WO2004013188A1 - Verfaren zur herstellung perl-bzw. kugelförmiger magnetischer partikel auf acrylsäurebasis zur aufreinigung biologischer substanzen - Google Patents

Verfaren zur herstellung perl-bzw. kugelförmiger magnetischer partikel auf acrylsäurebasis zur aufreinigung biologischer substanzen Download PDF

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WO2004013188A1
WO2004013188A1 PCT/EP2003/008032 EP0308032W WO2004013188A1 WO 2004013188 A1 WO2004013188 A1 WO 2004013188A1 EP 0308032 W EP0308032 W EP 0308032W WO 2004013188 A1 WO2004013188 A1 WO 2004013188A1
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WO
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monomer
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acrylic acid
magnetic
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PCT/EP2003/008032
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Olaf Lammerschop
Roland Breves
Stefan Stumpe
Detlef Müller-Schulte
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Henkel AG and Co KGaA
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Henkel AG and Co KGaA
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F2/00—Processes of polymerisation
    • C08F2/44—Polymerisation in the presence of compounding ingredients, e.g. plasticisers, dyestuffs, fillers

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing pearl-shaped or spherical magnetic particles based on acrylic acid for the purpose of purifying biological substances.
  • magnetic polymer particles are increasingly being used for the analysis, diagnosis or purification of cells and biomolecules such as antibodies or other proteins, nucleic acids and other biopolymers.
  • magnetic beads are a preferably pearl-shaped particle consisting of a polymer shell and having a particle size of 1 to 100 ⁇ m, in which a magnetic colloid or a micro- or nanoparticulate magnetic substance (e.g. magnetite) is encapsulated and thus the polymer particle gives magnetic properties.
  • a magnetic colloid or a micro- or nanoparticulate magnetic substance e.g. magnetite
  • certain ligands can be chemically coupled to the polymer shell, which are able to selectively bind the biomolecules or cells.
  • Magnetic separation in the simplest case by applying a hand magnet to the reaction vessel, enables the target substances in question to be bound be separated from the substance mixture and analyzed.
  • Magnetic iron dextran microparticles are known in the U.S. Patent 4,452,773.
  • Fe (II) and Fe (III) salt solution By mixing an Fe (II) and Fe (III) salt solution in the presence of a defined amount of dextran and then adding alkali, 30-40 nm colloidal iron oxide particles are obtained, to which dextran is adsorbed.
  • the PCT application WO 90/07380 is based on a similar method.
  • Fe (II) and Fe (III) salt solutions are treated with the addition of dextran at 40 ° C. and then titrated with NaOH, on the basis of which superparamagnetic particles with a size of 40-100 nm are obtained.
  • US Pat. No. 4,647,447 describes the production of ferromagnetic particles for NMR diagnostics. This is based either on Fe (II) / Fe (III) salt solutions or directly on microparticulate ferrites, which are converted into magnetic suspensions in the presence of a complexing agent such as serum albumin, polysaccharides, dextran or dextrin. From US Pat. No. 4,070,246 a product reacted with p-aminobenzoic acid and an aldehyde with the addition of a ferromagnetic powder is known, but with which nucleic acid purification is not possible. The production of defined pearl-shaped particles, as required for diagnostic tests, is also not feasible with this method. The same also applies to the methods described in US Pat. Nos. 4,106,448, 4,136,683 and 4,735,796 for the production of magnetic particles encapsulated for dextran for diagnosis and tumor therapy.
  • Serum albumin, polypeptide, or polysaccharide coated superparamagnetic iron oxide particles that can be used as contrast agents in NMR diagnostics are described in U.S. Pat. Patent 4,827,945.
  • pearl-shaped or spherical particles cannot be produced with the aforementioned processes.
  • the magnetic fractions cannot be separated using simple hand magnets, as is required for fast separation processes.
  • Pearl-shaped magnetic particles are known from US Patents 4,861,705.
  • Agarose-polyaldehyde composite particles are obtained by suspension of the polymer phase in an oil phase.
  • the polymer particles have a particle size of 40-1000 ⁇ m.
  • Spherical particles made of polyacrylates or polystyrene are known in the U.S. Patent 4,654,267 described, which are prepared by means of suspension polymerization. The particles are then swollen in an organic phase under defined conditions. This is followed by incubation of the polymer particles in an iron-salt solution, which, after diffusing into the particles, is oxidized to superparamagnetic iron oxides using ammonia. The process produces pearl-shaped particles with particle sizes between 0.5 and 20 ⁇ m. The process is technically very complex. In addition to the use of highly toxic substances, the time required to prepare the basic matrix is 10-30 hours.
  • PCT application WO92 / 22201 (identical to DEOS 38 36 475 A1) describes polystyrene particles which are polymerized onto a magnetic colloid in a two-step process. Pearl-shaped particles with clear colloid inclusions are not possible. The process is a time-consuming (> 20 hours) and labor-intensive process. The use as a DNA adsorber is not possible.
  • PCT application WO 90/15666 contains the production of magnetic particles which are stabilized (encapsulated) by sugar or vinyl polymers.
  • the process requires complex networking steps with e.g. Epichlorohydrin (extremely toxic) or dibromopropanol.
  • Polystyrene composite particles (not pearl-shaped particles) are the subject of U.S. Patent 5,834,121. A clear encapsulation of the magnetic colloid is not possible with this method. Rather, the colloid lies on the surface of the particles. Applications in PCR and nucleic acid separation are therefore ruled out from the outset. The process takes place under a nitrogen atmosphere at 65-90 ° C over a period of 24 hours.
  • Hua and Quian, J. Mater. Sei, Vol 36, 2001, 731 describe Na-polyacrylate hydrogels which are produced with the aid of the “reversed-phase” suspension polymerization using gamma rays. A gamma-ray source is required to produce these particles.
  • Polymethyl methacrylates and polystyrenes as stabilizers are described by Takahashi et al. (J. Polymer Sei., Vol. 34, 1996, pp 175). The polymerization takes place in toluene at 70-75 ° C for 8 hours under a nitrogen atmosphere.
  • a precipitation polymer of acrylamide, methylenebis-acrylamide and methacrylic acid, which is used as the core particle for the further polymerization with styrene, has been described by Kawaguchi et al. (Polym. Int. Vol. 30, 1993, pp 225).
  • Hirayama et al. (J. Chromatogr. A, Vol. 676, 1994, pp 267) describe the synthesis of pearl-shaped microparticles based on N, N-dimethylaminopropylacrylamide for endotoxin adsorption. The syntheses take place at 80 ° C over a period of 12 hours. The particles have a diameter of> 50 ⁇ m.
  • This object is achieved according to the invention by a process for the production of pearl-shaped or spherical magnetic particles based on acrylic acid for the purification of biological substances, which is characterized in that a mixture comprising a) at least one polar, preferably ionic, particularly preferably cationic, acrylate monomer, b) at least one crosslinker with at least two non-conjugated, ethylenically unsaturated double bonds, c) optionally at least one additional, copolymerizable water-insoluble monoethylenically unsaturated monomer, d) at least one polymerization initiator, e) at least one magnetic component and f) optionally further constituents in one with water immiscible organic phase suspended and radically crosslinked to pearl polymer particles.
  • a mixture comprising a) at least one polar, preferably ionic, particularly preferably cationic, acrylate monomer, b) at least one crosslinker with at least two non-conjugated, e
  • biological substances include in particular eukaryotic or prokaryotic cells, viruses, biopolymers (nucleic acids such as DNA, RNA, PNA and antibodies as well as other proteins and protein fragments), other biomolecules (eg sugar) and also chemically modified ones or to understand compounds based on naturally occurring biological substances, for example proteins modified by the addition of polyethylene glycol, or nucleic acids which are completely (all nucleotides) or partially (only a few nucleotides) modified (nucleic acid derivatives), for example by:
  • Monomers a) which can be used according to the invention are, for example, acrylic acid, methacrylic acid, acrylamide, methacrylamide, dimethylaminoethyl acrylate, diethylaminoethyl acrylate, dimethylaminoneopentyl acrylate and
  • Dimethylaminoneopentyl acrylate and dimethylaminoneopentyl methacrylate are preferably used in the form of their salts with strong mineral acids, sulfonic acids or carboxylic acids or in quaternized form.
  • Suitable monomers a) are sulfoethyl acrylate, sulfoethyl methacrylate, sulfopropyl acrylate, sulfopropyl methacrylate, 2-hydroxy-3-methacryloxypropyl sulfonic acid and 2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid.
  • the acid groups of the abovementioned acids can be used in the polymerization either in non-neutralized form or in partially or up to 100% neutralized form.
  • Preferred monomers of group a) are acrylic acid, methacrylic acid, acrylamide, methacrylamide, acrylamidopropanesulfonic acid and in particular methacrylic acid 2-dimethylaminoethyl ester, acrylic acid [2- (dimethylamino) ethyl ester], acrylic acid [3- (dimethylamino) propyl ester] or methacrylic acid 2-diethylaminoethyl ester and mixtures of these monomers.
  • monomers can be copolymerized with one another in any ratio, particularly preferably using partially neutralized acids.
  • Preferred monomer mixtures a) are acrylic acid and / or methacrylic acid; (Meth) acrylic acid / ester of (meth) acrylic acid with C1 to C4 alkanols, e.g. B. n-butyl acrylate. The (meth) acrylic acid can partially or completely in the form of salt.
  • Other preferred monomer mixtures a) are e.g. B.
  • acrylic acid and / or alkali acrylate / methacrylic acid acrylic acid / alkali acrylate, acrylic acid and / or alkali acrylate / acrylamidopropanesulfonic acid, acrylic acid and / or alkali acrylate / acrylamide, acrylamide / dimethylaminoethyl acrylate methochloride.
  • the monomers a) are used in an amount of 10 to 95% by weight, preferably 20 to 90% by weight, in particular 30 to 90% by weight, based on the total amount of monomers used.
  • the mixture contains at least one crosslinker b) with at least two non-conjugated, ethylenically unsaturated double bonds.
  • Suitable crosslinkers are, for example, N, N'-methylenebisacrylamide, polyethylene glycol diacrylates and polyethylene glycol dimethacrylates, which are each derived from polyethylene glycols with a molecular weight of 120 to 8500, preferably 400 to 2000, trimethylolpropane triacrylate, trimethylolpropane tri-methacrylate, ethylene glycol diacrylate diacrylate, propyl acrylate, propyl acrylate, Diacrylates and dimethacrylates of block copolymers of ethylene oxide and propylene oxide, polyhydric alcohols esterified twice or three times with acrylic acid or methacrylic acid, such as glycerol or pentaerythritol, triallylamine, tetraallylethylene diamine, divinylbenzene, diallyl phthalate, polyethylene glycol diol ethylenediol ether, polyethyleneol diol ethylenediol ether, and polyethylene toluene di
  • water-soluble crosslinking agents are used, e.g. B. 1, 1, 1, -Tris- (hydroxymethyl) propane triacrylate, 3- (acryloyloxy) -2-hydroxypropyl methacrylate,
  • crosslinking agent b Compounds which contain at least one polymerizable ethylenically unsaturated group and at least one further functional group are also suitable as crosslinking agent b).
