WO2004104590A1 - Probenträger auf basis eines porösen films mit metalloxidpartikeln, seine herstellung und verwendung, insbesondere zum selektiven nachweis von phosphorylierten/sultatierten biopolymeren - Google Patents

Probenträger auf basis eines porösen films mit metalloxidpartikeln, seine herstellung und verwendung, insbesondere zum selektiven nachweis von phosphorylierten/sultatierten biopolymeren Download PDF

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Thomas Moritz
Michael Linscheid
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    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry

Definitions

  • Porous film comprising metal oxide particles, sample carrier using the film, method for producing a sample carrier, use of the sample carrier and method for the selective detection of phosphorylated / sulfated biopolymers, in particular peptides / proteins
  • the present invention relates to a porous film comprising metal oxide particles, a sample carrier using the film, a production method for the sample carrier, the use of the sample carrier and a method for the detection of phosphorylated / sulfated biopolymers, in particular peptides / proteins.
  • Phosphorylation and dephosphorylation of biopolymers, especially proteins play an important role in regulating cell functions. They influence growth, metabolism and gene expression. Recognizing the phosphorylation pattern of metabolism and proteome analysis can help to better understand the complex regulatory networks and signal transmission systems in a cell.
  • the complete analysis of the phosphorylation pattern of a biological sample is a major challenge in biochemistry or bioanalytics, since the phosphorylated biopolymers, in particular proteins in very low concentrations, are present in addition to a large number of other biomolecules.
  • Mass spectrometry is one of the most important analysis methods for the characterization of biopolymers, especially proteins and peptides.
  • each mass spectrometer consists of three components, namely an ion source, a device for ion separation and a device for ion detection.
  • EI electron impact ionization mass spectrometry
  • CI chemical ionization mass spectrometry
  • FAB fast atom bombardment mass spectrometry
  • ESI electrospray ionization mass spectrometry
  • MALDI matrix-assisted Laser desorption / ionization mass spectrometry
  • MALDI matrix-assisted Laser desorption / ionization mass spectrometry
  • sample carrier for use in MALDI mass spectrometry, comprising:
  • a porous film on the substrate comprising metal oxide particles.
  • the metal oxide particles are preferably selected from the group comprising titanium dioxide, zirconium dioxide, niobium oxide, aluminum titanium oxide, tungsten-zirconium oxide, titanium zirconium oxide, hafnium dioxide, tungsten oxide, tin dioxide, lead oxide, lead dioxide, germanium dioxide and gallium oxide (T1O 2 , ZrO 2 , NbO, Al 2 TiO 5 , W 2 ZrO 8 , TiZrO 4 , HfO 2 , WO 3 , SnO2, PbO, PbO 2 , GeO 2 , and Ga 2 O 3 ).
  • the metal oxide particles are particles of titanium dioxide, zirconium dioxide and / or titanium zirconium oxide, or of a mixture of the aforementioned compounds.
  • the film has an average pore size ⁇ 50 ⁇ m, preferably an average pore size in the range 1 nm - 25 nm, most preferably an average pore size in the range 1 nm - 10 nm.
  • the film have a thickness of 0.1 ⁇ m - 10 ⁇ m, particularly preferably a thickness in the range of 2-4 ⁇ m, most preferably a thickness of approximately 3 ⁇ m.
  • the substrate is made of glass or coated glass.
  • the glass is conductive glass or conductive coated glass.
  • the substrate consists of glass coated with indium tin oxide (ITO).
  • the substrate consists of aluminum, aluminum with an aluminum oxide layer, in particular anodized aluminum (electrolytically oxidized).
  • the porous film on the substrate further comprises:
  • the MALDI matrix comprises a substance selected from the group: 2,5-dihydroxybenzoic acid, 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid, ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid, ferulic acid, 2,4,6-trihydroxyacetophenone.
  • MALDI matrix is to be understood to mean any substance which is suitable as a matrix for carrying out MALDI mass spectrometry. Examples of these are given below.
  • Biopolymers as used herein are to be understood in particular as proteins, peptides, nucleic acids, lipids and lipopolysaccharides.
  • the film on the substrate is only present and covers certain specific areas, while other areas in between remain free of the film.
  • Such "structuring" can be achieved with the aid of methods known in the field, for example screen printing methods, spin coating, dip coating, doctor blading, drop casting techniques, in each case with or without a corresponding shadow mask / shadow mask film which has the pattern to be applied desired for the metal oxide film.
  • the sample carrier further comprises:
  • One or more samples to be analyzed applied to the film which are believed to contain one or more substances of interest, with preference being given to the one or more sample (s) containing substances which are selected from the group comprising nucleic acids and proteins.
  • the proteins are most preferably phosphorylated and / or sulfated.
  • substance of interest means a substance that is sought to be detected.
  • substance of interest denotes a phosphorylated and / or sulfated biopolymer.
  • the exact nature and nature of the substrate in the sample carrier according to the invention is not essential as long as it is ensured that the substrate is suitable for carrying the film according to the invention. Consequently, the objects of the present invention, regardless of a sample carrier, are also achieved by a porous film comprising metal oxide particles, the film having the features already mentioned above in preferred embodiments.
  • the film of the invention is on a substrate as specified above.
  • the objects of the present invention are further achieved by using a film or sample carrier according to the invention for the detection of phosphorylated / sulfated biopolymers, in particular peptides / proteins from peptide / protein mixtures, the detection preferably using matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry (MALDI) takes place.
  • MALDI matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry
  • the objects of the present invention are also achieved by a method for the selective detection of phosphorylated / sulfated biopolymers, in particular peptides / proteins from peptide / protein mixtures, comprising the following steps:
  • the objects of the present invention are achieved by a method for producing a sample carrier for use in MALDI mass spectrometry, the sample carrier comprising a substrate and a porous film, comprising metal oxide particles, on the substrate, the method comprising the following steps:
  • Drying and subsequent annealing at 200-600 ° C., preferably 300-450 ° C., most preferably at approximately 400 ° C., for a period of 30 minutes-180 minutes, preferably 30 minutes-60 minutes, most preferably for approximately 45 minutes ,
  • the metal oxide is preferably selected from the group comprising titanium dioxide, zirconium dioxide, niobium oxide, aluminum titanium oxide, tungsten-zirconium oxide, titanium zirconium oxide, hafnium dioxide, tungsten oxide, tin dioxide, lead oxide, lead dioxide, germanium dioxide and gallium oxide.
