WO2003024587A2 - Verfahren zur aufreinigung von vollblut - Google Patents

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WO2003024587A2
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/36—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits
    • A61M1/3679—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits by absorption

Definitions

  • the invention relates to a method for producing an adsorber for separating harmful substances from whole blood and / or plasma, an adsorber in the form of hollow fibers or non-aggregated particles and the use of these adsorbers and a method for separating harmful substances from whole blood and / or Plasma using a device which contains the adsorber according to the invention.
  • a large number of diseases are caused by the presence of harmful substances in the blood. In the case of autoimmune diseases, these are autoantibodies. In sepsis, there are bacterial toxins. If it is possible to remove these pollutants from the blood, there is a cure or at least a significant improvement in the clinical picture.
  • Adsorption materials for medical technology are known from the prior art.
  • DE 39 32 971 discloses adsorption materials which remove low-density lipoproteins (LDL: low density lipoprotein) from blood or blood components or reduce their concentration.
  • LDL low-density lipoprotein
  • This adsorption material is an organic carrier with a fixed particle size and exclusion limit.
  • this adsorption material has functionalizations on its surface that can bind LD lipoproteins.
  • Such LDL adsorption materials can consist, for example, of polymethacrylate particles which are coated with polyacrylic acid (PAS), PAS being able to be present on both the outer and the inner surfaces of the LDL adsorber.
  • PAS polyacrylic acid
  • Such an adsorption material is compatible with whole blood, since PAS shows only slight interactions with blood cells.
  • Adsorption materials modified in this way Damage, bind or activate blood cells only to a small extent due to the weak interactions.
  • Whole blood tolerance is essentially dependent on the surface coating used. Whole blood compatibility is not possible when using certain functional groups, because they interact too severely with blood cells.
  • the plasma is pumped through a container in which there are porous, mostly spherical, particles that carry ligands that bind the pollutants.
  • a filter at the bottom of the container separates the spherical adsorber particles from the plasma, which is then combined with the cellular blood components and returned to the patient.
  • Dräger et al. disclose a whole blood compatible adsorbent consisting of particles large enough to form spaces into which the blood cells can penetrate.
  • the particles have pores that form internal cavities. Because of their size, these pores allow macromolecules to penetrate, but prevent the much larger blood cells from reaching these internal cavities.
  • the blood cells are only in contact with the outer surface, but not with the surface of the inner cavities.
  • such particles should be constructed as spherically and unaggregated as possible in order to have an outer surface which minimizes contact with the blood cells and thus also their binding and / or damage.
  • DE-A-198 42 785 discloses porous materials with such a chemically modified surface that the outer surface of the material has electroneutral and hydrophilic properties, whereas the inner surface can be coated with functional ligands. Whole blood tolerance of these materials is, however, not described or claimed.
  • the present invention relates to a method for producing an adsorber, comprising the following steps:
  • a porous carrier material which, because of its porosity, has outer surfaces 02 and surfaces 01 which lie in the pores of the carrier material. It also points out
  • the pores P of the porous carrier material are now filled with a medium which is liquid under the conditions of the filling and therefore essentially completely covers the surfaces 01 of the pores P.
  • this medium is essentially immiscible with a solution which is then used to modify the surface modifications L on the outer surfaces 02.
  • the solution for modifying the outer surfaces 02 cannot modify the surface modifications L on the inner surfaces 01 so that a reaction can only take place on the surface modifications L on the outer surfaces 02.
  • the medium is removed from the pores P of the porous carrier material.
  • An adsorber is obtained which has the surface modifications L 'on its outer surfaces 02 and the surface modifications L on its inner surfaces 01.
  • the adsorber obtained Due to the surface modifications L 'on its outer surfaces and the surface modifications L in the pores, the adsorber obtained has different properties on its outer surfaces 02 than in the pores P.
  • surface-compatible substances L ' are selected as surface modifications L' and those modifications which are capable of separating biomolecules and / or pathogenic substances of natural origin as well as synthetically and / or recombinantly produced origin from whole blood or plasma, such adsorbers can be purified of whole blood and / or blood plasma.
  • biomolecules and / or pathogenic substances that can be separated from whole blood and / or plasma with such adsorbers include toxins of biological and chemical-synthetic origin, their metabolites and degradation products, be it in connection with an infectious disease, with nutrition (e.g. Mushroom poisons, nicotine, ethanol, botulism), from professional and criminal acts (lead acetate as poison, B and C weapons), as gas, aerosol, liquid and solid.
  • Examples include CO, phosgene, chlorine, hydrocyanic acid, nitrosamine, oxalic acid, benzpyrene, solanine, nitrates, nitrites, amines, dichlorodisulfide, halogenated hydrocarbons, bacterial toxins (e.g.
  • mycotic mycotoxins such as epoxytrichotecenes, ochratonin A, zearalenoxin A, zearalenoxin A, ) and protozoonal origin and their constituents (eg exotoxins, endotoxins, fungal spores) and their breakdown products, biological combat poisons such as microcystins, anatoxins, saxitoxins, for example, come from bacterial production and their breakdown products, insecticides, bactericides, drugs and their metabolites, (alcohols, nicotine, Intoxicants, prodrugs, drugs and their metabolites and their breakdown products, antigens, DNA, RNA, ENA, immunoglobulins, autoimmune antibodies, antibodies, also anti-DNA antibodies, anti-nuclear Antibodies, viruses, retroviruses and virus components (e.g. hepatitis virus particles), immune complexes (e.g. immune complex hepatitis C virus), lipids, proteins, peptides, proteolipids,
  • mycotic
  • metals e.g. Hg, Cd, Pb, Cr, Co, Ni, Zn, Sn, Sb
  • semimetals e.g. As
  • interaction encompasses activation, binding, conversion and / or damage to substances and / or cells contained in whole blood. According to the invention, a selective interaction is preferred. The interaction can also be specific according to a further embodiment.
  • An adsorber in the form of essentially spherical, non-aggregated particles is advantageous, the blood particles, like the thrombocytes as the smallest of the blood cells, being able to migrate largely unhindered through the spaces between the particles.
  • the maximum mean pore size is determined by the size of the smallest blood cells.
  • An average pore size of 1 1.5 ⁇ m is preferred, more preferred is an average pore size of ⁇ 1.0 ⁇ m, since the maximum average pore size of 1.5 ⁇ m is smaller than the smallest blood cells, which have a diameter of approximately 2 ⁇ m ,
  • a maximum mean pore size as defined according to the present invention, it is ensured that essentially no blood cells can penetrate into the pores P. If only very small or dissolved particles are to be separated from the blood, it is preferred to choose a porous carrier material with a smaller average pore size, for example 1 ⁇ m, 0.5 ⁇ m or 0.3 ⁇ m. A particle size of 50 to 500 ⁇ m is furthermore advantageous, a particle size of 100 to 300 ⁇ m is more advantageous. It is also preferred that a maximum of 50% of the pore volume is present in pores which have a pore size of> 1.5 ⁇ m.
  • the surfaces of hollow fibers can be divided into three categories. On the one hand in the outer surfaces 02 surrounding the fibers, the surfaces 01 of the pores P and the luminal surfaces 03 which surround the inner cavities.
  • the “outer surfaces” 02 of the porous particles or the hollow fibers are understood to mean the surfaces surrounding the particles or the hollow fibers.
  • inner surfaces of a particle or a hollow fiber refers to the surfaces 01 which surround the pores P of the particles or the hollow fibers, i.e. the surfaces of the pores P.
  • luminal surface denotes the surfaces 03 of the inner cavities H of the hollow fibers.
  • a further advantageous embodiment of the invention uses hollow fibers as the carrier material.
  • the present invention discloses a method for producing an adsorber, comprising the following steps:
  • porous hollow fibers which have functional groups which can be modified on the surfaces 01, 02 and 03;
  • the pores are filled with a medium which is liquid under the conditions of the filling and which, under the conditions of modifying the surface modifications L on the surfaces 02 and 03, is essentially immiscible with a solution with which the surface modifications L on the surfaces 02 and 03 of the hollow fibers can be essentially completely modified.
  • Another method for producing an adsorber comprises the following steps:
  • porous hollow fibers which have functional groups which can be modified on the surfaces 01, 02 and 03; b) essentially complete modification of the functional groups on the surfaces 01, 02 and 03 to the surface modifications L; c) Filling the pores P and the inner cavities H of the hollow fibers with at least one medium which is liquid under the conditions of the filling and which, under the conditions of modifying the surface modifications L on the outer surfaces 02, is essentially immiscible with a solution with which the
  • the internal cavities and the pores are filled with a medium which is liquid under the conditions of the filling and which is essentially immiscible with a solution under the conditions of modifying the surface modifications L on the surfaces 02 , with which the surface modifications L on the surfaces 02 of the hollow fibers can be essentially completely modified.
  • porous carrier material a wide variety of materials can be used as the porous carrier material.
  • these materials are also suitable for the production of the hollow fibers used. Examples of suitable ones
  • Carrier materials or hollow fibers include silica, silicones, polytetrafluoroethylene (Teflon ®), polyester, quervemetztes polyvinyl alcohol, quervemetzte cellulose, cross-linked agarose, quervemetztes dextran, saponified ethylene vinyl acetates, polyether urethanes, polyurethanes, polyethylene terephthalates, polysaccharides, polypeptides, polyethylenes, polyesters, polystyrenes, Polyolefins, polysulfonates, polypropylene, polyether sulfones, polypyrroles, polyvinylpyrrolidones, polylactic acid, polyglycolic acid, polyorthoesters, aluminum oxide, glasses, Sepharose, carbohydrates and organic materials such as copolymers of acrylates or methacrylates and polyamides.
  • Teflon ® polytetrafluoroethylene
  • polyester quervemetztes polyvin
  • the carrier material preferably consists of organic material, and copolymers of acrylic acid esters or methacrylic acid esters and / or acrylic acid amides or methacrylic acid amides, for example polyacrylic acid-polyethylene copolymers, polyacrylamide-polyethylene copolymers, are particularly preferred. It is also advantageous if such copolymers carry epoxy groups as functional groups. Further copolymers which can be used according to the invention can be produced, for example, by suspension polymerization. Such a copolymer is commercially available under the name Toyopearl AF-Epoxy-650M (TosoHaas).
  • Statistical copolymers are also preferably produced by polymerizing ethylene glycol diacrylate or ethylene glycol dimethacrylate and glycidyl acrylate or glycidyl methacrylate and / or allyl glycidyl ether.
  • Another method according to the invention for producing an adsorber comprises the following steps: a) providing porous hollow fibers which have functional groups which can be modified on the surfaces 01, 02 and 03; b) filling the pores P of the hollow fibers with at least one medium which is liquid under the conditions of the filling and which is modified under the conditions of the modification of the functional groups
  • Surfaces 02 and 03 are essentially immiscible with a solution with which the functional groups on surfaces 02 and 03 of the hollow fibers can be essentially completely modified; c) essentially complete modification of the functional groups to the surface modifications L 'on the surfaces 02 and 03; and d) removing the medium which is essentially immiscible under the conditions of modifying the functional groups on the surfaces 02 and 03 with a solution with which the functional groups on the surfaces 02 and 03 can be essentially completely modified, from the pores P.
  • This method uses hollow fibers whose pores P are filled with a liquid medium which, under the conditions of modifying the functional groups on the surfaces 02 and 03, is essentially immiscible with a solution with which the functional groups on the surfaces 02 and 03 of the hollow fibers can be substantially completely modified before the said modification of the functional groups on the surfaces 02 and 03 is carried out.
  • the term "essentially complete modification” means that essentially all functional groups or surface modifications which are not present on the surface of the carrier material or of the hollow fibers and which are not covered by the medium are converted, and thus essentially no more free or modifiable functional groups or surface modifications remain on the respective surface of the carrier material or the hollow fiber.
  • the respective reaction solutions preferably each contain an excess of modifying agent.
  • modification includes changing, implementing, creating and / or destroying functional groups on the respective surfaces.
  • modification includes reacting the functional groups or the surface modifications with nucleophiles, electrophiles or radicals. After the essentially complete modification, the solution used is removed again.
  • Another method according to the invention describes the production of an adsorber, comprising the following steps: a) providing porous hollow fibers which have functional groups which can be modified on the surfaces 01, 02 and 03; b) filling the pores P and the internal cavities H of the hollow fibers with at least one medium which is liquid under the conditions of the filling and which is essentially immiscible under the conditions of modifying the functional groups on the surfaces 02 with a solution with which the functional ones Groups on the surfaces 02 of the hollow fibers can be essentially completely modified; c) essentially complete modification of the functional groups to the surface modifications L 'on the surfaces 02; and d) removing from the pores P the medium which is essentially immiscible under the conditions of modifying the functional groups on the surfaces 02 with a solution with which the functional groups on the surfaces 02 can be essentially completely modified and the internal cavities H.
  • the porous carrier material to be used or the hollow fibers to be used has functional groups which can be modified on their surfaces 01, 02 and 03.
  • These functional groups can be converted chemically or by radiation, which is preferably in the UV or visible range, to the surface modifications L or L '.
  • this can partially penetrate or not penetrate the carrier material, so that on the one hand all functional groups of the surfaces 01, 02 and 03 can be modified by means of this radiation or, in the case of radiation which does not penetrate the carrier material, the modification of the functional groups can only take place on the surfaces 02.
  • Tensioned heterocyclic systems which can be modified by nucleophilic or electrophilic ring opening are preferred as modifiable functional groups.
  • the nucleophilic ring opening is preferred. Through such a ring opening, further functional residues, chemical groups or molecules can be covalently bound to the functional groups, so that the surface modifications L or L 'result, whereby the surface modification L' can be identical to the functional groups.
  • Further functional groups which can be used according to the invention include amines, preferably primary amines, which can be reacted with carbonyl compounds to give imines and which can then, if appropriate, be converted to a more stable amine bond by hydrogenation.
  • carboxylic acids can be immobilized on amines via an amide bond.
  • Aziridines, oxiranes, oxaziridines, maleimides, N-succinimidyl esters, N-hydroxysuccinimides, hydrazides, azides, aldehydes, ketones, carboxylic acids, carboxylic acid esters are also used. Acid anhydrides, thiols, silanols, nitriles and compounds with chloromethyl groups and mixtures of the aforementioned functional groups.
  • adsorbers which have at least one surface modification L 'on the surfaces 02 or surfaces 02 and 03, depending on which method according to the invention is used, as a result of which these surfaces essentially do not interact with blood cells.
  • the adsorbers produced by the method according to the invention have at least one surface modification L on their surfaces 01 or, depending on the manufacturing process used for the adsorber on surfaces 01 and 03, which interacts with substances contained in the blood.
