JP2000217583A - エンドグルカナ―ゼ酵素を含んでなるセルラ―ゼ調製物 - Google Patents

エンドグルカナ―ゼ酵素を含んでなるセルラ―ゼ調製物

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シューレイン，マルティン
Shamkant Anant Patkar
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規なエンドグルカナーゼの提供。 【解決手段】 フミコーラインソレンス（Humicola in
solens) DSM1800 から誘導される高度に精製された〜43
kDのエンドグルカナーゼに対して産生される抗体と免疫
反応性であるか、または前記〜43kDのエンドグルカナー
ゼの誘導体である均質エンドグルカナーゼ成分を必須の
ものとして含むセルラーゼ調製物。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は単一成分エンドグル
カナーゼを含んでなるセルラーゼ調製物、そのセルラー
ゼ調製物を含んでなる洗剤添加剤、そのセルラーゼ調製
物を含む洗剤組成物ならびにそのセルラーゼ調製物によ
るセルロース含有織物の処理方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】当該技術分野では、一般に、綿含有織物
の反復洗濯が織物に非常に不快なごわ付きを起こすこと
が周知であり、そして当該技術分野ではこの問題を解決
する数種の方法が既に提案されてきた。例えば、ユニリ
ーバー社(Unilever Ltd.) の英国特許第 1,368,599号明
細書は綿含有織物のごわ付きを低減するセルロース分解
酵素の使用を教示する。また、米国特許第 4,435,307号
（ノボインダストリーＡ／Ｓ）明細書は、ごわ付き低減
洗剤添加剤として、フミコーラ・インソレンス（Humico
la insolens) 由来のセルロース分解酵素ならびにACxI
と称されるその断片の使用を教示する。
【０００３】当該技術分野で認識されているセルロース
分解酵素の他の用途としては、織物からよごれの除去お
よびその色の澄明化 (例えば、ヨーロッパ特許第 220,0
16号参照) 、水吸収性の向上 (特公昭52−48236 号）お
よび色の局所的な変化を処理された織物に与える「スト
ーンウォッシュ(Stone-washed)」外観の提供 (ヨーロッ
パ特許第307,564 号) が挙げられる。さらに、セルロー
ス分解酵素は、醸造酒業でβ−グルカンの分解に、製パ
ン業では小麦粉の特性の改善に、製紙業ではセルロース
の非晶質部分を除去してパルプ中の結晶セルロース含有
率の向上のために、そしてパルプの排液特性の改善に、
さらに飼料業でグルカンの消化の改善に使用される可能
性がある。
【０００４】セルロース分解酵素の実用上の開発は、あ
る程度まで、複合混合物である既知セルラーゼ調製物の
性質により抑制されてきた。複数酵素系の製造の最適化
は困難であるため、セルロース分解酵素類の工業的に有
効なコストでの製造の実施が困難であり、そしてそれら
の実用化は、セルロース系織物に対して所望の効果を奏
するには多量のセルロース分解酵素を使用する必要から
生じる困難性によって妨げられてきた。上記に指摘した
セルラーゼ調製物の短所は、多量のエンドグルカナーゼ
を含む調製物によって改善される可能性がある。エンド
グルカナーゼ活性を増強したセルラーゼ調製物は、国際
公開第WO89／00069 号明細書で公表されている。
【０００５】
【発明の要約】セルロース含有材料に対して好ましい活
性レベルを示す単一エンドグルカナーゼ成分がここに単
離された。従って、本発明はフミコーラ・インソレンス
（Humicola insolens) DSM1800由来の高度に精製され
た〜43kDのエンドグルカナーゼに対して産生される抗体
と免疫反応性であるか、またはその〜43kDエンドグルカ
ナーゼに対する相同体である均一のエンドグルカナーゼ
を必須のものとして含んでなるセルラーゼ調製物に関す
る。
【０００６】セルラーゼのこの特定のエンドグルカナー
ゼ成分は、相当な実用上の重要性を有するセルロース含
有材料の処理にとって有益であることが見い出された。
すなわち、このことが、例えば前記活性成分の生産に組
換え DNA技術を使用することによってセルラーゼの原価
上有効な製造を可能にし、そしてセルロース系材料に所
望の作用を提供するのに少量のセルラーゼ調製物が必要
とされるにすぎない点で酵素の現実的な使用を可能にす
る。
【０００７】〔発明の詳細な記述〕本発明のセルラーゼ
調製物は、そのエンドグルカナーゼ成分が総タンパク質
当り少なくとも約 50CMCエンドアーゼ単位の CMCエンド
アーゼ活性を示す有益なものである。本明細書の文脈
上、「 CMCエンドアーゼ活性」の語は、以下に詳述され
るように、本発明のセルラーゼ調製物とインキュベーシ
ョン後、カルボキシメチルセルロース(CMC) 溶液の粘度
の低下によって測定されるような、セルロースのグルコ
ース、セロビオースおよびトリロースへの分解能の観点
によるエンドグルカナーゼ成分のエンドグルカナーゼ活
性を意味する。
【０００８】本発明の好ましいセルラーゼ調製物は、エ
ンドグルカナーゼ成分が総タンパク質１mg当り少なくと
も約60の、特に、少なくとも約90の CMCエンドアーゼ単
位のCMCエンドアーゼ活性を示すものである。とりわけ
好ましいエンドグルカナーゼ成分は、総タンパク質１mg
当り少なくとも100CMCエンドアーゼ単位の CMCエンドア
ーゼ活性を示す。CMCエンドアーゼ (エンドグルカナー
ゼ) 活性は、次のようにCMC の低下する粘度から測定で
きる。
【０００９】pH9.0 の 0.1Ｍトリス（Tris) 緩衝液中35
ｇ／ＬのCMC(Hercules 7LFD)を含む基質溶液を調整す
る。分析すべき酵素試料をこの緩衝液に溶解する。基質
溶液10mLと酵素溶液 0.5mLを混合し、40℃に温度を調節
した粘度計 (例えば、Haake VT181, NVセンサー, 181r
pm) に移す。混合直後に粘度を読み取り、30分後に再度
粘度を読み取る。これらの条件下で１／２に粘度を低下
する酵素量を、 CMCエンドアーゼ活性１単位と定義す
る。
【００１０】当業者に既知の方法でマーカータンパク質
と共に SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAG
E) および等電点電気泳動を行って、本発明のセルラー
ゼ調製物のエンドグルカナーゼの分子量と等電点 (pI)
をそれぞれ測定した。この方法により、特定のエンドグ
ルカナーゼ成分の分子量は、〜43kDと決定された。この
エンドグルカナーゼの等電点は約 5.1と決定された。こ
のエンドグルカナーゼの免疫化学的特性は、実質的に国
際公開第WO89／00069 号に記載されるように実施したと
ころ、フミコーラ・インソレンス DSM1800由来の高度に
精製された〜43kDのエンドグルカナーゼに対して産生さ
れた抗体と免疫反応性であることが確認された。セロビ
オヒドロラーゼ活性は、セロビオースｐ−ニトロフェニ
ルに対する活性として特定できる。この活性は、37℃お
よびpH7.0 において１分間当りに放出されるニトロフェ
ニルのマイクロモルとして測定される。本発明のエンド
グルカナーゼは、実質的にはまったくセロビオヒドロラ
ーゼ活性を示さないことが確認された。
【００１１】本発明のセルラーゼ調製物のエンドグルカ
ナーゼ成分は、例えば、米国特許第4,435,307号明細書
に記載の粗フミコーラ・インソレンス セルラーゼ混合
物の逆相HPLC精製を始めとする大規模な精製操作により
最初のうちは単離されてきた(後記実施例１を参照）。
この操作は、驚くべきことに、非常に高いエンドグルカ
ナーゼ活性に起因して、予想外に好ましい特性を有する
単一成分として〜43kDのエンドグルカナーゼの単離物を
もたらした。
【００１２】他の態様では、本発明はエンドグルカナー
ゼ活性を示す酵素（以下、「エンドグルカナーゼ酵素」
と称する）であって、添付の配列表ID#2に示されるアミ
ノ酸配列を有する酵素またはエンドグルカナーゼ活性を
示すその相同体に関する。本明細書における文脈上、
「相同体」の語は、ある特定の限定された条件下〔例え
ば、５×SSC での予備ソーキングし、20％ホルムアミ
ド、５×デンハルト (Denhardt) 溶液、50mMのリン酸ナ
トリウム、pH6.8 、および50μｇの変性超音波処理され
たウシ胸線DNA の溶液中、約40℃で１時間予備ハイブリ
ダイゼーションし、次いで 100μＭのATP を加えた同じ
溶液中、約40℃で18時間ハイブリダイゼーションする〕
で、このアミノ酸配列のエンドグルカナーゼ酵素をコー
ドするDNA と同じプローブにハイブリッダイズするDNA
によってコードされたポリぺプチドを示すことを意図し
ている。
【００１３】この用語は、もとの配列のＣ末端およびＮ
末端のいずれかもしくは両方に１個以上のアミノ酸残基
が付加するか、あるいはもとの配列の１箇所以上の部位
における１個以上のアミノ酸残基が置換するか、あるい
はもとのアミノ酸配列のいずれかもしくは両末端におけ
るかまたはもとの配列内の１箇所以上の部位における１
個以上のアミノ酸残基が欠失するか、あるいはもとの配
列における１箇所以上の部位へ１個以上のアミノ酸残基
が挿入することにより得られる前記配列の誘導体を包含
することを意図している。
【００１４】本発明のエンドグルカナーゼ酵素は、特許
手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト
条約（ブダペスト条約）の規定に従ってDeutshe Sammlu
ng von Mikroorganismen, Mascheroder Weg 1B, D-3300
Braunschweig, FRGに1981年10月１日付で寄託され、フ
ミコーラインソレンス（Humicola insolens) 、例えば
DSM1800株のようなフミコーラの一の種によって生産可
能なものであってもよい。
【００１５】さらなる態様では、本発明は、添付の配列
表ID#4に示されるアミノ酸配列を有するエンドグルカナ
ーゼ酵素またはエンドグルカナーゼ活性を示すその相同
体 (上記の定義に同じ) に関する。このエンドグルカナ
ーゼ酵素は、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium
oxysporum)のようなフザリウムの一の種、例えばブダペ
スト条約の規定に従い Deutsche Sammlung von Mikroor
ganismen, Mascheroder Weg 1B, D-3300 Braunschweig,
FRGに1983年６月６日付で寄託された DSM2672株によっ
て生産可能なものであってもよい。
【００１６】さらに、相同的なエンドグルカナーゼは他
のセルロース分解酵素 産生微生物、例えば、トリコ
デルマ (Trichoderma)、ミセリオフトーラ (Myceliopht
hora) 、ファネロシェーテ (Phanerochaete ）、シゾフ
ィラム (Schizophyllum)、ペニシリウム (Penicilliu
m)、アスペルギルス (Aspergillus)およびゲオトリカム
(Geotricum)の種から誘導されうることも予期されてい
る。
【００１７】また、本発明は上記のようなエンドグルカ
ナーゼ酵素またはその酵素の前駆体をコードする DNA配
列を含んでなる DNA構成物にも関する。特に、この DNA
構成物は、添付の配列表ID#1もしくはID#3に示されるよ
うな DNA配列か、またはそれらの変性体を有する。これ
らの DNA配列の適当な変性体の例は、上記エンドグルカ
ナーゼの他のアミノ酸配列を生じないヌクレオチド置換
体であるが、 DNA構成物が導入される宿主有機体の使用
可能なコドンに相当するか、または異なるアミノ酸配列
を生じるためのもとの酵素と、場合によって異なる特性
を有するエンドグルカナーゼ変異体を生じる可能性のあ
る異なるタンパク質構造を生じるヌクレオチド置換体で
ある。可能な変性の別の例は、配列中への１個以上のヌ
クレオチドの挿入、配列のいずれかの末端における１個
以上のヌクレオチドの付加、あるいは配列のいずれかの
末端または配列内での１個以上のヌクレオチドの欠失で
ある。
【００１８】上記エンドグルカナーゼ酵素をコードする
本発明の DNA構成物は、確立された標準的な方法、例え
ばS. L. BeaucageおよびM. H. Caruthers, Tetrahedro
n Letters 22, 1981, 1859〜1869ページに記載されるホ
スホアミジト法または Matthesら、EMBO Journal 3, 19
84, 801〜805 ページに記載される方法、により合成的
に調製できる。ホスホアミジト法によれば、例えば、自
動 DNAシンセサイザーにより合成され、精製され、アニ
ール化され、連結され、次いで適当なベクターにクロー
ニングされる。
【００１９】エンドグルカナーゼ酵素またはその前駆体
をコードする DNA構成物は、例えば、フミコーラ・イン
ソレンス(DSM1800) のようなセルラーゼ産生微生物のcD
NAおよびゲノムライブラリーを創製し、次いで標準的な
技法 (Sambrookら、Molecular Cloning : A Laboratory
Manual, ２版、Cold Spring Harbor, 1989、参照)に
従うエンドグルカナーゼの全体もしくは一部のアミノ酸
配列に基づき合成されたオリゴヌクレオチドプローブを
使用するハイブリダイゼーション、または適当な酵素活
性 (すなわち、上記に定義したような CMCエンドアーゼ
活性) を所持するクローンの選択、またはもとのセルラ
ーゼ (エンドグルカナーゼ) に対する抗体と反応性を示
すタンパク質産生クローンの選択、などの常用されてい
る操作による陽性クローンのスクリーニングによって単
離されうる。
【００２０】最後に、この DNA構成物は、標準的技法に
従う合成起源のフラグメント、ゲノム起源のフラグメン
トまたは (適当なものとして) cDNA起源のフラグメント
(これらのフラグメントは完全な DNA構成物の様々な部
分に相当する) の連結によって調製される合成およびゲ
ノム起源の混合物、合成およびcDNA起源の混合物または
ゲノムおよびcDNA起源の混合物であってもよい。また、
DNA構成物は、例えば米国特許第 4,683,202号明細書ま
たは R. K. Saikiら、Science 239, 1988,487〜491 ペ
ージに記載されるような特定のプライマーを使用するポ
リメラーゼ連鎖反応により調製することもできる。
【００２１】さらに、本発明は、本発明の上記 DNA構成
物が挿入された組換え発現ベクターにも関する。これ
は、組換え DNA法を行うのに都合のよいいずれかのベク
ターであることができ、ベクターの選択はそれが導入さ
れる宿主細胞に左右されることが多いい。従って、ベク
ターは、自己複製ベクター、すなわち染色体外の独立体
として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、
例えプラスミドであることができる。また、ベクター
は、宿主細胞に導入されたとき、その宿主細胞のゲノム
中に組込まれ、それが組込まれた染色体と一緒に複製さ
れるものであってもよい。
【００２２】ベクターでは、エンドグルカナーゼをコー
ドする DNA配列が、適当なプロモーターおよびターミネ
ーターと調節可能に関連付けられている必要がある。プ