  • the film has an average pore size of ⁇ 50 nm, preferably in the range of 1 nm - 25 nm, most preferably in the range of 1 nm - 10 nm.
  • sample carrier which can be produced by a method according to the present invention, it being preferred that the sample carrier has a porous film made of metal oxide particles, the film has an average pore size of ⁇ 50 nm, preferably in the range 1-25 nm, most preferably in the range 1-10 nm.
  • the objects of the present invention are also achieved by using a sample carrier according to the present invention for the selective detection of phosphorylated / sulfated biopolymers, in particular peptides / proteins, the detection preferably being carried out using MALDI mass spectrometry.
  • the objects of the present invention are also achieved by a method for preparing a sample for MALDI mass spectrometry using a sample carrier according to the invention, the method comprising the steps:
  • washing steps to wash the metal oxide film
  • drying can be carried out after the individual steps.
  • phosphate-containing media are phosphate-containing buffer solutions, e.g. Sodium phosphate, potassium phosphate, ammonium phosphate at a suitable pH.
  • the MALDI matrix itself can also have phosphate groups. Washing in the washing step / steps can be carried out by applying / rinsing with water, dilute acids, buffer solutions etc.
  • MALDI matrix is to be understood to mean any substance which is suitable as a matrix for carrying out MALDI mass spectrometry. Examples of these are given below.
  • the application for registration relates to a sample carrier or a method for the selective and sensitive detection of phosphorylated / sulfated biopolymers, especially peptides / proteins in complex peptide / protein mixtures with the help of MALDI mass spectrometry.
  • the invention surprisingly enables fast sample preparation (approx. 30 min), smallest sample quantities (0.5 ⁇ l), high selectivity and high sensitivity and is suitable for a high sample throughput.
  • the invention includes the production of sample carriers from mesoporous metal oxide films for the detection of phosphorylated and / or sulfated biomolecules and specifies protocols for the immobilization, purification and release of the biomolecules on the sample carrier.
  • the film consists of nanoparticulate metal oxides, especially titanium dioxide and zirconium dioxide, which are produced using a sol-gel process.
  • pore size refers to the interstitial space present between the particles stored in the composite and denotes its average dimensions.
  • mesoporous as used herein means that the average pore size is in the range of ⁇ 50 nm, preferably in the range 1-25 nm, most preferably in the range 1-10 nm.
  • nanoparticulate metal oxides denotes metal oxides that have a particulate character, the average particle size being in the range from 1 to 30 nm.
  • MALDI sample carriers are sold by the leading mass spectrometer manufacturers (Applied Biosystems, Waters / Micromass, BrukerDaltoniks). These sample carriers serve, on the one hand, to transport the sample into the mass spectrometer and / or to purify or concentrate the sample.
  • a selective immobilization of phosphorylated / sulfated biomolecules is not achieved using the commercially available sample carriers.
  • the company Cyphergen offers protein arrays based on metal oxides. However, the pore size here is> 100 nm and therefore not mesoporous. Selectivity with regard to phosphorylated / sulfated biopolymers, in particular peptides / proteins, is also not described.
  • Immobilized metal affinity chromatography is also known and also commercially available (Sigma / Aldrich, Pierce).
  • the phosphorylated peptide is selectively bound with the help of iron cations or gallium cations and then released again. puts.
  • the disadvantage here is that larger amounts of sample are required and the immobilization is carried out “off-line”, ie with the aid of a separate column / cartridge, and the sample is then applied to a MALDI sample carrier. This can result in sample loss and reduce sensitivity.
  • FIG. 1 shows, by way of example and schematically, a sample carrier made of ITO glass with an insularly applied metal oxide film, the diameter of the individual “islands” being 1-3 mm;
  • FIG. 2 shows the use of the sample holder from FIG. 1 in a metal holder of a MALDI mass spectrometer (Voyager DE), a cutout having the size of the outline of the sample holder being cut out of the metal holder.
  • Voyager DE MALDI mass spectrometer
  • FIG. 3 shows a photograph of a holder for a sample carrier according to the invention for use in MALDI time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF),
  • FIG. 4 shows a photograph of a further holder for a sample carrier according to the invention for use in MALDI quadrupole ion trap mass spectrometry under atmospheric pressure (AP / MALDI-QIT),
  • 5 shows the mass spectrum of a tryptic digestion of beta-casein without using the sample carrier according to the invention
  • 6 shows the mass spectrum of a tryptic digestion of beta-casein using a sample carrier according to the invention.
  • 25 ml of titanium tetraisopropoxide are mixed with 10 ml of isopropanol in a dropping funnel and slowly added dropwise with stirring in 200 ml of water. Then 5 ml - 100 ml of concentrated nitric acid are added (however, organic acids such as acetic acid, formic acid, etc. can also be used) and boiled under reflux for 6 hours. The resulting isopropanol is drawn off. The resulting sol is then treated in an autoclave at 180 degrees Celsius for 18 hours. The resulting sol is then concentrated in a rotary evaporator at 40 ° C. and 30 mbar to 15% w / w titanium oxide, mixed with 20% Carbowax and stirred for 24 hours.
  • the viscous solution is on a substrate, e.g. B. Indium Tin Oxide (ITO) coated glass.
  • the substrate was using an adhesive film in the holes of z. B. 2 mm diameter were punched, structured.