  • the functional group of these crosslinkers must be able to react with the functional groups, essentially the carboxyl groups or sulfonic acid groups of the monomers a).
  • Suitable functional groups are e.g. B. hydroxyl, amino, epoxy, isocyanate, ester, amide and aziridino groups.
  • Suitable crosslinkers b) are also those compounds which carry at least two of the aforementioned functional groups and which can react with carboxyl and sulfonic acid groups of the monomers a).
  • Examples of such crosslinkers b) are ethylene glycol, diethylene glycol, triethylene glycol, tetraethylene glycol, polyethylene glycol, glycerol, polyglycerol, propylene glycol, diethanolamine, triethanolamine, polypropylene glycol,
  • Polypropylene glycol diglycidyl ether polyaziridine compounds such as 2,2-bishydroxymethylbutanoltris [3- (l-aziridinyl) propionate], 1,6-hexamethylene-diethyleneurea, diphenylmethane-bis ⁇ '- N.N'-diethyleneurea, halo-epoxy compounds such as epichlorohydrin and a Methyl fluorohydrin, polyisocyanates such as 2,4-tolylene diisocyanate and hexamethylene diisocyanate, alkylene carbonates such as 1, 3-dioxolan-2-one and 4-methyl-1, 3-dioxolan-2-one, polyquaternary amines such as condensation products of dimethylamine with epichlorohydrin, homo- and Copolymers of diallyldimethylammonium chloride and homo- and Copolymers of dimethylaminoethyl (meth) acrylate, which are optionally
  • crosslinkers b) are polyvalent metal ions which are able to form ionic crosslinks.
  • examples of such crosslinkers are magnesium, calcium, barium and aluminum ions.
  • These crosslinkers are added, for example, as hydroxides, carbonates or hydrogen carbonates to the aqueous polymerizable solution.
  • crosslinkers are multifunctional bases, which are also able to form ionic crosslinks, for example polyamines or their quaternized salts.
  • polyamines are ethylenediamine, diethylene triamine, triethylene tetramine, tetraethylene pentamine, pentaethylene hexamine and polyethyleneimines, and polyvinylamines each with molecular weights of up to 4,000,000.
  • crosslinkers b can be used individually or in mixtures.
  • the monomers b) are used in an amount of from 0.01 to 30% by weight, preferably from 0.1 to 30% by weight, in particular from 0.5 to 20% by weight, preferably from 0.5 to 15% by weight. -%, particularly preferably from 0.5 to 10 wt .-%, based on the total amount of monomer used.
  • crosslinker concentrations between 0.5 and 1% by weight are generally used.
  • Monomers c) which are suitable according to the invention are those monoethylenically unsaturated monomers which can be copolymerized with the monomers a) and b). These include, for example, the amides and nitriles of monoethylenically unsaturated carboxylic acids, e.g. B. acrylamide, methacrylamide and N-vinylformamide, acrylonitrile and methacrylonitrile, dialkyldiallylammonium halides such as dimethyldiallylammonium chloride, diethyldiallylammonium chloride, allylpiperidinium bromide, N-vinylimidazoles such as. B.
  • monoethylenically unsaturated carboxylic acids e.g. B. acrylamide, methacrylamide and N-vinylformamide, acrylonitrile and methacrylonitrile, dialkyldiallylammonium halides such as dimethyldiallylammonium chloride
  • N-vinylimidazole, 1-vinyl-2-methylimidazole and N-vinylimidazolines such as N-vinylimidazoline, 1-vinyl-2-methylimidazoline, 1-vinyl-2-ethylimidazoline or 1-vinyl-2-propylimidazoline, which are optionally used in the form of the free bases, in quaternized form or as a salt in the polymerization can be.
  • Dialkylaminoalkyl acrylates and dialkylaminoalkyl methacrylates dimethylaminoethyl acrylate, dimethylaminoethyl methacrylate, diethylaminoethyl acrylate and diethylaminoethyl methacrylate are also suitable.
  • the basic esters are preferably used in quaternized form or as a salt.
  • suitable compounds c) are, for example, vinyl esters of saturated C1 to C4 carboxylic acids such as vinyl formate, vinyl acetate or vinyl propionate, alkyl vinyl ethers with at least 2 C atoms in the alkyl group, such as ethyl vinyl ether or butyl vinyl ether, esters of monoethylenically unsaturated C3 to C6 carboxylic acids , e.g. B. esters of monohydric C1 to C18 alcohols and acrylic acid such.
  • vinyl esters of saturated C1 to C4 carboxylic acids such as vinyl formate, vinyl acetate or vinyl propionate
  • alkyl vinyl ethers with at least 2 C atoms in the alkyl group such as ethyl vinyl ether or butyl vinyl ether
  • esters of monoethylenically unsaturated C3 to C6 carboxylic acids e.g.
  • esters of monohydric C1 to C18 alcohols and acrylic acid such.
  • maleic acid monomethyl methylesters such as maleic acid monomethyl methylesters, such as maleic acid monomethyl ethylester, such as maleic acid monomethyl ethylester, such as maleic acid monomethyl ethoxylates, B.
  • N-vinyl lactams such as N-vinyl pyrrolidone or N-vinyl caprolactam
  • acrylic and methacrylic esters of alkoxylated monohydric, saturated alcohols e.g. B.
  • MM molecular weights of the polyalkylene glycols
  • suitable monomers of group c) are alkyl-substituted styrenes such as ethylstyrene or partly. Butylstyrene.
  • the monomers c) can also be used as binary or ternary mixtures in the copolymerization with the other monomers, for.
  • B. Mixtures of vinyl acetate and 2-hydroxyethyl acrylate in any ratio.
  • Preferred monomers c) are 2-hydroxyethyl methacrylate, acrylamide, 2-hydroxyethyl acrylate, vinyl acetate, (meth) acrylamide, (meth) acrylic acid ester, vinyl aromatic compounds and N-vinyl lactams, in particular N-vinyl pyrrolidone.
  • the monomers of group c) are used in amounts of 0.5 to 60% by weight, in particular 0.5 to 50% by weight, preferably 5 to 50% by weight, preferably 5 to 40% by weight , particularly preferably 5 to 30% by weight and very particularly preferably 5 to 20% by weight, based on the total monomers used for the polymerization.
  • polymerization initiators d e.g. Peroxides, hydroperoxides, hydrogen peroxide, persulfates, azo compounds and redox catalysts.
  • water-soluble initiators is preferred.
  • mixtures of different polymerization initiators e.g. B. mixtures of hydrogen peroxide and sodium or potassium peroxydisulfate. Mixtures of hydrogen peroxide and sodium peroxydisulfate can be used in any ratio.
  • Suitable organic peroxides are, for example, acetylacetone peroxide, methyl ethyl ketone peroxide, tert-butyl hydroperoxide, cumene hydroperoxide, tert-amyl perpivalate, tert-butyl perpivalate, tert-butyl perneohexanoate, tert-butyl perisobutyrate, tert-butyl per-2-ethylhexanoate .-Butyl perisononanoate, tert-butyl permaleate, tert-butyl perbenzoate, tert-butyl per-3,5,5-tri-methylhexanoate and tert-amyl perneodecanoate.
  • Particularly suitable polymerization initiators are N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine (TEMED) and ammonium persulfate (APS), the combined addition of
  • the preferred concentrations of TEMED and APS (40% aqueous solution), based on the monomer phase, are in the range of 1-10% by volume for TEMED and 1-20% for APS, with an increasing concentration of TEMED and APS generally is accompanied by a proportional increase in the rate of polymerization.
  • water-soluble azo starters e.g. B. 2,2'-azobis- (2-amidinopropane) dihydrochloride, 2,2'-azobis- (N, N'-dimethylene) iso-butyramidine-dihydrochloride, 2- (carbamoylazo) isobutyronitrile, 2,2'-azobis [2- (2'-imidazolin-2-yl) propane dihydrochloride and 4,4'-azobis (4-cyanovaleric acid).
  • B. 2,2'-azobis- (2-amidinopropane) dihydrochloride 2,2'-azobis- (N, N'-dimethylene) iso-butyramidine-dihydrochloride, 2- (carbamoylazo) isobutyronitrile
  • 2,2'-azobis [2- (2'-imidazolin-2-yl) propane dihydrochloride and 4,4'-azobis (4-cyanovaleric acid e.g. B. 2,2
  • Redox catalysts can also be used as initiators.
  • Redox catalysts contain as oxidizing component at least one of the above per compounds and as reducing component z.
  • Ascorbic acid or sodium sulfite is preferably used as the reducing component of the redox catalyst.
  • the oxidizing component of the redox catalyst one or more water-soluble azo starters can also be used.
  • the polymerization initiators mentioned are used in customary amounts, which can be suitably adapted by the person skilled in the art depending on the desired course of the reaction.
  • Magnetic components e) which are suitable according to the invention are, in particular, magnetic colloids or magnetic powders.
  • ferro-, ferri- or superparamagnetic substances which enter into a homogeneous mixture with the monomer phase can be used as magnetic colloids or magnetic powder.
  • Magnetite with particle sizes in the range from approximately 10 nm to approximately 600 nm, in particular approximately 20 to approximately 400 nm, is used as the preferred magnetic substance.
  • Such substances are e.g. commercially available under the trade name Bayferrox.
  • Bayferrox The production of such colloids is state of the art and has been by Shinkai et al., Biocatalysis, Vol. 5, 1991, pp61, Reimers and Khalafalla, Br. Patent 1, 439,031 or Kondo et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol 41, 1994, pp 99.
  • the concentrations of the colloids in the polymer phase are preferably in the range from about 5 to about 30% by volume, in particular 5 to 10% by volume, in the case of the colloids which, as a result of the preparation, are already present as aqueous colloids, and in the range from about 1 to about 20% by weight, in particular 5 to 10% by weight, in the case of the solid substances.
  • the magnetic properties of the polymer particles which can be produced according to the invention are achieved by directly admixing a suitable magnetic colloid or magnetic powder before the suspension to the monomer phase.
  • the possibility of precise metering of the magnetic substance enables the magnetic properties of the polymer particles to be set or changed in a targeted manner. This is particularly important with regard to the magnetic attraction forces of the particles that determine the separation efficiency.
  • This process parameter which is easy to vary, characterizes the process according to the invention compared with most of the methods known from the prior art for producing magnetic carriers.
  • the preparation times for the aforementioned prior art method are between 10 and 30 hours, whereas the method according to the invention only requires about 5 to 15 minutes to obtain the functionalized magnetic particles.
  • those substances can also be added to the magnetic powders which have emulsion-stabilizing properties and thereby promote a more homogeneous distribution of the magnetic substances in the monomer phase.
  • Substances of this type are, for example, poly-N-vinylpyrrolidone, cellulose acetate butyrate, serum albumin, aliphatic and aromatic sulfonic acid derivatives, gelatin or polyethylene glycols.
  • the amounts of The emulsifiers used are usually in the range from about 0.5 to about 5% by weight, based on the magnetic substance used.
  • the homogeneous distribution of the magnetic substances in the monomer phase can also be promoted, for example, by allowing high shear forces to act on the mixture. Homogenizers known to those skilled in the art are used for this.
  • Examples include:
  • Colloid mills, or other suitable homogenizers are generated.