ロモーターは、選んだ宿主細胞において転写活性を示
し、そしてその宿主細胞と同種もしくは異種のいずれか
のタンパク質をコードする遺伝子から誘導されうるいず
れかの DNA配列であることができる。エンドグルカナー
ゼをコードする DNA配列、プロモーターおよびターミネ
ーターをそれぞれ連結し、次いでそれらを適当なベクタ
ー中に挿入するのに使用する操作は当業者に周知である
(例えば、上記Sambrookら、参照) 。
【００２３】また、本発明は、本発明の DNA構成物また
は発現ベクターで形質転換された宿主細胞にも関する。
例えば、宿主細胞は、アスペルギルス (Aspergillus)の
ある種、最も好ましくは、アスペルギルス・オリーゼ
(Aspergillus oryzae)またはアスペルギルス・ニガー
(Aspergillus niger) であることができる。カビ細胞
は、それ自体既知方法によりプロトプラストを形成し、
プロトプラストを形質転換し、次いで細胞壁を再生でき
る。宿主微生物としてのアスペルギルスの使用は、ヨー
ロッパ特許第 238,023号明細書 (Novo Industri A/S)に
記載されており、その内容は引用することにより本明細
書の内容となる。宿主細胞は、酵母細胞、例えばサッカ
ロマイセス セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae)
の一菌株であってもよい。
【００２４】また、宿主有機体は、細菌、特に、ストレ
プトマイセス (Streptomyces) 、バチルス (Bacillus)
およびイー・コリー (E.coli) の１菌株であってもよ
い。細菌細胞の形質転換は、例えば、Sambrookら、Mole
cular Cloning : A LaboratoryManual, Cold Spring Ha
rbor, 1989 に記載されるような常法によって行うこと
ができる。
【００２５】さらに本発明は、本発明のエンドグルカナ
ーゼ酵素の生産方法であって、そのエンドグルカナーゼ
酵素を発現する条件下で上記のような宿主細胞を適当な
培地で培養する工程、次いで培養物からそのエンドグル
カナーゼ酵素を回収する工程を含んでなる方法に関す
る。形質転換された宿主細胞を培養するのに使用する培
地は、問題の宿主細胞を増殖するのに適するいずれかの
常用されている培地であってもよい。発現されたエンド
グルカナーゼは培養物中に分泌されることが都合よく、
そして培養物から周知の手法、例えば、遠心もしくは濾
過による培地からの細胞の分離、硫酸アンモニウムのよ
うな塩による培養物のタンパク質性成分の沈殿、次いで
イオン交換クロマトグラフィー、もしくはアフィニティ
ークロマトグラフィーなどのクロマトグラフ法により回
収できる。
【００２６】上述のような組換 DNA法ならびに当該技術
分野で周知のタンパク質精製法、発酵法および変法もし
くは他の方法を使用することにより、高純度のエンドグ
ルカナーゼを提供できる。本発明のセルラーゼ調製物ま
たはエンドグルカナーゼ酵素を、浸漬、洗濯またはすす
ぎ操作中に他の洗剤と一緒にセルロース含有織物へ添加
することが都合よい。従って、他の態様では、本発明は
本発明のセルラーゼ調製物またはエンドグルカナーゼ酵
素を含んでなる洗剤添加物に関する。
【００２７】この洗剤添加物は、粉化しない顆粒、安定
化された液体または保護された酵素の形態であることが
適当である。粉化しない顆粒は、例えば米国特許第 4,1
06,991号および同4,661,452 号 (両者とも、Novo Indus
tri A/S)明細書に従って調製でき、そして場合によって
当該技術分野で既知の方法により被覆してもよい。液体
酵素調製物は、例えば、ポリプロピレングリコールのよ
うなポリオール、糖もしくは糖アルコール、乳酸もしく
はホウ酸の確立された方法による添加によって安定化で
きる。保護された酵素は、ヨーロッパ特許第 238,216号
明細書に公表された方法により調製できる。
【００２８】本発明の洗剤添加物は、本添加物１ｇ当り
１〜500mg 、好ましくは５〜250mg、最も好ましくは10
〜100mg 含むことが適当であろう。この洗剤添加物は、
洗剤添加物に通常含められるプロテアーゼ、リパーゼ、
パーオキシダーゼまたはアミラーゼのような他の酵素を
さらに１種以上含めることができるものと理解されるで
あろう。
【００２９】本発明によれば、プロテアーゼがバチルス
・レンタス (Bacillus lentus) セリンプロテアーゼよ
り高い特異性を示すものである場合には、エンドグルカ
ナーゼ酵素の向上した貯蔵安定性が得られることが見い
出された。（本発明の目的上、バチルス・レンタス セ
リンプロテアーゼより高い特異性を示すプロテアーゼ
は、ＢおよびＲ緩衝液(pH9.5) 中１mg／mLのヒトインス
リン0.5mL を１リットル当り0.6CPUの酵素溶液75μＬ[N
ovo Nordisk Analysis Methods No.AF228/1 、参照〕と
37℃で 120分間インキュベーションし、１ＮのHCl 50μ
Ｌで反応を停止する条件下でバチルス・レンタス セリ
ンプロテアーゼを使用する場合よりも少ない成分にヒト
インスリンを分解するものである。
【００３０】このようなプロテアーゼの例は、ズブチリ
シン ノボ（Novo) もしくはその変異体 (例えば、米国
特許第4,914,031 号明細書に記載される変異体) 、ノカ
ルディア・ダッソンビレイ (Nocardia dassonvillei)
NRR18133から誘導されうるプロテアーゼ (国際公開第WO
88／03947 号明細書記載) 、バチルス・リケニホルミス
(Bachllus licheniformis)から生産可能な、グルタミ
ン酸およびアスパラギン酸に特異的なセリンプロテアー
ゼ (このプロテアーゼは同時係属中の国際特許出願第 P
CT／DK91／00067 号明細書に詳述されている) 、または
フザリウム・エスピー (Fusarium sp.) DSM2672から生
産可能なトリプシン様プロテアーゼ (このプロテアーゼ
は国際公開第WO89／06270 号明細書に詳述されている）
である。
【００３１】さらなる別の態様では、本発明は、本発明
のセルラーゼ調製物またはエンドグルカナーゼ酵素を含
んでなる洗剤組成物に関する。本発明の洗剤組成物は、
アニオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、カチオン界
面活性剤、両性界面活性剤または両性イオン界面活性
剤、ならびにこれらの界面活性剤の混合物であってもよ
い界面活性剤をさらに含んでなる。アニオン界面活性剤
の代表例としては、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩
(LAS) 、アルファオレフィンスルホン酸塩(AOS) 、アル
コールエトキシ硫酸塩(AES) および天然脂肪酸のアルカ
リ金属塩が挙げられる。
【００３２】しかしながら、エンドグルカナーゼはアニ
オン界面活性剤の存在下で安定性に乏しく、そして、一
方、非イオン界面活性剤またはポリビニルピロリドン、
ポリエチレングリコールもしくはポリビニルアルコール
のような一定のポリマー化合物の存在下でより安定であ
ることが見い出された。従って、本発明の洗剤組成物
は、低濃度のアニオン界面活性剤および／または一定量
の上述のような非イオン界面活性剤もしくは安定化ポリ
マーを含むことができる。
【００３３】本発明の洗剤組成物は、例えば、ビルダ
ー、漂白剤、漂白活性剤、抗凝集剤、金属イオン封鎖
剤、土質再付着防止剤、香料、酵素安定化剤、などの当
該技術分野で既知の他の洗剤成分を含んでもよい。本発
明の洗剤組成物は、いずれか適当な形状、例えば粉末ま
たは液体状に調製することができる。酵素は、上記のよ
うな酵素安定化剤を含めることにより液体洗剤中で安定
化することができる。一般的に、本発明の洗剤組成物の
溶液pHは、７〜12であり、そしてある例えでは 7.0〜1
0.5である。プロテアーゼ、リパーゼまたはアミラーゼ
のような他の洗剤酵素を、上記の添加剤と独立にまたは
組み合わせて本発明の洗剤組成物に含めることができ
る。
【００３４】本発明のセルラーゼ調製物による柔軟化、
土質除去および色の澄明化効果を得るには、洗濯液中の
セルラーゼ調製物濃度が１リットル当り0.0001〜100 、
好ましくは0.0005〜60、そして最も好ましくは0.01〜20
mgであることが必要である。本発明の洗剤組成物は、典
型的には、洗濯液中 0.5〜20ｇ／Ｌの濃度で使用され
る。一般的に、この洗剤組成物当り 0.1〜５重量％、ま
たは、好ましくは 0.2〜２重量％の量で洗剤添加物を加
えることが最も都合がよい。
【００３５】さらなる別の態様では、本発明は、セルロ
ース含有織物の手触りが悪くなる速度を低減するか、ま
たはセルロース含有織物の硬さを低減する方法であっ
て、上記のようなセルラーゼ調製物またはエンドグルカ
ナーゼ酵素によりセルロース含有織物を処理する工程を
含んでなる方法に関する。さらに本発明は、着色セルロ
ース含有織物の色の澄明化をもたらす方法であって、セ
ルラーゼ調製物またはエンドグルカナーゼで着色セルロ
ース含有織物を処理する工程を含んでなる方法、ならび
に着色セルロース含有織物の色の局所的な変化をもたら
す方法であって、本発明のセルラーゼ調製物またはエン
ドグルカナーゼにより着色セルロース含有織物を処理す
る工程を含んでなる方法に関する。
【００３６】本発明の方法は、洗濯中にセルロース含有
織物を処理することにより実施できる。しかしながら、
織物の処理は、場合によって、ソーキングもしくはすす
ぎ中に、あるいは織物が浸漬されているかもしくは浸漬
されうる水にセルラーゼ調製物もしくはエンドグルカナ
ーゼ酵素を単に添加することによって実施してもよい。
【００３７】本発明によれば、紙パルプの排液特性が強
度の著しい低下を伴うことなく本発明のエンドグルカナ
ーゼによる処理で有意に改善できることが見い出され
た。従って、本発明は、さらに、パルプ排液の特性の改
善方法であって、本発明のセルラーゼ調製物またはエン
ドグルカナーゼ酵素で紙パルプを処理する工程を含んで
なる方法にも関する。本発明の方法で処理できるパルプ
の例としては、故紙パルプ、再循環板紙パルプ、クラフ
トパルプ、亜硫酸パルプまたは加工熱処理パルプおよび
他の高収率パルプが挙げられる。
【００３８】本発明は、以下の実施例の好ましい態様を
参照しながらさらに詳細に説明されるが、これらの実施
例のいずれかの態様に本発明の範囲が限定されることを
意図するものでない。
【００３９】
【実施例】例１．フミコーラ インソレンス（Humicola
insolens) から〜43kDのエンドグルカナーゼ酵素の単
位 １．フミコーラ インソレンス セルラーゼ混合物から
精製された〜43kDのエンドグルカナーゼと反応性のウサ
ギ抗体の調製 米国特許第 4,435,307号明細書の実施例６に記載される
ようにフミコーラ インソレンス DSM1800を培養するこ
とによりセルラーゼを生産した。粗セルラーゼを、珪藻
土による濾過、超遠心、活性含有物の凍結乾燥によって
培養ブロスから回収した（米国特許第4,435,307 号明細
書の実施例１および６、参照）。
【００４０】国際公開第89／09259 号明細書に記載され
るように粗セルラーゼを精製し、得られた画分F1P1C2を
マウスの免疫感作に使用した。免疫感作は２週間の間隔
で５回行い、各毎にフロイントアジュバントを含むタン
パク質25μｇ使用した。Ed Harlow およびDavid Lane,
Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbo
r Laboratory 1988 に記載されるようにハイブリドーマ
細胞系を樹立した。この操作は以下のごとく具体的に記
載できる。マウスを放血した後、マウスの血清はF1P1C2
画分に存在するタンパク質と反応することを示したの
で、脾臓を採取し、そして均質化し、次いでPEG および
Hyclone (Utah, USA) 由来のフォクス・リバー(Fox-riv
er) ミエローマ細胞と混合した。
【００４１】これらのハイブリドーマを確立した HATス
クリーニング法により選択した。再クローン化されたハ
イブリドーマ細胞系を樹立した。これらの細胞系によっ
て産生される抗体を、スクリーニングし、市販のマウス
モノクローナルタイピングキット (Serotec, Oxford, E
ngland由来) を使用してIgG1サブクラスに属するものに
ついて選んだ。次に、常用のELISA によりF1P1C2との反
応性について陽性抗体をスクリーニングしたところ、SD
S-PAGEで粗フミコーラ インソレンス DSM1800セルラー
ゼを使用するイムノブロッティングに異なる応答を示
し、次いでウェスターンブロットによりそれらが異なる
エピトープを認識することを示すことが見い出された
が、それらのすべてが ELISA応答に非常に良好であるよ
うなＦ４，Ｆ15およびＦ41の選択物を得た。
【００４２】これら３種の抗体は、 CRBF1マウスの腹水
中に多量に産生されていた。セファロースに結合したプ
ロテインＡ (Kem. En. Tek., Copenhagen, Denmark) を
使用するプロテインＡ精製法により腹水からマウスガン
マグロブリンを精製した。異なるモノクローナルガンマ
グロブリン類を、捕捉抗体としてモノクローナル抗体、
抗原としてセルチーム(Celluzyme) の各種HPLC画分、お
よび検出抗体としてセルチーム由来のエンドグルカナー
ゼＢに対して産生されるウサギ抗体をそれぞれ使用する
サンドイッチELISA での応答について試験した。
【００４３】ELISA におけるバインディングを可視化す
るために、Dakopatts (Copenhagen,Denmark) 由来のペ
ルオキシダーゼへウサギIgG に対するブタ抗体を共有結
合し、次いで OPD(1,2−フェニレンジアミン塩酸塩) ／
H2O2で可視化した。最も高い ELISA応答は、モノクロー
ナル抗体Ｆ41で得られたので、それを免疫アフィニティ
ー精製工程で使用した。精製したマウスガンマーグロブ
リンＦ41を、製造者 (Pharmacia,Sweden) に説明される
ようにCNBr活性化セファロース４Ｂ 43ｇに結合し、次
いで洗浄した。
【００４４】２．フミコーラ インソレンス セルラー
ゼ調製物からの〜43kDのエンドグルカナーゼの免疫アフ
ィニティー精製 フミコーラ インソレンス セルラーゼ混合物 (上記)
を３％乾燥物まで希釈し、４℃で15分以内にpHを 3.5に
調節した。pHを 7.5に調節した後、沈殿物を濾去した。
次に、40℃で硫酸ナトリウムを加えて活性酵素を沈殿さ
せた(pH5.5で１kg当り 260ｇ) 。この沈殿物を水に溶解
して濾過した。酸処理を繰り返した。最後に、10.000Mw
カットオフのポリビニルスルホネート膜を使用する限外
濾過により濃縮した。
【００４５】次に、セルラーゼ生成物を３％乾燥物にな
るまで希釈し、pHを9.0 に調節した後、製造元 (Pharma
cia, Sweden)により推奨されるようにDEAEセファロース
カラムによりアニオン交換クロマトグラフィーにかけ
た。リン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0) にて上記Ｆ41ガン
マグロブリン結合セファロースカラムに上記プロテアー
ゼを含まない生成物をかけた。カラムにかけた後、 0.5
Ｍの塩化ナトリウムを含む同じ緩衝液で洗浄した。次
に、このカラムを 0.5Ｍの塩化ナトリウムを含有する0.
