WO2002058725A2 - Peptides non glycosyles derives de la proteine g du vrs et leur utilisation dans un vaccin - Google Patents

Peptides non glycosyles derives de la proteine g du vrs et leur utilisation dans un vaccin Download PDF

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    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to the respiratory syncytial virus, and more particularly to the identification of new antigens, useful in particular for the therapeutic and prophylactic treatment of conditions caused by this virus.
  • the respiratory syncytial virus is classified in the family of Paramyxoviridae, genus pneumovirus comprising a non-segmented AR ⁇ genome, of negative polarity, coding for 11 specific proteins.
  • RSVs there may be mentioned in particular human RSV type A and type B and bovine RSV, the genomic sequences of which are known.
  • RSV is one of the most common causative agents in infants and the elderly. Bronchiolitis is often severe in children and requires hospitalization. Currently there are no means of prevention against the disease due to RSV. The first RSV infection does not prevent the next. Treatment of severe cases with antibiotic therapy (Ribavirin) and / or combined with immunotherapy (human immunoglobulins) cannot reduce the worsening of the disease. In addition, this type of treatment is still very expensive. Clinical trials with ORAVAX H ⁇ K20 monoclonal antibodies (directed against RSV F protein) have not shown efficacy of treatment compared to placebo against RSV infection in children.
  • FI-RSV formalin-inactivated RSV vaccine
  • RSV structural proteins for a vaccine, such as the envelope proteins called F protein (fusion protein) or protein G (attachment protein), a 22 Kd glycoprotein, a 9.5 Kd protein, or the major capsid protein (protein N);
  • the subject of the present invention is an immunogenic peptide derived from the non-glycosylated RSV protein G and comprising at least the peptide sequence 148-193 of the human RSV protein G of subgroup A or B, or bovine RSV, or a sequence having at least 80% homology with said peptide sequences 148-193 of these G proteins, preferably with the exception of peptides derived from GRS protein of RSV having for sequence a sequence chosen from the sequences: a) SEQ ID Nos. 1 to 3; b) SEQ ID Nos.
  • immunogenic peptides those derived from the non-glycosylated RSV protein G containing at least the peptide sequence 148-193 of the human RSV protein G from subgroup A or B, or from bovine RSV, are preferred. or a sequence having at least 80% homology with said peptide sequences 148-193 of these G proteins, and of which the fragment 185-193 of said G proteins is 100% identical to the fragment 185-193 of said G proteins.
  • immunogenic peptide is intended to denote any peptide which, when it is preferably associated with a carrier or an adjuvant, is capable of generating or increasing an immune response directed against RSV.
  • peptide will also be understood to denote the polypeptides.
  • the notation "148-193" for the peptide sequence 148-193 should be understood as meaning that said amino acid sequence is the sequence between the amino acids in positions 148 and 193, ends included, of the protein G, protein G being an envelope protein of the
  • amino acid located in first position thus corresponds respectively to the amino acid located in position 130 of the RSV protein A sequence of type A, type B and bovine type.
  • the peptides according to the invention in particular the peptide of sequence 148-193, can in particular be obtained by conventional peptide chemical synthesis, without glycosylation stages, known to those skilled in the art or by recombinant route without glycosylation.
  • amino acid sequence having a homology of at least 80% after optimal alignment with a determined nucleic acid or amino acid sequence is meant a sequence which after optimal alignment with said determined sequence comprises a percentage of identity of at least 80% with said determined sequence.
  • percentage of identity between two amino acid sequences within the meaning of the present invention is meant a percentage of identical amino acid residues between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistics and the differences between the two sequences being distributed randomly and over their entire length.
  • Sequence comparisons between two amino acid sequences are traditionally carried out by comparing these sequences after having optimally aligned them, said comparison being carried out by segment or by “comparison window” to identify and compare the local regions of sequence similarity. .
  • the optimal alignment of the sequences for comparison can be achieved, besides manually, by means of the local homology algorithm of Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math.
  • the percentage of identity between two amino acid sequences is determined by comparing these two optimally aligned sequences per comparison window in which the region of the nucleic acid or amino acid sequence to be compared can comprise additions or deletions from the reference sequence for optimal alignment between these two sequences.
  • the percentage of identity is calculated by determining the number of identical positions for which the amino acid residue is identical between the two sequences, by dividing this number of identical positions by the total number of positions in the comparison window and by multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage of identity between these two sequences.
  • BLAST 2 sequences available on the site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf7bl2.html, the parameters used being those given by default (in particular for the parameters “open gap penaltie”: 5, and “extension gap penaltie”: 2; the chosen matrix being for example the “BLOSUM 62” matrix proposed by the program), the percentage of identity between the two sequences to be compared being calculated directly through the program.
  • sequences having a homology of at least 80% preference is given to sequences of peptides capable of inducing an immune response directed against RSV, such as the induction of an immune response measured by means of the standard techniques described in examples below, and presenting the least possible risk of associated immunopathologies, this risk being able to be evaluated in particular by the methods described in example V below.
  • said immunogenic peptide derived from the non-glycosylated RSV G protein according to the invention is a fragment of the peptide sequence 130-230 of the human RSV protein G of the subgroup A or B, or bovine RSV, or a fragment of a sequence having at least 80% homology with said peptide sequences 130-230 of these G proteins.
  • said peptide sequence 148-193 of protein G of human RSV of the subgroup A or B, or of bovine RSV comprises in position 173, 176, 182 and 186 a cysteine.
  • the peptide according to the invention has at least a first disulfide bridge connecting residues 173 and 186 and a second disulfide bridge connecting residues 176 and 182.
  • the peptides having a sequence chosen from the sequence 148-193, 148-200, 148-230, 140-193, 140-230, 130 are preferred. -193 and 130-200 of protein G of human RSV of subgroup A or B, or bovine RSV.
  • Said immunogenic peptides derived from the RSV G protein according to the invention may also be chosen from the peptides of sequence: a) SEQ ID Nos. 1 to 3; b) SEQ ID Nos. 1 to 3 comprising each of them the mutations C173S and C186S; c) sequences 140-200, 140-198, 140-198, 140-196 and 140-194 of the sequences as described in a) or b); and d) SEQ ID No.
  • compositions according to the invention can also contain at least one carrier protein and / or an adjuvant.
  • the carrier protein can advantageously be chosen from the TT protein (toxoid tetanus), the DT protein (diphtheria toxoid), the protein for binding to human serum albumin from Streptococcus and its fragments, the B subunit of cholera toxin (CTB) and extracts of bacterial membrane proteins such as OMPCs from Neisseria meningitidis (Vella et al., Infect. Immun., 60: 4977-4983, 1992), TraT of Escherichia coli (Croft et al, J. Immunol., 146 : 793-798, 1991) or PorB of Neisseria meningitidis (Fusco et al., J. Infect. Dis., 175: 364-372, 1997).
  • TT protein toxoid tetanus
  • DT protein diphtheria toxoid
  • CTB cholera toxin
  • One of the preferred carrier proteins consists of an OmpA of a bacterium of the genus Klebsiella, a major protein of the outer membrane called P40, which exhibits carrier protein activity, by the systemic route, for subunit antigens.
  • peptides WO 95/27787 and WO 96/14415; Haeuw et al, Eur. J. Biochem., 255: 446-
  • compositions according to the invention containing at least one carrier protein said carrier protein will preferably be non-glycosylated.
  • the adjuvant can in particular be chosen from MPL-A, Quil-A, ISCOM,
  • DDAC deoxyribonucleic acid
  • alum aluminum hydroxide
  • adjuphos CpG, Leif, CT, (cholera toxoid), LT (Heat labile enterotoxin) and detoxified versions of CT or
  • the peptide according to the invention can be associated, by mixing or by coupling, with the carrier protein and / or with the adjuvant.
  • the coupling is preferably a covalent coupling, which can be carried out chemically or by recombinant DNA techniques.
  • one or more linking elements are introduced into the peptide according to the invention and / or into said carrier or adjuvant to facilitate chemical coupling, preferably, said introduced linking element is an amino acid.
  • linking elements in particular amino acids to facilitate the coupling reactions between the peptide according to the invention and the carrier or adjuvant.
  • the covalent coupling between the peptide according to the invention and said carrier or adjuvant can be carried out at the N- or C-terminal end of said peptide.
  • the bifunctional reagents allowing this coupling will be determined according to the end of said peptide chosen to perform the coupling and the nature of said carrier or adjuvant to be coupled.
  • the coupling between the peptide according to the invention and said carrier or adjuvant is carried out by genetic recombination, when said carrier or adjuvant is of peptide nature.
