WO2002069984A2 - Verwendung von hyaluronsäure-uroniden zur behandlung von entzündlichen vorgängen - Google Patents

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Waltraud Hertel
Jörg-Hermann Ozegowski
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Hans-Knoll-Institut fur Naturstoff-Forschung Ev
Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Leibniz Institut fuer Naturstoff Forschung und Infektionsbiol eVi
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Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
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    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]

Definitions

  • the invention relates to the use of systemically and intracorporeally topical hyaluronic acid uronides for the treatment of inflammatory processes and for promoting health in humans and animals.
  • the invention can be used with utility in the pharmaceutical industry as well as the food and feed industries.
  • hyaluronic acid in humans and animals has a multitude of effects which promote health, well-being and appearance.
  • the high-molecular hyaluronic acids mainly cause mechanical effects in the body.
  • the high-molecular hyaluronic acid causes the turgor, which is responsible for the firmness and thus for the youthful appearance.
  • Degradation processes in which low-molecular oligohyaluronic acids are formed, allow the equilibrium concentration of hyaluronic acid in the organs to reach a low level, which is detrimental to health. This deficit can be compensated for by an increased incorporeal supply of high-molecular but also of low-molecular hyaluronic acid.
  • a food can be obtained from cockscombs by subjecting the tissue to various cleaning and digestion procedures, which also leads to a partial breakdown of the hyaluronic acid. It is pointed out that hyaluronic acid in humans and animals develops a multitude of beneficial effects, which promote health, in particular in the case of traumatic tissue symptoms in the joint areas, and also the condition and appearance.
  • US 4,808,576 protects systemically acting injection preparations which can be injected or applied topically dermally at locations which are not identical to the location of the traumatic tissue changes.
  • the sites of action in the healing of traumatized tissue differ from the application sites, e.g. the treatment of arthritis of the joints in accordance with US 4,808,576 does not require intra-articular application.
  • Hyaluronic acid is also proposed as a tolerance-improving component in peritoneal perfusion solutions (JP 1.151.462).
  • DE 19853066 protects low-molecular fragments of hyaluronic acid (oligohyaluronic acids) for the production of vaccines, produced by digestion with hyaluronidase from high-molecular hyaluronic acid, and DE 198339113 also uses low-molecular hyaluronic acid produced by digestion with hyaluronidase in the production of dendritic cells.
  • oral preparations are also proposed.
  • the patents state that the polymeric compounds pass through the gastrointestinal tract and are absorbed largely undamaged in the small intestine through the intestinal wall and via the blood or lymph in the Body are transported. The increased supply of mucopolysaccharides leads to a health-promoting systemic effect, especially in organs in which there is a deficiency in hyaluronic acid.
  • hyaluronic acid is obtained from cockscombs by subjecting the tissue to various cleaning and digestion procedures.
  • JP 9.262.057 describe a special food that i.a. Contains hyaluronic acid and is recommended for halitosis.
  • a food that promotes health and beauty contains special mucopolysaccharides and nucleic acids.
  • the mucopolysaccharides consist of a complex of hyaluronic acid, chondroitin sulfate and collagen as well as nucleic acids.
  • WO 97/25051 describes preparations with hyaluronic acid to be taken orally to prevent or prevent diseases and therapeutic preparations consisting of hyaluronan, a hyaluronic acid which additionally contains protein of animal origin crosslinked with formalin, in particular bird protein.
  • JP 11.124.401 protects the production of oligohyaluronic acids with molar masses less than 10,000 D with a hyaluronic acid-degrading enzyme and uses ultrafilter modules with a cut-off not less than 10,000 D when removing the enzyme.
  • JP 09.098.739 also describes the production of low molecular weight hyaluronic acid.
  • oligohyaluronic acids or low molecular weight hyaluronic acids are used as a food additive or for pharmaceutical and cosmetic applications, e.g. B. proposed with effect against aging of the skin.
  • RU 2.137.402 describes a special additive to dietary food, consisting of dried algae biomass with the addition of hyaluronic acid and possibly antioxidants, vitamin C and starch.
  • JP 10.056.983 uses hyaluronic acid or cockerel extracts to improve the texture of gel-like foods.
  • JP 4.197.145 uses hyaluronic acid in an amount of 0.05 to 0.8% for the preparation of starchy foods such as pastries, cooked rice or cakes. This way, an improved structure is obtained after the baking process and the food stays fresh longer.
  • animal binding proteins that bind to glycosaminoglycans can thereby additionally be chemically crosslinked. They are then immobilized on this material as impurities which are difficult to dissolve and cannot be removed by any cleaning procedures, such as, for example, commercially bundled hyaluronan. It is also disadvantageous that the effect of the hyaluronic acid obtained in this way on the traumatic tissue is only insufficiently characterized.
  • tissue absorption of the preparations of higher molecular weight hyaluronic acid usually used with molecular weights between about 100,000 D and about 2,500,000 D is relatively low due to the high molecular weights; the greater part is excreted via the digestive tract.
  • Another general disadvantage of high-molecular hyaluronic acid is that it can only be used in injectables due to the high viscosity of its aqueous solutions up to a concentration of about 20 mg / ml.
  • hyaluronic acid oligohyaluronic acids
  • hydrolytic cleavage of the hyaluronic acid with hyaluronidase was always carried out in order to break down the high molecular weight hyaluronic acid hydrolytically into small fragments with the addition of water.
  • the hyaluronidase is currently generally obtained from animal tissue, in particular from cattle testicles. The use of hyaluronidase of animal origin such as e.g. from cattle testicles due to the risk of transmission of infectious material from the animal to the user.
  • the enzyme hyaluronate lyase was used in WO 0.038.647 in order to produce low-molecular hyaluronic acid fragments. Due to the specific cleavage mechanism of this enzyme, a double bond is formed on the glucuronyl residue in the ⁇ -4,5-position. The cleavage of hyaluronic acid with hyaluronate lyase accordingly leads to chemical cleavage products which differ from the hydrolysis products of hydrolysis with hyaluronidase. The double bonds after cleavage with hyaluronate lyase change the physiological properties of the cleavage products.
  • WO 0.038.647 describes the epidermal topical application of formulations with hyaluronic acid uronides to protect, maintain or reconstruct the normal function and structure of human and animal skin and / or to prevent environmental, including UV-related Skin or mucous membrane damage described by UV radiation.
