacaggaaagaggtggtggaggagaagcagccctgggcatatctcagttgtggccacgtgcacgggtaccacaactgg ggccatcggagtgacacggaggccaacgagagggagtgtcccatgtgcaggactgtgggcccctatgtgcctctctggct tggctgtgaggcaggattttatgtagacgcaggaccgccaactcatgctttcactccctgtggacacgtgtgctcggaga agtctgcaaaatactggtctcagatcccgttgcctcatggaactcatgcatttcacgctgcttgccctttctgtgctaca cagctggttggggagcaaaactgcatcaaattaattttccaaggtccaattgactga
3'utr cgcccttgacagccatctacgactttattaacaggttactgtgaagattttgccactaactctagattttacctttttgt aatgctgtttatcagaggagggtgacaggggctggaaataaagagaggggacatggtgatgaaacatggcaggagtgtaa cagataccagtggtgtgttgcatgctcaaaacagcagcgtcgtcattgaagtctgcttgattaaaccataatatctttgt aataattggatt
Auf Proteineebene ergab sich ein Protein von 420 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 46 kD. Das Programmpaket PSORT II sagt eine cytoplasmatische
Lokalisation voraus, und erkennt keinerlei Signalsequenzen oder Motive. Das Programm
TM-pred sagt voraus, dass es sich bei M33 (Mensch) um kein Transmembranprotein handelt. Die chromosomale Lokalisation von M33 ist auf Chromosom 14 .
Die Proteinsequenz aus dem Carboxyterminalen Bereich (195 Aminosäuren), die von M32 bekannt ist, weist eine erstaunliche Identität von 97.9% über diesen Bereich mit M33 auf, was erklärt, warum dieser Klon mit der PCR zur Auffindung von hm32 kloniert wurde.
Sehr wahrscheinlich interagiert auch M33 mit M30, da die Sequenzen faktisch identisch sind (zumindest im Carboxyterminalen Bereich, der interagieren sollte).
Wie die hohe Ähnlichkeit von M32 und M33 bereits nahelegt, ist auch M33 in der Lage mit M30 Heterodimere zu bilden und ist aller Noraussicht nach für dessen Funktion wichtig.
Beispiel 12
Weitere Funktionen der Mitglieder der M30-Genfamilie
Die Datenbanksuche mit dem M30 Protein aus Ratte ergab eine Homologie zu einem Protein aus Drosophila, pellino (Grosshans, et al, Mech Dev, 81, 127-38, (1999)), accession number: AF091624. In Drosophila wurde pellino aufgrund seiner Interaktion mit pelle identifiziert Gr05,5,/ αn5', et al, Mech Dev, 81, 127-38, (1999)). Pelle ist ein Protein in der Signalkaskade des toll-Rezeptors, der eine wichtige Rolle in der Embryonalentwicklung von Drosophila spielt (Nentralisierung)fSe/v and Anderson, Annu Rev Cell Dev Biol, 12, 393-416, (1996)). Dabei aktiviert Pelle das ΝF-kB-Homologe dorsal in Drosophila.
