WO2004100988A1

WO2004100988A1 - 心保護剤

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Publication number: WO2004100988A1
Application number: PCT/JP2004/006384
Authority: WO
Inventors: Mizuo Miyazaki; Shinji Takai
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Filing date: 2004-05-12
Publication date: 2004-11-25
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Also published as: EP1640020A1; JPWO2004100988A1; US20060234916A1

Abstract

　本発明の課題は、高血圧、心肥大、心筋梗塞、動脈硬化、糖尿病性及び非糖尿病性腎疾患、PTCA施行後の再狭窄等に伴う不整脈、心臓繊維化、心不全の諸症状が危惧される場合に、効果的に心保護を可能とする薬剤を提供することである。　静脈内投与又は経口投与することによる少なくとも１の効果的な量のプロテアーゼ阻害剤を含む薬剤による。該プロテアーゼ阻害剤は、好ましくはセリンプロテアーゼ阻害剤であり、該セリンプロテアーゼ阻害剤はキモトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤である。具体的には、キマーゼ阻害剤であり、Suc-Val-Pro-PheP(OPh)2であるα-アミノアルキルホスホン酸のアリールジエステルのペプチド誘導体であり、好ましくは鏡像異性体Suc-Val-Pro-L-PheP(OPh)2である。

Description

明細書

心保護剤

技術分野

[0001] 本出願は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号特願

2003-134487からの優先権を請求する。

本発明は、心保護作用を有するプロテアーゼ阻害剤に関する。さらに詳しくは心筋梗塞又は狭心症治療後の心保護作用を有する本発明はセリンプロテアーゼ阻害剤、特にキマーゼ阻害剤に関する。

^景技術

[0002] 従来より、心筋梗塞又は狭心症の治療方法は、内科的又は外科的治療方法に大別され、幾つかの治療法が実施されてきた。現在、臨床の場で用いられている内科的療法は、主に血栓溶解療法であり、心筋梗塞等の原因となる血栓を除去するために組織プラスミノーゲン活性化因子 (t-PA)、ゥロキナーゼ (UK)等の線溶系薬剤が使用される。し力しながら、これら線溶系薬剤の大量投与により、患部以外の場所の生体にとって必要とされる血栓まで溶解されることになり、脳内出血等の重篤な副作用を併発することが問題である。また、これら線溶系薬剤はフイブリンを分解して血栓を溶解するものであるため、血栓の内容がフイブリンに由来するものでなければ、状況によっては十分な効果をあげられない場合がある。

[0003] 従って、現在では、このような内科的療法よりも、次の外科的療法がよく行われる状況にある。心筋梗塞や狭心症の原因となる血管の閉塞や狭窄を解消するための外科的療法として、今日では経皮的血管形成術 (PCTA)、冠動脈バイパス手術 (CAGB )等が行われている。しかし、これらはいずれも閉塞血管もしくは血管の狭窄部分を拡張もしくは迂回する方法であり、治療の実態から言えば、主要な冠動脈に対する療法であった。したがって、これらの治療方法が成功したとしても、心筋の虚血が全て消失するものではなく心筋の局所部位における虚血が依然として残り、心機能が十二分に回復しなレ、場合があった。

[0004] 一方、血管新生作用を有する各種の因子を用いることにより、上記目的、即ち、心筋の虚血部位に血管新生をもたらし、側副血行路の発達を促進することにより、虚血心筋へ新たな血液を供給することが試みられている。また、その他の外科的治療方法においても、新たな試みが行われ始めた。即ち、レーザーを用いた心筋内血管新生術 (TMLR又は TMR : transmyocardinal laser revascularization)による治療である (循環器 Today, l， p.939-946, 1997)。この TMLR法は、レーザーにより心筋にチャネルを開けて心室腔内より直接に心筋を灌流することによる治療方法である。本法に関する結果として、冠動脈狭窄症に有効であつたとの報告がなされている (Horvath KA et al, J. Thoracic andし ardiovasc Surg. ,丄丄 1, ρ.1041_10ευ， 1996、し ooley D A et al, J. Thoracic and Cardiovasc Surg., I l l, p.791-799, 1996)。しかしながら、この方法には、開けたチャネルが詰まってしまう等の問題点があり、追試によるとあまり有効とは言えない結果も得られている (Burkhoff D,Ann Thrac Surg.，61， p.1532- 1535, 1996)。

[0005] そこで、最近では、改良 TMLR法 (冠動脈周辺にレーザーで穴を開けて、血管新生を促進する方法）が開発されている。さらに、レーザーで開けたチャネルが詰まることを避けるために血管新生因子である VEGFを用いて、この方法を改善することが試みられた。しかし、 VEGFを用いて改良 TMLR法との併用療法が行われた力併用による効果は認められなかった (Annals of Thoracic Surgery,62, p.1051-1058， 1996)。以上のように近年では、心筋梗塞又は狭心症に対する内科的療法あるいは外科的療法が知られてはいるものの、いずれもこれらの方法の具体的な有効性は未だ明らかにされたものではなかった。

[0006] アンギオテンシン II(Angll)は、血圧上昇作用の他、細胞増殖促進作用を有することから、高血圧、心肥大、心筋梗塞、動脈硬化、糖尿病性及び非糖尿病性腎疾患、 PTCA施行後の再狭窄等の疾患の原因物質又は危険因子と考えられてレ、る。また、 Angllはアンギオテンシン変換酵素 (ACE)によりアンギオテンシン I(Angl)から生成されることが知られており、 ACE阻害剤は上記疾病の予防 ·治療剤として多数開発されている。し力、しながら、 ACE阻害剤の PTCA後の再狭窄に対する予防効果を期待して施行された MERCAPTOR試験 (Circulation, 86 , 1, plOO, 1992)及び MARCAPTOR試験 (J.Am.Coll.Cardiol., 27，l,p. l， 1996)の結果からは有効性は確認できなかった。上記臨床試験の成績は、ヒトには ACEの関与しない Angll産生経路が存在することを示唆するものであった。一方、奥西らはセリンプロテアーゼの一種であるキマーゼと呼ばれる酵素力ACEよりも高選択的に Anglを Angllに変換することを明らかにした