  • hyaluronic acid uronides as active ingredients for the treatment of inflammatory processes in human and animal tissues, the Uronids are administered intracorporeally and act systemically.
  • uronides of hyaluronic acid with molecular weights less than 80,000 D, preferably with molecular weights between 5,000 and 30,000 D are used.
  • the uronides contain less than 0.5%, less than 0.05% proteins for applications in injectables.
  • a characteristic feature of the hyaluronic acid uronides is their in vitro proven, previously unknown effect of being more angiogenic and anti-inflammatory than corresponding amounts of high-molecular hyaluronic acid or the low-molecular hyaluronic acid obtained with hyaluronidase.
  • An advantage of the supply of angiogenic hyaluronic acid uronides in people and animals with undersupplied hyaluronic acid is that they improve the growth of blood vessels in traumatized tissues or promote health or accelerate healing.
  • the intracorporeal administration of the uronides means that the rate of degradation of the body's own high-molecular hyaluronic acid, which is a pool for the body's own low-molecular hyaluronic acid, which has beneficial physiological effects, is reduced.
  • the supply of external hyaluronic acid uronides has a positive influence on the pool of high molecular hyaluronic acid because the natural outflow to the low molecular hyaluronic acids is reduced.
  • Another advantage of using the uronides is that they do not produce any disadvantageous viscosity in aqueous solution for the use according to the invention.
  • uronides according to the invention are new; So far, hyaluronic acid uronides have not been proposed for oral applications or as injectables, infusion solutions or rinsing solutions. The angiogenic and anti-inflammatory properties of uronides have not been described.
  • the epidermal topical applications as free radical scavengers or the use as protection against UV rays are expressly not part of the present invention.
  • Possibilities according to the invention for intracorporeal application of the uronides are the use in the form of an injection preparation, a rinsing solution or an infusion solution, with which the uronids reach the body directly without going through the digestive tract.
  • Flushing solutions are solutions that flush body cavities and wound cavities to achieve a dual effect, removing harmful substances, and aiding healing.
  • isotonic sterile solutions which contain between 1 mg / ml and 200 mg / ml hyaluronic acid uronides.
  • uronides When used as perfusion, infusion or rinsing solutions, these contain between 0.1 g / l and 100 g / l uronides as well as auxiliary substances and possibly other active substances or medicines.
  • Physiological saline is preferably used as the solvent.
  • Another way according to the invention for indirect administration is to add the uronides to food or feed.
  • concentrated uronides are present in non-perishable or storage-stable, unmixable and defined form in the foodstuffs or feedstuffs in various stages of the food or feed preparation. They can also be used directly in food supplements.
  • the uronides are proposed as food supplements in solid form, for example as powders, pellets, capsules or tablets or liquid formulations such as beverage additives, ready-made drinks or pasty, gel-like or semi-solid form. Without thereby restricting the invention, up to 30 g uronide per day without adverse health effects per 80 kg body weight are recommended for human applications.
  • ⁇ -sitosterol, ⁇ -tocopherol, vitamins and / or lecithin are added.
  • higher doses can be used depending on their weight. The possibility of realizing such a high daily dose represents a clear advantage of the invention compared to the oral intake of high-molecular or high-viscosity hyaluronic acid known per se.
  • the uronides used in accordance with the invention are in any case produced in a manner known per se by the action of an endogenously cleaving hyaluronate lyase from microorganisms, for example with an endo-hyaluronate lyase from a Streptococcus.
  • the purified enzyme is placed in a solution of high molecular hyaluronic acid with molecular weights greater than 500,000 D.
  • the concentration of hyaluronic acid in the solutions is between 1 g / l to 20 g / l.
  • the starting solutions can be prepared by dissolving hyaluronic acid in water or buffer solutions.
  • a more economical way of manufacturing is to start from hyaluronic acid solutions that are produced in the manufacturing process of hyaluronic acid.
  • the advantage of the last production variant is that a drying step can be avoided.
  • the cleavage reaction is interrupted by increasing the temperature above 50 ° C. by denaturing the hyaluronate lyase.
  • the reaction and the end of the reaction are monitored photometrically via the formation of a double bond in the ⁇ -4,5-position on the glucuronyl radical with an absorption maximum at 232 nm.
  • the molecular weights are determined using a laser light scattering method.
  • proteases in particular microbial or vegetable origin.
  • Neutral proteases of plant or microbial origin are preferably used as proteases.
  • the optionally added proteases or other high-molecular impurities such as lipoproteins still present in the hyaluronic acid can be removed by ultrafiltration with an ultrafilter module whose cut-off can be a maximum of 0.7 to 0.3 times lower than the average molar mass of the uronides. The uronide-free retentate is discarded and the run is concentrated with an ultrafilter.
  • the solution or the retentate which contains the uronides and possibly cleavage products of the protease treatment, is concentrated by ultrafiltration via ultrafilter modules.
  • the ultrafilter must preferably have a cut-off for retentate formation which is 15 to 35 times lower than the average molar mass of the uronides present after the enzymatic degradation.
  • Enrichment with an ultrafilter of 1 kD gives a concentrated uronide solution with an average molecular weight between 20,000 and 30,000 D.
  • the uronide-containing concentrates are brought into a solid form by one of the measures such as precipitation in alcohols such as ethanol, freeze drying or spray drying.
  • a white solid product is obtained, which easily dissolves in water.
  • the concentrate is precipitated in ethanol or in isobutanol.
  • the solid product is collected and dried.
  • CAM chorionallantois membrane
  • Uronides with molecular weights of 30 kD, 100 kD and 235 kD are placed on a CAM irritated with 0.25% sodium dodecyl sulfate (SDS) and the angiogenic reactions are assessed subjectively after 24 hours.
  • Fertilized chicken eggs are incubated for 3 days under standard conditions. On the third day of incubation, the eggs are disinfected with 70% ethanol. After dipping in ethanol, the eggs are air dried for a few minutes. During this time the embryo positions itself in the normal position.
  • the hatching eggs are opened at the bottom and the contents are carefully transferred into sterile petri dishes (20 mm high, 200 mm diameter).