  • the conjugates resulting from a coupling between the peptide according to the invention and said carrier or adjuvant can be prepared by genetic recombination.
  • the chimeric or hybrid protein (the conjugate) can be produced by recombinant DNA techniques by insertion or addition to the DNA sequence coding for said peptide according to the invention, of a sequence coding for said carrier or adjuvant of protein nature.
  • the methods for synthesizing hybrid molecules include the methods used in genetic engineering to construct hybrid polynucleotides encoding the desired polypeptide sequences.
  • the peptide according to the invention is conjugated to the carrier protein or to the adjuvant by a binding protein; this binding protein can in particular be chosen from a receptor for serum mammalian albumin and the receptors present on the surface of mucosal cells.
  • a subject of the invention is also the composition according to the invention, characterized in that said pharmaceutical composition also comprises at least one second antigen, immunogen or hapten of NRS and / or an antigen, immunogen or haptene derived from responsible microorganism pathologies of the airways chosen from parainfluenza viruses (PIN 1, 2, 3 and 4), influenza virus (A and B), hantaviruses, streptococci, pneumococci, haemophilus influenza type b, rhinoviruses, coronoviruses and meningococci.
  • parainfluenza viruses PIN 1, 2, 3 and 4
  • influenza virus A and B
  • hantaviruses hantaviruses
  • streptococci pneumococci
  • haemophilus influenza type b haemophilus influenza type b
  • rhinoviruses coronoviruses and meningococci.
  • immunogen, antigen or hapten is intended to denote in particular any compound expressed by an infectious agent, or one of their structural analogues, which alone or in combination with an adjuvant or carrier is capable of inducing a specific immune response of said agent infectious.
  • immunogen, antigen or hapten is also intended to denote in the present description a compound having a structural analogy with said antigen or hapten capable of inducing an immunological response directed against said antigen or hapten in an organism previously immunized with said analogous compound.
  • said second NRS antigen comprises at least one fragment of the protein G of the respiratory syncytial virus, said fragment comprising a T epitope or being solely composed of said T epitope.
  • said second NRS antigen comprises at least one fragment of the protein F of the respiratory syncytial virus, said fragment comprising a T epitope or being solely composed of said T epitope.
  • compositions according to the invention containing at least a second antigen or immunogen derived from NRS and / or an antigen derived from a microorganism responsible for pathologies of the airways, said antigen will preferably be non-glycosylated.
  • the pharmaceutically acceptable medium is the medium in which the compounds of the invention are administered, preferably a medium injectable into humans. It can consist of water, an aqueous saline solution or an aqueous solution based on dextrose and / or glycerol.
  • the invention also comprises a composition according to the invention, characterized in that said pharmaceutical composition is conveyed in a form making it possible to improve its stability and / or its immunogenicity; thus, it can be conveyed in the form of liposomes, virosomes, nanospheres, microspheres or microcapsules.
  • the invention also relates to antibodies, monoclonal or polyclonal, directed against the peptides according to the invention.
  • the monoclonal antibodies are preferably humanized and produced by the recombinant route. According to another aspect of the invention, they are obtained by the phage library method.
  • the monoclonal, polyclonal antibody or one of their fragments is characterized in that it is capable of binding specifically to an epitope or determining non-glycosylated peptides according to the invention.
  • the monoclonal antibodies can advantageously be prepared from hybridomas according to the technique described by Kohler and Milstein in 1975 (Nature, 256: 495-497, 1975).
  • the polyclonal antibodies can be prepared, for example by immunization of an animal, in particular a mouse or a rabbit, with the peptide according to the invention associated with an adjuvant of the immune response, then purification of the specific antibodies contained in the serum of the animals immumsed on an affinity column to which has been previously fixed, said peptide having served as an antigen.
  • the antibodies of the invention also include any fragment of said monoclonal antibody capable of binding to an epitope of the peptide according to the invention on which the monoclonal or polyclonal antibody from which said fragment is derived binds.
  • fragments include in particular single chain monoclonal antibodies or monovalent fragments Fab or Fab 'and divalent fragments such as F (ab') 2, which have the same binding specificity as the monoclonal or polyclonal antibody of which they are from.
  • a fragment according to the invention may also be a single chain Fv fragment produced by methods known to those skilled in the art and as described for example by Skerra et al. (Science, 240: 1038-1041, 1988) and King et al. (Biochemical J., 290: 723-729, 1991).
  • fragments of monoclonal or polyclonal antibodies of the invention can be obtained from the monoclonal or polyclonal antibodies as described above by methods such as digestion with enzymes, such as pepsin or papain and / or by cleavage of the disulfide bridges by chemical reduction.
  • the monoclonal or polyclonal antibody fragments included in the present invention can be synthesized by automatic peptide synthesizers such as those provided by the company Applied Biosystems, etc., or can be prepared manually using techniques known to those skilled in the art and as described for example by Geysen et al. (J. Immunol. Methods, 102: 259-274, 1978).
  • humanized monoclonal antibodies according to the invention or their fragments can be prepared by techniques known to those skilled in the art (Carter et al., PNAS, 89: 4285-4289, 1992; Mountain, et al., Biotechnol. Genet Eng. Rev. 10: 1-142, 1992). Such humanized monoclonal antibodies according to the invention are preferred for their use in therapeutic methods.
  • the antibodies of the invention, or their fragments can also be labeled with an enzymatic, fluorescent or radioactive type of labeling.
  • the monoclonal antibodies labeled according to the invention or their fragments include, for example, antibodies called immunoconjugates which can be conjugated for example with enzymes such as peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -D-galactosidase, glucose oxidase, glucose amylase , carbonic anhydrase, acetylcholinesterase, lysozyme, malate dehydrogenase or glucose-6 phosphate dehydrogenase or by a molecule such as biotin, digoxigenin or 5-bromo-deoxyuridine.
  • Fluorescent markers can also be conjugated to the monoclonal antibodies or their fragments of the invention and include in particular fluorescein and its derivatives, rhodamine and its derivatives, GFP (GFP for "Green
  • the monoclonal antibodies of the invention or their fragments can be prepared by methods known to those skilled in the art. They can be coupled to enzymes or fluorescent markers directly or through a spacer group or a linking group such as a polyaldehyde, such as glutaraldehyde, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid
  • conjugates comprising markers of the fluorescein type can be prepared by reaction with an isothiocyanate.
  • conjugates can also include chemiluminescent markers such as luminol and dioxetanes or bioluminescent markers such as luciferase and luciferin.
  • radioactive markers such as
  • the peptides and / or the antibodies according to the invention can, according to a mode of implementation of the invention, enter into the composition of a diagnostic kit.
  • the peptides and antibodies according to the invention can be used as a medicament, and more particularly for the preparation of a composition intended for the preventive or curative treatment of conditions caused by human NRS, subgroup A or B, or by bovine NRS, preferably by human NRS, in particular by subgroup A.
  • the invention also relates to the use of an immunogenic peptide derived from the non-glycosylated NRS protein G and comprising at least the peptide sequence 185-193 of human NRS protein G, subgroup A or B, or bovine, preferably human NRS from subgroup A or B, in particular from subgroup A of sequence SEQ ID ⁇ o. 4, or comprising a sequence having at least 80% homology with said peptide sequences 185-193 of these G proteins, or of an antibody according to the invention:
  • a pharmaceutical composition preferably a vaccine, intended for the prophylactic or therapeutic treatment of conditions caused by human NRS, subgroup A or B, or bovine and not inducing immunopathologies; or - for the preparation of a pharmaceutical composition intended to generate or increase an immune response against NRS and not inducing immunopathologies.
  • the immunogenic peptides according to the present invention are preferred, in particular: a) those derived from the non-glycosylated NRS protein G comprising at least the peptide sequence 148- 193 of protein G of human NRS of subgroup A or B, or of bovine NRS, or a sequence having at least 80% homology with said peptide sequences 148-193 of these G proteins, and of which the fragment 185- 193 is 100% identical to fragment 185-193 of said G proteins; or b) those as above defined in a) and the sequence of which is included in the sequence 130-230 of these G proteins, in particular the non-glycosylated immunogenic peptides of sequence SEQ ID ⁇ o. 1, ⁇ o. 2 and ⁇ o. 3 noted respectively G2A (or G2 ⁇ a), G2B and G2V, the peptide G2A being particularly preferred.
  • Figure 1 Migration on SDS page gel of the BBG2Na protein expressed in E. coli and in H ⁇ p-2 cells before and after treatment with deglycosylation enzymes.
