WO2004018665A1 - 核酸回収チップと核酸回収装置 - Google Patents

核酸回収チップと核酸回収装置 Download PDF

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cells
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Kenji Yasuda
Takanori Ichiki
Kazunori Okano
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Japan Science and Technology Agency
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

Definitions

  • the invention of this application relates to a nucleic acid recovery chip and a nucleic acid recovery apparatus for observing cells while culturing the cells, and selectively separating and recovering a nucleic acid component in a specific region in the cells when the cells reach a specific state. It is. Background art
  • a well-known DNA chip is a technique that uses a micropatterning technique and the complementarity of MA to detect a specific base sequence.
  • oligonucleotides having various sequences on a substrate are patterned on an array, a DNA sample is used to detect a binding position on the substrate, and a sequence of DNA in the sample is analyzed. It is.
  • the PCR reaction is the dissociation of DNA double strands (95, 30 seconds), annealing with oligonucleotides (37, 20 seconds), and complementary strand synthesis by DNA polymerase (72, 2 This is a well-known technology that amplifies a small amount of DNA fragment several hundred thousand times.
  • the primers of about 20 bases formed on the substrate and the single-stranded DNA / RNA in the sample are complementarily bound and captured and observed.
  • Emphasis has been placed on techniques for analyzing the intracellular distribution of mRNA in a particular cell state (at a specific time in the cell cycle) and for analyzing nucleic acid components in cells at each cell unit in a tissue. That is the fact. This is the same for the conventional methods for separating and analyzing various biological samples (apparatus).
  • the invention of this application is intended to clarify the distribution of nucleic acid components in cells in a specific state or the distribution of nucleic acid components in each cell in a tissue cell population.
  • An object of the present invention is to provide a new technical means capable of selectively separating and recovering a nucleic acid component in a specific region. Disclosure of the invention
  • an electrically conductive region is disposed on a transparent substrate, and a nucleic acid binding portion and a cell storage container portion are disposed on this region.
  • a chip for collecting a nucleic acid in a cell wherein the cell includes a means for applying a potential to the electrically conductive region, and a means for culturing cells in a cell-containing container.
  • the conductive region absorbs light of a specific wavelength, and when irradiated with the light of the specific wavelength, generates heat locally, so that nucleic acid components bound on the electrically conductive region are locally decomposed.
  • the c provides nucleic acid recovery chip, characterized in that it has to be separated and recovered, the invention of this application, in the second, as a means you applying a potential to the electrically conductive regions, electrically conductive regions And an upper electrically conductive portion opposed to the upper portion.
  • the nucleic acid recovery chip is provided with a body container, and fourthly, one or more cell storage containers each containing one cell are provided. 3. Provide a nucleic acid recovery chip according to any one of (3).
  • the invention of this application is a nucleic acid recovery device provided with any one of the nucleic acid recovery chips described above, wherein light of a specific wavelength is radiated to the electrically conductive region of the nucleic acid recovery chip.
  • a nucleic acid recovery device characterized by having an optical system for locally heating and a power supply system for applying a potential to this region.
  • an observation system for observing the state of cells Seventhly, the present invention provides a nucleic acid recovery device characterized by having a cell culture medium circulation system.
  • FIG. 1 is a schematic view of an embodiment showing an example of a basic configuration of a nucleic acid recovery chip of the invention of the present application.
  • FIG. 2 is a schematic view illustrating a procedure for recovering nucleic acid in cells using the nucleic acid recovery chip of the invention of the present application.
  • FIG. 3 is a schematic view illustrating one embodiment of an optical system and a solution sending system using the nucleic acid recovery chip of the invention of the present application.
  • a thin film layer 102 having optical absorption such as a chromium vapor deposition layer is disposed on an optically transparent substrate 101 such as a slide glass.
  • the film thickness of the thin film layer 102 be as thin as not to completely absorb light and to be uniform.
  • the transmitted light in the visible region is about 70%, which does not hinder the use of the present invention.
  • any one of Ti, V, Fe, Co, Ni, Mo, and W may be used.
