WO2002024916A1

WO2002024916A1 - Complex

Info

Publication number: WO2002024916A1
Application number: PCT/JP2001/008090
Authority: WO
Inventors: Hideto Chono; Hajime Matsumura; Mitsuhiro Ueno; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd; Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd; Takara Bio Inc
Priority date: 2000-09-20
Filing date: 2001-09-18
Publication date: 2002-03-28
Anticipated expiration: 2003-03-20
Also published as: TWI316090B; CN1193095C; US20040214303A1; KR20030032946A; CN1447858A; EP1319713B1; EP1319713A1; KR100801873B1; ATE456660T1; JPWO2002024916A1; AU2001286269A1; EP1319713A4; DE60141213D1; US20080206873A1

Description

明細書複合体技術分野

本発明は医学、薬学、農林水産学、食品学の分野において有用な真核生物に外来遺伝子を導入して形質転換する方法およびそれに関連する一連の技術に関する。背景技術

真核生物への遺伝子導入法としては、ウィルスベクターを用いる方法、裸の D

N Aをエンドサイト一シスや電気穿孔法、遺伝子銃によって導入する方法等が知られている。ウィルスベクターは、遺伝子治療の分野で基礎から臨床まで幅広く利用されている技術であり、例えばアデノウィルスベクターは標的細胞で目的遺伝子を一過性に大量発現させるのに適している。一方、レトロウイルスベクターは、宿主染色体への安定な組み込み機能により長期安定発現が可能であり、遺伝病の遺伝子治療の分野で期待されているベクターであり、また、トランスジェニック動物作製の分野でも期待されているベクターである。

しかし、ウィルスベクターを用いた遺伝子導入方法では、ウィルス感染を介して遺伝子導入されること力らゥィルスの指向性が問題となり、該ウィルスに対するレセプターを細胞表面に発現していない細胞には遺伝子導入することができない。この欠点を克服するため、水疱性口内炎ウィルスの外皮糖蛋白質 V S V— G を利用した広範な宿主域に感染可能なシユードタイプレトロウイルスベクターが開発されている。該ベクターは哺乳類のみならず、魚類、鳥類、昆虫、両生類等に遺伝子導入可能で、トランスジヱニック動物作製への応用が試みられているが、レトロウイルスの特性上、標的細胞に 1コピーしか入らないこと、及び感染から染色体への組み込みまでに少なくとも 7時間を要すること等の問題点を有している。

裸の D N Aを用いた遺伝子導入の場合、 D N Aは大腸菌等で容易に大量に調製することが可能であり、また、遺伝子導入は例えばリン酸カルシウムや力チォ- ックリボソームを介したエンドサイト一シスや、電気穿孔法、遺伝子銃、あるいはマイクロインジェクション技術によって可能である。この場合、一部の D N A が組換えにより染色体に取り込まれるが、その効率はきわめて悪く、ほとんどの場合一過性の遺伝子発現を期待した場合にのみ用いられている技術であり、長期安定発現には不適である。しかしながら、トランスジエニック生物作製においては、現時点では専ら裸の D N Aをマイクロインジェクション等によって導入する技術が採用されてきており、上記したように染色体への遺伝子の組み込みは偶然の組換えによってしか成立せず、トランスジヱニック生物の作製効率はきわめて悪く、そのため多大なコストと時間がかかっているのが現状である。発明の目的

本発明の目的は、レトロウイルスベクターの持っている特性である染色体への安定な遺伝子の組み込み機能を生かしつつ、宿主域を選ばずに遺伝子を導入し、幅広い範囲の細胞を形質転換する方法、及び該方法に使用される遺伝子導入用組成物、形質転換用組成物を提供することにある。これにより、幅広くトランスジヱニック生物作製が可能な技術を確立し、また、遺伝子治療の分野での新規べクターを開発することが出来る。発明の概要

本発明者らは鋭意研究の結果、組換えレト口ウィルスべクターが宿主染色体に組込まれる直前に形成される組換えプレインテグレーシヨン複合体

(recombinant pre - integration complex： r P I C ) を調製して標的細胞に導入した場合、この r P I Cに含まれる遺伝子が驚くべきことに元のウィルスの指向性に関係なく標的細胞の染色体上に組込まれることを見出した。

更に本発明者らは、この知見に基づき、幅広い範囲の標的細胞に遺伝子導入可能な複合体、及びその製造方法を開発し、該複合体を用いた細胞への遺伝子導入方法、細胞の形質転換法を開発し、本発明を完成した。

即ち、本発明を概説すれば、本発明の第 1の発明は、レトロウイルス由来の末端反復配列と、当該レトロウイルスに存在しない塩基配列の D N Aとを含有する 2本鎖 D N Aとレトロウイルス由来タンパク質成分を含む複合体に関する。

本発明の第 2の発明は、第 1の発明の複合体の製造方法に関する。

本発明の第 3の発明は、第 1の発明の複合体を細胞に導入する工程を包含することを特徴とする遺伝子導入方法に関する。

本発明の第 4の発明は、レトロウイルス由来タンパク質成分と、レトロウイノレス由来の末端反復配列と当該レトロウイノレスに存在しなレ、塩基配列の D N Aとを含有する 2本鎖 D N Aを細胞に導入することを特徴とする遺伝子導入方法に関する。

本発明の第 5の発明は、第 1の発明の複合体を含有することを特徴とする遺伝子導入用組成物に関する。

本発明の第 6の発明は、第 3または第 4の発明の遺伝子導入方法を行なうための遺伝子導入用キットに関する。

本発明の第 7の発明は、包装材と該包装材に封入された遺伝子導入用試薬からなる製造品に関し、該遺伝子導入用試薬が第 1の発明の複合体及び Z又は該複合体を調製するための試薬を含有し、前記遺伝子導入用試薬が、目的とする細胞への組換えレトロウィルスの感染の工程を含まない遺伝子導入に使用できることが、該包装材に付されたラベル又は該包装材に添付された指示書に表示されてなる、細胞への遺伝子導入用試薬の製造品に関する。

本発明の第 8の発明は、包装材と該包装材に封入された遺伝子導入用試薬からなる製造品に関し、該遺伝子導入用試薬が第 4の発明の遺伝子導入を行うための試薬を含有し、前記遺伝子導入用試薬が、目的とする細胞への組換えレトロウイルスの感染の工程を含まない遺伝子導入に使用できることが、該包装材に付されたラベル又は該包装材に添付された指示書に表示されてなる、細胞への遺伝子導入用試薬の製造品に関する。

本発明の第 9の発明は、第 1の発明の複合体を細胞に導入する工程を包含することを特徴とする細胞の形質転換方法に関する。

本発明の第 1 0の発明は、第 4の発明の方法によって遺伝子を導入する工程を包含することを特徴とする細胞の形質転換方法に関する。

本発明の第 1 1の発明は、第 1の発明の複合体を含有することを特徴とする細胞の形質転換用組成物に関する。

本発明の第 1 2の発明は、第 3または第 4の発明の遺伝子導入方法を包含することを特徴とする細胞の形質転換に使用されるキットに関する。

本発明の第 1 3の発明は、包装材と該包装材に封入された形質転換用試薬からなる製造品に関し、該形質転換用試薬が第 1の発明の複合体及び Z又は該複合体を調製するための試薬を含有し、前記形質転換用試薬が、目的とする細胞への組換えレトロウイルスの感染の工程を含まない形質転換に使用できること力 S、該包装材に付されたラベル又は該包装材に添付された指示書に表示されてなる、細胞の形質転換用試薬の製造品に関する。

本発明の第 1 4の発明は、包装材と該包装材に封入された形質転換用試薬からなる製造品に関し、該形質転換用試薬が第 1 0の発明の形質転換を行うための試薬を含有し、前記形質転換用試薬が、目的とする細胞への組換えレトロウイルスの感染の工程を含まない形質転換に使用できることが、該包装材に付されたラベル又は該包装材に添付された指示書に表示されてなる、細胞の形質転換用試薬の製造品に関する。発明の詳細な説明

以下、さらに詳細に本発明を説明する。

本発明の複合体は、標的細胞に遺伝子を導入するための複合体であって、具体的には少なくともレトロウィルス由来の末端反復配列（long terminal repeat：

