WO2002022943A1 - Procede pour desencrer des vieux papiers au moyen d'une cellulase, sans diminuer la resistance du papier, et procede d'evaluation - Google Patents

Procede pour desencrer des vieux papiers au moyen d'une cellulase, sans diminuer la resistance du papier, et procede d'evaluation Download PDF

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    • Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
    • Y02W30/00—Technologies for solid waste management
    • Y02W30/50—Reuse, recycling or recovery technologies
    • Y02W30/64—Paper recycling

Definitions

  • the present invention relates to a method for deinking a cellulase of waste paper without a decrease in paper strength and an evaluation method thereof.
  • the present invention relates to a method for deinking waste paper with reduced environmental impact. Furthermore, the present invention relates to a method for evaluating a cellulase which is effective for deinking treatment without reducing the paper strength (strength) and uses a small amount of a deinking agent, and a method for evaluating the effective concentration thereof.
  • Deforestation is cited as a cause of global warming, and reduction of carbon dioxide emissions is attracting attention as a global environmental problem.
  • Forest resources are mainly used in modern industries as wood, pulp, and paper.However, various methods to reduce the amount of deforestation are being studied to prevent global warming. Worked in each country.
  • Waste paper deinking is almost established as a method of recycling waste paper.
  • alkalis such as caustic soda and sodium silicate and agents such as oxidizing bleach such as hydrogen peroxide, chelating agents, and surfactants are added to promote the release of ink from pulp fibers.
  • oxidizing bleach such as hydrogen peroxide, chelating agents, and surfactants.
  • Kao Ishii proposed a deinking agent containing cellulase in Japanese Patent Application Laid-Open No. 59-9299. Paper force by the action of There is no disclosure of the decline.
  • Honshu Paper describes in Japanese Patent Publication No. 3-57235 the removal of waste paper, which is treated with an alcoholic deinking agent simultaneously or with an alcoholic acid deinking agent using an alcoholic acid-resistant cellulase, followed by an enzyme treatment. It proposes the ink method. Also, in Japanese Patent No.
  • Oji Paper proposes a deinking method in which an enzyme treatment including cellulase is followed by treatment with a deinking agent.
  • Novo Nordisk in Japanese Patent No. 3042718, is trying to search for an enzyme component that can be efficiently deinked by converting cellulase into a monocomponent.
  • alkaline chemicals and the like which are several percent by weight of dry pulp, are used for the purpose of efficient deinking by peeling and saponification of printing ink and pulp swelling.
  • pulp is usually suspended in water several tens of times the weight of dry pulp to process the pulp, which generates a large amount of waste liquid and uses chemicals to neutralize the waste liquid. It is a collection process with high environmental load. It is desired to improve such environmentally friendly deinking technology and develop an environmentally friendly deinking method.
  • Recycled paper is a technology that indirectly protects forest resources and helps to preserve the global environment, but it also reduces the environmental impact of wastewater and reduces the use of chemicals. It is expected that the environmental adaptability will be improved by further improvement.
  • enzymatic deinking has been expected as a technology to efficiently remove ink at neutral pH, but its application has been delayed due to the problems of reduced paper strength (strength) of waste paper pulp and enzyme costs. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for deinking wastepaper cellulase which can be carried out with a reduced amount of deinking chemicals and an economically feasible enzyme usage without reducing paper strength. . Disclosure of the invention
  • the present inventors attempted to fractionate each of the cellulase components derived from mold-derived cellulase, and examined the activity of the obtained enzyme components on pulp, the deinking effect of the used paper, and the strength of the obtained used paper. The properties were evaluated.
  • the cellular component which contains a significant amount of endoglucanase, was originally known to be able to degrade cellulose to give cellulose decomposed products such as dalcose when a very small amount is applied to pulp. It was found that the swelling degree indicated by the water retention value of the pulp increased with little effect of zeolites. That is, it was found that the cellulose fibers constituting the pulp were hydrated and the pulp was swollen. In the past, swelling of pulp was an effect that had been found with caustic soda and liquid ammonia, which are alkaline chemicals. However, this kind of phenomenon was not found with cellulase.
  • Cellulase also reduces the use of these chemicals by comparing the deinking activity of endalkanase with caustic soda, sodium silicate, and hydrogen peroxide, which are currently widely used deinking agents.
  • the present inventors have found that the present invention has an effect sufficient to substitute, and have completed the present invention.
  • the enzyme effective for the intended waste paper deinking application and the effective amount of the enzyme used are evaluated for the pulp swelling activity (PSA) calculated by measuring the increase in the water retention value of the pulp provided in the present invention. This makes it possible to define it. -.
  • the present invention relates to a method for deinking waste paper, which comprises using a cellulase exhibiting pulp swelling activity (PSA).
  • PSD pulp swelling activity
  • the present invention further provides a method characterized in that the pulp swelling activity (PSA) is carried out in a cellulase concentration region where the pulp swelling activity (PSA) is at a maximum value, which is 25 units (25 U) or more.
  • the present invention relates to the above-mentioned method, which is NCE4 derived from the genus Humi cola, or RCE I derived from the genus Rhizopus.
  • the present invention also relates to a cellulase enzyme effective for deinking waste paper without a decrease in paper strength and to an evaluation method for obtaining an effective enzyme concentration.
  • the present invention further provides an evaluation method characterized by measuring the degree of swelling of the pulp after the cellulase is reacted with the pulp, the pulp concentration is 1% / V), and the pulp is subjected to the optimum pH and the optimum temperature of the enzyme used.
  • An evaluation method characterized by measuring the change in pulp water retention value (WRV) after reaction with cellulase for 60 minutes, and a pulp concentration of 1% (W / V), optimum ⁇ ⁇ After reacting cellulase for 60 minutes under conditions of optimum temperature, increase pulp water retention value (WRV) by 1% Pulp swelling with 10 units (10U) of cellulase activity
  • the present invention relates to an evaluation method characterized by measuring activity (PSA).