  • These substances contained in the blood are primarily the pollutants mentioned at the outset, which are to be removed from the whole blood or plasma. It is also preferred that the
  • surface modification is understood to mean an organic end group, an organic residue, a substance, part of a substance or a molecule or part of a molecule which is suitable for being bonded to a functional group of the porous support material or the hollow fibers ,
  • the surface modifications L have the property of having essentially no interactions with blood cells, so that the outer surfaces of the carrier material or of the hollow fibers are inert to the blood cells. This means that these surfaces are compatible with whole blood and essentially do not damage, injure, adsorb and / or activate blood cells or blood cells contained in the whole blood.
  • Such surface modifications L 'compatible with whole blood comprise at least one substance selected from the group consisting of carboxylic acids, Polycarboxylic acids, polyacrylic acids, oligoacrylic acids, albumin, heparin, heparin derivatives, heparan sulfate, glycosaminoglycans, oligosaccharides, polysaccharides and chitosan derivatives.
  • So-called immune adsorbers have the ability to preferably show selective interactions with certain substances, parts of substances or groups of substances contained in a solution. These immunoadsorbents are therefore particularly suitable as surface modification L.
  • Autoimmune antibodies monosaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, thiols, oligonucleotides, polynucleotides, peptide antibiotics, native and recombinant DNA or RNA as well as amino acids and their derivatives, in particular histidine or tryptophan, polyamino acids, heterocyclic amines such as tryptamine or histrotein, glycoproteins, glycoproteins, glycoproteins, glycoproteins, glycoproteins Complement, antiimmunoglobulin antibodies, synthetic polyanions such as polyvinyl sulfate, polyacrylic acid, polyphosphoric acid esters and combinations thereof.
  • the surface modification L thus interacts with substances contained in the blood, whereby only those substances which are small enough depending on the selected pore size can come into contact with the surface modifications L in order to be able to penetrate into the pores P.
  • Surface modification L is therefore a so-called functional surface modification, functional surface modification being understood to mean, for example, separation effectors or else catalysts or enzymes.
  • separation effectors generate selective interactions that can be used for chromatographic separations or other distribution processes, separation or purification processes, such as liquid-liquid distribution.
  • the adsorbers according to the invention are therefore not only suitable for removing substances Whole blood or plasma, but generally for the selective removal of certain substances from a complex mixture of different substances, substances and / or cells or other particles, which in addition to chemical substances, metals or metal ions and biomolecules also include whole cells, blood cells, bacteria, viruses or the like ,
  • Another method according to the invention for producing an adsorber is not limited to hollow fibers, but uses any porous support materials and comprises the following steps: a) providing a porous support material which is on its inner
  • Surfaces 02 is essentially immiscible with a solution with which the functional groups on the outer surfaces 02 of the porous carrier material can be essentially completely modified; c) essentially complete modification of the functional groups to the surface modifications L 'on the outer surfaces 02; d) Removing from the pores the medium which is essentially immiscible under the conditions of modifying the functional groups on the outer surfaces 02 with a solution with which the functional groups on the outer surfaces 02 can be essentially completely modified P; and optionally e) essentially complete modification of the functional groups to the surface modifications L on the inner surfaces 01.
  • the last step in this process is to convert the functional groups on the inner surfaces 02 to the surface modifications L.
  • a water-based solution is preferably used to modify the functional groups on the surfaces 02 or on the surfaces 02 and 03.
  • a further advantageous embodiment uses radiation that essentially penetrates the carrier material or the hollow fiber or essentially does not penetrate it for this modification.
  • the term “liquid medium under the conditions of filling” encompasses media which can be introduced or filled into the pores of a carrier material or the hollow fibers and can be substantially completely removed from these pores again.
  • Such media primarily include hydrophobic organic media.
  • hydrophobic organic media are linear Ce to C 2 o alkanes, branched C 6 to C 20 alkanes, cyclic C 6 to C 2u alkanes, linear or branched alkane chains bearing Ce to C 2 o cycloalkanes , C 6 - to C 2 o-arylalkanes, linear or branched alkane chain-bearing C 6 - to C 20 aromatics, C 6 - to C 22 aromatics, linear C & - to C 2 o-alkanols, branched C ⁇ -bis C 2 o -alkanols, cyclic C ⁇ to C 20 alkanols, linear or branched alkane chain-bearing C6 to C 2 o-cycloalkanols, C 6 to C 20 hydroxyarylalkanes, linear or branched hydroxyalkane chain-bearing Ce- to C 2 o-aromatics
  • the C 6 - to C 2 o-alkanes include, for example, hexane, heptane, octane, nonane, decane, cyclohexane and dodecane.
  • the C 6 to C 2u alkanols include, for example, hexanol, octanol, decanol, undecanol and dodecanol.
  • said medium will be one which is liquid at room temperature.
  • a medium which is gaseous at room temperature can also be used.
  • the pores P are filled, for example at a reduced temperature and / or increased pressure, with the medium which is liquid under the conditions of the filling.
  • the functional groups on the surfaces are then modified under comparable conditions.
  • This embodiment has the advantage that a medium which is gaseous at room temperature is particularly easy to remove from the pores P.
  • a medium can also be used which is liquid under the conditions of filling Room temperature and normal pressure is however fixed.
  • the pores of the hollow fibers or of the porous carrier material are then filled with the medium at elevated temperature.
  • This embodiment has the advantage of a particularly permanent and inert filling of the inner pores P or cavities H, which means that more drastic conditions, ie chemically aggressive conditions, can also be used to modify the functional groups of the outer surfaces.
  • this filling of the pores P or cavities H can be carried out with a medium by immersing the hollow fibers or the particles of the porous support material in a medium which is liquid at room temperature and swollen with it in the simplest case, so that the air in the is essentially completely displaced from the pores P and, depending on the method used, from the cavities H.
  • the particles or hollow fibers can also be placed in an airtight container, whereupon the air is removed from the container and thus also from the pores or cavities by applying a vacuum, and the medium, which is liquid under these conditions, into the Pores P or cavities H can penetrate.
  • the excess liquid medium can be sucked off from the hollow fibers or carrier material particles, for example using a suction filter, without the medium contained in the pores P or cavities H being removed again.
  • the reaction solution for modifying the functional groups of the outer surfaces 02 or, depending on the method used according to the invention, of the outer surfaces 02 and the luminal surfaces 03 is then added.
  • the solution for modifying the functional groups not covered by the medium is essentially immiscible with said medium in order to prevent the groups covered by the medium from being exposed.
  • the medium is removed again, for example by suction, washing out, heating, applying vacuum and / or centrifugation.
  • the present invention discloses adsorbers which are produced by one of the aforementioned processes.
  • Adsorbers in the form of hollow fibers with an average pore size of ⁇ 1.5 ⁇ m are particularly preferred.
  • the inner, luminal diameter (D1) of the porous hollow fibers can be between 0 and 5 mm, preferably between 0 and 1 mm.
  • the present invention further discloses a device for separating biomolecules and / or pathogenic substances from whole blood and / or plasma, comprising a housing in which the adsorber in the form of porous particles or hollow fibers as loose particles or fibers and / or as a bundle loose and / or firmly glued to the housing, is included, the housing having at least one inlet and at least one outlet optionally provided with a particle filter.
  • the device according to the invention preferably comprises a housing
  • the present invention further discloses a method for separating
  • Biomolecules and / or pathogenic substances from whole blood and / or plasma comprising the steps: a) providing a device according to the invention; b) passing whole blood and / or plasma; and optionally c) regeneration of the adsorber.
  • an adsorber for whole blood is provided in the form of essentially hollow, non-aggregated particles.
  • a preferred embodiment uses hollow fibers as the adsorbent material.
  • Such hollow fibers preferably have an inside diameter (D1) of ⁇ 5 mm and an outside diameter (D2) of ⁇ 6 mm.
  • the outer surface 02 of the adsorption material has at least one surface modification L 'and the surface 01 of the pores P has at least one surface modification L.
  • the surfaces 03 of the inner cavities H can either have the surface modification L or the surface modification L' exhibit.
  • the surface modifications L 'of the outer surface 02 essentially ensure compatibility with whole blood, since the outer surface interacts almost exclusively with the blood cells.
  • the surfaces have 01 or additionally the surfaces 03 prefer surface modifications L, which can interact with substances contained in the blood.
  • the present invention thereby eliminates the disadvantages of the prior art methods mentioned.
  • the method according to the invention has the advantage that the blood does not need to be separated into plasma and cellular components, but rather can be passed as a whole through an adsorption material which is preferably fixedly mounted with and / or in a housing.
  • the adsorber carries the pollutant-binding ligands, which adsorb the pollutants contained in the whole blood only in its pores P or inner cavities H, which are too small to absorb the cellular components of the whole blood. Because the adsorber is firmly connected to the housing, there is no risk of adsorber particles getting into the bloodstream. Since the pollutant-binding surface modifications L are only in the pores P or internal cavities H, which are inaccessible to cells, they cannot develop a cell-damaging effect. The removal of the pollutants is much more complete, since the entire blood volume comes into contact with the adsorber and not only the plasma separated from the cellular components. The additional burden on the patient due to the separation into plasma and cellular components is eliminated.
  • the adsorbers according to the invention can be used not only for the removal of harmful substances from whole blood or plasma, but are also used wherever chemical substances of any kind are to be separated from a solution or suspension containing living cells.
  • the adsorbers according to the invention can be used for the gentle separation of cytotoxic substances from cell culture solutions or fermentation solutions by gluing the adsorber with and / or in a suitable housing or by holding it back through a particle filter and passing the corresponding cell culture solution or fermentation solution through. It is preferred to use these adsorbers for the gentle separation of extracellularly formed biomolecules from cell culture or fermentation media without having to separate cellular constituents and nutrient medium from one another.
  • biomolecules can be proteins, enzymes or other substances, preferably with pharmacological activity. figure description
  • FIG. 1 schematically shows a cross section through an embodiment of an adsorber according to the invention in the form of a porous hollow fiber which carries the surface modifications L 'on its outer surfaces 02 and the luminal surfaces 03 of the cavities H, as a result of which blood compatibility is achieved, and on the inner surfaces 01 the pores P has the surface modifications L, which have the ability to adsorb harmful substances from the whole blood.
  • a hollow fiber adsorber can be produced, for example, by a method according to the invention according to claim 2 or claims 4 and 5.
  • FIG. 2 schematically shows a cross section through an embodiment of an adsorber according to the invention in the form of a porous hollow fiber which has the surface modifications L ′ on its outer surfaces 02, as a result of which blood compatibility is achieved, and on the inner surfaces 01 of the pores P and the luminal surfaces 03 the cavities H have the surface modifications L, which have the ability to adsorb harmful substances from the whole blood.
  • a hollow fiber adsorber can be produced, for example, by a method according to the invention according to claim 3 or claims 6 and 7.
  • FIG. 3 schematically shows a cross section through an embodiment of an adsorber according to the invention in the form of a porous particle which has the surface modifications L ′ on its outer surfaces 02, as a result of which blood compatibility is achieved, and the pores P on its inner surfaces 01 has the surface modifications L, which have the ability to adsorb harmful substances from whole blood.
  • an adsorber can be produced, for example, by a method according to the invention as claimed in claim 1 or claim 8.
  • FIG. 4 is a graphic representation of an elution diagram for determining the TSST 1 adsorption by induction of the TNF- ⁇ release of lymphocytes. Examples
  • the carrier material particles are suctioned off with water, 4m NaCl and washed again with water and dried in a vacuum desiccator over CaCl 2 .
  • the particles modified in this way are rotated again with 200 ml of the above-mentioned CME-CDI solution at 4 ° C. for 30 minutes in a round bottom flask and as quickly as possible with 250 ml of 4 ° C. cold 0.1 M MES buffer (pH 4 , 75) rinsed.
  • a solution of 1 g of TSST 1 -binding peptide (TSST: toxic shock syndrome toxin 1-binding peptide, custom synthesis by Bachern, sequence: GADRSYLSFIHLYPELAGA) in 200 ml of 0.1 M MES buffer at 4 ° C. for 18 hours added and rotated. Then it is rinsed with water, with 4 M saline solution and again with water and dried completely in vacuo.
  • the dried " particles are completely filled with dodecanol and suction filtered again after 10 minutes and cooled to 4 ° C.
  • the cooled particles are filled with 6 M hydrochloric acid at 4 ° C. and stored at 4 ° C. for 15 hours. It is then decanted off, rinsed with neutral pH water at 4 ° C. and then rinsed with isopropanol at 40 ° C. It is rinsed again with water, with 4 M NaCl and again with water and dried over CaCl 2 in a vacuum desiccator.
  • Example 2
  • a microfiltration module from A / G Technology Corporation with a pore size of 0.65 ⁇ m, an inner diameter of the hollow fibers of 0.5 mm and a membrane area of 0.14 m 2 was placed in a circle with a solution of 94 mg FeS0 X 7 H 2 0 and rinsed 84 mg Na 2 S 2 0 5 in 200 ml water. After 15 minutes, 3.4 ml of methacrylic acid are added to the storage vessel and then 3.4 ml of hydrogen peroxide (30%) 2 minutes later. The solution is then pumped in a circle for a further 2 hours. The microfiltration module is then rinsed with flowing water on the inside and outside of the hollow fibers simultaneously for 4 hours to remove reagent residues. The microfiltration module is then completely emptied.
  • TSST toxic shock syndrome toxin 1 binding
  • the dried microfiltration module is completely filled with dodecanol and completely emptied after 10 minutes.
  • the module is cooled to 4 ° C.
  • the cooled module was filled with 6 M hydrochloric acid at 4 ° C. in and around the hollow fibers and stored at 4 ° C. for 15 hours. The module is then emptied, rinsed neutral with 4 ° C cold water and then rinsed with 40 ° C warm isopropanol. It was then rinsed once more with water, with 4 M saline solution and again with water and dried.
  • Example 3
  • the module as described in Example 2 is completely filled with dodecanol and emptied after 10 minutes in such a way that the pores remain filled with dodecanol and then cooled to 4 ° C.
  • the immobilization solution is prepared by dissolving 1.5 g of heparin in 275 ml of a 0.1 M MES buffer solution (pH 4.75). The immobilization solution is pumped through the module at 4 ° C. overnight (18 hours).
  • the module is opened and samples modified with heparin are taken.
  • the surface area available for analysis should not be less than 20 cm 2 .
  • the sample is cut and placed in a hydrolysis tube.
  • 2-4 mg of heparin are weighed exactly as the heparin standard solution and placed in a hydrolysis tube.