  • the particles produced according to the invention preferably have a particle size in the range from approximately 1 to approximately 50 ⁇ m, preferably 1 to 30 ⁇ m, in particular 1 to 20 ⁇ m.
  • Such particle sizes have been found to be optimal in the field of separation technology both with regard to rapid magnetic separation and with regard to the maximum available particle surfaces, which are decisive for the separation capacity of the carrier.
  • the magnetic particles based on polyacrylate known from the prior art consistently have a particle size> 50 ⁇ m, those based on polystyrene have a particle size of ⁇ 1 ⁇ m.
  • Obtaining particle sizes in the range from about 1 to about 50 ⁇ m is surprisingly achieved by using oils, in particular mineral oil, animal or vegetable oils (vegetable oils) as suspension medium with a viscosity in the range from 25 to 150 mPa-s, in particular in the range from 30 to 80 mPa-s (or centipoise) possible.
  • oils in particular mineral oil, animal or vegetable oils (vegetable oils) as suspension medium with a viscosity in the range from 25 to 150 mPa-s, in particular in the range from 30 to 80 mPa-s (or centipoise) possible.
  • the monomer phase is preferably prepolymerized for about 5 to about 180 seconds before being suspended in the organic phase.
  • Oils which can preferably be used according to the invention are selected from a) mineral oils, ie liquid distillation products which have been obtained from mineral raw materials (petroleum, lignite and hard coal, wood, peat) and which consist essentially of mixtures of saturated hydrocarbons, b) oils of animal origin , in particular technical fish oils, such as capelin oil, herring oil, mackerel oil, orange-roughy oil, sardine oil, tuna oil and others, and c) oils of vegetable origin, in particular apricot kernel oil, argan oil, avocado oil, babassu oil, cottonseed oil, borage seed oil, calendula oil, camelina oil, peanut oil Deep-frying oil, rosehip seed oil, hemp oil, hazelnut oil, currant seed oil, St.
  • mineral oils ie liquid distillation products which have been obtained from mineral raw materials (petroleum, lignite and hard coal, wood, peat) and which consist essentially of mixtures of saturated hydrocarbons
  • oils of animal origin in particular
  • the polymerization reaction is preferably carried out in a manner known to the person skilled in the art, either in the batch reactor, in the continuous flow tube, in the stirred tank cascade or in the continuous stirred tank reactor.
  • the boiler reactors have gained the greatest importance in the chemical industry because they have a very high degree of flexibility with regard to the operating conditions and the mode of operation and can be adapted to almost all process requirements.
  • Stirred tank reactors are suitable for discontinuous and continuous operation and they have a wide range of applications, from the laboratory tank to the large reactor. Stirred tank reactors are available in a standardized design for numerous applications in a wide variety of materials and material combinations. Stirred tank reactors are easy to walk on and clean and allow a relatively simple switch to other polymerization reactions (see e.g. Ullmann, Volume 3, 4th ed., Pp. 505-510).
  • the reactor containers suitable for carrying out the process according to the invention have stirring devices, which usually consist of a stirrer driven by an agitator shaft and, for certain applications, also have stators for better mixing serve as baffle.
  • the stirrers themselves are attached to mostly vertical stirrer axes, which project either from below or from above into the generally cylindrical reactor vessel. Centric installation from above into the reactor vessel is generally preferred, since the stirrer shaft can be sealed relatively easily.
  • stirrers for example propeller stirrers, disc stirrers, anchor stirrers, impeller stirrers, blade stirrers, MIG stirrers, etc. are known.
  • the suspension process is preferably carried out using a conventional propeller stirrer.
  • stirring speeds between 1000 and 4000 rpm. required, with a direct proportionality between the stirring speed and the fineness of the particles.
  • Particle sizes of ⁇ 10 ⁇ m can be consistently achieved with stirring speeds of> 2000 rpm. and those> 10 ⁇ m with stirring speeds of ⁇ 1000-2000 rpm. achieve.
  • Protective colloids, polymerization accelerators or emulsifiers are particularly suitable as further constituents f) which can be used according to the invention. These are known from the prior art and can be added to the reaction by the person skilled in the art as required.
  • An essential feature of the present invention is the ability to determine the desired properties of the beads, such as molecular binding behavior, magnetic properties, functionality, through the composition of the starting mixture.
  • the porosity of the particles which is a direct influencing parameter for the biomolecule binding capacities, is determined to a decisive degree by the concentration of the crosslinking agent b) in the monomer batch.
  • the monomer batch contains between 0.5 and 10% by weight of crosslinking agent, preferably between 0.5 and 2% by weight. The lower the proportion of crosslinker in the reaction mixture, the larger the pores of the polymerized particles.
  • the method according to the invention enables the porosity to be controlled directly via the crosslinker concentration.
  • the polymer particles obtained according to the invention are suitable for purifying biomolecules, microorganisms or cells, depending on the type and number of polar functions which they contain in copolymerized form.
  • ligands can also be chemically coupled to the polymer shell, which are capable of selectively binding the biomolecules, microorganisms or cells.
  • the polymer particles (after suspension polymerization has been carried out) are preferably reacted with monomers, the reactive groups Preferred monomers with reactive groups are selected from glycidyl methacrylates, glycidyl acrylates, haloalkyl methacrylates, haloalkyl acrylates,
  • Maleic anhydride acrylic acid chloride, acrylic acid anhydride, methacrylic acid chloride and methacrylic acid anhydride.
  • These monomers with reactive groups are preferably with nucleophiles such as amines, especially with Polyamines and particularly preferably subsequently reacted with polyethyleneimines. This causes a modification of the particle surface with the desired ligands.
  • the polymer batch is prepolymerized for 30 seconds and then suspended in 300 ml of vegetable oil, viscosity 84 centipoise, with stirring (1500 rpm) for 4 minutes. The mixture is then left to polymerize for a further 10 minutes without stirring. About 100 ml of petroleum ether are added to the suspension; the oil phase can then be separated by applying a hand magnet. The polymer phase is washed several times with petroleum ether, acetone and ethanol. The polymer phase is then kept in distilled water for several hours. Polymer particles with an average particle size of 27 ⁇ m are obtained.
  • a magnetite colloid is analogous to the specification by Kondo et al., Appl. Microbiol. Biotechn., Vol. 41, 1994, 99-105. 5 ml of the aqueous colloid are sonicated for 30 seconds with a high-performance ultrasound finger (from Dr. Hielscher). This colloid is then a mixture consisting of 10 ml of acrylamide (30% aqueous solution), 2 ml of 2-hydroxyethyl methacrylate and 1 ml of N, N'-methylenebisacrylamide (30% ' ⁇ ge aqueous solution) and 15 ml of 2-dimethylaminoethyl methacrylate added.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung perl- bzw. kugelförmiger magnetischer Partikel auf Acrylsäurebasis zur Aufreinigung biologischer Substanzen.

Description

Verfahren zur Herstellung perl- bzw. kugelförmiger magnetischer Partikel auf Acrylsäurebasis zur Aufreinigung biologischer Substanzen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung perl- bzw. kugelförmiger magnetischer Partikel auf Acrylsäurebasis zum Zweck der Aufreinigung biologischer Substanzen.
Im Bereich der Biowissenschaften werden in zunehmendem Maße magnetische Polymerpartikel für die Analyse, Diagnostik oder Aufreinigung von Zellen und Biomolekülen wie Antikörpern oder anderen Proteinen, Nukleinsäuren und anderen Biopolymeren eingesetzt.
Bei diesen sogenannten Magnetbeads handelt es sich um ein aus einer Polymerhülle bestehendes, vorzugsweise perlförmiges Partikel mit einer Teilchengröße von 1 bis 100 μm, in das ein magnetisches Kolloid oder eine mikro- bzw. nanopartikuläre magnetische Substanz (z.B. Magnetit) eingekapselt ist und so dem Polymerteilchen magnetische Eigenschaften verleiht. Zur Auftrennung von Biomolekülen oder Zellen können bestimmte Liganden („Fängermoleküle") an die Polymerhülle chemisch gekoppelt werden, die die Biomoleküle oder Zellen selektiv zu binden vermögen. Durch magnetische Separation, im einfachsten Fall durch Anlegen eines Handmagneten an das Reaktionsgefäß, können die betreffenden Zielsubstanzen aus dem Substanzgemisch abgetrennt und analysiert werden.
Die Verwendung magnetischer Polymerpartikel bietet gegenüber den klassischen chromatographischen Trennverfahren zwei entscheidende Vorteile: a) Man arbeitet in einer Suspension, wodurch eine Reaktionskinetik ähnlich der einer homogenen Lösung gegeben ist, b) der Trennvorgang gegenüber den herkömmlichen Verfahren wird um den Faktor 10 bis 100 verkürzt. Ferner kann bei der Nukleinsäure-Auftrennung der zeitaufwendige Zentrifugationsschritt gänzlich umgangen werden. In der PCT Anmeldung WO 99/62079 werden magnetische Nanopartikel mit einer Teilchengröße <0,3 μm beschrieben, die durch Beschichten eines magnetischen Oxids mit einem chelatierenden Stabilisator wie Gelatine, Polyethylenimin, Polyaminen, Dextran, Chitosan, Polylysin, Polyvinylpyrrolidon oder Proteinen gewonnen werden. Ein Einsatz dieser Teilchen in der Nukleinsäure-Aufreinigung ist nicht möglich.
Magnetische Eisen-Dextran Mikropartikel sind in der U.S. Patentschrift 4,452,773 beschrieben. Durch Mischen einer Fe(ll)- und Fe(lll)-Salzlösung in Gegenwart einer definierten Menge Dextran und anschließende Zugabe von Alkali werden 30- 40 nm große, kolloidale Eisenoxid- Teilchen gewonnen, an die Dextran adsorbiert ist. Ein ähnliches Verfahren liegt der PCT Anmeldung WO 90/07380 zugrunde. Es werden Fe(ll)- und Fe(lll)-Salzlösungen unter Zugabe von Dextran bei 40°C behandelt und anschließend mit NaOH titriert, aufgrund dessen superparamagnetische Partikel mit einer Größe von 40-100 nm erhalten werden. Der Nachteil beider Verfahren im Hinblick auf rasche und einfache Abtrennung besteht darin, daß aufgrund der Feinheit der Partikel eine Separation nur mittels eines hochgradienten Magnetfeldes („High Gradient Magnetic Field") möglich ist. Ein hochgradientes Magnetfeld wird durch eine mit Stahlwolle dicht-gepackte Säule erzeugt, die sich zwischen den Polschuhen zweier starker Elektro- bzw. Handmagnete befindet. Die Trennung der Teilchen erfolgt durch Hindurchleiten der Suspension durch die gefüllte Trennsäule. Eine Abtrennung solcher Kolloide ist mittels herkömmlicher Handmagnete nicht möglich. Grundsätzliche experimentelle Unterschiede zu der herkömmlichen Chromatographietechnik bestehen somit kaum. Erschwerend für den Nachweis dieser Magnetpartikel ist ferner der Umstand, daß die Teilchen unter dem Lichtmikroskop nicht mehr sichtbar sind.