Das toll-Rezeptorsystem hat sich aus einem System mit wenigen (bekannten) Komponenten zu einem komplexen Regulationssystem im Säugetier entwickelt(Be/v and Anderson, Annu Rev Cell Dev Biol, 12, 393-416, (1996)). Im Säugetier gibt es mehrere toll-homologe Rezeptoren (IL-1, IL-18, TLR-1,...). Das wichtigste Rezeptorsystem ist der Interleukin-1 Rezeptor, der in vielen pathologischen Prozessen eine Rolle spielt (Auron, Cytokine Growth Factor Rev, 9, 221-37, (1998)). Die Aktivierung dieses Rezeptors führt ebenfalls zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors ΝF-kB, allerdings über eine Signaltransduktionskaskade mit mehreren Proteinen. Die Gruppe der Interleukin-Rezeptor- assoziierten Kinasen (IRAK-1, IRAK-2, ΪRAK-M)(Cao, et al, Science, 271, 1128-31, (1996, Muzio, et al, Science, 278, 1612-5, (1997, Wesche, et al, J Biol Chem, 274, 19403- 10, (1999)) ist dabei homolog zu pelle, und wichtig für die optimale Funktion der Signalübertragung (Kanakaraj, et al, J Exp Med, 187, 2073-9, (1998, Vig, et al, J Biol Chem, 274, 13077-84, (1999)). Da pellino im Drosophilasystem mit pelle assoziiert ist, sollten die Mitglieder der M30- Genfamilie im Säugetier eine funktioneil wichtige Rolle im IL-1- Signaltransduktionskaskaden spielen. Insbesondere ist eine funktioneile Beeinflussung der Interleukin-Rezeptor-assoziierten Kinasen (IRAK-1, IRAK-2, IRAK-M) denkbar. Ebenso kann M30 auf weiter „downstream" gelegene Ereignisse in der Signaltransduktionskaskade wirken, die eine direkte Wirkung auf die Aktivierung des Transkriptionsfaktors ΝF-kB haben. Mögliche Wirkungsorte sind hierbei -die ΝIK-Kinase oder IKK-Kinasen(X«rz'«, J Biol Chem, 274, 27339-42, (1999)). Der Signaltransduktionsweg und mögliche Wirkorte von M30 sind schematisch in Fig. 6 dargestellt. Denkbar ist auch, dass M30 an einem neuen Signalweg vom IL-1 oder IL-18- Rezeptor zu MAP-Kinasen beteiligt ist (z.B. p38). Dieser Signalweg ist bisher weniger gut charakterisiert. Ebenso wird eine Aktivierung der Jun-Ν-terminalen Kinase (JΝK) durch IL- 1 / IRAK diskutiert.
Die Funktion von Mitgliedern der M30-Genfamilie in diesem Pathway könnte eine modulierende verstärkende oder abschwächende Wirkung auf die Signalübertragung haben. Die sehr schnelle Regulation von M30-mRNA in Prozessen, in denen mterleukin-l vermehrt exprimiert wird (Kainatgabe (Eriksson, et al, Brain Res Mol Brain Res, 58, 195- 208, (1998, Panegyres and Hughes, J Neurol Sei, 154, 123-32, (1998, Yabuuchi, et al, Brain Res Mol Brain Res, 20, 153-61, (1993, Minami, et al, Biochem Biophys Res Commun, 176, 593-8, (1991, Minami, et al, Biochem Biophys Res Commun, 171, 832-7, (1990)) oder fokale cerebrale Ischämie (Buttini, et al, Brain Res Mol Brain Res, 23, 126- 34, (1994, Zhang, et al, Brain Res, 784, 210-7, (1998))), unterstreicht diese Annahme. M31 ist darüber hinaus, aufgrund seines Vorkommens in Ovarialtumoren, für Diagnose und Therapie dieser Tumorart von Bedeutung.
Bedeutung von M30 für pharmakotherapeutische Ansätze
In jüngerer Zeit gewinnen Ansätze zur Inhibierung/Beeinflussung von Signaltransduktionswegen „downstream" eines membranständigen Rezeptors in der pharmakologischen Forschung zunehmend Bedeutung. Diese Ansätze werden wahrscheinlich in Zukunft einen wichtigen Anteil in der Therapie humaner Erkrankungen haben, insbesondere bei bisher schlecht oder nicht therapierbaren Erkrankungen (Kletsas and Papavassiliou, Exp. Opin. luvest. Drugs, 8, 737-746, (1999)). Vorteile dieser Ansätze sind, dass sie erstens Ereignisse beeinflussen können, die von mehreren Stimuli hervorgerufen werden können, und eine gemeinsame Endstrecke haben, zweitens, dass zelluläre Ereignisse zeitlich nach dem auslösenden Stimulus liegen, und deshalb länger einer Intervention zugänglich sind.