  • the nucleic acid probe layer 113 can be immobilized on the substrate surface by the covalent bond of the oxide layer formed on the surface of the metal layer to the silanol group.
  • a wall 103 of a container for culturing the cells 104 is laminated on the light absorbing thin film layer 102.
  • Container size and distribution The location is appropriately selected according to the type of cell. For example, in the case of a nerve cell, the width is preferably about 50 or more.
  • a path 110 may be left so that axons and the like can be joined to other cells.
  • the height of the container wall 103 must be such that cells cannot cross.
  • the height may be 20 m or more.
  • agarose used as the material of the container wall 103, it has no adhesiveness to cells and is not harmful to cells because it is not a signal substance for cells. Optimal with little effect on data.
  • This region 109 is deposited as thin as the region 102 so as to have light transmittance.
  • the state of the cells in the container 105 can be continuously observed using the objective lens 112.
  • the substrate is locally heated, and the nucleic acid component bonded to the nucleic acid probe layer 113 is selectively thermally denatured and collected. can do.
  • An electric field can be applied between the region 102 and the region 109 using the power supply module 111.
  • the region 102 is configured as one electrode, but a plurality of electrode arrays that operate independently for each cell container may be used.
  • FIG. 2 is a schematic view illustrating a procedure for recovering nucleic acid in cells using the nucleic acid recovery chip of the invention of the present application.
  • FIG. 2 (1) is a schematic diagram showing the state of the substrate surface before cells are introduced.
  • a nucleic acid probe 202 is fixed to capture a nucleic acid component.
  • the nucleic acid probe 202 may be composed of a sequence centered on po1y-T in order to selectively recover mRNA, or when a specific nucleic acid component is to be recovered. May be composed of a sequence complementary to a specific nucleic acid component, or may be a mixture of nucleic acid probes having a plurality of different sequences.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the state of the substrate surface before cells are introduced.
  • the nucleic acid probe 202 may be composed of a sequence centered on po1y-T in order to selectively recover mRNA, or when a specific nucleic acid component is to be recovered. May be composed of a sequence complementary
  • FIG. 2 (2) is a schematic diagram showing a state where cells 203 are arranged on the substrate surface 201.
  • the cells When a specific cell state is reached while observing the state of the cells 203 under a microscope, the cells may be crushed by focused infrared light irradiated through a microscope objective lens, or the electrodes of each cell culture vessel may be independent. If so, a DC or AC electric field may be applied to the electrodes to disrupt the cells. Alternatively, when cells in all containers are to be crushed simultaneously, the cells may be crushed by introducing an agent such as a surfactant.
  • FIG. 2 (3) is a schematic diagram showing the procedure for separating intracellular proteins and nucleic acid components after cell disruption.
  • nucleic acid components in cells can be fixed in a two-dimensionally projected form on the substrate surface 201.
  • Fig. 2 (4) shows that a DC electric field opposite to the previous one can be applied to remove the nucleic acid component 206 that did not bind to the nucleic acid probe 205 on the substrate surface. ing.
  • 2 (5) is a schematic diagram showing a procedure for locally dissociating and recovering nucleic acid components in cells bound to the nucleic acid probe by focused light heating. Since only the nucleic acid sample 209 bound to the nucleic acid probe in the region 208 heated by the focused light irradiated by the objective lens 207 is selectively dissociated into the solution, it contains the dissociated nucleic acid component in this region By recovering the solution, it becomes possible to selectively recover the nucleic acid component in a specific region in the cell.
  • FIG. 3 schematically illustrates an apparatus configuration as one embodiment of an optical system and a solution sending system using the nucleic acid recovery chip of the invention of the present application.
  • this system uses a microscopy system and a culture solution circulation system at the same time. It has a focused light irradiation system for selectively recovering nucleic acids on the acid recovery chip 100.
  • a nucleic acid recovery chip 100 is arranged on the optical path of the microscopic observation optical system, and a culture solution supply / discard section for supplying a solution is connected to the nucleic acid recovery chip 100. ing.
  • the microscopic observation optical system has the following configuration.
  • the light emitted from the light source 301 is adjusted to a specific wavelength by the filter 302, collected by the condenser lens 303, and irradiated to the nucleic acid recovery chip 100.