  • Figure 2 Antigenicity of non-glycosylated and glycosylated BBG2Na against a panel of monoclonal antibodies specific for the NRS protein G fragment and for the BB part of BBG2 ⁇ a.
  • the monoclonal antibodies 5B7, 5C2, 8A3, 11F7 and 18D1 are specific for the fragment of the NRS G protein in BBG2 ⁇ a.
  • the 13F 10 monoclonal antibody is specific for the BB part of BBG2Na.
  • FIG. 3 Immunogenicity of glycosylated and non-glycosylated BBG2Na in mice.
  • BBG2Na non-glycosylated BBG2Na
  • gBBG2Na glycosylated BBG2Na
  • Cell Ag cell control antigen
  • FI-RSV VRS inactivated by formalin
  • PBS buffered saline phosphate.
  • Figure 4 Protective efficacy of glycosylated and non-glycosylated BBG2Na in BALB / c mice.
  • BBG2Na non-glycosylated BBG2Na
  • gBBG2Na glycosylated BBG2Na
  • Cell Ag cell control antigen
  • FI-RSV VRS inactivated by formalin
  • PBS buffered saline phosphate.
  • Figure 5 Number of nucleated cells infiltrating the lungs after challenge and cell populations present in these lungs represented by the CD4 / CD8 ratio.
  • Figure 6 Number of granulocytes (LGL) and cells labeled with the antibody RB6- 8B5 (polynuclear).
  • Figure 7 Secretion of Th2 cytokines (IL-5 and IL-10); significant increase in cytokine secretion in mice immunized with gBBG2Na and FI-VRS compared to those treated with BBG2Na.
  • Th2 cytokines IL-5 and IL-10
  • the fusion peptide BBG2Na is composed of a very conserved fragment of the G protein of VRS-A, commonly called G2Na (fragment 130-230 of protein G of human RSV type A), fused by genetic engineering at the site of binding to albumin of the streptococcus protein G, site called BB.
  • G2Na fragment 130-230 of protein G of human RSV type A
  • BBG2Na a recombinant protein, designated BBG2Na, in E.coli and in eukaryotic HEp-2 cells.
  • the proteins were purified on HSA-Sepharose columns. Confirmation of glycosylation and non-glycosylation of proteins expressed in eukaryotic and prokaryotic systems has been demonstrated by treatment of the proteins with deglycosylation enzymes and analysis of the products on SDS-PAGE gel of 9%.
  • the protein resulting from prokaryotic expression migrates at the same height, regardless of the treatment or not with the deglycosylation enzymes.
  • the protein derived from eukaryotic expression migrates less than the prokaryotic protein before enzymatic treatment, after deglycosylation it migrates at the same height as the prokaryotic protein.
  • BBG2Na from E. coli (non-glycosylated) or H ⁇ p-2 cells (glycosylated) are similar or not from an antigenic point of view
  • the 2 forms of protein were tested in ⁇ LISA against a panel of monoclonal antibodies specific for BBG2Na. Briefly, the proteins were brought into contact with these antibodies at the same concentration on ⁇ LISA plates and the titer in monoclonal antibody was determined according to the last dilution of the antibody giving an OD greater than 2 times the background noise. of the test. As can be seen in Figure 2, the 2 forms of BBG2Na could not be distinguished from each other, which indicates that the proteins are very similar from an antigenicity point of view.
  • Example III
  • mice were immunized 3 times (on D0, D14 and D24) intraperitoneally (ip) with 2 ⁇ g of non-glycosylated or glycosylated BBG2Na, or by the HEp-2 control cell antigen, FI-VRS or PBS.
  • ip intraperitoneally
  • the sera of the mice were collected and were tested in ELISA against antigens of RSV, as described by Power, U.F. et al. (Virology, 230: 155-166, 1997).
  • the mice immunized with the peptide BBG2Na glycosylated or non-glycosylated had practically the same titre in anti-RSV antibodies. Therefore, the two forms of the protein are also very similar in terms of their immunogenicity.
  • mice are immunized on D0, D14, D24. They are challenged with 10 TCID 50 of RSN-A on D34 and are sacrificed, after intracardiac blood puncture, 7 days later.
  • the lungs are removed, reduced to small fragments and treated with an enzymatic mixture of coUagenase, Dnase and Dispase as described (H. Plotnicky-Gilquin et al., Nirol., 258: 128-40, 1999).
  • the pulmonary infiltrating cells are scanned and then labeled using fluorescent antibodies specific for the different types of cell populations.
  • the intracellular cytokines are detected after stimulation of the cells and intracellular labeling with specific antibodies.
  • the analysis of the labeled cells is carried out using FACSvantage (Becton Dickinson).
  • Th2 cytokines IL Secretion of Th2 cytokines
  • IL-5 and IL-10 Th2 cytokines
  • the response profile with BBG2Na is comparable to that of mice treated with the cellular antigen alone.
  • the secretion of Th2 cytokines (IL-5 and IL-10) is shown in Figure 7.

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Abstract

La présente invention se rapporte au virus respiratoire syncytial, et plus particulièrement à l'identification de nouveaux antigènes non glycosylés, utiles notamment pour le traitement thérapeutique et prophylactique des affections provoquées par ce virus.

Description

PEPTIDES NON GLYCOSYLES DERIVES DE LA PROTEINE G DU NRS ET LEUR UTILISATION DANS UN VACCIN
La présente invention se rapporte au virus respiratoire syncytial, et plus particulièrement à l'identification de nouveaux antigènes, utiles notamment pour le traitement thérapeutique et prophylactique des affections provoquées par ce virus.
Le virus respiratoire syncytial (NRS) est classé dans la famille des Paramyxoviridae, genre pneumovirus comportant un génome ARΝ non segmenté, de polarité négative, codant pour 11 protéines spécifiques. Parmi les VRS, on peut citer notamment le VRS humain de type A et de type B et le VRS bovin dont les séquences génomiques sont connues.
Le VRS est l'un des agents étiologiques les plus fréquemment rencontrés chez le nourrisson et chez les personnes âgées. Les bronchiolites sont souvent graves chez l'enfant et nécessitent l'hospitalisation. Actuellement il n'existe pas de moyens de prévention contre la maladie due au VRS. La première infection au VRS ne prévient pas contre la suivante. Le traitement des cas graves par antibiothérapie (Ribavirine) et/ou associé avec l'immunothérapie (immunoglobulines humains) ne peuvent pas atténuer l'aggravation de la maladie. De plus, ce type de traitement reste encore très coûteux. Les essais cliniques avec les anticorps monoclonaux HΝK20 de ORAVAX (dirigés contre la protéine F du VRS) n'ont pas montré d'efficacité du traitement par rapport au placebo contre l'infection du VRS chez l'enfant. Dans les années 60, les tentatives d'immunisation des enfants avec un vaccin VRS inactivé à la formaline (FI-RSV) avaient eu pour conséquence l'aggravation de la maladie au lieu de conférer une protection contre l'infection naturelle au VRS. Cette aggravation de la maladie a été caractérisée par une augmentation des neutrophiles polymorphonucléaires, des lymphocytes et des éosinophiles dans le sang et les poumons ( im et al., Pédiatrie Res. 10:75-78 (1976)). Il a aussi été démontré chez la souris que FI-RSV induisait une réponse immune de type Th2 (T-helper 2), se traduisant notamment par une production importante d'IL-4, d'IL-5, d'IL-10 et d'IL-13, descytokines Th2. Des études récentes ont permis de corréler cette immunopathologie observée suite à l'administration de FI-RSV avec une région précisément déterminée, un épitope CD4+ de séquence 185-193 de la protéine G du VRS humain de type A (de séquence SEQ ID No. 4 : ICKRIPNKK), qui s'avère primordiale pour obtenir une réponse en cytokines Th2 chez les souris (Varga et al., J. Immunol., 165:6487-6495, 2000).