  • the cellulase used in the present invention is characterized by containing endoglucanase. Specifically, monocomponent endoglucanase, cellulase containing a large amount of a specific endalcanase component, and the like can be used.
  • the origin of the endalcanase contained in the cellulase is derived from fungi (genus Tricoderma, for example, Trichoderma ′ reesei reesei), genus Humicola, for example, Humicola inso. Genus (ik insolens), genus Acremonium (Acremonium), such as acremonium cell mouth lyticus cellulolyticus, genus Rhizopus (eg, R_oryzae), genus Mucor (eg) Mucor 'I circinel loides, Phycomyces, such as P.
  • Cellulase is an enzyme that decomposes a water-insoluble cellulose substrate by the synergistic action of several kinds of enzymes, and its components are known to be / 3-dalcosidase, endo-dalkanase, and cellopiohydrase.
  • components such as EGI to EGIV for Trichoderma-derived endalcanase and EGI to EGV for Fumichila endorcanase are known, but all are used in the method of the present invention. it can.
  • each component of cellulase may be classified as one of the sugar hydrolase families proposed by Hennrissat et al.
  • the present inventors have already provided cellulases derived from the genus Trichoderma, cellulases derived from the genus Humicola, cellulases derived from the genus Rhizopus, and the like as such mold-derived cellulases. Similar cellulases are also available from Genencor, Novo, Iogen and others. Kao, on the other hand, provides Bacillus cellulases as bacterial cellulases. In the present invention, these cellulases can also be used.
  • SCE3 which is an endoglucanase derived from the genus Trichoderma
  • NCE4 which is an endoglucanase derived from Humicola
  • RCE1 which is an endoglucanase derived from the genus Rhizopus, which the present inventors have already provided.
  • SCE3 which is an endoglucanase derived from the genus Trichoderma
  • NCE4 which is an endoglucanase derived from Humicola
  • RCE1 which is an endoglucanase derived from the genus Rhizopus
  • SCE3 described in W098 / 54332 as a cellulase derived from Trichoderma sp.
  • NCE4 described in W098 / 03640 as a cellulase derived from Humicola sp. The deinking activity was compared.
  • the pulp swelling activity (PSA) proposed in the present invention is measured as follows. 0.5 g of pulp that has been completely disintegrated with a standard disintegrator described in JIS P-8209 for 20 minutes is adjusted to a pulp concentration of 1% (W / V) with a buffer of the optimal pH of the enzyme used for evaluation. Suspend as above, add enzyme and react at optimal temperature for 60 minutes. reaction In order to measure the degree of swelling of the pulp afterwards, the water retention value which is one of the indicators of the degree of swelling
  • WRV pulp water retention value
  • PSA pulp swelling activity
  • This pulp swelling activity is not necessarily proportional to the amount of enzyme added, but this is because the amount of enzyme added is too small-the pulp does not swell and swell-the PSA is low, but the enzyme added If the amount is too large, the cellulose fibers of the pulp will be cut excessively, so that water cannot be contained between the fibers and PSA will decrease. Therefore, PSA will show a peak (maximum) over a range of enzyme concentrations.
  • the preferred enzyme for practicing the present invention is an enzyme having a higher PSA value even with a small amount of addition.
  • it is an enzyme whose pulp swelling activity (PSA) value is more than 25 units (25 U) per 0.5 g of absolutely dried pulp.
  • the amount of the enzyme to be used is preferably near the maximum value of the pulp swelling activity (PSA) as described above if the value of the pulp swelling activity (PSA) is 25 units (25 U) or more, depending on the enzyme used. It changes appropriately.
  • the optimal pH and optimal temperature of the enzyme in the present invention can be measured by the following procedure.
  • the buffer used for the measurement of the optimal pH was 50 fflM acetate buffer for pH 4-5.5, 50 mM phosphate buffer for pH 6-8, and 50 mM glycine-sodium hydroxide buffer for pH9. Used.
  • a solution containing the enzyme is added to 0.5 ml of a buffer in which 2% of CMC (carboxymethylcellulose, manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) is dissolved, and the mixture is incubated at 30 to 70 ° C for 30 minutes.
  • CMC carboxymethylcellulose, manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • the concentration of the resulting reducing sugar in the resulting reaction solution is determined by the 3,5-dinitrosalicylic acid method (DNS method). sand That is, the reaction solution 30 minutes after the reaction 1.
  • NDS method 3,5-dinitrosalicylic acid method
  • NS reagent 3 Add Om 1, incubate in a boiling water bath for 5 minutes, dilute with distilled water 8.0 m 1, Measure the absorbance at 540 nm.
  • a calibration curve is created using the glucose solution diluted stepwise, and the amount of reducing sugars produced in the enzyme reaction solution is determined in terms of glucose.
  • the activity is calculated using the amount of enzyme that produces reducing sugars equivalent to lAimol of glucose per minute as one unit.
  • the DNS reagent can be prepared according to the description in the literature (for example, "Biochemical Experimental Method 1: Determination of Monosaccharides", pp. 19-20, 1981, Sakuzo Fukui, Gakkai Shuppan Center).
  • the deinking activity of cellulase is measured as follows when newspaper waste paper cut into 3 cm squares is used as raw material waste paper. 24 g of absolutely dry raw paper is disintegrated at 50 ° (:, 20 minutes) using a standard disintegrator described in JIS P-8209 to obtain waste paper pulp. Cellulase is added to waste paper pulp whose pH has been adjusted with a buffer solution or sulfuric acid. Enzyme reaction for 1 hour at 50 ° C After the reaction, add distilled water at 50 ° C to the waste paper pulp to 4.5 L, and use an experimental flow meter (floating screening tester FW type).
  • the whiteness of the cellulase-treated sample is measured by measuring the cellulase untreated sample.
  • the value obtained by subtracting the whiteness of the cellulase-untreated sample from the temperature is defined as the whiteness (deinking activity) Comparing the deinking activity with the cellulase components, cellopiohai, which is considered to be degraded from the end of cellulose.