  • the substrate can be structured using any suitable method. Such methods are known to the person skilled in the art. Exemplary methods that can be used and that result in a sample carrier that has areas with and areas without metal oxide film are: screen printing, spin coating, dip coating, doctor blading, drop casting techniques, respectively with or without a corresponding shadow mask / shadow mask film which has the pattern to be applied and desired for the metal oxide film.
  • the film is removed.
  • the glass substrate is then annealed at 400 ° C for 45 minutes. This creates mesoporous metal oxide films with a diameter of 2 mm and a thickness of 2 micrometers. After cooling, the ITO glass is cut into 3 x 2 cm pieces.
  • the phosphorylated / sulfated proteins / peptides are enriched when the sample is applied via a metal oxide film according to the invention.
  • suitable (different) washing solutions which are applied and removed again after a suitable time, the washing solutions pursuing two goals without the inventors wishing to be bound to a particular mechanism: 1. washing out the non- bound non-phosphorylated proteins / peptides, 2. loosening the binding of the phosphorylated proteins / peptides by adding a phosphate-containing buffer, the phosphates in the buffer at least partially detaching the bound phosphorylated proteins / peptides from their binding to the metal oxide film and thereby to the Make the desorption ionization process accessible.
  • a phosphate-containing buffer to the metal oxide film significantly increases the sensitivity in the subsequent mass spectrometry.
  • a matrix customary in MALDI for example 2,5-dihydroxybenzoic acid, 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid, ferulic acid, 2,4,6-trihydroxyacetophenone, ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA)
  • HCCA ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid
  • a phosphate-containing MALDI matrix can also be applied, which acts both as a matrix and also brings about the aforementioned “phosphate exchange”.
  • the sample carrier thus produced and provided with samples is introduced into the mass spectrometer, for example, by means of a modified metal carrier for the MALDI-TOF Voyager DE device from Applied Biosystems.
  • a recess the size of the ITO glass was milled into the metal carrier.
  • the glass is placed in the recess and contacted with metal tongues (see FIGS. 1 and 2 for a schematic illustration and FIGS. 3 and 4 for photographs of sample carriers actually produced).
  • 1 shows an ITO-coated glass (1) on which a metal oxide film is arranged in an "insular" arrangement, the individual spots (islands) (2) of the metal oxide film having an average diameter of 1-3 mm.
  • FIG. 1 shows an ITO-coated glass (1) on which a metal oxide film is arranged in an "insular" arrangement, the individual spots (islands) (2) of the metal oxide film having an average diameter of 1-3 mm.
  • FIG. 1 shows an ITO-coated glass (1) on which a metal oxide film is arranged in an "insul
  • FIG. 2 schematically shows a holder (3) of a MALDI mass spectrometer (for example Voyager DE from Applied Biosystems), into which a recess (4) the size of the ITO-coated glass from FIG. 1 has been milled. Furthermore, FIG. 2 shows a metal tongue (5) for contacting the sample carrier according to the invention (for example the ITO-coated glass from FIG.
  • FIGS. 3 and 4 show a holder for a sample carrier according to the invention which has been manufactured and actually used, FIG. 3 showing a holder for MALDI
  • Time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF) used holder, Figure 4 one for
  • MALDI quadrupole ion trap mass spectrometry at atmospheric pressure AP / MALDI QIT
  • AP / MALDI QIT atmospheric pressure
  • the sample to be examined which is assumed to contain phosphorylated peptides / sulfated peptides
  • a MALDI sample carrier according to the invention (with a metal oxide film) which selectively enriches the phosphorylated peptides / proteins while other, non-phosphorylated / sulfated proteins / peptides can be removed by suitable washing solutions.
  • the result is a sample carrier enriched with phosphorylated / sulfated proteins / peptides, which can then be used directly in MALDI mass spectrometry.
  • Different buffers can be used for the washing steps after application of the sample, depending on the type, scope and origin of the applied sample.
  • a matrix customary in MALDI is then applied, referred to herein as "MALDI matrix".
  • a phosphate-containing / phosphate group-containing MALDI matrix can be applied to the film.
  • FIG. 5 and 6 show a mass spectrum of a tryptic digestion of beta-casein, obtained without (FIG. 5) and with (FIG. 4) using a sample carrier according to the invention (trypt. Digestion 15 pmol / ⁇ l, matrix HCCA 10 mg / ml, 1 ⁇ l sample).
  • the peaks belonging to phosphopeptides are marked with an asterisk.
  • Fig. 5 the corresponding peaks are extremely small and are clearly overlaid by other peaks of non-phosphorylated peptides.
  • Figure 6 shows the three largest peaks as peaks based on phosphorylated peptides. This means that the use of a sample carrier according to the invention leads to a highly selective and sensitive detection of phosphorylated peptides.
  • sample carrier is part of the MALDI spectrometer or the associated method
  • complex pre-purification steps in separate devices are dispensed with, and there is to a certain extent an "on-line" immobilization, cleaning, enrichment and release of phosphorylated / sulfated peptides / proteins , which makes the device according to the invention and the method according to the invention particularly suitable for high-throughput analysis by means of MALDI mass spectrometry.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betriffi einen porösen Film, urnfassend Metalloxidpartikel, einen Probenträger unter Verwendung des Films, ein Herstellungsverfahren für den Probenträger, die Verwendung des Probenträgers sowie ein Verfahren zum Nachweis von phosphorylierten/sulfatierten Biopolymeren, insbesondere Peptiden/Proteinen.

Description

Poröser Film, umfassend Metalloxidpartikel, Probenträger unter Verwendung des Films, Verfahren zur Herstellung eines Probenträgers, Verwendung des Probenträgers sowie Verfahren zum selektiven Nachweis von phosphorylierten/sulfatierten Biopolymeren, insbesondere Peptiden/Proteinen
Die vorliegende Erfindung betrifft einen porösen Film, umfassend Metalloxidpartikel, einen Probenträger unter Verwendung des Films, ein Herstellungsverfahren für den Probenträger, die Verwendung des Probenträgers sowie ein Verfahren zum Nachweis von phosphorylierten/sulfatierten Biopolymeren, insbesondere Peptiden/Proteinen.