  • the irradiated light is used for observation with an objective lens 305 as transmitted light.
  • the transmitted light image inside the nucleic acid collection chip 100 passes through the filter 312 by the mirror 311 and is guided to the camera 313 to form an image on the light receiving surface of the camera. Therefore, the material of the nucleic acid recovery chip 100 is desirably an optically transparent material with respect to the light having the wavelength selected by the filter 302.
  • glass such as borosilicate glass or quartz glass, resin or plastic such as polystyrene, or a solid substrate such as a silicon substrate, or a polymer such as agarose is used.
  • a silicon substrate when a silicon substrate is used, light having a wavelength of 900 nm or more is used for observation.
  • the light emitted from the light source 308 is guided to the objective lens 305 by the dichroic mirror 310 after the wavelength is selected by the filter 309, and the light inside the nucleic acid recovery chip 100 Used as excitation light for fluorescence observation.
  • the fluorescence emitted from the nucleic acid recovery chip 100 is collected again by the objective lens 105, and only the fluorescence and transmitted light after cutting the excitation light by the filter 131 must be observed with the camera 310. Can be.
  • the combination of the filters 302, 309, and 321 only the transmitted light can be observed with the camera 313, or only the fluorescent light can be observed, and the transmitted light image and fluorescent light can be observed. Images can be observed simultaneously.
  • a laser beam generated by a laser source 307 is moved by a movable dichroic mirror
  • a mechanism for introducing the objective lens into the objective lens is also provided.
  • This laser is focused by the objective lens 305 and can locally heat the nucleic acid recovery chip 100.
  • the focal point is moved, it is possible to move the focusing position of the laser within the nucleic acid recovery chip 100 by moving the movable dichroic mirror.
  • the wavelength of this laser a wavelength that does not absorb water and has no photochemical action is desirable.
  • the image data obtained by the camera is analyzed by the image processing and analysis device 314, and based on various analysis results, the temperature control on which the movable dichroic and mirror 306 and the nucleic acid recovery chip 100 are mounted
  • a stage movement motor 315 that can be freely moved in the XY direction can be driven.
  • a movable dichroic mirror 300 or a stage 304 with a temperature control function on which a cultured mygrochamper 100 is mounted can be controlled at regular intervals, or the stage can be controlled at regular intervals.
  • the movement motor 3 15 can be driven.
  • the nucleic acid recovery chip 100 can be used to supply multiple types of culture solutions with different concentrations or reagents for cell disruption from the solution tank 3 16 according to the state of the cells.
  • the temperature of the culture solution supplied by the supply device 3 17 is adjusted by the temperature control mechanism in the supply device, and the dissolved gas component is adjusted by the dissolved air exchange mechanism.
  • the structure is such that a reagent such as a culture solution is supplied to the recovery chip 100.
  • the culture in container 100 is also used for dispenser with PCR function.
  • the nucleic acid can be introduced into the capillary electrophoresis apparatus 319 to examine the sequence of the sample nucleic acid supplied from the nucleic acid recovery chip 100, or the waste liquid can be sent to the waste liquid reservoir 320.