  • Detoxase shows excellent deinking activity when the amount of enzyme added to bone-dry pulp is in the range of 0.001 to 0.1% (/ W).
  • endodalkanase which is considered to degrade cellulose molecular chains randomly, can show deinking activity with a low enzyme addition of 0.01% (W / W) or less. Furthermore, the deinking effect is reduced when the enzyme is treated with an excess amount such as 0.1% (W / W).
  • the amount of cellulase added is usually indicated by cellulase weight or cellulase activity with respect to dry pulp weight. Any amount of cellulase can be added as long as it is within the range where the deinking effect can be exerted.However, in general, it is sufficient to show effective deinking activity in consideration of economical efficiency-minimum -The amount is added. J ⁇ The effect of the ink can be exerted _
  • the enzyme concentration that can be expressed in terms of the pulp swelling activity (PSA) proposed by the present inventors is such that a cellulase that exhibits an activity of 25 U or more per 0.5 g of pulp bone dryness. It can be defined as zero concentration.
  • the amount of added cellulase is expressed as enzyme activity using hydroxyethylcellulose (HEC) as a substrate, based on absolutely dried pulp lg.
  • HEC hydroxyethylcellulose
  • the amount of enzyme that reduces the substrate of IMOI is defined as InkatZg ⁇ pulp
  • it can be added in the range of 0.01 nkat / g-pulp or more and 10000 nkat / g-pulp or less.
  • it is not more than 100 nkatZg ⁇ pulp, more preferably not more than 10 nkat / g ⁇ pulp.
  • used paper is suspended in water, disintegrated with a disintegrator such as pulp, and then deinking chemicals such as caustic soda, sodium silicate, hydrogen peroxide, and a chelating agent are added and ripened. .
  • deinking chemicals such as caustic soda, sodium silicate, hydrogen peroxide, and a chelating agent are added and ripened.
  • the ink is removed together with the deinking agent, which is a surfactant, by flotation or cleaning to remove printing ink.
  • the cellulase treatment in the used paper deinking method provided by the present invention is preferably used instead of a commonly used deinking agent at the time of ripening simultaneously with or after defibration.
  • the pH can be adjusted with a slight amount of acid or alkali such as sulfuric acid or caustic soda to keep the waste paper pulp at the optimal pH for cellulase, and a buffer solution is added. It is also possible.
  • Waste paper used for cellulase deinking can be any commonly used paper. These can also be used, but preferably, used newspapers, used magazines, and used office paper can be used. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • Piohydrolase having an optimum pH near PH5, and an optimum pH near pH6 Piohydrolase having an optimum pH near PH5, and an optimum pH near pH6.
  • NCE2 (described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-126492) with enhanced Humicola sp.
  • Piohydrolase having lipase and NCE4 (described in W098 / 03640) with enhanced endal kana monolase component was used.
  • Pulp was added with a 0.3% (W / V) deinking agent (Lipotol LH-350, manufactured by Nikka Chemical Co., Ltd.), and subjected to floatation for 10 minutes. Further, the pulp is collected with a 140 mesh sieve and washed with distilled water. ⁇ After dehydration, the pulp is diluted with distilled water so that the pulp concentration becomes 0.15% (W / V), and the wiping device is used as described in JIS P-8209. By A hand plow sheet was prepared. As a control, a waste paper pulp not treated with cellulase was subjected to the same operation to obtain a cellulase-untreated sample.
  • a deinking agent Lipotol LH-350, manufactured by Nikka Chemical Co., Ltd.
  • the whiteness of the handsheet was measured using a reflectance measuring instrument (spectrophotometer CM525I, manufactured by Minolta) based on JIS P-8123.
  • the difference between the whiteness of the cellulase-treated sample and the whiteness of the cellulase-untreated sample was defined as ⁇ whiteness.
  • the PSA was measured in the same manner as in Example 1. Further, the tensile strength was measured according to JIS P-8113, and the tear strength was measured according to JIS P-8116, and the specific tensile strength and the specific tear strength were calculated.
  • Tables 2 and 3 show the results of measurement of the deinking effect of Trichoderma spp. From the results shown in Table 2, it is clear that cellopiohydrase having no swelling effect has no deinking effect. Also, from the results in Table 3, it can be seen that the endalcanase having a pulp swelling effect shows a significant decrease in strength in the low concentration region where the PSA is 25 U or more and the absolute dry pulp weight is 0.01% (W / W) or less. It has been found that it has a deinking effect without using. Furthermore, it was found that with an excessive amount of 0.1% (W / W), the deinking effect was reduced or the intensity was reduced by the enzyme treatment.
  • the amount of conventional deinking chemicals used is 1.5% (W / W) caustic soda + 3% (W / W) sodium silicate + 0.5% (W / W) hydrogen peroxide Based on this, the effect of reducing the amount of deinking chemicals used by enzyme deinking was examined.
  • waste paper pulp enzymatically treated with 0.01% (W / W) of SCE 3 was used in three stages of deinking chemicals, i.e., 1/4, 1/2, 1x use Treated with an amount of deinking agent.
  • the chemical treatment was performed by immersing waste paper pulp in the chemical at 50 ° C for 60 minutes.