1 Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5) で洗浄した後、カ
ラムを５mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5) で洗浄し
た。最後に、 0.1Ｍのクエン酸で〜43kDのエンドグルカ
ナーゼを溶離した。総収量：1563CMC エンドアーゼ単位
のエンドグルカナーゼ活性物25mg。
【００４６】溶離されたタンパク質は、SDS-PAGEにより
単一バンドでMW〜43kDを示すように泳動し、等電点電気
泳動後のpIは約 5.0〜5.2 であった。不活性タンパク質
を逆相精製法で除去した。不活性タンパク質と活性タン
パク質を、２−プロパノールのグラージエントを使用す
るHPLCで分離した。不活性タンパク質は約25％２−プロ
パノールで溶離し、そして活性の〜43kDのエンドグルカ
ナーゼは30％の２−プロパノールで溶離し、この活性エ
ンドグルカナーゼは CMC−コンゴ−レッド清浄区分によ
って検出可能である。
【００４７】この方法で、122CMCエンドアーゼ単位を有
する活性タンパク質0.78mgを回収した。この操作を30回
繰り返した。〜43kDのエンドグルカナーゼを上記TFA と
プロパノールを除去するために凍結乾燥して回収し、次
いでリン酸緩衝液に溶解した。精製物のエンドグルカナ
ーゼ活性は、タンパク質１mg当り156CMCエンドアーゼ単
位であり、凍結乾燥を含む総収率は、エンドグルカナー
ゼ活性の65％であった。
【００４８】こうして得られた〜43kDの酵素を使用し
て、N. Axelsenら、A Manual of Quantitative Immunol
electrophoresis, Blackwell Scientific Publication
s, 1973、第23章に記載される方法に準じてウサギを免
疫感作した。精製イムノグロブリンは、それ自体既知
の、硫酸アンモニウム沈殿、次いで透析、そしてDEAEセ
ファデックスによるイオン交換クロマトグラフィーによ
り抗血清から回収した。エンドグルカナーゼに対する精
製イムノグロブリンのバインディングを測定し、ウサギ
イムノグロブリンAS169 をさらなる研究用として選ん
だ。
【００４９】 ３．〜43kDのエンドグルカナーゼの特性決定 アミノ酸組成：完全加水分解によるアミノ酸分析後に次
の組成が得られた。 Asp 17 Asn 15 Thr 25 Ser 29 Glu 6 Gln 13 Pro 21 Gly 32 Ala 23 Cys 20 Val 14 Met 1 Ile 7 Leu 8 Tyr 6 Phe 15 Lys 9 His 2 Trp 9 Arg 12
【００５０】アミノ酸組成より非グリコシル化タンパク
質のMwは 30,069 と推定された。グリコシル化は、 グルコース 10 マンノース 28 と測定され、Mw 6,840に相当する。こうして、エンドグ
ルカナーゼの総Mwは 36,900(＋／− 2,400) であった。
１分子当りの吸収係数は次のように推定された： トリプトファン ９×5690 チロシン ６×1280 システイン 20× 120 合 計 １分子当り61290
【００５１】280nm における吸収係数1.66は、１mL当り
タンパク質１mgに相当する（文献：S. C. GillおよびP.
Hippel, Anal. Biochemistry 182, 312〜326 (198
9)) 。アミノ酸配列を、エドマン分解法によりアプライ
ド・バイオシステムズ・475A・プロテインシクェネータ
ー (Applied Biosystems 475A Protein Sequenator)で
決定した。唯一の配列はこのタンパク質が純粋であるこ
とを示した。このアミノ配列を、添付の配列表ID#2に示
す。
【００５２】酵素の特性：この酵素はpH３と 9.5との間
で安定である。この酵素は、結晶セルロースまたは基質
セルビオースβ−ｐ−ニトロフェニル（セロビオヒドロ
ラーゼの基質）をあまり分解しないが、非晶質セルロー
スを主としてセロビオース、セロトリオースおよびセロ
テトラオースに分解するので、この酵素は不溶性非晶質
セルロースからセロデキストリン類を生産するのに使用
できることを示す。この酵素は約50℃で最大活性を示す
と共にpH6.0 と10.0との間で活性である。
【００５３】例２．アスペルギルス・オリーゼ (Asperg
illus oryzae)における〜43kDの上記エンドグルカナー
ゼのクローニングと発現部分cDNA：Okayama およびBerg
(1982) Mol. Cell. Biol.２, 161〜170 ページの方法
に従いフミコーラ・インソレンス DSM1800株のmRNA (Ka
planら、(1979) Biochem.J. 183, 181〜184 ページ)
からcDNAライブラリーを作製した。このライブラリーを
放射活性標識オリゴヌクレオチド類とハイブリダイゼー
ションし、組換え体から不動化したDNA と共に濾過した
(Gergenら、(1979) Nucleic Acids Res.７, 2115〜21
36ページ) 。
【００５４】これらのヌクレオチドプローブ類は、精製
〜43kDのエンドグルカナーゼの代表的フラグメントのア
ミノ酸配列に基づき作製した。３種のプローブ (NOR 12
51,2048および2050) にハイブリダイゼーションする１
種のコロニーを見い出し、それを単離した。この配列
は、挿入された 680bpのcDNAが上記〜43kDのタンパク質
のＣ末端の 181アミノ酸をコードし、そして３′の翻訳
されないmRNAであることを示す。このクローン由来の 2
37bp鎖長のPvu Ｉ−Xho Ｉフラグメントを、フミコーラ
インソレンスmRNAとのノーザンブロット法 (Sambrook
ら、上記、7.40〜7.42ページおよび7.46〜7.48ページに
記載) のプローブに使用したところ、完全な〜43kDのmR
NAは約1100bpの鎖長を有することを示した。同じ菌株由
来のゲノムライブラリーのプローブとして同じ 237bpの
フラグメントを使用した。
【００５５】ゲノムのクローン：フミコーラ・インソレ
ンス DSM1800株のゲノムライブラリーを、Yeltonの方法
(M.M.Yeltonら、(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. LIS
A. 81, 1470 〜1474ページ) により調製した総DNA から
作製し、次いで Sau3Aで部分消化した。４kbを越えるフ
ラグメントをアガロースゲルから単離し、次いでBam H1
で消化しそして脱リン酸化したpBR322に連結した。この
連結生成物を、常法によりｒ- ｍ+ にしたイ．コーリー
(E. coli) MC1000 (CasadabanおよびCohen (1980) J.
Mol. Biol.,138,179〜207 ページ) に導入した。
【００５６】40.000個の組換え体を「部分cDNA」の欄に
記載した 237bpのPvu Ｉ−Xho Ｉ部分cDNAフラグメント
でスクリーニングした。完全な〜43kDのエンドグルカナ
ーゼ配列を含む２つのコロニーを選び、その遺伝子を製
造元の説明書に従いシークエナーゼ (Sequenase) (商
標) キット(United status Biochemical Corporation)
を使用して、ジデオキシ法で配列決定した。この配列
は、ゲノム遺伝子中の１つのイントロンを除き完全鎖長
のcDNA遺伝子（下記「完全鎖長のcDNA」の欄を参照）の
配列と同一であった。
【００５７】このゲノム遺伝子を、パーキン・エルマー
／シータス DNAアンプリフィケーションシステム（Perk
in-Elmer／Cetus DNA Amplification System) を使用
し、製造元の説明書に従う PCR法により増幅した。この
遺伝子の５′末端ではプライマー NOR2378を使用した。
このプライマーは、Bcl Ｉ部位で１つのＣのＴへの置換
が起っている以外、その遺伝子の５′非翻訳末端とマッ
チする25mer である。この遺伝子の３′末端では、プラ
イマー NOR2389を使用した。このプライマーは、21塩基
がその遺伝子の３′非翻訳末端とマッチし、そしてプラ
イマーの５′端の５塩基がSa1 Ｉ部位を完成する26mer
である。
【００５８】アスペルギルス発現ベクターpToc68は、プ
ラスミドp775 (この構築はヨーロッパ特許第 238,023号
明細書に記載されている) から以下のリンカーを挿入す
ることにより構築した。
【化１】
【００５９】pTocの構築は、添付の図１に示す。上記で
得られた PCRフラグメントを、Bcl ＩおよびSa1 Ｉで消
化し、次いでBam HIおよびXho Ｉで消化したpToc68に挿
入した。得られたプラスミド(pDaHj 109) のインサート
を配列決定したところ、もとのクローンと同一であるこ
とを示した。
【００６０】完全鎖長のcDNA：第一鎖cDNAを既知配列(N
OR2153) の特定のプライマーから合成し、そして第二鎖
の合成はGublerおよびHoffman (1983) GENE 25, 263
〜269 ページに記載される方法に従って行った。ゲノム
遺伝子の配列は、mRNAの５′部をとらえると同時に ATG
開始コドンの前の右にBam HI部位を導入するような PCR
プライマー(NOR2334) を設計できるようにした。５′末
端でこのプライマーを使用し、３′末端でNOR2153 を使
用することにより二本鎖cDNA生成物上で PCRを行った。
【００６１】次に、PCR-cDNAの一部をコードする完全鎖
長を、３′Pvu Ｉ−Eco 0109と共にPCR反応由来の５′B
am HI−Pvu Ｉフラグメントを、クレノウポリメラーゼ
でそれをブラント端とするように満たし、Bam HI−Nru
Ｉで切断したアスペルギルスの発現ベクターpToC68にク
ローニングして構築し (図１）、そして挿入された DNA
を検査した(pSX320) (図２参照）。この完全鎖長cDNAの
配列を添付の配列表ID#1に示す。
【００６２】使用したオリゴヌクレオチドプライマー
類：
【化２】
【００６３】略字： Ｙ：ピリミジン（Ｃ＋Ｔ） Ｒ：プリン（Ａ＋Ｇ） Ｎ：全４種の塩基 太字：もとの配列に対する変化または挿入部。 下線：PCR により導入された制限部位。
【００６４】〜43kDのエンドグルカナーゼの発現：アス
ペルギルス・オリーゼ (Aspergillus oryzae) IFO 417
7 のプロテアーゼ欠失誘導体であるアスペルギルス・オ
リーゼ A1560−T40 をプラスミドpS×320で形質転換
し、 pUC19ベクター (Yannisch−Perronら、(1985), GE
NE 33, 103〜119 ページ) 上に 2.7kbのXba Ｉフラグ
メントとしてアスペルギルス ニヅランス (Aspergillu
s nidulans)由来のamds遺伝子を担うpToC90で同時形質
転換することによりアセトアミドによる選択に使用した
(Corrickら、(1987), GENE 53, 63〜71ページ) 。形質
転換は、ヨーロッパ特許出願公開第 238,023号明細書に
記載されるように行った。多数の形質転換体を〜43kDの
エンドグルカナーゼの同時発現についてスクリーニング
した。形質転換体をSDS-PAGE (p.3)と CMCエンドグルカ
ナーゼ活性により評価した。
【００６５】ゲノム遺伝子を含有するプラスミド (pCaH
j109) で上記のようにアスペルギルス オリーゼ A1560
-T40を形質転換した。これらの形質転換体の評価は、発
現レベルがcDNAの形質転換体のそれと類似であることを
示した。精製された〜43kDのエンドグルカナーゼをその
Ｎ末端配列と糖含量について分析した。Ｎ末端配列は、
HPLC精製〜43kDのエンドグルカナーゼのそれと同一であ
ることを示した。糖含量は、グルコースよりも１モル当
り10＋／−８のガラクトースを組換え酵素が含む点でHP
LC精製43kDの酵素のそれと異なる。
【００６６】例３．フザリウム・オキシスポラム（Fusa
rium oxysporum)のゲノムDNA の単離 フザリウム・オキシスポラムの凍結乾燥培養物をリン酸
緩衝液で元へ戻し、５枚のフォックス(FOX) 培地 (酵母
エキス６％，K2HPO4 1.5％, MgSO4・7H2O 0.75％, グ
ルコース 22.5％, 寒天 1.5％, pH5.6)プレートの各々
に５度スポットし、37℃でインキュベーションした。イ
ンキュベーションの６日後、プレートからコロニーをか
きとり、 0.001％のツウィーン (Tween)-80 15mLに入
れ、濃く曇った懸濁液を得た。
【００６７】液体フォックス(FOX) 培地 300mLをそれぞ
れ含む４個の１リットルフラスコに上記胞子懸濁液２mL
で植菌し、240rpmの30℃でインキュベーションした。イ
ンキュベーションの４日目に培養物を４層の滅菌ガーゼ
を通して濾過し、滅菌水で洗浄した。菌体をワットマン
濾紙上で乾燥し、液体窒素で凍結し、冷却乳鉢で微粉末
にすりつぶし、新鮮な溶菌緩衝液(10mM Tris-Cl, pH7.