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Abstract

特定の波長に対して透明なガラス基板上に、積層した前記特定の波長に対して吸収を持つ領域と、前記領域が電気伝導性を持ち、前記領域に電位を印加する手段と、前記領域の上に核酸を結合させる手段と、前記領域の上に細胞を収容する容器と、その容器で細胞を培養する手段と、前記細胞を観察する手段と、前記領域に前記特定の波長の集束光が照射されることで集束光近傍のみで局所的に発熱し、その熱によって前記領域上に結合した核酸成分を局所的に解離・回収する手段とし、特定の状態にある細胞内の核酸成分の分布あるいは組織細胞集団中の各細胞内の核酸成分の分布を明らかにするために、特定の細胞状態の各細胞の特定領域の核酸成分を選択的に分離し、回収する手段とする。

Description

明 細 書 核酸回収チップと核酸回収装置 技術分野
この出願の発明は、 細胞を培養しながら観察し、 細胞が特定の状態に なったところで細胞中の特定領域の核酸成分を選択的に分離し、 回収す る核酸回収チップと核酸回収装置に関するものである。 背景技術
近年、 生体関連試料としての DNA や核酸、 さらにはタンパク質につい ての効率的で、 しかも高精度な分離、 分析のための手法、 手段の開発が 急速に進展している。
たとえば周知の DNA チップはマイクロパターニングの技術と MA の 相補性とを利用し、特定の塩基配列を検出する手法である。 このものは、 基板上に様々な配列を持つオリゴヌクレオチドをアレー上にパ夕一二 ングしておき、 DNA 試料が基板上の結合位置を検出し、試料中の DNA の 持つ配列を解析するものである。 また、 P C R反応は DNA 二本鎖の解離 ( 9 5で、 3 0秒間）、 オリゴヌクレオチドとのァニ一リング（3 7 、 2 0秒間）、 DNA ポリメラーゼによる相補鎖合成 （7 2で、 2分間） の 三反応の繰り返しからなり、微量な DNA 断片を数十万倍に増幅させる技 術であることがよく知られている。 一方、 流体中の局所領域において温 度上昇を発生させる技術として光を用いる方法がある。 光吸収を持つ微 粒子をレーザートラップすることにより微粒子周辺の mオーダ一の 微小領域に局所的温度上昇を発生させ、 タンパクサブュニット会合体を 切断する技術について、 鷲律らが静電気学会講演論文集 （ 1 9 9 4年） 1 1 1頁から 1 1 4頁に報告している。 またこの出願の発明者らは、 先 に特願平 1 0— 1 6 3 2 1 4として、 基板上の複数の領域に、 各々異な つた核酸プローブを固定し、 これに試料 DNA中の相補鎖 DNAを結合させ た後、 集束光の熱によって局所的に相補鎖 DNAを解離させ回収する 装置と方法を提案している。
他方、 培養細胞の溶液環境と、 細胞間の物理的接触を制御しながら培 養する公知例は無い。 そこで発明者らは、 これらの問題点を解決し、 新 たに特定の一細胞のみを選択し、 その一細胞を細胞株として培養する技 術、および細胞を観察する場合に、細胞の溶液環境条件を制御し、かつ、 容器中での細胞濃度を一定に制御する技術、 あるいは相互作用する細胞 を特定しながら培養観察する技術を発明し特願 2 0 0 0 - 3 5 6 8 2 7として出願している。
しかしながら、従来の DNA チップによる遺伝子解析技術では、 基板上 に形成された 2 0塩基ほどのプライマーと試料中の DNA / RNA の一本鎖 を相補的に結合させることにより捕獲し、 観察することに重点が置かれ てきており、 特定の細胞状態 （細胞周期内の特定の時期） における mRNA の細胞内分布や組織中の各細胞単位での細胞内の核酸成分の分析技術 については考慮されていないのが実情である。 そして、 このことは、 従 来の各種の生体関連試料の分離、 分析方法 （装置） について同様であつ た。