  • 2.5 ml cell culture medium 89.5% Eagles minimum essential medium, 10% fetal calf serum, 500 lU / ml penicillin and 50 ⁇ g / ml streptomycin
  • the shellless chicken embryos are incubated further in the incubator at 36.5 ° C and over 96% humidity and 0.7% CO 2 concentration.
  • test solution (20 ⁇ l) is superficially applied to one site of damage, the second remains untreated as a control. After 24 hours, the CAM reaction and the formation of new vessels are assessed verbally on the color monitor image.
  • the angiogenesis of the injured CAM is documented with the ' Stemi 2000-C, Schott cold light source ' KL 1500 ", color camera 2 1-CCD, type: MC-1009S, color monitor and JVC video cassette recorder SR-S388E.
  • the 30 kD, 100 kD and 235 kD hyaluronic acid uronides significantly accelerate the angiogenic reactions in the first 24 hours after CAM irritation of the ex ovo-incubated chicken embryos after SDS treatment.
  • hyaluronic acid 50 g are dissolved in 4.9 L of 0.01 M acetate buffer pH 7.0 at 4 ° C. overnight with stirring. The solution is then heated to 30 ° C. in a thermostat while stirring. For cleavage, 100 ml of a hyaluronate lyase solution containing 1000 U of hyaluronate lyase / ml of 0.01 M acetate buffer pH 7.0 are added to this solution.
  • Hyaluronate lyase activity is determined according to the method described above. The 100 ml hyaluronate lyase solution is mixed in as quickly as possible, and the viscosity of the hyaluronic acid solution drops rapidly after only 3 minutes.
  • hyaluronic acid 50 g are dissolved in 4.9 L of 0.01 M acetate buffer pH 7.0 at 4 ° C. overnight with stirring. The solution is then heated to 30 ° C. in a thermostat while stirring. For cleavage, 100 ml of a hyaluronate lyase solution containing 100 U of hyaluronate lyase / ml of 0.01 M acetate buffer pH 7.0 are added to this solution.
  • Hyaluronate lyase activity is determined according to the method described above. The 100 ml hyaluronate lyase solution is mixed in as quickly as possible, the viscosity of the hyaluronic acid solution dropping rapidly after 10 minutes.
  • One hyaluronate lyase unit corresponds to the activity, the 0.05 mg hyaluronic acid in 30
  • the hyaluronic acid is cleaved in accordance with embodiment 2.1.
  • the ultrafiltration step is modified. 50 Anson units of the protease bromelain (Merck Eurolab GmbH) are added. The mixture is stirred at room temperature for 2 hours. The solution is then ultrafiltered through an ultrafilter with a cut off of 20 kD. The run is then concentrated to a retentate volume of 3 l with an ultrafilter with a cut off of 1 kD. The concentrate is then freeze-dried and taken in orally in the form of solutions and orally as a solution or addition to food and feed.
  • Embodiment 4 Embodiment 4
  • 10 g of uronides with an average molecular weight of 20 to 30 kD are mixed with 90 g of dry milk powder, 0.2 g of lecithin, 0.02 g of tocopherol, 1 g of ⁇ -sitosterol and 2 g of sucrose by grinding together and then taken orally as a dietary supplement.
  • cereal starch 90 g are mixed with 10 g of hyaluronic acid uronide in the form of their sodium salt and 0.1 g of a vitamin mixture and taken orally as a dietary supplement.
  • an injection solution containing about 50 mg / ml 50 g of hyaluronic acid uronide with an average molecular weight of 25,000 D in the form of its sodium salt are dissolved in 1 liter of pyrogen-free physiological saline.
  • the solution is sterile filtered, filled into ampoules as a solution for injection and injected into humans or animals.
  • 100 g hyaluronic acid uronide in the form of its sodium salt are dissolved with 100 ml of physiological saline and mixed with 0.02% potassium sorbate, 5 g glucose and 0.1% sorbic acid.
  • the acidity is adjusted to a pH of 5.2 with dilute citric acid. Up to 10 ml of the solution are recommended daily for oral intake by an adult.

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Abstract

Die Erfindung beschreibt die intrakorporale Verwendung von hochaktiven niedermolekularen Hyaluronsäure-Uroniden biotechnischer Herkunft zur Behandlung von entzündlichen Vorgängen und der Förderung der Gesundheit in Mensch und Tier.

Description

Verwendung von Hyaluronsäure-Uroniden zur Behandlung von entzündlichen Vorgängen
Die Erfindung betrifft die Verwendung von systemisch und intrakorporal topisch wirkenden Hyaluronsäure-Uroniden für die Behandlung von entzündlichen Prozessen und zur Förderung der Gesundheit bei Mensch und Tier. Die Erfindung kann mit Nutzen in der pharmazeutischen Industrie als auch für die Nahrungsmittel- und die Futtermittelindustrie eingesetzt werden.
Es ist bekannt, dass Hyaluronsäure in Mensch und Tier, bevorzugt dem monogastrischem Tier, eine Vielzahl die Gesundheit als auch das Befinden und das Aussehen fördernde Wirkungen entfaltet. Die hochmolekularen Hyaluronsäuren bewirken im Körper vor allem mechanische Effekte. Insbesondere entwickeln sie wegen ihrer viskoelastischen Eigenschaften in der Synovialflüssigkeit einen die Gelenke schmierenden Effekt (US 4.801.619, US 5.972.909, US 5.079.236). In der Unterhaut bewirkt die hochmolekulare Hyaluronsäure den Turgor, der die Straffheit und damit für das jugendliche Aussehen verantwortlich ist. Durch Abbauprozesse, bei denen niedermolekulare Oligohyaluronsäuren entstehen, kann sich die Gleichgewichtskonzentration der Hyaluronsäure in den Organen auf einem niedrigen, für die Gesundheit nachteiligen Pegel einstellen. Durch ein erhöhtes inkorporales Angebot an hochmolekularer aber auch von niedermolekularer Hyaluronsäure kann dieses Defizit ausgeglichen werden.
Nach JP 5.111.367 kann aus Hahnenkämmen ein Nahrungsmittel gewonnen werden, indem das Gewebe verschiedenen Reinigungs- und Aufschlußprozeduren unterworfen wird, wobei es auch zu einem partiellen Abbau der Hyaluronsäure kommt. Es wird darauf hingewiesen, dass Hyaluronsäure in Mensch und Tier bei inkorporaler Aufnahme eine Vielzahl von günstigen, die Gesundheit, insbesondere bei traumatischen Gewebeerscheinungen in Gelenkbereichen als auch das Befinden und Aussehen fördernde Wirkung entfaltet.