Beispiele für erfolgreiche Eingriffe in solche Signalkaskaden sind beispielsweise Inhibitoren für Caspasen (Ekert, et al, Cell Death Differ, 6, 1081-1086, (1999)), die Apoptoseprozesse noch längere Zeit nach einem auslösenden Stimulus blockieren können. Besondere Aufmerksamkeit hat auch der Transkriptionsfaktor NF-kappaB gefunden, sowie Prozesse, die diesen aktivieren. Beispielsweise wurde die Klonierung der I-kappaB- Kinasen mit dem Ziel verfolgt, spezifische Inhibitoren für NF-kappaB vermittelte Gentranskription zu finden. Die pharmakologische Bedeutung von NF-kappaB liegt vor allem auf den Gebieten der Immunerkrankungen, der Krebserkrankungen, und neurologischer Erkrankungen. Ein wichtiges Aktivierungsystem für diesen Transkriptionsfaktor ist das Interleukin-1 System (Baeuerle, Curr Biol, 8, R19-22, (1998)). Eine pharmakologische Beeinflussung dieses Systems ist von potentiell grosser Bedeutung für die Therapie einer Vielzahl von Krankheiten. Das Signalsystem II- 1 /NF-kappaB kann, wie oben angeführt, an den Endpunkten, der Bindung des Liganden an den II- 1 Rezeptor beispielsweise, oder der Aktivierung von NF- kappaB selbst beeinflusst werden. Eine Vielzahl von molekularen Schritten zwischen diesen beiden Punkten sind für das Funktionieren des Systems essentiell, und bieten sich ebenfalls für eine pharmakologische Beeinflussung an. Bisher unbekannte Moleküle (wie M30) können von essentieller Bedeutung für das Funktionieren dieses Systems sein, da sie z.B. in den gängigen Assays (z.B. Zell-Transfektionsstudien) gegenwärtig sind.
Differentielle Transkriptionsprofilierungen gewinnen in der Pharmaforschung zur Identifizierung potentieller neuer Targets für Pharmaka in letzter Zeit grosse Bedeutung. Transkriptionelle Regulation, d.h. Regulation der mRNA-Menge eines Gens in der Zelle, ist ein wesentlicher Schritt für die Reaktion der Zelle auf Stimuli, neben Proteinphosphorylierungen, Proteindegradation etc. M30 unterliegt offensichtlich einer sehr raschen Regulation durch transkriptionelle Aktivierung, wie wir oben gezeigt haben. Oft haben solche schnell regulierten Gene kritische Schlüsselstellungen für zelluläre Vorgänge inne.
Eine pharmakologische Beeinflussung von M30 kann über die folgenden Ansatzpunkte erfolgen:
1. eine Beeinflussung der Transkriptmenge von m30 in der Zelle, beispielsweise die
Suppression der schnellen Hochregulation nach pathologischen Prozessen; 2. die Inhibierung einer enzymatischen Aktivität von M30, z.B. einer Kinase- Aktivität;
3. die Inhibierung einer Interaktion mit einem oder mehreren anderen Molekülen, insbesondere mit anderen Proteinen.
Beispiel 13
Beispiele für Identifizierung von Liganden Mit Hilfe gängiger Interaktionsscreeningverfahren (z.B. yeast-two-hybrid System, Screenen von Expressionsbibliotheken mit dem lambda-gtll -System, Co- Immunpräzipitationen) können Proteininteraktionspartner von M30 identifiziert werden. Ein yeast-two-hybrid Screen kann beispielsweise unter Benutzung des Matchmaker- Systems der Fa. Clontech erfolgen. Dazu wird die cDNA von M30 in einen sog. Bait- Vektor kloniert (z.B. pGBTIO). Eine Bibliothek in dem sog. Prey-Vektor (z.B. eine fötale Gehimbank) kann dann nach einem Interaktionspartner durchsucht werden (siehe z.B. (Kuner, et al, Science, 283, 74-7, (1999))). Ein Screen von Expressionsbanken im Phagensystem kann anhand gängiger Protokolle (Ausubel et al., Protocols in Molecular Biology, New York, 1997) erfolgen. Nach Auffinden eines solchen Partners kann ein Assay für ein High-throughput-screening System (HTS) aufgebaut werden. Dieses kann benutzt werden, um Inhibitoren für die Interaktion von M30 mit seinem Partner zu finden, die die Funktion von M30 damit herabsetzen oder aufheben können. Dabei kann z.B. ein System benutzt werden, das den FRET Effekt benutzt (fluorescence resonance energy transfer). Dazu werden M30 und sein Interaktionspartner in Fusion mit Mutanten des Green fluorescent proteins (GFP) kloniert, z.B. BFP (blue fluorescent protein) und GFP (green fluorescent protein, S65T Mutante) (Mahajan, et al, Nat Biotechnol, 16, 547-52, (1998)). Es können auch CFP und YFP verwendet werden. Diese Fusionsproteine werden in Bakterien oder anderen Expressionssystemen (Baculoviren, Hefen) exprimiert und auf gereinigt, z.B. über einen Polyhistidintag und Nickelsäulen. Die beiden Proteine gibt man in einer Konzentration im Bereich von 100 nM zusammen. BFP ist hierbei der Donor (Excitation bei 389 nm) und GFP der Akzeptor (Emission bei 511 nm). Der FRET Effekt tritt bei Annäherung der beiden Proteine auf 50 - 10 Angström auf. Die Proteinmischung kann in Microtiterplatten pipettiert werden, und mit Substanzen einer chemischen Bank inkubiert werden. Dabei kann es auch von Vorteil sein, zunächst das M30 Fusionsprotein mit der chemischen Substanz vorzui kubieren, und danach den Interaktionspartner zuzugeben. Eine Inhibition der Interaktion lässt sich dann über eine Abnahme des FRET- Effektes feststellen (Messung mit Photomultipliern oder Spektralphotometer). Eine Implementation eines High-throughput-screening Systems unter Ausnutzung des FRET- Effektes ist in (Mere, et al, Drug Discov Today, 4, 363-369, (1999)) beschrieben. Dieses Testsystem kann prinzipiell auch in Zellen erfolgen, unter Umständen ist dies erforderlich. Prinzipiell kann auch ein HTS-System unter Benutzung des SPA (scintillation proximity assays) (Fa. Amersham) etabliert werden. Dabei würde ein Peptid des Interaktionspartners von M30 an SPA-beads gekoppelt werden. Ein Fusionsprotein aus M30 und der Konsensusphosphorylierungsstelle der Protein-Kinase-A (Sequenz RRASV) und einem Aufreinigungstag (z.B. Polyhistidintag) kann hergestellt und aufgeremigt werden. Durch Inkubation mit Proteinkinase A und 33P-ATP kann das M30 Fusionsprotein mit 33P markiert werden. Die SPA-beads können im Microtiterformat mit Substanzen aus einer kombinatorischen library inkubiert werden. Nach Zugabe des M30 Fusionsproteins kann die Szintillation, die durch Bindung des 33P-markierten M30 Fusionsproteins an den SPA- bead entsteht, gemessen werden. Ein Inhibitor der Interaktion würde den Szintillationseffekt unterdrücken.
Ähnliche Assays, die auf dem Prinzip einer Interaktionsinhibiton beruhen, sind im Prinzip gleichwertig, und können ebenfalls eingesetzt werden. Insbesondere können diese Assay-Systeme für das Auffinden von Inhibitoren der Heterodimerisierung von M30-Familienmitgliedem (z.B. M30 und M32) benutzt werden.
Beispiel 14:
Interaktionsexperimente in Hefe mittels Kotransformationsexperimenten zum Nachweis der Interaktion von m30 mit Proteinkinasen des ILl-Signaltransduktionsweges Zum Nachweis einer möglichen Interaktion von m30 mit Kinasen der IRAK-Familie wurden m30-Fragmente in die sog. Bait- und Prey- Vektoren für das yeast-2-hybrid-System kloniert.
Zur Herstellung der Prey-Konstrukte, die die m30-Fragmenten enthielten, wurden PCR- Reaktionen mit folgenden Primerpaaren mit dem Plasmid m30-26 als Vorlage ("Template") durchgeführt:
Für die Amplifikation des Fragments m30_l_pGADT7 (n-terminal, Fragl.SEQ in Fig. 11) mittels PCR, das die aminoterminalen 525 bp umfaßt, wurde das Oligonukleotidpaar m30_Es _sl (GATC GAATTC TTT TCT CCT GAT CAA GAA; Seq ID NO 19) und m30_Sa_a2 (GATC GTCGAC GGA CGT CTT CCA TTT GGC; Seq ID NO 20) genutzt.
Für die Amplifikation des Fragments m30_2_pGADT7 (mittlerer Bereich, Frag2.SEQ in Fig. 11) mittels PCR, das die mittleren Nukleotide von 526 bis 903 bp umfaßt, wurde das Oligonukleotidpaar m30_Es_s2 (GATC GAATTC GCC AAA TGG AAG ACG TCC; Seq ID NO 21) und m30_Sa_a3 (GATC GTCGAC CCT CTT CAT GCT GGG GAA; Seq ID NO 22) verwendet.