生命体の構成やその活動等について解析するためには、 前記のとおり の、 特定の細胞状態での特定領域の核酸成分の分離、 分析が欠かせない のであるが、 このための手段についての検討はほとんど進んでいない。 そこで、 この出願の発明は、 特定の状態にある細胞内の核酸成分の分 布あるいは組織細胞集団中の各細胞内の核酸成分の分布を明らかにす るために、 特定の細胞状態の各細胞の特定領域の核酸成分を選択的に分 離し、 回収することのできる新しい技術手段を提供することを課題とし ている。 発明の開示
この出願の発明は、 上記の課題を解決するものとして、 第 1には、 透 明基板上に電気伝導性領域が配置され、 この領域の上に核酸結合部と細 胞収容容器部が配設された細胞中の核酸回収チップであって前記の電 気伝導性領域に電位を印加する手段と、 細胞収容容器部中で細胞が培養 される手段とが具備されているとともに、 前記の電気伝導性領域は、 特 定の波長の光に対して吸収を有し、 この特定波長の光が照射されること で局所的に発熱し、 電気伝導性領域上に結合した核酸成分が局所的に解 離 ·回収されるようにしたことを特徴とする核酸回収チップを提供する c また、 この出願の発明は、 第 2には、 電気伝導性領域に電位を印加す る手段として、 電気伝導性領域とこれに対向配置された上部電気伝導性 部とを有していることを特徴とする核酸回収チップを提供し、 第 3には、 細胞収容容器部中で細胞が培養される手段として、 細胞収容容器部を内 包して、 細胞培養液の流通を可能とした箱体容器部が具備されているこ とを特徴とする核酸回収チップを、 第 4には、 一細胞を収容する細胞収 容容器部が 1以上配設されているごと特徴とする請求項 1ないし 3の いずれかの核酸回収チップを提供する。
そして、 この出願の発明は、 第 5には、 前記にいずれかの核酸回収チ ップを備えた核酸回収装置であって、 核酸回収チップの電気伝導性領域 に特定波長の光を照射して局所的に加熱させる光学系とともに、 この領 域に電位を印加する電源系を有していることを特徴とする核酸回収装 置を提供し、 第 6には、 細胞の状態を観察する観察系を有していること を特徴とする核酸回収装置を、 第 7には、 細胞の培養液の流通系を有し ていることを特徴 _とする核酸回収装置を提供する。 図面の簡単な説明 .
図 1は、 この出願の発明の核酸回収チップの基本構成の一例を示す実 施例の模式図である。 図 2は、 この出願の発明の核酸回収チップを用いた細胞中の核酸回収 手順を例示した模式図である。
図 3は、 この出願の発明の核酸回収チップを用いる光学系および溶液 送液系の 1実施例を例示したの模式図である。
なお、 図中の符号は次のものを示す。
1 0 0 核酸回収チップ
1 0 1 光学的に透明な基板
1 0 2 光学吸収を持つ薄膜層
1 0 3 光学的に透明で、 細胞等に対して毒性を持たない物質の壁
1 04 細胞等の試料
1 0 5 細胞容器
1 0 6 光学的に透明な容器
1 0 7 , 1 0 8 管
1 0 9 導電性を持った層
1 1 0 トンネル
1 1 1 電源モジュール
1 1 2、 2 0 7, 3 0 5 対物レンズ
1 1 3 核酸プローブ
20 1 基板表面
2 Ό 2 核酸プローブ
20 3 細胞
204 夕ンパク質
20 5 核酸プローブ
2 0 6 2 0 9 核酸
2 0 8 局所加熱領域
3 0 1 光源
30 2、 3 0 9、 3 1 2 フィルター
30 3 3 3 0 4 温調機能付ステージ
3 0 6 可動ダイクロイツク · ミラ
3 0 8 光源
3 1 0 ダイクロイツク · ミラー
3 1 ミラー
3 1 3 カメラ
3 1 5 ステージ移動用モータ一
3 1 6 溶液槽
3 1 7
3 1 8 P C R反応機能つき分配器
3 1 9 キヤピラリー電気泳動装置
3 2 0 廃液溜 発明を実施するための最良の形態
この出願は上記のとおりの特徴をもつものであるが、 以下にその実施 の形態について説明する。