L T R) と、当該レトロウイルスに存在しない塩基配列の D N A (すなわち、当該レトロウイルスとは異なる起源の D NA) とを含有する 2本鎖 D NAとレトロウィルス由来タンパク質成分を含有する複合体であり、レトロウイルスとしての構造を持たない複合体である。即ち、本発明の複合体は、レトロウイルスの R N Aゲノムやエンベロープを持たず、あるいはレトロウイスの R NAゲノムゃェンべロープが感染能を失っており、感染性をもたない複合体である。 1つの実施態様において、上記レトロウイルス由来の末端反復配列および当該レトロウィルスに存在しない塩基配列の D NAは組換えレトロウイルスに由来する。該複合体を使用することによって該複合体中の組換えレトロウイルス由来 2本鎖 D N Aに含まれる遺伝子、或いは当該レトロウイルスに存在しない塩基配列の D NAを標的細胞に導入することが出来る。ここで、糸且換えレトロウイルスとは、天然のレトロウィルスのゲノムの塩基配列の一部が改変されたものを言い、例えば、外来遺伝子が挿入されたレトロウイルスや、ウィルスゲノム上に存在する遺伝子、またはその一部に欠損、置換、挿入、付加を有するレトロウイルス等があげられる。該組換えレトロウイルスに特に限定はなく、ェコトロピックであってもアンフォトロピックであってもシユードタイプであっても良く、例えば、市販の糸且換えレトロウィルスベクターを使用することが出来る。

ここで、レトロウイルス由来の末端反復配列（long terminal repeat ： L T R) と、当該レトロウイルスに存在しない塩基配列の D NAとを含有する 2本鎖

D N Aとしては、特に限定はないが、好適にはレトロウイルス由来の 2つの L T Rの間に当該ウィルスに存在しなレ、塩基配列の D N Aが挿入されたものが挙げられる。

当該ウィルスに存在しない塩基配列の D N Aには特に限定はなく、細胞中に導入することが望まれる任意の D N Aを使用することができる。例えば、酵素、増殖因子やその他のタンパク質をコードする遺伝子を含有する D N Aの他、アンチセンス核酸、リボザィム、等をコードする遺伝子を含有する D N Aを使用することができる。

また、上記の D N Aは、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を含有していてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、細胞に抗生物質に対する耐性を付与する薬剤耐性遺伝子や、酵素活性によつて遺伝子導入された細胞を見分けることができるレポーター遺伝子等が利用できる。

本発明において、細胞に導入しょうとする遺伝子は適当なプロモーター、例えば、レトロウィルスベクター中に存在する L T Rのプロモーターや外来プロモーターの制御下に、本発明の複合体の 2本鎖 D N Aに含有させて使用することができる。また、効率よい外来遺伝子の転写を達成するためにプロモータ一や転写開始部位と共同する他の調節要素、例えばェンハンサー配列やターミネータ一配列等を 2本鎖 D N A内に含有させてもよい。また、染色体へのポジションエフェクトを回避するために、インスレータ一配列等を 2本鎖 D N A内に含有させてもよレ、。導入される外来遺伝子は天然のものでも、または人工的に作製されたものでもよく、あるいは起源を異にする DN A分子が、ライゲーシヨン等の公知の手段によって結合されたものであってもよい。

本発明において、レトロウイルス由来タンパク質成分とは、宿主 DNAにウイルス DNAを組込む活性を有するものを言い、特に限定はないが、レトロウイノレス由来の末端反復配列を有する D N Aを染色体に組込む活性を有する酵素、例えばレトロウイルス由来のインテグラーゼを含有するものが挙げられる。さらに、レトロウイルス由来タンパク質成分には、レトロウイルスによる染色体への遺伝子の組込みに際して形成されるプレインテグレーシヨン複合体（P I C) に含まれることが知られている他のタンパク質が含まれていてもよい。そのようなタンノク質としては逆転写酵素、核酸結合蛋白質、力プシド蛋白、マトリックス蛋白が挙げられる。その他、細胞内に存在する因子、例えば非ヒストン蛋白である H MG I、 B A F— 1や DNA依存性蛋白リン酸化酵素（DNA—PK) 等が含まれていても良い。また、本発明に使用されるレトロウイルス由来タンパク質成分には、宿主染色体へのウィルスの DNAの組込む活性を有する範囲で天然のレトロウィルス由来タンパク質成分に欠損、置換、挿入、付加を有するものも含まれる。

レトロウイルスは分裂増殖している細胞に感染し、そのウィルス遺伝子は宿主細胞の染色体に組込まれる。レトロウィルスによる染色体への遺伝子の組込みは、 (1) レセプターを介したウィルス粒子の標的細胞表面への吸着、（2) コアの放出による細胞質内への侵入、（3) コア内に存在する逆転写酵素による c DN Aの合成、（4) 同酵素の RNa s e H活性と D N A依存 D N A合成活性による 2本鎖 DNAの合成、（5) プレインテグレーシヨン複合体（pre- integration complex： P I C) の形成、 (6) P I Cの核への移行、（7) 組込み活性を有する酵素の作用による宿主染色体への安定な組み込み、の一連の過程により成立する。

遺伝子の染色体への組み込みのためには、宿主細胞の核膜の崩壊によって P I Cが宿主の核内へ移行することが必要であり、この移行は宿主細胞が G 2 /M期を通過することによって成立する。即ち、分裂していない細胞では P I Cは核内に移行できず、遺伝子は染色体に組込まれない。従って、レトロウイルスが感染した細胞を G 1期で停止しておくと、核内に移行できない P I Cが細胞質に蓄積する。蓄積した P I Cは細胞質より調製することが出来る。

本発明の複合体は、好適には上記したメカニズムを利用して、例えば以下のようにして調製することが出来る。

組換えレトロウイルスをァフィディコリン等の細胞周期調節剤で処理して G 1 期で停止した細胞に感染させ、感染細胞を培養する。本明細書において培養とは、細胞数の増加を目的として細胞のインキュベートを行なうことのみに限定されず、細胞を細胞周期を停止した状態で維持する行為をも包含する。感染から 7〜1 1 時間程の間に、細胞質内では逆転写、 2本鎖 DNA合成、組換えプレインテグレ ―ンョン複合体 ^recombinant pre - integration complex： r P Iし) 形成力 ^¾進行するが、細胞周期が G 1期で停止されているため、生成した r P I Cは染色体内に組込まれることはなく、細胞質に蓄積する。細胞質に蓄積した r P I Cは、界面活性剤で細胞膜を分解することによって容易に抽出でき、抽出した r P I C は本発明の方法に使用することが出来る。また、抽出された r P I Cは遠心分離やクロマトグラフィ一等の公知の方法によって精製することが出来、このようにして得られた精製！： P I Cも本発明の方法に使用することが出来る。

本発明の複合体を調製するための培養細胞は、用いるレトロウイルスが感染しうる細胞であれば何でもよく、例えば N I H/ 3 T 3細胞（ATCC CRL— 1658) 、 HT— 1080細胞（ATCC CCL— 121) 、 293細胞

(ATCC CRL- 1573) 等を使用することが出来る。

組換えレトロウイルスを G 1期で停止した細胞に感染させる際には、ポリブレン等、適当な補助剤や、国際公開 WO 95/26200号公報や WO 97/18 318号公報に記載の機能性物質を使用することによって、効率よく感染させることが出来る。上記機能性物質としては、フイブロネクチンのフラグメントを使用することが出来、特にレトロネクチン（宝酒造社製）を好適に使用することが出来る。

組換えレト口ウィルスの粒子内には 2本鎖 DNAの合成に必要な逆転写酵素活性と DN A合成酵素活性が存在し、また、染色体への組み込みに必要なインテグラーゼ等のタンパク質成分が存在する。従って本発明の複合体は、組換えレトロウィルス粒子を試験管内で崩壊したものに、デォキシリボヌクレオチドを添加してインキュベートすることによつても、調製することが出来る。

即ち、組換えレトロウイルス粒子を試験管内で適当な条件で崩壊し、ここにデォキシリボヌクレオチドを添加することによって試験管内で c DNAの合成及び

2本鎖 D N Aの合成反応が進行し、合成された 2本鎖 D N Aはインテグラーゼ等のタンパク質成分と会合し、 r P I Cが形成される。このようにして形成された r P I Cは本発明の方法に使用することが出来る。また、形成された r P I Cは遠心分離やクロマトグラフィー等の公知の方法によって精製することが出来、このようにして得られた精製 r P I Cも本発明の方法に使用することが出来る。また、本発明の複合体はレトロウイルス由来の LTRと当該ウィルスに存在しない塩基配列とを有する 2本鎖 DNAと、レトロウイルス由来タンパク質成分を別々に調製し、両者を試験管内で混合することによって、ウィルス粒子を使用することなく調製することもできる。