(Biochem.Biophys.Res.Commun., 149, pl l86, 1987)。そこで、 Angll産生の異常亢進に起因する心臓 ·循環器系疾患の予防 ·治療に結びつく臨床応用可能なキマーゼ阻害剤の開発が望まれている。上記課題を解決するために、キマーゼ阻害剤を心臓- 循環器系疾患の予防治療剤として使用する発明も開示されている (特許文献 1、 2)。

[0007] しかしながら、上記キマーゼ阻害剤に関しては、投与方法、投与量等が明らかにされておらず、十分に効果を発揮しうるか否かは不明であった。

特許文献 1：特開 2000-95770号公開公報

特許文献 2：特開平 10-53579号公開公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0008] 本発明は、例えば高血圧、心肥大、心筋梗塞、動脈硬化、糖尿病性及び非糖尿病性腎疾患、 PTCA施行後の再狭窄等に伴う不整脈、心臓繊維化、心不全の諸症状が危惧される場合に、各症状を軽減化し、効果的に心保護を可能とする薬剤を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0009] 本発明者らは、少なくとも 1の効果的な量のプロテアーゼ阻害剤を、心不全の諸症状が危惧される場合の心保護に十分量一定期間投与することで、上記に伴うの諸症状が改善しうることに着目し、鋭意研究を重ねた結果、該プロテアーゼ阻害剤を含む薬剤を静脈内投与又は経口投与することで上記目的を解決しうることを見出し、本発明を完成した。

[0010] すなわち本発明は、以下よりなる。

1.少なくとも 1のプロテアーゼ阻害剤を有効量含む薬剤であって、静脈内投与又は経口投与されることを特徴とする心保護剤。

2.該プロテアーゼ阻害剤が、セリンプロテアーゼの阻害剤である、前項 1に記載の心保護剤。

3.該セリンプロテアーゼの阻害剤が、キモトリブシン様セリンプロテアーゼの阻害剤である前項 2に記載の心保護剤。

4.該キモトリプシン様セリンプロテアーゼの阻害剤力キマーゼの阻害剤である前項 3に記載の心保護剤。

5.該キマーゼの阻害剤が、ひ-アミノアルキルホスホン酸のァリールジエステルのぺプチド誘導体である前項 4に記載の心保護剤。

6.該キマーゼの阻害剤が、 Suc-Val-Pro-Phe^P(OPh)である前項 4の心保護剤。

2

7.該キマーゼ阻害剤が、 Suc_Vaト Pro_Phe^P(OPh)の鏡像異性体

2

Suc-Val-Pro-L-Phe^P(OPh)の濃縮製剤である前項 4に記載の心保護剤。

2

8.該鏡像異性体濃縮製剤において、 Suc-Val-Pro-L-Phe^P(OPh)が

2

Suc-Val-Pro-Phe^P(OPh)の総重量の 95%以上を含有する前項 7に記載の心保護剤

2

9.該プロテアーゼ阻害剤が、当該部位において当該プロテアーゼ阻害剤の効果的な局所濃度を維持する伝達体と結合して投与され、そして、当該伝達体は、ヒアルロン酸、ヒドロゲル、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、シクロデキストラン、そしてその化合物からなる集合体より選択された高分子量担体をなす、前項 1一 8のいずれか 1に記載の心保護剤。

10.前項 1一 9のいずれか 1に記載のプロテアーゼ阻害剤と、薬学的に許容できる希釈液又は賦形剤からなる心保護剤混合物。

11.脊椎動物被検体に対し、高血圧、心肥大、心筋梗塞、動脈硬化、糖尿病性及び非糖尿病性腎疾患、 PTCA施行後の再狭窄等に伴う不整脈、心臓繊維化、心不全が危惧される場合における前項 10に記載の心保護剤混合物を投与する不整脈、心臓繊維化及び/又は心不全の改善方法。

12.前項 10に記載の心保護剤混合物の使用に関し、高血圧、心肥大、心筋梗塞、動脈硬化、糖尿病性及び非糖尿病性腎疾患、 PTCA施行後の再狭窄等に伴う不整脈、心臓繊維化、心不全が危惧される場合の不整脈、心臓繊維化及び/又は心不全に応用するための薬品を作るための使用。

13.高血圧、心肥大、心筋梗塞、動脈硬化、糖尿病性及び非糖尿病性腎疾患、 PTCA施行後の再狭窄等に伴う不整脈、心臓繊維化、心不全が危惧される場合の前項 10に記載の心保護剤混合物の不整脈、心臓繊維化及び/又は心不全改善剤としての使用。

発明の効果

[0011] 本発明は、プロテアーゼ阻害剤を有効量含む薬剤を、静脈内投与又は経口投与することを特徴とする脊椎動物披検体の高血圧、心肥大、心筋梗塞、動脈硬化、糖尿病性及び非糖尿病性腎疾患、 PTCA施行後の再狭窄等に伴う不整脈、心臓繊維ィ匕、心不全による諸症状の改善に関するものである。当該プロテアーゼ阻害剤は、例えばこれらの疾患の治療中又は後に投与することができる。

発明を実施するための最良の形態

[0012] 本発明の薬剤は、温血の哺乳類の高血圧、心肥大、心筋梗塞、動脈硬化、糖尿病性及び非糖尿病性腎疾患、 PTCA施行後の再狭窄等に伴う不整脈、心臓繊維化、心不全による諸症状を改善する為の薬剤であり、当該哺乳類に少なくとも 1の効果的な量のセリンプロテアーゼ阻害剤を、静脈内投与又は経口投与により心保護作用に十分量一定期間投与することからなる。好ましい実施例は、少なくとも 1のキモトリプシン様セリンプロテアーゼであるセリンプロテアーゼ阻害剤を使用する、心保護方法に関する。本発明の薬剤は当該温血哺乳類としてヒトに適用することができる。

本発明において、高血圧、心肥大、心筋梗塞、動脈硬化、糖尿病性及び非糖尿病性腎疾患、 PTCA施行後の再狭窄等に伴う、不整脈、心臓繊維化、心不全に対する心保護作用が期待できる。