4, １％SDS, 50mM EDTA, 100 μＬ DEPC) 75mL に加え
た。十分に混合した懸濁液を１時間65℃の湯浴でインキ
ュベーションし、ベンチトップ型遠心機により５℃ 400
0RPMで10分間回転した。上澄をデカントし、エタノール
で沈殿させた。氷上で１時間後、その溶液を20分間19,0
00rpm で回転させた。上澄をデカント後、イソプロパノ
ールで沈殿させた。10分間10,000rpm で遠心後、上澄を
デカントし、ペレットを乾燥させた。
【００６８】TER 液 (10mM Tri−HCl, pH7.4, １mM EDT
A, 100μｇ RNAseA)を各チューブに加え、それぞれのチ
ューブを２日間４℃で貯蔵した。これらのチューブを取
り出して65℃の湯浴中に30分間置き、不溶性の DNAを浮
遊させた。溶液をフェノール／CHCl3 ／イソアミルアル
コールで２度、 CHCl3／イソアミルアルコールで２度抽
出し、次いでエタノール沈殿した。ペレットを沈殿さ
せ、エタノールを除去した。70％エタノールを加え、 D
NAを−20℃で一夜貯蔵した。デカントおよび乾燥後、TE
R １mLを加え、１時間65℃でチューブをインキュベーシ
ョンすることで DNAを溶解した。こうしてゲノムDNA 1.
5mg を得られた。
【００６９】フザリウム オキシスポラム（Fusarium
oxysporum)の〜43kDエンドグルカナーゼのクローニング フミコーラの〜43kDセルラーゼに対するフザリウムの相
同体を単離するために、PCR(米国特許第 4,683,195号お
よび同 4,683,202号明細書に記載されるように) および
クローン化を行った。次に、この生成物を配列決定し、
PCR増幅用プローブのライブラリーとして使用するプラ
イマー類を構築した。これらのオリゴヌクレオチドを使
用して、cDNAライブラリーから対応するクローンを単離
した。
【００７０】PCR を使用して43kDの相同体の部分鎖長cD
NAとゲノムのフラグメントを単離した。 PCR反応では、
鋳型としてcDNAまたはゲノムDNA のいずれかと共に高変
性のオリゴヌクレオチド (下記表を参照) の７種の組み
合わせを使用した。ただ１種の組み合わせがフザリウム
の43kD相同体の部分クローンを生成しただけである。２
つの個別のセットの PCR条件を各オリゴヌクレオチド対
について使用した。第一のセットは非常に少ない生成物
を調製するが非常に高い特異性をもつように設計した。
このセットの28サイクルで各種ファクターが特異性を保
持した。65℃のアニーリング温度はこれらのオリゴヌク
レオチドにとっては非常に高温であった。この温度のア
ニーリング時間はほんの30秒間に設定した。
【００７１】反応液 100μＬ当り各変性プライマー混合
物20ピコモルを使用した。使用したオリゴヌクレオチド
は、「クローニング要素(Cloning element) を含まない
デジェネレート (degenarate) 領域だけを含み、Amplit
aq (商標) (Perkin-Elmer Cetus)１単位を反応液 100μ
Ｌ当りに使用し、そしてEDTAを最後の10分間の72℃イン
キュベーションの終りに反応チューブに加えてPCR サイ
クル後の低温でのミスマッチプライマーによる伸長を防
いだ。第一セットのサイクルの生成物は、高い特異性を
確保するのに必要な低い効率の増幅のためにアガロース
電気泳動のエチジウムブロマイド染色により可視化され
ることは期待できないであろう。
【００７２】しかしながら、第二セットの増幅は、第一
セットからの生成物を効率よく増幅するように設計され
た。このことを達成するファクターとしては、アニーリ
ング温度を55℃に低下すること、アニーリング時間を１
分まで延長すること、オリゴヌクレオチドの量を反応液
100μＬ当り各混合物を 100ピコモルまで増加するこ
と、デジェネレートタンパク質に沿った「プライム (Pr
ime)」クローニング要素を含む別の１組のオリゴヌクレ
オチド類を使用すること（溶融温度を極端に高める）、
および反応液 100μＬ当りAmplitaq (商標) ポリメラー
ゼを2.5 単位使用することが挙げられる。
【００７３】PCR 反応は、Perkin-Elmer Cetusにより推
奨されるように行った。マスター混合物を２つの DNA源
（ゲノムおよびcDNA）のそれぞれについて作製した。こ
れは、１×PCR の緩衝液 (10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50m
M KCl, 1.5mM MgCl2, 0.01％ゼラチン、Perkin-Elmer
Cetus), 0.2mMのデオキシヌクレオチド(Ultrapure
(商標) dNTPの100mM 溶液、Pharmacia), １単位のAmpli
taq (商標) ポリメラーゼ(Perkin Elmer Cetus)および
反応混合物 100μＬ当り 0.5μｇのゲノムDNA または50
ngのcDNAを含んでなり、そして脱イオン水で反応液 100
μＬ当り98μＬに容量を調節した。
【００７４】ラベルを貼った 0.5チューブ (エッペンド
ルフ) に各オリゴヌクレオチド混合物 (下記参照) 20ピ
コモル (20ピコモル／μＬ濃度の液１μＬ）を加えた。
これらを、 0.5mLチューブ中にまた、マスター混合物と
軽質硬油とを含め、パーキン・エルマー・シータス (Pe
rkin-Elmer Cetus) サーマルサイクラー (thermocycle
r) 中へ入れた。適当なマスター混合物98μＬと軽質硬
油55μＬをオリゴヌクレオチド類と共に各チューブに加
えた。次に、順次段階的なサイクル (パラメーターにつ
いては下記チャートを参照のこと) で反応を開始した。
最後の72℃インキュベーションの終りに、10mMのEDTA溶
液(pH8.0) 50μＬを各チューブに加え、72℃でさらに５
分間インキュベーションした。
【００７５】
【表１】 一連の PCR工程サイクル条件は次のとおりであった。
【００７６】
【表２】
【００７７】PCR サイクルの第一セット後、イソプロピ
ルアルコール沈殿により反応混合物から DNAを精製し、
サイクルの第二セットで使用した。軽質鉱油の大部分を
各試料の上部から除いた後、試料を新たなラベルを貼っ
たチューブに移した。次に、各チューブを等量の PCI
(49％フェノール：49％クロロホルム：２％イソアミル
アルコール）で、次いで等量のクロロホルムで抽出し
た。次に、反応液へ 7.5Ｍの酢酸アンモニウム75μＬ、
グリコーゲン１μＬおよびイソプロピルアルコール226
μＬを加えて DNAを沈殿させた。
【００７８】ペレットを脱イオン水20μＬに再懸濁し
た。再懸濁液各２μＬをラベルを貼ったチューブに入
れ、それぞれ新たなプライマー（上記表参照） 100ピコ
モル (20ピコモル／μＬ濃度の液５μＬ）と共に第二回
の PCR増幅を行った。マスター混合物は、アレゲノム
(Alegenomic) およびcDNA鋳型の除去ならびに反応チュ
ーブ中のオリゴヌクレオチドと DNA容量を添加する水の
量を減らすことにより増加するように補足したこと以外
上記のように調製した。反応とサイクルは上記のように
設定した (上記表を参照) 。
【００７９】28サイクルが終了した後、軽質鉱油を試料
の上部ら除去し、次いで PCR混合物を新たなチューブに
採取した。各試料10μＬをパラフィン上にスポットし、
約５分間45℃でインキュベーションして、残存する軽質
鉱油をパラフィンに吸収させ試料容量を減少させた。次
に、これらの液滴を６倍の色素２μＬと共に１％アガロ
ースゲル(Seaken GTG(商標) 、FMC, Rockland, ME)にの
せて電位泳動を行った。鋳型がcDNAであって反応番号２
に約 550塩基対の単一バンドが見られた。鋳型がゲノム
DNA であって反応番号12に約 620塩基対のバンドが見ら
れた。これらの反応液をオリゴヌクレオチドZC3486およ
びZC3561 (表１）でプライムした。
【００８０】これは、フミコーラ43kD配列との比較から
予期される 510塩基対 PCR生成物と非常に近似してい
た。ゲノム鋳型による反応でより大きな生成物が合成さ
れるのは、この領域内にイントロンが存在することによ
る。これらの２つのバンドを含むアガロースを切り出
し、製造業者の説明書に従ってPrep-A-Gene(商標) キッ
ト(Bio Rad) を使用することにより DNAを抽出した。 D
NAは脱イオン水50μＬで溶離し、３Ｍの酢酸ナトリウ
ム、グリコーゲン１μＬおよびエタノール 140μＬで沈
殿させた。 DNAペレットを乾燥し、TE (10mM Tris-HCl,
pH8.0, １mM EDTA)７μＬで再懸濁させた。
【００８１】pBSsk-′ベクターにクローニングした PCR
フラグメントを、最初にEco RIと共にpBluescript II s
k-(Stratagene, La Jolla, CA)で消化して調製し、次い
で切断プラスミドを 0.8％のseaplaque GTG (商標) ア
ガロース(FMC) からPre-A-Gene (商標) キット(Bio Ra
d) を使用し、製造業元の指示に沿って精製した。オリ
ゴヌクレオチドZC1773およびZC1774 (表１）を、パーキ
ン・エルマーシータス（Perkin−Elmer Cetus) PCRサー
マルサイクラーにより各オリゴヌクレオチド２ピロモル
ずつ混合し、アニーリング緩衝液 (200mM Tris-HCl, pH
7.6, 50mM MgCl2)0.5μＬを加えた脱イオン水で反応液
量を４μＬまで増量し、次いで30秒間65℃の温度に保持
しそして20分かけてゆっくり20℃まで冷却することによ
ってアニーリングした。
【００８２】次に、これらのオリゴヌクレオチドをEco
RI消化pBluescoriptベクターへ次のようにして連結し
た。脱イオン水 5.5μＬ、アニーリングされたオリゴヌ
クレオチド２μＬ、消化されたベクターの脱イオン水に
よる１：３希釈物１μＬ，10×T4 DNAリガーゼ緩衝液(B
oehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis IN)
１μＬおよびT4 DNAリガーゼ (Gibco-BRL) 0.5μｌを混
合し、次いで 2.5時間16℃で混合物をインキュベーショ
ンした。次に、連結混合物を脱イオン水で 100μＬの容
量に調節し、次いで PCIおよびクロロホルムで抽出し
た。電気穿孔法の (エレクトロポレーション) の効率を
高めるために、次に、酢酸アンモニウム50μＬ、グリコ
ーゲン１μＬおよびイソプロパノール 151μＬで DNAを
沈殿させた。
【００８３】バイオラッド(Bio-Rad) 電気穿孔法装置に
より、製造業元の指示に従って、脱イオン水による再懸
濁液10μＬの１μＬのイ・コリー (E. coli) DH10-B エ
レクトロマックス (electromax) 細胞(Gibco-BRL) 中へ
電気穿孔法を実施した。電気穿孔法の直後に、キュベッ
トへ２×YTブロス (１リットル当り：トリプトン16ｇ、
酵母エキス10ｇ、 NaCl 10ｇ) １mLを加えて混合した。
各種希釈物を、 100μｇ／mLのアミピシリンを含み、ジ
メチルホルムアミド中20mg／mLのX-Gal(５−ブロモ−４
−クロロ−３−インドリル−６−Ｄ−ガラクトロピラノ
シド、Sigma, st. Louis, MO) 100μＬと１ＭのIPTG
(Sigma) 20μＬを塗布した 100mmのLBプレート (１リ
ットル当り：トリプトン10ｇ、酵母エキス８ｇ、NaCl
５ｇ、寒天14.5ｇ) 上へのせた。
【００８４】１夜生育後、上記バクテリアプラークにつ
いて上述する条件に従って、オリゴヌクレオチドZC3424
(ブルースクリプトリバースプライマー) およびZC3425
(Ｔ７プロモータープライマー)(表１）を使用する小さ
なインサートについての PCRにより各種青色コロニーと
白色コロニーを解析した。最初に１分45秒94℃で変性
後、45秒間94℃、30秒40℃および１分間72℃を30サイク
ル行った。 PCR生成物のアガロースゲル電気泳動によ
り、pBluescript クローニング領域中に小さなインサー
トを含む PCRバンドを与える１つの青色コロニーを、 1
50μｇ／mLのアンピシリンを含むTB (１リットル当り：
トリプトン12ｇ、酵母エキス24ｇ、グリセロール４mLを
オートクレーブした後、0.17Ｍ KH2PO4, 0.72ＭK2HPO4
100mLを加えた。
【００８５】Sambrockら、Molecular Cloning 、第２
版、1989，A.2)の液体培地 100mL中で１夜生育した。配
列分析は正しくオリゴヌクレオチドが挿入されたことを
示すが、プロモーターのフレームの pBluescriptベクタ
ー中に存在するβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は保持され
たままであった。DNA 調製物の50μｇをEco RIで消化
し、 PCIとクロロホルムで抽出し、次いで酢酸ナトリウ
ムとエタノールで沈殿させた。 DNAペレットを脱イオン
水50μＬに再懸濁した。消化された pBS sk-′を、10×
T4 DNAポリメラーゼ緩衝液〔0.33Ｍ Tris ／酢酸、pH8.