Die U.S. Patentschrift 4,647,447 beschreibt die Herstellung ferromagnetischer Partikel für die NMR-Diagnostik. Hierbei wird entweder von Fe(ll)/Fe(lll)- Salzlösungen oder direkt von mikropartikulären Ferriten ausgegangen, die in Gegenwart eines Komplexbildners wie z.B. Serum Albumin, Polysacchariden, Dextran oder Dextrin zu Magnetsuspensionen umgesetzt werden. Aus der U.S. Patentschrift 4,070,246 ist ein mit p-Aminobenzoesäure und einem Aldehyd unter Zugabe eines ferromagnetischen Pulvers umgesetztes Produkt bekannt, mit dem jedoch eine Nukleinsäure-Aufreinigung nicht möglich ist. Die Herstellung definierter perlförmiger Partikel, wie sie für diagnostische Tests erforderlich sind, ist mit diesem Verfahren ebenfalls nicht durchführbar. Ähnliches gilt auch für die in den U.S. Patentschriften 4,106,448, 4,136,683 und 4,735,796 beschriebenen Verfahren zur Herstellung von Dextran eingekapselten magnetischen Partikeln für die Diagnostik und die Tumortherapie.
Serum Albumin-, Polypeptid- oder Polysaccharid-beschichtete super- paramagnetische Eisenoxid-Partikel, die als Kontrastmittel in der NMR-Diagnostik eingesetzt werden können, sind in dem U.S. Patent 4,827,945 beschrieben.
Die Herstellungen von Eisenoxiden durch Ausfällen von Eisensalzen in Gegenwart von Dextranen oder Polyglutaraldehyden gehen aus den U.S. Patenten 2,870,740 und 4,267,234 hervor.
Allen vorgenannten Verfahren und Produkten ist gemeinsam, daß die ferromagnetischen oder superparamagnetischen Partikel erst durch Ausfällen einer Fe-Salzlösung, die ein bestimmtes molares Verhältnis von Fe(ll) und Fe(lll)- Salzen voraussetzt, in Gegenwart eines Komplexbildners bzw. Beschichtungsagens hergestellt werden.
Die Synthese magnetischer Albumin- oder Protein-beschichteter Mikropartikel für die Virus- und Zeil-Separation sowie für diagnostische Tests ist Gegenstand der U.S. Patente 4,345,588; 4,169,804; 4,115,534; 4,230,685; 4,247,406 und 4,357,259.
Definierte perl- bzw. kugelförmige Partikel, lassen sich mit den vorgenannten Verfahren nicht herstellen. Die Abtrennung der magnetischen Fraktionen ist darüber hinaus mittels einfacher Handmagnete, wie sie für schnelle Separationsprozesse erforderlich ist, nicht möglich. Perlförmige Magnetpartikel sind aus den U.S. Patenten 4,861,705 bekannt. Es werden Agarose-Polyaldehyd-Komposit-Partikel durch Suspension der Polymerphase in einer Öl-Phase gewonnen. Die Polymerpartikel weisen eine Teilchengröße von 40-1000 μm auf.
Kugelförmige Partikel aus Polyacrylaten oder Polystyrol werden in dem U.S. Patent 4,654,267 beschrieben, die mittels Suspensionspolymerisation hergestellt werden. Anschließend werden die Teilchen in einer organischen Phase unter definierten Bedingungen gequollen. Es folgt eine Inkubation der Polymerpartikel in einer Eisen-Salzlösung, die, nachdem sie in die Teilchen diffundiert ist, mittels Ammoniak zu superparamagnetischen Eisenoxiden oxidiert werden. Das Verfahren liefert perlförmige Partikel mit Korngrößen zwischen 0.5 und 20 μm. Das Verfahren ist technisch sehr aufwendig. Neben der Verwendung hochtoxischer Substanzen beträgt der Zeitaufwand für die Präparation der Grundmatrix 10-30 Stunden. Ferner bedarf es zusätzlicher Nitro-, Nitroso- oder Amino-Gruppen, die durch einen zusätzlichen Präparationsschritt in die Polymermatrix eingeführt wird, um eine ausreichende Adsorption der Fe-Salze zu gewährleisten. Der entscheidende Nachteil der dort beschriebenen Partikel liegt in dem Grundpolymeren Polystyrol begründet. Polystyrol stellt ein äußerst hydrophobes Material dar, das im Kontakt mit Proteinlösungen oder anderen Biomolekülen stark zur unspezifischen Adsorption neigt, ein Phänomen, das besonders bei Separationsprozessen nachteilig ist. Ein Einsatz der dort beschriebenen Partikel in der Nukleinsäure-Aufreinigung ist nicht möglich.
In der PCT Anmeldung WO92/22201 (identisch mit DEOS 38 36 475 A1) werden Polystyrol Partikel beschrieben, die in einem Zweischrittverfahren auf ein Magnetkolloid aufpolymerisiert werden. Perlförmige Partikel mit eindeutigen Kolloideinschlüssen sind nicht möglich. Das Verfahren stellt einen zeit- (> 20 Std.) und arbeitsaufwendigen Prozess dar. Die Verwendung als DNA-Adsorber ist nicht möglich.
Gegenstand des französischen Patentes No. 79 21 343/2463 807 sind Polystyrol- Beads, an die u.a. anti-DNA Antikörper oder Enzyme gekoppelt werden. Es wird eine ÖI-in-Wasser-Dispersionspolymerisation verwendet, die bei 90°C über mehrere Stunden hinweg stattfindet und zu relativ großen Partikeln führt: >0,2 mm. Eine DNA Abtrennung ist mit diesen Trägern nicht möglich.
In dem U.S. Patent 4,157, 323 werden Acrylat-Beads für die Zellseparation und - markierung beschrieben. Aufgrund der Feinheit der Magnetpartikel (30-200 nm) können diese Partikel nicht in routinemäßigen (automatisierten) Separationen eingesetzt werden. Das Verfahren erfordert aufwendige Synthesebedingungen: 100 °C Synthesetemperatur, Argon-Atmosphäre, Gamma-Bestrahlung. Eine DNA- Separationen ist nicht möglich.
Die PCT Anmeldung WO 90/15666 beinhaltet die Herstellung magnetischer Partikel, die durch Zucker- oder Vinylpolymere stabilisiert (eingekapselt) werden. Das Verfahren erfordert aufwendige Vernetzungsschritte mit z.B. Epichlorhydrin (extrem giftig) oder Dibrompropanol.
Polystyrol Komposit-Partikel (keine perlförmigen Teilchen) sind Gegenstand des U.S. Patentes 5,834,121. Eine eindeutige Einkapselung des Magnetkolloids ist bei diesem Verfahren nicht möglich. Das Kolloid liegt vielmehr auf der Oberfläche der Partikel auf. Dadurch scheiden Anwendungen in der PCR sowie in der Nukleinsäure Separation von vornherein aus. Das Verfahren findet unter Stickstoff-Atmosphäre bei 65-90°C über einen Zeitraum von 24 Std. statt.
Hua und Quian, J. Mater. Sei, Vol 36, 2001 , 731 beschreiben Na-Polyacrylat Hydrogele, die mit Hilfe der „reversed-phase" Suspensions-Polymerisation unter Anwendung von Gammastrahlen hergestellt werden. Zur Herstellung dieser Teilchen ist eine Gamma-Strahlen-Quelle vonnöten.
Die Präparation perlförmiger Polyacrylat-Partikel (Hydroxyethyl-methacrylat, Methacrylsäure) unter Zuhilfenahme speziell synthetisierter
Polymethylmethacrlyate und Polystyrole als Stabilisatoren werden von Takahashi et al. (J. Polymer Sei., Vol. 34, 1996, pp 175) beschrieben. Die Polymerisation findet in Toluol bei 70-75°C über einen Zeitraum von 8 Stunden hinweg unter Stickstoff-Atmosphäre statt.
Eine weiteres Verfahren zur Herstellung von Polyhydroxymethylmethacrylat- Mikropartikeln, die für die Metall-Chelat-Affinitäts-Chromatographie einsetzbar sind, wird von Denizli et al. (Colloids and Surfaces, Vol. 174, 2000, pp 307) beschrieben. Die Synthese findet über einen Zeitraum von 24 Stunden bei 65°C statt.
Ein Fällungspolymerisat aus Acrylamid, Methylenbis-Acrylamid und Methacrylsäure, das als Kernpartikel für die weitere Polymerisation mit Styrol benutzt wird, ist von Kawaguchi et al. (Polym. Int. Vol. 30, 1993, pp 225) beschrieben worden.
Hirayama et al. (J. Chromatogr. A, Vol. 676, 1994, pp 267) beschreiben die Synthese perlförmiger Mikropartikel auf der Basis von N,N- dimethylaminopropylacrylamid für die Endotoxin Adsorption. Die Synthesen finden bei 80°C über einen Zeitraum von 12 Stunden statt. Die Teilchen weisen einen Durchmesser von >50 μm auf.
Alle vorgenannten Verfahren auf Polyacrylat oder Polystyrol-Basis stellen sehr zeitaufwendige Präparationstechniken dar, die bis zu 24 Stunden dauern. Die Herstellung magnetischer Partikel, die für die Nukleinsäure-Aufreinigung geeignet wären, sind mit den Verfahren sowie den Produkten aus dem Stand der Technik nicht realisierbar.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, magnetische, perl- bzw. kugelförmige Mikropartikel bereitzustellen, die für die Abtrennung biologischer Substanzen, insbesondere für die Abtrennung von Biopolymeren geeignet sind und die die Nachteile der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren und Produkte, beispielsweise in Bezug auf Herstellungsaufwand, Partikelgeometrie, magnetisches Separationsverhalten, Korngröße, Funktionalität und Trenneigenschaften vermeiden. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung perl- bzw. kugelförmiger magnetischer Partikel auf Acrylsäurebasis zur Aufreinigung biologischer Substanzen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Mischung umfassend a) mindestens ein polares, vorzugsweise ionisches, besonders bevorzugt kationisches Acrylat-Monomer, b) mindestens einen Vernetzer mit mindestens zwei nicht konjugierten, ethylenisch ungesättigten Doppelbindungen, c) gegebenenfalls mindestens ein zusätzliches, copolymerisierbares wasserunlösliches monoethylenisch ungesättigtes Monomer, d) mindestens einen Polymerisationsinitiator, e) mindestens eine magnetische Komponente sowie f) gegebenenfalls weitere Bestandteile in einer mit Wasser nicht mischbaren organischen Phase suspendiert und zu perlförmigen Polymerpartikeln radikalisch vernetzt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind unter „biologischen Substanzen" insbesondere eukaryotische oder prokaryotische Zellen, Viren, Biopolymere (Nukleinsäuren wie DNA, RNA, PNA und Antikörper sowie andere Proteine und Proteinfragmente), sonstige Biomoleküle (z. B. Zucker) und auch chemisch modifizierte oder natürlich vorkommenden biologischen Substanzen nachempfundene Verbindungen zu verstehen, beispielsweise durch Anlagerung von Polyethylenglykol modifizierte Proteine, oder Nukleinsäuren, die vollständig (alle Nukleotide) oder teilweise (nur einige Nukleotide) modifiziert sind (Nukleinsäurederivate), beispielsweise durch:
• Veränderung der Internucleosidbrücken: Austausch von Phosphodiestern gegen Methylphosphonate, Phosphoramidate, Phosphorothioate oder Hydroxylamine;
• Veränderung der Zuckerkomponenten: Austausch der Ribose gegen diverse Hexo- bzw. Pentopyranosen oder 3'-5'-carbocyclisch verbrückte Derivate der 2'-Deoxyribose (Steffens R & Leumann CJ (1997) Tricyclo-DNA: A phosphodiester-backbone based DNA analog exhibiting strong comlementary base-pairing properties. J. Am. Chem. Soc. 119, 11548-11549); • Austausch des Strangrückgrats: Austausch der Polyesterketten auf Basis von Zucker-Phosphat-Einheiten gegen Carboxamidketten auf Basis von Aminosäurederivaten wie N-(2-Aminoethyl)-glycin-Einheiten.