Eine Reihe von Schutzrechten beschreibt die topische Anwendung von Hyaluronsäure und deren Salzen bei Arthritiden durch intraartikuläre Injektion. US 4.808.576 schützt systemisch wirkende Injektionspräparate, die injiziert oder topisch dermal an Stellen appliziert werden können, die nicht identisch mit dem Ort der traumatischen Gewebeveränderungen sind. Die Wirkungsorte bei der Heilung traumatisierter Gewebe unterscheiden sich von den Applikationsorten, z.B. erfordert die Behandlung von Arthritiden der Gelenke entsprechend US 4,808,576 keine intraartikuläre Applikation.
Hyaluronsäure wird auch als die Verträglichkeit verbessernder Bestandteil in peritonal anzuwendenden Perfusionslösungen vorgeschlagen (JP 1.151.462).
DE 19853066 schützt niedermolekulare Fragmente der Hyaluronsäure (Oligohyaluronsäuren) zur Herstellung von Impfstoffen, hergestellt durch Verdauung mit Hyaluronidase aus hochmolekularer Hyaluronsäure, und DE 198339113 setzt ebenfalls durch Verdauung mit Hyaluronidase hergestellte niedermolekulare Hyaluronsäure bei der Herstellung von dendritischen Zellen ein. Darüber hinaus werden neben den Injektionspräparaten auch oral anzuwendende Präparate vorgeschlagen. In den Patentschriften wird ausgesagt, dass die polymeren Verbindungen den Magen-Darm-Kanal passieren und im Dünndarm durch die Darmwand weitgehend unzerstört absorbiert und über das Blut bzw. die Lymphe im Körper transportiert werden. Durch die erhöhte Versorgung mit Mucopolysacchariden kommt es zu einer gesundheits-fördemden systemischen Wirkung besonders in Organen, in denen ein Hyaluronsäure-defizit besteht.
Die orale Zuführung von Hyaluronsäure wird z.B. in JP 5.111.367 beschrieben. Die Hyaluronsäure wird aus Hahnenkämmen gewonnen, indem das Gewebe verschiedenen Reinigungs- und Aufschlußprozeduren unterworfen wird. JP 9.262.057 beschreiben eine Spezialnahrung, die u.a. Hyaluronsäure enthält und bei Halitosis empfohlen wird.
Ein die Gesundheit und Schönheit förderndes Nahrungsmittel enthält nach JP 10.165.138 spezielle Mucopolysaccharide und Nukleinsäuren. Die Mucopolysaccharide bestehen aus einem Komplex von Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat und Kollagen sowie Nukleinsäuren.
WO 97/25051 beschreibt Zubereitungen mit oral aufzunehmender Hyaluronsäure zur Verhinderung oder Vorbeugung von Krankheiten sowie therapeutische Zubereitungen bestehend aus Hyaluronan, einer Hyaluronsäure, die zusätzlich mit Formalin vernetztes Protein tierischer Herkunft insbesondere Vogelprotein enthält. JP 11.124.401 schützt die Herstellung von Oligohyaluronsäuren mit Molmassen kleiner als 10.000 D mit einem Hyaluronsäure-abbauenden Enzym und setzt bei der Entfernung des Enzyms Ultrafiltermodule mit einem cut off nicht kleiner als 10.000 D ein. Auch JP 09.098.739 beschreibt die Herstellung von niedermolekularer Hyaluronsäure. Die Oligohyaluronsäuren bzw. niedermolekularen Hyaluronsäuren werden als Nahrungs-zusatz oder für pharmazeutische und kosmetische Anwendungen, z. B. mit Wirkung gegen die Alterung der Haut vorgeschlagen. RU 2.137.402 beschreibt einen spezielle Zusatz zu diätischer Nahrung, bestehend aus getrockneter Algenbiomasse mit einem Zusatz von Hyaluronsäure sowie gegebenenfalls Antioxydantien, Vitamin C und Stärke.
JP 10.056.983 setzt Hyaluronsäure oder Extrakte aus Hahnenkämmen ein, um die Textur von gelförmigen Nahrungsmittel zu verbessern. JP 4.197.145 verwendet Hyaluronsäure in einer Menge von 0,05 bis 0,8% zur Zubereitung stärkehaltiger Nahrungsmitteln wie Gebäck, gekochten Reis oder Kuchen. Auf diesem Weg wird nach dem Backprozess eine verbesserte Struktur erhalten und die Nahrungsmittel halten sich länger frisch.
Es besteht bei bei der aus Tieren gewonnenen Hyaluronsäure der gravierende Nachteil, dass durch die an sich für die Gesundheit günstige Zuführung von Hyaluronsäure es gleichzeitig zu einer Übertragung von infektiösem oder allergenen Material wie Viren, Prionen oder Nukleinsäuren kommen kann. Die tierischen Proteine, die als Verunreinigung immer dann vorhanden sind, wenn die Hyaluronsäure aus tierischem Material gewonnen wurde, können zu einer Antigenreaktion führen. Weiterhin besteht die Gefahr, dass es beim Sammeln der verderblichen tierischen Organe wie z. B. Hahnenkämme zu mikrobiellen Infektionen in dem Material kommen kann, bei der mikrobielle Toxine auf die Konsumenten übertragen werden. Diese Gefahr ist auch in tierischem Material, das zur Verhinderung mikrobieller Infektionen mit Formalin versetzt wurde, nicht aufgehoben. Im Gegenteil; es können dadurch tierische Bindungsproteine, die an Glycosaminoglycane binden, zusätzlich chemisch vernetzt werden. Sie sind dann als schwerlösliche und durch keine Reinigungsprozeduren zu entfernenden Verunreinigungen an diesem Material wie beispielsweise kommerziell gebändeltes Hyaluronan immobilisiert. Nachteilig ist auch, dass die Wirkung der so gewonnenen Hyaluronsäure am traumatischen Gewebe nur sehr ungenügend charakterisiert ist.