Parmi les documents relatifs à l'utilisation d'une protéine structurale particulière, ou d'un de ses fragments, du VRS en tant qu'immunogène et/ou pour la préparation de vaccin, on peut citer :
- la demande internationale de brevet WO 87/04185, publiée le 16 juillet 1987, qui propose d'utiliser des protéines structurales du VRS en vue d'un vaccin, comme les protéines d'enveloppe appelées protéine F (protéine de fusion) ou protéine G (protéine d'attachement), une glycoprotéine de 22 Kd, une protéine de 9,5 Kd, ou la protéine majeure de capside (protéine N) ;
- la demande internationale de brevet WO 89/02935, publiée le 6 avril 1989, qui décrit les propriétés de protection de la protéine F entière du VRS, éventuellement modifiée sous forme monomérique ou déglycosylée. Une série de fragments de la protéine F a été clonée en vue de rechercher leurs propriétés neutralisantes ; - la demande internationale de brevet WO 95/27787, publiée le 19 octobre 1995, montrant que la protéine G du VRS ou certains de ses fragments, peuvent être utiles dans la préparation de produits destinés au traitement et/ou à la prévention d'affections provoquées par le VRS, sous-groupe A ou B ; et
- la demande de brevet européen EP 0 814 089, publiée le 29 décembre 1997, proposant d'utiliser certains fragments de la protéine F de fusion ou la protéine G entière de type recombinant du VRS pour la protection contre les infections par le VRS de produits destinés au traitement et/ou à la prévention d'affections provoquées par le
VRS.
Des peptides structurellement homologues à la séquence 149-197 de la protéine G et dans laquelle aucun oligosaccharide n'est lié à une serine, thréonine ou asparagine sont également décrits dans la demande internationale de brevet WO 97/46581 publiée le 11 décembre 1997 ; il y est précisé que cette absence de glycosylation permet de rendre cette région accessible pour se lier à des récepteurs.
On peut enfin citer la demande internationale de brevet WO 99/03987, publiée le 28 janvier 1999, et le document publié par Simard et al. (Antiviral Research, 28:303-
315, 1995) qui décrivent des fragments de la protéine G du VRS contenant des épitopes spécifiques, utilisés dans un vaccin contre l'infection au VRS. Toutefois, aucune de ces demandes ne répondait au problème d'obtenir une réponse immune suffisante et présentant le moins de risque possible d'immunopathologies associées à la production d'IL-5 ou à d'autres cytokines / chémokines impliquées dans cette réaction immunopathogène comme, mais non limité à, riL-4, lTL-10 ou l'IL-13.
Ceci est justement l'objet de la présente invention.
De manière surprenante, il a été mis en évidence qu'un peptide immunogène non glycosylé dérivé de la protéine G du VRS répond aux problèmes mentionnés ci-dessus.
Ainsi, la présente invention a pour objet un peptide immunogène dérivé de la protéine G du VRS non glycosylé et comportant au moins la séquence peptidique 148- 193 de la protéine G du VRS humain du sous-groupe A ou B, ou du VRS bovin, ou une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec lesdites séquences peptidiques 148-193 de ces protéines G, de préférence à l'exception des peptides dérivés de la protéine G du VRS ayant pour séquence une séquence choisie parmi les séquences : a) SEQ ID Nos. 1 à 3 ; b) SEQ ID Nos. 1 à 3 comprenant chacune d'entre elles les mutations Cl 73 S et C186S ; c) les séquences 140-200, 140-198, 140-198, 140-196 et 140-194 des séquences telles que décrites en a) ou b) ; d) SEQ ID No. 1 comprenant les 6 mutations F163S, F165S, F168S, F170S, C173S et C186S ; e) SEQ ID No. 1 comprenant les 4 mutations N191S, K192N, G195K et T198P ; f) SEQ ID No. 1 comprenant les 4 mutations N157K, N160K, N161D et F163Y ; g) SEQ ID No. 1 comprenant les 8 mutations N157K, N160K, N161D, F163Y, N191S, K192N, G195K et T198P ; ou h) les séquences 124-203 et 1-230 de la protéine G du VRS (Simard et al., 1995).
Parmi lesdits peptides immunogènes selon l'invention, on préfère ceux dérivés de la protéine G du VRS non glycosylé comportant au moins la séquence peptidique 148-193 de la protéine G du VRS humain du sous-groupe A ou B, ou du VRS bovin, ou une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec lesdites séquences peptidiques 148-193 de ces protéines G, et dont le fragment 185-193 desdites protéines G est identique à 100 % au fragment 185-193 desdites protéines G. Parmi lesdits peptides immunogènes selon l'invention, on préfère ceux dérivés du VRS humain du sous-groupe A ou B, notamment dérivés du type A et comprenant la séquence SEQ ID No. 4 de la liste des séquences ci-après.
Par le terme «peptide immunogène», on entend désigner tout peptide qui, lorsqu'il est de préférence associé à un porteur ou un adjuvant, est capable de générer ou accroître une réponse immunitaire dirigée contre le VRS.
Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme «peptide » également les polypeptides.
Dans la présente description, la notation « 148-193 » pour la séquence peptidique 148-193 doit être entendue comme signifiant que ladite séquence d'acides aminés est la séquence comprise entre les acides aminés en position 148 et 193, extrémités incluses, de la protéine G, la protéine G étant une protéine d'enveloppe du
VRS.
Les séquences peptidiques ainsi définies par ce type de notation dans la présente description peuvent être aisément identifiables à partir des séquences SEQ ID No. 1,
SEQ ID No. 2 et SEQ ID No. 3 de la liste des séquences ci-après représentant respectivement le fragment peptidique de séquence 130-230 de la protéine G du VRS de type A, de type B et de type bovin.
Pour ces trois séquences SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 et SEQ ID No. 3 représentées dans la liste des séquences ci-après, l'acide aminé situé en première position correspond ainsi et respectivement à l'acide aminé situé en position 130 de la séquence de la protéine G du VRS de type A, de type B et de type bovin.
Les peptides selon l'invention, en particulier le peptide de séquence 148-193, peuvent notamment être obtenus par synthèse chimique peptidique classique, sans étapes de glycosylation, connue de l'homme du métier ou par voie recombinante sans glycosylation.
Les méthodes de préparation des peptides recombinants non glycosylés sont aujourd'hui bien connues de l'homme de l'art et ne seront pas développées dans la présente description. Parmi les cellules utilisables pour la production de ces protéines recombinantes, on peut notamment citer les cellules bactériennes (Olins P.O. et Lee
S.C., Curr. Op. Biotechnology 4:520-525, 1993), et plus particulièrement E. coli. Par séquence d'acides aminés présentant une homologie d'au moins 80 % après alignement optimal avec une séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés déterminée, on entend désigner une séquence qui après alignement optimal avec ladite séquence déterminée comprend un pourcentage d'identité d'au moins 80 % avec ladite séquence déterminée.
Par «pourcentage d'identité» entre deux séquences d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par «fenêtre de comparaison» pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou encore par les logiciels de comparaison BLAST N ou BLAST P).
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par fenêtre de comparaison dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. Par exemple, on pourra utiliser le programme BLAST, «BLAST 2 séquences», disponible sur le site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf7bl2.html, les paramètres utilisés étant ceux donnés par défaut (en particulier pour les paramètres «open gap penaltie» : 5, et «extension gap penaltie» : 2 ; la matrice choisie étant par exemple la matrice «BLOSUM 62» proposée par le programme), le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer étant calculé directement par le programme.
Parmi lesdites séquences présentant une homologie d'au moins 80 %, on préfère les séquences de peptides capables d'induire une réponse immunitaire dirigée contre le VRS, telle que l'induction d'une réponse immunitaire mesurée au moyen des techniques standards décrites dans les exemples ci-après, et présentant le moins de risque possible d'immunopathologies associées, ce risque pouvant être évalué en particulier par les méthodes décrites à l'exemple V ci- après.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit peptide immunogène dérivé de la protéine G du VRS non glycosylé selon l'invention est un fragment de la séquence peptidique 130-230 de la protéine G du VRS humain du sous-groupe A ou B, ou du VRS bovin, ou un fragment d'une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec lesdites séquences peptidiques 130-230 de ces protéines G.
Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, ladite séquence peptidique 148-193 de la protéine G du VRS humain du sous-groupe A ou B, ou du VRS bovin comprend en position 173, 176, 182 et 186 une cystéine.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, le peptide selon l'invention présente au moins un premier pont disulfure reliant les résidus 173 et 186 et un deuxième pont disulfure reliant les résidus 176 et 182.
Parmi lesdits peptides immunogènes dérivés de la protéine G du VRS selon l'invention, on préfère les peptides ayant pour séquence une séquence choisie parmi la séquence 148-193, 148-200, 148-230, 140-193, 140-230, 130-193 et 130-200 de la protéine G du VRS humain du sous-groupe A ou B, ou du VRS bovin.