ここで使用されるレトロウイルス由来の LTRと当該ウィルスに存在しない塩基配列の DNAを有する 2本鎖 DNAには特に限定はないが、例えば、レトロゥィルス由来の 2つの LTRの間に当該ウィルスに存在しない塩基配列の DN Aが挿入されたものが挙げられる。ここで、当該ウィルスに存在しない塩基配列の D N Aのサイズに限定はなく、目的に応じて任意のサイズのものを使用することが出来る。

レトロウイルス由来の LTRと当該ウィルスに存在しない塩基配列の DNAを有する 2本鎖 DN Aの調製法に特に限定はなく、例えば、レトロウィルス由来の LTRと当該レト口ウィルスに存在しない塩基配列の DNAのカセットを有するプラスミドを構築し、該プラスミドで形質転換した大腸菌等の宿主細胞を培養し、該培養物から単離されたプラスミドより大量に調製することが出来る。該プラスミドにおいて、レトロウイルス由来の LTRと当該ウィルスに存在しない塩基配列の DN Aを有する 2本鎖 DN Aの両側に制限酵素切断部位を配しておけば、該制限酵素を作用させることによって目的の 2本鎖 D N Aを容易に調製することが出来る。また、レトロウイルス由来の LTRと当該ウィルスに存在しない塩基配列の D NAを有する 2本鎖 D NAは、上記したカセットを有するプラスミドを铸型として、 P C R等の遺伝子増幅法にて増幅することによつても調製することも出来る。

一方、本発明に使用されるレトロウイルス由来タンパク質成分の調製法に特に限定はないが、例えばウィルス粒子より調製したもの、遺伝子工学的に調製したもの、或いはパッケージング細胞より調製したもの等が挙げられる。本発明に使用されるレトロウイルス由来タンパク質成分、例えばィンテグラーゼをコ一ドする遺伝子を発現ベクターにクローニングし、該発現べクターを用いて大腸菌等を宿主として遺伝子工学的に発現することによって容易に該成分を調製することが可能である。

パッケージング細胞を培養して得られる培養上清に D N Aの組込み活性を有する成分が含まれており、該培養上清より本発明に使用されるレトロウイルス由来タンパク質成分を調製することが出来る。例えば、パッケージング細胞を培養して得られた培養上清を超遠心にかけることにより、該成分を含む蛋白質複合体を調製することが出来る。また、該成分を含む蛋白質複合体は、パッケージング細胞抽出液より得ることができる。該蛋白質複合体は、本発明に使用できる。また、該蛋白質複合体より、公知の方法で D N Aの組込み活性を有する成分を精製することができ、このようにして精製されたものも本発明に使用できる。

ここで、用いられるパッケージング細胞に特に限定はなく、例えば B O S C 2 3細胞等が好適に使用される（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 : 8392-8396

(1993) ) 。

以上のようにしてインビトロで別々に調製したレトロウイルス由来の L T尺と当該ウィルスに存在しない塩基配列を有する 2本鎖 D NAとレトロウイルス由来タンパク質成分をィンビトロで混合することによって、ウィルス粒子を用いることなくインビトロで本発明の複合体を調製することが出来る。このようにして調製された複合体は、本発明の方法に使用できる。また、該複合体は必要に応じて遠心分離やクロマトグラフィー等の公知の方法によって精製することが出来、精製された複合体も本発明の方法に使用することが出来る。

また、このようにインビトロで本発明の複合体を調製する場合、上記したように複合体中の 2本鎖 D NAの大きさに限定はなく、該複合体を用いれば、従来のレトロウイルスベクターによる遺伝子導入法では導入が不可能であった 8 k b以上の遺伝子の導入が可能である。

さらに、上記の複合体は、当該複合体の細胞への導入、 D N Aの染色体への組込みを妨げない範囲で他の要素を含むことが出来る。

また、本発明の複合体はレトロウイルス粒子にパッケージングされている必要はない。

本発明の複合体は、調製後、直ちに遺伝子導入に使用することが出来る。また、凍結保存しておき、必要な時に融解して使用することも出来る。凍結保存の方法に特に限定はないが、例えば、ドライアイスで急凍したのち— 8 0 °Cで保存することが出来る。

上記の方法によって調製した複合体を標的細胞に導入することにより、標的細胞の染色体へ遺伝子を導入することが出来、また標的細胞を形質転換することが出来る。

複合体の標的細胞への導入方法に特に限定はなく、例えば、力チォニックリポソーム法やリン酸カルシウム法等のエンドサイトーシスを利用した方法、電気穿孔法ゃ遺伝子銃法やマイクロインジェクション法等の公知の方法で導入することが出来る。穿孔法を用いて導入を行なう場合には、国際公開 W0 9 6 / 1 7 0 7 3号公報に記載のように、導入後の標的細胞を細胞接着活性を有する物質の存在下にて培養することで効率良く形質転換された細胞を得ることが出来る。

また、レトロウイルス由来の L T Rと当該ウィルスに存在しない塩基配列を有する 2本鎖 D NAと、レトロウイルス由来タンパク質成分を、それぞれ標的細胞に導入することにより、標的細胞の染色体へ遺伝子を導入することが出来、また標的細胞を形質転換することができる。

レトロウィルス由来の L T Rと当該ウィルスに存在しない塩基配列を有する 2 本鎖 D NAと、レトロウイルス由来タンパク質成分の導入の順序に限定はなく、レトロウィルス由来の L T Rと当該ウィルスに存在しない塩基配列を有する 2本鎖 D N Aを先に導入しても良いし、レトロウイルス由来タンパク質成分を先に導入しても良く、また、両者を同時に導入しても良い。レトロウイルス由来の L T Rと当該ウィルスに存在しない塩基配列を有する 2本鎖 D N Aと、レトロウイノレス由来タンパク質成分の標的細胞への導入方法に特に限定はなく、例えば、カチォニックリポソーム法ゃリン酸カルシウム法等のェンドサイトーシスを利用した方法、電気穿孔法や遺伝子銃法やマイクロインジェクション法等の穿孔法等の公知の方法で導入することが出来る。穿孔法を用いて導入を行なう場合には、国際公開 WO 9 6 / 1 7 0 7 3号公報に記载のように、導入後の標的細胞を細胞接着活性を有する物質の存在下にて培養することで効率良く形質転換された細胞を得ることが出来る。

本発明の遺伝子導入方法、形質転換方法の標的細胞の由来に特に限定はなく、本発明の複合体の由来する組換えレトロウィルスの指向性に限定されることなく、幅広く任意の真核細胞を標的とすることが出来、例えば、哺乳類、鳥類、魚類、昆虫、植物等の真核生物の細胞を標的とすることが出来る。

また、標的細胞の種類にも特に限定はなく、例えば、造血幹細胞、胚性幹細胞等の幹細胞の他、卵、精子等の生殖細胞、各種体細胞等あらゆる種類の細胞を標的とすることが出来る。

また、標的細胞は、培養細胞であっても生物個体であっても良く、脊椎動物の受精卵、生殖細胞系列を標的とすることでトランスジエニック動物の作製も可能である。

従来のレトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入ではウィルスの感染から遺伝子の染色体への組込みまでに少なくとも 7時間を有していたが、これは細胞質内でプレインテグレーション複合体が形成されるのに時間を要していたためであり、この間に標的細胞の細胞分裂が起こり、その結果として遺伝子が導入される細胞と遺伝子が導入されない細胞が生じるモザイク化がおこり、トランスジェ- ック動物の作製において、大きな問題点となつていた。

一方、本発明の遺伝子導入法においては、導入後直ちに遺伝子は染色体に導入され、モザイク化を引き起こすことはない。即ち、本発明の遺伝子導入方法、形質転換方法はトランスジエニック生物の効率の良レ、作製をも可能とするものである。

また、従来のレトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入では標的細胞 1個あたり 1コピーの遺伝子しか導入できなかったが、本発明の導入方法では、導入する複合体の量を調節することによって、標的細胞 1個あたり複数コピーの遺伝子を導入することが可能である。

本発明の遺伝子導入用組成物、形質転換用組成物とは、本発明の遺伝子導入方法、形質転換方法に使用される遺伝子導入用組成物、形質転換用組成物を指し、本発明の複合体、またはレト口ウィルス由来タンパク質成分を含有することを特徴とする。該組成物には、適当な緩衝液、塩類等を含有させることが出来、更に遺伝子導入を促進させる任意の物質を含有させることも出来る。