まず、この出願の発明の核酸回収チップの基本構成の一例を図 1 の実 施例を用いて説明する。 核酸回収チップ 1 0 0で、 スライドガラス等の 光学的に透明な基板 1 0 1上に、 クロムの蒸着層などの光学吸収を持つ 薄膜層 1 0 2が配置されている。 透過光で観察をする場合には、 薄膜層 1 0 2の膜厚は、 光を完全に吸収しない程度でかつむらの無い程度の薄 いものであることが望ましい。 例えば、 クロムの場合には、 膜厚 5 O A で蒸着すれば可視領域の透過光 7 0 %程度であり、 この発明の用途に用 いるのに支障ない。 その他、 T i , V , Fe, Co, Ni , Mo ， W のいずれか の金属を用いてもよい。 これらの金属は、 金属層の表面にできた酸化物 層がシラノール基と共有結合することで、 基板表面に核酸プロ一ブ層 1 1 3を固定することができる。 吸光薄膜層 1 0 2の上には、 細胞 1 0 4 を培養するための容器の壁 1 0 3が積層されている。 容器の大きさや配 置は、細胞の種類に応じて適宜選択するが、たとえば、神経細胞の場合、 幅 5 0 程度以上であることが望ましい。 また、 各容器の間に細胞は 移動できないが、 軸索等が他の細胞に接合できるように経路 1 1 0を空 けておいてもよい。 また、 容器の壁 1 0 3の高さは細胞が乗り越えない 程度の高さを持つ必要がある。 たとえば神経細胞の場合には、 高さ 2 0 m以上あればよい。 特に容器の壁 1 0 3の素材がァガロースを用いた 場合には、 細胞との接着性も無く、 また、 細胞に対してのシグナル物質 でもないことから細胞にとっては無害なだけでなく、 培養実験データへ の影響が小さく最適である。 細胞 1 0 4を培養するとき、 培養液の循環 が必要な場合には、 容器の壁 1 0 3を含む細胞培養領域をすベて覆う構 造の光学的に透明な容器 1 0 6を被せて、 管 1 0 7から溶液を導入し、 管 1 0 8から廃液を回収すればよい。 このとき、 電極となる領域 1 0 2 と対になるように、 導電性を持つ領域 1 0 9を容器 1 0 6内上面に付加 する。 この領域 1 0 9の厚さは、 領域 1 0 2と同様に光透過性を有する 程度に薄く蒸着する。 ここで容器 1 0 5内の細胞の様子は対物レンズ 1 1 2を用いて連続観察することができる。 また、 対物レンズを通じて近 赤外光の集束光を基板表面に照射することで、 局所的に加熱して、 前記 核酸プローブ層 1 1 3と結合した核酸成分を選択的に熱変性させて回 収することができる。 電源モジュール 1 1 1を用いて領域 1 0 2と領域 1 0 9の間に電界を印加することができる。 ま'たこの実施例では、 領域 1 0 2が 1枚の電極として構成されているが、 各細胞容器ごとに独立し て動作する複数の電極アレイを用いてもよい。
図 2は、 この出願の発明の核酸回収チップを用いた細胞中の核酸回収 手順を例示した模式図である。 図 2 ( 1 ) は、 細胞を導入する前の基板 表面の状態を示した模式図である。 基板表面 2 0 1には核酸成分を捕獲 するために核酸プローブ 2 0 2が固定されている。 ここで、 核酸プロ一 ブ 2 0 2としては、 m R N Aを選択的に回収するために p o 1 y— Tを 中心とした配列で構成してもよいし、 特定の核酸成分を回収したい場合 は、 特定の核酸成分に相補的な配列で構成してもよいし、 あるいは、 複 数の異なる配列の核酸プローブを混合して配列させてもよい。図 2 ( 2 ) は、 前記基板表面 2 0 1上に細胞 2 0 3が配置されている様子を示した 模式図である。 細胞 2 0 3の状態を顕微鏡観察しながら特定の細胞状態 となったときに、 顕微鏡対物レンズを通じて照射した赤外線集束光によ つて細胞を破砕してもよいし、 各細胞培養容器の電極が独立している場 合は、 電極に直流あるいは交流の電場を印加して細胞を破砕してもよレ 。 あるいは一斉にすベての容器の細胞を破碎する場合は、 界面活性剤等の 薬剤を導入することで細胞を破砕してもよい。 図 2 ( 3 ) は、 細胞破砕 後の細胞内タンパク質と核酸成分との分離手順を示した模式図である。 基板表面 2 0 1と対極との間に直流電界を印加することで、 タンパク質 成分と核酸成分とを分離する。 