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Description

明細書 紙力低下を伴わない古紙のセルラーゼ脱墨法及びその評価方法 技術分野
本発明は、 環境への負荷が軽減された古紙の脱墨方法に関する。 更に 紙力 （強度） 低下を伴わず、 かつ脱墨用薬剤の使用量を低減した脱墨処 理に有効なセルラ一ゼとその有効濃度とを評価する方法に関する。 背景技術
森林伐採は地球温暖化の原因としてあげられ、 二酸化炭素排出量の削 減は地球規模の環境問題として注目されている。 森林資源は主に木材 · パルプ ·紙として現代産業に活用されているが、 地球温暖化を防ぐため 森林伐採量を減らす種々の方法が検討されており、 紙分野では古紙リサ ィクル率の向上が各国で取り組まれている。
古紙脱墨処理は、 古紙リサイクルの方法としてほぼ確立されている。 現状では、 苛性ソーダ、 珪酸ソーダなどのアルカリ と過酸化水素などの 酸化漂白剤、 キレート剤、 界面活性剤等の薬剤を加え、 パルプ繊維から のインクの剥離を促進する。 この後、 洗浄法及び 又はフローテーショ ン法を用いてパルプとインクを分離する脱墨処理が行われている。
しかし、 古紙原料や印刷技術の多様化により、 従来の脱墨技術では脱 墨が困難になってきている。 また、 粘着異物 · 繊維損傷 · 排水負荷等の 課題を解決するため、 より環境にやさしい脱墨方法として中性脱墨処理 が注目されており、 この中性脱墨をより効果的に行うためにセルラ一ゼ などを利用した酵素処理が検討されている。
カピゃ細菌由来のセルラーゼを用いる古紙の脱墨処理方法に関する提 案として、 花王石鹼は特開昭 59- 9299号公報においてセルラーゼを含有 する脱墨剤を提案しているが、 想定されるセルラーゼの作用による紙力 の低下については何ら開示がない。 また、 本州製紙は特公平 3- 57235号 公報においてアル力リ耐性セルラ一ゼを用いてアル力リ性の脱墨用薬剤 と同時あるいは脱墨用薬剤で処理した後に酵素処理を行う古紙の脱墨法 を提案している。 また、 特許 2805313号公報において王子製紙はセルラ ーゼを含む酵素処理後に脱墨薬剤で処理する脱墨法を提案している。 ま た、 ノボ . ノルディスクは特許 3042718号公報において、 セルラーゼの モノコンポーネント化により効率的に脱墨できる酵素成分の探索を試み ている。 しかしながら、 上記のいずれの方法でも、 古紙の脱墨における 紙力 （強度） .の低下や環境 Jこ-負荷がかかる化学薬品の低減 _、 低.コス トで 脱墨効果を実現するための酵素の選抜に対して有効な手段を講ずること ができなかった。
さまざまな検討が行われているにもかかわらず、 酵素脱墨処理の普及 率は極めて低い。 セルラーゼは、 これまでにベッセルピックの除去、 抄 紙性 · ろ水性の改善、 古紙脱墨などの分野への適用が検討されてきた。 しかしながら、 セルラーゼが高価なこと、 セルラ一ゼの作用 ·効果がは つきり しないことから、 ベッセルピ Vクの除去以外の分野ではほとんど 実用に供されていないのが現状である。 更に、 セルラ一ゼがセルロース- 繊維を分解する酵素であることから、 脱墨後の古紙パルプの収率低下、 紙力 （強度） 低下が起こりやすいことが指摘されている。
一方、 古紙脱墨処理は印刷インキの剥離 · けん化、 パルプ膨潤による 効率的脱墨の目的から、 乾燥パルプ重量あたり数％にもおよぶアルカリ 性化学薬品等が使用されている。 また、 通常乾燥パルプ重量あたり数十 倍の用水に懸濁してパルプが処理されるため、 大量のアル力リ性廃液が 発生するとともに、 本廃液の中和処理に化学薬品が使用されるため、 環 境負荷の高い回収処理となっている。 このような環境負荷の高い脱墨技 術を改善し、 環境にやさしい脱墨方法の開発が望まれている。
古紙再生処理は間接的に森林資源を保護し地球環境の保全に役立つ技 術ではあるが、 廃水の環境負荷低減や化学薬品の使用量低減などのさら なる改善により、 環境適応性が向上するものと期待されている。 そこで 酵素脱墨処理は、 中性 pHにおいて効率的にィンクを除去する技術として 期待されてきたが、 古紙パルプの紙力 （強度） 低下や酵素コス トが課題 となり応用が見合わされてきた。 したがって、 本発明の目的は、 紙力を 低下させずに、 脱墨用薬剤の使用量を低減し、 経済的に可能な酵素使用 量で実施する古紙のセルラーゼ脱墨方法を提供することにある。 発明の開示
以上のように、 古紙脱墨に用いるセルラ一ゼには、 紙力 （強度） を低 下させずに経済的な酵素使用量で脱墨効果を得ることが望まれている。 そこで本発明者らは、 カビ由来のセルラ一ゼにっき、 おのおののセルラ ーゼ成分の分画を試み、 得られた酵素成分のパルプへの作用性、 古紙脱 墨作用及び得られた古紙の強度特性を評価した。
驚くべきことに、 ェンドグルカナーゼを著量含有するセルラ一ゼ成分 は、 極めて少量をパルプに作用させると、 セルロースを分解してダルコ ースなどのセルロース分解物を与えるという本来知られていたセルラー ゼの作用をほとんど起こさず、 パルプの保水値で示される膨潤度が上昇 することがわかった。 すなわち、 パルプを構成するセルロース繊維を水 和させ、 パルプを膨潤させることがわかった。 従来、 パルプの膨潤はァ ルカリ性化学薬品である苛性ソーダや液状アンモニアに見出されてきた 効果であるが、 ことセルラーゼに関してはこの種の現象は見出されてい なかった。
更に鋭意検討の結果、 本発明者らは、 セルラ一ゼによるパルプの膨潤 と古紙の脱墨効果、 膨潤作用をもつセルラーゼの種類と古紙脱墨に有効 なセルラーゼの種類には良好な相関があることを見出した。 この結果、 驚くべきことにカビ由来のエンドダルカナーゼは、 従来報告されている 処理酵素濃度よりも低い濃度領域で古紙の脱墨活性を発現するとともに. 酵素脱墨処理された古紙の強度は酵素処理前の古紙の強度と遜色がない ことを見出すに至った。 また、 エンドダルカナ一ゼによる脱墨活性を現 在ひろく用いられている脱墨用薬剤である苛性ソーダ · 珪酸ソーダ · 過 酸化水素と比較したところ、 セルラーゼはこれらの化学薬品使用量を低 減させる、 あるいは代替するに足る効果を示すことを見出し、 本発明を 完成するに至った。
すなわち、 目的とする古紙脱墨用途に有効な酵素と有効な酵素使用量 は、 本発明に提供されるパルプの保水値の上昇を測定して算出されるパ ルプ膨潤活性（PSA)を評価することにより定義することが可能となった ので-あ-る。 - .