本発明の遺伝子導入用キット、形質転換用キットとは、本発明の遺伝子導入方法、形質転換方法に使用されるキットを指し、パッケージされた形態において、該方法に使用される試薬類に加え、本発明の複合体を細胞に導入することを指示した指示書、もしくはレトロウイルス由来タンパク質成分と、レトロウイルス由来の末端反復配列と当該レトロウイノレスに存在しなレ、塩基配列の D N Aとを含有する 2本鎖 D N Aとを細胞に導入することを指示した指示書を含むことを特徴とする。ここで指示書とは、本発明の実施方法を指示する書面を指す。例えば本発明の遺伝子導入方法、形質転換方法、該方法における本発明の複合体、レトロゥィルス由来タンパク質成分の使用方法、推奨される反応条件等を記載した印刷物であり、パンフレットまたはリーフレット形式の取り扱い説明書のほか、キットに添付されたラベル、キットが納められたパッケージ等に記載されたものを含む。さらに、インターネットのような電子媒体を通し、開示、提供された情報も含まれる。

本発明のキットは、本発明の複合体調製のための細胞、細胞培養のための培地、試薬、培養器、複合体やレトロウイルス由来タンパク質成分やレトロウイルス由来の末端反復配列と当該レト口ウィルスに存在しない塩基配列の D N Aとを含有する 2本鎖 D N Aの標的細胞への導入に使用される試薬類等を含めることが出来る。

該キットを用いることで、本発明の遺伝子導入方法、形質転換方法を簡便に行なうことが出来る。

本発明の遺伝子導入用試薬の製造品又は形質転換用試薬の製造品とは、包装材と該包装材に封入された遺伝子導入用試薬又は細胞の形質転換用試薬からなる製造品であって、該遺伝子導入用試薬又は形質転換用試薬がレトロウイルス由来の末端反復配列と当該レトロウイルスに存在しない塩基配列の D N Aとを含有する 2本鎖 D N Aとレトロウイルス由来タンパク質成分を含む複合体及び /又は該複合体を調製するための試薬を含有し、前記遺伝子導入用試薬又は形質転換用試薬力目的とする細胞へのレトロウイルスの感染の工程を含まない遺伝子導入又は形質転換に使用できること力 S、該包装材に付されたラベル又は該包装材に添付された指示書に表示されてなることを特徴とする。

また、本発明の遺伝子導入用試薬の製造品又は形質転換用試薬の製造品とは、包装材と該包装材に封入された遺伝子導入用試薬又は形質転換用試薬からなる製造品であって、該遺伝子導入試薬又は形質転換用試薬がレトロウィルス由来タンパク質成分を含有する糸且成物を含有し、前記遺伝子導入用試薬が、目的とする細胞への組換えレト口ウィルスの感染の工程を含まない遺伝子導入又は形質転換に使用できることが、該包装材に付されたラベル又は該包装材に添付された指示書に表示されてなることを特徴とする。

本発明によれば、従来のレトロウイルスベクターによる遺伝子導入方法の欠点であった宿主域の限定は克服され、あらゆる真核細胞への遺伝子導入が可能である。即ち、従来のレトロウイルスベクターによる遺伝子導入は、該ウィルスに対するレセプターを介した感染によるものであり、該レセプターの有無により宿主域は限定される。一方、本発明の複合体は、エンドサイトーシスを利用した方法、即ち、電気穿孔法、遺伝子銃法、マイクロインジェクション法等の公知の方法によってレセプターの有無に関わりなく導入することが出来、その結果、宿主域の限定なく広く任意の細胞に遺伝子を導入することが出来る。また、本発明の方法によれば、目的の標的細胞に導入すると直ちに遺伝子が染色体に組込まれるため、従来のトランスジエニック生物の作製法において問題となっていたモザイク化は起こらず、効率の良いトランスジエニック生物の作製も可能である。

また、従来のウィルスベクターを用いた遺伝子導入方法では、使用されるウイルス粒子の作製に煩瑣な操作を必要し、また力価の高いウィルスベクターを作製することは難しいとの欠点があった。しかしながら、本発明の複合体は、ウィルス粒子を用いることなくインビトロで調製することも可能であり、この場合、煩瑣な操作を行なうことなく、短時間で大量の複合体を調製することが出来、従来に比べ、はるかに簡便に効率の良い遺伝子導入が可能となった。

このように、本発明は従来の技術の欠点を克服した優れた技術であり、例えば、従来の方法の限界により効果が限定されていたあらゆる遺伝子治療に応用することで、顕著な治療効果を期待できる等、優れた有用性を示す。

実施例

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例 1

組換えプレインテグレーシヨン複合体（r P I C) の調製

1. e c o GF Pウィルス液の調製

グリ一ン蛍光タンパク質（ G F P ) 遺伝子とネオマイシン耐性遺伝子を含有するプラスミドをパッケージング細胞 GP + E— 8 6 [ジャーナルォブウイ口ロジー（Journal of Virology) 、第 62巻、第 1120〜1124頁（1988年） ] に導入した e c o GF Pウィルス産生細胞は 1 0%ゥシ胎児血清（バイオウイターカー社製）ならびに 5 0単位 Zm 1のペニシリン（ギブコ社製）及び 50 gノ m l のストレプトマイシン（ギブコ社製）を含有するダルべッコ改変ィ一ダル培地 (DMEM、シグマ社製）中で 3 7°C、 5%C〇₂にて培養した。なお、以降の操作に使用した DMEMはすべて 50単位/ m 1のべ-シリンおよび 5 0 μ g/ m 1のストレプトマイシンを含んだものである。 e c o GF Pウィルス液は上記産生細胞をセミコンフルェントに生育させた 1 0 c m径のプレートに 1 0%ゥシ胎児血清を含有する 7m 1の DMEMを添加し、 3 2°C、 5%〇〇₂にて24時間培養した後に培養上清を 0. 4 5ミクロンのフィルター（ミリポア社製）でろ過してウィルス上清液ストックとし、使用するまでは一 8 0°Cで保存した。

2. ウィルス上清液の力価の測定

ウィルス上清液の力価の測定は N I H/3 T 3細胞（ATCC CRL— 1 6 5 8) を使用して標準的な方法 [ジャーナルォブウイロロジー、第 62卷、第 1120〜1124頁（1988年） ] に従って測定した。すなわち、 6ゥエルの組織培養用プレート（岩城硝子社製）の 1ゥエルあたり 5 1 0⁴個の1^ 1 ^1/3丁3細胞を含む 1 0%ゥシ血清（ギブコ社）を含有する DMEM 2m lを添カ卩し、 3 7°C、 5%C〇₂にて一晩培養した後、培地を吸引除去し、各ゥエルに系列希釈したウィルス上清液 1 m 1を加え、更にへキサジメトリン .ブロミド（ポリブレン：アルドリッチ社製）を終濃度 8 μ gZm 1となるよう加えた。これを 3 7°C で 4時間培養し、さらに 1 0 %ゥシ血清を含有する D EMEMを 1 m 1添加して 20時間培養した後、培地を終濃度 0. 5mgZm lの G4 1 8 (ギブコ社製）と 1 0%ゥシ血清を含有する DMEM 2m lと交換しさらに培養を続けた。 3 〜4日毎に G4 1 8含有培地を交換し 1 0〜1 2日後に生育した G 4 1 8耐性コロニーを 0. 2%メチレンブルーを含むメタノール溶液で染色しその数を計測した。ゥエルあたりのコロニー数にウィルス上清液の希釈倍率を乗じた値より、上清 1 m 1あたりの感染性粒子数（c f u_ m l ) を算出し、ウィルス力価とした。調製した e c o GF Pウィルス液の力価は 1 X 1 0⁷c f u/m 1であった。

3. r P I Cの調製

N I H/ 3 T 3細胞 2 X 1 0⁶個を 1 0 c m径のプレートで 1 0 %ゥシ血清を含有する 1 0m lの DMEMで 24時間、 3 7°C、 5%C0₂で培養し、培地を 2 / gZm lのァフイディコリン（和光純薬社製）と 1 0 %ゥシ血清を含有する

7 m 1の DMEMに交換しさらに 14時間、 3 7°C、 5%C0₂で培養した。ァフイディコリンを添加してから 14時間後に、培地を吸引除去し、 e c oGFP ウィルス液 2m 1 と 1 0%ゥシ血清を含有する DMEM 3m lを混和し、更にァフィディコリンを終濃度 2 g/m 1 となるよう、およびポリプレンを終濃度