0, 0.66Ｍ 酢酸カリウム、 0.1Ｍ酢酸マグネシウム、
５mMジチオスレイトール、５mM BSA (New England Biol
abs)〕40μＬ、脱イオン水 260μＬ、１mMのdTTP (Ultr
apure (商標) 、Pharmacia) 40μＬおよびT4 DNAポリ
メラーゼ (１Ｕ／μＬ) (Gibco-BRL)40μＬを１mg／mL
のベクターDNA に加えることによりカットバックした。
【００８６】混合物を15分間12℃でインキュベーション
し、次いで10分間70℃でインキュベーションした。連結
に使用する DNAを調製するために、 PCIとクロロホルム
で抽出し、次いで酢酸ナトリウムとエタノールで沈殿さ
せた。ペレットを脱イオン水200 μＬに再懸濁し、濃度
0.1μｇ／μＬとした。上記カットバックpBS sk−′ベ
クターへの挿入用43kD相同的 PCR生成物を調製するため
に、dTTPの代りにdATPを含めた10μＬ容量の反応液中で
T4 DNAポリメラーゼ(Gibco-BRL) によりそれらをカット
バックした。得られた DNA溶液を PCIとクロロホルムで
抽出し、次いで酢酸ナトリウム、グリコーゲンおよびエ
タノールによって沈殿した。
【００８７】DNAペレットを脱イオン水10μＬに再懸濁
した。DNA 試料 7.5μＬを、10×リガーゼ緩衝液 (Boeh
ringer-Mannheim)１μＬおよびT4 DNAリガーゼ(Boehrin
ger-Mannheim) 0.5μＬで0.1 μｇのカットバックpBS
sk−′(0.1μｇ／μＬ) に連結した。次に、この連結反
応混合物を脱イオン水で 150μＬ容量まで増量し、次い
で PCIとクロロホルムで抽出した。電気穿孔法の効率を
高めるために、次に、酢酸ナトリウム15μＬ、グリコー
ゲン１μＬおよびイソプロパノール 166μＬでDNA を沈
殿させた。脱イオン水再懸濁液10μＬのうち１μＬを、
製造元の指示に従ってBio-Rad 電気穿孔法装置によりイ
・コリーDH10-Bエレクトロマックス細胞(BRL) 中に電気
穿孔した。
【００８８】電気穿孔法の直後、 SOBブロス (１リット
ル当り：トリプトン20ｇ、酵母エキス５ｇ、１Ｍ NaCl
10mL、１Ｍ KCl 2.5mLをオートクレーブした後、１Ｍ M
gCl210mLと１Ｍ MgSO4 10mLを加えた) をキュベットに
加え、次いで細胞混合物を100μｌチューブに移し、好
気下で１時間37℃にてインキュベーションした。各種希
釈物を、アンピシリン 100μｇ／mLを含み、ジメチルホ
ルムアミド中20mg／mLのX-Gal (Sigma) と１ＭのIPTG(S
igma) を塗布した 100mmのLBプレート上にのせた。２種
の形質転換（cDNAとゲノム）のそれぞれ３個の白色コロ
ニーを採取し、配列決定した。
【００８９】配列分析は、インサートがフミコーラの43
kDセルラーゼと高度に相同性であることを示した。ゲノ
ムのインサートは、イントロンの存在を除きcDNAと同一
であった。２つの42mer オリゴヌクレオチドZC3709およ
びZC3710 (表１）は、ライブラリープローブおよび PCR
プライマーと使用する配列から設計した。これらのオリ
ゴヌクレオチドは PCR生成物の逆の末端に由来し、 DNA
の対向する鎖にハイブリッドするように設計されている
ので、それらはライブラリーのスクリーニングの際に可
能性のあるクローンを試験するための PCR反応のプライ
マーとして使用できる。
【００９０】フザリウム・オキシスポラム（Fusarium
oxysporum) cDNA ライブラリーの構築 フザリウム・オキシスポラムを発酵によって生育し、い
ろいろな時間に試料を採取して RNAを抽出し、セルラー
ゼ活性を分析した。活性の分析には、総セルラーゼ活性
のアッセイと色澄明化のアッセイを含む。最高の色澄明
化を示すフザリウム・オキシスポラム試料は、ポリ
(Ａ）＋RNA が単離された全体の RNAから抽出された。
【００９１】フザリウム・オキシスポラムのcDNAライブ
ラリーを構築するために、第一鎖cDNAを２種の反応液
（一つは放射能標識したdATPで、他の一つは放射能標識
しないdATP）で合成した。 2.5×反応混合物を、以下の
試薬を次の順序で混合することにより室温で調製した。
５×の逆転写酵素緩衝液 (Gibco-BRL, Gaithersburg, M
aryland)10μＬ、200mM のジチオスレイトール (−70℃
で保蔵された原液由来または新たに調製) 2.5μＬおよ
び各オリゴヌクレオチドチド三リン酸(dATP, dGTP, dTT
P および５−メチルdCTP, Pharmacia LKB Biotechnolog
y, Alamada, CA.から得た) 10mMを含む混合物2.5 μ
Ｌ。
【００９２】反応混合物を２つのチューブに 7.5μＬず
つ分注した。10μCi／μＬの 32Pα−dATP (Amersham,
Arlington Heights, IL) 1.3μＬを一つのチューブに加
え、もう一方のチューブには水 1.3μＬを加えた。各混
合物の７μＬを最終反応チューブに移した。それぞれの
チューブで、５mMのTris-HCl(pH7.4) および50μＭのED
TA 14 μＬ中フザリウム オキシスポラムのポリ (Ａ）
＋ RNA５μｇを、１μｇ／μＬの第一鎖プライマー（ZC
2938：GACAGAGCACAGAATTCACTAGTGAGCTCT15) ２μＬと混
合した。この RNAプライマー混合物を４分間65℃に加熱
し、氷水で冷却し、次いで微量遠心管で短時間遠心し
た。 RNAプライマー混合物８μＬを最終反応チューブに
加えた。
【００９３】200 Ｕ／μＬのSuperscript(商標) 逆転写
酵素(Gibco-BRL) ５μＬを各チューブに加えた。ゆるや
かに撹拌した後、チューブを30分間45℃でインキュベー
ションした。10mMのTris-HCl(pH7.4) , １mMのEDTA 80
μＬを各チューブに加え、試料を回転させて、簡単に遠
心した。各チューブから３μＬを採取し、 TCA沈殿によ
り取り込まれたカウントと反応液中の総カウントを測定
した。各チューブからの試料２μＬをゲル電気泳動で分
析した。各試料の残りを、オイスターグリコーゲンの存
在下でエタノール沈殿処理した。核酸を遠心によりペレ
ット化し、次いでこれらのペレットを80％エタノールで
洗浄した。エタノール洗浄後、試料を10分間通気乾燥し
た。第一鎖の合成は、ポリ (Ａ）＋RNA から DNAの転換
率33％に相当するフザリウムオキシスポラムcDNA 1.6μ
ｇを与えた。
【００９４】第二鎖の合成は、ヘアピン DNAをもたらす
第二鎖合成の第一鎖プライミングを促進する条件下で第
一鎖反応液由来の RNA−DNA ハイブリダイゼーションに
よって行った。２つの第一鎖反応液のれぞれに由来する
第一鎖生成物を、水71μＬに再懸濁した。次の試薬、５
×第二鎖緩衝液(100mM Tris, pH7.4, 450mM KCl, 23mM
MgCl2 および50mM (NH4)2SO4) 20μＬ, ５mMβ−NAD ３
μＬおよび各10mMのデオキシヌクレオチド三リン酸混合
物５μＬを、室温で上記反応チューブに添加した。
【００９５】α−32PdATP １μＬを、第一鎖合成用の末
標識dATPを含む反応混合物に加え、一方、一鎖合成用の
標識dATPを含むチューブには水１μＬを含めた。次に、
各チューブに、７Ｕ／μＬのイ・コリー DNAリガーゼ(B
oehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) 0.6 μＬ、８
Ｕ／μＬのイ・コリー DNAポリメラーゼＩ(Amersham)3.
1 μＬおよび２Ｕ／μＬのRNase H (Gibco-BRL) を加え
た。反応液を２時間16℃でインキュベーションした。
【００９６】インキュベーション後、各反応液由来の２
μＬを使用して TCA沈殿性カウントと反応液の総カウン
トを測定し、次いで各反応液由来の２μＬをゲル電気泳
動により分析した。各試料の残りに、 2.5μｇ／μＬの
オイスターグリコーゲン２μＬ、 0.5mMのEDTA ５μＬ
および10mMのTris-HCl (pH7.4)、 １mMのEDTA 200μＬを
加えた。試料をフェノール−クロロホルムで抽出し、次
いでイソプロパノール沈殿させた。遠心後、ペレットを
80％エタノール 100μＬで洗浄し、通気乾燥した。反応
の各々によって得られた二本鎖cDNAは、約 2.5μｇであ
った。
【００９７】ムングビーン(mung been) ヌクレアーゼ処
理によりヘアピンの一本鎖DNA を切り取った。各cDNAペ
レットを水15μＬに再懸濁し、次いで各チューブに10×
ムングビーン緩衝液(0.3Ｍ酢酸ナトリウム、pH4.6 、３
Ｍ NaCl および10mM ZnSO4)2.5μＬ 10mMの DTT 2.5μ
Ｌ、50％のグリセロール 2.5μＬおよび10Ｕ／μＬのム
ングビーンヌクレアーゼ(New England Biolabs, Beverl
y, MA)2.5 μＬを加えた。
【００９８】反応液を30分間30℃でインキュベーション
し、各チューブに10mMのTris-HCl(pH7.4) および１mM E
DTA 75μＬを加えた。２μＬのアリコートをアルカリ性
アガロースゲル分析により分析した。１ＭのTris-HCl
(pH7.4) 100μＬを各チューブに加え、試料をフェノー
ル−クロロホルムで２度抽出した。 DNAをイソプロパノ
ールで沈殿させ、次いで遠心によりペレット化した。遠
心後、DNA のペレットを80％エタノールで洗浄し、通気
乾燥した。２つの反応のそれぞれからの DNAの収量は、
約２μｇであった。
【００９９】このcDNAの末端をT4 DNAポリメラーゼで処
理して平滑にした。水24μＬの合計容量で２つの試料に
由来する DNAを再懸濁した後、合わせた。この DNAに、
10×Ｔ４緩衝液 (330mM Tris−酢酸塩、pH7.9 、670 mM
KAc、100mM MgAcおよび１mg／mLのゼラチン）４μＬ、
１mMのdNTP ４μＬ、50mMのDTT ４μＬおよび１Ｕ／μ
ＬのT4DNA ポリメラーゼ(Boehringer-Mannheim) ４μＬ
を加えた。これらの試料を１時間15℃でインキュベーシ
ョンした。インキュベーション後、10mMのTris-HCl(pH
7.4) および１mMのEDTA 160μＬを加え、次いで試料を
フェノール−クロロホルムで抽出した。 DNAをイソプロ
パノールで沈殿させ、次いで遠心によりペレット化し
た。遠心後、 DNAを80％エタノールで洗浄し、次いで通
気乾燥した。
【０１００】この DNAを水 6.5μＬで再懸後、Eco RIア
ダプターを平滑化された DNAに付加した。この DNAに、
１μｇ／μＬのEco RIアダプター(Invitrogen, San Die
go,CAカタログ#409-20)１μＬ、10×リガーゼ緩衝液(0.
5Ｍ Tris, pH7.8および50mMMgCl2) １μＬ、10mMのATP
0.5 μＬ、 100mMのDTT 0.5μＬおよび１Ｕ／μＬのT4
DNAリガーゼ(Boehringer-Mannheim) １μＬを加えた。
この試料を室温で１夜インキュベーションした後、リガ
ーゼを15分間65℃で変性した。
【０１０１】第一鎖プライマーによってコードされたSs
I クローニング部位を、SsI エンドヌクレアーゼで消化
することにより露出させた。このDNA に水33μＬ、10×
Ss I緩衝液(0.5Ｍ Tris, pH8.0, １Ｍ MgCl2および 0.5
Ｍ NaCl)５μＬおよび５Ｕ／μＬのSsI ２μＬを加え、
この試料を２時間37℃でインキュベーションした。10mM
のTris-HCl(pH7.4) および１mMのEDTA 150μＬを加え、
試料をフェノール−クロロホルムで抽出し、次いで DNA
をイソプロパノールで沈殿させた。
【０１０２】cDNAをセファロースCL2B (Pharmacia LKB
Biotechnology)カラムでクロマト処理してcDNAのサイズ
を選択し、そしてアダプターを含まないものを除去し
た。セファロースCL2Bカラム 1.1mLを１mLのプラスチッ
ク使い捨てピペットに流し込み、そのカラムを50倍カラ
ム容量の緩衝液(10mL Tris, pH7.4 および１mM EDTA)で
洗浄した。試料をのせ、１滴ずつ画分を集め、ポイド容
積中の DNAを集めた。画分した DNAをイソプロパノール
で沈殿させた。遠心後、 DNAを80％エタノールで洗浄
し、次いで通気乾燥した。
【０１０３】フザリウム・オキシスポラムのcDNAライブ
ラリーを、Eco RIおよびSst I で消化したベクターpYcD
E8′ (国際公開第WO90／10698 号参照) にそのcDNAを連
結することにより樹立した。10×リガーゼ緩衝液８μ
Ｌ、10mMのATP ４μＬ、200mMのDTT ４μＬおよび１単
位のT4 DNAリガーゼ(Boehringer-Mannheim) を含むリゲ
ーション反応溶液８μＬ中、cDNA 400ngに390ng のベク
ターを連結した。室温で１夜インキュベーション後、オ
イスターグリコーゲン５μｇおよび10mMのTris-HClおよ
び１mMのEDTA 120μｇを加え、試料をフェノール−クロ
ロホルムで抽出した。 DNAをエタノールで沈殿させ、DN
A ペレットを80％エタノールで洗浄した。通気乾燥後、
DNAを水３μＬに再懸濁した。
【０１０４】電気穿孔法成分 DH10B細胞 (Gibco-BRL) 3
7 μＬを上記 DNAに加え、Bio-RadGene Pulser (Model
#1652076)およびBio-Rad Pulse Controller (Model #16
52098) エレクトロポレーションニット (Bio-Rad Labor
atories, Richmond, CA) により電気穿孔法を完了し
た。SOC (Hanahan, J. Mol. Biol. 166(1983), 557〜58
0)の４mLをエレクトロポレーション処理した細胞に加
え、次いで細胞懸濁液 400μＬを10枚の150mm LBアンピ
シリンプレートの各々に広げた。１夜インキュベーショ
ン後、 LBamp培地10mLを各プレートに加え、細胞を培地
から採取した。グリセロール原液とプラスミド調製物を
各プレートから作製した。ライブラリーのバックグラン
ド (インサートを含まないベクター) を、インサートを
伴わないベクターの連結と電気穿孔法後の数個のクロー
ンの力価測定によって約１％において樹立した。
【０１０５】43kD相同体の完全鎖長cDNAクローンを単離
するため、 1,100,000コロニーのライブラリーを 100μ
ｇ／mLのアンピシリンを含む 150mmのLBプレート上にま
いた。各10枚のプレート上にグリセロール原液由来の 1
00,000コロニーをまき、そして各５枚のプレート上に2
0,000コロニーをまいた。上記のように釣菌を２度行っ
た。予備ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーシ
ョンおよび洗浄も上記のように実施した。ハイブリダイ
ゼーションでは、２つの末端が標識された 42merのオリ
ゴヌクレオチド類、ZC3709およびZC3710 (43kd相同体に
特異性である) を使用した。
【０１０６】フィルターは、77℃でTMACL により20分間
１度洗浄した。複写フィルター上に現われる22個のスポ
ットが観察された。プレートの対応する領域をピペット
の大きい端を使用してそぎ取り、１×PCR 緩衝液に入れ
た。単離されたこれらを、各単離物に対して２セットの
オリゴヌクレオチドを使用して PCR分析した。２種の43
kD特異性オリゴヌクレオチドを含む一つのセットを、ハ
イブリダイゼーションプローブとして使用し、そしても
う一つのものは、一つの43kD特異性オリゴヌクレオチド
(ZC3709)と一つのベクター特異性オリゴヌクレオチド
（ZC3634) を含む。PCR は、パーキンエルマーシータス
の指示に従って上記のように行った。
【０１０７】各プライマー20ピコモルと細胞懸濁液５μ
Ｌを、50μＬの各反応液中で使用した。94℃における１
分30秒の最初の変性後、94℃１分と72℃２分の30サイク
ルを使用し、最後の伸長は72℃で10分の時間とした。結
果は22個のうち17が上記２つの43kD特異性オリゴヌクレ
オチド認識部位を含むことを示した。残りの５つのクロ
ーンは、上記２つの部位の一つ（ZC3709) を含むが、ベ
クター特異性プライマーを使用する PCRにより切り縮め
られそして十分な長さでないので他の部位を含まないこ
とが明らかにされた。
【０１０８】９種の最も長いクローンをスクリーニング
の別のレベルで単一コロニーを単離目的で選んだ。各５
つの10倍希釈物を、第一セットのリフト（lift) につい
て上記したような操作でまいた。９種のすべてが二次レ
ベルのスクリーニングのオートラジオグラフ上にシグナ
ルを示した。コロニーは非常に密集していたので、放射
能シグナルの領域内の数個の分離したコロニーを単一コ
ロニーとして70μｇ／mLのアンピシリンを含む150 mm L
B プレート上で単離した。
【０１０９】コロニーをつまようじでそぎ取りマスター
混合物25μＬに入れたこと以外第一レベルのスクリーニ
ングについて記載したようにオリゴヌクレオチドZC3709
およびZC3710を使用する PCRによって〜43kDエンドグル
カナーゼに対する相同性を試験した。９個のクローンの
うち７個について予期したサイズのバンドが得られた。
これらの培養を 150μｇ／mLのアンピシリンを含むテリ
フィック ブロス (Terrific Broth) 20mLで開始した。
DNAを、上記のようなアルカリ溶菌および PEG沈殿によ
って単離した。
【０１１０】DNA 配列分析 これらのcDNAを、酵母発現ベクターpYCDE8′により配列
決定した。New England Nuclear からの35-SdATP (M.