  • the hydrolysis tubes After adding 10 ml of 8M HCI aq , the hydrolysis tubes are tightly sealed and heated to 100 ° C in a drying cabinet for 4 hours. The solution is then transferred quantitatively to a round-bottom flask, the polymer residues remaining in the hydrolysis tube. After concentrating the solution to dryness, a few ml of dist. Water added and evaporated to dryness again. This is repeated three times. The residue is distilled in 10 ml. Water dissolved. The heparin standard solution is 1: 100 with dist. Diluted water.
  • H eparin heparin content on the sample surface
  • Hep E weight Weighing heparin for the preparation of the heparin standard solution SFI peak area (glucosamine peak) of the sample in the chromatogram Hep F ⁇ peak area (glucosamine peak) of the heparin standard in the chromatogram
  • a heparin content of 7.3 pmol / cm 2 is determined.
  • the test result is shown graphically in FIG. 4.
  • the microfiltration module from A / G Technology Corporation is completely filled with dodecanol and emptied after 10 minutes.
  • the module is cooled to 4 ° C. This is followed by flushing the module in a circle with a solution of 94 mg FeS0 X 7 H 2 0 and 84 mg Na S 2 0 in 200 ml water at a temperature of 15 ° C. After 15 minutes, 3.4 ml are first placed in the storage vessel
  • the module is opened immediately and a few fibers are taken statistically 5 cross-sections.
  • the streptavidin in the pores is clearly localized in the pores of the fibers within the next 15 minutes due to an intense blue color (at 80x magnification, stereo magnifying glass).
  • the microfiltration module from A / G Technology Corporation is only filled with dodecanol from the blood circulation side (50 ml / min), so that no dodecanol can escape onto the filtrate side.
  • the module is immediately cooled to 4 ° C. This is followed by flushing the module on the filtrate side in a circle with a solution of 94 mg FeS0 X 7 H 2 0 and 84 mg Na S 2 0 5 in 200 ml water at a temperature of 15 ° C. After 15 minutes, 3.4 ml of methacrylic acid are added to the storage vessel and then 3.4 ml of hydrogen peroxide (30%) 2 minutes later. The solution is then pumped in a circle for a further 3 hours. Then the microfiltration module is used to remove
  • the module is opened immediately and some fibers are statistically removed. 5 cross sections are made per fiber and the streptavidin is localized on the luminal side of the fiber as well as in the pores within the next 15 minutes by intensive blue staining (at 80x magnification, stereo magnifying glass).

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Adsorbers zur Abtrennung von schädlichen Stoffen aus Vollblut und/oder Plasma als auch Zellkulturmedien, einen Adsorber in Form von Hohlfasern oder nicht-aggregierten Teilchen sowie die Verwendung dieser Adsorber und ein Verfahren zur Abtrennung von schädlichen Stoffen aus Vollblut und/oder Plasma unter der Verwendung einer Vorrichtung, welche den erfindungsgemäßen Adsorber enthält.

Description

Verfahren zur Aufreinigung von Vollblut
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Adsorbers zur Abtrennung von schädlichen Stoffen aus Vollblut und/oder Plasma, einen Adsorber in Form von Hohlfasern oder nicht-aggregierten Teilchen sowie die Verwendung dieser Adsorber und ein Verfahren zur Abtrennung von schädlichen Stoffen aus Vollblut und/oder Plasma unter der Verwendung einer Vorrichtung, welche den erfindungsgemäßen Adsorber enthält.
Eine große Anzahl von Erkrankungen werden dadurch verursacht, daß sich schädliche Substanzen im Blut befinden. Im Falle der Autoimmunerkrankungen handelt es sich hierbei um Autoantikörper. Bei der Sepsis sind es bakterielle Toxine. Wenn es gelingt, diese Schadstoffe aus dem Blut zu entfernen, tritt eine Heilung oder zumindest eine deutliche Verbesserung des Krankheitsbildes auf.
Um derartige Schadstoffe aus dem Vollblut zu entfernen, werden Materialien benötigt, welche eine Vollblutverträglichkeit besitzen. Derartige Materialien dürfen nicht zur Komplement- und/oder Gerinnungsaktivierung führen und/oder eine Thrombozytenaggregation bzw. Thrombozytenadhäsion verursachen.
Aus dem Stand der Technik sind Adsorptionsmaterialien für die Medizintechnik bekannt. DE 39 32 971 offenbart beispielsweise Adsorptionsmaterialien, welche aus Blut oder Blutbestandteilen Lipoproteine mit niedriger Dichte (LDL: low density lipoprotein) entfernen bzw. deren Konzentration herabsetzen. Bei diesem Adsorptionsmaterial handelt es sich um einen organischen Träger mit festgelegter Partikelgröße und Ausschlußgrenze. Zudem trägt dieses Adsorptionsmaterial auf seiner Oberfläche Funktionalisierungen, welche LD-Lipoproteine binden können.
Derartige LDL-Adsorbtionsmaterialien können beispielsweise aus Polymethacrylatteilchen bestehen, welche mit Polyacrylsäure (PAS) beschichtet sind, wobei PAS sowohl auf den äußeren als auch den im Inneren liegenden Oberflächen des LDL-Adsorbers gebunden vorliegen kann. Ein derartiges Adsorptionsmaterial ist vollblutverträglich, da PAS nur geringe Wechselwirkungen mit Blutzellen aufweist. In dieser Weise modifizierte Adsorptionsmaterialien schädigen, binden oder aktivieren Blutzellen nur in geringem Maße aufgrund der schwachen Wechselwirkungen.
Die Vollblutverträglichkeit ist im wesentlichen von der verwendeten Oberflächenbeschichtung abhängig. Bei der Verwendung bestimmter funktioneller Gruppen ist eine Vollblutverträglichkeit nicht gegeben, da aufgrund von Wechselwirkungen mit Blutzellen diese zu stärk geschädigt oder gebunden werden.
Aus diesem Grunde trennen einige aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren vor der Aufreinigung des Blutes das Blutplasma von den zellulären Bestandteilen ab. In einem zweiten Schritt wird nun das Plasma durch ein Behältnis gepumpt, in dem sich poröse meist sphärische Partikel befinden, die Liganden tragen, welche die Schadstoffe an sich binden. Ein Filter am Boden des Behältnisses trennt die sphärischen Adsorberpartikel vom Plasma ab, das anschließend mit den zellulären Blutbestandteilen vereinigt und dem Patienten wieder zugeführt wird.
Dieses Verfahren des Standes der Technik [Samuelsson G.: Extracorporeal immunoadsorption with protein A: technical and clinical results. J. Clin. Apheresis 2001 , 16, 49-52] hat einige Nachteile. Es besteht das Risiko, daß durch ein Versagen des Filters Adsorberpartikel in den Blutkreislauf des Patienten geraten und dort einen Hirnschlag, einen Herzinfarkt, eine Lungenembolie oder ähnliches auslösen. Die Trennung in Plasma und zelluläre Bestandteile stellt eine zusätzliche Belastung für den Patienten dar, ist aber bisher nötig, da die schadstoffbindenden Liganden zellschädigend wirken. Da diese Trennung nie vollständig sein kann, verbleibt ein Teil des Plasmas bei den zellulären Bestandteilen und wird daher nicht von Schadstoffen befreit. Der zusätzliche apparative Aufwand für die Trennung in Plasma und zelluläre Bestandteile führt dazu, daß dem Patienten ein größeres Blutvolumen entzogen werden muß. Somit weist das Verfahren des Standes der Technik in Bezug auf die Anwendungsfreundlichkeit, den apparativen Aufwand, den Wirkungsgrad und die Belastung des Patienten einige Nachteile auf.
Dräger et al. (Eur. J. Clin. Invest. 1998, 28, 12; US-A-5 476 715) offenbaren ein vollblutverträgliches Adsorbtionsmaterial, welches aus Teilchen besteht, die so groß sind, daß sie Zwischenräume bilden, in die die Blutzellen eindringen können. Zusätzlich weisen die Teilchen Poren auf, welche innere Hohlräume formen. Diese Poren gestatten aufgrund ihrer Größe Makromolekülen das Eindringen, verhindern jedoch, daß die wesentlich größeren Blutzellen diese inneren Hohlräume erreichen können. Dies hat zur Folge, daß die Blutzellen nur Kontakt zur äußeren Oberfläche haben, aber nicht zur Oberfläche der inneren Hohlräume. Gemäß EP 0 424 698 sollten derartige Teilchen möglichst sphärisch und unaggregiert aufgebaut sein, um eine äußere Oberfläche aufzuweisen, welche den Kontakt zu den Blutzellen und somit auch deren Bindung und/oder Schädigung minimiert.
DE-A-198 42 785 offenbart poröse Materialien mit einer derartig chemisch modifizierten Oberfläche, daß die äußere Oberfläche des Materials elektroneutrale und hydrophile Eigenschaften aufweist, die innere Oberfläche hingegen mit funktionellen Liganden beschichtet sein kann. Eine Vollblutverträglichkeit dieser Materialien wird jedoch nicht beschrieben oder beansprucht.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es nun, ein Verfahren zur Abtrennung schädlicher Stoffe aus Vollblut sowie Adsorptionsmaterialien, welche in diesem Verfahren eingesetzt werden können, und Verfahren zur Herstellung dieser Adsorptionsmaterialien bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird durch die technische Lehre des Hauptanspruchs der vorliegenden Erfindung gelöst. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung, der Figur und den Beispielen der vorliegenden Patentanmeldung.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Adsorbers, umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen eines porösen Trägermaterials, welches auf seinen inneren Oberflächen 01 und seinen äußeren Oberflächen 02 modifizierbare funktionelle Gruppen aufweist;
b) im wesentlichen vollständiges Modifizieren der funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 01 und 02 zu den Oberflächenmodifizierungen L;
c) Füllen der Poren P des porösen Trägermaterials mit mindestens einem unter den Bedingungen des Füllens flüssigen Medium, welches unter den Bedingungen des Modifizierens der Oberflächenmodifizierungen L auf den äußeren Oberflächen 02 mit einer Lösung im wesentlichen nicht mischbar ist, mit welcher die Oberflächenmodifizierungen L auf den äußeren Oberflächen 02 des porösen Trägermaterials im wesentlichen vollständig modifiziert werden können;
d) im wesentlichen vollständiges Modifizieren der Oberflächenmodifizierungen L zu den Oberflächenmodifizierungen L' auf den äußeren Oberflächen 02; und
e) Entfernen des Mediums, welches unter den Bedingungen des
Modifizierens der Oberflächenmodifizierungen L auf den äußeren Oberflächen 02 mit einer Lösung, mit welcher die Oberflächenmodifizierungen L im wesentlichen vollständig modifiziert werden können, im wesentlichen nicht mischbar ist, aus den Poren P.
Bei diesem Verfahren wird ein poröses Trägermaterial bereitgestellt, welches aufgrund seiner Porosität äußere Oberflächen 02 sowie Oberflächen 01 aufweist, welche in den Poren des Trägermaterials liegen. Zudem weist das
Trägermaterial auf den Oberflächen 01 und 02 modifizierbare funktioneile Gruppen auf, welche durch chemische Reaktion zu Oberflächenmodifizierungen L umgesetzt werden können. Bevorzugt werden derartige chemische Reaktionen eingesetzt, welche im wesentlichen eine vollständige bzw. quantitative Oberflächenmodifizierung bewirken. Erfindungsgemäß werden nun die Poren P des porösen Trägermaterials mit einem Medium gefüllt, welches unter den Bedingungen des Füllens flüssig ist und daher im wesentlichen vollständig die Oberflächen 01 der Poren P bedeckt. Zudem ist dieses Medium im wesentlichen nicht mischbar mit einer Lösung, die anschließend zur Modifizierung der Oberflächenmodifizierungen L auf den äußeren Oberflächen 02 eingesetzt wird. Aufgrund der Tatsache, daß das Medium die inneren Oberflächen 01 im wesentlichen vollständig bedeckt und mit der Lösung zur Modifizierung der äußeren Oberflächen nicht mischbar ist, kann die Lösung zur Modifizierung der äußeren Oberflächen 02 die Oberflächenmodifizierungen L auf den inneren Oberflächen 01 nicht modifizieren, so daß eine Reaktion nur an den Oberflächenmodifizierungen L auf den äußeren Oberflächen 02 stattfinden kann.
Nach der Modifizierung der Oberflächenmodifizierungen L auf den äußeren Oberflächen 02, welche bevorzugt im wesentlichen vollständig bzw. quantitativ abläuft, wird das Medium aus den Poren P des porösen Trägermaterials entfernt. Man erhält einen Adsorber, der auf seinen äußeren Oberflächen 02 die Oberflächenmodifizierungen L' und auf seinen inneren Oberflächen 01 die Oberflächenmodifizierungen L trägt. Durch das Befüllen der Poren P des Trägermaterials konnten somit gezielt bestimmte Bereiche des Trägermaterials, nämlich die Oberflächen 01 der Poren P vor der Modifizierung der Oberflächenmodifizierungen L auf den äußeren Oberflächen geschützt werden.
Der erhaltene Adsorber weist aufgrund der Oberflächenmodifizierungen L' auf seinen äußeren Oberflächen und den Oberflächenmodifizierungen L in den Poren, auf seinen äußeren Oberflächen 02 andere Eigenschaften auf, als in den Poren P.
Wählt man beispielsweise als Oberflächenmodifizierungen L' blutverträgliche Substanzen und als Oberflächenmodifizierungen L solche Modifizierungen, die fähig sind, Biomoleküle und/oder pathogene Stoffe natürlicher Herkunft als auch synthetisch und/oder rekombinant hergestellten Ursprungs aus Vollblut oder Plasma abzutrennen, so lassen sich derartige Adsorber zur Aufreinigung von Vollblut und/oder Blutplasma einsetzen.
Zu den Biomolekülen und/oder pathogenen Stoffen, welche mit derartigen Adsorbern aus Vollblut und/oder Plasma abgetrennt werden können, zählen Toxine biologischer und chemisch-synthetischer Herkunft, deren Metaboliten und Abbauprodukte, sei es im Zusammenhang mit einer Infektionskrankheit, mit der Ernährung (z.B. Pilzgifte, Nikotin, Ethanol, Botulismus), aus beruflich bedingten und kriminellen Handlungen heraus (Bleiacetat als Gift, B- und C-Waffen), als Gas, Aerosol, Flüssigkeit und Feststoff.