Die Geweberesorption der in der Regel verwendeten Präparate von höhermolekularer Hyaluronsäure mit Molmassen zwischen etwa 100.000 D und etwa 2.500.000 D ist auf Grund der hohen Molmassen relativ gering; der größere Anteil wird über den Verdauungstrakt wieder ausgeschieden. Generell nachteilig an der hochmolekularen Hyaluronsäure ist weiterhin, dass sie in Injektionspräparaten auf Grund der hohen Viskosität ihrer wässrigen Lösungen nur bis zu einer Konzentration von etwa 20mg/ml eingesetzt werden kann.
Es ist anzunehmen, dass die kleineren Bruchstücke der Hyaluronsäure wahrscheinlich besser resorbiert werden als die hochmolekulare Hyaluronsäure und so über die Blutbahn oder das lymphatische System zu den Orten mit Mangelerscheinungen bzw. mit traumatischen Gewebeveränderungen gelangen. In den Fällen, wo niedermolekulare Hyaluronsäure (Oligohyaluronsäuren) mit Molmassen kleiner als 100.000 D eingesetzt werden, wurde immer eine hydrolytische Spaltung der Hyaluronsäure mit Hyaluronidase vorgenommen, um die hochmolekulare Hyaluronsäure hydrolytisch unter Wasseranlagerung zu kleinen Bruchstücken zu zerlegen. Die Hyaluronidase wird z.Z. generell aus tierischem Gewebe insbesondere aus Rinderhoden gewonnen. Sehr nachteilig ist die Verwendung der Hyaluronidase tierischen Ursprungs wie z.B. aus Rinderhoden durch die Gefahr der Übertragung von infektiösem Material aus dem Tier auf den Anwender.
Als Alternative wurde in WO 0.038.647 das Enzym Hyaluronatlyase eingesetzt, um niedermolekulare Hyaluronsäurebruchstücke herzustellen. Auf Grund des spezifischen Spaltungsmechanismus dieses Enzyms entsteht in Δ-4,5-Stellung an dem Glucuronylrest eine Doppelbindung. Der Spaltung der Hyaluronsäure mit Hyaluronatlyase führt demnach zu chemischen Spaltprodukten, die sich von den Hydrolyseprodukten der Hydrolyse mit Hyaluronidase unterscheiden. Die Doppelbindungen nach Spaltung mit Hyaluronatlyase verändern die physiologischen Eigenschaften der Spaltprodukte. So ist sie beispielsweise verantwortlich für die besonderen radikalbindenden Eigenschaften des Uronids. Auf Grund dieser Wirkung wird in WO 0.038.647 die epidermal topische Anwendung von Formulierungen mit Hyaluronsäure-Uroniden zum Schutz, der Erhaltung bzw. Rekonstruktion der normalen Funktion und Struktur der menschlichen und tierischen Haut und/oder und zur Verhinderung umweltbedingter, einschließlich UV-bedingter Haut- bzw. Schleimhautschädigung durch UV-Strahlung beschrieben.
Es ist das Ziel der Erfindung, die Heilung von traumatischen Gewebe bzw. von Entzündungen, beispielsweise der Rheumatoidarthritis, wirksam zu fördern bzw. das Entstehen solcher Erscheinungen mit ihrer bekannten negativen Auswirkungen auf den Gesundheitszustand zu unterbinden und die Nachteile bekannter Vorgehensweisen bei der Versorgung von Mensch und Tier mit Hyaluronsäure oder Oligohyaluronsäuren als Wirkstoffkomponente zu umgehen.
Die der Zielstellung zugrunde liegende Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung von Hyaluronsäure-Uroniden als Wirkstoffe zur Behandlung von entzündlichen Vorgängen in menschlichen und tierischen Geweben, wobei die Uronide intrakorporal zugeführt werden und systemisch wirken. Erfindungsgemäß werden Uronide der Hyaluronsäure mit Molmassen kleiner als 80.000 D, bevorzugt mit Molmassen zwischen 5.000 und 30.000 D angewendet. Die Uronide enthalten weniger als 0,5%, bei Anwendungen in Injektionspräparaten weniger als 0,05 % Proteine.
Kennzeichnendes Merkmal der Hyaluronsäure-Uronide ist ihre in vitro ausgewiesene, bisher nicht bekannte Wirkung, stärker angiogen und entzündungshemmend zu wirken als entsprechende Mengen an hochmolekularer Hyaluronsäure oder der mit Hyaluronidase gewonnenen niedermolekularer Hyaluronsäure. Vorteilhaft an der Zuführung angiogen wirkender Hyaluronsäure-Uronide bei denen mit Hyaluronsäure- unterversorgten Menschen und Tiere ist, dass bei Ihnen das Wachstum von Blutgefäßen in traumatisierten Geweben verbessert bzw. der Gesundheitszustand gefördert bzw. die Heilung beschleunigt wird. Durch die intrakorporale Verabreichung der Uronide wird erreicht, dass die Abbaurate der körpereigenen hochmolekularen Hyaluronsäure, die ein Pool für die günstige physiologische Wirkungen aufweisende körpereigene niedermolekulare Hyaluronsäure darstellt, reduziert wird. Durch die Zuführung externer Hyaluronsäure-Uronide wird der Pool hochmolekularer Hyaluronsäure positiv beeinflußt, weil der natürliche Abfluß zu den niedermolekularen Hyaluronsäuren sich verringert.
Weiterhin ist an der Verwendung der Uronide vorteilhaft, dass sie in wässriger Lösung für die erfindungsgemäße Anwendung keine nachteilige Viskosität erzeugen.
Die erfindungsgemäße Verwendung der Uronide ist neu; Hyaluronsäure-Uronide wurden bisher auch nicht für orale Applikationen oder als Injektionspräparate, Infusionslösungen oder Spüllösungen vorgeschlagen. Die angiogenen und entzündungshemmenden Eigenschaften der Uronide wurden noch nicht beschrieben. Die epidermal topischen Anwendungen als Radikalfänger bzw. die Anwendung als Schutz vor UV-Strahlen sind ausdrücklich nicht Teil der vorliegenden Erfindung.