[0013] (プロテアーゼ阻害剤）

本発明の薬剤に含有されるプロテアーゼ阻害剤は公知物質であり、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを使用することができる。

[0014] 本発明の心保護剤の対象となるプロテアーゼ群は、好ましくはセリンプロテアーゼである。該セリンプロテアーゼは、ペプチド中のセリンを開裂結合させるエンドべプチダーゼのサブクラスである (Barrett, A.J.,In: Protease Inhibitors, Ed. Barrett, A. J. et.al, Elsevir, Amsterdam, p.3-22, 1986)。セリンプロテアーゼ自体は公知である。例えばキモトリブシン'スーパーファミリー及び放線菌属 (Streptomyces)ズブチリシン 'ス一パーファミリ一等の 2種のセリンプロテアーゼのスーパーファミリーが報告されている。

[0015] セリンプロテアーゼ阻害剤は公知であり、以下の系統群に分類することができる。 (

1)ゥシのすい臓来トリプシン阻害剤（クニッッ）ファミリーであり、塩基性プロテアーゼ阻普; ifl Ketcham, L.K. et al, In:Atlas of Protein sequence and Structure, Ed.

Dayhoif, M.〇·， p.131-143, 1978) (以下「BPTI」という）としても知られている、 (2)

Kazal群、（3)法線菌属 (Streptomyces)ズブリシン阻害剤群（以下「SSI」とレ、う）、 (4)大豆トリプシン阻害剤（クニッッ）ファミリー、（6)ポテト阻害剤ファミリー、（7)ボウマンバークファミリー (Laskowski,M. et al. Ann. Rev. Biochem. , 49:p.593-626, 1980)を含む

。 BPTI群、 Kazal群、 SSI群、大豆トリプシン群、ポテトトリプシン群のメンバを含む多くの完全な阻害剤と、 S印 rin-ひ- 1-抗トリプシンの開裂型のための結晶学的データが禾 IJ用できる (Read, R.J. et al,In:Protease Inhibitors, Ed. Barret. A.J. et al, Elsevier,

Amsterdam, p.301-336, 1986)などがあげられる。多くのセリンプロテアーゼ阻害剤は広い特異性をもち、血液凝固セリンプロテアーゼを含むプロテア一ゼのキモトリプシン.スーパーファミリーとセリンプロテア一ゼの放線菌属スーパーファミリー両者を抑制することができる (Laskowski et al, Ann. Rev. Biochem., 49:p.593- 626， 1980)。各阻害剤の特異性は、セリンプロテアーゼの直接の開裂部位に対するァミノ末端のァミノ酸の同一性によって決定すると考えられている。 P部位残基として知られるこのアミノ酸は、セリンプロテアーゼの活性部位において、セリンとァシル結合を形成すると考えられている (LaskowskiLaskowski et al, Ann. Rev. Biochem., 49:p. 593 -626, 1980)

[0016] 本発明の薬剤に含有される好ましいセリンプロテアーゼ阻害剤は、セルピン (se卬 in) ファミリーとボウマンバーク (Bowman-Birk)ファミリーに属する。セルピンファミリーに対するセリンプロテアーゼ阻害剤として、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤である PAI- 1、 PAI_2、 PAI-3があり、 C1エステラーゼ阻害剤、ひ _2 -抗プラスミン、コントラプシン (contrapsin)、ひ -1-抗トリプシン、抗トロンビン III、プロテア一ゼネクシン I、ひ- 1- 抗キモトリプシン、プロテイン C阻害剤、へパリンコフアクター II及び成長ホルモン調節タンパク質が挙げられる (Carrell et al, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 52: 527-535， 1987)。

[0017] キモトリブシン'スーパーファミリーのセリンプロテアーゼの例としては、組織型プラスミノーゲン活十生ィ匕因子 (tissue-type plasminogen activator : t_PA)、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、キモトリブシン、プラスミン、エラスターゼ、ゥロキナーゼ（又は非尿型プラスミノーゲン活性化因子 (u-PA)、ァクロシンン、活性化プロテイン C、 C1エステラーゼ、カプテシン G、キマーゼ、そしてカリクレイン、トロンビン、 Vila因子、 IXa因子、 Xa因子、 XIa因子、 Xlla因子を含む血液凝固カスケードのプロテアーゼなどが含まれる (Barrett, A.J., In: Protease inhibitors, Ed. Barrett, A. J. et.al., Elsevir,

Amsterdam, p.3-22, 1986， Strassburger, W.et.al, FEBS Lett., 157:p.219-223, 1983)

[0018] キモトリブシン'スーパーファミリーのすべてのセリンプロテアーゼの触媒ドメインは、配列相同性と構造相同性をもつ。配列相同性は、（1)特異活性部位残基、例えば、トリプシンの場合に、 195位のセリン、 57位のヒスチジン及び 102位のァスパラギン酸が共通する；（2)ォキシァニオン孔 (oxyanion hole) (例えば、トリプシンの場合に、 193位のグリシン及び 194位のァスパラギン酸）、（3)構造においてジスルフイド架橋を形成するシスティン残基、の全保存を含む (Hartley, B.S. ,Symp. So Gen. Micrbopl., 24: 152-182(1974))。

[0019] 構造相同性は（1) 2つのグリーク'キー構造からなる一般ホールド (common

fold)(Richrdoson), (2)触媒残基の一般要因、（3)分子核内での構造の精密な保存 (Stroud,R.M., Sci. AM. , 231 :24-88)を含む。

[0020] 本発明の薬剤は、 α -アミノアルキルホスホン酸のァリールジエステルのペプチド誘導体を含むことができる。ゥシトロンビン、ヒト因子 XIIa、ヒト因子 Xa、ヒト結晶カリクレイン、ゥシトリプシン、ラット皮膚トリプターゼ、ヒト白血球エラスターゼ、ブタすい臓エラスターゼ、ゥシキモトリプシン、ヒト白血球カテブシン G、ラットマスト細胞プロテアーゼ IIを含む幾多のセリンプロテアーゼの阻害剤に関し、これらひ-アミノアルキルホスホン酸塩誘導体が発見されている (米国特許 5543396， 5686419,5952307、他)。これらの誘導体は、ヒト血漿に含まれ、種々の環境下で非常に安定している。例えば、本発明の薬剤に含有される好適な阻害剤 Suc-Va卜 Pra-Ph_e ^P(〇Ph)、特に好ましくは