Als Beispiele sind zu nennen CO, Phosgen, Chlor, Blausäure, Nitrosamine, Oxalsäure, Benzpyrene, Solanin, Nitrate, Nitrite, Amine, Dichlordisulfid, halogenierte Kohlenwasserstoffe, Toxine bakterieller (z.B. Bakteriämie,), mykotischer (Mykotoxine wie Epoxytrichotecene, Ochratoxin A, Zearalenon) und protozoonaler Herkunft und deren Bestandteile (z.b. Exotoxine, Endotoxine, Pilzsporen) und deren Abbauprodukte, biologische Kampfgifte wie Microcystine, Anatoxine, Saxitoxine beispielsweise stammen aus bakterieller Produktion und deren Abbauprodukte, Insektizide, Bakterizide, Drogen und deren Metaboliten, ( Alkohole, Nikotin, Rauschmittel, Prodrugs, Arzneimittel und deren Metaboliten und ihre Abbauprodukte, Antigene, DNA, RNA, ENA, Immunglobuline, Autoimmunantikörper, Antikörper, auch Anti-DNA-Antikörper, Anti Nuclear- Antikörper, Viren, Retroviren und Virenbestandteile (z.B Hepatitisvirenpartikel), Immunkomplexe (z.B. Immunkomplex Hepatitis-C Virus), Lipide, Proteine, Peptide, Proteolipide, Glycoproteine und Proteoglycane, Fibrinogen, Fibrin,
Blutersatzprodukte und Plasmaersatzprodukte, Prionen, NanoWaffen, Metalle (z. B. Hg, Cd, Pb, Cr, Co, Ni, Zn, Sn, Sb) sowie Ionen dieser Metalle, Halbmetalle (z. B. As) sowie Ionen dieser Halbmetalle.
Wählt man nun ein poröses Trägermaterial mit einer Porengröße kleiner als der Durchmesser einer Blutzelle, so können die Blutzellen nicht in die Poren des Trägermaterials eindringen und auch nicht mit den Oberflächen 01 wechselwirken. Somit ist es bei derartigen Adsorbern nicht erforderlich, daß die inneren Oberflächen 01 der Kontaktaktivierung Rechnung tragen müssen, d.h. daß durch die Oberflächen 01 Blutzellen nicht aggregiert, verletzt, zerstört oder aktiviert werden, da die Blutzellen mit diesen Oberflächen nicht in Kontakt kommen.
Der Begriff "Wechselwirkung" umfaßt eine Aktivierung, Anbindung, Umsetzung und/oder Schädigung von im Vollblut enthaltenen Substanzen und/oder Zellen. Erfindungsgemäß ist eine selektive Wechselwirkung bevorzugt. Die Wechselwirkung kann auch gemäß einer weiteren Ausführungsform spezifisch sein.
Vorteilhaft ist ein Adsorber in Form von im wesentlichen sphärischen, nicht aggregierten Teilchen, wobei die Blutteilchen, wie die Thrombozyten als kleinste der Blutzellen, weitgehend ungehindert durch die Zwischenräume der Teilchen wandern können. Die maximale mittlere Porengröße wird durch die Größe der kleinsten Blutzellen bestimmt. Eine mittlere Porengröße von ≤ 1 ,5 μm ist bevorzugt, mehr bevorzugt ist eine mittlere Porengröße von < 1 ,0 μm, da die maximale mittlere Porengröße von 1 ,5 μm kleiner ist als die kleinsten Blutzellen, welche einen Durchmesser von etwa 2 μm haben.
Bei einer, wie gemäß der vorliegenden Erfindung definierten maximalen mittleren Porengröße ist sichergestellt, daß im wesentlichen keine Blutzellen in die Poren P eindringen können. Sofern nur sehr kleine oder gelöste Teilchen aus dem Blut abgetrennt werden sollen, ist es bevorzugt, ein poröses Trägermaterial mit einer geringeren mittleren Porengröße zu wählen, beispielsweise 1 μm, 0,5 μm oder 0,3 μm. Vorteilhaft ist ferner eine Korngröße der Teilchen von 50 bis 500 μm, vorteilhafter eine Korngröße von 100 bis 300 μm. Zudem ist bevorzugt, daß maximal 50% des Porenvolumens in Poren vorliegt, welche eine Porengröße von > 1 ,5 μm aufweisen.
Die Oberflächen von Hohlfasern lassen sich in drei Kategorien einteilen. Zum einen in die äußere, die Fasern umgebende Oberflächen 02, die Oberflächen 01 der Poren P sowie die luminalen Oberflächen 03, welche die inneren Hohlräume umgeben.
Erfindungsgemäß wird unter den "äußeren Oberflächen" 02 der porösen Teilchen oder der Hohlfasern die das Teilchen bzw. die Hohlfasern umschließenden Oberflächen verstanden.
Unter dem Begriff "innere Oberflächen" eines Teilchens oder einer Hohlfaser werden die Oberflächen 01 bezeichnet, welche die Poren P der Teilchen oder der Hohlfasern umschließen, d.h. die Oberflächen der Poren P.
Der Begriff "luminale Oberfläche" bezeichnet die Oberflächen 03 der inneren Hohlräume H der Hohlfasern.
Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung verwendet als Trägermaterial Hohlfasern. Die vorliegende Erfindung offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines Adsorbers, umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen von porösen Hohlfasern, welche auf den Oberflächen 01 , 02 und 03 modifizierbare funktioneile Gruppen aufweisen;
b) im wesentlichen vollständiges Modifizieren der funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 01 , 02 und 03 zu den Oberflächenmodifizierungen L;
c) Füllen der Poren P der Hohlfasern mit mindestens einem unter den Bedingungen des Füllens flüssigen Medium, welches unter den Bedingungen des Modifizierens der Oberflächenmodifizierungen L auf den Oberflächen 02 und 03 mit einer Lösung im wesentlichen nicht mischbar ist, mit welcher die Oberflächenmodifizierungen L auf den Oberflächen 02 und 03 der Hohlfasern im wesentlichen vollständig modifiziert werden können; d) im wesentlichen vollständiges Modifizieren der Oberflächenmodifizierungen L zu den Oberflächenmodifizierungen L' auf den Oberflächen 02 und 03; und
e) Entfernen des Mediums, welches unter den Bedingungen des Modifizierens der Oberflächenmodifizierungen L auf den Oberflächen 02 und 03 mit einer Lösung, mit welcher die Oberflächenmodifizierungen L auf den Oberflächen 02 und 03 im wesentlichen vollständig modifiziert werden können, im wesentlichen nicht mischbar ist, aus den Poren P.
Bei diesem Verfahren werden die Poren mit einem Medium gefüllt, welches unter den Bedingungen des Füllens flüssig ist und, welches unter den Bedingungen des Modifizierens der Oberflächenmodifizierungen L auf den Oberflächen 02 und 03 mit einer Lösung im wesentlichen nicht mischbar ist, mit welcher die Oberflächenmodifizierungen L auf den Oberflächen 02 und 03 der Hohlfasern im wesentlichen vollständig modifiziert werden können.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung eines Adsorbers, umfaßt die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen von porösen Hohlfasern, welche auf den Oberflächen 01 , 02 und 03 modifizierbare funktioneile Gruppen aufweisen; b) im wesentlichen vollständiges Modifizieren der funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 01 , 02 und 03 zu den Oberflächenmodifizierungen L; c) Füllen der Poren P und der inneren Hohlräume H der Hohlfasern mit mindestens einem unter den Bedingungen des Füllens flüssigen Medium, welches unter den Bedingungen des Modifizierens der Oberflächenmodifizierungen L auf den äußeren Oberflächen 02 mit einer Lösung im wesentlichen nicht mischbar ist, mit welcher die
Oberflächenmodifizierungen L auf den äußeren Oberflächen 02 der Hohlfasern im wesentlichen vollständig modifiziert werden können;
d) im wesentlichen vollständiges Modifizieren der Oberflächenmodifizierungen L zu den Oberflächenmodifizierungen L' auf den äußeren Oberflächen 02; und e) Entfernen des Mediums, welches unter den Bedingungen des Modifizierens der Oberflächenmodifizierungen L auf den äußeren Oberflächen 02 mit s äußeren Oberflächen 02 im wesentlichen vollständig modifiziert werden können, im wesentlichen nicht mischbar ist, aus den Poren P und den inneren Hohlräumen H.
Bei diesem Verfahren werden im Gegensatz zum vorgenannten die inneren Hohlräume sowie die Poren mit einem Medium gefüllt, welches unter den Bedingungen des Füllens flüssig ist und, welches unter den Bedingungen des Modifizierens der Oberflächenmodifizierungen L auf den Oberflächen 02 mit einer Lösung im wesentlichen nicht mischbar ist, mit welcher die Oberflächenmodifizierungen L auf den Oberflächen 02 der Hohlfasern im wesentlichen vollständig modifiziert werden können.
Somit lassen sich Adsorber herstellen, welche entweder nur auf den Oberflächen 01 der Poren P oder auf den Oberflächen 01 der Poren P sowie der luminalen Oberflächen 03 der Innenräume H die Oberflächenmodifizierungen L' aufweisen.
Erfindungsgemäß können als poröses Trägermaterial verschiedenartigste Materialien verwendet werden. Zudem eignen sich diese Materialien auch zur Herstellung der verwendeten Hohlfasern. Beispiele für geeignete
Trägermaterialien bzw. Hohlfasern umfassen Silica, Silicone, Polytetrafluorethylen (Teflon®), Polyesterurethane, quervemetztes Polyvinylalkohol, quervemetzte Cellulose, quervernetzte Agarose, quervemetztes Dextran, verseifte Ethylen- Vinylacetate, Polyetherurethane, Polyurethane, Polyethylenterephthalate, Polysaccharide, Polypeptide, Polyethylene, Polyester, Polystyrole, Polyolefine, Polysulfonate, Polypropylen, Polyethersulfone, Polypyrrole, Polyvinylpyrrolidone, Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Polyorthoester, Aluminiumoxid, Gläser, Sepharose, Kohlenhydrate sowie organische Materialien, wie Copolymere von Acrylaten oder Methacrylaten sowie Polyamiden. Vorzugsweise besteht das Trägermaterial aus organischem Material und besonders bevorzugt sind Copolymere von Acrylsäureestem oder Methacrylsäureestem und/oder Acrylsäureamiden oder Methacrylsäureamiden, beispielsweise Polyacrylsäure- Polyethylen-Copolymere, Polyacrylamid-Polyethylen-Copolymere. Ferner ist zudem vorteilhaft, wenn derartige Copolymere Epoxidgruppen als funktioneile Gruppen tragen. Weitere erfindungsgemäß einsetzbare Copolymere können beispielsweise durch Suspensionspolymerisation hergestellt werden. Ein derartiges Copolymer ist im Handel unter der Bezeichnung Toyopearl AF-Epoxy-650M (TosoHaas) erhältlich. Bevorzugt sind zudem statistische Copolymere hergestellt durch Polymerisation von Ethylenglycoldiacrylat oder Ethylenglycoldimethacrylat und Glycidylacrylat oder Glycidylmethacrylat und/oder Allylglycidether.
Für Honitasern eignen sich insbesondere Silicone, Polytetrafluorethylen (Teflon®), Polyesterurethane, Polyetherurethane, Polyurethane, Polyethylenterephthalate, Polysaccharide, Polypeptide, Polyethylene, Polyester, Polystyrole, Polyolefine, Polysulfonate, Polysulfone, Polypropylen, Polyethersulfone, Polypyrrole, Polyvinylpyrrolidone, Polymilchsäure, Polyglycolsäure und Polyorthoester.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren zur Herstellung eines Adsorbers, umfaßt die folgenden Schritte: a) Bereitstellen von porösen Hohlfasern, welche auf den Oberflächen 01 , 02 und 03 modifizierbare funktioneile Gruppen aufweisen; b) Füllen der Poren P der Hohlfasern mit mindestens einem unter den Bedingungen des Füllens flüssigen Medium, welches unter den Bedingungen des Modifizierens der funktionellen Gruppen auf den
Oberflächen 02 und 03 mit einer Lösung im wesentlichen nicht mischbar ist, mit welcher die funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 02 und 03 der Hohlfasern im wesentlichen vollständig modifiziert werden können; c) im wesentlichen vollständiges Modifizieren der funktionellen Gruppen zu den Oberflächenmodifizierungen L' auf den Oberflächen 02 und 03; und d) Entfernen des Mediums, welches unter den Bedingungen des Modifizierens der funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 02 und 03 mit einer Lösung, mit welcher die funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 02 und 03 im wesentlichen vollständig modifiziert werden können, im wesentlichen nicht mischbar ist, aus den Poren P.
Bei diesem Verfahren werden Hohlfasern eingesetzt, deren Poren P mit einem flüssigen Medium gefüllt werden, welches unter den Bedingungen des Modifizierens der funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 02 und 03 mit einer Lösung im wesentlichen nicht mischbar ist, mit welcher die funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 02 und 03 der Hohlfasern im wesentlichen vollständig modifiziert werden können, bevor die besagte Modifizierung der funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 02 und 03 durchgeführt wird. Erfindungsgemäß bedeutet der Begriff "im wesentlichen vollständiges Modifizieren", daß im wesentlichen alle auf einer Oberfläche des Trägermaterials oder der Hohlfasern vorhandenen nicht durch das Medium bedeckten funktionellen Gruppen oder Oberflächenmodifizierungen umgesetzt werden, und somit im wesentlichen keine freien bzw. modifizierbaren funktionellen Gruppen oder Oberflächenmodifikationen mehr auf der jeweiligen Oberfläche des Trägermaterials bzw. der Hohlfaser verbleiben. Um eine derartige, im wesentlichen vollständige Modifizierung zu bewirken, enthalten die jeweiligen Reaktionslösungen vorzugsweise jeweils einen Überschuß an Modifizierungsmittel.
Der Begriff "Modifizieren" umfaßt das Verändern, Umsetzen, Schaffen und/oder Zerstören von funktionellen Gruppen auf den jeweiligen Oberflächen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt der Begriff des Modifizierens das Umsetzen der funktionellen Gruppen oder der Oberflächenmodifikationen mit Nucleophilen, Electrophilen oder Radikalen. Nach der im wesentlichen vollständigen Modifizierung wird die verwendete Lösung wieder entfernt.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren beschreibt die Herstellung eines Adsorbers, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellen von porösen Hohlfasern, welche auf den Oberflächen 01 , 02 und 03 modifizierbare funktioneile Gruppen aufweisen; b) Füllen der Poren P und der inneren Hohlräume H der Hohlfasern mit mindestens einem unter den Bedingungen des Füllens flüssigen Medium, welches unter den Bedingungen des Modifizierens der funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 02 mit einer Lösung im wesentlichen nicht mischbar ist, mit welcher die funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 02 der Hohlfasern im wesentlichen vollständig modifiziert werden können; c) im wesentlichen vollständiges Modifizieren der funktionellen Gruppen zu den Oberflächenmodifizierungen L' auf den Oberflächen 02; und d) Entfernen des Mediums, welches unter den Bedingungen des Modifizierens der funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 02 mit einer Lösung, mit welcher die funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 02 im wesentlichen vollständig modifiziert werden können, im wesentlichen nicht mischbar ist, aus den Poren P und den inneren Hohlräumen H. Bei diesem Verfahren hingegen werden nicht nur die Poren P sondern auch die inneren Hohlräume H mit einem Medium gefüllt, bevor die anschließende Modifizierung der funktionellen Gruppen vorgenommen wird. Nachdem nun entsprechend der beiden vorgenannten Verfahren die funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 02 bzw. auf den Oberflächen 02 und 03 zu den Oberflächenmodifizierungen L' umgesetzt worden sind, kann nach dem Entfernen des Mediums optional noch ein weiterer Verfahrensschritt durchgeführt werden, wobei die noch verbliebenen funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 01 und 03 bzw. 01 zu den Oberflächenmodifizierungen L umgesetzt werden.