Erfindungsgemäß einsetzbare Monomere a) sind beispielsweise Acrylsäure, Methacrylsäure, Acrylamid, Methacrylamid, Dimethylaminoethylacrylat, Diethylamino-ethylacrylat, Dimethylaminoneopentylacrylat und
Dimethylaminoethylmethacrylat, Dimethylaminopropylacrylat,
Dimethylaminoneopentylacrylat und Dimethylaminoneopentylmethacrylat. Die basischen Acrylate und Methacrylate werden vorzugsweise in Form ihrer Salze mit starken Mineralsäuren, Sulfonsäuren oder Carbonsäuren oder in quaternisierter Form verwendet.
Weitere geeignete Monomere a) sind Sulfoethylacrylat, Sulfoethylmethacrylat, Sulfopropylacrylat, Sulfopropylmethacrylat, 2-Hydroxy-3-methacryloxypropyl- sulfonsäure und 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure. Die Säuregruppen der vorgenannten Säuren können entweder in nicht neutralisierter Form oder in partiell bzw. bis zu 100% neutralisierter Form bei der Polymerisation eingesetzt werden.
Bevorzugte Monomere der Gruppe a) sind Acrylsäure, Methacrylsäure, Acrylamid, Methacrylamid, Acrylamidopropansulfonsäure und insbesondere Methacrylsäure- 2-dimethylaminoethylester, Acrylsäure-[2-(dimethylamino)-ethylester], Acrylsäure- [3-(dimethylamino)-propylester] oder Methacrylsäure-2-diethylaminoethylester sowie Mischungen dieser Monomere.
Diese Monomeren können in jedem beliebigen Verhältnis miteinander copolymerisiert werden, wobei besonders bevorzugt partiell neutralisierte Säuren verwendet werden. Bevorzugte Monomergemische a) sind Acrylsäure und/oder Methacrylsäure; (Meth)acrylsäure/Ester der (Meth)acrylsäure mit C1 bis C4- Alkanolen, z. B. n-Butylacrylat. Die (Meth)acrylsäure kann dabei teilweise oder vollständig als Salz vorliegen. Weitere bevorzugt verwendete Monomergemische a) sind z. B. Acrylsäure und/oder Alkaliacrylat/Methacrylsäure, Acrylsäure/ Alkaliacrylat, Acrylsäure und/oder Alkaliacrylat/Acrylamidopropansulfonsäure, Acrylsäure und/oder Alkaliacrylat/Acrylamid, Acrylamid/Dimethylaminoethyl- acrylatmethochlorid .
Die Monomere a) werden in einer Menge von 10 bis 95 Gew.-%, vorzugsweise von 20 bis 90 Gew.-%, insbesondere von 30 bis 90 Gew.-%, bezogen auf die eingesetzte Monomergesamtmenge eingesetzt.
Zur Herstellung vernetzter Polymerisate enthält die Mischung wenigstens einen Vernetzer b) mit mindestens zwei nicht konjugierten, ethylenisch ungesättigten Doppelbindungen.
Geeignete Vernetzer sind beispielsweise N,N'-Methylenbisacrylamid, Polyethylenglykoldiacrylate und Polyethylenglykoldimethacrylate, die sich jeweils von Polyethylenglykolen eines Molekulargewichts von 120 bis 8500, vorzugsweise 400 bis 2000, ableiten, Trimethylolpropantriacrylat, Trimethylolpropantri- methacrylat, Ethylenglykoldiacrylat, Propylenglykoldiacrylat, Butandioldiacrylat, Hexandioldiacrylat, Hexandioldimethacrylat, Diacrylate und Dimethacrylate von Blockcopolymerisaten aus Ethylenoxid und Propylenoxid, zweifach bzw. dreifach mit Acrylsäure oder Methacrylsäure veresterte mehrwertige Alkohole, wie Glycerin oder Pentaerythrit, Triallylamin, Tetraallylethylendiamin, Divinylbenzol, Diallylphthalat, Polyethylenglykoldivinylether von Polyethylenglykolen eines Molekulargewichts von 126 bis 4000, Trimethylolpropandiallylether, Butandioldivinylether, Pentaerythrittriallylether und/oder Divinylethylenhamstoff.
Vorzugsweise setzt man wasserlösliche Vernetzer ein, z. B. 1 ,1 ,1 ,-Tris- (hydroxymethyl)propantriacrylat, 3-(acryloyloxy)-2-hydroxypropylmethacrylat,
Methacrylsäureallylester, Acrylsäuevinylester N,N'-Methylen-bisacrylamid, Polyethylenglykoldiacrylate und Polyethylenglykoldimethacrylate, die sich von Additionsprodukten von 2 bis 400 Mol Ethylenoxid an 1 Mol eines Diols oder Polyols ableiten, Vinylether von Additionsprodukten von 2 bis 400 Mol Ethylenoxid an 1 Mol eines Diols oder Polyols, Ethylenglykoldiacrylat,
Ethylenglykoldimethacrylat oder Triacrylate und Trimethacrylate von
Additionsprodukten von 6 bis 20 Mol Ethylenoxid an ein Mol Glycerin, Pentaerythrittriallylether und/oder Divinylharnstoff.
Als Vernetzer b) sind außerdem Verbindungen geeignet, die mindestens eine polymerisierbare ethylenisch ungesättigte Gruppe und mindestens eine weitere funktionelle Gruppe enthalten. Die funktionelle Gruppe dieser Vernetzer muß in der Lage sein, mit den funktioneilen Gruppen, im wesentlichen den Carboxylgruppen oder Sulfonsäuregruppen der Monomeren a) zu reagieren. Geeignete funktionelle Gruppen sind z. B. Hydroxyl-, Amino-, Epoxi-, Isocyanat-, Ester-, Amid- und Aziridinogruppen.
Als Vernetzer b) kommen außerdem solche Verbindungen in Betracht, die mindestens zwei der vorgenannten funktioneilen Gruppen tragen, die mit Carboxyl- und Sulfonsäuregruppen der Monomeren a) reagieren können. Beispiele für solche Vernetzer b) sind Ethylenglykol, Diethylenglykol, Triethylenglykol, Tetraethylenglykol, Polyethylenglykol, Glycerin, Polyglycerin, Propylenglykol Diethanolamin, Triethanolamin, Polypropylenglykol,
Blockcopolymerisate aus Ethylenoxid und Propylenoxid, Sorbitanfettsäureester, ethoxylierte Sorbitanfettsäureester, Trimethylolpropan, Pentaerythrit, Polyvinylalkohol, Sorbit, Polyglycidylether wie Ethylenglykoldiglycidylether, Polyethylenglykoldiglycidylether, Glycerindiglycidylether, Glycerinpolyglycidylether, Diglycerinpolyglycidylether, Polyglycerinpolyglycidylether, Sorbitpolyglycidylether, Pentaerythritpolyglycidylether, Propylenglykoldiglycidylether und
Polypropylenglykoldiglycidylether, Polyaziridinverbindungen wie 2,2- Bishydroxymethylbutanoltris[3-(l-aziridinyl)propionat], 1 ,6-Hexamethylen- diethylenharnstoff, Diphenylmethan-bis^^'-N.N'-diethylenharnstoff, Halogen- epoxyverbindungen wie Epichlorhydrin und a-Methylfluorhydrin, Polyisocyanate wie 2,4-Toluylendiisocyanat und Hexamethylendiisocyanat, Alkylencarbonate wie 1 ,3-Dioxolan-2-on und 4-Methyl-1 ,3-dioxolan-2-on, polyquaternäre Amine wie Kondensationsprodukte von Dimethylamin mit Epichlorhydrin, Homo- und Copolymere von Diallyldimethylammoniumchlorid sowie Homo- und Copolymerisate von Dimethylaminoethyl(meth)acrylat, die gegebenenfalls mit beispielsweise Methylchlorid quaterniert sind.
Weitere geeignete Vernetzer b) sind polyvalente Metallionen, die in der Lage sind, ionische Vernetzungen auszubilden. Beispiele für solche Vernetzer sind Magnesium-, Calcium-, Barium- und Aluminiumionen. Diese Vernetzer werden beispielsweise als Hydroxide, Carbonate oder Hydrogencarbonate der wäßrigen polymerisierbaren Lösung zugesetzt.
Weitere geeignete Vernetzer sind multifunktionelle Basen, die ebenfalls in der Lage sind, ionische Vernetzungen auszubilden, beispielsweise Polyamine oder deren quaternierte Salze. Beispiele für Polyamine sind Ethylendiamin, Diethy- lentriamin, Triethylentetramin, Tetraethylenpentamin, Pentaethylenhexamin und Polyethylenimine sowie Polyvinylamine mit Molmassen von jeweils bis zu 4000000.
Die vorgenannten Vernetzer b) können einzeln oder in Mischungen verwendet werden.
Die Monomeren b) werden in einer Menge von 0,01 bis 30 Gew.-%, vorzugsweise von 0,1 bis 30 Gew.-%, insbesondere von 0,5 bis 20 Gew.-%, bevorzugt von 0.5 bis 15 Gew.-%, besonders bevorzugt von 0.5 bis 10 Gew.-%, bezogen auf die Monomergesamtmenge, eingesetzt. Für die Herstellung hochporöser Träger (Porenweite >50 nm) werden in der Regel Vernetzerkonzentrationen zwischen 0,5 und 1 Gew.% eingesetzt.
Erfindungsgemäß geeignete Monomere c) sind solche monoethylenisch ungesättigte Monomere, die mit den Monomeren a) und b) copolymerisierbar sind. Hierzu gehören beispielsweise die Amide und Nitrile von monoethylenisch ungesättigten Carbonsäuren, z. B. Acrylamid, Methacrylamid und N-Vinyl- formamid, Acrylnitril und Methacrylnitril, Dialkyldiallylammoniumhalogenide wie Dimethyldiallylammoniumchlorid, Diethyldiallylammoniumchlorid, Allylpiperidinium- bromid, N-Vinylimidazole wie z. B. N-Vinylimidazol, 1 -Vinyl-2-methylimidazol und N-Vinylimidazoline wie N-Vinylimidazolin, 1-Vinyl-2-methylimidazolin, 1-Vinyl-2- ethylimidazolin oder 1-Vinyl-2-propylimidazolin, die gegebenenfalls in Form der freien Basen, in quaternisierter Form oder als Salz bei der Polymerisation eingesetzt werden können.
Außerdem eignen sich Dialkylaminoalkylacrylate und Dialkylaminoalkyl- methacrylate, Dimethylaminoethylacrylat, Dimethylaminoethylmethacrylat, Diethylaminoethylacrylat und Diethylaminoethylmethacrylat. Die basischen Ester werden vorzugsweise in quaternisierter Form oder als Salz eingesetzt.