タンパク質と核酸成分とで等電点が大き く異なっているため、 核酸成分のみを基板表面 2 0 1に引き寄せ、 基板 表面からタンパク質成分 2 0 4を遊離させて溶液を流して排除するこ とができる。 また、 細胞中の核酸成分を、 基板表面 2 0 1上に 2次元に 射影したかたちで固定することができる。 図 2 ( 4 ) は、 その後、 先ほ どとは反対の直流電界を印加して、 基板表面の核酸プローブ 2 0 5と結 合しなかった核酸成分 2 0 6を除去することができることを示してい る。 図 2 ( 5 ) は、 次に集束光加熱によって核酸プローブと結合した細 胞内核酸成分を局所的に解離させ回収する手順を示した模式図である。 対物レンズ 2 0 7によって照射した集束光によって加熱した領域 2 0 8の核酸プローブに結合した核酸試料 2 0 9のみが選択的に溶液中に 解離することから、 この領域の解離した核酸成分を含む溶液を回収する ことで細胞内の特定領域の核酸成分の選択回収が可能となる。
図 3は、 この出願の発明の核酸回収チップを用いる光学系および溶液 送液系の 1実施例としての装置構成を模式的に例示したものである。 こ の装置では細胞等の試料を核酸回収チップ 1 0 0で培養しながらその 状態変化を観察するために、 顕微鏡観察系、 培養液循環系を、 同時に核 酸回収チップ 1 0 0上の核酸を選択回収させるために集束光照射系を 持っている。 図 3からもわかるように顕微観察光学系の光路上に核酸回 収チップ 1 0 0を配置しており、 この核酸回収チップ 1 0 0に溶液を供 給する培養液供給'廃棄部が連結されている。まず、顕微観察光学系は、 以下のような構成になっている。 光源 3 0 1から照射された光は、 フィ ルタ一 3 0 2で特定の波長に調整され、 コンデンサレンズ 3 0 3によつ て集光されて、 核酸回収チップ 1 0 0に照射される。 照射された光は、 透過光として対物レンズ 3 0 5での観察に用いられる。 核酸回収チップ 1 0 0内部の透過光像は、 ミラ一 3 1 1によってフィルタ 3 1 2通過後、 カメラ 3 1 3に誘導され、 カメラの受光面に結像する。 従って、 核酸回 収チップ 1 0 0の素材は、 フィルタ 3 0 2で選択された波長の光に対し て、 光学的に透明な素材であることが望ましい。 具体的には、 ホウケィ 酸ガラス、 石英ガラス等のガラスや、 ポリスチレン等の樹脂やプラスチ ック、 あるいはシリコン基板等の固体基板および、 ァガロース等の高分 子を用いる。 また特にシリコン基板を用いる場合は波長 9 0 0 n m以上 の波長の光を観測に用いる。 また、 図 1 の吸光層 1 0 2のところで述べ たように、 光の吸収が前記特定の波長において 8 0 %未満となるような 膜厚あるいは吸収を持たない波長を選択的に用いることが望ましい。 また、 光源 3 0 8から照射された光も、 フィルダー 3 0 9で波長選択 された後に、 ダイクロイツク · ミラ一 3 1 0によって対物レンズ 3 0 5 に誘導され、 核酸回収チップ 1 0 0内部の蛍光観察の励起光として用い られる。 核酸回収チップ 1 0 0から発した蛍光は再度対物レンズ 3 0 5 によって集光され、 フィルタ一 3 1 2によって励起光をカツ トした後の 蛍光と透過光のみをカメラ 3 1 3で観察することができる。 このとき、 フィルター 3 0 2、 3 0 9、 3 1 2の組み合わせを調整することで、 透 過光のみをカメラ 3 1 3で観察したり、 あるいは蛍光のみを観察したり, 透過光像と蛍光像を同時に観察することも出来る。 光路内には、 レーザ 一光源 3 0 7で発生させたレーザー光を可動ダイクロイツク ·ミラー 3 0 6によって対物レンズ 3 0 5に導入する機構も備わっている。 このレ —ザ一は対物レンズ 3 0 5によって集束光となり、 核酸回収チップ 1 0 0を局所的に加熱することができる。 集光点を移動させる場合には、 可 動ダイクロイック · ミラ一を移動させることで、 核酸回収チップ 1 0 0 内でのレーザ一の集束位置を動かすことが可能である。 このレーザ一の 波長としては、 水の吸収を持たず、 光化学作用を持たない波長が望まし い。 たとえば N d ： Y A Gレーザ一の 1 0 6 4 n mなどでは、 水、 ガラ ス、 ァガロース等に対して顕著な吸収はなく、 選択的にクロム薄膜層の みでレーザ一光吸収が起こり、 光が吸収されたクロム薄膜層の光集束点 近傍のみで局所的に発熱する。