Phosphorylierungen und Dephosphorylierungen von Biopolymeren, insbesondere Proteinen spielen eine wichtige Rolle in der Regulierung von Zellfunktionen. Sie beeinflussen u. a. das Wachstum, den Metabolismus und die Genexpression. Das Erkennen des Phosphorylie- rungsmusters von Metabolismus und Proteomanalyse kann dazu beitragen die komplexen regulatorischen Netzwerke und Signalübertragungssysteme in einer Zelle besser zu verstehen. Die vollständige Analyse des Phosphorylierungsmusters einer biologischen Probe ist eine große Herausforderung in der Biochemie bzw. Bioanalytik, da die phosphorylierten Biopolymere, insbesondere Proteine in sehr geringen Konzentration, neben einer Vielzahl von anderen Biomolekülen vorhanden sind. Die Massenspektrometrie ist eine der wichtigsten Analysemethoden für die Charakterisierung von Biopolymeren, insbesondere Proteinen und Pepti- den. Sie ist ein Analyseverfahren, um Verbindungen zu identifizieren, ihre Reinheit zu kontrollieren, die qualitative und quantitative Zusammensetzung einer Probe sowie die Masse einer Verbindung exakt zu bestimmen. Bei allen Formen der Massenspektrometrie ist die Bildung von Ionen der zu untersuchenden Spezies erforderlich, die anschließend aufgetrennt und in einem Detektor nachgewiesen werden. Demzufolge besteht jeder Massenspektrometer aus drei Bestandteilen, nämlich einer Ionenquelle, einer Vorrichtung zur Ionentrennung sowie einer Vorrichtung zum Ionennachweis. Abhängig von der Art der Ionenerzeugung unterscheidet man Elektronenstoß-Ionisations-Massenspektrometrie (EI), chemische Ionisations- Massenspektrometrie (CI), Fast-Atom-Bombardement-Massenspektrometrie (FAB), Elektro- spray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI) und Matrix-assistierte Laser- Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI). Die Matrix- Assisted-Laser- Desorption-Ionisation (MALDI), gekoppelt mit einem Massenspektrometer ist die Methode zur Hochdurchsatz-Analyse von Biopolymer-, insbesondere Protein- und Peptid-Gemischen. Dabei kann es aufgrund der niedrigen Konzentration von phosphorylierten/sulfatierten Biopolymeren, insbesondere Proteinen Peptiden zu einer vollständigen Signalunterdrückung in einem solchen Gemisch kommen, d. h. ein Nachweis dieser Verbindungen ist oftmals nicht möglich. Dementsprechend gibt es einen Bedarf auf dem Gebiet für ein Verfahren, zum Nachweis von phosphorylierten/sulfatierten Biopolymeren, insbesondere Peptiden/Proteinen, das für diese hochempfindlich und selektiv ist. Insbesondere existiert ein Bedarf für Vorrichtungen und Verfahren, die die Durchführung der Matrix-assistierten Laser-Desorptions- Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-Massenspektrometrie) erleichtern und für die vorgenannten Substanzen selektiv und deutlich empfindlicher machen.
Demzufolge ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, den Nachweis von phosphorylierten/sulfatierten Biopolymeren, insbesondere Peptiden/Proteinen, auch in komplexen Gemischen, zu erleichtern. Insbesondere ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren bereitzustellen, die bzw. das den Nachweis von phosphorylierten/sulfatierten Biopolymeren, insbesondere Peptiden/Proteinen mittels MALDI- Massenspektrometrie erleichtert und empfindlicher macht.
Diese Aufgaben werden gelöst durch einen Probenträger zur Anwendung bei der MALDI- Massenspektrometrie, umfassend:
- ein Substrat,
- einen auf dem Substrat befindlichen, porösen Film, umfassend Metalloxidpartikel.
Bevorzugt sind die Metalloxidpartikel ausgewählt aus der Gruppe, die Titandioxid, Zirkoniumdioxid, Nioboxid, Aluminiumtitanoxid, Wolfram-Zirkon-Oxid, Titaniumzirkoniumoxid, Hafniumdioxid, Wolframoxid, Zinndioxid, Bleioxid, Bleidioxid, Germaniumdioxid und Galliumoxid umfaßt (T1O2, ZrO2, NbO, Al2TiO5, W2ZrO8, TiZrO4, HfO2, WO3, SnO2, PbO, PbO2, GeO2, und Ga2O3).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Metalloxidpartikel Partikel aus Titandioxid, Zirkoniumdioxid und/oder Titanzirkoniumoxid, oder aus einer Mischung der vogenannten Verbindungen. In einer Ausführungsform hat der Film eine mittlere Porengröße < 50 um, bevorzugt eine mittlere Porengröße im Bereich von 1 nm - 25 nm, am bevorzugtesten eine mittlere Porengröße im Bereich von 1 nm - 10 nm.
Es wird bevorzugt, daß der Film eine Dicke von 0,1 μm - 10 μm, besonders bevorzugt eine Dicke im Bereich von 2 - 4 μm, am bevorzugtesten eine Dicke von ungefähr 3 μm hat.
In einer Ausführungsform besteht das Substrat aus Glas oder beschichtetem Glas. In einer Ausführungsform ist das Glas leitfähiges Glas oder leitfähig beschichtetes Glas. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform besteht das Substrat aus mit Indium-Zinn-Oxid (ITO) beschichteten Glas.
In einer Ausführungsform besteht das Substrat aus Aluminium, Aluminium mit einer Aluminiumoxid-Schicht, insbesondere eloxiertem Aluminium (elektrolytisch oxidiert).
In einer Ausführungsform umfaßt der auf dem Substrat befindliche, poröse Film weiterhin:
- eine MALDI-Matrix.
In einer Ausführungsform umfaßt die MALDI-Matrix eine Substanz, ausgewählt aus der Gruppe: 2,5-Dihydroxybenzoesäure, 3,5-Dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure, α-Cyano-4- hydroxyzimtsäure, Ferulasäure, 2,4,6-Trihydroxyacetophenon.