2 Suc-Val-Pro-L-Phe^P(OPh)は、ヒト血漿内で約 20時間の半減期をもつ。この安定性

2

は重要である。なぜなら、腹膜の浸出物は、大部分のプロテアーゼ阻害剤を中和し、活性を失わせると予測されるからである。アミノアルキルホスホン酸は α -アミノ酸に相似しており、そして、一般的に受容したアミノ酸のための上付き文字の Ρへと続く 3文字の略称が命名された。例えば、ァラニンに関するジフエニルひ _(Ν-ベンジルォキシカノレニノレァミノ (N— benzyloxycarbonylamino)ェチノレホスホネイト (ethylphosphonate) は Cbz-Ala^P(OPh) と略称される。

2

[0021] C-端末のリン酸塩残基を有するペプチド Val^P(OPh)、それはパリンの類似体である

2

力これは比較的有効で比較的特異的なエラスターゼ及びエラスターゼ様酵素に特異的な不可逆性阻害剤である。フエ二ルァラニン、他の芳香族アミノ酸又は長脂肪酸族側鎖と関連性がある C-端末リン酸塩残基は比較的有効であり、比較的特効のあるキモトリブシンとキモトリブシン様酵素の阻害剤である。オル二チン、溶解素、アルギニン又は、 α _ァミノ- α _(4-アミジノフエニル)メタンホスホン酸塩 [(4-AmPhGly)^P (OPh) ]又は α -ァミノ- α -(4-アミジノフエニルメチル)メタンホスホン酸塩 [(4_AmPhe)^P

2

(OPh) ]の c-端末ジフエ二ルエステルに関連性があるペプチドは、比較的有効で比

2

較的安定性のあるトリプシンとトリプシン様酵素の阻害剤である。

[0022] 酵素との反応に対する付加的な特異性及び/又は増加した活性は、ペプチド構造の部位におけるアミノ酸配列の変異により、阻害分子へ導くことができる。ペプチドの P-二トロアニリドといった酵素基質の配列と効果的なペプチドのリン酸塩阻害剤の配列間には一般的に一致した配列がある。比較的高活性の阻害剤は、一般的に、特定の酵素のための好都合なペプチドの P-二トロア二リド基質の配列をもつ。例えば、キモトリブシンそしてキモトリブシン様酵素に対して比較的有効な阻害剤である

Suc-Val-Pro-Phe^P(OPh)は、これらの酵素に適当な基質である

2

Suc-Va卜 Pro- Phe- NAと類似のアミノ酸配列を有する。ヒト白血球エラスターゼに比較的有効な阻害剤 [Meo-Suc- Ala- Ala- Pro_Val^P(Oph)及び Boc- Va卜 Pro_Val^P(OPh) ]

2 2 は、この酵素に対する 2つの適当な基質 MeO-Suc_Ala_Ala-Pro_Va卜 NA及び

Boc-Vaト Pro- Vaト NAと類似のアミノ酸配列をもつ。論文中に報告された、それらの同じセリンプロテアーゼのための比較的有効な可逆的 ·不可逆的な阻害剤中に発見されたペプチド配列に基づくセリンプロテアーゼのためのホスホン酸塩阻害剤の設計も可能で 3Dる (Powers and Harper, in Protease Inhibitors, Barrett and Salvesen, eds.， Elsevier, p55— 152, 1986; Trainore, D.A. , Trends in Pharm. Sci. 8:303—307, 1987)。

[0023] a -ァミノアルキルホスホン酸のジフヱニルエステルは前記方法により合成することができる (米国特許 5543396)。ひ -ァミノアルキルホスホン酸の 2(置換フエニル)エステノレは、トリフヱニル亜リン酸の代わりに 3(置換フヱニル)リン酸を使用する方法にて調製すること力 Sできる。パーフルォロアルキルジエステルは、エステル転移反応に含まれる方法によって合成することができる (Szewczyk et al. , Synthesis, p.409-414, 1982)。代わりに、前記のようにァミノアルキルホスホン酸のジエステルの合成とそれらのぺプチドは、ホスホン酸部分のエステル化により行うことができる (Bartlett et al. , Bioorg. Chem. , 14:356-377, 1986)。本発明の薬剤に含有される多くの付加的セリンプロテアーゼ阻害剤は、米国特許により開示される（米国特許 6262069， 5916888, 5900400, 5157019， 4829052, 5723316, 5807829)。

[0024] 多くの有機化合物は光学活性型が存在する。光学活性化合物を示す場合、識別コード Dそして L又は Rそして Sが、キラル中心の分子の絶対配置を示すために使用される。識別コード (+)と (-)又は dと 1は、水平偏光の回転のサインを示すため、化合物により使用される。（-)又は 1は化合物が左旋回していることを意味し、化合物識別コード (+) 又は dは化合物が右旋回していることを示す。立体異性体とよばれるこれらの化合物は、互いに鏡像であることを除けば同一である。特定の立体異性体は鏡像異性体として表すことができ、そのような異性体の混合物は鏡像異性混合物又は鏡像異性ラセミックと呼ばれることもある。本発明の薬剤の製法として、立体異性純度又は光学純度をより有効性を増加及び Z又は有害作用を減少させる手段を利用することができる。

本明細書において使用される用語「キラル」は、鏡像相手の重合不可の性質の分子をしめすものである。し力、しながら、用語「アキラル」は鏡像相手に重合可能な分子を示す。用語「立体異性体」は同一化学構造をもつ化合物を意味する。しかし、空間の原子又は群の配置に関しては相違する。特に「鏡像異性体」は、重合不可能な鏡像ともう一つの 2種の化合物の立体異性体を意味する。 [0025] 一方、「ジァステレオマ」は非対称の 2以上の中心を持つ立体異性体を示し、その分子は相互に鏡像ではない。キラル中心の命名法に関しては、用語 Sと R配置が IUPAul974(Recommendations for section E., Fundamental Stereochemistry, Pure Appl. Chem., 45:13-30， 1976)により定義される。