Für die AmpHkation des Fragments m30_3 _pGADT7 (C-terminus; Frag.3.SEQ in Fig. 11) mittels PCR, das die carboxyterminalen 384 bp (904 - 1287 bp) umfaßt, wurde das Oligonukleotidpaar m30_E2_s3 (GATC GAATTC TTC CCC AGC ATG AAG AGG: Seq ID NO 23) und m30_Sa_al (GATC GTCGAC GTC TAG AGG TCC TTG GAA; Seq ID NO 24) genutzt.
Für die Amplifikation des Fragments m30_4_pGADT7 (Vollänge, Frag4.SEQ in Fig. 11) mittels PCR, das- die gesamten 1251 bp der m30-cDNA umfaßt, wurde das Oligonukleotidpaar m30_Es_sl (GATC GAATTC TTT TCT CCT GAT CAA GAA) und m30_Sa_al (GATC GTCGAC GTC TAG AGG TCC TTG GAA) verwendet.
Für die Amplifikation des Fragments m30_5_pGADT7 (N-terminale 2/3 des Proteins, Frag5.SEQ in Fig. 11) mittels PCR, das die aminoterminalen 885 bp der m30-cDNA umfaßt, wurde das Oligonukleotidpaar m30_Es_sl (GATC GAATTC TTT TCT CCT GAT CAA GAA) und m30_Sa_a3 (GATC GTCGAC CCT CTT CAT GCT GGG GAA) verwendet.
Die PCR-Fragmente wurden mit Hilfe des Qiagen-Qiaquick-Protokolls nach Herstellerangaben aufgereinigt, und nach dem Schneiden mit EcoRI und Sall in den Prey- Nektor pGADT7 der Fa. Clontech ligiert. Die fehlerfreie Sequenz der erhaltenen Klone wurden durch Sequenzierung auf beiden Νukleotidsträngen bestätigt.
Für die Klonierung von Pelle in den Eαtt-Nektor (pGBKTT) wurde Re//e mittels PCR- Reaktion aus Drosophila-Pe//e-Klonen (LD13069) amplifiziert. Hierfür wurden die Oligonukleotide pelle(pgbkt7)ΝcoIs (GAT CTG CCA TGG GAT GAG TGG CGT CCA GAC CGC CGA A; Seq ID NO 25) und pelle(pgbkt7)ecoRIas (GAT CGA ATT CCT AGT CGG TAA CAA ACG GTT CGA A; Seq ID NO 26) genutzt.
Das so erhaltene PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen Ncol und EcoRI verdaut und in den linearisierten Berit-Vektor pGBKT7 ligiert. Zur Verifikation der fehlerfreien Sequenz des so erhaltenen Konstrukts wurden die PCR-generierten Bereiche des Konstrukts von beiden Seiten sequenziert.
Als Positivkontrolle wurden die bei der Firma Clontech kommerziell erhältlichen Positivkontrollen SNF1 und SNF4 benutzt. Als Negativkontrolle wurde das Drosophila- Protein pellino als Bait mit einer anderen Serin-Threonin-Kinase (9B5) kotransformiert, die keine direkte Homologie zu Pelle aufweist und daher nicht mit Pellino interagieren sollte.
Die Hefe-Kotransformationen in HE7c-Stämmen wurden nach folgendem Protokoll durchgeführt:
Nach Aufwachsen einer Ηefekolonie in einem Endvolumen von 50 ml YPD bei 30°C bis zu einer OD600 von 0.5 - 0.6 werden die HefezeUen bei 3000 rpm 5 min abzentrifugiert. Das Zellpellet wird mit 25 ml Η2O gewascheri, anschliessend werden die Hefezellen erneut pelletiert. Das Pellet wird mit 2.5 ml H O gewaschen, und erneut pelletiert. Danach werden die HefezeUen mit 5 ml Lithium-Lösung gewaschen (100 mM LiAcetat in TE Puffer (pH 7.6)). Das Pellet wird in 250 ul der Lithium-Lösung aufgenommen. Ca. 1 ug des Bait- Plasmids werden mit 1 ug des Pre -Plasmids, 50 ug denaturierter genomischer DNA aus Heringssperma, 50 ul der Hefe-Zellsuspension, und 300 ul einer PEG-Lösung (40% PEG MW 3500, 0.1 M LiAcetat, 1 x TE (pH 7.6)) für 30 min bei 30°C inkubiert. Danach wird die Mischung für 10 min bei 42°C inkubiert, und gelegentlich invertiert. Danach wird die Mischung für 1 min auf 4°C temperiert, und anschließend durch Zentrifugation pelletiert (10.000 rpm, 20 sec). Das Pellet wird zweimal in 1 ml H O gewaschen, und dann in 50 ul H O resuspendiert, und anschliessend auf Agarselektionsplatten ohne Tryptophan und ohne Leucin („-trp-leu") und zusätzlich ohne Histidin („-trp-leu-his") ausplattiert.