8 μ g/m 1となるよう加えた液を N I HZ3T 3細胞に添カ卩して 3 2°C、 5% C〇₂でウィルス感染を開始した。感染開始から 3時間後にウィルス液を除去し、培地を 2 μ g/ 1のァフィディコリンと 1 0%ゥシ血清を含有する 7m 1の D MEMに交換しさらに 7時間（ウィルス感染開始から 1 0時間）、 3 2°C、 5%

C〇₂で培養した。この間に、 N I HZ3T 3細胞に感染したウィルスは逆転写、 DNA合成反応が進行し、 r P I Cを形成するが、 N I 3 T 3細胞はァフィディコリンで G 1期に細胞周期が停止しているためレトロウイルス遺伝子が染色体に組込まれることはなく細胞質に蓄積する。細胞質に蓄積した r P I Cは以下の方法によって抽出した。すなわち、感染から 1 0時間後の細胞を 5m 1の P B Sで洗浄し、 2 m 1のトリプシン一 EDTA 液（バイオウイターカー社製）で細胞を分散し、 1 0%ゥシ血清を含有する 5m 1の DMEMを添加して細胞を遠心分離（2 00 X g、 5分）し、沈殿した細胞を 9 m 1のバッファー A ( 1 OmM T r i s、 2 2 5 mM KC 1、 5 mM

Mg C l ₂、 1 mM DTT、 20 μ gZm 1ァプロチニン、 p H 7. 4) で洗浄して遠心分離（2 0 0 X g、 5分）し、沈殿を 2 5 0 1のバッファー Aに懸濁した。細胞懸濁液に 1. 2 5 1の 5 %ジギトニン ZDM S O溶液を添加し、 2 5°Cにて 5分間静置して細胞質画分を抽出した。抽出液を l O O O X gで 3 分間遠心分離し、上清をさらに 5 000 X gで 3分間遠心した。得られた上清は r P I C液として 5 0 μ 1ずつ分注し、 _ 80°Cにて保存した。

4. 2本鎖 DN Aの検出

上記 3にて、抽出し、凍結保存した r P I C液を希釈したものを铸型とし、 G F P遺伝子特異的プライマーを使用した P CR反応により組換えレトロウイルス由来の GF P遺伝子の検出を行った。タカラタック（TaKaRa Taq、 5 u n i t s /μ 宝酒造社製） 0. 5 μ 1、 1 0 X PCRバッファー（宝酒造社製） 5 μ 1、 1. 2 5 mM d NTP 混合液 8 μ 1、銹型 1 1、 P r i me r 1 (配列番号 l) 20 pmo l、 P r i me r 2 (配列番号 2 ) 2 0 p m o 1 を混合し、蒸留水で 5 0 μ 1にメスアップして調製した P CR反応液にミネラルオイルを重層して 94 °C、 1分間加熱の後、 94 °Cで 3 0秒、 5 9 で 3 0秒、

7 2 °Cで 3 0秒を 1サイクルとする反応を 3 0回繰り返した。反応後、 P CR反応液 1 0 z 1を 2%ァガロースゲル電気泳動に供し、増幅断片を確認した。铸型には、 r P I Cを希釈したもの、および r P I Cよりフエノール一クロロフオルム抽出で精製した DNAを用い、対照としてウィルス感染していない N I H/3 T 3細胞から同様の操作で抽出した画分を甩ぃ P C R反応に供した。陽性コントロールとして GF P発現プラスミドベクターを用いた。その結果、 r P I Cを希釈したもの、 r P I Cよりフエノールークロロフオルム抽出で精製した DNAを铸型とした場合、 GF P遺伝子由来の 3 1 6 b pの断片の増幅が確認され、上記 3で調製された r P I Cに組換えウィルス由来の GF P遺伝子が含まれていることが示された。

実施例 2

r P I Cの培養細胞への導入

マウス N I HZ 3 T 3細胞は 10%ゥシ血清を含む DM EM培地を増殖培地とし、ヒト 293細胞（ATCC CRL- 1 573) は 10%ゥシ胎児血清を含む DMEM培地を増殖培地とし、 37°C、 5 %C0₂の条件下で培養を行った。 10 cm径プレートでコンフルェントに増殖したマウス N I HZ3T 3細胞、ヒト 293細胞はトリプシン処理でプレートから剥がした後、血清を含まない DM EMで洗浄し、 700 μ 1の DMEMに懸濁した。 700 1の細胞懸濁液と実施例 1で調製した r P I C 100 1を0. 4 cm幅のエレクト口ポレーションキュベット（バイオラッド社製）に入れ、ジーンパルサー I I (バイオラッド社製）で 250V、 975 μ 室温の条件でエレクト口ポレーシヨンを行レ、、マウス N I Η/3Τ3細胞は 1/10量を、ヒト 293細胞は 1ノ 4量を 10 c m径のゼラチンコート（岩城硝子社製）に播き、エレクト口ポレーシヨンの翌日から G41 8を 0. 5mgZm 1含有する増殖培地で培養した。

エレクトロポレーシヨンから 7日目に蛍光顕微鏡にて観察したところ、マウス N I HZ3 T 3細胞、ヒト 293細胞の何れにおいても緑色の蛍光を発する細胞が観察され、マウス由来細胞、ヒト由来細胞を問わず導入した GFP遺伝子が発現していることが示された。

また、更に培養を続け、エレクトロポレーシヨンから 2週間、 G418選択培地で培養した後、出現したネオマイシン（G418) 耐性コロニーをメチレンブノレ一で染色したところ、マウス N I H/3 T 3細胞からは 46個の而村生コロニーが得られ、ヒト 293細胞からは 196個の耐性コロニーが得られ、導入した遺伝子が安定的に発現していることが示された。

以上の結果は、マウス由来の細胞にし力感染することが出来ないェコトロピックウィルスから調製した r P I Cが、従来の方法では遺伝子導入できなかったヒト由来の細胞へ遺伝子を安定的に導入できたことを示し、 r P I Cが宿主域を選ばず安定的に遺伝子導入可能なベクターであることを示すものである。

実施例 3 高力価 r P I Cの調製と r P I Cのインテグレーション効率の評価

1. 高力価 r P I Cの調製

e c o GF Pウィルス液 25 Om 1を、 4°C、 2900 x g、 16時間低速遠心し、沈殿を 10 %ゥシ血清含有 DMEM 5 m 1で懸濁することにより、高力価 e c o GF Pウィルス液を調製した。このウィルス液の力価は 4 x 10⁸ c f uZm lであった。このウィルス液を使用し、 M. O. I . =200の条件で N I HZ 3 T 3細胞に感染し、実施例 2の方法で r P I Cを調製した。

2. r P I Cのインテグレーション効率の評価

高力価 r P I Cを用いて、 293細胞にエレクトロポレーション法で遺伝子導入した。対照として、 G F P遺伝子とネオマイシン耐 14遺伝子を含有するブラスミドベクターをエレクトロポレーシヨン法、およびトランスフエクシヨン法で 2 93細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入から 3日後の 293細胞をフローサイトメーター FACS Va n t a g e (B e c t o n D i c k i n s o n社) に供し、 GFP発現 293細胞を選択的に回収した。回収後の 293細胞の GFP 発現率は、 r P I C導入実験区が 94. 3 %、プラスミドベクタ一エレクトロポレ一シヨン実験区が 94. 3%、プラスミドベクタートランスフエクシヨン実験区が 98. 8%、であり、一過性に遺伝子導入された細胞が選択的に回収された。この一過性 GFP発現 293細胞を G418+および G418—培地中で 2週間培養し、 [G418含有プレートのコロニー数] ÷ [G418不含プレートのコロニー数] から長期安定遺伝子発現効率を算出し、インテグレーション効率とした。 r P I Cのインテグレーション効率は 98. 7%、プラスミドベクターェレクトロボレ一シヨン実験区のインテグレーション効率は 7. 5%、プラスミドベクタートランスフエクション実験区のインテグレーション効率は 1. 4%であつた。 r P I Cはインテグレーション効率に優れたベクターであることが示された。