Unter "MALDI-Matrix", wie hierin verwendet, ist jede Substanz zu verstehen, die sich als Matrix zur Durchführung der MALDI-Massenspektrometrie eignet. Beispiele hierfür sind weiter unten genannt.
Unter "Biopolymeren", wie hierin verwendet, sind insbesondere Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Lipide und Lipopolysaccharide zu verstehen.
In einer Ausführungsform liegt der auf dem Substrat befindliche Film nur an bestimmten, eigens dafür vorgesehenen Bereichen vor und deckt diese ab, während andere, dazwischen liegende Bereiche von dem Film frei bleiben. Eine solche "Strukturierung" kann mit Hilfe von auf dem Gebiet bekannten Verfahren erzielt werden, bspw. Siebdruckverfahren, Spin-Coating-, Dip-Coating-, Doctor-Blading-, Drop- Casting-Techniken, jeweils mit oder ohne entsprechende Lochmaske/Lochmaskenfolie, die das aufzubringende, für den Metalloxidfilm gewünschte Muster aufweist.
In einer Ausführungsform umfaßt der Probenträger weiterhin:
Eine oder mehrere auf dem Film aufgebrachte zu analysierende Proben, von denen angenommen wird,, daß sie eine oder mehrere Substanzen von Interesse enthält (enthalten), wobei bevorzugt ist, daß die eine oder mehrere Probe(n) Substanzen enthält (enthalten), die ausgewählt sind aus der Gruppe, umfassend Nukleinsäuren und Proteine.
Am bevorzugtesten sind die Proteine phosphoryliert und/oder sulfatiert.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff "Substanz von Interesse" eine Substanz, deren Nachweis angestrebt wird.
Insbesondere bezeichnet der Begriff "Substanz von Interesse" ein phosphoryliertes und/oder sulfatiertes Biopolymer.
Es ist zu betonen, daß die genaue Art und Natur des Substrats in dem erfindungsgemäßen Probenträger nicht wesentlich ist, solange gewährleistet ist, daß das Substrat zum Tragen des erfindungsgemäßen Films geeignet ist. Folglich werden die Aufgaben der vorliegenden Erfindung, unabhängig von einem Probenträger, auch gelöst durch einen porösen Film, umfassend Metalloxidpartikel, wobei der Film in bevorzugten Ausführungsformen die bereits oben erwähnten Merkmale aufweist. In einer Ausführungsform liegt der erfindungsgemäße Film auf einem Substrat, wie oben spezifiziert, vor.
Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden weiterhin gelöst durch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Films bzw. Probenträgers zum Nachweis von phosphorylierten/sulfatierten Biopolymeren, insbesondere Peptiden/Proteinen aus Peptid/Proteingemischen, wobei der Nachweis bevorzugt mittels Matrix-assistierter-Laser-Desorptions-Ionisations- Massenspektrometrie (MALDI) erfolgt. Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden auch gelöst durch ein Verfahren zum selektiven Nachweis von phosphorylierten/sulfatierten Biopolymeren, insbesondere Peptiden/Proteinen aus Peptid/Proteingemischen, umfassend die folgenden Schritte:
- Bereitstellen eines Probenträgers gemäß der vorliegenden Erfindung,
- Bereitstellen einer Probe, von der angenommen wird, daß sie phosphorylierte/sulfatierte Biopolymere, insbesondere Peptide/Proteine, alleine oder in Kombination mit anderen Biopolymeren, insbesondere Peptiden/Proteinen, enthält und Aufbringen der Probe auf den Probenträger,
- Durchfuhren von MALDI-Massenspektrometrie.
Weiterhin werden die Aufgaben der vorliegenden Erfindung gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines Probenträgers zur Anwendung bei der MALDI-Massenspektrometrie, wobei der Probenträger ein Substrat und einen auf dem Substrat befindlichen porösen Film, umfassend Metalloxidpartikel, umfaßt, das Verfahren umfassend die folgenden Schritte:
- Herstellung eines Sols aus Metalloxid,
- Induzieren der Gelbildung, beispielsweise durch Einengung und/oder thermische Behandlung,
- Auftragen des Gels auf ein Substrat,
- Trocknung und anschließendes Tempern bei 200 - 600°C, bevorzugt 300 - 450°C, am bevorzugtesten bei ungefähr 400°C, für einen Zeitraum von 30 Minuten - 180 Minuten, bevorzugt 30 Minuten - 60 Minuten, am bevorzugtesten für ungefähr 45 Minuten.
Bevorzugt ist das Metalloxid ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Titandioxid, Zirkoniumdioxid, Nioboxid, Aluminiumtitanoxid, Wolfram-Zirkoniumoxid, Titaniumzirkoniumoxid, Hafniumdioxid, Wolframoxid, Zinndioxid, Bleioxid, Bleidioxid, Germaniumdioxid und Galliumoxid.
In einer Ausführungsform hat der Film eine mittlere Porengröße von < 50 nm, bevorzugt im Bereich von 1 nm - 25 nm, am bevorzugtesten im Bereich von 1 nm - 10 nm.
Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden ebenso gelöst durch einen Probenträger, herstellbar nach einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei bevorzugt ist, daß der Probenträger einen porösen Film aus Metalloxidpartikeln aufweist, wobei der Film eine mittlere Porengröße von < 50 nm, bevorzugt im Bereich von 1 - 25 nm, am bevorzugtesten im Bereich von 1 - 10 nm hat.
Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden außerdem gelöst durch eine Verwendung eines Probenträgers gemäß der vorliegenden Erfindung zum selektiven Nachweis von phosphorylierten/sulfatierten Biopolymeren, insbesondere Peptiden/Proteinen, wobei bevorzugt der Nachweis über MALDI-Massenspektrometrie erfolgt.
Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden außerdem gelöst durch ein Verfahren zum Vorbereiten einer Probe für die MALDI-Massenspektrometrie unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Probenträgers, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
- Bereitstellen eines erfindungsgemäßen Probenträgers,
- Aufbringen einer Probe auf den Metalloxidfilm des Probenträgers, wobei von der Probe angenommen wird, daß sie phosphorylierte/sulfatierte Biopolymere, insbesondere Proteine enthält,
- einen oder mehrere Waschschritte, um den Metalloxidfilm zu waschen,
- Aufbringen eines phosphathaltigen Mediums auf den Metalloxidfilm des Probenträgers,
- Aufbringen einer MALDI-Matrix auf den Metalloxidfilm des Probenträgers.
Je nach Bedarf kann nach den einzelnen Schritten getrocknet werden. Beispiele für phosphat- haltige Medien sind phosphathaltige Pufferlösungen, z.B. Natriumphosphat, Kaliumphosphat, Ammoniumphosphat bei einem geeigneten pH- Wert. Alternativ zu dem getrennten Aufbringen eines phosphathaltigen Mediums und dem Aufbringen einer MALDI-Matrix kann die MALDI-Matrix auch selbst Phosphatgruppen aufweisen. Das Waschen in dem Wasch- scliritt/den Waschschritten kann durch Aufbringen von/Spülen mit Wasser, verdünnten Säuren, Pufferlösungen etc. erfolgen.
Unter "MALDI-Matrix", wie hierin verwendet, ist jede Substanz zu verstehen, die sich als Matrix zur Durchführung der MALDI-Massenspektrometrie eignet. Beispiele hierfür sind weiter unten genannt.
Die zur Anmeldung kommende Erfindung betrifft einen Probenträger bzw. ein Verfahren für den selektiven und empfindlichen Nachweis von phosphorylierten/sulfatierten Biopolymeren, insbesondere Peptiden/Proteinen in komplexen Peptid/Protein-Gemischen mit Hilfe der MALDI-Massenspektrometrie. Die Erfindung ermöglicht überraschenderweise eine schnelle Probenaufbereitung (ca. 30 min), kleinste Probenmengen (0,5 μl), hohe Selektivität und hohe Empfindlichkeit und ist für einen hohen Probendurchsatz geeignet. Die Erfindung beinhaltet die Herstellung von Probenträgem aus mesoporösen Metalloxidfilmen für den Nachweis von phosphorylierten und/oder sulfatierten Biomolekülen und gibt Protokolle für die Immobilisierung, Aufreinigung und Freisetzung der Biomoleküle auf dem Probenträger an. Ohne auf einen besonderen Mechanismus festgelegt sein zu wollen, gehen die Erfinder derzeit davon aus, daß die Grundlage des Verfahrens die selektive Immobilisierung der phosphorylierten/sulfatierten Biomoleküle aufgrund ihrer Affinität zu dem mesoporösen Film und der anschließenden Freisetzung und Untersuchung in einem MALDI-Massenspektrometer ist. Der Film besteht aus nanopartikulären Metalloxiden, insbesondere Titandioxid und Zirkondioxid, die mit Hilfe eines Sol-Gel- Verfahrens hergestellt werden.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Porengröße" auf den zwischen den im Verbund gelagerten Partikeln vorhandenen Interstitialraum und bezeichnet dessen durchschnittliche Dimensionierungen. Der Begriff "mesoporös", wie hierin verwendet, bedeutet, daß die durchscl nittliche Porengröße im Bereich von < 50 nm, bevorzugt im Bereich von 1 - 25 nm, am bevorzugtesten im Bereich von 1 - 10 nm liegt. Die Bezeichnung "nanopartikuläre Metalloxide" bezeichnet Metalloxide, die einen partikulären Charakter haben, wobei die durchschnittliche Partikelgröße im Bereich von 1 - 30 nm liegt.
MALDI-Probenträger werden von den führenden Massenspektrometer-Herstellern (Applied Biosystems, Waters/Micromass, BrukerDaltoniks) vertrieben. Diese Probenträger dienen zum einen dem Transport der Probe in das Massenspektrometer und/oder zur Aufreinigung bzw. Aufkonzentrieren der Probe. Eine selektive Immobilisierung von phosphorylierten/sulfatierten Biomolekülen wird mittels der kommerziell erhältlichen Probenträger nicht erreicht. Die Firma Cyphergen bietet Protein Arrays auf der Basis von Metalloxiden an. Die Porengröße ist hier aber > 100 nm und daher nicht mesoporös. Es wird auch keine Selektivität bezüglich phosphorylierten/sulfatierten Biopolymeren, insbesondere Peptiden/Proteinen beschrieben.
Ebenfalls bekannt und auch kommerziell erhältlich (Sigma/Aldrich, Pierce) ist die Immobili- zed Metall Affinity Chromatography (IMAC). Dabei wird das phosphorylierte Peptid selektiv mit Hilfe von Eisenkationen oder Galliumkationen gebunden und anschließend wieder freige- setzt. Nachteilig ist hier, daß größere Probenmengen benötigt werden und die Immobilisierung "off-line", d. h. mit Hilfe einer separaten Säule/Kartusche erfolgt und anschließend die Probe auf einen MALDI-Probenträger aufgetragen wird. Dadurch kann ein Probenverlust erfolgen und die Empfindlichkeit verringert werden.
Weiterhin sind von der Gruppe um Suzuki et al. ("2D-LC for Selective Extraction of Phosphopeptides using Titania Precolumn"; Poster Abstract, 31st ASMS Conference, January 8 - 12, 2003, Montreal, Canada) Studien bekannt, in denen die Verwendung von Titandioxid als neues Packungsmaterial für die HPLC-Analyse zur selektiven Aufreinigung von phospho- rylierten Verbindungen beschrieben wird. Weiterhin wird die Verwendung einer Vor- Reinigung mittels Titandioxid-HPLC in einer eigens dafür vorgesehenen Säule und der sich anschließenden Analyse mittels Massenspektrometrie dieser voraufgereinigten Probe vorgeschlagen. Der direkte Einsatz von Titandioxid-Filmen im Massenspektrometer wird nicht in Erwägung gezogen.