Erfindungsgemäße Möglichkeiten der intrakorporalen Applikation der Uronide sind die Anwendung in Form eines Injektionspräparates, einer Spüllösung oder einer Infusionslösung, mit der die Uronide direkt ohne Umweg über den Verdauungstrakt in den Körper gelangen. Spüllösungen sind Lösungen, mit denen Körperhohlräume und Wundkavitäten gespült werden, um einen zweifachen Effekt zu erreichen, die Entfernung von schädlichen Substanzen und die Unterstützung der Heilung. Bei der Anwendung in Form eines Injektionspräparates werden isotonische sterile Lösungen vorgeschlagen, die zwischen 1 mg/ml und 200 mg/ml Hyaluronsäure- Uronide enthalten.
Bei der Anwendung als Perfusions-, Infusions- oder Spüllösungen enthalten diese zwischen 0,1 g/l und 100 g/l Uronide sowie Hilfsstoffe und gegebenenfalls andere Wirkstoffe oder Arzneimittel. Als Lösemittel wird bevorzugt physiologische Kochsalzlösung eingesetzt. Ein weiterer erfindungsgemäßer Weg für die indirekte Darreichung ist die Zumischung der Uronide zu Nahrungsmittel bzw. Futtermittel. Hierzu werden in nichtverderblicher bzw. lagerstabiler, nicht entmischbarer und definierter Form vorliegende konzentrierte Uronide den Nahrungsmitte oder Futtermitteln in den unterschiedlichsten Stadien der Nahrungs- oder Futterzubereitung zugemischt. Sie können auch direkt in Nahrungsergänzern eingesetzt werden. Die Uronide werden als Nahrungsergänzer in feste Form, z.B. als Pulver, Pellets, Kapseln oder Tabletten oder flüssige Formulierungen wie Getränkezusätze, Fertiggetränke oder pastöse, gelförmige oder halbfester Form vorgeschlagen. Ohne damit die Erfindung einzuschränken, werden für Anwendungen am Menschen bis zu 30 g Uronid pro Tag ohne für die Gesundheit nachträgliche Erscheinungen pro 80 kg Körpergewicht empfohlen. In weiteren Ausführungen werden ß-Sitosterol, α-Tocopherol, Vitamine und/oder Lecithin zugesetzt. Für monogastrische Tiere können entsprechend ihres Gewichtes höhere Dosen angesetzt werden. Die Möglichkeit, eine so hohe Tagesdosis zu realisieren, stellt einen deutlichen Vorteil der Erfindung gegenüber der an sich bekannten oralen Aufnahme von hochmolekularer bzw. hochviskoser Hyaluronsäure dar.
Die Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten Uronide erfolgt in jedem Fall in an sich bekannter Weise durch die Einwirkung einer endogen spaltenden Hyaluronatlyase aus Mikroorganismen, beispielsweise mit einer endo- Hyaluronatlyase aus einem Streptococcus. Das gereinigte Enzym wird in eine Lösung hochmolekularer Hyaluronsäure mit Molmassen größer als 500.000 D gegeben. Die Konzentrationen der Hyaluronsäure in den Lösungen beträgt zwischen 1 g/l bis 20 g/l. Die Ausgangslösungen können durch Lösen von Hyaluronsäure in Wasser bzw. Pufferlösungen hergestellt werden. Eine wirtschaftlichere Möglichkeit der Herstellung besteht darin, von Hyaluronsäurelösungen auszugehen, die im Herstellungsprozeß der Hyaluronsäure anfallen. Vorteilhaft an der letzten Herstellungsvariante ist, dass ein Trocknungsschritt vermieden werden kann. Die Spaltungsreaktion wird durch eine Temperaturerhöhung über 50°C durch Denaturierung der Hyaluronatlyase unterbrochen.
Die Reaktion als auch das Reaktionsende wird photometrisch über die Bildung einer Doppelbindung in Δ-4,5-Stellung an dem Glucuronylrest mit einem Absorptionsmaximum bei 232 nm, verfolgt. Die Molmassen werden mit einer Laserlichtstreumethode bestimmt.
In Anschluß an die Spaltung besteht die Möglichkeit, durch Zusatz von Proteasen, insbesondere mikrobieller oder pflanzlicher Herkunft die in Lösung vorhandenen Proteinverunreinigungen, darunter auch die denaturierte Hyaluronatlyase, zu hydrolysieren. Als Proteasen werden bevorzugt neutrale Proteasen pflanzlicher oder mikrobieller Herkunft eingesetzt. Die optional zugesetzten Proteasen oder andere, in der Hyaluronsäure noch anwesende hochmolekulare Verunreinigungen wie Lipoproteine, können durch Ultrafiltration mit einem Ultrafiltermodul entfernt werden, dessen cut off maximal um den Faktor 0,7 bis 0,3 niedriger sein kann als die mittlere Molmasse der Uronide. Das uronidfreie Retentat wird verworfen und der Durchlauf mit einem Ultrafilter konzentriert. Zur Konzentrierung und partiellen Reinigung wird die Lösung oder das Retentat, welche die Uronide und möglicherweise Spaltprodukte der Proteasebehandlung enthält, durch Ultrafiltration über Ultrafiltermodule konzentriert. Überraschend wurde gefunden, dass der Ultrafilter bevorzugt einen cut off für die Retentatbildung aufweisen muß, der um den Faktor 15 bis 35 bis niedriger liegt als die mittlere Molmasse der nach dem enzymatischen Abbau vorliegenden Uronide. Durch die Anreicherung mit einem Ultrafilter von 1 kD wird eine konzentrierte Uronidlösung mit einer mittleren Molmasse zwischen 20.000 und 30.000 D erhalten. Die Verwendung von Ultrafiltern mit einem größerem cut off, beispielsweise von 5 kD anstatt 1 kD führt erfahrungsgemäß zu erheblichen Verlusten der Uronide mit Molmassen 20.000 bis 30.000 D im Konzentrat. Uronide mit Molmassen größer als 80.000 können dagegen mit einem Ultrafilter mit einem cut off von 5 kD gereinigt werden. Bei der Herstellung eines für orale Anwendungen geeigneten Uronids mit Molmassen zwischen 20.000 und 30.000 D kann bei Verwendung ausreichend sauberer Hyaluronsäurepräparate der Schritt der Proteinentfernung durch Ultrafiltration entfallen.
Die uronidhaltigen Konzentrate werden durch eine der Maßnahmen wie Ausfällen in Alkoholen wie beispielsweise Ethanol, Gefriertrocknen oder Sprühtrocknen in eine feste Form gebracht.