本発明は、 パルプ膨潤活性（PSA)を示すセルラーゼを用いることを特 徵とする古紙の脱墨方法に関する。 本発明は、 さらにパルプ膨潤活性 (PSA)が 25単位（25U)以上となるセルラーゼ濃度領域で行うことを特徴と する方法、 パルプ膨潤活性（PSA)が極大値を示すセルラーゼ濃度領域で 行うことを特徴とする方法、 セルラーゼがェンドグルカナ一ゼであると こ ろ の 方 法 、 お よ びェ ン ド グル カ ナ 一 ゼが ト リ コ デル マ ( Tr i chode rma) 属由来の SCE3、 又はフミコーラ ( Humi co l a) 属由来の NCE4、 又はリゾブス ( Rh i z opus ) 属由来の RCE Iである上述の方法に関す る。
また本発明は、 紙力低下を伴わない古紙の脱墨処理に有効なセルラー ゼ酵素及び有効な酵素濃度を得るための評価方法に関する。 本発明は、 さらにパルプにセルラーゼを反応させた後パルプの膨潤度を測定するこ とを特徴とする評価方法、 パルプ濃度 1 % / V)、 用いる酵素の至適 pH 及び至適温度でパルプをセルラーゼで 60分間反応させた後、 パルプの保 水値（WRV)の変化を測定することを特徴とする評価方法、 および絶乾 0. 5 gのパルプを基質として、 パルプ濃度 1 % (W/V)、 至適 ρΗ · 至適温度の 条件下でセルラーゼを 60分間反応させた後、 パルプの保水値 （WRV)を 1 %増加させるセルラ一ゼの活性を 10単位（10U)とするパルプ膨潤活性 (PSA)を測定することを特徴とする評価方法に関する。 本発明に用いられるセルラーゼはェンドグルカナ一ゼを含有すること を特徴とし、 詳しくはモノコンポーネント化エンドグルカナ一ゼ、 特定 エンドダルカナーゼ成分を大量に含有するセルラ一ゼなどを用いること ができるが、 その酵素製剤の製造方法に限定されるものではない。 また セルラーゼに含有されるエンドダルカナーゼの起源は、 カビ （トリコデ ルマ (Tric oderma) 属、 例えばトリコデルマ ' リーセィ reesei) トリコデルマ · ビリデ viride)、 フミコーラ (Humicola) 属、 例え ばフ ミ コーラ · イ ンソ レンス （ik insolens )、 ア ク レモニゥム ( Acremonium) 属、 例えばアク レモニゥム · セル口 リ ティ カス cellulolyticus)、 リゾプス (Rhizopus) 属、 例えばリ ゾブス · ォリゼ 一 (L_ oryzae)、 ムコール (Mucor) 属、 例えばムコール ' サ一シネロ イデス （I circinel loides)、 ファイコマイセス (Phycomyces) 属、 例 えばファイコマイセス - 二テンス (P. nitens) など） や細菌 （バチル ス (Bacillus) 属、 シュ一ドモナス (Pseudomonas) 属、 クロス トリジ ゥム (Clostridium) 属など） など、 エンドダルカナーゼを生産するも のであればよい。 また、 これらのエンドダルカナーゼの遺伝子を導入し た形質転換体に由来する酵素などを用いることができるが、 本記載によ り制限を受けるものではない。
セルラーゼは、 数種類の酵素の協働作用により水不溶のセルロース基 質を分解する酵素であり、 その成分として /3—ダルコシダーゼ、 エンド ダルカナ一ゼ、 セロピオハイ ド口ラーゼが知られている。 例えば、 トリ コデルマ属由来のエンドダルカナーゼについては EGI〜EGIV、 フミコ一 ラ属由来のェンドダルカナーゼについては EGI〜EGVなどの成分が知られ ているが、 本発明の方法に全て利用できる。 また、 セルラーゼの各成分 は Hennrissatらの提唱する糖加水分解酵素ファミリ一に分類される場合 もあり、 近年ではエンドダルカナ一ゼ （EC.3.2.1.4) が存在するフアミ リ一として、 5、 6、 7、 8、 9、 12、 44、 45、 48、 51、 61、 74などが あることが知られている。 例えば、 トリコデルマ ' ビリデ由来のエンド グルカナ一ゼ I Iはファミリー 5に、 フミコ一ラ ' インソレンス由来のェ ンドグルカナ一ゼ Vはファミリ一 45に分類されることが知られている。 市販のセルラーゼは、 細菌 · カビなどの微生物により上記 3成分の混 合物として生産されることが多い。 従来培養条件を工夫することにより 酵素構成成分の組成比を若千変化させることはできたが、 大幅な変化を 与えることは困難であった。 ところが、 近年の遺伝子工学技術の発展に より特定遺伝子の選択 · 発現が可能となったことから、 紙パルプの処理 に有効な特定のセルラーゼ成分を分離 · 同定しさらには高発現クローン を創製すること.により経済的に-優れた新規酵素を創製できる可能性が高 まった。