Es wird nunmehr Bezug genommen auf die Zeichnungen, bei denen
Fig. 1 beispielhaft und schematisch einen Probenträger aus ITO-Glas mit einem insular aufgetragenen Metalloxidfilm zeigt, wobei der Durchmesser der einzelnen "Inseln" 1 - 3 mm beträgt;
Fig. 2 den Einsatz des Probenträgers aus Fig. 1 in einen Metallträger eines MALDI- Massenspektrometers (Voyager DE) zeigt, wobei aus dem Metallträger eine Aussparung in Größe der Umrisse des Probenträgers ausgeschnitten ist.
Fig. 3 eine Photographie eines Halters für einen erfindungsgemäßen Probenträger zum Einsatz bei der MALDI-Time-of-flight-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) zeigt,
Fig. 4 eine Photographie eines weiteren Halters für einen erfindungsgemäßen Probenträger zum Einsatz bei der MALDI-Quadrupol-Ionenfallen-Massenspektrometrie unter Atmosphärendruck (AP/MALDI-QIT) zeigt,
Fig. 5 das Massenspektrum eines tryptischen Verdaus von Beta-Casein ohne Verwendung des erfindungsgemäßen Probenträgers zeigt, und Fig. 6 das Massenspektrum eines tryptischen Verdaus von Beta-Casein unter Verwendung eines erfmdungsgemäßen Probenträgers zeigt.
Die Erfindung wird nunmehr anhand der speziellen Beispiele verdeutlicht, die zu Erläute- rungszwecken, nicht zur Beschränkung der Erfindung dargeboten werden.
Beispiel 1
Herstellung einer Ausführungsform eines mesoporösen Metalloxidfilms
25 ml Titantetrai sopropoxid werden mit 10 ml Isopropanol in einem Tropftrichter gemischt und langsam unter Rühren in 200 ml Wasser getropft. Anschließen werden 5 ml - 100 ml konzentrierte Salpetersäure hinzugegeben (es können jedoch auch organische Säuren, wie Essigsäure, Ameisensäure, etc. verwendet werden) und 6 Stunden unter Rückfluß gekocht. Das entstehende Isopropanol wird abgezogen. Das entstandene Sol wird dann 18 h bei 180 Grad Celsius in einem Autoklaven behandelt. Das resultierende Sol wird dann im Rotationsverdampfer bei 40°C und 30 mbar auf 15% w/w Titanoxid eingeengt, mit 20 % Carbowax versetzt und 24 Stunden gerührt. Die viskose Lösung wird auf einem Substrat, z. B. Indium Zinn Oxid (ITO) beschichtetes Glas, ausgestrichen. Das Substrat wurde mit Hilfe einer Klebefolie, in der Löcher von z. B. 2 mm Duchmesser gestanzt wurden, strukturiert. Eine Strukturierung des Substrats kann mit jedem hierzu geeigneten Verfahren erfolgen. Solche Verfahren sind dem Fachmann bekannt. Beispielhafte Verfahren, die verwendet werden können, und die zu einem Probenträger fuhren, der Bereiche mit und Bereiche ohne Metalloxidfilm hat, sind: Siebdruckverfahren, Spin-Coating-, Dip-Coating-, Doctor-Blading-, Drop-Casting-Techniken, jeweils mit oder ohne entsprechende Lochmaske/Lochmaskenfolie, die das aufzubringende, für den Metalloxidfilm gewünschte Muster aufweist.
Nach Trocknung der Lösung wird die Folie abgezogen. Anschließend wird der Glasträger bei 400°C 45 Minuten getempert. Es entstehen so mesoporöse Metalloxidfilme von 2 mm Durchmesser und 2 Mikrometer Dicke. Nach Abkühlen wird das ITO Glas in Stücke von 3 x 2 cm Größe geschnitten.
Die Anreicherung der phosphorylierten/sulfatierten Proteine/Peptide bei Auftragung der Probe erfolgt über einen erfindungsgemäßen Metalloxidfilm. Anschließend an die Aufbringung der Probe wird mit geeigneten (unterschiedlichen) Waschlösungen, die aufgebracht und nach einer geeigneten Zeit wieder abgenommen werden, gewaschen, wobei mit den Waschlösungen zweierlei Ziele verfolgt werden, ohne daß die Erfinder an einen bestimmten Mechanismus gebunden sein wollen: 1. Auswaschen der nicht-gebundenen nicht-phosphorylierten Protei- ne/Peptide, 2. Lockerung der Bindung der phosphorylierten Proteine/Peptide durch Zugabe eines phosphathaltigen Puffers, wobei die im Puffer befindlichen Phosphate die gebundenen phosphorylierten Proteine/Peptide zumindest teilweise aus ihrer Bindung zu dem Metalloxidfilm lösen und dadurch dem Desorptions-Ionsisations- Vorgang zugänglich machen. Es hat sich nämlich überraschenderweise gezeigt, daß das Aufbringen eines phosphathaltigen Puffers auf den Metalloxidfilm die Empfindlichkeit bei der sich anschließenden Massenspektrometrie deutlich erhöht. Anschließend wird eine MALDI-übliche Matrix (bspw. 2,5- Dihydroxybenzoesäure 3,5-Dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure, Ferulasäure, 2,4,6- Trihydroxyacetophenon, α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (HCCA)) aufgebracht. Alternativ zu dem getrennten Aufbringen eines phosphathaltigen Puffers und einer MALDI-Matrix kann auch eine phosphathaltige MALDI-Matrix aufgebracht werden, die sowohl als Matrix fungiert als auch den zuvor erwähnten "Phosphat-Austausch" bewirkt. Das Einbringen des so hergestellten und probenversehenen Probenträgers in das Massenspektrometer erfolgt bspw. durch einen modifizierten Metallträger für das MALDI-TOF Voyager DE-Gerät der Firma Applied Biosystems. In den Metallträger wurde eine Aussparung in Größe des ITO Glases gefräst. Das Glas wird in die Aussparung gelegt und mit Metallzungen kontaktiert (siehe Fig. 1 und 2 für eine schematische Darstellung und Figur 3 und 4 für Photographien von tatsächlich hergestellten Probeträgern). Dabei ist in Figur 1 ein ITO-beschichtetes Glas (1) dargestellt, auf dem sich in "insularer" Anordnung ein Metalloxidfilm befindet, wobei die einzelnen Spots (Inseln) (2) des Metalloxidfilms durchschnittlich eüien Durchmesser von 1 -3 mm haben. Figur 2 zeigt schematisch einen Halter (3) eines MALDI-Massenspektrometers (bspw. Voyager DE von Applied Biosystems), in den eine Aussparung (4) in Größe des ITO-beschichteten Glases aus Figur 1 gefräst worden ist. Weiterhin zeigt Figur 2 eine Metallzunge (5) zum Kontaktieren des erfindungsgemäßen Probenträgers ( z.B. des ITO-beschichteten Glases aus Figur
1).