D. Bigginら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1983,
3963〜3965ページ、参照) を使用するジデオキシチェ
インターミネーション法(F. Sangerら、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 74, 1977, 5463〜5467ページ) を、すべ
ての配列決定反応に使用した。
【０１１１】これらの反応は、 Pharmaciaからの変性 t
7DNAポリメラーゼ (S. TaborおよびC.C.Richardson, Pr
oc. Natl. Acadd. Sci. USA 84, 1987, 4767 〜4771ペ
ージ、参照) で触媒され、そしてADH1プロモーター(ZC9
96：ATT GTT CTC GTT CCC TTT CTT)に相補的なオリゴヌ
クレオチド、CYC1ターミネーター(ZC3635 ：TGT ACGCAT
CTA ACA TTA)に相補的なオリゴヌクレオチドまたは目
的の DNAに相補的なオリゴヌクレオチドによりプライム
された。二本鎖鋳型はNaOHで変性 (E.Y.ChenおよびP.H.
Seeburg,DNA ４, 1985,165〜170 ページ）した後、配列
決定用オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさ
た。オリゴヌクレオチド類は、AppliedBiosystems Mode
l 380A DNA シンセサイザーにより合成した。配列決定
反応に使用したオリゴヌクレオチド類を下記シーケンシ
ングオリゴヌクレオチド表に列挙する。
【０１１２】
【表３】
【０１１３】
【表４】
【０１１４】例４．色澄明化試験 フミコーラ（Humicola) 〜43kDエンドグルカナーゼ（30
の精製実施物の混合物) を、色澄明試験について米国特
許第 4,435,307号の実施例６に記載のフミコーラ イン
ソレンス（Humicola insolens）セルラーゼ調製物と比
較した。試験材料として、使い古した黒色綿スワッチを
使用した。澄明試験は、３回反復洗浄するターゴトメー
ターで行った。各洗濯の間にスワッチを１度乾燥した。
【０１１５】条件：30分間40℃で２ｇ／Ｌの液体洗剤お
よび水の硬度９°dH。スワッチの大きさは10×15cmであ
り、各ビーカー中に２枚のワッチを入れる。洗剤の組成
は次のとおりである。 アニオン界面活性剤（Nansa 1169／p) 10％ 非イオン界面活性剤 (Berol 160) 15％ エタノール 10％ トリエタノールアミン 5％ 水 60％ (塩酸でpHを 8.0に調節した) 。
【０１１６】用量：２種の酵素を63および125CMCエンド
アーゼ単位／Ｌで使用した。結果 ：結果は、１〜７点の範囲でスワッチを評価する22
人のパネラーによって評価された。より高い点数はより
良い澄明化が得られたものである。
【０１１７】
【表５】 本発明の〜43kDエンドグルカナーゼは、従来技術のフミ
コーラ インソレンス（H. insolens)より約30倍優れた
性能を示し、そして国際公開第WO89／09259 号に従うセ
ルラーゼ調製物より約６倍優れた性能を示すことがわか
る。
【０１１８】例５．プロテアーゼの存在下でのフミコー
ラ（Humicola) 〜43kDエンドグルカナーゼの安定性 異なるプロテアーゼが存在する液体洗剤中の本発明の〜
43kDエンドグルカナーゼの貯蔵安定性を、以下の条件下
で測定した。酵素 本発明の〜43kDエンドグルカナーゼ Glu ／Asp 特異性バチルス リケニフォルミス (B. lic
heniformis) セリンプロテアーゼ トリプシン様フザリウムエスピー (Fusarium sp.) DSM2672 プロテアーゼ バチルス レンタス (B. lentus)セリンプロテアーゼ Subtilisin Novo
【０１１９】洗剤 乳白剤、香料または酵素 (実験で添加されるもの以外)
のどれも含まれていない米国で市販されている液体洗
剤。酵素安定剤として＋１−１％（重量／重量）のホウ
酸。用量 エンドグルカナーゼ：洗剤１ｇ当り12CMCU プロテアーゼ：洗剤１ｇ当り 0.2mgインキュベーション 35℃で７日
【０１２０】残存活性 相当するプロテアーゼと共にインキュベーション７日後
のエンドグルカナーゼ残存活性は、その CMCアーゼ活性
（CMCU) で測定した。CMC アーゼ活性は次のように測定
した。脱イオン水中30ｇ／ＬのCMC (Hercules 7LFD) 基
質溶液を調製した。測定すべき酵素試料を0.01Ｍのリン
酸緩衝液(pH7.5) に溶解した。酵素液 1.0mLと 0.1Ｍの
リン酸緩衝液(pH7.5) 2.0mL を試験管中で混合し、酵素
反応はその試験管に基質溶液 1.0mLを加えることにより
開始した。混合液を20分間40℃でインキュベーション
し、その後反応を 0.125Ｍのリン酸三ナトリウム・12H2
O 2.0mL添加するすることにより停止した。ブライド試
料はインキュベーションすることなく調製した。
【０１２１】フェリシアニド溶液 (脱イオン水１Ｌ中フ
ェリシアン化ナトリウム1.60ｇおよびリン酸三ナトリウ
ム・12H2O 14.0ｇ) 2.0 mLを試験試料ならびにブライン
ド試料に加え、直ちに沸騰水に浸した後10分間インキュ
ベーションした。インキュベーション後、試料を水道水
で冷却した。 420nmで吸光度を測定し、標準曲線はグル
コース溶液で作成した。１ CMCアーゼ単位 (CMCU) は、
上記に特定される条件下で、１分間にグルコース１マイ
クロモルに相当する量の還元糖を生成する酵素量として
定義されている。
【０１２２】結果 本発明のエンドグルカナーゼの貯蔵安定性は、上記条件
下でその残存活性 (CMCU％として) として測定された。
【表６】
【０１２３】これらの結果は、Savinaseより高度の特異
性をもつプロテアーゼが洗剤組成物に含められた場合
に、本発明のエンドグルカナーゼの液体洗剤中での貯蔵
安定性が改善されることを示す。
【０１２４】例６．デニム織物の色の局所的な変化を付
与するためのフミコーラ〜43kDエンドグルカナーゼの使
用 「ストーンウォッシュ」の外観に近似するジーンズの表
面の色に局所的な変化を付与するために、12kgの「ウォ
ッシュコーター(Wascator)」 FL120洗濯物抽出機中でデ
ニムジーンズを〜43kDエンドグルカナーゼ処理にかけ
た。機械負荷量当り４本のジーンズを使用した。実験条
件は以下のとおりであった。
【０１２５】糊抜き 40Ｌの水 100mL のB. amyloliquefaciensアミラーゼ* , 120Ｌ 70ｇのKH2PO4 30ｇのNa2HPO4 55℃ 10分 pH6.8 ＊Novo Nordisk A/Sより入手可 糊抜きの後排水した。
【０１２６】摩耗 40Ｌの水 120 ｇのH. insolens セルラーゼ混合物または×ｇの〜
43kDエンドグルカナーゼ 70ｇのKH2PO4 30ｇのNa2HPO4 55℃ 75分 pH6.6 摩耗処理後、排水、すすぎ、後洗濯およびすすぎを行っ
た。
【０１２７】結果は、ジーンズの視覚的外観を判断する
ことにより評価した。各種用量の〜43kDエンドグルカナ
ーゼを使用してフミコーラ インソレンス（H. insolen
s)セルラーゼ混合物 120ｇによって得られるのと等価の
摩耗レベルを得た。この等価のレベルは、〜43kDエンド
グルカナーゼ 1.0〜1.25ｇで得られた。処理被服の引裂
強さの測定値は、両酵素処理間で有意差が示されなかっ
た。
【０１２８】例７．織物表面の毛羽の除去へのフミコー
ラ（Humicola) 〜43kDエンドグルカナーゼの使用 新しい織物に対して高度の柔軟性を付与する酵素の効力
を検査するために、12kgの「ウォッシュコーター」 FL1
20洗濯抽出機中で綿100 ％の織物を〜43kDエンドグルカ
ナーゼで処理した。実験条件は次のとおりであった。織物 綿 100％の織物は、Nordisk Textilより漂白済み (NT21
16-b) または未漂白(NT2116-ub) のものを入手した。織
物 400ｇを機械負荷量当り使用した。
【０１２９】糊抜き 40Ｌの水 200mL のB. amyloliquefaciensアミラーゼ, 120Ｌ 60ｇのKH2PO4 20ｇのNa2HPO4 60℃ 10分 pH6.4 糊抜き処理後、排水した。
【０１３０】主洗濯 40Ｌの水 0-600 ｇのH. insolens セルラーゼ調製物または×ｇの
〜43kDエンドグルカナーゼ 60ｇのKH2PO4 40ｇのNa2HPO4 60℃ 60分 pH6.7 摩耗処理後排水した。
【０１３１】後洗濯 40Ｌの水 40ｇのNa2CO3 10ｇのBerol 08 80℃ 15分 pH10.1 後洗濯後排水した。〜43kDエンドグルカナーゼを３段階
の濃度で主洗濯で使用した。
【０１３２】織物試料の重量減小を処理前後に測定し
た。重量減小を％で表示し、そして糊抜された織物と比
較した。織物の厚さを、厚さ測定器 L&W、タイプ22／１
によって測定した。織物のスワッチ (10×６cm）２枚を
測定し、μｍによる５箇所の測定値を各スワッチについ
て記録した。スワッチは、98.07kPaの加圧下で測定され
た。保持された厚さを％で表示し、糊抜き織物と比較し
た。織物の強度は、引裂試験機(Elemendorf 09) によっ
て測定した。６枚のスワッチ (10×６cm）をたて方向に
切断し、そして６枚のスワッチ（10×６cm）をよこ方向
に切断した。引裂強さは、ASTM D1424に従いmNで測定し
た。酵素処理織物の織物強度は、糊抜き織物との比較に
おいて％で表示される。
【０１３３】織物の剛性は、キングファブリックスティ
フネステスター (King Fabric Stiffness Tester) で測
定した。４枚のスワッチ（10×20cm; たて方向に10cm)
を織物から切り取り、各スワッチを裏返しに折り重 (10
×10cm) 、そして中央に開口リングを備えたテーブル上
に置いた。織物を、グラムで教示される一定の力のピス
トンでリングを介して押した。ASTM D4032円形折り曲げ
試験法 (Circular Bend Test Method)に従い測定を行っ
た。保持織物曲げ剛性は、糊抜きされた織物と比較にお
いて％で表示される。これらの試験の結果は、次の表に
示される。
【０１３４】
【表７】
【０１３５】例８．紙パルプの処理へのフミコーラ（Hu
micola) 〜43kDエンドグルカナーゼの使用 パルプ排液に対する酵母の効果を検査するために、各種
タイプの紙パルプの処理に〜43kDエンドグルカナーゼを
使用した。実験条件は次のとおりであった。パルプ １．回収紙混合物：新聞紙33％、雑誌33％およびコンピ
ューター用紙33％からなる。脱インク薬品の使用または
不使用（それぞれ、WPC またはWP) 。 ２．再循環ボール箱 (RCC)。 ３．漂白クラフトパルプ：マツ製（BK) 。 ４．未漂白熱砕木パルプ：モミ製（TMP)。
【０１３６】セルラーゼ活性 (CEVU) の測定 トリス (Tris) 緩衝液(pH9.0) 中33.3ｇ／ＬのCMC (Her
cules 7LFD) 含有基質溶液を調製した。測定すべき酵素
試料を上記緩衝液に溶解した。基質溶液10mLと酵素溶液
0.5mLを混合し、40℃に温度調節された粘度計 (Haake
VT181, NV sensor, 181rpm) に移した。１セルラーゼ粘
度単位（CEVU) は、ノボノルディスクアナリティカルメ
ソッド (Novo Nordisk Analytical Method) No.AF253
(ノボノルディスクより入手可) により定義される。
【０１３７】パルプ排液の測定 (ショッパー・リーグラ
ー) ショッパー・リーグラー (Schopper-Riegler)(SR) 数
は、２ｇ／Ｌの粘度をもつ均質パルプに対する ISOスタ
ンダード5267 (パート１）に従って測定した。既知量の
パルプを金属製の篩を通して漏斗中へ流した。この漏斗
には、軸方向の孔と横方向の孔が設けられている。横方
向の孔を通過する濾液量をショッパー・リーグラー単位
が目盛られた容器で測定する。
【０１３８】酵素処理 〜43kDエンドグルカナーゼ調製物を７CEVU／mLに希釈
し、上記パルプ（50ｇDS、粘度３％）に加えた。酵素用
量は、乾燥パルプ１kg当り2400CEVUであった。酵素処理
は、60分間ゆるやかに撹拌しながらpH7.5 および40℃で
行った。試料を30分間後に採取して反応の進行をモニタ
ーした。60分後、反応を停止するためにパルプを冷水
（＋４℃）で粘度 0.5％に希釈した。湿潤パルプの排液
を上記のように測定し、ショッパー・リーグラー (SR)
値を求めた。減圧下での排液時間も測定した。結果を下
記表にまとめる。
【０１３９】
【表８】
【０１４０】
【表９】
【０１４１】
【表１０】
【０１４２】上記表から、〜43kDエンドグルカナーゼ処
理は、製紙で使用されるパルプのSR値の著しい低下をも
たらし、そして排液が有意に改善されることを示す。ラ
ピッド カーテン (Rapid Kothen) 装置により各種パル
プから紙シートを作製し、各種パラメーター (破壊長を
含む) に関する強度を測定した。酵素の作用に起因する
強度特性の低下はみられなかった。
【０１４３】
【配列表】 <110> Novo Nordisk A/S <120> Cellulase preparation containing Endoglucanase Enzymol <130> <150> 1990-05-09 <151> 1159/90 <150> 1991-04-22 <151> 0736/91 <160> 32 <210> 1 <211> 1060 <212> DNA <213> Humicola insolens <221> mat peptide <222> 73..927 <221> sig peptide <222> 10..72 <221> CDS <222> 10..927 <400> 1 ggatccaag atg cgt tcc tcc ccc ctc ctc ccg tcc gcc gtt gtg Met Arg Ser Ser Pro Leu Leu Pro Ser Ala Val Val -21 -20 -15 -10 gcc ctg ccg gtg ttg gcc ctt gcc gct gat ggc agg tcc acc cgc tac 96 Ala Leu Pro Val Leu Ala Leu Ala Ala Asp Gly Arg Ser Thr Arg Tyr -5 1 5 tgg gac tgc tgc aag cct tcg tgc ggc tgg gcc aag aag gct ccc gtg 144 Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ala Lys Lys Ala Pro Val 10 15 20 aac cag cct gtc ttt tcc tgc aac gcc aac ttc cag cgt atc acg gac 192 Asn Gln Pro Val Phe Ser Cys Asn Ala Asn Phe Gln Arg Ile Thr Asp 25 30 35 40 ttc gac gcc aag tcc ggc tgc gag ccg ggc ggt gtc gcc tac tcg tgc 240 Phe Asp Ala Lys Ser Gly Cys Glu Pro Gly Gly Val Ala Tyr Ser Cys 45 50 55 gcc gac cag acc cca tgg gct gtg aac gac gac ttc gcg ctc ggt ttt 288 Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala Val Asn Asp Asp Phe Ala Leu Gly Phe 60 65 70 gct gcc acc tct att gcc ggc agc aat gag gcg ggc tgg tgc tgc gcc 336 Ala Ala Thr Ser Ile Ala Gly Ser Asn Glu Ala Gly Trp Cys Cys Ala 75 80 85 tgc tac gag ctc acc ttc aca tcc ggt cct gtt gct ggc aag aag atg 384 Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Lys Met 90 95 100 gtc gtc cag tcc acc agc act ggc ggt gat ctt ggc agc aac cac ttc 432 Val Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe 105 110 115 120 gat ctc aac atc ccc ggc ggc ggc gtc ggc atc ttc gac gga tgc act 480 Asp Leu Asn Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr 125 130 135 ccc cag ttc ggc ggt ctg ccc ggc cag cgc tac ggc ggc atc tcg tcc 528 Pro Gln Phe Gly Gly Leu Pro Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser 140 145 150 cgc aac gag tgc gat cgg ttc ccc gac gcc ctc aag ccc ggc tgc tac 576 Arg Asn Glu Cys Asp Arg Phe Pro Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr 155 160 165 tgg cgc ttc gac tgg ttc aag aac gcc gac aat ccg agc ttc agc ttc 624 Trp Arg Phe Asp Trp Phe Lys Asn Ala Asp Asn Pro Ser Phe Ser Phe 170 175 180 cgt cag gtc cag tgc cca gcc gag ctc gtc gct cgc acc gga tgc cgc 672 Arg Gln Val Gln Cys Pro Ala Glu Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg 185 190 195 200 cgc aac gac gac ggc aac ttc cct gcc gtc cag atc ccc tcc agc agc 720 Arg Asn Asp Asp Gly Asn Phe Pro Ala Val Gln Ile Pro Ser Ser Ser 205 210 215 acc agc tct ccg gtc aac cag cct acc agc acc agc acc acg tcc acc 768 Thr Ser Ser Pro Val Asn Gln Pro Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr 220 225 230 tcc acc acc tcg agc ccg cca gtc cag cct acg act ccc agc ggc tgc 816 Ser Thr Thr Ser Ser Pro Pro Val Gln Pro Thr Thr Pro Ser Gly Cys 235 240 245 act gct gag agg tgg gct cag tgc ggc ggc aat ggc tgg agc ggc tgc 864 Thr Ala Glu Arg Trp Ala Gln Cys Gly Gly Asn Gly Trp Ser Gly Cys 250 255 260 acc acc tgc gtc gct ggc agc act tgc acg aag att aat gac tgg tac 912 Thr Thr Cys Val Ala Gly Ser Thr Cys Thr Lys Ile Asn Asp Trp Tyr 265 270 275 280 cat cag tgc ctg tagacgcagg gcagcttgag ggccttactg gtggccgcaa 964 His Gln Cys Leu 285 cgaaatgaca ctcccaatca ctgtattagt tcttgtacat aatttcgtca tccctccagg 1024 gattgtcaca taaatgcaat gaggaacaat gagtac 1060