Weitere geeignete Verbindungen c) sind beispielsweise Vinylester von gesättigten C1- bis C4-Carbonsäuren wie Vinylformiat, Vinylacetat oder Vinylpropionat, Alkylvinylether mit mindestens 2 C-Atomen in der Alkylgruppe, wie z.B. Ethylvinylether oder Butylvinylether, Ester von monoethylenisch ungesättigten C3- bis C6-Carbonsäuren, z. B. Ester aus einwertigen C1- bis C18-Alkoholen und Acrylsäure wie z. B. Methylacrylat, Ethylacrylat, Propylacrylat, Isopropylacrylat, n- Butylacrylat, Isobutylacrylat, Hexylacrylat, 2-Ethylhexylacrylat, Stearylacrylat, die entsprechenden Ester der Methacrylsäure, Fumarsäure oder Maleinsäure, Halbester von Maleinsäure, z.B. Maleinsäuremonomethylester und Hydroxyalkylester der genannten monoethylenisch ungesättigten Carbonsäuren, z. B. 2-Hydroxyethylacrylat, Hydroxypropylacrylat, Hydroxybutylacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Hydroxypropylmethacrylat und Hydroxybutylmethacrylat, N-Vinyllactame wie N-Vinylpyrrolidon oder N-Vinylcaprolactam, Acrylsäure- und Methacrylsäureester von alkoxylierten einwertigen, gesättigten Alkoholen, z. B. von Alkoholen mit 10 bis 25 C-Atomen, die mit 2 bis 200 Mol Ethylenoxid und/oder Propylenoxid pro Mol Alkohol umgesetzt worden sind, sowie Monoacrylsäureester und Monomethacrylsäureester von Polyethylenglykol oder Polypropylenglykol, wobei die Molmassen (MM) der Polyalkylenglykole beispielsweise bis zu 2000 betragen können. Weiterhin geeignete Monomere der Gruppe c) sind alkylsubstituierte Styrole wie Ethylstyrol oder teil. Butylstyrol. Die Monomeren c) können auch als binäre oder ternäre Mischungen bei der Copolymerisation mit den anderen Monomeren eingesetzt werden, z. B. Mischungen aus Vinylacetat und 2-Hydroxyethylacrylat in beliebigem Verhältnis.
Bevorzugte Monomere c) sind 2-Hydroxyethylmethacrylat, Acrylamid, 2- Hydroxyethylacrylat, Vinylacetat, (Meth)acrylamid, (Meth)acrylsäureester, vinylaromatische Verbindungen und N-Vinyllactame, insbesondere N-Vinyl- pyrrolidon.
Gegebenenfalls setzt man die Monomere der Gruppe c) in Mengen von 0,5 bis 60 Gew.-%, insbesondere 0,5 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 50 Gew.-%, bevorzugt 5 bis 40 Gew.-%, besonders bevorzugt 5 bis 30 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt 5 bis 20 Gew.-%, bezogen auf die insgesamt zur Polymerisation gelangenden Monomere ein.
Als Polymerisationsinitiatoren d) können sämtliche unter den Polymerisationsbedingungen in Radikale zerfallende Verbindungen eingesetzt werden, z.B. Peroxide, Hydroperoxide, Wasserstoffperoxid, Persulfate, Azoverbindungen sowie Redoxkatalysatoren.
Bevorzugt ist der Einsatz von wasserlöslichen Initiatoren. In manchen Fällen ist es vorteilhaft, Mischungen verschiedener Polymerisationsinitiatoren zu verwenden, z. B. Mischungen aus Wasserstoffperoxid und Natrium- oder Kaliumperoxidisulfat. Mischungen aus Wasserstoffperoxid und Natriumperoxidisulfat können in jedem beliebigen Verhältnis verwendet werden.
Geeignete organische Peroxide sind beispielsweise Acetylacetonperoxid, Methylethylketonperoxid, tert.-Butylhydroperoxid, Cumolhydroperoxid, tert.-Amyl- perpivalat, tert.-Butylperpivalat, tert.-Butylperneohexanoat, tert.-Butyl- perisobutyrat, tert.-Butylper-2-ethylhexanoat, tert.-Butylperisononanoat, tert.-Butyl- permaleat, tert.-Butylperbenzoat, tert.-Butylper-3,5,5-tri-methylhexanoat und tert.- Amylperneodekanoat. Besonders geeignete Polymerisationsinitiatoren sind N,N,N',N'-Tetramethyl- ethylendiamin (TEMED) und Ammoniumpersulfat (APS), durch deren kombinierte Zugabe eine signifikante Beschleunigung der Polymerisation erzielt werden kann.
Die bevorzugten Konzentrationen von TEMED und APS (40%ige wäßrige Lösung) liegen, bezogen auf die Monomerphase, im Bereich von 1-10 Vol. % für TEMED und 1-20% für APS, wobei generell eine steigende Konzentration an TEMED und APS mit einem proportionalen Anstieg der Polymerisationsgeschwindigkeit einhergeht.
Überraschenderweise konnte gezeigt werden, daß die oben beschriebene Polymerisationsbeschleunigung nur dann eintritt, wenn die APS Zugabe zeitlich vor der TEMED Zugabe erfolgt. Auf diese Weise kann die Polymerisation und somit die Beadbildung innerhalb weniger Minuten abgeschlossen werden.
Weiterhin geeignet sind wasserlösliche Azostarter, z. B. 2,2'-Azobis-(2- amidinopropan)dihydrochlorid, 2,2'-Azobis-(N,N'-dimethylen)iso-butyramidin- dihydrochlorid, 2-(Carbamoylazo)isobutyronitril, 2,2'-Azobis [2-(2'-imidazolin-2- yl)propan-dihydrochlorid und 4,4,-Azobis-(4-cyanovaleriansäure).
Als Initiatoren können weiterhin Redoxkatalysatoren verwendet werden. Redoxkatalysatoren enthalten als oxidierende Komponente mindestens eine der oben angegebenen Perverbindungen und als reduzierende Komponente z. B. As- corbinsäure, Glukose, Sorbose, Ammonium- oder Alkalimetall-hydrogensulfit, - sulfit, -thiosulfat, -hyposulfit, -pyrosulfit oder -sulfid, Metallsalze, wie Eisen-ll-ionen oder Silberionen oder Natriumhydroxymethylsulfoxylat.
Vorzugsweise verwendet man als reduzierende Komponente des Redoxkatalysators Ascorbinsäure oder Natriumsulfit. Anstelle der oxidierenden Komponente des Redoxkatalysators kann man auch einen oder mehrere wasserlösliche Azostarter verwenden. Die genannten Polymerisationsinitiatoren werden in üblichen Mengen eingesetzt, die in Abhängigkeit von dem gewünschten Reaktionsverlauf durch den Fachmann in geeigneterweise angepaßt werden können.
Erfindungsgemäß geeignete magnetische Komponenten e) sind insbesondere Magnetkolloide oder magnetische Pulver. Als magnetische Kolloide bzw. Magnetpulver können grundsätzlich solche ferro-, ferri- oder superparamagnetischen Substanzen eingesetzt werden, die eine homogene Mischung mit der Monomerphase eingehen.
Als bevorzugte magnetische Substanz wird Magnetit mit Partikelgrößen im Bereich von etwa 10 nm bis etwa 600 nm, insbesondere etwa 20 bis etwa 400 nm eingesetzt. Substanzen solcher Art sind z.B. unter der Handelsbezeichnung Bayferrox im Handel erhältlich. Die Herstellung solcher Kolloide ist allgemeiner Stand der Technik und wurde u.a. von Shinkai et al., Biocatalysis, Vol. 5, 1991 , pp61 , Reimers und Khalafalla, Br. Patent 1 ,439,031 oder Kondo et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol 41 , 1994, pp 99, beschrieben.
Die Konzentrationen der Kolloide in der Polymerphase liegen, jeweils bezogen auf die Monomerphase, vorzugsweise im Bereich von etwa 5 bis etwa 30 Vol.-%, insbesondere 5 bis 10 Vol.-% bei den Kolloiden, die herstellungsbedingt bereits als wäßrige Kolloide vorliegen, und im Bereich von etwa 1 bis etwa 20 Gew.-%, insbesondere 5 bis 10 Gew.-% bei den Festsubstanzen.
Die magnetischen Eigenschaften der erfindungsgemäß herstellbaren Polymerpartikel werden durch direktes Zumischen eines geeigneten Magnetkolloids oder magnetischen Pulvers vor der Suspension zu der Monomerphase erzielt. Durch die Möglichkeit des genauen Zudosierens der magnetischen Substanz können parallel damit die magnetischen Eigenschaften der Polymerpartikel in gezielter Weise eingestellt bzw. verändert werden. Dies ist vor allem im Hinblick auf die die Trenneffizienz determinierenden magnetischen Attraktionskräfte der Teilchen von ausschlaggebender Bedeutung. Dieser einfach zu variierende Verfahrensparameter zeichnet den erfindungsgemäßen Prozess gegenüber den meisten aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zur Herstellung magnetischer Träger eindeutig aus.
So sind in dem im U.S. Patent 4,654,267 beschriebenen Verfahren zur Herstellung magnetischer Partikel aufwendige Quellungsprozesse mit Eisensalzen und anschließende Oxidation zum Magnetit erforderlich, während bei dem erfindungsgemäßen Verfahren das magnetische Kolloid in einfacher Weise der Monomerphase zugesetzt werden kann.
Bei der anschließenden Suspension in der organischen Phase werden die Magnet-Kolloide dann simultan in die sich bildenden Polymertröpfchen eingekapselt. Diese Verfahrensweise stellt eine deutliche verfahrenstechnische Vereinfachung gegenüber dem vorgenannten Verfahren dar, womit auch eine erhebliche Zeitersparnis verbunden ist.
Die Präparationszeiten bei dem vorgenannten Verfahren aus dem Stand der Technik betragen zwischen 10 und 30 Stunden, das erfindungsgemäße Verfahren benötigt hingegen lediglich etwa 5 bis 15 Minuten zur Gewinnung der funktionalisierten Magnetpartikel.
Um eine möglichst feindisperse, gleichmäßige Verteilung der Magnetpartikel in dem Polymeren zu gewährleisten, ist es vorteilhaft eine kurzzeitige Beschallung der Monomermischung mit Hilfe eines Ultraschallfingers oder in einem entsprechenden Ultraschallbad vorzunehmen oder, beispielsweise durch Einsatz üblicher Homogenisatoren, hohe Scherkräfte auf die Mischung einwirken zu lassen.
Neben der Beschallung können den magnetischen Pulvern auch solche Substanzen zugesetzt werden, die emulsionsstabilisierende Eigenschaften besitzen und dadurch eine homogenere Verteilung der Magnetsubstanzen in der Monomerphase fördern. Substanzen dieser Art sind z.B. Poly-N-Vinylpyrrolidon, Celluloseacetat-butyrat, Serum-Albumin, aliphatische und aromatische Sulfonsäure-Derivate, Gelatine oder Polyethylenglykole. Die Mengen der eingesetzten Emulgatoren liegen zumeist im Bereich von etwa 0.5 bis etwa 5 Gew.-%, bezogen auf die eingesetzte Magnetsubstanz.