Erfindungsgemäß weist das zu verwendende poröse Trägermaterial bzw. die zu verwendenden Hohlfasern auf ihren Oberflächen 01 , 02 sowie 03 modifizierbare funktioneile Gruppen auf. Diese funktionellen Gruppen können chemisch oder auch durch eine Strahlung, welche bevorzugt im UV- oder sichtbaren Bereich liegt, zu den Oberflächenmodifizierungen L bzw. L' umgesetzt werden. Je nach verwendetem Trägermaterial und je nach verwendeter Strahlung kann diese das Trägermaterial teilweise durchdringen oder nicht durchdringen, so daß zum einen mittels dieser Strahlung alle funktionellen Gruppen der Oberflächen 01 , 02 sowie 03 modifiziert werden können oder bei einer das Trägermaterial nicht durchdringenden Strahlung die Modifizierung der funktionellen Gruppen nur auf den Oberflächen 02 stattfinden kann.
Als modifizierbare funktionelle Gruppen sind gespannte heterocyclische Systeme bevorzugt, welche durch nucleophile oder electrophile Ringöffnung modifiziert werden können. Hierbei ist die nucleophile Ringöffnung bevorzugt. Durch eine derartige Ringöffnung lassen sich kovalent weitere funktionelle Reste, chemische Gruppen oder Moleküle an die funktionellen Gruppen binden, so daß sich die Oberflächenmodifikationen L bzw. L' ergeben, wobei die Oberflächenmodifikation L' mit den funktionellen Gruppen identisch sein können.
Weitere funktionelle Gruppen, welche erfindungsgemäß Verwendung finden können, umfassen Amine, bevorzugt primäre Amine, welche sich mit Carbonylverbindungen zu Iminen umsetzen lassen und anschließend gegebenenfalls durch Hydrierung zu einer stabileren Aminbindung umgesetzt werden können. Darüber hinaus können an Amine Carbonsäuren über eine Amidbindung immobilisiert werden. Verwendung finden zudem Aziridine, Oxirane, Oxaziridine, Maleinimide, N-Succinimidylester, N-Hydroxysuccinimide, Hydrazide, Azide, Aldehyde, Ketone, Carbonsäuren, Carbonsäureester, Säureanhydride, Thiole, Silanole, Nitrile sowie Verbindungen mit Chlormethylgruppen und Gemische der vorgenannten funktionellen Gruppen.
Durch diese chemische oder photochemische Modifizierung erhält man Adsorber, welche auf den Oberflächen 02 bzw. den Oberflächen 02 und 03, je nachdem welches erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt wird, mindestens eine Oberflächenmodifizierung L' aufweisen, wodurch diese Oberflächen im wesentlichen nicht mit Blutzellen wechselwirken. Eine bevorzugte
Oberflächenmodifizierung der Oberflächen 01 bzw. der Oberflächen 01 und 03 stellt die Aminierung dar.
Ferner weisen die durch die erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Adsorber auf ihren Oberflächen 01 bzw. je nach verwendetem Herstellungsverfahren des Adsorbers auf den Oberflächen 01 sowie 03 mindestens eine Oberflächenmodifizierung L auf, welche mit im Blut enthaltenen Substanzen wechselwirkt. Bei diesen im Blut enthaltenen Substanzen handelt es sich vorrangig um die eingangs erwähnten Schadstoffe, welche aus dem Vollblut oder Plasma zu entfernen sind. Zudem ist bevorzugt, daß die
Oberflächenmodifikationen L und L' durch kovalente Bindungen mit den entsprechenden Oberflächen verknüpft werden. Eine andersartige Anbindung, beispielsweise durch hydrophobe, elektrostatische und/oder ionische Wechselwirkungen, ist jedoch auch möglich.
Erfindungsgemäß wird unter "Oberflächenmodifizierung" eine organische Endgruppe, ein organischer Rest, eine Substanz, ein Teil einer Substanz oder ein Molekül bzw. ein Teil eines Moleküls verstanden, welches geeignet ist, an eine funktionelle Gruppe des porösen Trägermaterials bzw. der Hohlfasern gebunden zu werden.
Die Oberflächenmodifikationen L' weisen erfindungsgemäß die Eigenschaft auf, im wesentlichen keine Wechselwirkungen mit Blutzellen zu haben, so daß die äußeren Oberflächen des Trägermaterials bzw. der Hohlfasern gegenüber den Blutzellen inert sind. Dies bedeutet, daß diese Oberflächen mit Vollblut kompatibel sind und im Vollblut enthaltene Blutzellen bzw. Blutkörperchen im wesentlichen nicht schädigen, verletzen, adsorbieren und/oder aktivieren.
Derartige mit Vollblut kompatiblen Oberflächenmodifizierungen L' umfassen mindestens eine Substanz ausgewählt aus der Gruppe, welche Carbonsäuren, Polycarbonsäuren, Polyacrylsäuren, Oligoacrylsäuren, Albumin, Heparin, Heparinderivate, Heparansulfat, Glykosaminoglykane, Oligosaccharide, Polysaccharide und Chitosanderivate umfaßt.
Für die Oberflächen der porösen Teilchen bzw. der Hohlfasern, welche aufgrund ihrer inneren Lage nicht mit Blutzellen oder Blutkörperchen in Kontakt kommen, ist eine oben beschriebene Kompatibilität nicht nötig. Diese Oberflächen 01 bzw. je nach verwendetem Verfahren zur Herstellung des Adsorbers 01 und 03 tragen erfindungsgemäß Oberflächenmodifikationen L, welche im Vollblut oder Plasma enthaltene Schadstoffe oder Moleküle binden können. Die Fähigkeit, vorzugsweise selektive Wechselwirkungen mit bestimmten, in einer Lösung enthaltenen Substanzen, Teilen von Substanzen oder Substanzgruppen zu zeigen, besitzen sogenannte Immunadsorber. Diese Immunadsorber eignen sich somit insbesondere als Oberflächenmodifikation L. Vorteilhaft ist es im speziellen, als mindestens eine Oberflächenmodifizierung L mindestens eine Substanz aus der Gruppe auszuwählen, welche Peptide, Proteine, monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörpern, Fragmente von Antikörpern, synthetische Antigene, natürliche Antigene, Autoimmunantikörper, Monosaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide, Thiole, Oligonucleotide, Polynucleotiden, Peptidantibiotika, native sowie rekombinante DNA bzw. RNA als auch Aminosäuren und deren Derivate, insbesondere Histidin oder Tryptophan, Polyaminosäuren, heterocyclische Amine wie Tryptamin oder Histamin, Glycoproteine, Lipide, Lipoproteine, Komplement, Antiimmunoglobulinantikörper, synthetische Polyanionen wie Polyvinylsulfat, Polyacrylsäure Polyphosphorsäureester und deren Kombinationen umfaßt.
Die Oberflächenmodifikation L wechselwirkt somit mit im Blut enthaltenen Substanzen, wobei nur solche Substanzen mit den Oberflächenmodifikationen L in Kontakt treten können, welche abhängig von der gewählten Porengröße klein genug sind, um in die Poren P eindringen zu können. Die
Oberflächenmodifikation L ist daher eine sogenannte funktionelle Oberflächenmodifizierung, wobei unter funktioneller Oberflächenmodifizierung beispielsweise Separationseffektoren oder auch Katalysatoren oder Enzyme verstanden werden. Derartige Separationseffektoren erzeugen selektive Wechselwirkungen, die für chromatographische Trennungen oder andere Verteilungsverfahren, Trennungs- oder Reinigungsverfahren, wie der Flüssig- Flüssig-Verteilung, eingesetzt werden können. Somit eignen sich die erfindungsgemäßen Adsorber nicht nur zur Entfernung von Substanzen aus Vollblut oder Plasma, sondern allgemein zur selektiven Entfernung von bestimmten Substanzen aus einem komplexen Gemisch verschiedenster Stoffe, Substanzen und/oder Zellen oder anderer Teilchen, welche neben chemischen Stoffen, Metallen oder Metallionen sowie Biomolekülen auch ganze Zellen, Blutkörperchen, Bakterien, Viren oder ähnliches umfassen.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren zur Herstellung eines Adsorbers ist nicht auf Hohlfasern beschränkt, sondern verwendet beliebige poröse Trägermaterialien und umfaßt die folgenden Schritte: a) Bereitstellen eines porösen Trägermaterials, welches auf seinen inneren
Oberflächen 01 und seinen äußeren Oberflächen 02 modifizierbare funktionelle Gruppen aufweist; b) Füllen der Poren P des porösen Trägermaterials mit mindestens einem unter den Bedingungen des Füllens flüssigen Medium, welches unter den Bedingungen des Modifizierens der funktionellen Gruppen auf den äußeren
Oberflächen 02 mit einer Lösung im wesentlichen nicht mischbar ist, mit welcher die funktionellen Gruppen auf den äußeren Oberflächen 02 des porösen Trägermaterials im wesentlichen vollständig modifiziert werden können; c) im wesentlichen vollständiges Modifizieren der funktionellen Gruppen zu den Oberflächenmodifizierungen L' auf den äußeren Oberflächen 02; d) Entfernen des Mediums, welches unter den Bedingungen des Modifizierens der funktionellen Gruppen auf den äußeren Oberflächen 02 mit einer Lösung, mit welcher die funktionellen Gruppen auf den äußeren Oberflächen 02 im wesentlichen vollständig modifiziert werden können, im wesentlichen nicht mischbar ist, aus den Poren P; und gegebenenfalls e) im wesentlichen vollständiges Modifizieren der funktionellen Gruppen zu den Oberflächenmodifizierungen L auf den inneren Oberflächen 01.
Bei diesem Verfahren erfolgt als letzter Schritt die Umsetzung der funktionellen Gruppen auf den inneren Oberflächen 02 zu den Oberflächenmodifizierungen L.
Bevorzugt wird zur Modifizierung der funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 02 oder auf den Oberflächen 02 sowie 03 eine auf Wasser basierende Lösung verwendet. Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform verwendet für diese Modifizierung eine das Trägermaterial oder die Hohlfaser im wesentlichen durchdringende oder eine im wesentlichen nicht durchdringende Strahlung. Der Begriff "unter den Bedingungen des Füllens flüssiges Medium" umfaßt erfindungsgemäß Medien, welche in die Poren eines Trägermaterials oder der Hohlfasern eingebracht bzw. eingefüllt und aus diesen Poren wieder im wesentlichen vollständig entfernt werden können.
Derartige Medien umfassen vor allem hydrophobe organische Medien. Beispiele für hydrophobe organische Medien sind lineare Ce- bis C2o-Alkane, verzweigte C6- bis C20-Alkane, cyclische C6- bis C2u-Alkane, lineare oder verzweigte Alkanketten- tragende Ce- bis C2o-Cycloalkane, C6- bis C2o-Arylalkane, lineare oder verzweigte Alkanketten-tragende C6- bis C20-Aromaten, C6- bis C22-Aromaten, lineare C&- bis C2o-Alkanole, verzweigte Cβ- bis C2o-Alkanole, cyclische Cβ- bis C20-Alkanole, lineare oder verzweigte Alkanketten-tragende C6- bis C2o-Cycloalkanole, C6- bis C20-Hydroxyarylalkane, lineare oder verzweigte Hydroxyalkanketten-tragende Ce- bis C2o-Aromaten, lineare CQ- bis C30-Carbonsäureester, verzweigte Cβ- bis C30- Carbonsäureester, cyclische Ce- bis C3o-Carbonsäureester, cyclische mit linearen oder verzweigten Alkanketten substituierte Ce- bis C30-Carbonsäureester, C6- bis C3o-Arylcarbonsäureester, aromatische mit linearen oder verzweigten Alkanketten substituierte C - bis C30-Carbonsäureester. Auch Mischungen der vorbezeichneten Substanzen können erfindungsgemäß eingesetzt werden.
Zu den C6- bis C2o-Alkanen zählen beispielsweise Hexan, Heptan, Octan, Nonan, Decan, Cyclohexan, und Dodecan.
Zu den C6- bis C2u-Alkanolen zählen beispielsweise Hexanol, Octanol, Decanol, Undecanol und Dodecanol.
In der Regel wird es sich bei dem besagten Medium um eines handeln, welches bei Raumtemperatur flüssig ist. Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann jedoch auch ein bei Raumtemperatur gasförmiges Medium verwendet werden. Dann werden die Poren P beispielsweise bei erniedrigter Temperatur und/oder erhöhtem Druck mit dem unter den Bedingungen des Füllens flüssigen Mediums gefüllt. Unter vergleichbaren Bedingungen werden sodann die funktionellen Gruppen auf den Oberflächen modifiziert. Diese Ausführungsform hat den Vorteil, daß ein bei Raumtemperatur gasförmiges Medium besonders leicht wieder aus den Poren P zu entfernen ist.
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform kann auch ein Medium eingesetzt werden, welches unter den Bedingungen des Füllens flüssig, bei Raumtemperatur und Normaldruck jedoch fest ist. Die Poren der Hohlfasern bzw. des porösen Trägermaterials werden dann bei erhöhter Temperatur mit dem Medium gefüllt. Diese Ausführungsform weist den Vorteil einer besonders dauerhaften und inerten Füllung der inneren Poren P bzw. Hohlräume H auf, wodurch zur Modifizierung der funktionellen Gruppen der äußeren Oberflächen auch drastischere Bedingungen, d.h. chemisch aggressivere Bedingungen, verwendet werden können.