[0026] 本発明の薬剤に含有される化合物に関し、互換的に使われている用語「鏡像異性的に濃縮された」と「非ラセミ体」は、光学的に濃縮された構成物を示し、その構成物内では鏡像異性体のラセミ混合物と比較して、一方の鏡像異性体が濃縮されている。別に明記されていない場合は、それらは、望ましい鏡像異性体の望ましくない鏡像異性体に対する相対的な割合力 ^対 1以上である構成物を示す。例えば、鏡像異性的に濃縮された製剤は、望ましい鏡像異性体の望ましくない鏡像異性体に対する相対的な割合が、重さにして 50%以上であり、望ましくは少なくとも 75%、さらに望ましくは 80%である。もちろん濃縮物は、「十分に鏡像異性的に濃縮」された製剤、「十分に非ラセミ体の」製剤又は「十分に光学的に純粋」な製剤にすることにより 80%以上とすることが可能であり、それは少なくとも望ましい鏡像異性体が 85%以上、望ましくは 90%以上、さらに望ましくは 95%以上である薬剤を意味する。

[0027] 鏡像体の分離は、既に公知の幾つかの方法によって達成することができる。例えば、 2の鏡像異性体のラセミ混合物はクロマトグラフィーによって分離することができる ( Chirai Liquid Cnromatography , W.J. Lough, Ed. uhapman and Hall, New fork, 1989)。鏡像異性体は、伝統的な分離技術によっても分離することができる。例えば、ジァステレオマ塩の構成物と分画結晶化によって鏡像異性体を分離することができる。カルボン酸の鏡像異性体の分離については、ジァステレオマ塩が、ブルシン、キニーネ、エフヱドリン、ストリキニーネ、その他のような鏡像異性的に純粋なキラル塩基を添加することにより形成される。代わりに、ジァステレオマエステルは、遊離物質を産出するためのジァステレオマエステルの分離、加水分離に続いて、鏡像異性的に濃縮されたカルボン酸であるメントールのような鏡像異性的に純粋なキラルアルコールをカロえることにより形成される。ァミノ化合物の光学異性体の分離に関しては、キラルカルボン又はカンファースルホン酸、酒石酸、マンデル酸又は乳酸といったスルホン酸の添カ卩によりジァステレオマ塩の形成といった結果になる。上記のような分離技術のほかに、活性鏡像異性体は、既に公知の方法を使用し、望ましい光学異性体のみを産する立体特異的合成によっても合成することができる。キラル合成は高鏡像異性的純度の生成物を産出することができる。し力しながら、幾つかの事例では、生成物の鏡像異性的純度は特段高くない。熟練者たちは、キラル合成によって得られた鏡像異性的濃度をより高めるものとして、上記分離方法を高く評価している。鏡像異性体の光学的濃度は先行技術によって既知の方法によって決定される。例えば、鏡像異性体試料は、キラルクロマトグラフィーカラム上の高速液状クロマトグラフィーによつて分析すること力 Sできる。

[0028] 本発明の薬剤に含有されるセリンプロテアーゼ阻害剤としてのキマーゼ阻害剤は、温血の哺乳類の腹膜内の癒着形成を防止、抑制又は治療方法に使用され、当該哺乳類に少なくとも 1の効果的な量のキマーゼ阻害剤を組織修復に十分量一定期間存在するように、静脈内投与又は経口投与することができる。

[0029] 好適には、例えば Suc-Va卜 Pro_Phe^P(OPh)とレ、つた α -ァミノアルキルホスホン酸の

2

ァリールジエステルのペプチド誘導体であるキマーゼ阻害剤を使用することができる

。より好適には、鏡像異性的に濃縮した α _アミノアルキルホスホン酸のァリールジェステルのペプチド誘導体、例えば Suc-Va卜 Pro-L_Phe^P(Oph)の製剤を使用すること

2

ができる。この Suc-Vd-Pro-L-Phe^P(Oph)は、全 Suc-Vd-Pro_Phe^P (Oph)重量の 50

2 2

%、 80%好ましくは 95%以上に濃縮したものが好適である。当該温血哺乳類はヒトであることが望ましい。濃縮する方法は、例えばアセトン一エーテルを用いて結晶化させ、再度同様に結晶化させることにより得ることができる。

[0030] (製剤）

本発明の薬剤は、前記プロテアーゼ阻害剤を単独で、あるいは適当な製剤用添カロ物と共に製剤形態の医薬組成物として調製し、投与することができる。このような医薬組成物の投与形態としては、経口的投与に使用されるもの、又は非経口的に投与されるものであれば特に限定されなレ、が、例えば、錠剤、シロップ、注射用アンプル剤や注射用凍結乾燥粉末剤等を用いることができる。各種製剤形態への調製は、当業者が利用可能な周知の製剤添加物、例えば、希釈剤や添加剤などを用いて慣用の手法に従って行うことができる。 [0031] 例えば、注射用凍結乾燥粉末剤は、精製された前記プロテアーゼ阻害剤の有効量を注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液等の希釈液に溶解し、必要に応じてカルボキシメチルセファロース、アルギン酸ナトリウム等の賦形斉 lj、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸ナトリウム、アミノ酸、ヒト血清アルブミン等の安定化剤、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニゥム、フエノール等の保存斉 [j、ブドウ糖、ダルコン酸カルシウム、塩酸プロ力イン等の無痛化剤、塩酸、酢酸、クェン酸、水酸化ナトリウム等の pH調節剤等を加え、常法により製造することができる。また、注射用アンプル剤は、前記プロテアーゼ阻害剤の有効量を注射用蒸留水、生理食塩水、リンゲル液などの希釈剤に溶解し、必要に応じてサリチル酸ナトリウム、マ二トール等の溶解補助剤、クェン酸ナトリウム、グリセリン等の緩衝剤、ブドウ糖、添加糖等の等張化剤、前述の安定化剤、保存剤、無痛化剤、 pH調節剤等の添加剤を加えた後、通常の加熱滅菌、無菌ろ過等により無菌化して調製することができる。なお、有効成分の種類によつては加熱滅菌工程で失活する場合があるので、滅菌方法は適宜選択すべきである。