Die ß-Galaktosidase-Färbung wurde nach dem folgendem Protokoll durchgeführt:
Von den Hefekolonien werden nach dreitägigem Wachstum auf Agar-Selektionsplatten ohne Tryptophan, Leucin und Histidin auf einem Nitrozellulosefilter (Schleicher und Schüll) ein Replika-Abdruck gezogen. Der Filter wird nach kurzem Trocknen in flüssigen Stickstoff überführt, um die Zellen aufzubrechen. Die Filter werden dann bei 30°C in einer Lösung mit X-Gal inkubiert. Die Blaufärbung der positiven Kolonien erfolgt - je nach Stärke der Interaktion - nach einigen Minuten bis nach einigen Stunden.
Tabelle 2: Ergebnis der m3 O/pelle / IRAK Kotransformationen
Figure imgf000059_0001
Aus diesem Ergebnis lässt sich schliessen, dass nicht nur das Drosophila-Protein pellino mit pelle interagiert, sondern daß auch das humane Homologe von pellino - m30 - mit j9e//e-homologen Proteinkinasen im Säugetier interagieren kann. Die Interaktion erfolgt hierbei vermutlich mit den aminoterminalen Proteinanteilen von m30 (siehe Lage der Fragmente Fragl.SEQ bis Frag.5.SEQ in Fig. 11 im Vergleich zu Tabelle 2). Weiterhin konnte gezeigt werden, daß das Drosophila-Protein Pellino ebenfalls noch mit dem humanen IRAKl interagieren kann. Dies zeigt, dass die Interaktion von m30-Homologen zu />et7e-homologen Proteinen in den verschiedensten Organismen zu beobachten ist, was dafür spricht, daß diese Protein/Protein-Interaktionen zwischen m30-Homologen und ?e/ e-Homologen wahrscheinlich eine sehr wichtige funktioneile Bedeutung haben. Interessanterweise funktioniert die Interaktion von pelle mit pellino nur mit pellino als bait, nicht in der „umgekehrten" Richtung, dies ist ein Phänomen, was bei vielen yeast-2-hybrid Screens beobachtet wird.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Diagnose neurodegenerativer Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration eines Proteins , aufweisend eine der Sequenzen SEQ ID NO 2,
4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, oder eines Säugetier-Homologes dieses Proteins oder eines Muteins dieses Proteins, das über einen Bereich von 50 Aminosäuren seiner Aminosäuresequenz eine Sequenzidentität mit einer der Sequenzen von über 60 % aufweist, in einer Körp'erprobe bestimmt wird.
2. Protein, aufweisend eine Sequenz SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10 12, 14, 16, 18 oder ein Homologes oder Mutein desselben, das über einen Bereich von 189 Aminosäuren eine Sequenzidentität mit einer der Sequenzen von größer 55 %, vorzugsweise mit SEQ ID NO 16 von größer 81 % oder mit SEQ ID NO 14 von größer 69 %, aufweist oder ein Fusionsprotein eines solchen Proteins mit einem anderen Protein darstellt. 3. Protein, dessen Transkript mit einer Sonde umfassend einen Bereich von 20 Nukleotiden aus den Sequenzen SEQ ID NO 17, 15 13, 11, 9, 7, 5,
3, 1 unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
4. Antikörper gegen ein Protein nach einem der Ansprüche 2 oder 3.
5. DNA-Konstrukt, umfassend Nukleinsäure codierend für ein Protein nach einem der Ansprüche 2 oder 3 und einen operativ damit verknüpften Promotor.