In der Praxis kann dieses Füllen der Poren P bzw. Hohlräume H mit einem Medium durchgeführt werden, indem im einfachsten Fall die Hohlfasern bzw. die Teilchen des porösen Trägermaterials in ein bei Raumtemperatur flüssiges Medium eingetaucht und mit diesem aufgequollen werden, so daß die Luft im wesentlichen vollständig aus den Poren P und je nach verwendetem Verfahren aus den Hohlräumen H verdrängt wird. Ferner können die Teilchen bzw. Hohlfasern auch in einen luftdichten Behälter gegeben werden, woraufhin die Luft aus dem Behälter und somit auch aus den Poren bzw. Hohlräumen durch Anlegen eines Vakuums entfernt wird, und das Medium, welches unter diesen Bedingungen flüssig ist, in die Poren P bzw. Hohlräume H eindringen kann.
Nach dem Aufquellen der Teilchen bzw. Hohlfasern kann das überschüssige flüssige Medium beispielsweise mit einer Nutsche von den Hohlfasern bzw. Trägermaterialteilchen abgesaugt werden, ohne daß das in den Poren P bzw. Hohlräumen H enthaltene Medium wieder entfernt wird. Anschließend wird die Reaktionslösung zum Modifizieren der funktionellen Gruppen der äußeren Oberflächen 02 bzw. je nach verwendetem erfindungsgemäßem Verfahren der äußeren Oberflächen 02 sowie der luminalen Oberflächen 03 zugegeben. Die Lösung zum Modifizieren der durch das Medium nicht bedeckten funktionellen Gruppen ist im wesentlichen mit dem besagten Medium nicht mischbar, um ein Freilegen der durch das Medium bedeckten Gruppen zu verhindern.
Nach der erfolgten Modifizierung wird das Medium beispielsweise durch Absaugen, Auswaschen, Erwärmen, Anlegen von Vakuum und/oder Zentrifugation wieder entfernt.
Des weiteren offenbart die vorliegende Erfindung Adsorber, welche nach einem der vorgenannten Verfahren hergestellt werden. Besonders bevorzugt sind Adsorber in Form von Hohlfasern mit einer mittleren Porengröße von < 1 ,5 μm. Der innere, luminale Durchmesser (D1 ) der porösen Hohlfasern kann zwischen 0 und 5 mm, bevorzugt zwischen 0 und 1 mm liegen.
Die vorliegende Erfindung offenbart weiterhin eine Vorrichtung zur Abtrennung von Biomolekülen und/oder pathogenen Stoffen aus Vollblut und/oder Plasma, umfassend ein Gehäuse, in dem der Adsorber in Form von porösen Teilchen oder Hohlfasern als lose Teilchen oder Fasern und/oder als Bündel lose und/oder fest mit dem Gehäuse verklebt, enthalten ist, wobei das Gehäuse mindestens einen Einlaß und mindestens einen gegebenenfalls mit einem Partikelfilter versehenen Auslaß aufweist.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfaßt ein Gehäuse mit vorzugsweise einem
Volumen von 10 ml bis 1250 ml.
Die vorliegende Erfindung offenbart ferner ein Verfahren zur Abtrennung von
Biomolekülen und/oder pathogenen Stoffen aus Vollblut und/oder Plasma, umfassend die Schritte: a) Bereitstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung; b) Durchleiten von Vollblut und/oder Plasma; und gegebenenfalls c) Regeneration des Adsorbers.
Insbesondere wird ein Adsorber für Vollblut in Form von im wesentlichen hohlen, nicht-aggregierten Teilchen bereitgestellt. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet Hohlfasern als Adsorptionsmaterial. Derartige Hohlfasern haben vorzugsweise einen Innendurchmesser (D1 ) von < 5 mm und einen Außendurchmesser (D2) von < 6 mm.
Die äußere Oberfläche 02 des Adsorptionsmaterials weist mindestens eine Oberflächenmodifizierung L' auf und die Oberfläche 01 der Poren P mindestens eine Oberflächenmodifizierung L. Die Oberflächen 03 der inneren Hohlräume H können je nach verwendetem Verfahren zur Herstellung des Adsorbers entweder die Oberflächenmodifikation L oder die Oberflächenmodifikation L' aufweisen.
Durch die Oberflächenmodifikationen L' der äußeren Oberfläche 02 wird im wesentlichen eine Vollblutverträglichkeit erhalten, da die äußere Oberfläche fast ausschließlich in Wechselwirkung mit den Blutzellen tritt. Je nach verwendetem erfindungsgemäßen Verfahren weisen die Oberflächen 01 oder zusätzlich auch die Oberflächen 03 bevorzugt Oberflächenmodifizierungen L auf, welche mit im Blut enthaltenen Substanzen wechselwirken können.
Die vorliegende Erfindung beseitigt dadurch die erwähnten Nachteile der Verfahren des Standes der Technik.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, daß das Blut nicht in Plasma und zelluläre Bestandteile getrennt zu werden braucht, sondern als Ganzes durch ein Adsorptionsmaterial geleitet werden kann, das vorzugsweise fest mit und/oder in einem Gehäuse gelagert ist. Der Adsorber trägt die schadstoffbindenden Liganden, welche die im Vollblut enthaltenen Schadstoffe adsorbieren nur in seinen Poren P bzw. inneren Hohlräumen H, die zu klein sind, um die zellulären Bestandteile des Vollblutes aufzunehmen. Dadurch, daß der Adsorber fest mit dem Gehäuse verbunden ist, besteht kein Risiko, daß Adsorberpartikel in den Blutkreislauf geraten. Da die schadstoffbindenden Oberflächenmodifikationen L sich nur in den für Zellen unzugänglichen Poren P bzw. inneren Hohlräumen H befinden, können sie keine zeilschädigende Wirkung entfalten. Die Entfernung der Schadstoffe ist wesentlich vollständiger, da das gesamte Blutvolumen mit dem Adsorber in Kontakt kommt und nicht nur das von den zellulären Bestandteilen abgetrennte Plasma. Die zusätzliche Belastung des Patienten durch die Trennung in Plasma und zelluläre Bestandteile entfällt.
Ferner können die erfindungsgemäßen Adsorber nicht nur für die Entfernung von schädlichen Stoffen aus Vollblut oder Plasma eingesetzt werden, sondern finden überall dort Verwendung, wo chemische Stoffe jeglicher Art aus einer lebende Zellen enthaltenden Lösung oder Suspension abgetrennt werden sollen.
Dementsprechend können die erfindungsgemäßen Adsorber zur zeilschonenden Abtrennung von zytotoxischen Stoffen aus Zellkulturlösungen oder Fermentationslösungen verwendet werden, indem der Adsorber mit und/oder in einem geeigneten Gehäuse verklebt wird oder durch einen Partikelfilter im Gehäuse zurückgehalten wird und man die entsprechende Zellkulturlösung oder Fermentationslösung durchleitet. Bevorzugt ist der Einsatz dieser Adsorber zur zellschonenden Abtrennung extrazellulär gebildeter Biomoleküle aus Zellkultur- oder Fermentationsmedien, ohne daß zelluläre Bestandteile und Nährmedium voneinander getrennt werden müßten. Bei diesen Biomolekülen kann es sich um Proteine, Enzyme oder andere Substanzen bevorzugt mit pharmakologischer Wirksamkeit handeln. Figurenbeschreibung
Figur 1 zeigt schematisch einen Querschnitt durch eine Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Adsorbers in Form einer porösen Hohlfaser, welche auf ihren äußeren Oberflächen 02 und den luminalen Oberflächen 03 der Hohlräume H die Oberflächenmodifikationen L' trägt, wodurch eine Blutverträglichkeit erreicht wird, und auf den inneren Oberflächen 01 der Poren P die Oberflächenmodifikationen L aufweist, welche die Fähigkeit haben, schädliche Stoffe aus dem Vollblut zu adsorbieren. Ein derartiger Hohlfaseradsorber kann beispielsweise nach einem erfindungsgemäßen Verfahren gemäß Anspruch 2 oder Ansprüche 4 und 5 hergestellt werden.
Figur 2 zeigt schematisch einen Querschnitt durch eine Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Adsorbers in Form einer porösen Hohlfaser, welche auf ihren äußeren Oberflächen 02 die Oberflächenmodifikationen L' trägt, wodurch eine Blutverträglichkeit erreicht wird, und auf den inneren Oberflächen 01 der Poren P und den luminalen Oberflächen 03 der Hohlräume H die Oberflächenmodifikationen L aufweist, welche die Fähigkeit haben, schädliche Stoffe aus dem Vollblut zu adsorbieren. Ein derartiger Hohlfaseradsorber kann beispielsweise nach einem erfindungsgemäßen Verfahren gemäß Anspruch 3 oder Ansprüche 6 und 7 hergestellt werden.
Figur 3 zeigt schematisch einen Querschnitt durch eine Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Adsorbers in Form eines porösen Teilchens, welches auf seiner äußeren Oberflächen 02 die Oberflächenmodifikationen L' trägt, wodurch eine Blutverträglichkeit erreicht wird, und auf seine inneren Oberflächen 01 der Poren P die Oberflächenmodifikationen L aufweist, welche die Fähigkeit haben, schädliche Stoffe aus dem Vollblut zu adsorbieren. Ein derartiger Adsorber kann beispielsweise nach einem erfindungsgemäßen Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 8 hergestellt werden.
Figur 4 ist die graphische Darstellung eines Elutionsdiagramms zur Bestimmung der TSST 1 Adsorption durch Induktion der TNF-α Ausschüttung von Lymphozyten. Beispiele
Beispiel 1 :
In 200 ml einer 0,1 m MES (2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure) Pufferlösung (pH 4,75) werden 75mg CME-CDI (N-Cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimid- methyl-p-toluolsulfonat) bei 4°C vollständig aufgelöst. 75 mg Polyacrylsäure, in 25 ml MES-Puffer gelöst, werden zur Lösung gegeben und auf pH 4,75 bei 4°C eingestellt 75 ml aminierte Trägermaterialteilchen der Firma TosoHaas mit einer Partikelgröße von 65μm und einer durchschnittlichen Porengröße von 1 ,5 μm (Toyopearl AF-Amino-650M mit 100μmol NH2/ml ) werden mit der oben beschriebenen Lösung versetzt, geschüttelt und in einem Rundkolben über Nacht bei 4°C rotiert.
Die Trägermaterialteilchen werden abgesaugt mit Wasser, 4m NaCI und wieder mit Wasser gewaschen und im Vakuumexsiccator über CaCI2 getrocknet.
Zur Aktivierung der Carboxylgruppe werden die derart modifizierten Teilchen wieder mit 200 ml der oben genannten CME-CDI -Lösung bei 4°C für 30 Minuten in einem Rundkolben rotiert und möglichst schnell mit 250 ml 4°C kaltem 0,1 M MES Puffer (pH4,75) gespült. Nach Entfernung der Spüllösung wird eine Lösung von 1 g TSST 1 -bindendes Peptid (TSST: toxic shock syndrom toxin 1 bindendes Peptid, Auftragssynthese bei Bachern, Sequenz: GADRSYLSFIHLYPELAGA) in 200 ml 0,1 M MES Puffer bei 4°C für 18 Stunden zugesetzt und rotiert. Danach wird mit Wasser, mit 4 M Kochsalzlösung und wieder mit Wasser gespült und im Vakuum vollständig getrocknet.
Die getrockneten " Teilchen werden vollständig mit Dodecanol gefüllt und nach 10 Minuten wieder abgesaugt und auf 4°C gekühlt.
Entfernung des TSST 1 -bindenden Peptides von der äußeren Oberfläche:
Die gekühlten Teilchen werden mit 4°C kalter 6 M Salzsäure gefüllt und 15 Stunden bei 4°C gelagert. Anschließend wird abdekantiert, mit 4°C kaltem Wasser pH neutral gespült und anschließend mit 40°C warmem Isopropanol gespült. Es wird erneut mit Wasser, mit 4 M NaCI und erneut mit Wasser gespült und im Vakkuumexsiccator über CaCI2 getrocknet. Beispiel 2:
Ein Mikrofiltrationsmodul der A/G Technology Corporation mit der Porengröße 0,65 μm, einem inneren Durchmesser der Hohlfasern von 0,5 mm und einer Membranfläche von 0,14 m2 wurde im Kreis mit einer Lösung von 94 mg FeS0 X 7 H20 und 84 mg Na2S205 in 200 ml Wasser durchspült. Nach 15 Minuten werden in das Vorratsgefäß zuerst 3,4 ml Methacrylsäure und 2 Minuten danach 3,4 ml Wasserstoffperoxyd (30%ig) gegeben. Anschließend wird die Lösung noch 2 weitere Stunden im Kreis gepumpt. Danach wird das Mikrofiltrationsmodul zur Entfernung von Reagenzienresten gleichzeitig auf der Innen- und Außenseite der Hohlfasern 4 Stunden lang mit fließendem Wasser gespült. Das Mikrofiltrationsmodul wird danach vollständig entleert.
In 220 ml einer 0,1 m MES (2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure) Pufferlösung (pH 4,75) werden 7,5g CME-CDI (N-Cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimid- methyl-p-toluolsulfonat) bei 4°C vollständig aufgelöst. Diese Lösung wird bei 4°C
30 Minuten im Kreis durch das Mikrofiltrationsmodul gepumpt. Anschließend wird das Modul leergepumpt und möglichst schnell mit 250 ml 4°C kaltem 0,1 M MES
Puffer (pH4,75) gespült. Nach Entfernung der Spüllösung wird eine Lösung von 1 g TSST 1 -bindendes Peptid (TSST: toxic shock syndrom toxin 1 bindendes
Peptid, Auftragssynthese bei Bachern, Sequenz: GADRSYLSFIHLYPELAGA) in
200 ml 0,1 M MES Puffer bei 4°C für 18 Stunden im Kreis gepumpt. Danach wird das Modul leergepumpt und mit Wasser, mit 4 M Kochsalzlösung und wieder mit
Wasser gespült und im Vakuum vollständig getrocknet.
Das getrocknete Mikrofiltrationsmodul wird vollständig mit Dodecanol gefüllt und nach 10 Minuten wieder vollständig geleert. Das Modul wird auf 4°C gekühlt.
Entfernung des TSST 1 -bindenden Peptides von der äußeren und luminalen Oberfläche:
Das gekühlte Modul wurde mit 4°C kalter 6 M Salzsäure in und um die Hohlfasern gefüllt und 15 Stunden bei 4°C gelagert. Anschließend wird das Modul geleert, mit 4°C kaltem Wasser pH neutral gespült und anschließend mit 40°C warmem Isopropanol gespült. Danach wurde noch einmal mit Wasser, mit 4 M Kochsalzlösung und erneut mit Wasser gespült und getrocknet. Beispiel 3:
Immobilisierung von Heparin auf der äußeren und luminalen Hohlfaseroberfläche:
Zur Heparinisierung der äußeren und luminalen Hohlfaseroberfläche wird das wie in Beispiel 2 beschriebene Modul vollständig mit Dodecanol gefüllt und nach 10 Minuten derart geleert, dass die Poren mit Dodecanol gefüllt bleiben und anschließend auf 4°C gekühlt.