[0032] 本発明の薬剤は、医薬上許容される担体等を用いて、錠剤、顆粒、カプセル剤、散剤等の固型状、あるいは液剤、懸濁剤、シロップ、乳剤、レモナーデ剤等の液状の態様で、経口投与、非経口投与に適した剤型に製剤化し、医薬製剤として用いることもできる。必要ならば、上記製剤に補助剤、安定化剤、湿潤剤、その他の常用添加剤、例えば乳糖、クェン酸、酒石酸、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、白土、庶糖、トウモロコシ澱粉、タルク、ゼラチン、寒天、ぺクチン、落花生油、ォリーブ油、カカオ油、エチレングリコール等を配合してもよい。

(投与量）

[0033] 本発明の薬剤は、少なくとも 1種のプロテアーゼ阻害剤を有効量含み、該プロテアーゼ阻害剤が癒着形成の部位において効果的な濃度で実質的に上皮化に足る十分な時間滞留するように投与することができる。

[0034] 本発明において、投与可能なプロテアーゼ阻害剤の量と濃度は、効果を得るに十分な濃度すなわち「有効量」を最低濃度とし、「薬学的に許容できる」「薬理学的に許容できる」を最高濃度とした範囲で決定することができる。所望の癒着形成を防止、抑制又は治療したい部位 (腹部、胸部、眼、心臓、婦人科的組織等）で効果が得られるように、プロテアーゼ阻害剤混合物は適した剤型や媒体 (生理食塩水)で、静脈内投与又は経口投与することができる。

[0035] 本発明において「有効量」という用語は、上記の癒着形成の防止、抑制又は治療において、微毒又は無毒で、所望する反応を得る為の薬剤の十分な量を意味する。求められる正確な量は被検体によってまちまちであり、被検体の種、年齢、体重、一般的体調、投与の形態などによって変わってくる。適切な「有効量」は、ここに提供された事と慣例的な方法を使用した普遍的な先行技術により決定することもできる。

[0036] 「薬学的に許容できる」とは、効果と危険性の比率的と比例して、過度の毒性、炎症、アレルギー反応又はその他の問題点又は合併症を伴わなレ、、ヒト又は動物の組織との接触に適当な、信頼できる医療判断の範囲内での、物質、化合物、混合物又は投与形式を意味する。

[0037] 該プロテアーゼ阻害化合物は、一般的に作用する間隔で投与することができ、例えば手術前、手術中、手術完了後の期間にも投与することができる。術後少なくとも 1一 72時間、好ましくは 1一 48時間の間に投与を開始することができる。例えば静脈内投与の場合は、術後少なくとも 1一 24時間、好ましくは 1一 12時間の間に投与を開始すること力 Sでき、経口投与の場合は、同様に 1一 72時間、好ましくは 12— 48時間、より好ましくは 12— 24時間の間に投与を開始することができる。

[0038] 本発明の薬剤は、少なくとも 1種のプロテアーゼ阻害剤が心保護を要する部位におレ、て効果的な濃度で実質的な投与量で投与することができる。例えば、本発明の薬剤に含有されるプロテアーゼ阻害剤の具体例であるキマーゼ阻害剤

(Suc-Val-Pro-L-Phe^P(Oph) )を手術中に 10 μ M使用したとき、該生体内のキマーゼ活性は血管組織において 4週間にわたり顕著に抑制された。キマーゼ阻害剤

(Suc-Val-Pro-L-Phe^P(Oph) )の効果的な投与量は、成人体重 lkg、 1日あたり

0.0001— lOOmgの間で選択することができる。例えば静脈内投与の場合には 0.001— 100mg、好ましくは 0.01 lmgの間で、また経口投与の場合には 0.1— 100mg、好ましくは 0.1 10mgの間で投与量を選択することができる。

[0039] 他のプロテアーゼ阻害剤の効果的な量、経路は、公知の手段により決定することができる。

実施例 1

[0040] 以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

[0041] (実施例 1)アミノアルキルホスホン酸誘導体の調製

アミノアルキルホスホン酸のァリールジエステルのペプチド誘導体力、らなる薬剤は先行技術の 1つによって証明され、実行される (Biochemistry, 30, p.485-493, 1991)。

[0042] キマーゼ活性と癒着形成との関係を説明するのに、典型的なセリンプロテアーゼ阻害剤、キマーゼ阻害剤、 Suc-Val-Pro-Phe^P(Oph)の効果を調べた。この化合物は公

2

知の方法を使用し合成した (Biochemistry, 30， p.485-493, 1991)。さらに詳しくは、 Cbz-Val-OH(0.25g, 1 mmol)、 DCC(0.2g, 1 mmol)と水素和物 Cbz- Vaト Pro- Phe^P (OPh) (0.584g, 1 mmol)は、 30mlの酢酸ェチルに溶解し、オイルを加える。この溶液

2

に対し、 0.1g(l mmol)のコハク無水物と O. lgの 5%Pd/Cが加えられ、混合物は、薄層クロマトグラフィーが新しい斑点を示すまで、水素気圧下で攪拌される。触媒はろ過により取り除かれ、有機層は数回水で洗浄され、乾燥後有機溶媒は提供の為に除去させる。有機物として例えば、ハイドロスコープ固体としての 0.45g(65%)の生成物が得られた (mp.50-53°C. ; one apot on TLC, R=0.4; ¹P NMR 19.75， 19.23ppm， ratio 1 : 1,

f

Anal. Calcd. for C H O N P.2H〇： 59.56; H,6.42. Found:C, 59.59; H， 6.42)。

34 40 3 3 2

[0043] (実施例 2) Suc-Val-Pro-Phe^P(Oph)キマーゼ阻害剤の濃縮鏡像異性体の調製

2

以下に使用されているように、以下の略語が適用される。 Zはべンジルォキシカルボニル、 Bocは tert-ブチルォキシカルボニル、 WSCDはカルボジイミド、 HOBtは