本発明者らは、 すでにこのようなカビ由来のセルラーゼとして、 トリ コデルマ属由来のセルラーゼ、 フミコーラ属由来のセルラーゼ、 リゾプ ス属由来のセルラ一ゼなどを提供してきている。 同様なセルラーゼは Genencor社、 Novo社、 I ogen社なども提供している。 一方、 花王は細菌 由来のセルラーゼとしてバチルス属セルラーゼを提供している。 本発明 には、 これらのセルラーゼも使用可能である。 好ましくは、 本発明者ら がすでに提供してきたトリコデルマ属由来のェンドグルカナーゼである SCE3、 フミコ一ラ属由来のエンドグルカナ一ゼである NCE4、 リゾプス属 由来のェンドダルカナーゼである RCE 1などをあげることができる。
本発明では、 エンドダルカナーゼとして、 トリコデルマ属由来のセル ラーゼとして W098/54332号に記載の SCE3を、 フミコーラ属由来のセルラ ーゼとして W098/03640号に記載の NCE4を選び下記試験に用いて脱墨活性 の比較を行った。
パルプ膨潤活性（P S A)の測定方法
本発明で提案するパルプ膨潤活性（PSA)は以下のように測定する。 J I S P- 8209に記載の標準離解機により 20分間離解した絶乾 0. 5 gのパル プを、 評価に用いる酵素の至適 pHの緩衝液でパルプ濃度が 1 % (W/V)に なるように懸濁し、 酵素を添加して至適温度で 60分間反応させる。 反応 後のパルプの膨潤度を測定するため、 膨潤度の指標の一つである保水値
(WRV)を 「紙パルプの試験法」 （紙パルプ技術協会編集 · 発行、 1995年） p 73に示されたパルプの保水値（WRV)測定法に基づき測定する。 未処理 パルプについても同様にして膨潤度 （保水値） を測定する。 酵素処理パ ルプの保水値を未処理パルプの保水値と比較し、 保水値が 1 %増加する ような酵素活性を 10単位（10U)とし、 この単位をパルプ膨潤活性（PSA)と 定義する。
このパルプ膨潤活性（PSA)は酵素の添加量とは必ずしも比例しないが これは添加する酵素の量が過少である-とパルプ-は膨-潤しないた—め PSAは 低くなるが、 添加する酵素の量が過剰であるとパルプのセルロース繊維 が過剰に切断されるため繊維間に水を含むことができなくなり PSAは低 下すると考えられる。 それゆえ、 PSAはある範囲の酵素濃度でピーク (極大値） を示すこととなる。
パルプ膨潤活性 （P SA) は大きいほど脱墨効果が高くなることから、 本発明を実施する上で好ましい酵素は添加量が少なくても PSAがより高 い数値を示す酵素である。 すなわち、 パルプ膨潤活性 （PSA) の値が絶 乾パルプ 0. 5 gあたり 25単位（25U)以上示す酵素である。 また、 使用する 酵素の添加量はパルプ膨潤活性 （PSA) の値が 25単位（25U)以上であれば 先に記載したように PSA値が極大となる近傍が好ましく、 その範囲は用 いる酵素により適宜変化する。
本発明における酵素の至適 pHと至適温度は、 次のような手順により測 定できる。 なお、 至適 pHの測定に使用する緩衝液は、 pH4〜5. 5について は 50fflM酢酸緩衝液、 pH6〜8については 50mMリ ン酸緩衝液、 pH9について は 50mMグリシン—水酸化ナトリウム緩衝液を用いる。
酵素を含む溶液 0. 5m 1 を、 2 %の CMC (カルボキシメチルセルロース、 東京化成工業株式会社製） を溶解させた緩衝液 0. 5m 1 に添加し、 30— 70°Cで 30分間インキュベーションする。 次いで、 得られる反応液の生成 還元糖濃度を、 3, 5-ジニトロサリチル酸法 （DNS法） で定量する。 すな わち、 反応 30分後の反応液 1. Om 1 中に]) NS試薬 3. Om 1 を添加し、 沸騰 水浴中で 5分間インキュベーショ ンした後、 蒸留水 8. 0 m 1 で希釈し、 540 n mの吸光度を測定する。 段階的に希釈したグルコース溶液を用い て検量線を作成し、 酵素反応液中の生成還元糖量をグルコース換算で決 定する。 1分間に l Ai mo lのグルコース相当の還元糖を生成する酵素量 を 1単位として活性を算出する。 なお、 DNS試薬は文献 （例えば、 「生物 化学実験法 1 一還元糖の定量法」、 第 19〜20頁、 1981年、 福井作蔵著、 学会出版センター） の記載に従って調製することができる。
セルラーゼの脱墨活性一-.