In 220 ml einer 0,1 m MES (2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure) Pufferlösung (pH 4,75) werden 7,5g CME-CDI (N-Cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)carbodiimid- methyl-p-toluolsulfonat) bei 4°C vollständig aufgelöst. Diese Lösung wird zur Aktivierung der Carboxylgruppen bei 4°C 30 Minuten im Kreis durch das Mikrofiltrationsmodul gepumpt. Nach Entfernen der Aktivierungslösung wird möglichst schnell mit 250 ml kaltem MES-Puffer gründlich gespült und mit der Immobilisierungslösung versetzt.
Die Immobilisierungslösung wird durch Lösen von 1 ,5 g Heparin in 275 ml einer 0,1 m MES-Pufferlösung (pH 4,75) hergestellt. Die Immobilisierungslösung wird bei 4°C über Nacht, (18h) durch das Modul umgepumpt.
Zur Entfernung des nicht kovalent gebundenen Heparins wird bei 4°C mit 4 M NaClaq und anschließend mit Wasser für 30 Minuten und anschließend mit 40°C warmem Isopropanol zur Entfernung des Dodecanols gespült. Danach wird noch einmal mit Wasser, mit 4 M Kochsalzlösung und erneut mit Wasser gespült und getrocknet.
Beispiel 4:
Quantitative Bestimmung des immobilisierten Heparins auf den Hohlfaseroberflächen:
Das Modul wird geöffnet und mit Heparin modifizierte Proben werden entnommen.
Die für die Analytik zur Verfügung stehende Oberfläche sollte dabei 20 cm2 nicht unterschreiten. Die Probe wird nach genauer Bestimmung der vorhandenen Oberfläche zerschnitten und in ein Hydrolyserohr gegeben. Für die Heparinbestimmung werden als Heparinstandardlösung 2-4 mg Heparin genau eingewogen und in ein Hydrolyserohr gegeben.
Nach Zugabe von 10 ml 8M HCIaq werden die Hydrolyserohre dicht verschlossen und 4h auf 100°C im Trockenschrank erwärmt. Anschließend wird die Lösung quantitativ in einen Rundkolben überführt, wobei die Polymerüberreste im Hydrolyserohr verbleiben. Nach Einengen der Lösung zur Trockne werden einige ml dest. Wasser zugegeben und wieder zur Trockne eingeengt. Dies wird dreimal wiederholt. Der Rückstand wird in 10 ml dest. Wasser gelöst. Die Heparinstandardlösung wird 1 :100 mit dest. Wasser verdünnt.
Die Proben werden mit Hilfe der Anionenaustauschchromatographie mit gepulster amperometrischer Detektion vermessen. Berechnungsformel : XHeparin [pmθl/cm2] =
HepEmwaage [mg] • Sπ / HepFι • Fpro e [cm2] • 13.000.000 [mg/mol] • 100
Heparin = Heparingehalt auf der Probenoberfläche
HepEinwaage Heparin-Einwaage zur Herstellung der Heparinstandardlösung SFI Peakfläche (Glucosaminpeak) der Probe im Chromatogramm HepFι Peakfläche (Glucosaminpeak) des Heparinstandards im Chromatogramm
Fpra e Oberfläche des eingesetzten Materials
13.000.000 durchschnittliche Molmasse des Heparin
100 Verdünnungsfaktor der Heparinstandardlösung
Es wird ein Heparingehalt von 7,3 pmol/cm2 ermittelt.
Beispiel 5:
Messung der TSST 1 Adsorption durch Induktion der TNF-α Ausschüttung von Lymphozyten:
200 ml Blut wurde mit 40 μg TSST 1 (Sigma) versetzt und davon eine 1 ml Probe als positive Referenz entnommen. Der Rest wurde mit einer Flußrate von 1 ml/min durch den gemäß Beispiel 2 hergestellten Adsorber gepumpt. Von dem austretenden Blut wurden 10 ml Fraktionen aufgefangen. Dann wurden die Fraktionen und die positive Referenz 4 Stunden bei 37°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Danach wurden die Proben 15 min bei 600 g zentrifugiert und von allen Proben Plasma abpipettiert. Mit den so gewonnenen Plasmaproben wurde ein hTNF-α ELISA (human Tumor Necrosis Factor-α Emzyme Linked Immuno Sorbent Assay) der Firma Röche nach Gebrauchsanleitung durchgeführt:
Figure imgf000026_0001
K = Kontrolle
Graphisch ist das Versuchsergebnis wiedergegeben in Figur 4.
Beispiel 6:
Das Mikrofiltrationsmodul der A/G Technology Corporation wird vollständig mit Dodecanol gefüllt und nach 10 Minuten wieder geleert. Das Modul wird auf 4°C gekühlt. Es folgt die Durchspülung des Moduls im Kreis mit einer Lösung von 94 mg FeS0 X 7 H20 und 84 mg Na S20 in 200 ml Wasser bei einer Temperatur von 15°C. Nach 15 Minuten werden in das Vorratsgefäß zuerst 3,4 ml
Methacrylsäure und 2 Minuten danach 3,4 ml Wasserstoffperoxyd (30%ig) gegeben. Anschließend wird die Lösung noch 3 weitere Stunden im Kreis gepumpt. Danach wird das Mikrofiltrationsmodul zur Entfernung von
Reagenzienresten gleichzeitig auf der Innen- und Außenseite der Hohlfasern
4 Stunden lang mit kaltem fließendem Wasser gespült. Das Mikrofiltrationsmodul wird danach vollständig entleert. , Anschließend wird mit 40°C warmem Isopropanol zur Entfernung des Dodecanols gespült. Danach wird noch einmal mit Wasser, mit 4 M Kochsalzlösung und erneut mit Wasser gespült und getrocknet.
Beispiel 7:
Eine Lösung von 220 ml 0,02 m PBS-Puffer (pH 7,4), die 5 mg Streptavidin beinhaltet, wird 2h im Kreis durch das in vorangehenden Beispiel 6 modifizierte Mikrofiltrationsmodul gepumpt. Anschließend wird mit 220ml PBS-Puffer unter Zugabe von 1% NaN3 gespült. Die Lagerung des Moduls erfolgt in feuchtem Zustand bei 4-8°C.
Beispiel 8:
Sichtbarmachung des Streptavidin mit labelled Biotin-HRP/TMB:
220 μg horseradish peroxidase-labelled biotin (Biotin-HRP, biotinamidocaproyl- labelled Peroxidase von Sigma P2907) werden in 220 ml PBS-Puffer pH=7,4 0,05% Tween 20 gelöst und auf der Filtratseite 0,5h bei RT im Kreis durch das Filtrationsmodul gepumpt.
Anschließend wird 15 min mit PBS-Puffer gewaschen und 220 ml präzipitierendes TMB (3, 3', 5, 5'-Tetramethyl-Benzidine in saurem Puffer pH 5,5 mit 0,01 % H202) unter Lichtausschluß 1/2h bei RT inkubiert. Die folgenden Waschschritte mit PBS-Puffer (5min) und anschließend mit Wasser (10min) werden ebenfalls unter Ausschluß von Licht durchgeführt.
Das Modul wird sofort geöffnet und einige Fasern statistisch 5 Querschnitte genommen. Das Streptavidin in den Poren wird innerhalb der nächsten 15 Minuten durch eine intensive Blaufärbung eindeutig in den Poren der Faser lokalisiert (bei 80acher Vergrößerung, Stereolupe).
Beispiel 9:
Das Mikrofiltrationsmodul der A/G Technology Corporation wird hur von der Blutkreislaufseite aus mit Dodecanol gefüllt (50ml/min), so dass kein Dodecanol auf die Filtratseite austreten kann. Das Modul wird sofort auf 4°C gekühlt. Es folgt die Durchspülung des Moduls auf der Filtratseite im Kreis mit einer Lösung von 94 mg FeS0 X 7 H20 und 84 mg Na S205 in 200 ml Wasser bei einer Temperatur von 15°C. Nach 15 Minuten werden in das Vorratsgefäß zuerst 3,4 ml Methacrylsäure und 2 Minuten danach 3,4 ml Wasserstoffperoxyd (30%ig) gegeben. Anschließend wird die Lösung noch 3 weitere Stunden im Kreis gepumpt. Danach wird das Mikrofiltrationsmodul zur Entfernung von
Reagenzienresten auf der Außenseite der Hohlfasern 4 Stunden lang mit kaltem fließendem Wasser gespült. Das Mikrofiltrationsmodul wird danach vollständig entleert. Anschließend wird mit 40°C warmem Isopropanol zur Entfernung des Dodecanols gespült. Danach wird noch einmal mit Wasser, mit 4 M
Kochsalzlösung und erneut mit Wasser gespült und getrocknet.
Beispiel 10:
Eine Lösung von 220 ml 0,02 m PBS-Puffer (pH 7,4), die 5 mg Streptavidin beinhaltet, wird 2h im Kreis durch das in vorangehenden Beispiel 9 modifizierte Mikrofiltrationsmodul gepumpt. Es wird mit PBS-Puffer gespült unter Zugabe von 1 % NaN3. Die Lagerung des Moduls erfolgt in feuchtem Zustand bei 4-8°C.
Beispiel 11 :
Sichtbarmachung des Streptavidin mit labelled Biotin-HRP/TMB:
220 μg horseradish peroxidase-labelled Biotin (Biotin-HRP, biotinamidocaproyl- labelled Peroxidase von Sigma P2907) werden in 220 ml PBS-Puffer pH=7,4 0,05% Tween 20 gelöst und auf der Filtratseite 0,5h bei RT im Kreis durch das Filtrationsmodul gepumpt.
Anschließend wird 15 min mit PBS-Puffer gewaschen und 220 ml präzipitierendes TMB (3, 3', 5, 5 '-Tetramethyl-Benzidine in saurem Puffer pH 5,5 mit 0,01 % H202) unter Lichtausschluß 1/2h bei RT inkubiert. Die folgenden Waschschritte mit PBS-Puffer (5min) und anschließend mit Wasser (10min) werden ebenfalls unter Ausschluß von Licht durchgeführt.
Das Modul wird sofort geöffnet und statistisch einige Fasern entnommen. Pro Faser werden 5 Querschnitte hergestellt und das Streptavidin auf der luminalen Seite der Faser als auch in den Poren innerhalb der nächsten 15 Minuten durch eine intensive Blaufärbung lokalisiert (bei 80acher Vergrößerung, Stereolupe).

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung eines Adsorbers, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellen eines porösen Trägermaterials, welches auf seinen inneren Oberflächen 01 und seinen äußeren Oberflächen 02 modifizierbare funktionelle Gruppen aufweist; b) im wesentlichen vollständiges Modifizieren der funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 01 und 02 zu den Oberflächenmodifizierungen L; c) Füllen der Poren P des porösen Trägermaterials mit mindestens einem unter den Bedingungen des Füllens flüssigen Medium, welches unter den Bedingungen des Modifizierens der Oberflächenmodifizierungen L auf den äußeren Oberflächen 02 mit einer Lösung im wesentlichen nicht mischbar ist, mit welcher die Oberflächenmodifizierungen L auf den äußeren Oberflächen 02 des porösen Trägermaterials im wesentlichen vollständig modifiziert werden können; d) im wesentlichen vollständiges Modifizieren der Oberflächenmodifizierungen L zu den Oberflächenmodifizierungen L' auf den äußeren Oberflächen 02; und e) Entfernen des Mediums, welches unter den Bedingungen des Modifizierens der Oberflächenmodifizierungen L auf den äußeren Oberflächen 02 mit einer Lösung, mit welcher die Oberflächenmodifizierungen L im wesentlichen vollständig modifiziert werden können, im wesentlichen nicht mischbar ist, aus den Poren P.
2. Verfahren zur Herstellung eines Adsorbers, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellen von porösen Hohlfasern, welche auf den Oberflächen 01 , 02 und 03 modifizierbare funktionelle Gruppen aufweisen; b) im wesentlichen vollständiges Modifizieren der funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 01 , 02 und 03 zu den Oberflächenmodifizierungen L; c) Füllen der Poren P der Hohlfasern mit mindestens einem unter den Bedingungen des Füllens flüssigen Medium, welches unter den
Bedingungen des Modifizierens der Oberflächenmodifizierungen L auf den Oberflächen 02 und 03 mit einer Lösung im wesentlichen nicht mischbar ist, mit welcher die Oberflächenmodifizierungen L auf den Oberflächen 02 und 03 der Hohlfasern im wesentlichen vollständig modifiziert werden können; d) im wesentlichen vollständiges Modifizieren der Oberflächenmodifizierungen L zu den Oberflächenmodifizierungen L' auf den Oberflächen 02 und 03; und e) Entfernen des Mediums, welches unter den Bedingungen des Modifizierens der Oberflächenmodifizierungen L auf den Oberflächen 02 und 03 mit einer Lösung, mit welcher die Oberflächenmodifizierungen L auf den Oberflächen 02 und 03 im wesentlichen vollständig modifiziert werden können, im wesentlichen nicht mischbar ist, aus den Poren P.
3. Verfahren zur Herstellung eines Adsorbers, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellen von porösen Hohlfasern, welche auf den Oberflächen 01 ,
02 und 03 modifizierbare funktionelle Gruppen aufweisen; b) im wesentlichen vollständiges Modifizieren der funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 01 , 02 und 03 zu den Oberflächenmodifizierungen L; c) Füllen der Poren P und der inneren Hohlräume H der Hohlfasern mit mindestens einem unter den Bedingungen des Füllens flüssigen Medium, welches unter den Bedingungen des Modifizierens der Oberflächenmodifizierungen L auf den äußeren Oberflächen 02 mit einer Lösung im wesentlichen nicht mischbar ist, mit welcher die Oberflächenmodifizierungen L auf den äußeren Oberflächen 02 der
Hohlfasern im wesentlichen vollständig modifiziert werden können; d) im wesentlichen vollständiges Modifizieren der Oberflächenmodifizierungen L zu den Oberflächenmodifizierungen L' auf den äußeren Oberflächen 02; und e) Entfernen des Mediums, welches unter den Bedingungen des
Modifizierens der Oberflächenmodifizierungen L auf den äußeren Oberflächen 02 mit einer Lösung, mit welcher die Oberflächenmodifizierungen L auf den äußeren Oberflächen 02 im wesentlichen vollständig modifiziert werden können, im wesentlichen nicht mischbar ist, aus den Poren P und den inneren Hohlräumen H.