カメラで得られた画像データは画像処理解析装置 3 1 4によって解 析され、 さまざまな解析結果を基に可動ダイクロイツク，ミラ一 3 0 6 や、 核酸回収チップ 1 0 0が載っている温調機能付可動 X Yステージ 3 0 4の位置を制御するために X-Y 方向に自在に移動させるステージ移 動用モータ一 3 1 5を駆動することができる。 これによつて細胞の形状 を認識したり、 認識後にその細胞を追跡し、 つねに画像の中心に位置さ せたり、 対物レンズとの距離を調節することで画像のピントを特定の細 胞に合わせたりすることが可能となる。 あるいは、 一定時間の周期で可 動ダイクロイツク · ミラ一 3 0 6や、 培養マイグロチャンパ 1 0 0が載 つている温調機能付ステ一—ジ 3 0 4を制御したり、 一定間隔でステージ 移動用モータ一 3 1 5を駆動することができる。
培養液供給，廃棄部について説明すると、 核酸回収チップ 1 0 0に複 数の種類の種類、 濃度の異なる培養液あるいは細胞破碎用の試薬等を細 胞の状態に応じて溶液槽 3 1 6から供給装置 3 1 7によって供給され た培養液は、 供給装置内の温度調節機構によって液温を調節され、 さら に溶存空気交換機構.によって溶存気体の成分が調整され、 流速を調節さ れながら核酸回収チップ 1 0 0に培養液等の試薬を供給する構造にな つている。 容器 1 0 0の培養液はまた P C R反応機能つき分配器 3 1 8 によって P C R反応増幅した後にキヤビラリ一電気泳動装置 3 1 9に 導入して核酸回収チップ 1 0 0から供給された試料核酸の配列を調べ たり、 あるいは廃液を廃液溜 3 2 0におくることができる。
もちろん、 この出願の発明は以上の例に限定されることなしに、 その 細部について様々な形態が可能であることは言うまでもない。 産業上の利用可能性
以上詳しく説明したとおり、 この出願の発明によって、 培養している 細胞の特定の状態での核酸成分の空間分布を解析することが可能とな る。

Claims

請求の範囲
1 . 透明基板上に電気伝導性領域が配置され、 この領域の上に核酸結 合部と細胞収容容器部が配設された細胞中の核酸回収チップであって 前記の電気伝導性領域に電位を印加する手段と、 細胞収容容器部中で細 胞が培養される手段とが具備されているとともに、 前記の電気伝導性領 域は、 特定の波長の光に対して吸収を有し、 この特定波長の光が照射さ れることで局所的に発熱し、 電気伝導性領域上に結合した核酸成分が局 所的に解離 · 回収されるようにしたことを特徴とする核酸回収チップ。
2 . 電気伝導性領域に電位を印加する手段として、 電気伝導性領域と これに対向配置された上部電気伝導性部とを有していることを特徴と する請求項 1の核酸回収チップ。
3 . 細胞収容容器部中で細胞が培養される手段として、 細胞収容容器 部を内包して、 細胞培養液の流通を可能とした箱体容器部が具備されて いることを特徴とする請求項 1または 2の核酸回収チップ。
4 . 一細胞を収容する細胞収容容器部が 1以上配設されていることを 特徴とする請求項 1ないし 3のいずれかの核酸回収チップ。
5 . 請求項 1ないし 4のいずれかの核酸回収チップを備えた核酸回収 装置であって、 核酸回収チップの電気伝導性領域に特定波長の光を照射 して局所的に加熱させる光学系とともに、 この領域に電位を印加する電 源系を有していることを特徴とする核酸回収装置。
6 . 細胞の状態を観察する観察系を有していることを特徴とする請求 項 5の核酸回収装置。
7 . 細胞の培養液の流通系を有していることを特徴とする請求項 5ま たは 6の核酸回収装置。
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