6. DNA-Konstrukt, umfassend einen Promotor und eine mit dem Promotor operativ verknüpfte Sequenz zur Kontrolle der Neusynthese des Proteins gemäß einem der Ansprüche 2 oder 3 in einer Zelle.
7. Verwendung eines Konstruktes nach einem der Ansprüche 5 oder 6 für die Gentherapie.
8. Zelle, enthaltend ein Konstrukt nach einem der Ansprüche 5 oder 6.
9. Transgenes nichtmenschliches Wesen, aufweisend Zellen mit einem veränderten Gen in dem Genom der betreffenden Zelle, wobei der Wildtyp des Gens für ein Protein nach Anspruch 2 oder 3 codiert.
10. Verfahren zur Diagnose einer neurodegenerativen Krankheit oder der Anfälligkeit gegenüber dieser Krankheit, gekennzeichnet durch die Sequenzabweichung in einem Gen, das für ein Protein nach einem der Ansprüche 2 oder 3 codiert, gegenüber dem Wildtyp.
11. Verfahren zur Diagnose von Karzinomen oder Sarkomen, insbesondere von Ovarialkrebs, gekennzeichnet durch den Nachweis der Überexpression eines Proteins nach SEQ ID NO 14 in einer Körperprobe.
12. Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 2 oder 3 zur Suche nach Liganden, die an diese Proteine binden.
13. Verwendung eines Proteins nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß ein Yeast- Two-Hybrid-System eingesetzt wird.
14. Ligand, der mit einer Dissoziationskonstante von kleiner 1 μM an ein Protein gemäß einem der Ansprüche 2 oder 3 bindet.
15. Verwendung eines Liganden nach Anspruch 14 zur Herstellung eines Medikaments zur
Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen und Erkrankungen des
Immunsystems sowie von Karzinomen und Sarkomen.
16. Verwendung eines Liganden nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der
Ligand das Protein IRAK-1 oder ein zu IRAK-1 homologes Protein ist.
17. Verwendung eines Liganden nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß dieser
Ligand die Oligomerisierung von M30 und seinen Homologen zu Hetero- oder
Homooligomeren beeinflußt.
18. Verwendung der Interaktion von M30 mit Proteinkinasen zur Herstellung eines
Arzneimittels zur Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen.
19. Verwendung nach Ansprach 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteinkinase eine Kinase aus der IRAK-Genfamilie oder eines ihrer Homologen oder Derivate ist.
20. Verwendung eines Inhibitors für ein Protein nach einem der Ansprüche 2 oder 3 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie von neurodegenerativen Erkrankungen.
21. Verwendung eines Inhibitors für ein Protein nach einem der Ansprüche 2 oder 3 gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die neurodegenerative Erkrankung der Schlaganfall ist.
22. Arzneimittel enthaltend einen funktionalen Inhibitor für ein Protein nach einem der Ansprüche 2 oder 3.
23. Screening- Verfahren zur Identifikation und/oder zur Charakterisierung von funktionalen Inhibitoren und/oder von Liganden von M30 oder einem Homologen von M30, umfassend die folgenden Schritte a) Bereitstellung von Zellen, die M30 oder eines seiner Homologen überexprimieren b) Behandlung dieser Zellen mit einer Apoptose-auslösenden Substanz, insbesondere mit Staurosporin, c) Behandlung eines Anteils der Zellen aus b) mit einer Substanz mit vermeintlicher
Inhibitor-Funktion bezüglich M30 oder bezüglich eines seiner Homologen, während die restlichen Zellen aus b) unbehandelt bleiben, d) Durchführung eines vergleichenden Apoptose- Assays bei Extrakten aus Zellen, die nach c) mit einem Inhibitor-Kandidaten bzw. nicht mit einem Inhibitor-Kandidat behandelt wurden, wobei die Behandlung der Zellen nach b) gleichzeitig mit der Behandlung nach c) oder die Behandlungen nach b) und c) in beliebiger Reihenfolge nacheinander erfolgen können.
24. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Apoptose-Assay aus der Spaltung des PARP-Proteins und der anschließenden quantitativen Detektion der PARP-Spaltprodukte im Westemblot besteht.
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