Nach Gefriertrocknung wird ein weißes Festprodukt erhalten, welches sich leicht in Wasser löst. In einem Ausführungsbeispiel wird das Konzentrat in Ethanol oder in Isobutanol ausgefällt. Das Festprodukt wird gesammelt und getrocknet.
Ausführunqsbeispiel 1
Der Nachweis der angiogenen Wirkung der Hyaluronsäure-Uronide erfolgt mit einem Test zur Gefäßbildung an der Chorionallantois-Membran (CAM) des Hühnerembryos ex ovo. Dabei werden Uronide mit Molmassen von 30 kD, 100 kD und 235 kD werden auf einer mit 0,25%iger Natriumdodecylsulfat (SDS) irritierten CAM plaziert und nach 24 h die angiogene Reaktionen subjektiv beurteilt. Befruchtete Hühnereier werden 3 Tage unter Standardbedingungen bebrütet. Am 3. Bruttag werden die Eier mit 70%igen Ethanol desinfiziert. Nach dem Tauchen in Ethanol werden die Eier einige Minuten an der Luft getrocknet. In dieser Zeit positioniert sich der Embryo in Normallage. Die Bruteier werden an der Unterseite aufgeschlagen und der Inhalt vorsichtig in sterile Petrischalen (20 mm Höhe, 200 mm Durchmesser)befördert. In jede Petrischale werden noch 2,5 ml Zellkulturmedium (89,5% Eagles minimum essential medium, 10% fötales Kälberserum, 500 lU/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin) gefüllt. Die schalenlosen Hühnerembryonen werden im Brutschrank bei 36,5 °C und über 96% Luftfeuchte sowie 0,7 % CO2 - Konzentration weiter bebrütet.
Prüfablauf:
Die Schädigung der CAM erfolgt ab 8. Bruttag mit 0,25%iger SDS (20μl) an zwei unterschiedlichen Stellen. Etwa eine Stunde später wird auf die eine Schädigungsstelle Prüflösung (20μl) oberflächlich aufgetragen, die zweite bleibt unbehandelt als Kontrolle. Nach 24 Stunden werden die CAM-Reaktion und die Gefäßneubildung subjektiv auf dem Farbmonitorbild verbal beurteilt. Prüfdokumentation:
Die Angiogenese der verletzten CAM wird mit dem Steriomikroskop 'Stemi 2000-C, Schott-Kaltlichtquelle 'KL 1500", Farbkamera 2 1-CCD, Typ: MC-1009S, Farbmonitor und JVC Videokassetenrecorder SR-S388E dokumentiert. Die 30 kD, 100 kD und 235 kD Hyaluronsäure-Uronide beschleunigen deutlich die angiogenen Reaktionen in den ersten 24 Stunden nach CAM-Irritation der ex ovo bebrüteten Hühnerembryonen nach SDS-Behandlung.
Ausführungsbeispiel 2
2.1 Herstellung von Uroniden mit einer mittleren Molmasse von 25 kD
50 g Hyaluronsäure werden in 4,9 L 0,01 M Acetatpuffer pH 7,0 bei 4 °C über Nacht unter Rühren gelöst. Anschließend wird die Lösung in einem Thermostaten unter Rühren auf 30 °C erwärmt. Zur Spaltung werden dieser Lösung 100 ml einer Hyaluronatlyaselösung zugesetzt, die 1000 E Hyaluronatlyase/ml 0,01 M Acetatpuffer pH 7,0 enthält. Die Hyaluronatlyaseaktivität wird nach der oben beschriebenen Methode bestimmt. Die 100 ml Hyaluronatlyaselösung werden möglichst schnell untergemischt, wobei bereits nach 3 min die Viskosität der Hyaluronsäurelösung rapide abfällt. Es wird unter Rühren für 1 h bei 30 °C inkubiert. Während der Spaltung werden kontinuierlich Proben entnommen und deren Extinktion bei 232 nm in 1cm Küvetten vermessen. Nach der Inkubation von einer Stunde wird die Hyaluronatlyaseaktivität durch 5 minütiges Erhitzen auf 75 °C inaktiviert. Nach Abkühlen der Lösung auf 40 °C werden die Uronide in einer Ultrafiltration über ein Ultrafilter mit einem cut off von 1 kD (0,07 m2) auf ein 1/10 des Ausgangsvolumens konzentriert. Dabei werden gleichzeitig die Oligo- und Disaccharide abgetrennt. Das Konzentrat wird lyophilisiert und davon die Molmasse bestimmt .
2.2 Herstellung von Uroniden mit einer mittleren Molmasse von 80 kD
50 g Hyaluronsäure werden in 4,9 L 0,01 M Acetatpuffer pH 7,0 bei 4 °C über Nacht unter Rühren gelöst. Anschließend wird die Lösung in einem Thermostaten unter Rühren auf 30 °C erwärmt. Zur Spaltung werden dieser Lösung 100 ml einer Hyaluronatlyaselösung zugesetzt, die 100 E Hyaluronatlyase/ml 0,01 M Acetatpuffer pH 7,0 enthält. Die Hyaluronatlyaseaktivität wird nach der oben beschriebenen Methode bestimmt. Die 100 ml Hyaluronatlyaselösung werden möglichst schnell untergemischt, wobei nach 10 min die Viskosität der Hyaluronsäurelösung rapide abfällt. Es wird unter Rühren für 1 h bei 30 °C inkubiert. Während der Spaltung werden kontinuierlich Proben entnommen und deren Extinktion bei 232 nm in 1cm Küvetten vermessen. Nach der Inkubation von einer Stunde wird die Hyaluronatlyaseaktivität durch 5 minütiges Erhitzen auf 75 °C inaktiviert. Nach Abkühlen der Lösung auf 40 °C werden die Uronide in der Minisette durch Ultrafiltration über ein 5 kD Ultrafilter (0,07 m2) auf ein 1/5 des Ausgangsvolumens konzentriert. Dabei werden gleichzeitig die Oligo- und Disaccharide abgetrennt. Das Konzentrat wird lyophilisiert und davon die Molmasse bestimmt . 2.3 Bestimmung der Molmasse
Die Bestimmung der Molmasse erfolgt mit Hilfe der HPLC Chromatographie an PSSG Gel über eine HEMA Bio 2000 7.5 x 300 mm Säule.