Lesdits peptides immunogènes dérivés de la protéine G du VRS selon l'invention pourront également être choisis parmi les peptides de séquence : a) SEQ ID Nos. 1 à 3 ; b) SEQ ID Nos. 1 à 3 comprenant chacune d'entre elles les mutations C173S et C186S ; c) les séquences 140-200, 140-198, 140-198, 140-196 et 140-194 des séquences telles que décrites en a) ou b) ; et d) SEQ ID No. 1 comprenant les 6 mutations F163S, F165S, F168S, F170S, C173S et C186S ; (fragments peptidiques de la protéine G du VRS humain du sous-groupe A ou B, ou du VRS bovin de séquence 140-194, 140-196, 140-200, 140-198 et 130-230 dont certaines de ces séquences peuvent présenter un acide aminé substitué par rapport à la séquence de la protéine G sauvage), parmi les peptides de séquence : e) SEQ ID No. 1 comprenant les 4 mutations N191S, K192N, G195K et T198P ; f) SEQ ID No. 1 comprenant les 4 mutations N157K, N160K, N161D et F163Y ; et g) SEQ ID No. 1 comprenant les 8 mutations N157K, N160K, N161D, F163Y, N191S,
K192N, G195K et T198P ; (fragments peptidiques de la protéine G du VRS humain de sous-groupe A de séquence 130-230 comportant respectivement 4, 4 et 8 acides aminés substitués par rapport à la séquence sauvage) ou parmi les peptides de séquence 124-203 et 1-230 desdites protéines G sauvages du VRS humain ou bovin.
L'invention a encore pour objet une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins un peptide selon l'invention. Ces compositions selon l'invention peuvent en outre contenir au moins une protéine porteuse et/ou un adjuvant.
La protéine porteuse peut être avantageusement choisie parmi la protéine TT (tétanus toxoïde), la protéine DT (toxoïde diphtérique), la protéine de liaison à la sérumalbumine humaine du Streptocoque et ses fragments, la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB) et les extraits de protéines membranaires bactériennes telles que les OMPC de Neisseria meningitidis (Vella et al., Infect. Immun., 60:4977-4983, 1992), TraT d'Escherichia coli (Croft et al, J. Immunol., 146:793-798, 1991) ou PorB de Neisseria meningitidis (Fusco et al., J. Infect. Dis., 175:364-372, 1997).
Une des protéines porteuses préférées consiste en une OmpA d'une bactérie du genre Klebsiella, protéine majeure de la membrane externe baptisée P40, présentant une activité de protéine porteuse, par voie systémique, pour des antigènes sous-unitaires peptidiques (WO 95/27787 et WO 96/14415 ; Haeuw et al, Eur. J. Biochem., 255:446-
454, 1998 ; Plotnicky-Gilquin et al., J. Nirol., 73:5637-5645, 1999).
Dans les compositions selon l'invention contenant au moins une protéine porteuse, ladite protéine porteuse sera de préférence non glycosylée. L'adjuvant peut notamment être choisi parmi le MPL-A, le Quil-A, l'ISCOM, le
Diméthyl Dioctadécyl Ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure
(DDAC), l'alum (hydroxyde d'aluminium), l'adjuphos, les CpG, la Leif, la CT, (toxoïde du choléra), la LT (Heat labile enterotoxine) et les versions détoxifiées de la CT ou la
LT. Le peptide selon l'invention peut être associé, par mélange ou par couplage, à la protéine porteuse et/ou à l'adjuvant.
Le couplage est de préférence un couplage covalent, qui peut être réalisé par la voie chimique ou par des techniques d'ADN recombinant.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, il est introduit un ou plusieurs éléments de liaison dans le peptide selon l'invention et/ou dans ledit porteur ou adjuvant pour faciliter le couplage chimique, de préférence, ledit élément de liaison introduit est un acide aminé.
Selon l'invention, il est possible d'introduire un ou plusieurs éléments de liaison, notamment des acides aminés pour faciliter les réactions de couplage entre le peptide selon l'invention et le porteur ou adjuvant. Le couplage covalent entre le peptide selon l'invention et ledit porteur ou adjuvant peut être réalisé à l'extrémité N- ou C- terminale dudit peptide. Les réactifs bifonctionnels permettant ce couplage seront déterminés en fonction de l'extrémité dudit peptide choisi pour effectuer le couplage et de la nature dudit porteur ou adjuvant à coupler. Dans un autre mode de réalisation particulier, le couplage entre le peptide selon l'invention et ledit porteur ou adjuvant est réalisé par recombinaison génétique, lorsque ledit porteur ou adjuvant est de nature peptidique.
Les conjugués issus d'un couplage entre le peptide selon l'invention et ledit porteur ou adjuvant peuvent être préparés par recombinaison génétique. La protéine chimérique ou hybride (le conjugué) peut être produite par des techniques d'ADN recombinant par insertion ou addition à la séquence d'ADN codant pour ledit peptide selon l'invention, d'une séquence codant pour ledit porteur ou adjuvant de nature protéique.
Les procédés de synthèse des molécules hybrides englobent les méthodes utilisées en génie génétique pour construire des polynucléotides hybrides codant pour les séquences polypeptidiques recherchées. On pourra, par exemple, se référer avantageusement à la technique d'obtention de gènes codant pour des protéines de fusion décrite par D.N. Goeddel (Gène expression technology, Methods in Enzymology, vol. 185:3-187, 1990).
Selon l'un des aspects de l'invention, le peptide selon l'invention est conjugué à la protéine porteuse ou à l'adjuvant par une protéine de liaison ; cette protéine de liaison peut notamment être choisie parmi un récepteur de l'albumine sérique de mammifère et les récepteurs présents à la surface des cellules mucosales.
L'invention a également pour objet la composition selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique comprend en outre au moins un deuxième antigène, immunogène ou haptène du NRS et/ou un antigène, immunogène ou haptène dérivé de micro-organisme responsable de pathologies des voies aériennes choisi parmi les parainfluenza virus (PIN 1, 2, 3 et 4), l'influenza virus (A et B), les hantavirus, les streptocoques, les pneumocoques, haemophilus influenza type b, les rhinovirus, les coronovirus et les méningocoques. Par « immunogène, antigène ou haptène », on entend désigner en particulier tout composé exprimé par un agent infectieux, ou un de leurs analogues structuraux, qui seul ou en association avec un adjuvant ou porteur est capable d'induire une réponse immunitaire spécifique dudit agent infectieux.
On entend également désigner par "immunogène, antigène ou haptène" dans la présente description un composé présentant une analogie structurale avec ledit antigène ou haptène capable d'induire une réponse immunologique dirigée contre ledit antigène ou haptène dans un organisme préalablement immunisé avec ledit composé analogue.
Dans un mode de réalisation encore plus préféré de l'invention, ledit deuxième antigène du NRS comprend au moins un fragment de la protéine G du virus respiratoire syncytial, ledit fragment comprenant un épitope T ou étant uniquement composé dudit épitope T. Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, ledit deuxième antigène du NRS comprend au moins un fragment de la protéine F du virus respiratoire syncytial, ledit fragment comprenant un épitope T ou étant uniquement composé dudit épitope T.
Dans les compositions selon l'invention contenant au moins un deuxième antigène ou immunogène dérivé du NRS et/ou un antigène dérivé de micro-organisme responsable de pathologies des voies aériennes, ledit antigène sera de préférence non glycosylé.
Au sens de la présente invention, le milieu pharmaceutiquement acceptable est le milieu dans lequel les composés de l'invention sont administrés, préférentiellement un milieu injectable chez l'homme. Il peut être constitué d'eau, d'une solution aqueuse saline ou d'une solution aqueuse à base de dextrose et/ou de glycérol.
L'invention comprend également une composition selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité ; ainsi, elle peut être véhiculée sous forme de liposomes, virosomes, nanosphères, microsphères ou microcapsules.
L'invention a également pour objet des anticorps, monoclonaux ou polyclonaux, dirigés contre les peptides selon l'invention.
Les anticorps monoclonaux sont, de préférence, humanisés et produits par la voie recombinante. Selon un autre aspect de l'invention, ils sont obtenus par la méthode de librairie de phages.
De préférence, l'anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments, est caractérisé en ce qu'il est capable de se fixer spécifiquement sur un épitope ou déterminant des peptides non glycosylés selon l'invention.
Les anticorps monoclonaux pourront avantageusement être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par Kohler et Milstein en 1975 (Nature, 256:495-497, 1975).