Oleksyszynと Powers (Methods Enzymol, 244:423-441, 1994)及びベンジルォキシカルポニルは水素臭化物酸溶液により取り除かれた。生成物を WSCD-HOBt反応により Boc-Proとカップリングさせ、その後ラセミ混合物を得た。その後、再沈殿により分離した。まず、溶液中の非活性鏡像異性体を結晶化させて、溶液から除去した。 HC1を加えた Bocの溶液中の活性鏡像異性体からブロックを除いた後、試料を

WSCD-HOBt反応により Boc-Valとカップリングさせ、再度ブロックを除レ、て分離された。この生成物に対し、コハク無水物とトリエタノアミンを加え、 Suc-Va卜 Pro_Phe^P (OPh)を得た。そして、生成物を逆相 HPLCによって濃縮した。

[0044] (Z-DL-Phe^P(Oph) )

フエニルァセトアルデヒド (28.3mL，0.242mol)を 45mLの酢酸で溶解した。力ルバミル酸べンジルエステル (24.4g, 0.161mol)とトリフエニル亜リン酸塩 (50.0 g， 0.161 mol)をこの溶液に加え、 1.5時間 85°Cで攪拌した。有機溶剤を蒸発させた後、残りの溶液を室温まで冷まし、 400mLのメタノールをこの溶液に加え、 _20°Cで結晶化できるようにした。該生成物をろ過により集め、冷メタノールにより洗浄し、 32.9g(42%)の Z-D_Phe^P (OPh)と Z_L_Phe^P(〇Ph)の化合物を産出するため真空内で乾燥した。

[0045」 (DL-Phe (OPh) - HBr)

Z-Phe^P(〇Ph)と Z- L- Phe^P(〇Ph) (14.3g， 29.3 mmol)の混合物を 30mLの 25%水素臭化物/酢酸溶液中に溶解し、室温で 1時間攪拌した。両方を加えた後、分離された固体試料をろ過によって集めた。この試料をエーテルで洗浄し、 12g(94%)の Dと

L-Phe^P(OPh) · HBrの混合物を得る為に真空乾燥した。

[0046] (Boc-Pro-DL-Phe^P(OPh) )

Dと L— Phe^P(Oph) - HBr(11.5g, 26 mmol), Boc— Pro(5.53g， 25.7mmol)と HOBt(3.58g,

26.5mmol)の混合物を 70mLの DMFに溶解し、 WSCD(4.70mL, 26.5mmol)を点滴によりで氷で冷却しながら加えた。室温で 3.5時間攪拌した後、溶液を真空で濃縮し、ェチルアセテートをカ卩えた。結果により得られた溶液を逐次、酢酸とアルカリ性溶液で洗浄し、 MgSOで乾燥し、真空乾燥濃縮した。アセトンーェテールにより結晶化させ、同様に再結晶化させて不活性鏡像異性体 (D体)を除去し、 Boc-Pro-L-Phe^P(OPh)を得た。残存溶液を真空で濃縮し、 5.10gの鏡像異性体を産出するための溶解剤としてトルエンーェチルーアセテート (5: 1)をカ卩え、中圧シリカゲルで精製した。

[0047] (Boc-Pro- L-Phe^P(〇Ph) )

Boc-Pro-L-Phe^P(OPh) (4.98g, 9.05 mmol)を 37mLの冷 HCI/ジォキサン (4.9N)に溶解し、室温で 1時間攪拌した。概溶液は真空で蒸発、乾燥させた。残物を 40mLの DMFで溶解し、 Boc- Val(2.06g, 9.50 mmol)と HOBt(1.35g， 9.96 mmol)をこの溶液にカロえた。 WSCD(1.77mL, 9.96 mmol)を点滴又は氷で冷やしながらこの溶液に加え、室温で一晩攪拌した。酢酸ェチルをこの反応溶液に加え、引き続いて、酸性とアルカリ性の溶液で洗浄した。 MgSOで乾燥させ、ろ過した後、無色オイルとして

6.26g(94%)の生成物を産出し、真空で濃縮した。

[0048] (Sue- Pro- L- Phe^P(OPh) )

Boc-Pro-L-Phe^P(OPh) (5.86g, 8.47 mmol)を 35mLの冷 HCI/ジォキサン (4.9 に加え溶解し、室温で 1時間攪拌した。概溶液を真空で蒸発、乾燥した。残物を 35mL の DMFを加え溶解し、コハク無水物 (1.02g， 10.2mmol)を加えた。トリェチルァミン (2.36mL, 16.9mmol)を点滴によりこの溶液に加え、室温で 2時間攪拌した。氷冷しな力 ¾HC1溶液により溶液の pHが pHl.Oとなるように調整し、酢酸ェチルを加えて試料を抽出した。抽出物を飽和塩水溶液で洗浄し、 MgSOで乾燥させ、黄色オイルとして生成物を産出し、真空でろ過、濃縮した。オイルを逆相 HPLC (分離管: YMC ODS SH-363-5, 30 X 250mm,移動相： 0.1TFA,勾配 40-70% MeCN)により濃縮し、ホワイトパウダーとして、 2.30g(42 %)の生成物を産出し冷却乾燥した。

[0049] (分析結果）

試料： Suc-Va卜 Pro-L_Phe^P(OPh)

Lot. : 520217

Volume： 2.0g X I

概観：白粉

HPLCによる純度：主ピーク 98.8% カラム： YMC Pack, ODS- A 4.6mm I.D. X 150mm

移動相： 0.1%TFA,勾配 30-80% MeCN (25min)

流率 : 1.0mL/min

検出：フォトメーターにより紫外線吸光度（波長： 220nm)

アミノ酸分析：モル率回収率

Val(l) 1.00 90.5%

Pro(l) 1.03

Phe^P(〇h) 0.98

加水分解状況： 6mol HCI, phenol, 110°C， 22時間基本分析： Calcd C H N O S: C,62.86; H,6.21; N,6.47%