実施例 4

r P I Cのメダカ受精卵への導入

成熟したヒメダカォス、メス各 1尾を一組として、 3 Lの水道水で水温 2 5 °C、 14時間照明、 10時間喑条件にて飼育し、一日 3〜5回、テトラフイン (テトラべルケ社）を 3〜5分で食べ切る量を与え、産卵させた。産卵直後の卵を採取し、 8 p pmのメチレンブルー水溶液中で、ピンセットでほぐし、同水溶液で洗浄した。実施例 3で調製した高力価 r P I C をゲルろ過力ラム S u p e r o s e 6 (アマシャムフアルマシア社）で精製し、 r P I C含有画分 5 μ 1をマイクロインジェクションピペット（ナリシゲ社製芯入硝子管モデル G D- 1 より作製）に入れ、顕微鏡下で観察しながら 1細胞期のメダカ受精卵の細胞 1個あたりに約 5 0 ρ 1の r P I C液を注入した。 6 9個の卵にマイクロインジェクシヨンを行い、 9 6ゥエルプレートの各ゥエルに卵を 1個づっ入れ、 8 p pmのメチレンブル一水溶液中で 2 5°Cで培養した。産卵後 8日目以降、ふ化してきた稚魚を順次水槽に移し最終的に合計 4 7匹の稚魚がふ化した。孵化直後の稚魚 1 6匹をサンプリングし、 1. 5m 1容マイクロチューブに入れ、一 2 0°Cで保存した。ふ化した稚魚からは以下の方法でゲノム DNAを抽出し、 PCR法でネオマイシン耐性遺伝子の検出を行った。すなわち、稚魚 1匹が入っているマイクロチューブに 1 00 μ 1の抽出バッファー（1 0 mM T r i s、 1 0 0 mM N a C l、 1 0 mM EDTA、 3 9 mM DTT、 2% SD S、 5 0 μ g/m 1 P r o t e i n a s e K、 pH 8) を添加し、 6 0°Cにて 4時間インキュベートした。なお、インキュベート開始の 3 0分後、 6 0分後に攪拌を行った。次にチューブあたり 5 gの RN a s e Aを添加し、 3 7°Cで 1時間ィンキュベー卜し、さらに、フエノール ' クロロフォルム抽出、エタノール沈殿を施し、得られたゲノム DNAをそれぞれ 5 0 μ 1の蒸留水に溶解した。

得られたゲノム DNA溶液の内、 1 μ 1を铸型とし、ネオマイシン耐性遺伝子特異的プライマーを使用して P C R反応により導入遺伝子の検出を行った。反応は T a K a R a T a q (宝酒造社製）を用いて、 T a K a R a T a q 0. 5 1、 1 0 χ P CRバッファー 5 1、 dNTP 混合液 8 μ 1、希釈した铸型 1 μ 1、 P r i m e r 3 (配列番号 3) 2 0 pmo 1 , P r i me r 4 (配列番号 4) 2 0 pmo 1、蒸留水で 5 0 μ 1にメスアップし、ミネラルオイルを重層して 94 °C 1分間加熱の後、 94 °C 30秒、 5 6 °C 3 0秒、 7 2°C 3 0秒の反応を 3 0回繰り返した。 PCR反応液 1 0 At 1を 2% ァガロースゲルで電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果、マイクロインジェクシヨンにより r P I Cを導入したメダカ 1 6匹中 1 6匹から導入遺伝子が検出され、遺伝子導入効率は 1 0 0 %であった。メダカ受精卵は受精後 1時間は 1細胞期であるが、以後は 3 5分に一度分裂していく。このように非常に早い速度で分裂する細胞においては、 VSV— Gレトロウイルスベクタ一を用いた場合は逆転写のプロセスが律速となり、発生がかなり進んだ段階でしか遺伝子が組込まれなレ、。また、プラスミドベクターは偶然の組換えによってのみ、宿主染色体に組込まれる。一方、 r P I Cは N I HZ3 T 3細胞のゲノムに組込まれる直前に抽出しているため、インテグレーション効率の高い状態で調製されており、細胞分裂の初期段階でゲノムに組込まれることが期待でき、トランスジエニック動物作製用べクターなど多方面で応用可能なベタターであることを示すものである。実施例 5

BO S C 2 3細胞上清を利用した培養細胞への遺伝子導入

レトロウィルス g a g— p o 1遺伝子とェコトロピック e n v遺伝子が導入されたパッケージング細胞 B O S C 2 3を 1 0%ゥシ胎児血清ならびに 5 0単位 Z m 1のぺニシリン及び 5 0 μ g/m 1のストレプトマイシンを含有するダルべッコ改変ィ一ダル培地中で 3 7 °C、 5 % CO ₂の条件下で培養した。

1 0 c m径プレートで BO S C 2 3細胞を培養し、セミコンフルェントに生育したところで新しい 1 0%ゥシ胎児血清を含有する 5 m 1の DMEM培地と交換し、 3 7°C、 5% C〇₂にて 24時間培養した。

その培養上清を 0. 4 5ミクロンのフィルター（ミリポア社製）でろ過したものを、超遠心機により、 3 0 0 00 r pm、 4°C、 2時間遠心した。

得られた沈殿物を DMEMにて洗浄後、再度、超遠心機により、 3 0000 r p m、 4°C、 2時間遠心し、得られた沈殿物を 5 0 1の DMEMに懸濁し、 S D S含有試薬を加え、 9 9°C、 5分間、加熱処理後、蛋白質電気泳動（SD S— PAGE) を行なった。

その結果、沈殿物中に g a g蛋白（p 3 0、 p i 5) が含まれていることが確認できた。

このことから、 BO S C 2 3細胞の培養上清には、 g a g— ρ ο ΐ — e n v蛋白を含む蛋白複合体の存在が示唆された。この蛋白複合体は e n v蛋白の機能により、細胞への感染能も有すると予想される。この、 BO S C 2 3細胞の培養上清に存在する蛋白複合体を利用した培養細胞ゲノムへのプラスミド DNA組込み能について実験を行なった。

1. BO S C 2 3細胞上清サンプルの調製

B〇 S C 2 3細胞上清サンプルとは、 1 0 c m径プレートでセミコンフルェントに生育した BOS C 2 3細胞を、新しい 1 0%ゥシ胎児血清を含有する 1 Om 1の DMEM培地と交換し、 3 2°C、 5 %C O ₂にて 24時間培養し、得られた培養上清を 0. 4 5ミクロンのフイノレター（ミリポア社製）でろ過したものである。

2. BOS C 2 3細胞上清サンプルを利用した遺伝子の導入

マウス N I HZ3 T 3細胞は1 0%ゥシ血清を含む DM EM培地を増殖培地とし、 3 7°C、 5%C〇₂の条件下で培養した。マウス N I HZ3 T 3細胞を 1 0 c m径プレートでセミコンフルェントに生育させたものに対し、レトロウイノレス L T R遺伝子に挟まれた G F P遺伝子とネオマイシン耐性遺伝子を含有するレトロウィルス産生用プラスミドベクター p DON— A I— r s GF Pをリポフエクトァミン 2 0 0 0 (ギブコ社製）にて遺伝子導入し、 1 0m lの 1 0%ゥシ血清を含む DMEM培地で 3 7 °C、 5 % C O ₂の条件下で 5時間培養したものを試験サンプノレとした。尚、 p DON— A I — r s GF Pは、 r s GF Pをコードするプラスミド p QB 1 2 5 (宝酒造社製）より調製した r s GF Pをオードする遺伝子をレトロウイルスベクター p DON— A Iに組み込んだものである。試験サンプルは、 5時間培養後、培地を吸引除去し、 1. で調製した B O S C 2 3細胞上清サンプル 4m 1を加え、更にへキサジメトリン ·ブロミド（ポリプレン：アルドリツチ社製）を終濃度 8 g/m 1になるように加え、 3 2°Cで 1 6時間培養した。 1 6時間培養後、 BO S C 2 3細胞上清サンプノレを吸引除去し、 1 0 m 1の 1 0%ゥシ血清を含む DMEM培地を加え、 3 7°C、 5%C〇₂の条件下で 24時間培養した。 24時間培養後、細胞を回収し、内 200 00個の細胞を 6 c m径のゼラチンプレートに播き、終濃度が 0. SmgZm 1になるように G 4 1 8 (ギブコ社製）を加えた 1 0%ゥシ血清を含む DMEM培地にて培養を行なった。 1 4日後に生育した G4 1 8耐性コロニーを 0. 2%メチレンブルーを含むメタノール溶液で染色し、その数を計測した。加えて、コントロールとして 500個の細胞を 6 c m径のゼラチンプレートに播ぃたものも用意し、 G418 を含まない通常の培地にて、 37°C、 5%C〇₂の条件下で 14日間培養後、生育したコロニーを 0. 2%メチレンブルーを含むメタノール溶液で染色し、その数を計測した。