Die homogene Verteilung der Magnetsubstanzen in der Monomerphase läßt sich auch fördern, indem man beispielsweise hohe Scherkräfte auf die Mischung einwirken läßt. Dazu verwendet man Homogenisatoren, die dem Fachmann bekannt sind.
Beispielhaft seien genannt:
Labordissolver Dispermat, Fa. VMA-Getzmann, Reichshof, DE Ultra-Turax, Fa. Janke und Kunkel, Stauten, DE Druckhomogenisator, Fa. Gaulin, Lübeck, DE Geräte mit einem Rotor-Stator-System, etwa
Dispax, Fa. Janke und Kunkel, Stauten, DE
Cavitron-Homogenisatoren, Fa. v. Hagen & Funke, Sprochhövel, DE
Homogenisatoren der Fa. Kotthoff, Essen, DE
Homogenisatoren der Fa. Dorr Oliver, Grevenbroich, DE.
Üblicherweise betreibt man diese Geräte bei Drehzahlen von 1000 bis 25.000 pro Minute, bevorzugt 2000 bis 25.000 pro Minute. Weiterhin können die hohen Scherkräfte ebenso durch
Hindurchpressen der Mischung unter hohem Druck durch einen engen Spalt oder durch Düsen kleinen Durchmessers,
Kolloidmühlen, oder andere geeignete Homogenisatoren erzeugt werden.
Die erfindungsgemäß hergestellten Partikel weisen vorzugsweise eine Teilchengröße im Bereich von etwa 1 bis etwa 50 μm, vorzugsweise 1 bis 30 μm, insbesondere 1 bis 20 μm auf. Solche Teilchengrößen haben sich im Bereich der Separationstechnologie sowohl im Hinblick auf eine rasche magnetische Abtrennung als auch in Bezug auf maximal verfügbare Teilchenoberflächen, die ausschlaggebend für die Trennkapazität des Trägers sind, als optimal herausgestellt. Die aus dem Stand der Technik bekannten Magnetpartikel auf Polyacrylat-Basis weisen durchweg eine Partikelgröße >50 μm, solche auf Basis von Polystyrol eine solche von <1 μm auf.
Teilchengrößen im Bereich von etwa 1 bis etwa 50 μm zu erhalten, wird überraschenderweise durch die Verwendung von Ölen, insbesondere Mineralöl, tierischen oder pflanzlichen Ölen (Pflanzenölen) als Suspensionsmedium mit einer Viskosität im Bereich von 25 bis 150 mPa-s, insbesondere im Bereich von 30 bis 80 mPa-s (bzw. Centipoise) ermöglicht.
Vorzugsweise wird die Monomerphase vor der Suspension in der organischen Phase etwa 5 bis etwa 180 Sekunden vorpolymerisiert.
Erfindungsgemäß bevorzugt einsetzbare Öle sind ausgewählt unter a) Mineralölen, d. h. flüssigen Destillationsprodukten, die aus mineralischen Rohstoffen (Erdöl, Braun- u. Steinkohlen, Holz, Torf) gewonnen wurden und die im wesentlichen aus Gemischen von gesättigten Kohlenwasserstoffen bestehen, b) Ölen tierischen Ursprungs, insbesondere technischen Fischölen, wie Capelinöl, Heringsöl, Makrelenöl, Orange-Roughy-Öl, Sardinenöl, Thunfischöl und anderen, sowie c) Ölen pflanzlichen Ursprungs, insbesondere Aprikosenkernöl, Arganöl, Avocadoöl, Babassuöl, Baumwollsaatöl, Boragesamenöl, Calendulaöl, Camelinaöl, Erdnussöl, Frittieröl, Hagebuttenkernöl, Hanföl, Haselnussöl, Johannisbeersamenöl, Johanniskrautöl, Jojobaöl, Kakaobutter, Knoblauchöl, Kokosöl, Kürbiskernöl, Kukuinussöl, Leinöl, Lorbeeröl, Maiskeimmöl, Makadamianussöl, Mandelöl, Mangofett, M.C.T.-ÖI, Mohnöl, Nachtkerzenöl, Olivenöl, Palmkernöl, Palmöl, Paranussöl, Pekannussöl, Perillaöl, Pfirsichkernöl, Pistazienkemöl, Rain Forest Öle, Reiskeimöl, Rizinusöl, Gemischen aus Rüböl / Rapsöl, Gemischen aus Safloröl / Distelöl, Sanddornfruchtfleischöl, Schwarzkümmelöl, Senföl, Sesamöl, Sheabutter, Sojaöl, Sonnenblumenöl, Traubenkernöl, Walnussöl und Weizenkeimöl, oder Mischungen davon.
Die Polymerisationsreaktion wird bevorzugtermaßen in dem Fachmann bekannter Weise entweder im Batch-Reaktor, im kontinuierlichen Strömungsrohr, in der Rührkesselkaskade oder im kontinuierlichen Rührkesselreaktor durchgeführt. Die Kesselreaktoren haben in der chemischen Industrie dabei die größte Bedeutung erlangt, da sie eine sehr große Flexibilität bezüglich der Betriebsbedingungen und der Betriebsweise aufweisen und an fast alle Prozeßerfordernisse angepaßt werden können. Rührkesselreaktoren eignen sich für diskontinuierliche und kontinuierliche Betriebsweise und sie besitzen einen weiten Einsatzbereich, der vom Laborkessel bis zum Großreaktor reicht. Rührkesselreaktoren sind in standardisierter Bauweise für zahlreiche Anwendungen in verschiedensten Werkstoffen und Werkstoffkombinationen erhältlich. Rührkesselreaktoren sind leicht begeh- und reinigbar und erlauben eine relativ einfache Umstellung auf andere Polymerisationsreaktionen (s. z. B. Ullmann, Band 3, 4. Aufl., S. 505-510).
Neben den üblichen Kühl- und Heizeinrichtungen, Zu- und Ableitungen für Reaktionsedukte und -produkte weisen die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeigneten Reaktorbehälter Rührvorrichtungen auf, die meist aus einem über eine Rührwelle angetriebenen Rührer bestehen und für gewisse Anwendungsfälle zudem Statoren aufweisen, die zur besseren Durchmischung als Stromstörer dienen. Die Rührer selbst sind an meist senkrechten Rührerachsen befestigt, welche entweder von unten oder von oben in den im allgemeinen zylindrischen Reaktorbehälter hineinragen. Der zentrische Einbau von oben in den Reaktorbehälter ist im allgemeinen bevorzugt, da die Abdichtung der Rührerwelle relativ einfach durchgeführt werden kann.
Aus Ulimanns, Enzyclopedia of Industrial Chemistry, 5. Auflage, Volume B2, Kapitel 25 sind unterschiedlichste Rührer, beispielsweise Propellerrührer, Scheibenrührer, Ankerrührer, Impellerrührer, Blattrührer, MIG-Rührer, usw. bekannt. Erfindungsgemäß bevorzugt wird der Suspensionsvorgang mit Hilfe eines konventionellen Propellerrührers bewerkstelligt. Um die gewünschten Teilchengrößen von 1 bis 30 μm zu erhalten, werden Rührgeschwindigkeiten zwischen 1000 und 4000 U/Min. benötigt, wobei eine direkte Proportionalität zwischen der Rührgeschwindigkeit und der Feinheit der Teilchen gegeben ist. So lassen sich Teilchengrößen von <10 μm durchweg mit Rührgeschwindigkeiten von >2000 U/Min. und solche >10 μm mit Rührgeschwindigkeiten von <1000-2000 U/Min. erzielen.
Als erfindungsgemäß einsetzbare weitere Bestandteile f) kommen insbesondere Schutzkolloide, Polymerisationsbeschleuniger oder Emulgatoren in Betracht. Diese sind aus dem Stand der Technik bekannt und können durch den Fachmann je nach Bedarf der Reaktion zugesetzt werden.
Ein wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht in der Möglichkeit, die gewünschten Eigenschaften der Beads wie Molekülbindungsverhalten, magnetische Eigenschaften, Funktionalität durch die Zusammensetzung der Ausgangsmischung festzulegen. So wird die Porosität der Teilchen, die ein unmittelbarer Einflußparameter für die Biomolekül-Bindungskapazitäten darstellt, in entscheidendem Maße durch die Konzentration des Vernetzers b) in dem Monomeransatz festgelegt. In der Regel enthält der Monomeransatz zwischen 0,5 und 10 Gew.-% Vernetzeranteil, vorzugsweise zwischen 0,5 und 2 Gew.-%. Je geringer der Vernetzeranteil im Reaktionsansatz ist, desto größer werden die Poren der polymerisierten Partikel.
Dies stellt einen weiteren überraschenden Vorteil der vorliegenden Erfindung dar, denn bei üblichen Suspensionspolymerisationsverfahren muß man, um eine große innere Oberfläche zu erzielen, einen geringen Vernetzungsgrad wählen. Durch Einlagern von Lösungsmittelmolekülen werden die Kettenabstände aufgeweitet und die Polymere werden sehr weich (Gel-Typen) und sind somit mechanisch sehr instabil, was für viele Anwendungen, insbesondere im Bereich der Separation von Biomolekülen, unerwünscht ist. Wenn größere mechanische Stabilität gefordert wird, benötigt man permanent makroporöse Polymere. Diese werden bei der üblichen Suspensionspolymerisation durch Anwesenheit geeigneter Porenbildner (meist ein inertes Lösungsmittel) in der dispersen Phase gebildet. Das Porogen soll ein thermodynamisch gutes Lösungsmittel für das Monomer, aber ein schlechtes Lösungsmittel für das Polymer sein. Ein "gutes" Porogen führt zu sehr später Phasenseparation und damit zu kleinen Poren, ein "schlechtes" Porogen führt zu früherer Phasentrennung und großen Poren. Aufgrund der hohen Vernetzungsgrade sind solche Polymerträger nur sehr wenig quellbar, haben aber gute mechanische Eigenschaften.
Im Gegensatz dazu ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren die Steuerung der Porosität direkt über die Vernetzerkonzentration.
Außerdem werden - im Gegensatz zu den aus dem Stand der Technik bekannten Suspensionsphasen - für das erfindungsgemäße Verfahren keine zusätzlichen oberflächenaktiven Stabilisatoren für die organische Phase benötigt. Dieser Umstand erleichtert die anschließenden Waschprozeduren, da beim Entfernen der Ölphase keine restlichen Stabilisatoren auf der Oberfläche der Beads verbleiben können.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Polymerpartikel sind in Abhängigkeit von Art und Anzahl der polaren Funktionen, die sie einpolymerisiert enthalten, zur Aufreinigung von Biomolekülen, Mikroorganismen oder Zellen geeignet.