34 40 3 8

Calcd C H N O S - 8H O - 0.5TFA:

34 40 3 8 2

C58.30; H,5.88; N,5.83%

Hound:C, 58.34; H,5.94; N,5.51%

マススぺタトロメトリー： 650.3 (Calcd[M+H] =650.253(by

exact

ESI-MS))

[0050] (実験例） Suc-Va卜 Pro_L-Phe^P(〇Ph)の内服による心筋梗塞後の生存率

2

シリアンハムスター (SLC社)、年齢 6週間 (体重 85 90グラム)をの左冠動脈を結紮し、心筋梗塞モデルを作製した (Jpn. J. Pharmacol, 86， p.203-214, 2001, Life Sci. 71， p.437-446, 2002)。キマーゼ阻害薬である Suc-Vaト Pro- L_Phe^P(〇Ph) (10mg/kg)(9例

2

)又は偽薬 (23例)をモデル作製前 3日よりモデル作成後 14日まで 1日 1回、ゾンデで強制経口投与し、モデル作製後 14日までの癒着程度を比較検討した。尚、生存曲線よりログランプ検定を用いて有意差検定を行った。

その結果、 14日までの偽薬群の生存率は 39.1%であったのに対し、

Suc-Val-Pro-L-Phe^P(OPh) (10mg/kg)を術前より投与した群では 88.9%であり、有意

2

に Suc-Va卜 Pro-L_Phe^P(OPh)投与群で生存率が増加した（図 1)。

2

また、同様に 14日までの偽薬群の生存率は 39.1 %であったのに対し、

Suc-Val-Pro-L-Phe^P(OPh) (10mg/kg)を術後経口投与した群では 88.9%であり、有

2

意に Suc-Vaト Pro-L_Phe^P(OPh)投与群で生存率が増加した（図 2)。

2

Suc-Val-Pro-L-Phe^P(OPh)は、心筋梗塞を起こす前より投与することにより、有意

2

にその生存率を改善することができ、また心筋梗塞後に投与しても有意に改善することができた。このことより、 Suc_Va卜 Pro_L-Phe^P(〇Ph)は、心筋梗塞の予防及び梗塞

2

後の生存率を向上させるのに有用である。

産業上の利用可能性

[0051] 以上説明したように、本発明の心保護剤を内服することで、心筋梗塞の予防が可能となり、また、心筋梗塞が生じた後の生存率も改善したことから、心筋梗塞等に伴う不整脈、心臓繊維化、心不全に対する心保護剤として有用であることが示唆された。図面の簡単な説明 [図 1]心筋梗塞前より偽薬または Suc-Vaト Pro-L_Phe^P(OPh)を内服させたときの生存率を示す図である。（実験例）

[図 2]心筋梗塞後に偽薬または Suc-Va卜 Pro-L_Phe^P(OPh)を内服させたときの生存率を示す図である。（実験例）

Claims

請求の範囲

[I] 少なくとも 1のプロテアーゼ阻害剤を有効量含む薬剤であって、静脈内投与又は経口投与されることを特徴とする心保護剤。

[2] 該プロテアーゼ阻害剤が、セリンプロテアーゼの阻害剤である、請求項 1に記載の心保護剤。

[3] 該セリンプロテアーゼの阻害剤が、キモトリブシン様セリンプロテアーゼの阻害剤である請求項 2に記載の心保護剤。

[4] 該キモトリブシン様セリンプロテアーゼの阻害剤力キマーゼの阻害剤である請求項

3に記載の心保護剤。

[5] 該キマーゼの阻害剤が、 α -アミノアルキルホスホン酸のァリールジエステルのぺプチド誘導体である請求項 4に記載の心保護剤。

[6] 該キマーゼの阻害剤が、 Suc-Val-Pro-Phe^P(OPh)である請求項 4の心保護剤。

2

[7] 該キマーゼ阻害剤が、 Suc-Val-Pro-Phe^P(OPh)の鏡像異性体 Suc-Va卜 Pro-L_Phe^P

2

(OPh)の濃縮製剤である請求項 4に記載の心保護剤。

2

[8] 該鏡像異性体濃縮製剤にぉレ、て、 Suc-Va卜 Pro-L_Phe^P(OPh)が Suc-Va卜 Pro_Phe^P

2

(OPh)の総重量の 95%以上を含有する請求項 7に記載の心保護剤。

2

[9] 該プロテアーゼ阻害剤が、当該部位において当該プロテアーゼ阻害剤の効果的な局所濃度を維持する伝達体と結合して投与され、そして、当該伝達体は、ヒアルロン酸、ヒドロゲノレ、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、シクロデキストラン、そしてその化合物からなる集合体より選択された高分子量担体をなす、請求項 1一 8のいずれか 1に記載の心保護剤。

[10] 請求項 1一 9のいずれ力 4に記載のプロテアーゼ阻害剤と、薬学的に許容できる希釈液又は賦形剤からなる心保護剤混合物。

[II] 脊椎動物被検体に対し、高血圧、心肥大、心筋梗塞、動脈硬化、糖尿病性及び非糖尿病性腎疾患、 PTCA施行後の再狭窄等に伴う不整脈、心臓繊維化、心不全が危惧される場合における請求項 10に記載の心保護剤混合物を投与する不整脈、心臓繊維化及び/又は心不全の改善方法。

[12] 請求項 10に記載の心保護剤混合物の使用に関し、高血圧、心肥大、心筋梗塞、動脈硬化、糖尿病性及び非糖尿病性腎疾患、 PTCA施行後の再狭窄等に伴う不整脈、心臓繊維化、心不全が危惧される場合の不整脈、心臓繊維化及び/又は心不全に応用するための薬品を作るための使用。

[13] 高血圧、心肥大、心筋梗塞、動脈硬化、糖尿病性及び非糖尿病性腎疾患、 PTCA施行後の再狭窄等に伴う不整脈、心臓繊維化、心不全が危惧される場合の請求項 10 に記載の心保護剤混合物の不整脈、心臓繊維化及び Z又は心不全改善剤としての使用。