対照として、トランスフヱクシヨンによる遺伝子導入後、 5時間後に、培地を吸引除去し、通常の培地を加え、 37°C、 5 %C〇₂の条件下で培養を行なった。

40時間後に細胞を回収し、内 20000個の細胞を 6 cm径のゼラチンプレ一トに播き、終濃度が 0. 5mg/m 1になるように G418 (ギブコネ土製）を加えた 10%ゥシ血清を含む DMEM培地にて培養を行なった。 14日後に生育した G 418耐性コロニーを 0. 2%メチレンブルーを含むメタノール溶液で染色しその数を計測した。加えて、コントロールとして 500個の細胞を 6 cm径のゼラチンプレートに播ぃたものを用意し、通常の培地にて、 37°C、 5%CO ₂の条件下で 14日間培養後、生育したコロニーを 0. 2 %メチレンブルーを含むメタノール溶液で染色し、その数を計測した。

長期遺伝子発現効率（ィンテグレーシヨン効率）は、 [G 418含有プレートのコロニー数] ÷ [G418不含プレートのコロニー数] にて算出した。試験サンプルにて得られたインテグレーション効率は、 5. 00%であった。これに対し、対照実験区より得たィンテグレーション効率は、 0. 76 %であった。このことから、プラスミドベクターを細胞に導入後、 BOSC 23細胞上清サンプルをその導入細胞に感染させることで、 BOSC23細胞上清サンプル中の g a g-p o 1 -e n v蛋白を含む蛋白複合体の働きにより、プラスミドベクターを宿主細胞ゲノムに約 7倍の高い効率で組込ませることができることが示された。これは、 LTRを有するプラスミドベクターと、レトロウイルス構造タンパク質が標的細胞内で複合体を形成していることを示すものである。産業上の利用の可能性

本発明によって、幅広く宿主域を選ばずに遺伝子を効率よく導入する方法が提供された。また、本発明の遺伝子導入法によれば、導入された遺伝子は速やかに宿主の染色体に組込まれるため、効率良いトランスジェユック生物の作製を可能にするものである。

配列表フリーテキスト

SEQ ID NO '· 1： PCR primer to amplify a portion of GFP gene.

SEQ ID NO: 2: PCR primer to amplify a portion of GFP gene.

SEQ ID NO: 3: PCR primer to amplify a portion of neo^r gene.

SEQ ID NO: 4： PCR primer to amplify a portion of neo^r gene.

Claims

請求の範囲

1. レトロウイルス由来の末端反復配列と、当該レトロウイルスに存在しない塩基配列の DN Aとを含有する 2本鎖 DN Aとレトロウィルス由来タンパク質成分を含む複合体。

2. レトロウイルス由来の末端反復配列と、当該レトロウイルスに存在しない塩基配列の DNAとを含有する 2本鎖 DNAが組換えレトロウイルスに由来する請求項 1記載の複合体。

3. 組換えレトロウィルスが当該組換えレトロウィルスに対する感受性を有する細胞に当該組換えレトロウイルスを感染させて得られる請求項 2記載の複合体。

4. 組換えレト口ウィルスに対する感受性を有する細胞が細胞周期を停止している請求項 3記載の複合体。

5. 単離された、レトロウイルス由来の末端反復配列と当該レトロウイルスに存在しない塩基配列の DNAとを含有する 2本鎖 DNA、および単離された、レトロウィルス由来タンパク質成分を混合して得られる請求項 1記載の複合体。

6. レトロウィルス由来タンパク質成分がパッケージング細胞の培養上清由来及び Z又はパッケージング細胞の抽出物由来であることを特徴とする請求項 1記載の複合体。

7. レトロウイルス由来タンパク質成分が、レトロウイルス由来の末端反復配列を有する DN Aを染色体 DN Aに組込む活性を有する酵素を含有することを特徴とする請求項 1記載の複合体。

8. 下記工程を包含することを特徴とする複合体の製造方法：

(a) レトロウイルス由来の末端反復配列と、当該レトロウイルスに存在しない塩基配列とを含有する組換えレトロウイルスを当該組換えレトロウイルスに対する感受性を有する細胞に感染させる工程；

(b) (a) 工程で得られる感染細胞を培養する工程；及び

(c) (b) 工程で得られる培養細胞より、組換えレトロウイルス由来の 2本鎖 DNAとレトロウイルス由来タンパク質成分を含む複合体を採取する工程。

9. 組換えレトロウィルスに対する感受性を有する細胞が細胞周期を停止していることを特徴とする請求項 8記載の複合体の製造方法。

10. 下記工程を包含することを特徴とする複合体の製造方法：

(a) レトロウイルス由来の末端反復配列と、当該レトロウイルスに存在しない塩基配列とを含有する組換えレト口ウィルス粒子を破壊し、ウィルスの構成成分を含有する混合液を調製する工程、

( b ) (a) 工程で得られる混合液にデォキシリボヌクレオチドを添加し、糸且換えレトロウィルス由来の 2本鎖 DNAを調製し、当該 2本鎖 DNAとレトロウイルス由来タンパク質成分を含む複合体を形成させる工程；及び、

(c) (b) 工程で得られる当該複合体を採取する工程。

1 1. 下記工程を包含することを特徴とする複合体の製造方法：

(a) レトロウイルス由来の末端反復配列及び当該レトロウイルスに存在しない塩基配列の DNAを含有する 2本鎖 DNAを単離する工程；

(b) レトロウイルス由来タンパク質成分を単離する工程；

( c ) 前記工程で得られる 2本鎖 D N A及ぴレトロウイルス由来タンパク質成分を混合し、複合体を形成させる工程；及び、

( d ) 前記工程で形成される複合体を採取する工程。

12. レトロウイルス由来タンパク質がパッケージング細胞の培養上清及び Z 又パッケージング細胞の抽出物であることを特徴とする請求項 1 1の製造方法。

13. レトロウイルス由来タンパク質成分が、レトロウイルス由来の末端反復配列を有する D N Aを染色体 D N Aに組込む活性を有する酵素を含有することを特徴とする請求項 8、 10および 1 1のいずれか 1項記載の複合体の製造方法。

14. レトロウイルス由来の末端反復配列と、当該レトロウイルスに存在しない塩基配列の DN Aとを含有する 2本鎖 DNAとレトロウイルス由来タンパク質成分を含む複合体を細胞に導入する工程を包含することを特徴とする細胞への遺伝子導入方法。

15. 複合体が請求項 8、 10および 1 1のいずれか 1項に記載の製造方法により得られる請求項 14記載の細胞への遺伝子導入方法。

16. レトロウイルス由来タンパク質成分と、レトロウイルス由来の末端反復配列と当該レトロウイルスに存在しない塩基配列の DN Aとを含有する 2本鎖 D N Aを細胞に導入することを特徴とする、細胞への遺伝子導入方法。

1 7 . レトロウイルス由来タンパク質成分が、パッケージング細胞培養上清由来であることを特徴とする請求項 1 6記載の細胞への遺伝子導入方法。

1 8 . レトロウイルス由来タンパク質成分が、レトロウイルス由来の末端反復配列を有する D N Aを染色体 D N Aに組込む活性を有する酵素を含有することを特徴とする請求項 1 6記載の遺伝子導入方法。

1 9 . レトロウイルス由来タンパク質成分を含有することを特徴とする細胞への遺伝子導入用成物。

2 0 . レトロウイルス由来タンパク質成分が、レトロウイルス由来の末端反復配列と、当該レトロウイルスに存在しない塩基配列の D N Aとを含有する 2本鎖 D N Aと複合体を形成していることを特徴とする請求項 1 9記載の細胞への遺伝子導入用組成物。

2 1 . 複合体が請求項 8、 1 0および 1 1のいずれか 1項に記載の製造方法により得られることを特徴とする請求項 2 0記載の細胞への遺伝子導入用組成物。

2 2 . さらに、レトロウイルス由来の末端反復配列を有するベクターを含有することを特徴とする請求項 1 9の遺伝子導入用組成物。

2 3 . ベクターが、組換えレトロウイルスを作製するためのベクターであることを特徴とする請求項 2 2記載の遺伝子導入用組成物。

2 4 . ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする請求項 2 2記载の遺伝子導入用,組成物。

2 5 . レトロウイルス由来タンパク質成分が、パッケージング細胞の培養上清由来及び Z又はパッケージング細胞の抽出物由来であることを特徴とする請求項 1 9記載の遺伝子導入用組成物。

2 6 . レトロウイルス由来タンパク質成分が、レトロウイルス由来の末端反復配列を有する D N Aを染色体 D N Aに組込む活性を有する酵素を含有することを特徴とする請求項 1 9記載の遺伝子導入用組成物。