Les anticorps polyclonaux pourront être préparés, par exemple par immunisation d'un animal, en particulier une souris ou un lapin, avec le peptide selon l'invention associé à un adjuvant de la réponse immunitaire, puis purification des anticorps spécifiques contenus dans le sérum des animaux immumsés sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été fixée, ledit peptide ayant servi d'antigène. Les anticorps de l'invention comprennent également tout fragment dudit anticorps monoclonal capable de se fixer sur un épitope du peptide selon l'invention sur lequel se fixe l'anticorps monoclonal ou polyclonal dont ledit fragment est issu. Des exemples de tels fragments incluent en particulier des anticorps monoclonaux simple chaîne ou des fragments monovalents Fab ou Fab' et des fragments divalents tels que F(ab')2, qui possèdent la même spécificité de fixation que l'anticorps monoclonal ou polyclonal dont ils sont issus. Un fragment selon l'invention pourra également être un fragment Fv simple chaîne produit par des méthodes connues de l'homme de l'art et telles que décrites par exemple par Skerra et al. (Science, 240:1038-1041, 1988) et King et al. (Biochemical J., 290:723-729, 1991).
Selon la présente invention, des fragments d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux de l'invention peuvent être obtenus à partir des anticorps monoclonaux ou polyclonaux tels que décrits précédemment par des méthodes telles que la digestion par des enzymes, comme la pepsine ou la papaïne et/ou par clivage des ponts disulfures par réduction chimique. D'une autre manière, les fragments d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux compris dans la présente invention peuvent être synthétisés par des synthétiseurs automatiques de peptides tels que ceux fournis par la société Applied Biosystems, etc., ou peuvent être préparés manuellement en utilisant des techniques connues de l'homme de l'art et telles que décrites par exemple par Geysen et al. (J. Immunol. Methods, 102:259-274, 1978).
En général, pour la préparation d'anticorps monoclonaux, polyclonaux ou leurs fragments, on pourra se référer aux techniques qui sont en particulier décrites dans le manuel « Antibodies » (Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications pp. 726, 1988) ou à la technique de préparation à partir d'hybridomes décrite par Kohler et Milstein en 1975.
Les anticorps monoclonaux humanisés selon l'invention ou leurs fragments peuvent être préparés par des techniques connues de l'homme de l'art (Carter et al., PNAS, 89: 4285-4289, 1992 ; Mountain, et al., Biotechnol. Genêt. Eng. Rev., 10:1-142, 1992). De tels anticorps monoclonaux humanisés selon l'invention sont préférés pour leur utilisation dans des méthodes thérapeutiques. Les anticorps de l'invention, ou leurs fragments pourront également être marqués par un marquage de type enzymatique, fluorescent ou radioactif.
Les anticorps monoclonaux marqués selon l'invention ou leurs fragments incluent par exemple des anticorps dits immunoconjugués qui peuvent être conjugués par exemple avec des enzymes telles que la péroxydase, la phosphatase alkaline, la β-D- galactosidase, la glucose oxydase, la glucose amylase, l'anhydrase carbonique, Pacétyl- cholinestérase, le lysozyme, la malate déhydrogénase ou la glucose-6 phosphate déhydrogénase ou par une molécule comme la biotine, la digoxigénine ou la 5-bromo- désoxyuridine. Des marqueurs fluorescents peuvent être également conjugués aux anticorps monoclonaux ou leurs fragments de l'invention et incluent notamment la fluorescéine et ses dérivés, la rhodamine et ses dérivés, la GFP (GFP pour « Green
Fluorescent Protein »), le dansyl, l'umbelliférone etc.. Dans de tels conjugués, les anticorps monoclonaux de l'invention ou leurs fragments peuvent être préparés par des méthodes connues de l'homme de l'art. Ils peuvent être couplés aux enzymes ou aux marqueurs fluorescents directement ou par l'intermédiaire d'un groupe espaceur ou d'un groupe de liaisons tel qu'un polyaldéhyde, comme le glutaraldéhyde, l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), l'acide diéthylènetriaminepentaacétique
(DPTA), ou en présence d'agents de couplage tels que le périodate etc.. Les conjugués comportant des marqueurs de type fluorescéine peuvent être préparés par réaction avec un isothiocyanate.
D'autres conjugués peuvent inclure également des marqueurs chimioluminescents tels que le luminol et les dioxétanes ou des marqueurs bioluminescents tels que la luciférase et la luciférine.
Parmi les marqueurs pouvant être fixés sur l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention, on préfère également les marqueurs radioactifs tels que
14C, 36C1, 57Co, 58Co, 51Cr, 152Eu, 59Fe, 3H, 125I, 131I, 32P, 33P '35S, 75SE et 99ιnTc qui peuvent être détectés par des moyens connus tels que par exemple le compteur gamma ou à scintillations ou par autoradiographie.
Les peptides et/ou les anticorps selon l'invention peuvent, selon un mode de mise en œuvre de l'invention, entrer dans la composition d'un kit de diagnostic.
Les peptides et les anticorps selon l'invention peuvent être utilisés à titre de médicament, et plus particulièrement pour la préparation d'une composition destinée au traitement préventif ou curatif des affections provoquées par le NRS humain, sous- groupe A ou B, ou par le NRS bovin, de préférence par le NRS humain, notamment de sous-groupe A.
Ainsi, l'invention concerne encore l'utilisation d'un peptide immunogène dérivé de la protéine G du NRS non glycosylé et comportant au moins la séquence peptidique 185-193 de la protéine G du NRS humain, sous-groupe A ou B, ou bovin, de préférence du NRS humain du sous-groupe A ou B, notamment du sous-groupe A de séquence SEQ ID Νo. 4, ou comportant une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec lesdites séquences peptidiques 185-193 de ces protéines G, ou d'un anticorps selon l'invention :
- pour la préparation d'une composition pharmaceutique, préférentiellement d'un vaccin, destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des affections provoquées par le NRS humain, sous-groupe A ou B, ou bovin et n'induisant pas d'immunopathologies ; ou encore - pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre le NRS et n'induisant pas d'immunopathologies.
Pour ces deux utilisations ci-avant selon l'invention, parmi lesdits peptides immunogènes, on préfère les peptides immunogènes selon la présente invention, en particulier : a) ceux dérivés de la protéine G du NRS non glycosylé comportant au moins la séquence peptidique 148-193 de la protéine G du NRS humain du sous-groupe A ou B, ou du NRS bovin, ou une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec lesdites séquences peptidiques 148-193 de ces protéines G, et dont le fragment 185- 193 est identique à 100 % au fragment 185-193 desdites protéines G ; ou b) ceux tels que ci-avant définis en a) et dont la séquence est comprise dans la séquence 130-230 de ces protéines G, notamment les peptides immunogènes non glycosylés de séquence SEQ ID Νo. 1, Νo. 2 et Νo. 3 notés respectivement G2A (ou G2Νa), G2B et G2V, le peptide G2A étant particulièrement préféré.
Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. Dans ces exemples, on se référera aux figures suivantes : Figure 1 : Migration sur gel SDS Page de la protéine BBG2Na exprimée dans E. coli et dans des cellules HΕp-2 avant et après traitement avec des enzymes de déglycosylation. Figure 2 : Antigénicité de BBG2Na non-glycosylé et glycosylé vis-à-vis d'un panel d'anticorps monoclonaux spécifiques pour le fragment de la protéine G du NRS et pour la partie BB de BBG2Νa.
GlyBBG2Na = BBG2Na glycosylé ; BBG2Na = BBG2Na non-glycosylé. Les anticorps monoclonaux 5B7, 5C2, 8A3, 11F7 et 18D1 sont spécifiques pour le fragment de la protéine G du NRS dans BBG2Νa. L'anticorps monoclonal 13F 10 est spécifique pour la partie BB de BBG2Na.
Figure 3 : Immunogénicité de BBG2Na glycosylé et non-glycosylé chez la souris.
BBG2Na = BBG2Na non-glycosylé ; gBBG2Na = BBG2Na glycosylé ; Cell Ag = antigène contrôle cellulaire ; FI-RSV = VRS inactivé par le formol ; PBS = phosphate buffered saline. Figure 4 : Efficacité protectrice de BBG2Na glycosylé et non-glycosylé chez la souris BALB/c.
BBG2Na = BBG2Na non-glycosylé ; gBBG2Na = BBG2Na glycosylé ; Cell Ag = antigène contrôle cellulaire ; FI-RSV = VRS inactivé par le formol ; PBS = phosphate buffered saline. Figure 5 : Nombre de cellules nucléées infiltrant les poumons après challenge et populations cellulaires présentes dans ces poumons représentées par le rapport CD4/CD8.
Figure 6 : Nombre de granulocytes (LGL) et de cellules marquées par l'anticorps RB6- 8B5 (polynucléaires). Figure 7 : La sécrétion des cytokines Th2 (IL-5 et IL- 10) ; augmentation significative de la sécrétion des cytokines chez les souris immunisées avec gBBG2Na et FI- VRS par rapport à celles traitées avec BBG2Na.