2.4 Bestimmung von Hyaluronatlyase
Lösungen:
0,1 M Acetatpuffer pH 6,0 :
8,1 g Natriumacetat werden in 100 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert mit 1 M HCI auf pH 6,0 eingestellt und auf 11 mit destilliertem. Wasser aufgefüllt.
Hyaluronsäurelösung:
20 mg Hyaluronsäure werden in 100 ml 0,1 M Acetatpuffer pH 6,0 gelöst
CTA-Lösung:
2.5 g Cetyltrimethylammoniumbromid werden in 100ml 2%iger ( 2g/100ml) Natronlauge unter leichter Erwärmung gelöst.
Enzymbestimmung:
Es werden in einer Mikrotiterplatte 50 μl 0,1 M Acetatpuffer pH 6,0 vorgelegt. Danach wird von 50 μl Probelösung eine geometrische Verdünnungsreihe angelegt und 50μl Hyaluronsäurelösung hinzugefügt. Dieser Ansatz wird für 30 min bei 37 °C inkubiert. Anschließend werden 200μl CTA-Lösung hinzugefügt. Nach 10 Minuten wird die Platte im ELISA-Reader bei 600 nm vermessen. Die reziproke Verdünnung bei der 50% der Hyaluronsäure abgebaut werden, gibt die Aktivität der Hyaluronatlyase an.
Definition der Einheit:
Eine Hyaluronatlyaseeinheit entspricht der Aktivität, die 0,05 mg Hyaluronsäure in 30
Minuten spaltet.
Ausführungsbeispiel 3
Die Spaltung der Hyaluronsäure wird entsprechend Ausführungsbeispiel 2.1 durchgeführt. Der Schritt der Ultrafiltration wird modifiziert. Es werden 50 Anson- Einheiten der Protease Bromelain (Merck Eurolab GmbH) zugesetzt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt. Anschließend wird die Lösung durch einen Ultrafilter mit einem cut off von 20 kD ultrafiltriert. Der Durchlauf wird anschließend mit einem Ultrafilter mit einem cut off von 1 kD auf ein Retentatvolumen von 3 I konzentriert. Das Konzentrat anschließend gefriergetrocknet und in Form von Lösungen inkorporal und als Lösung oder Beimengungen zu Nahrungs- und Futtermittel oral aufgenommen. Ausführungsbeispiel 4
10 g Uronide mit einer durchschnittlichen Molmasse von 20 bis 30 kD werden mit 90 g Trockenmilchpulver, 0,2 g Lecithin, 0,02 g Tocopherol, 1 g ß-Sitosterol und 2 g Saccharose durch gemeinsames Vermählen gemischt und anschließend als Nahrungsergänzer oral aufgenommen.
Ausführungsbeispiel 5
90 g Cerealienstärke werden mit 10 g Hyaluronsäure-Uronid in Form ihres Natriumssalzes und 0,1 g einer Vitaminmischung gemischt und als Nahrungsergänzer oral aufgenommen.
Ausführungsbeispiel 6
Zur Herstellung einer etwa 50 mg/ml enthaltenden Injektionslösung werden 50 g Hyaluronsäure-Uronid einer mittlere Molmasse von 25.000 D in Form ihres Natriumsalzes in 1 I pyrogenfreier physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Die Lösung wird sterilfiltriert, als Injektionslösung in Ampullen abgefüllt und in Mensch oder Tier injiziert.
Ausführungsbeispiel 7
Zur Herstellung einer Lösung für Anwendungen bei der peritonalen Perfusion werden 1 g Glucose, 2 g Glycerol und 1 g Hyaluronsäure-Uronid in Form ihres Natriumsalzes in einem Liter Injektionswasser gelöst und mit mit Kochsalzlösung isotonisch eingestellt und sterilfiltriert.
Ausführungsbeispiel 8
100 g Hyaluronsäure-Uronid in Form ihres Natriumsalzes werden mit 100 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst und mit 0,02 % Kaliumsorbat, 5 g Glukose und 0,1 % Sorbinsäure versetzt. Die Azidität wird mit verdünnter Zitronensäure auf einen pH-Wert von 5,2 eingestellt. Bis zu 10 ml der Lösung werden täglich für die orale Aufnahme eines Erwachsenen empfohlen.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Hyaluronsäure-Uroniden als Wirkstoffe zur Behandlung von entzündlichen Vorgängen in menschlichen und tierischen Geweben.
2. Verwendung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Hyaluronsäure-Uronide Molmassen zwischen 1.000 D und 80.000 D und einen Proteingehalt von kleiner als 0,5 % aufweisen.
3. Verwendung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Hyaluronsäure-Uronide intrakorporal zugeführt werden.
4. Verwendung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Hyaluronsäure-Uroniden um Substanzen handelt, die aus Hyaluronsäure bzw. Hyaluronat biotechnischer Herkunft durch Einwirkung mikrobieller Hyaluronatlyasen hergestellt werden.
5. Verwendung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Hyaluronsäure-Uronide in intravenös, subkutan oder intramuskulär anzuwendenden isotonischen Injektionslösungen eingesetzt werden, welche die Uronide in Konzentrationen zwischen 1 mg/ml und 200 mg/ml enthalten und welche weniger als 0,05% Protein, bezogen auf die eingesetzten Uronide, enthalten.
6. Verwendung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Hyaluronsäure-Uronide in Form von isotonischen Perfusions-, Spül- oder Infusionslösung eingesetzt werden, welche die Uronide in Konzentrationen zwischen 0,1 mg/ml und 100 mg/ml enthalten
7. Verwendung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Hyaluronsäure-Uronide Nahrungsmitteln bzw. Tierfutter zugemischt werden.
8. Verwendung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Hyaluronsäure-Uronide in Nahrungsergänzern eingesetzt und diese gegebenenfalls Tocopherole und/oder ß-Sitosterol enthalten.
9. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Hyaluronsäure-Uronide in gelöster Form eingesetzt werden.
10. Verwendung gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Hyaluronsäure-Uronide in fester Form als Pulver, Pellets, Kapseln oder Tabletten oder in pastöser bis gelförmiger halbfester Form eingesetzt werden.
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