【０１４４】 <210> 2 <211> 305 <212> PRT <213> Humicola insolens <400> 2 Met Arg Ser Ser Pro Leu Leu Pro Ser Ala Val Val Ala Ala Leu Pro -21 -20 -15 -10 Val Leu Ala Leu Ala Ala Asp Gly Arg Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys -5 1 5 10 Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ala Lys Lys Ala Pro Val Asn Gln Pro 15 20 25 Val Phe Ser Cys Asn Ala Asn Phe Gln Arg Ile Thr Asp Phe Asp Ala 30 35 40 Lys Ser Gly Cys Glu Pro Gly Gly Val Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln 45 50 55 Thr Pro Trp Ala Val Asn Asp Asp Phe Ala Leu Gly Phe Ala Ala Thr 60 65 70 75 Ser Ile Ala Gly Ser Asn Glu Ala Gly Trp Cys Cys Ala Cys Try Glu 80 85 90 Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Lys Met Val Val Gln 95 100 105 Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Asn 110 115 120 Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe 125 130 135 Gly Gly Leu Pro Gly Gln Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Asn Glu 140 145 150 155 Cys Asp Arg Phe Pro Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe 160 165 170 Asp Trp Phe Lys Asn Ala Asp Asn Pro Ser Phe Ser Phe Arg Gln Val 175 180 185 Gln Cys Pro Ala Glu Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Arg Arg Asn Asp 190 195 200 Asp Gly Asn Phe Pro Ala Val Gln Ile Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ser 205 210 215 Pro Val Asn Gln Pro Thr Ser Thr Ser Thr Thr Ser Thr Ser Thr Thr 220 225 230 235 Ser Ser Pro Pro Val Gln Pro Thr Thr Pro Ser Gly Cys Thr Ala Glu 240 245 250 Arg Trp Ala Gln Cys Gly Gly Asn Gly Trp Ser Gly Cys Thr Thr Cys 255 260 265 Val Ala Gly Ser Thr Cys Thr Lys Ile Asn Asp Trp Tyr His Gln Cys 270 275 280 Leu
【０１４５】 <210> 3 <211> 1473 <212> DNA <213> Fusarium oxysporum <221> CDS <222> 97..1224 <400> 3 gaattcgcgg ccgctcattc acttcattca ttctttagaa ttacatacac tctctttcaa 60 aacagtcact ctttaaacaa aacaactttt gcaaca atg cga tct tac act ctt 114 Met Arg Ser Tyr Thr Leu 1 5 ctc gcc ctg gcc ggc cct ctc gcc gtg agt gct gct tct gga agc ggt 162 Leu Ala Leu Ala Gly Pro Leu Ala Val Ser Ala Ala Ser Gly Ser Gly 10 15 20 cac tct act cga tac tgg gat tgc tgc aag cct tct tgc tct tgg agc 210 His Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Ser Trp Ser 25 30 35 gga aag gct gct gtc aac gcc cct gct tta act tgt gat aag aac gac 258 Gly Lys Ala Ala Val Asn Ala Pro Ala Leu Thr Cys Asp Lys Asn Asp 40 45 50 aac ccc att tcc aac acc aat gct gtc aac ggt tgt gag ggt ggt ggt 306 Asn Pro Ile Ser Asn Thr Asn Ala Val Asn Gly Cys Glu Gly Gly Gly 55 60 65 70 tct gct tat gct tgc acc aac tac tct ccc tgg gct gtc aac gat gag 354 Ser Ala Tyr Ala Cys Thr Asn Tyr Ser Pro Trp Ala Val Asn Asp Glu 75 80 85 ctt gcc tac ggt ttc gct gct acc aag atc tcc ggt ggc tcc gag gcc 402 Leu Ala Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Lys Ile Ser Gly Gly Ser Glu Ala 90 95 100 agc tgg tgc tgt gct tgc tat gct ttg acc ttc acc act ggc ccc gtc 450 Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu Thr Phe Thr Thr Gly Pro Val 105 110 115 aag ggc aag aag atg atc gtc cag tcc acc aac act gga ggt gat ctc 498 Lys Gly Lys Lys Met Ile Val Gln Ser Thr Asn Thr Gly Gly Asp Leu 120 125 130 ggc gac aac cac ttc gat ctc atg atg ccc ggc ggt ggt gtc ggt atc 546 Gly Asp Asn His Phe Asp Leu Met Met Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile 135 140 145 150 ttc gac ggc tgc acc tct gag ttc ggc aag gct ctc ggc ggt gcc cag 594 Phe Asp Gly Cys Thr Ser Glu Phe Gly Lys Ala Leu Gly Gly Ala Gln 155 160 165 tac ggc ggt atc tcc tcc cga agc gaa tgt gat agc tac ccc gag ctt 642 Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Ser Glu Cys Asp Ser Tyr Pro Glu Leu 170 175 180 ctc aag gac ggt tgc cac tgg cga ttc gac tgg ttc gag aac gcc gac 690 Leu Lys Asp Gly Cys His Trp Arg Phe Asp Trp Phe Glu Asn Ala Asp 185 190 195 aac cct gac ttc acc ttt gag cag gtt cag tgc ccc aag gct ctc ctc 738 Asn Pro Asp Phe Thr Phe Glu Gln Val Gln Cys Pro Lys Ala Leu Leu 200 205 210 gac atc agt gga tgc aag cgt gat gac gac tcc agc ttc cct gcc ttc 786 Asp Ile Ser Gly Cys Lys Arg Asp Asp Asp Ser Ser Phe Pro Ala Phe 215 220 225 230 aag gtt gat acc tcg gcc agc aag ccc cag ccc tcc agc tcc gct aag 834 Lys Val Asp Thr Ser Ala Ser Lys Pro Gln Pro Ser Ser Ser Ala Lys 235 240 245 aag acc acc tcc gct gct gct gcc gct cag ccc cag aag acc aag gat 882 Lys Thr Thr Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gln Pro Gln Lys Thr Lys Asp 250 255 260 tcc gct cct gtt gtc cag aag tcc tcc acc aag cct gcc gct cag ccc 930 Ser Ala Pro Val Val Gln Lys Ser Ser Thr Lys Pro Ala Ala Gln Pro 265 270 275 gag cct act aag ccc gcc gac aag ccc cag acc gac aag cct gtc gcc 978 Glu Pro Thr Lys Pro Ala Asp Lys Pro Gln Thr Asp Lys Pro Val Ala 280 285 290 acc aag cct gct gct acc aag ccc gtc caa cct gtc aac aag ccc aag 1026 Thr Lys Pro Ala Ala Thr Lys Pro Val Gln Pro Val Asn Lys Pro Lys 295 300 305 310 aca acc cag aag gtc cgt gga acc aaa acc cga gga agc tgc ccg gcc 1074 Thr Thr Gln Lys Val Arg Gly Thr Lys Thr Arg Gly Ser Cys Pro Ala 315 320 325 aag act gac gct acc gcc aag gcc tcc gtt gtc cct gct tat tac cag 1122 Lys Thr Asp Ala Thr Ala Lys Ala Ser Val Val Pro Ala Tyr Tyr Gln 330 335 340 tgt ggt ggt tcc aag tcc gct tat ccc aac ggc aac ctc gct tgc gct 1170 Cys Gly Gly Ser Lys Ser Ala Tyr Pro Asn Gly Asn Leu Ala Cys Ala 345 350 355 act gga agc aag tgt gtc aag cag aac gag tac tac tcc cag tgt gtc 1218 Thr Gly Ser Lys Cys Val Lys Gln Asn Glu Tyr Tyr Ser Gln Cys Val 360 365 370 ccc aac taaatggtag atccatcggt tgtggaagag actatgcgtc tcagaaggga 1274 Pro Asn 375 tcctctcatg agcaggcttg tcattgtata gcatggcatc ctggaccaag tgttcgaccc 1334 ttgttgtaca tagtatatct tcattgtata tatttagaca catagatagc ctcttgtcag 1394 cgacaactgg ctacaaaaga cttggcaggc ttgttcaata ttgacacagt ttcctccata 1454 aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1473
【０１４６】 <210> 4 <211> 376 <212> PRT <213> Fumicola oxysporum <400> 4 Met Arg Ser Tyr Thr Leu Leu Ala Leu Ala Gly Pro Leu Ala Val Ser 1 5 10 15 Ala Ala Ser Gly Ser Gly His Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys 10 25 30 Pro Ser Cys Ser Trp Ser Gly Lys Ala Ala Val Asn Ala Pro Ala Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Lys Asn Asp Asn Pro Ile Ser Asn Thr Asn Ala Val Asn 50 55 60 Gly Cys Glu Gly Gly Gly Ser Ala Tyr Ala Cys Thr Asn Tyr Ser Pro 65 70 75 80 Trp Ala Val Asn Asp Glu Leu Ala Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Lys Ile 85 90 95 Ser Gly Gly Ser Glu Ala Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu Thr 100 105 110 Phe Thr Thr Gly Pro Val Lys Gly Lys Lys Met Ile Val Gln Ser Thr 115 120 125 Asn Thr Gly Gly Asp Leu Gly Asp Asn His Phe Asp Leu Met Met Pro 130 135 140 Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Ser Glu Phe Gly Lys 145 150 155 160 Ala Leu Gly Gly Ala Gln Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Ser Glu Cys 165 170 175 Asp Ser Tyr Pro Glu Leu Leu Lys Asp Gly Cys His Trp Arg Phe Asp 180 185 190 Trp Phe Glu Asn Ala Asp Asn Pro Asp Phe Thr Phe Glu Gln Val Gln 195 200 205 Cys Pro Lys Ala Leu Leu Asp Ile Ser Gly Cys Lys Arg Asp Asp Asp 210 215 220 Ser Ser Phe Pro Ala Phe Lys Val Asp Thr Ser Ala Ser Lys Pro Gln 225 230 235 240 Pro Ser Ser Ser Ala Lys Lys Thr Thr Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gln 245 250 255 Pro Gln Lys Thr Lys Asp Ser Ala Pro Val Val Gln Lys Ser Ser Thr 260 265 270 Lys Pro Ala Ala Gln Pro Glu Pro Thr Lys Pro Ala Asp Lys Pro Gln 275 280 285 Thr Asp Lys Pro Val Ala Thr Lys Pro Ala Ala Thr Lys Pro Val Gln 290 295 300 Pro Val Asn Lys Pro Lys Thr Thr Gln Lys Val Arg Gly Thr Lys Thr 305 310 315 320 Arg Gly Ser Cys Pro Ala Lys Thr Asp Ala Thr Ala Lys Ala Ser Val 325 330 335 Val Pro Ala Tyr Tyr Gln Cys Gly Gly Ser Lys Ser Ala Tyr Pro Asn 340 345 350 Gly Asn Leu Ala Cys Ala Thr Gly Ser Lys Cys Val Lys Gln Asn Glu 355 360 365 Tyr Tyr Ser Gln Cys Val Pro Asn 370 375