On peut également noter que le pourcentage de lymphocytes de poumon sécrétant des cytokines de type Th2 chez les souris immunisées avec gBBG2Na et FI- VRS est similaire. EXEMPLES
Exemple I
Le peptide de fusion BBG2Na est composé d'un fragment très conservé de la protéine G du VRS-A, fra ment dénommé G2Na (fragment 130-230 de la protéine G du VRS humain de type A), fusionné par génie génétique au site de liaison à l'albumine de la protéine G du streptocoque, site appelé BB. Ce peptide ainsi qu'une méthode de production dudit peptide sont décrits dans l'art antérieur et notamment dans la demande de brevet internationale de brevet WO 95/27787.
Afin de mettre en évidence l'importance de la non-glycosylation de ce peptide, nous avons produit une protéine recombinante, désignée BBG2Na, dans E.coli et dans des cellules eucaryotes HEp-2. Les protéines ont été purifiées sur des colonnes de HSA- sepharose. La confirmation de la glycosylation et la non-glycosylation des protéines exprimées dans les systèmes eucaryotiques et procaryotiques, a été démontrée par le traitement des protéines avec des enzymes de déglycosylation et l'analyse des produits sur gel SDS-PAGE de 9 %.
Comme mise en évidence dans la figure 1, la protéine issue de l'expression procaryotique migre à la même hauteur, peu importe le traitement ou non avec les enzymes de déglycosylation. Tout au contraire, la protéine dérivée de l'expression eucaryotique migre moins que la protéine procaryotique avant traitement enzymatique, après déglycosylation elle migre à la même hauteur que la protéine procaryotique.
Exemple II
Pour déterminer si BBG2Na issu d'E. coli (non-glycosylé) ou des cellules HΕp-2 (glycosylé) sont similaires ou non du point de vue antigénique, les 2 formes de protéines ont été testées en ΕLISA contre un panel d'anticorps monoclonaux spécifiques de BBG2Na. Brièvement, les protéines ont été mises en contact avec ces anticorps à la même concentration sur des plaques ΕLISA et le titre en anticorps monoclonal a été déterminé en fonction de la dernière dilution de l'anticorps donnant une D.O. supérieure à 2 fois le bruit de fond de l'essai. Comme il peut être constaté dans la figure 2, les 2 formes de BBG2Na n'ont pu être distinguées entre elles, ce qui indique que les protéines sont très similaires d'un point de vue antigénicité. Exemple III
Afin de comparer l'immunogénicité des 2 formes de BBG2Na, des souris BALB/c ont été immunisées 3 fois (à J0, J14 et J24) par voie intra péritonéale (ip) par 2 μg de BBG2Na non-glycosylé ou glycosylé, ou par l'antigène cellulaire HEp-2 contrôle, FI- VRS ou PBS. Deux semaines après la dernière immunisation, les sérums des souris ont été prélevés et ont été testés en ELISA contre des antigènes de VRS, comme décrit par Power, U.F. et al. (Virology, 230:155-166, 1997). Comme démontré dans la figure 3, les souris immunisées avec le peptide BBG2Na glycosylé ou non- glycosylé ont eu pratiquement le même titre en anticorps anti-VRS. Donc, les deux formes de la protéine sont aussi très similaires du point de vue de leur immunogénicité.
Exemple IN
Afin de mettre en évidence la capacité protectrice des deux formes de BBG2Νa les souris décrites ci-dessus dans l'exemple 3 ont été challengées par le VRS-A, 10 jours après la dernière immunisation. La figure 4 montre que toutes les 2 formes ont permis d'obtenir une protection dans les poumons d'une manière stérilisante contre l'infection avec le VRS. Ces résultats indiquent que BBG2Na non-glycosylé et glycosylé sont autant protecteurs l'un que l'autre chez la souris.
Exemple V
Les résultats présentés en figures 2, 3 et 4 indiquent que le pouvoir vaccinal du peptide revendiqué n'est pas affecté du fait d'être non-glycosylé mais au contraire, il reste aussi antigénique, immunogénique et efficace en terme de protection des poumons contre un challenge avec le VRS qu'un peptide glycosylé dérivé de la protéine G native ou exprimé dans des cellules eucaryotes.
Une étude d'immunopathologie a été réalisée chez la souris BALB/c (8 souris par groupe), en comparant les peptides de fusion BBG2Na glycosylé (gBBG2Na), non- glycosylés (BBG2Na) et le FI-NRS.
Les souris sont immunisées à J0, J14, J24. Elles sont challengées avec 10 TCID50 du RSN-A à J34 et sont sacrifiées, après ponction sanguine intracardiaque, 7 jours plus tard. Les poumons sont prélevés, réduits en petits fragments et traités par un mélange enzymatique de coUagénase, Dnase et Dispase comme décrit (H. Plotnicky- Gilquin et al., Nirol., 258:128-40, 1999). Les cellules infiltrantes pulmonaires sont numérées puis marquées à l'aide d'anticorps fluorescents spécifiques des différents types de populations cellulaires. Les cytokines intracellulaires sont mises en évidence après stimulation des cellules et marquage intracellulaire par des anticorps spécifiques. L'analyse des cellules marquées est réalisée en utilisant le FACSvantage (Becton Dickinson). I. Analyse des cellules pulmonaires
1. Au niveau de l'analyse des cellules pulmonaires, le nombre de cellules nucléées infiltrant les poumons après challenge est augmenté significativement dans les groupes de souris immunisées avec gBBG2Na et FI-NRS. De même, on constate un changement qualitatif des populations cellulaires présentes dans ces poumons, avec un rapport CD4/CD8 significativement augmenté comme cela peut se voir sur la figure 5.
2. De même, le nombre de granulocytes (LGL) et de cellules marquées par l'anticorps RB6-8B5 (polynucléaires) est également considérablement augmenté dans les groupes immunisés avec gBBG2Νa et FI- VRS (voir figure 6).
IL Sécrétion des cytokines Th2 En accord avec les changements quantitatifs et qualitatifs observés au niveau des cellules infiltrantes pulmonaires, on observe une augmentation significative de la sécrétion des cytokines Th2 (IL-5 et IL- 10) chez les souris immunisées avec gBBG2Na et FI- VRS par rapport à celles traitées avec BBG2Na. Le profil de réponses avec BBG2Na est comparable à celui des souris traitées avec l'antigène cellulaire seul. La sécrétion des cytokines Th2 (IL-5 et IL-10) est représentée à la figure 7.
L'augmentation des infiltrats cellulaires, l'augmentation du rapport CD4/CD8, l'apparition des polynucléaires et l'augmentation de la sécrétion de cytokines Th2 sont caractéristiques pour l'induction d'une immunopathologie induite par le VRS. Il a ainsi été démontré que la glycosylation de BBG2Na conduit à une potentialisation de son profil immunopathologique, avec des effets comparables à ceux du FI- VRS.

Claims

REVENDICATIONS
1/ Peptide immunogène dérivé de la protéine G du VRS, caractérisé en ce que ledit peptide est non-glycosylé et comporte au moins la séquence peptidique 148- 193 de la protéine G du VRS humain du sous-groupe A ou B, ou du VRS bovin, ou une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec lesdites séquences peptidiques
148-193 de ces protéines G.
2/ Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite séquence peptidique 148-193 de la protéine G du VRS du sous-groupe A ou B comprend en position 173, 176, 182 et 186 une cystéine.
3/ Peptide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit peptide immunogène dérivé de la protéine G du VRS a pour séquence une séquence choisie parmi les séquences 148-193, 148-200, 148-230, 140-193, 140-230, 130-193 et 130- 200. 4/ Peptide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit peptide immunogène dérivé de la protéine G du VRS a pour séquence une séquence choisie parmi les séquences : a) SEQ ID Nos. 1 à 3 ; b) SEQ ID Nos. 1 à 3 comprenant chacune d'entre elles les mutations Cl 73 S et C186S ; c) les séquences 140-200, 140-198, 140-198, 140-196 et 140-194 des séquences telles que décrites en a) ou b) ; d) SEQ ID No. 1 comprenant les 6 mutations F163S, F165S, F168S, F170S, C173S et C186S ; e) SEQ ID No. 1 comprenant les 4 mutations N191S, K192N, G195K et T198P ; f) SEQ ID No. 1 comprenant les 4 mutations N157K, N160K, N161D et F163Y ; et g) SEQ ID No. 1 comprenant les 8 mutations N157K, N160K, N161D, F163Y, N191S,
K192N, G195K et T198P ; ou h) les séquences 124-203 et 1-230 de la protéine G sauvage de VRS.