2 7 . レトロウィルス由来タンパク質成分を含有する細胞への遺伝子導入用組成物を包含する細胞への遺伝子導入用キット。

2 8 . 細胞への遺伝子導入方法に使用されるキットであって、パッケージされた形態において、レトロウイルス由来の末端反復配列と、当該レトロウイルスに存在しない塩基配列の D N Aとを含有する 2本鎖 D N Aとレトロウイルス由来タンパク質成分を含む複合体を細胞に導入することを指示した指示書を含むことを特徴とする細胞への遺伝子導入用キット。

2 9 . 細胞への導入方法に使用されるキットであって、パッケージされた形態において、レトロウイルス由来タンパク質成分と、レトロウイルス由来の末端反復配列と当該レトロウイルスに存在しない塩基配列の D N Aとを含有する 2本鎖 D NAとを細胞に導入することを指示した指示書を含むことを特徴とする細胞への遺伝子導入用キット。

3 0 . 包装材と該包装材に封入された遺伝子導入用試薬を含む製造品であって、該遺伝子導入用試薬がレト口ウィルス由来の末端反復配列と当該レト口ウィルスに存在しなレ、塩基配列の D N Aとを含有する 2本鎖 D NAとレトロウイルス由来タンパク質成分を含む複合体及び/又は該複合体を調製するための試薬を含有し、前記遺伝子導入用試薬が、目的とする細胞への組換えレトロウイルスの感染のェ程を含まない遺伝子導入に使用できることが、該包装材に付されたラベル又は該包装材に添付された指示書に表示されてなる、細胞への遺伝子導入用試薬の製造

P

Po

3 1 . 包装材と該包装材に封入された遺伝子導入用試薬を含む製造品であって、該遺伝子導入試薬がレトロウイルス由来タンパク質成分を含有し、前記遺伝子導入用試薬が、目的とする細胞への組換えレトロウイルスの感染の工程を含まない遺伝子導入に使用できること力該包装材に付されたラベル又は該包装材に添付された指示書に表示されてなる、細胞への遺伝子導入用試薬の製造品。

3 2 . レトロウイルス由来タンパク質成分が、レトロウイルス由来の末端反復配列を有する D N Aを染色体 D N Aに組込む活性を有する酵素を含有することを特徴とする請求項 3 0又は 3 1記載の製造品。

3 3 . レトロウイルス由来の末端反復配列と、当該レトロウイルスに存在しない塩基配列の D N Aとを含有する 2本鎖 D N Aとレトロウイルス由来タンパク質成分を含む複合体を細胞に導入する工程を包含することを特徴とする細胞の形質転換方法。

3 4 . 複合体が請求項 8、 1 0および 1 1のいずれか 1項に記載の製造方法により得られることを特徴とする請求項 3 3記載の細胞の形質転換方法。

3 5 . レトロウイルス由来タンパク質成分と、レトロウイルス由来の末端反復配列と当該レトロウイルスに存在しない塩基配列の D N Aとを含有する 2本鎖 D N Aとを細胞に導入することを特徴とする、細胞の形質転換方法。

3 6 . レトロウイルス由来タンパク質成分が、パッケージング細胞の培養上清由来及び Z又はパッケージング細胞の抽出物由来であることを特徴とする請求項 3 5記載の細胞の形質転換方法。

3 7 . レトロウイルス由来タンパク質成分が、レトロウイルス由来の末端反復配列を有する D N Aを染色体 D N Aに組込む活性を有する酵素を含有することを特徴とする請求項 3 5記載の細胞の形質転換方法。

3 8 . レトロウイルス由来タンパク質成分を含有することを特徴とする細胞の形質転換用組成物。

3 9 . レトロウイルス由来タンパク質成分がレトロウイルス由来の末端反復配列と、当該レトロウイルスに存在しない塩基配列の D NAとを含有する 2本鎖 D

N Aと複合体を形成していることを特徴とする請求項 3 8記載の細胞の形質転換用組成物。

4 0 . 複合体が請求項 8、 1 0および 1 1のいずれか 1項記載の製造方法により得られることを特徴とする請求項 3 8記載の細胞の形質転換用組成物。

4 1 . さらに、レトロウイルス由来の末端反復配列と当該レトロウイルスに存在しなレ、塩基配列の D N Aとを含有する 2本鎖 D N Aを作製するためのベクターを含有することを特徴とする請求項 3 8記載の細胞の形質転換用組成物。

4 2 . ベクターが、組換えレトロウイルス作製用であることを特徴とする請求項 4 1記載の細胞の形質転換組成物。

4 3 . ベクターがプラスミドベクターであることを特徴とする請求項 4 1記載の細胞の形質転換用組成物。

4 4 . レトロウイルス由来タンパク質成分が、パッケージング細胞の培養上清由来及び Z又はパッケージング細胞の抽出物由来であることを特徴とする請求項 3 8記載の細胞の形質転換用組成物。

4 5 . レトロウイルス由来タンパク質成分が、レトロウイルス由来の末端反復配列を有する D N Aを染色体 D N Aに組込む活性を有する酵素を含有することを特徴とする請求項 3 8記載の細胞の形質転換用組成物。

4 6 . レトロウイルス由来タンパク質成分を含有する細胞の形質転換用組成物を包含する細胞の形質転換用キット。

4 7 . 細胞の形質転換方法にレトロウィルス由来の末端反復配列と、当該レト口ウィルスに存在しない塩基配列の D NAとを含有する 2本鎖 D NAとレトロゥィルス由来タンパク質成分を含む複合体を細胞に導入することを指示した指示書を含むことを特徴とする細胞の形質転換用キット。

4 8 . 細胞の形質転換方法に使用されるキットであって、パッケージされた形態において、レトロウイルス由来タンパク質成分と、レトロウイルス由来の末端反復配列と当該レトロウイルスに存在しない塩基配列の D N Aとを含有する 2本鎖 D N Aとを細胞に導入することを指示した指示書を含むことを特徴とする細胞の形質転換用キット。

4 9 . 包装材と該包装材に封入された形質転換用試薬を含む製造品であって、該形質転換用試薬が組換えレトロウイルス由来の 2本鎖 D N Aとレトロウイルス由来タンパク質成分を含む複合体及び Z又は該複合体を調製するための試薬を含有し、前記形質転換用試薬が、目的とする細胞への組換えレトロウイルスの感染の工程を含まない形質転換に使用できることが、該包装材に付されたラベル又は該包装材に添付された指示書に表示されてなる、細胞への形質転換用試薬の製造

P

口 α₀

5 0 . 包装材と該包装材に封入された形質転換用試薬を含む製造品であって、該形質転換用試薬がレトロウィルス由来タンパク質成分を含有し、前記形質転換用試薬が、目的とする細胞への組換えレトロウイルスの感染の工程を含まない形質転換に使用できることが、該包装材に付されたラベル又は該包装材に添付された指示書に表示されてなる、細胞の形質転換用試薬の製造品。

5 1 . レトロウイルス由来タンパク質成分が、レトロウイルス由来の末端反復配列を有する D Ν Αを染色体 D Ν Αに組込む活性を有する酵素であることを特徴とする請求項 4 9又は 5 0記載の製造品。

5 2 . 遺伝子を導入する対象が真核細胞である請求項 1 4又は 1 6記載の遺伝子導入方法。

5 3 . 遺伝子を導入する対象が真核細胞由来の培養細胞である請求項請求項 1 4又は 1 6記載の遺伝子導入方法。

5 4 . 遺伝子を導入する対象が真核生物個体である請求項請求項 1 4又は 1 6 記載の遺伝子導入方法。

5 5 . 遺伝子を導入する対象が脊椎動物受精卵である請求項請求項 1 4又は 1 6記載の遺伝子導入方法。

5 6 . 遺伝子を導入する対象が脊椎動物生殖細胞系列である請求項請求項 1 4 又は 1 6記載の遺伝子導入方法。

5 7 . 形質転換する対象が真核細胞である請求項 3 3又は 3 5記載の形質転換方法。

5 8 . 形質転換する対象が真核細胞由来の培養細胞である請求項請求項 3 3又は 3 5記載の形質転換方法。

5 9 . 形質転換する対象が真核生物個体である請求項請求項 3 3又は 3 5記載の形質転換方法。

6 0 . 形質転換する対象が脊椎動物受精卵である請求項請求項 3 3又は 3 5記載の形質転換方法。

6 1 . 形質転換する対象が脊椎動物生殖細胞系列である請求項請求項 3 3又は 3 5記載の形質転換方法。