【０１４７】 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Linker KFN 514 <400> 5 agctgcggcc gcaggccgcg gaggcca 27
【０１４８】 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Linker KFN 515 <400> 6 agcttggcct ccgcggcctg cggccgc 27
【０１４９】 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Linker KFN 516 <400> aattcgcggc cgcggccatg gaggcc 26
【０１５０】 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Linker KFN 519 <400> aattggcctc catggccgcg gccgcg 26
【０１５１】 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer NOR 1251 <400> 9 aaygcygaca aaycc 15
【０１５２】 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer NOR 2048 <400> 10 aacgaygayg gnaayttccc 20
【０１５３】 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer NOR 2050 <400> 11 aaygaytggt accaycartg 20
【０１５４】 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer NOR 2153 <400> 12 gcgccagtag cagccgggct tgaggg 26
【０１５５】 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer NOR 2334 <400> 13 acgtctcaac tcggatccaa gatgcgtt 28
【０１５６】 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer NOR 2378 <400> 14 ctcaactctg atcaagatgc gttcc 25
【０１５７】 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer NOR 2389 <400> 15 tgtcgaccag taaggccctc aagctg 26
【０１５８】 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer ZC 3485 <400> 16 tgggaytgyt gyaarcc 17
【０１５９】 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer ZC 3486 <400> 17 agggagaccg gaattctggg aytgytgyaa rcc 33
【０１６０】 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer ZC 3556 <400> 18 ccnggnggng gngtngg 17
【０１６１】 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer ZC 3557 <400> 19 agggagaccg gaattcccng gnggnggngt ngg 33
【０１６２】 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer ZC 3558 <400> 20 acnaycatnk tyttncc 17
【０１６３】 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer ZC 3559 <400> 21 gacagagcac agaattcacn aycatnktyt tncc 34
【０１６４】 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer ZC 3560 <400> 22 nggrttrtcn gcnkyytyra acca 24
【０１６５】 <210> 23 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer ZC 3561 <400> 23 gacagagcac agaattcngg rttrtcngcn kyytyraacc a 41
【０１６６】 <210> 24 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> ZC 3709 <400> 24 ggggtagcta tcacattcgc ttcgggagga gataccgccg ta 42
【０１６７】 <210> 25 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> ZC 3710 <400> 25 cttcttgctc ttggagcgga aaggctgctg tcaacgcccc tg 42
【０１６８】 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> CYCI terminator ZC 3635 <400> 26 tgtacgcatg taacatta 18
【０１６９】 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> ADHI promoter ZC 3634 <400> 27 ctgcacaata tttcaagc 18
【０１７０】 <210> 28 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer ZC 3709 <400> 28 ggggtagcta tcacattcgc ttcgggagga gataccgccg ta 42
【０１７１】 <210> 29 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer ZC 3710 <400> 29 cttcttgctc ttggagcgga aaggctgctg tcaacgcccc tg 42
【０１７２】 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer ZC 3870 <400> 30 agcttctcaa ggacggtt 18
【０１７３】 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer ZC 3881 <400> 31 aacaagggtc gaacactt 18
【０１７４】 <210> 32 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Primer ZC 3882 <400> 32 ccagaagacc aaggatt 17
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、プラスミドｐＴｏＣ６８の作製過程を
示す図である。
【図２】図２は、エンドグルカナーゼをコードするＤＮ
Ａのクローニングを示す図であ。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１月２１日（２０００．１．２
１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｓ 3/04 Ｃ１２Ｓ 3/04 Ｄ０６Ｍ 16/00 Ｄ０６Ｍ 16/00 Ａ // Ｄ２１Ｈ 11/20 Ｄ２１Ｈ 11/20 (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 ミッケルセン，ヤン メラー デンマーク国，デーコー−2820 ゲントフ テ，スネルレバイ 20．エル (72)発明者 シューレイン，マルティン デンマーク国，デーコー−2100 ケーベン ハウン エー，ビーデベルツガーデ 51 (72)発明者 パトカル，シャムカント アナント デンマーク国，デーコー−2800 リングバ イ，クリストファーズ アレ 91

Claims (31)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 フミコーラ・インソレンス (Humicola
    insolens) DSM1800から誘導される高度に精製された〜4
    3kDのエンドグルカナーゼに対して産生される抗体と免
    疫反応性であるか、または前記〜43kDのエンドグルカナ
    ーゼの誘導体である均質エンドグルカナーゼ成分を必須
    のものとして含むセルラーゼ調製物。
  2. 【請求項２】 前記エンドグルカナーゼ成分が、タンパ
    ク質１mg当り少なくとも50CMC エンドアーゼ単位を示す
    請求の範囲第１項のセルラーゼ調製物。
  3. 【請求項３】 前記エンドグルカナーゼ成分が、総タン
    パク質１mg当り少なくとも60CMC エンドアーゼ単位、特
    に総タンパク質１mg当り少なくとも90CMC エンドアーゼ
    単位、好ましくは総タンパク質１mg当り少なくとも100C
    MCエンドアーゼ単位を示す請求の範囲第２項のセルラー
    ゼ調製物。
  4. 【請求項４】 前記エンドグルカナーゼ成分が、実質的
    にセロビオヒドロラーゼ活性を示さない請求の範囲第１
    項のセルラーゼ調製物。
  5. 【請求項５】 前記エンドグルカナーゼ成分が、等電点
    約5.1 をもつ請求の範囲第１〜４項のいずれかのセルラ
    ーゼ調製物。
  6. 【請求項６】 エンドグルカナーゼ活性を示す酵素であ
    って、添付の配列表ID#2に示されるアミノ酸配列を有す
    る酵素またはエンドグルカナーゼ活性を示す前記酵素の
    相同体。
  7. 【請求項７】 フミコーラ（Humicola) 属の一の種、例
    えばフミコーラ・インソレンス（Humicola insolens)
    によって生産できる請求の範囲第６項のエンドグルカナ
    ーゼ酵素。
  8. 【請求項８】 酵素が添付の配列表ID#4で示されるアミ
    ノ酸配列をもつエンドグルカナーゼ活性を示す酵素また
    はエンドグルカナーゼ活性を示す前記酵素の相同体。
  9. 【請求項９】 フザリウム（Fusarium) 属の一の種、例
    えばフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporu
    m)により生産できる請求の範囲第８項のエンドグルカナ
    ーゼ酵素。
  10. 【請求項１０】 請求の範囲第６〜９項のいずれかに記
    載されたエンドグルカナーゼ酵素をコードする DNA配列
    を含んでなる DNA構成物。
  11. 【請求項１１】 前記 DNA配列が、添付の配列表ID#1も
    しくはID#3に示されるか、またはそれらの変性体である
    請求の範囲第10項の DNA構成物。
  12. 【請求項１２】 挿入された請求の範囲第10または11項
    の DNA配列を担持する発現ベクター。
  13. 【請求項１３】 請求の範囲第10もしくは11項の DNA構
    成物または請求の範囲第12項の発現ベクターで形質転換
    された細胞。
  14. 【請求項１４】 糸状菌細胞、例えばトリコデルマ (Tr
    ichoderma)もしくはアスペルギルス (Aspergillus)の一
    の種に属する、特にアスペルギルス・オリーゼ (Asperg
    illus oryzae)もしくはアスペルギルス・ニガー (Aspe
    rgillus niger）、あるいは酵母細胞、例えばハンゼヌ
    ラ（Hansenula)もしくはサッカロミセス (Saccharomyce
    s)の一の種に属する、例えばサッカロミセス・セレビシ
    エ (Saccharomyces cerevisiae)である請求の範囲第13
    項の細胞。
  15. 【請求項１５】 請求の範囲第６〜９項のいずれかに記
    載されるようなエンドグルカナーゼ酵素の生産方法であ
    って、前記エンドグルカナーゼ酵素の発現が可能な条件
    下の適当な培地で請求の範囲第13もしくは14項の細胞を
    培養する工程、ならびにその培養物からエンドグルカナ
    ーゼ酵素を回収する工程を含んでなる方法。
  16. 【請求項１６】 請求の範囲第１〜５項のいずれかのセ
    ルラーゼ調製物または請求の範囲第６〜９項のいずれか
    のエンドグルカナーゼ酵素を、好ましくは粉立ち性のな
    い顆粒状、安定化された液体状または保護された酵素状
    で含有する洗剤添加剤。
  17. 【請求項１７】 前記添加剤の１ｇ当り、酵素タンパク
    質を１〜500 mg、好ましくは５〜250 mg、最も好ましく
    は10〜100 mg含む請求の範囲第16項の洗剤添加剤。
  18. 【請求項１８】 プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシ
    ダーゼおよび／またはアミラーゼのような別の酵素をさ
    らに含んでなる請求の範囲第16項の洗剤添加剤。
  19. 【請求項１９】 前記プロテアーゼが、バチルス・レン
    タス (Bacillis lentus) セリンプロテアーゼよりも高
    度の特異性をもつものである請求の範囲第18項の洗剤添
    加剤。
  20. 【請求項２０】 前記プロテアーゼが、ズブチリシンノ
    ボ (subtilisin Novo) もしくはその変異体、ノカルデ
    ィア・ダッソンビレイ (Nocardia dassonvillei) NRRL
    18133 から誘導されるプロテアーゼ、バチルス・リケニ
    フォルミス (Bacillis licheniformis)によって生産で
    きるグルタミン酸およびアスパラギン酸に特異的なセリ
    ンプロテアーゼ、またはフザリウム・エスピー (Fusari
    um sp.) DSM2672 によって生産できるトリプシン様プロ
    テアーゼである請求の範囲第19項の洗剤添加剤。
  21. 【請求項２１】 請求の範囲第１〜５項のいずれかのセ
    ルラーゼ調製物または請求の範囲第６〜９項のいずれか
    のエンドグルカナーゼ酵素を含んでなる洗剤組成物。
  22. 【請求項２２】 プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシ
    ダーゼおよび／またはアミラーゼのような別の酵素をさ
    らに含んでなる請求の範囲第21項の洗剤組成物。
  23. 【請求項２３】 前記プロテアーゼが、バチルス・レン
    タス (Bacillus lentus)セリンプロテアーゼよりも高度
    の特異性をもつものである請求の範囲第22項の洗剤組成
    物。
  24. 【請求項２４】 前記プロテアーゼが、ズブチリシンノ
    ボ(subtilisin Novo)もしくはその変異体、ノカルディ
    ア・ダッソンビレイ (Nocardia dassonvillei) NRRL18
    133 から誘導されるプロテアーゼ、バチルス・リケニフ
    ォルミス (Bacillus licheniformis)によって生産でき
    るグルタミン酸およびアスパラギン酸に特異的なセリン
    プロテアーゼ、またはフザリウム・エスピー (Fusarium
    sp.)DSM2672 によって生産できるトリプシン様プロテ
    アーゼである請求の範囲第23項の洗剤組成物。
  25. 【請求項２５】 洗浄液１リットル当り、前記セルラー
    ゼ調製物またはエンドグルカナーゼ酵素が酵素タンパク
    質として0.01〜 100mg、好ましくは0.05〜60mg、最も好
    ましくは 0.1〜20mgに相当する濃度で存在する請求の範
    囲第21項の洗剤組成物。
  26. 【請求項２６】 請求の範囲第16〜20項のいずれかの洗
    剤添加剤を含んでなる洗剤組成物。
  27. 【請求項２７】 セルロース含有織物がごわ付き始める
    速度を低減するかまたはセルロース含有織物のごわ付き
    を低減する方法であって、セルロース含有織物を請求の
    範囲第１〜５項のいずれかのセルラーゼ調製物または請
    求の範囲第６〜９項のいずれかのエンドグルカナーゼ酵
    素で処理する工程を含んでなる方法。
  28. 【請求項２８】 着色されたセルロース含有織物の色を
    澄明化を行う方法であって、着色されたセルロース含有
    織物を請求の範囲第１〜５項のいずれかのセルラーゼ調
    製物または請求の範囲第６〜９項のいずれかのエンドグ
    ルカナーゼ酵素で処理する工程を含んでなる方法。
  29. 【請求項２９】 着色されたセルロース含有織物の色の
    局所的な変化を提供する方法であって、着色されたセル
    ロース含有織物を請求の範囲第１〜５項のいずれかのセ
    ルラーゼ調製物または請求の範囲第６〜９項のいずれか
    のエンドグルカナーゼ酵素で処理する工程を含んでなる
    方法。
  30. 【請求項３０】 セルラーゼ調製物による織物の処理が
    その織物の浸漬、洗濯またはすすぎを通じて実施される
    請求の範囲第27, 28または29項の方法。
  31. 【請求項３１】 パルプの排液特性の改善方法であっ
    て、紙パルプを請求の範囲第１〜５項のいずれかのセル
    ラーゼ調製物または請求の範囲第６〜９項のいずれかの
    エンドグルカナーゼで処理する工程を含んでなる方法。
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