Es können jedoch auch bestimmte Liganden („Fängermoleküle") an die Polymerhülle chemisch gekoppelt werden, die die Biomoleküle, Mikroorganismen oder Zellen selektiv zu binden vermögen. Zur Herstellung dieser Liganden werden die Polymerpartikel (nach erfolgter Suspensionspolymerisation) vorzugsweise mit Monomeren umgesetzt, die reaktive Gruppen enthalten. Bevorzugte Monomere mit reaktiven Gruppen sind ausgewählt unter Glycidylmethacrylaten, Glycidylacrylaten, Halogenalkylmethacrylaten, Halogenalkylacrylaten,
Maleinsäureanhydrid, Acrylsäurechlorid, Acrylsäureanhydrid, Methacrylsäure- chlorid und Methacrylsäureanhydrid. Diese Monomere mit reaktiven Gruppen werden vorzugsweise mit Nucleophilen wie z.B. Aminen, im besonderen mit Polyaminen und besonders bevorzugt mit Polyethyleniminen nachträglich umgesetzt. Hierdurch wird eine Modifizierung der Partikeloberfläche mit den erwünschten Liganden bewirkt.
Ganz besonders bevorzugt ist die Verwendung von Monomeren, die über alkylierende Reagenzien modifiziert werden können wie Aminoalkyl(meth)acrylate,
Hydroxyalkyl(meth)acrylate.
Weitere voneinander unabhängige Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind: Perl- bzw. kugelförmige magnetische Partikel auf Acrylsäurebasis zur Aufreinigung biologischer Substanzen, erhältlich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren sowie die Verwendung perl- bzw. kugelförmiger magnetischer Partikel auf Acrylsäurebasis, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurden, zur Aufreinigung biologischer Substanzen.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch darauf einzuschränkent.
Beispiel 1
10 ml einer wäßrigen Mischung bestehend aus Acrylamid und N,N'- Methylenbisacrylamid (34:1) werden mit 10 ml 2-Dimethylaminoethyl-methacrylat und 118 mg Magnetit-Kolloid (Bayferrox, Fa. Bayer) vermischt und 10 Sekunden mit Ultraschall behandelt (500 W). Der Mischung werden sodann 2 ml 0,4 %ige Ammoniumpersulfat-Lösung (APS) und 1 ml N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED) zugesetzt. Nach Zugabe des TEMEDs wird der Polymeransatz 30 Sekunden vorpolymerisiert und sodann in 300 ml Pflanzenöl, Viskosität 84 Centipoise, unter Rühren (1500 U/Min.) für 4 Min. suspendiert. Mann läßt die Mischung danach für weitere 10 Min. ohne Rühren weiter polymerisieren. Der Suspension werden ca. 100 ml Petroläther zugesetzt; die Ölphase läßt sich sodann durch Anlegen eines Handmagneten abtrennen. Es folgt mehrfaches Waschen der Polymerphase mit Petroläther, Aceton und Äthanol. Danach wird die Polymerphase mehrere Stunden in aqua dest aufbewahrt. Es werden Polymerpartikel mit einer mittleren Teilchengröße von 27 μm gewonnen.
Beispiel 2
Ein Magnetit-Kolloid wird analog der Vorschrift von Kondo et al., Appl. Microbiol. Biotechn., Vol. 41 , 1994, 99-105, hergestellt. 5 ml des wäßrigen Kolloids werden für 30 Sekunden mit einem Hochleistungsultraschallfinger (Fa. Dr. Hielscher) beschallt. Dieses Kolloid wird sodann einer Mischung, bestehend aus 10 ml Acrylamid (30%ige wäßrige Lösung), 2 ml 2-Hydroxyethyl-methacrylat und 1 ml N.N'-Methylenbisacrylamid (30%'ιge wäßrige Lösung) und 15 ml 2- Dimethylaminoethyl-methacrylat , zugesetzt. Nach Zugabe von 2 ml APS und 1 ml TEMED wird die Mischung in 40 ml Pflanzenöl (Viskosität 105 Centipoise) unter Rühren (2200 U/Min) für 4 Minuten dispergiert. Danach wird die Suspension für 15 Minuten auf 60°C ohne Rühren aufgeheizt. Die Ölphase wird sodann nach Absetzen der Polymerphase abdekantiert und diese mehrfach abwechselnd analog Beispiel 1 mit Petroläther, Aceton und Äthanol gewaschen. Die gewonnene Fraktion wird mehrere Stunden in Wasser aufbewahrt. Man erhält Polymerpartikel mit einer mittleren Teilchengröße von 13 μm.
Beispiel 3
8 ml N.N'-Methylenbisacrylamid, 85 ml 2-Hydroxyethyl-methacrylat und 95 ml 2- Dimethylaminoethyl-methacrylat werden vermischt. 8,5 g Bayferrox 318 M-Pulver (Fa. Bayer), das zuvor mit 5 ml Polyethylenglykol (Mw 400) vermischt wurden, werden der Monomermischung zugesetzt. Die Mischung wird sodann 10 Sekunden mit einer Ultraschall-Sonotrode analog Beispiel 2 beschallt. Es erfolgt die Zugabe von 18 ml APS. Die Mischung wird anschließend in 2,5 Liter Pflanzenöl gemäß Beispiel 1 unter Rühren (1500 U/Min) dispergiert. Nach 30 Sekunden erfolgt die Zugabe von 10 ml TEMED. Nach 3minütiger Dispersion unter Rühren läßt man die Mischung weitere 15 Minuten ohne Rühren bei Raumtemperatur stehen. Es erfolgt die Abtrennung der Ölphase. Nach mehrmaligem Waschen mit Petroläther wird die Polymerphase mehrfach abwechselnd mit Aceton und Äthanol nachgewaschen. Danach wird die Polymerphase mehrere Stunden in 500 ml aqua dest aufbewahrt. Es werden Polymerpartikel mit einer mittleren Teilchengröße von 22 μm gewonnen.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung perlförmiger magnetischer Partikel auf Acrylsäurebasis zur Aufreinigung biologischer Substanzen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Mischung umfassend a) mindestens ein polares Acrylat-Monomer, b) mindestens einen Vernetzer mit mindestens zwei nicht konjugierten, ethylenisch ungesättigten Doppelbindungen, c) gegebenenfalls mindestens ein zusätzliches, copolymerisierbares wasserunlösliches monoethylenisch ungesättigtes Monomer, d) mindestens einen Polymerisationsinitiator, e) mindestens eine magnetische Komponente sowie f) gegebenenfalls weitere Bestandteile in einer mit Wasser nicht mischbaren organischen Phase suspendiert und zu perlförmigen Polymerpartikeln radikalisch vernetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das polare Acrylat- Monomer a) ein ionisches Acrylat-Monomer, vorzugsweise ein kationisches Acrylat-Monomer ist, insbesondere ein Acrylat-Monomer, das ausgewählt ist unter Methacrylsäure-2-dimethylaminoethylester, Acrylsäure-[2-(dimethyl- amino)-ethylester], Acrylsäure-[3-(dimethylamino)-propylester] oder Methacrylsäure-2-diethylaminoethylester.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die organische Phase ausgewählt ist unter a) Mineralölen, b) Ölen tierischen Ursprungs, insbesondere technischen Fischölen, wie Capelinöl, Heringsöl, Makrelenöl, Orange-Roughy-Öl, Sardinenöl, Thunfischöl und anderen, sowie c) Ölen pflanzlichen Ursprungs, insbesondere Aprikosenkernöl, Arganöl, Avocadoöl, Babassuöl, Baumwollsaatöl, Boragesamenöl, Calendulaöl, Camelinaöl, Erdnussöl, Frittieröl, Hagebuttenkemöl, Hanföl, Haselnussöl, Johannisbeersamenöl, Johanniskrautöl, Jojobaöl, Kakaobutter, Knoblauchöl, Kokosöl, Kürbiskernöl, Kukuinussöl, Leinöl, Lorbeeröl, Maiskeimöl, Makadamianussöl, Mandelöl, Mangofett, M.C.T.-ÖI, Mohnöl, Nachtkerzenöl, Olivenöl, Palmkemöl, Palmöl, Paranussöl, Pekannussöl, Perillaöl, Pfirsich kernöl, Pistazienkernöl, Rain Forest Öle, Reiskeimöl, Rizinusöl, Gemischen aus Rüböl / Rapsöl, Gemischen aus Safloröl / Distelöl, Sanddornfruchtfleischöl, Schwarzkümmelöl, Senföl, Sesamöl, Sheabutter, Sojaöl, Sonnenblumenöl, Trauben kernöl, Walnussöl und Weizenkeimöl, oder Mischungen davon.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die organische Phase eine Viskosität im Bereich von 25 bis 150 mPa-s, insbesondere im Bereich von 30 bis 80 mPa-s aufweist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetische Komponente e) Magnetit mit Partikelgrößen im Bereich von etwa 10 nm bis etwa 600 nm, insbesondere etwa 20 bis etwa 400 nm.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetische Komponente e) Substanzen zugesetzt enthält, die emulsionsstabilisierende Eigenschaften besitzen, insbesondere Substanzen, die ausgewählt sind unter Poly-N-Vinylpyrrolidon, Celluloseacetat- butyrat, Serum-Albumin, aliphatischen und aromatischen Sulfonsäure- Derivaten, Gelatine oder Polyethylenglykolen oder Mischungen davon.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Monomer c) ausgewählt ist unter 2- Hydroxyethylmethacrylat, Acrylamid, 2-Hydroxyethylacrylat, Vinylacetat, (Meth)acrylamid, (Meth)acrylsäureester, vinylaromatischen Verbindungen und N-Vinyllactamen, insbesondere N-Vinylpyrrolidon.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Monomer c) in Mengen von 0,5 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 50 Gew.-%, bevorzugt 5 bis 40 Gew.-%, besonders bevorzugt 5 bis 30 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt 5 bis 20 Gew.-%, bezogen auf die insgesamt zur Polymerisation gelangenden Monomere, eingesetzt wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Monomerphase vor der Suspension in der organischen Phase etwa 5 bis etwa 180 Sekunden vorpolymerisiert wird.
10.Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Polymerisationsinitiator d) aus einer Mischung von Ammoniumpersulfat und N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin besteht.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Ammoniumpersulfat-Zugabe zeitlich vor der N,N,N',N'-
Tetramethylethylendiamin-Zugabe erfolgt.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man nach erfolgter Suspensionspolymerisation Liganden chemisch an die Polymerhülle koppelt, die Biomoleküle, Mikroorganismen oder Zellen selektiv zu binden vermögen.
13. Perlförmige magnetische Partikel auf Acrylsäurebasis zur Aufreinigung biologischer Substanzen, erhältlich nach einem der Ansprüche 1 bis 12 dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel eine Teilchengröße im Bereich von etwa 1 bis etwa 50 μm, vorzugsweise 1 bis 30 μm, insbesondere 1 bis 20 μm aufweisen und a) mindestens ein polares Acrylat-Monomer, b) mindestens einen Vernetzer mit mindestens zwei nicht konjugierten, ethylenisch ungesättigten Doppelbindungen, c) gegebenenfalls mindestens ein zusätzliches, copolymerisierbares wasserunlösliches monoethylenisch ungesättigtes Monomer, d) mindestens eine magnetische Komponente sowie e) gegebenenfalls weitere Bestandteile einpolymerisiert enthalten.
14. Verwendung von periförmigen magnetischen Partikeln auf Acrylsäurebasis, wie in Anspruch 13 beschrieben, zur Aufreinigung biologischer Substanzen, insbesondere zur Aufreinigung von Nukleinsäuren, Nukleinsäurederivaten, eukaryotischen Zellen, Proteinen, Viren oder Bakterien.
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