セルラーゼの脱墨活性は、 新聞古紙を 3 cm角に裁断したものを原料古 紙として用いた場合以下のように測定される。 絶乾 24 gの原料古紙を J I S P- 8209に記載の標準離解機により 50° (：、 20分間離解を行い古紙パル プを得る。 緩衝液又は硫酸により pHを調整した古紙パルプにセルラーゼ を添加、 50°C、 1時間酵素反応を行う。 反応後、 古紙パルプに 50°Cの蒸 留水を 4. 5 Lになるように添加し、 実験用フローテ一ター （浮遊選別試 験機 FW型、 共伸産業社製） に供し、 対絶乾パルプ 0. 1〜0. 5 % (W/V)の脱 墨剤 （リポトール LH- 350、 日華化学社製） を添加し 10分間フローテーシ ヨンを行う。 更にパルプを回収して、 蒸留水で洗浄 · 脱水した後、 パル プ濃度 0. 15 % (W/V)になるように蒸留水で希釈し、 J I S P- 8209に記載の 方法で手すき装置により抄紙して手すきシートを得る。 対照として、 セ ルラーゼで処理しない古紙パルプに同様の操作を行い、 セルラーゼ無処 理サンプルとする。 手すきシートの白色度は、 J I S P- 8123に基づいて反 射率測定計器を用いて測定する。 同様に、 セルラ一ゼ無処理サンプルに つき測定を行い、 セルラーゼ処理サンプルの白色度からセルラーゼ無処 理サンプルの白色度を差し引いた値を△白色度 （脱墨活性） と定義する。 脱墨活性をセルラーゼの各成分で比較すると、 セルロースの末端より 分解を進めるとされるセロピオハイ ド口ラーゼには、 絶乾パルプに対す る酵素添加量が 0. 001〜0. 1 % ( /W)の範囲において優れた脱墨活性を見 出すことはできないが、 セルロースの分子鎖をランダムに分解するとさ れるエンドダルカナ一ゼには、 0.01% (W/W)以下という低い酵素添加量 での脱墨活性を見出すことができる。 更に、 0.1% (W/W)のような過剰量 で酵素処理すると脱墨効果は減少する。
セルラーゼによる古紙脱墨方法において、 セルラ一ゼの添加量は、 通 常乾燥パルプ重量に対するセルラーゼ重量又はセルラ一ゼ活性で示され る。 セルラーゼ添加量は、 脱墨効果を発揮できる量の範囲であればいず れの数量をも添加することができるが、 通常の場合、 経済性を考慮して 有効脱墨活性を示すに足る-最小-量が添加される.。 J兑墨効果を発揮 _でき-る 酵素濃度は、 本発明者らの提案するパルプ膨潤活性（PSA)で表わすなら ば、 パルプ絶乾 0.5gに対して 25U以上の活性を示すようなセルラ一ゼ濃 度と定義できる。 また、 添加セルラーゼ量は、 ヒドロキシェチルセル口 ース （HEC)を基質とした酵素活性で表した場合、 絶乾パルプ lgに対して. IMOIの基質を減少させる酵素量を InkatZg · pulpとして定義すると、 0.01 nkat/g - pulp以上 10000 nkat/g - pulp以下の範囲で添加するこ とができる。 好ましくは、 100 nkatZg · pulp以下、 更に好ましくは 10 nkat/g · pulp以下である。
一般的な脱墨工程では、 古紙を水に懸濁しパルパ一などの離解装置に より離解した後、 苛性ソーダ ·珪酸ソーダ · 過酸化水素 · キレート剤な どの脱墨用薬剤が添加され熟成が行われる。 更に界面活性剤である脱墨 剤とともに、 印刷インク除去のためのフローテーショ ンあるいは洗浄に 供されて脱墨される。 本発明で提供する古紙脱墨法におけるセルラーゼ 処理は、 離解と同時にあるいは離解後の熟成の時点で、 通常使用される 脱墨用薬剤に代替し使用することが好ましい。 この際セルラーゼ活性を 最大限に発揮するために、 古紙パルプをセルラーゼの至適 pHに保つよう に若干の硫酸や苛性ソーダなどの酸 ' アルカリで pHを調整することもで きるし、 緩衝液を添加することも可能である。
セルラーゼ脱墨に供される古紙は、 通常用いられるものであればいず れをも使用することが可能であるが、 好ましくは、 新聞古紙、 雑誌古紙. オフィス古紙などをあげることができる。 発明を実施するための最良の形態
本発明をより具体的に説明するため、 以下に実施例を示すが、 本発明 は実施例により限定されるものではない。
実施例 1 トリコデルマ属由来のェンドグルカナーゼ II (EGII)及びセロ ピオハイ ド口ラ一ゼ I (CBHI)のパルプ膨潤活性（PSA)の測定
標準離解機 （タツピ—パル―プ離解機、 東洋精機製） で 2ΰ.分間離解した 絶乾 0.5 gの新聞古紙を ρΗ5の 50 mMクェン酸緩衝液でパルプ濃度が 1 % (W/V)になるように懸濁し、 市販のメイセラ一ゼ TP60 (明治製菓製） か ら Rahkamo, L. らの方法 （Cellulose, 3 , 153-163 ( 1996)) に基づいて 調製した精製 EGII又は精製 CBHIを対絶乾パルプ 0.02% (W/W)添加して 50°Cで 60分間反応後、 「紙パルプの試験法」 （紙パルプ技術協会編集 · 発 行、 1995年） p 73に示されたパルプの保水値 （WRV) 測定法に基づきパ ルプの膨潤度を測定した。 パルプ膨潤活性（PSA)は、 酵素処理パルプの 保水値を未処理パルプの保水値と比較し、 保水値が 1 %増加するような 酵素活性を 10単位（10U)として算出した。 この結果を表 1 に示した。 表 1の結果から、 上述の反応条件下では、 セロビオハイ ド口ラーゼにはパ ルプ膨潤作用がみられないが、 エンドダルカナーゼにパルプの保水値を 増加させるパルプ膨潤作用があることがわかる。
表 1
Figure imgf000013_0001
実施例 2 脱墨試験