5/ Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient dans un milieu pharmaceutiquement acceptable, au moins un peptide selon l'une des revendications 1 à 4. 61 Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle contient en outre au moins une protéine porteuse et/ou un adjuvant.
Il Composition selon la revendication 5 ou 6, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique contient en outre un adjuvant, préférentiellement choisi dans le groupe d'adjuvant comprenant le MPL-A, le Quil-A, 1TSCOM, le Diméthyl Dioctadécyl Ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC), l'alum, l'adjuphos, les CpG, la Leif, la CT, la LT et les versions détoxifiées de la CT ou la LT.
8/ Composition selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisée en ce que ledit peptide est associé, par mélange ou par couplage, à la protéine porteuse et/ou à l'adjuvant.
9/ Composition selon l'une des revendications 5 à 8, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique contient en outre un deuxième antigène, immunogène ou haptène du VRS et/ou un antigène, immunogène ou haptène dérivé de micro-organisme responsable de pathologies des voies aériennes choisi parmi les para influenza virus (PIV 1, 2, 3, 4), l'influenza virus (A et B), les hantavirus, les streptocoques, les pneumocoques, haemophilus influenza type b, les rhinovirus, les coronovirus et les méningocoques.
10/ Composition selon l'une des revendications 5 à 9, caractérisée en ce que ledit milieu pharmaceutiquement acceptable est constitué d'eau, d'une solution aqueuse saline ou d'une solution aqueuse à base de dextrose et/ou de glycérol.
11/ Composition selon l'une des revendications 5 à 10, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité. 12/ Anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un peptide selon l'une des revendications 1 à 4.
13/ Anticorps selon la revendication 12, caractérisés en qu'ils sont humanisés.
14/ Kit de diagnostic caractérisé en ce qu'il comprend un peptide selon l'une des revendications 1 à 4 ou un anticorps selon la revendication 12 ou 13. 15/ Utilisation d'un peptide immunogène dérivé de la protéine G du VRS non glycosylé et comportant au moins la séquence peptidique 185-193 de la protéine G du
VRS humain, sous-groupe A ou B, ou bovin, ou comportant une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec lesdites séquences peptidiques 185-193 de ces protéines G, ou d'un anticorps selon la revendication 12 ou 13, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement prophylactique ou thérapeutique des affections provoquées par le VRS et n'induisant pas d'immunopathologies. 16/ Utilisation d'un peptide immunogène dérivé de la protéine G du VRS non glycosylé et comportant au moins la séquence peptidique 185-193 de la protéine G du VRS humain, sous-groupe A ou B, ou bovin, ou comportant une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec lesdites séquences peptidiques 185-193 de ces protéines G, ou d'un anticorps selon la revendication 12 ou 13, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement prophylactique ou thérapeutique des affections provoquées par le VRS, sous-groupe A ou B et n'induisant pas d'immunopathologies.
17/ Utilisation selon l'une des revendications 15 ou 16, caractérisée en ce que ledit peptide immunogène dérivé de la protéine G du VRS non glycosylé est un peptide selon l'une des revendications 1 à 4.
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Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005007189A1 (fr) * 2003-07-15 2005-01-27 Id Biomedical Corporation Of Quebec Vaccin purifie contre l'infection a virus respiratoire syncytial
WO2005027978A3 (fr) * 2003-09-19 2005-05-19 Novo Nordisk As Nouveaux derives de glp-1
WO2005028516A3 (fr) * 2003-09-19 2005-09-29 Novo Nordisk As Nouvelles etiquettes d'affinite pour les proteines plasmiques
US8513192B2 (en) 2009-01-22 2013-08-20 Novo Nordisk A/S Stable growth hormone compounds resistant to proteolytic degradation
US8536122B2 (en) 2005-03-18 2013-09-17 Novo Nordisk A/S Acylated GLP-1 compounds
US8603972B2 (en) 2005-03-18 2013-12-10 Novo Nordisk A/S Extended GLP-1 compounds
US8779109B2 (en) 2010-01-22 2014-07-15 Novo Nordisk Health Care Ag Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy
US8841249B2 (en) 2009-08-06 2014-09-23 Novo Nordisk A/S Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy
US8865868B2 (en) 2008-08-06 2014-10-21 Novo Nordisk Healthcare Ag Conjugated proteins with prolonged in vivo efficacy
US9487593B2 (en) 2010-07-07 2016-11-08 Artificial Cell Technologies, Inc Respiratory syncytial virus antigenic compositions and methods
US11045523B2 (en) 2013-04-05 2021-06-29 Novo Nordisk Healthcare Ag Formulation of growth hormone albumin-binder conjugate
WO2024084785A1 (fr) * 2022-10-20 2024-04-25 一般財団法人阪大微生物病研究会 Composition appropriée pour être utilisée en tant que vaccin contre le virus rs

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX338357B (es) 2010-01-22 2016-04-13 Novo Nordisk Healthcare Ag Compuestos estables de la hormona de crecimiento.

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2718452B1 (fr) * 1994-04-06 1996-06-28 Pf Medicament Elément d'immunogène, agent immunogène, composition pharmaceutique et procédé de préparation.
FR2726576B1 (fr) * 1994-11-07 1997-01-31 Pf Medicament Production de peptides analogues de peptides hydrophobes, peptide recombinant, sequence d'adn correspondante
FR2766192B1 (fr) * 1997-07-17 2001-07-13 Pf Medicament Epitopes du vrs et anticorps les comportant, utiles dans le diagnostic et la therapie

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7368537B2 (en) 2003-07-15 2008-05-06 Id Biomedical Corporation Of Quebec Subunit vaccine against respiratory syncytial virus infection
WO2005007189A1 (fr) * 2003-07-15 2005-01-27 Id Biomedical Corporation Of Quebec Vaccin purifie contre l'infection a virus respiratoire syncytial
EP2204188A1 (fr) * 2003-07-15 2010-07-07 ID Biomedical Corporation of Quebec Vaccin purifié contre l'infection à virus réspiratoire syncytial
US7897560B2 (en) 2003-09-19 2011-03-01 Novo Nordisk A/S Plasma protein affinity tags
JP2007537981A (ja) * 2003-09-19 2007-12-27 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ 新規の血漿タンパク質親和性タグ
JP2007505840A (ja) * 2003-09-19 2007-03-15 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ 新規ｇｌｐ−１誘導体
AU2004273573B2 (en) * 2003-09-19 2010-04-22 Novo Nordisk A/S Albumin-binding derivatives of therapeutic peptides
WO2005028516A3 (fr) * 2003-09-19 2005-09-29 Novo Nordisk As Nouvelles etiquettes d'affinite pour les proteines plasmiques
WO2005027978A3 (fr) * 2003-09-19 2005-05-19 Novo Nordisk As Nouveaux derives de glp-1
US8536122B2 (en) 2005-03-18 2013-09-17 Novo Nordisk A/S Acylated GLP-1 compounds
US8603972B2 (en) 2005-03-18 2013-12-10 Novo Nordisk A/S Extended GLP-1 compounds
US8865868B2 (en) 2008-08-06 2014-10-21 Novo Nordisk Healthcare Ag Conjugated proteins with prolonged in vivo efficacy
US8513192B2 (en) 2009-01-22 2013-08-20 Novo Nordisk A/S Stable growth hormone compounds resistant to proteolytic degradation
US8841249B2 (en) 2009-08-06 2014-09-23 Novo Nordisk A/S Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy
US8779109B2 (en) 2010-01-22 2014-07-15 Novo Nordisk Health Care Ag Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy
US9695226B2 (en) 2010-01-22 2017-07-04 Novo Nordisk Healthcare Ag Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy
US9487593B2 (en) 2010-07-07 2016-11-08 Artificial Cell Technologies, Inc Respiratory syncytial virus antigenic compositions and methods
US11045523B2 (en) 2013-04-05 2021-06-29 Novo Nordisk Healthcare Ag Formulation of growth hormone albumin-binder conjugate
WO2024084785A1 (fr) * 2022-10-20 2024-04-25 一般財団法人阪大微生物病研究会 Composition appropriée pour être utilisée en tant que vaccin contre le virus rs

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002058725A3 (fr) 2003-01-09
AU2002233457A1 (en) 2002-08-06
EP1353690A2 (fr) 2003-10-22
FR2819810A1 (fr) 2002-07-26
FR2819810B1 (fr) 2004-05-28

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