4. Verfahren zur Herstellung eines Adsorbers, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellen von porösen Hohlfasern, welche auf den Oberflächen 01 , 02 und 03 modifizierbare funktionelle Gruppen aufweisen; b) Füllen der Poren P der Hohlfasern mit mindestens einem unter den Bedingungen des Füllens flüssigen Medium, welches unter den Bedingungen des Modifizierens der funktionellen Gruppen auf den
Oberflächen 02 und 03 mit einer Lösung im wesentlichen nicht mischbar ist, mit welcher die funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 02 und 03 der Hohlfasern im wesentlichen vollständig modifiziert werden können; c) im wesentlichen vollständiges Modifizieren der funktionellen Gruppen zu den Oberflächenmodifizierungen L' auf den Oberflächen 02 und 03; und d) Entfernen des Mediums, welches unter den Bedingungen des
Modifizierens der funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 02 und 03 mit einer Lösung, mit welcher die funktionellen Gruppen auf den
Oberflächen 02 und 03 im wesentlichen vollständig modifiziert werden können, im wesentlichen nicht mischbar ist, aus den Poren P.
5. Verfahren nach Anspruch 4 umfassend zusätzlich den Schritt e): e) Im wesentlichen vollständiges Modifizieren der funktionellen Gruppen zu den Oberflächenmodifizierungen L auf den Oberflächen 01.
6. Verfahren zur Herstellung eines Adsorbers, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellen von porösen Hohlfasern, welche auf den Oberflächen 01 ,
02 und 03 modifizierbare funktionelle Gruppen aufweisen; b) Füllen der Poren P und der inneren Hohlräume H der Hohlfasern mit mindestens einem unter den Bedingungen des Füllens flüssigen Medium, welches unter den Bedingungen des Modifizierens der funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 02 mit einer Lösung im wesentlichen nicht mischbar ist, mit welcher die funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 02 der Hohlfasern im wesentlichen vollständig modifiziert werden können; c) im wesentlichen vollständiges Modifizieren der funktionellen Gruppen zu den Oberflächenmodifizierungen L' auf den Oberflächen 02; und d) Entfernen des Mediums, welches unter den Bedingungen des Modifizierens der funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 02 mit einer Lösung, mit welcher die funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 02 im wesentlichen vollständig modifiziert werden können, im wesentlichen nicht mischbar ist, aus den Poren P und den inneren Hohlräumen H.
7. Verfahren nach Anspruch 6 umfassend zusätzlich den Schritt e): e) Im wesentlichen vollständiges Modifizieren der funktionellen Gruppen zu den Oberflächenmodifizierungen L auf den Oberflächen 01 und 03.
8. Verfahren zur Herstellung eines Adsorbers, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellen eines porösen Trägermaterials, welches auf seinen inneren Oberflächen 01 und seinen äußeren Oberflächen 02 modifizierbare funktionelle Gruppen aufweist; b) Füllen der Poren P des porösen Trägermaterials mit mindestens einem unter den Bedingungen des Füllens flüssigen Medium, welches unter den Bedingungen des Modifizierens der funktionellen Gruppen auf den äußeren Oberflächen 02 mit einer Lösung im wesentlichen nicht mischbar ist, mit welcher die funktionellen Gruppen auf den äußeren Oberflächen 02 des porösen Trägermaterials im wesentlichen vollständig modifiziert werden können; c) im wesentlichen vollständiges Modifizieren der funktionellen Gruppen zu den Oberflächenmodifizierungen L' auf den äußeren Oberflächen 02; d) Entfernen des Mediums, welches unter den Bedingungen des Modifizierens der funktionellen Gruppen auf den äußeren Oberflächen
02 mit einer Lösung, mit welcher die funktionellen Gruppen auf den äußeren Oberflächen 02 im wesentlichen vollständig modifiziert werden können, im wesentlichen nicht mischbar ist, aus den Poren P; und e) im wesentlichen vollständiges Modifizieren der funktionellen Gruppen zu den Oberflächenmodifizierungen L auf den inneren Oberflächen 01.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 8, wobei zum Modifizieren der funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 02 oder auf den Oberflächen 02 sowie 03 eine auf Wasser basierende Lösung verwendet wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 8, wobei zum Modifizieren der funktionellen Gruppen auf den Oberflächen 02 oder auf den Oberflächen 02 sowie 03 eine Strahlung verwendet wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 10 wobei zum Füllen der Poren P oder zum Füllen der Poren P sowie der inneren Hohlräume H ein hydrophobes organisches Medium verwendet wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , wobei das hydrophobe organische Medium eine Substanz oder eine Mischung von Substanzen ist, welche aus der
Gruppe ausgewählt wird, die umfaßt: lineare C6- bis C20-Alkane, verzweigte Cβ- bis C2o-Alkane, cyclische C6- bis C20-Alkane, lineare oder verzweigte Alkanketten-tragende C6- bis C20- Cycloalkane, C6- bis C2o-Arylalkane, lineare oder verzweigte Alkanketten- tragende C6- bis C20-Aromaten, C6- bis C22-Aromaten, lineare Ce- bis C20-
Alkanole, verzweigte Ce- bis C20-Alkanole, cyclische Ce- bis C2o-Alkanole, lineare oder verzweigte Alkanketten-tragende C6- bis C20-Cycloalkanole, C6- bis C20-Hydroxyarylalkane, lineare oder verzweigte Hydroxyalkanketten- tragende C6- bis C2o-Aromaten, lineare C6- bis C30-Carbonsäureester, verzweigte C6- bis C30-Carbonsäureester, cyclische C6- bis C30-
Carbonsäureester, cyclische mit linearen oder verzweigten Alkanketten substituierte C6- bis C3o-Carbonsäureester, C6- bis C3o-Arylcarbonsäureester, aromatische mit linearen oder verzweigten Alkanketten substituierte C6- bis C30-Carbonsäureester.
13. Adsorber erhältlich nach einem der Verfahren gemäß mindestens eines Anspruchs 1 - 12.
14. Adsorber gemäß Anspruch T3 in Form von porösen Hohlfasern mit einer mittleren Porengröße von < 1 ,5 μm.
15. Adsorber nach Anspruch 13 oder 14, wobei der innere Durchmesser der porösen Hohlfasern zwischen 0 und 5 mm liegt.
16. Adsorber gemäß Anspruch 13 in Form von im wesentlichen sphärischen, nicht aggregierten Teilchen mit einer mittleren Porengröße von < 1 ,5 μm.
17. Adsorber nach Anspruch 13 oder 16, wobei die Teilchen eine Korngröße von 50 bis 500 μm aufweisen.
18. Adsorber gemäß einem der Ansprüche 13 - 17, wobei maximal 50% des Porenvolumens in Poren vorliegt, welche eine Porengröße von > 1 ,5 μm aufweisen.
19. Adsorber nach einem der Ansprüche 13 - 18, wobei die Oberflächen 02 oder die Oberflächen 02 sowie 03 mindestens eine Oberflächen- modifizierung L' aufweisen, wodurch diese Oberflächen im wesentlichen nicht mit Blutzellen wechselwirken.
20. Adsorber nach einem der Ansprüche 13 - 19, wobei die Oberflächen 01 oder die Oberflächen 01 sowie 03 mindestens eine Oberflächen- modifizierung L aufweisen, welche mit im Blut enthaltenen Substanzen wechselwirkt.
21. Adsorber nach einem der Ansprüche 13 - 20, wobei die Oberflächen 02 oder die Oberflächen 02 sowie 03 durch kovalente Bindung mindestens einer Oberflächenmodifizierung L' modifiziert sind.
22. Adsorber nach einem der Ansprüche 13 - 21 , wobei die Oberflächen 01 oder die Oberflächen 01 sowie 03 durch kovalente Bindung mindestens einer Oberflächenmodifizierung L modifiziert sind.
23. Adsorber nach einem der Ansprüche 13 - 22, wobei die mindestens eine Oberflächenmodifizierung L' mindestens eine Substanz ausgewählt aus der Gruppe ist, welche umfaßt: Carbonsäuren, Polycarbonsäuren, Polyacrylsäuren, Oligoacrylsäuren, Albumin, Heparin, ' Heparinderivate, Heparansulfate, Glykosaminoglykane, Oligosaccharide, Polysaccharide und
Chitosanderivate.
24. Adsorber nach einem der Ansprüche 13 - 23, wobei die mindestens eine Oberflächenmodifizierung L ein Immunadsorber ist.
25. Adsorber nach einem der Ansprüche 13 - 24 wobei die mindestens eine Oberflächenmodifizierung L mindestens eine Substanz ausgewählt aus der Gruppe ist, welche umfaßt: Peptide, Proteine, monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörpern, Fragmente von Antikörpern, synthetische Antigene, natürliche Antigene, Autoimmunantikörper, Monosaccharide,
Oligosaccharide, Polysaccharide, Thiole, Oligonucleotide, Polynucleotiden, Peptidantibiotika, native und/oder rekombinante DNA sowie RNA, D- und L- Aminosäuren und deren Derivate, Polyaminosäuren und heterocyclische Amine wie Tryptamin und Histamin, Glycoproteine, Lipide, Lipoproteine, Komplement, Antiimmunoglobulinantikörper, synthetische Polyanionen wie Polyvinylsulfat, Polyacrylsäure, Polyphosphorsäureester und deren Kombinationen.
26. Adsorber nach einem der Ansprüche 13 - 24, wobei die modifizierbaren funktionellen Gruppen aus der Gruppe ausgewählt werden, welche Amine, Aziridine, Oxirane, Oxaziridine, Maleinimide, N-Succinimidylester, N- Hydroxysuccinimide, Hydrazide, Azide, Aldehyde, Ketone, Carbonsäuren, Carbonsäureester, Säureanhydride, Thiole, Silanole, Nitrile, Verbindungen mit Chlormethylgruppen oder Gemische dieser funktionellen Gruppen umfaßt.
27. Adsorber nach einem der Ansprüche 13 - 26, wobei das Trägermaterial ein von Acrylaten, Methacrylaten, Acrylsäureestern oder Methacrylsäureestern und/oder Acrylsäureamiden oder Methacrylsäureamiden abgeleitetes Copolymer ist oder aus Silica, Silicone, Polytetrafluorethylen, Polyesterurethanen, quervernetztem Polyvinylalkohol, quervernetzter Cellulose, quervernetzter Agarose, quervernetztem Dextran, verseifte Ethylen-Vinylacetate, Polyetherurethane, Polyurethane,
Polyethylenterephthalate, Polysaccharide, Polypeptide, Polyethylene, Polyester, Polystyrole, Polyolefine, Polysulfonate, Polysulfone, Polypropylen, Polyethersulfone, Polypyrrole, Polyvinylpyrrolidone, Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Polyorthoester, Aluminiumoxid, Gläser, Sepharose, Kohlenhydrate und/oder Polyamiden besteht.
28. Adsorber nach Anspruch 27, wobei das Copolymer ein durch Polymerisation von Ethylenglycoldiacrylat oder Ethylenglycoldimethacrylat und Glycidylacrylat oder Glycidylmethacrylat und/oder Allylglycidether hergestelltes, statistisches Copolymer ist.
29. Adsorber nach Anspruch 27 oder 28, wobei das Copolymer durch Suspensionspolymerisation hergestellt wird.
30. Verwendung des Adsorbers gemäß einem der Ansprüche 13 - 29 zum Abtrennen von Biomolekülen und/oder pathogenen Stoffen aus Vollblut oder Plasma.
31. Verwendung nach Anspruch 30, wobei die abzutrennenden natürlichen, synthetischen und/oder rekombinanten Biomoleküle Immunglobuline, Toxine sowie deren Metaboliten und Abbauprodukte, Pilzgifte, Nikotin, Ethanol, Bleiacetat, CO, Phosgen, Chlor, Blausäure, Nitrosamine, Oxalsäure, Benzpyrene, Solanin, Nitrate, Nitrite, Amine, Dichlordisulfid, halogenierte
Kohlenwasserstoffe, Epoxytrichotecene, Aflatoxine, Ochratoxin A, Zearalenon, Exotoxine, Endotoxine, Pilzsporen und deren Abbauprodukte, biologische Kampfgifte wie Microcystine, Anatoxine und Saxitoxine, Insektizide, Bakterizide, Drogen und deren Metaboliten, Prodrugs, Arzneimittel und deren Metaboliten und ihre Abbau produkte, Antigene, DNA,
RNA, ENA, Antikörper, Anti-DNA-Antikörper, Anti-Nuclear-Antikörper, Viren, Retroviren und Virenbestandteile, Immunkomplexe, Autoimmunkomplexe, Lipide, Proteine, Peptide, Proteolipide, Glycoproteine, Proteoglycane, Fibrinogen, Fibrin, Blutersatzprodukte und Plasmaersatzprodukte, Nanowaffen, Metalle sowie Halbmetalle und deren Ionen und/oder
Immunkomplexe sind.
32. Verwendung des Adsorbers gemäß einem der Ansprüche 13 - 29 zum Abtrennen von Biomolekülen und/oder zytotoxischen Stoffen aus Zellkultur- lösungen oder Fermentationslösungen.
33. Vorrichtung zur Abtrennung von Biomolekülen und/oder pathogenen Stoffen aus Vollblut und/oder Plasma, umfassend ein Gehäuse, in dem ein Adsorber gemäß einem der Ansprüche 13 bis 29 in Form von porösen Teilchen oder Hohlfasern als lose Teilchen oder Fasern und/oder als Bündel lose und/oder fest mit dem Gehäuse verklebt, enthalten ist, wobei das Gehäuse mindestens einen Einlaß und mindestens einen im Fall der Verwendung von losen Teilchen oder losen Hohlfasern mit einem Partikelfilter versehenen Auslaß aufweist.
34. Vorrichtung gemäß Anspruch 33, wobei das Gehäuse ein Volumen von 10 ml bis 1250 ml umfaßt.
35. Verfahren zur Abtrennung von Biomolekülen und/oder pathogenen Stoffen aus Vollblut und/oder Plasma, umfassend die Schritte: a) Bereitstellung einer Vorrichtung gemäß Anspruch 33 oder 34; b) Durchleiten von Vollblut und/oder Plasma; und gegebenenfalls c) Regeneration des Adsorbers.
36. Verfahren zur Abtrennung von Biomolekülen und/oder zytotoxischen Stoffen aus Zellkulturlösungen oder Fermentationslösungen umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellung einer Vorrichtung gemäß Anspruch 33 oder 34; b) Durchleiten der Zellkulturlösung oder Fermentationslösung; und c) Elution der Biomoleküle aus dem Adsorber oder gegebenenfalls Elution der zytotoxischen Stoffe aus dem Adsorber.
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