3 cm角に裁断した絶乾 24gの新聞古紙を JIS P- 8209に記載の標準離解 機 （タツピ—パルプ離解機、 東洋精機製） により 50°C、 20分間離解を行 つた。 得られた古紙パルプを 50mMクェン酸緩衝液で pH5に調整し、 絶乾 パルプに対して 0.001、 0.01、 0.1% (W/W)になるようにセルラ一ゼを添 加、 50°C、 1時間酵素反応を行った。 セルラーゼは、 PH5付近 至適 pH をもつ トリコデルマ (Trichoderma)属のセ口ピオハイ ドロラ一ゼである CBHK エンドダルカナーゼ成分が増強された SCE3 (W098/54332号に記載） , pH6付近に至適 pHをもつフミコーラ (Humicola)属のセ口ピオハイ ドロラ —ゼが増強された NCE2 (特開平 8- 126492号公報に記載） と、 エンドダル カナ一ゼ成分が増強された NCE4 (W098/03640号に記載） を用いた。 反応 後、 古紙パルプに 50°Cの蒸留水を 4.5Lになるように添加して、 実験用 フローテ一夕一 （浮遊選別試験機 FW型、 共伸産業社製.） に供し、 対絶 乾パルプ 0.3% (W/V)の脱墨剤 （リポトール LH-350、 日華化学社製） を添 加し 10分間フローテーシヨンを行った。 更に、 140メッシュのふるいで パルプを回収、 蒸留水で洗浄 ♦ 脱水した後、 パルプ濃度 0.15% (W/V)に なるように蒸留水で希釈し、 JIS P- 8209に記載の方法で手すき装置によ り手すきシートを調製した。 対照として、 セルラーゼで処理しない古紙 パルプに同様の操作を行い、 セルラーゼ無処理サンプルとした。 手すき シートの白色度は、 J I S P- 8123に基づいて反射率測定計器（分光測色計 CM525 I , ミノルタ製） を用いて測定した。 セルラ一ゼ処理サンプルの白 色度とセルラ一ゼ無処理サンプルの白色度の差を△白色度と定義した。 また、 実施例 1 と同様にして P S Aを測定した。 更に引張強さは J I S P- 81 13、 引裂強さは J I S P- 81 16にしたがって測定し、 比引張強さ、 比引裂 強さを算出した。
表 2及び表.3にトリコデルマ属及ぴフミ—ユーラ属のセ口ピオハイ ド口 ラーゼ及びェンドダルカナーゼの脱墨効果を測定した結果を示す。 表 2の結果から膨潤作用をもたないセロピオハイ ド口ラーゼには脱墨効果 が認められないことが明らかである。 また表 3の結果から、 パルプ膨潤 作用をもつエンドダルカナーゼは、 PSAが 25U以上である対絶乾パルプ重 量 0. 01 % (W/W)以下という低濃度領域で著しい強度低下を起こさずに脱 墨効果をもつことが見出された。 更に、 0. 1 % (W/W)という過剰量では、 酵素処理すると脱墨効果は減少、 あるいは強度が低下することがわかつ た。 また、 PSAが 25U以上である対絶乾パルプ重量 0. 01 % (W/W)の低濃度 ェンドグルカナーゼで処理された古紙の強度を解析すると、 従来のセル ラーゼ脱墨処理 （表 3では 0. 1 %処理） で観察されたセルラーゼによる 紙力の低下作用がほとんどみられないことから、 セルラ一ゼ処理による 強度面でのマイナス効果が解決された。
表 2
Figure imgf000015_0001
表 3
Figure imgf000015_0002
実施例 3 従来の化学脱墨と酵素脱墨の比較
従来使用されている脱墨用薬剤の使用量を対絶乾パルプ 1.5% (W/W)苛 性ソーダ + 3 % (W/W)珪酸ソーダ + 0. 5% (W/W)過酸化水素を基準として 酵素脱墨による脱墨用薬剤使用量の低減効果を調べた。 実施例 2 と同様 に 0.01% (W/W) の S C E 3で酵素処理した古紙パルプを 3段階の脱墨 用薬剤の使用量、 すなわち上記標準使用量の 1/4倍、 1/2倍、 1倍の使用 量の脱墨用薬剤で処理した。 薬剤処理は 50°C、 60分間古紙パルプを薬剤 に浸漬して行った。 その後、 実施例 2 と同様に白色度を測定した結果を 表 4に示した。 無処理 +薬剤 （酵素未処理で脱墨用薬剤を標準量使用し た実験区） の△白色度と SCE3 + 1/2薬剤 （S CE3 · 0. 01 %処理工程 +脱墨 用薬剤を標準の 1/2量使用した実験区） の△白色度がほぼ一致すること から、 セルラーゼ処理を脱墨処理に用いることにより、 脱墨用薬剤の使 用量を 1/2程度に低減することが可能であることがわかる。 表 4
Figure imgf000016_0001
産業上の利用可能性
本発明により、 古紙脱墨に有効なパルプ膨潤活性をもつセルラーゼを 評価して選択することが可能となり、 従来よりも低い酵素濃度で、 紙力 の低下を伴わずに、 使用する脱墨薬剤の量を低減した、 低コス トかつ環 境にやさしい古紙脱墨法が可能となった。 本明細書に引用されたすベての刊行物は、 その内容の全体を本明細書 に取り込むものとする。 また、 添付の請求の範囲に記載される技術思想 および発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更 が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。 本発明は のような変形および変更をも包含することを意図している。

Claims

請求の範囲
1. パルプ膨潤活性（PSA)を示すセルラ一ゼを用いることを特徴とする 古紙の脱墨方法。
2. パルプ膨潤活性（PSA)が 25単位（25ϋ)以上となるセルラーゼ濃度領域 で行うことを特徴とする請求項 1記載の方法。
3. パルプ膨潤活性（PSA)が極大値を示すセルラ一ゼ濃度領域で行う こ とを特徵とする、 請求項 1又は請求項 2のいずれかに記載の方法。
4. セルラーゼがエンドダルカナ一ゼであるところの、 請求項 1から請 求項 3のいずれかに記載の方法。 ― . .
5. エンドダルカナーゼがトリ コデルマ (Trichoderma) 属由来の SCE3 又はフミコーラ (Humicola) 属由来の NCE4、 又はリゾブス (Rhizopus) 属由来の RCEIである請求項 4記載の方法。
6. 紙力低下を伴わない古紙の脱墨処理に有効なセルラーゼ酵素及び有 効な酵素濃度を得るための評価方法であって、 パルプにセルラーゼを反 応させた後パルプの膨潤度を測定することを特徴とする方法。
7. パルプ濃度 1 % (W/V)、 用いる酵素の至適 pH及び至適温度でパルプ をセルラーゼで 60分間反応させた後、 パルプの保水値（WRV)の変化を測 定することを特徴とする請求項 6記載の方法。
8. 絶乾 0.5gのパルプを基質として、 パルプ濃度 1 % (W/V)、 至適 ρΗ · 至適温度の条件下でセルラ一ゼを 60分間反応させた後、 パルプの保水値 (WRV)を 1 %増加させるセルラーゼの活性を 10単位（10U)とするパルプ膨 潤活性（PSA)を測定することを特徴とする請求項 6又は請求項 7のいず れかに記載の方法。
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