Figuren 3 und 4 zeigen einen in der Praxis hergestellten und tatsächlich verwendeten Halter für einen erfindungsgemäßen Probenträger, wobei Figur 3 einen in der Praxis für MALDI-
Time-of-flight-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) verwendeten Halter, Figur 4 einen für
MALDI-Quadrupol-Ionenfallen-Massenspektrometrie bei Atmosphärendruck (AP/MALDI- QIT) verwendeten Halter zeigt. In beiden Figuren ist der insular aufgetragene Metalloxidfilm, in Form von Kreisen, auf dem Glas zu sehen.
Beispiel 2
Um phosphorylierte Peptide mit Hilfe von MALDI-Massenspektrometrie nachzuweisen, kann beispielsweise folgendes Verfahren verwendet werden:
Idee des Verfahrens ist, daß die zu untersuchende Probe, von der angenommen wird, daß sie phosphorylierte Peptide/sulfatierte Peptide enthält, auf einen erfindungsgemäßen MALDI- Probenträger (mit Metalloxidfilm) aufgebracht wird, der die phosphorylierten Pepti- de/Proteine selektiv anreichert, während andere, nicht-phosphorylierte/sulfatierte Proteine/Peptide durch geeignete Waschlösungen entfernt werden können. Resultat ist ein mit phosphorylierten/sulfatierten Proteinen/Peptiden angereicherter Probenträger, der danach direkt in der MALDI-Massenspektrometrie verwendet werden kann. Für die Waschschritte nach Aufbringung der Probe können unterschiedliche Puffer verwendet werden, je nach Art, Umfang und Herkunft der aufgetragenen Probe. Anschließend wird eine MALDI-übliche Matrix aufgebracht, hierin als "MALDI-Matrix" bezeichnet.
Beispielsweise kann folgendes Protokoll für den erfolgreichen und hochselektiven Nachweis von phosphorylierten Peptiden verwendet werden:
Protokoll für den Nachweis von phosphorylierten Peptiden
1 μl Probelöung auf einen gemäß Beispiel 1 hergestellten Film pipettieren
15 min warten überstehende Lösung mit Pipette abnehmen
3 x mit 2 μl Wasser waschen
3 x mit 2 μl 100 mM Essigsäure waschen
1 μl 100 mM Ammoniumdihydrogenphosphat auf den Film pipettieren
15 min warten
MALDI-Matrix auf den Film pipettieren (Bspw.: 2,5-Dihodydroxybenzoesäure, 3,5-
Dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure, Ferulasäure, 2,4,6-Trihydroxyacetophenon, α.-Cyano-4- hydroxyzimtsäure) . Trocknen lassen und messen mittels MALDI-Massenspektrometer.
Alternativ kann statt der getrennten Applikation eines Phosphatpuffers und einer MALDI- Matrix eine phosphathaltige/Phosphatgruppenenthaltende MALDI-Matrix auf den Film aufgetragen werden.
Beispiel 3
Fig. 5 und Fig. 6 zeigt ein Massenspektrum eines tryptischen Verdaus von Beta-Casein, erhalten ohne (Fig. 5) und mit (Fig. 4) Verwendung eines erfindungsgemäßen Probenträgers(trypt. Verdau 15 pmol/μl, Matrix HCCA 10 mg/ml, 1 μl Probe). Die zu Phosphopeptiden (phosphorylierten Peptiden) gehörenden Peaks sind mit einem Sternchen gekennzeichnet. In Fig. 5 sind die entsprechenden Peaks äußerst klein und werden deutlich überlagert von anderen Peaks von nicht-phosphorylierten Peptiden. Im Gegensatz dazu zeigt Fig. 6 die drei größten Peaks als Peaks, die auf phosphorylierten Peptiden beruhen. Dies bedeutet, daß die Verwendung eines erfindungsgemäßen Probenträgers zu einem hochselektiven und empfindlichen Nachweis von phosphorylierten Peptiden führt.
Da der Probenträger Bestandteil des MALDI-Spektrometers bzw. des dazugehörigen Verfahrens ist, entfallen aufwendige Vor-Aufreinigungsschritte in separaten Vorrichtungen, und es findet gewissermaßen eine "on-line"-Immobiliserung, Reinigung, Anreicherung und Freisetzung von phosphorylierten/sulfatierten Peptiden/Proteinen statt, was die erfindungsgemäße Vorrichtung bzw. das erfindungsgemäße Verfahren für die Hochdurchsatz-Analyse mittels MALDI-Massenspektrometrie bestens geeignet macht.
Die in der vorstehenden Besclireibung, den Ansprüchen sowie den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebigen Kombinationen für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.

Claims

Ansprüche
1. Probenträger zur Anwendung bei der MALDI-Massenspektrometrie, umfassend:
- ein Substrat,
- einen auf dem Substrat befindlichen, porösen Film, umfassend Metalloxidpartikel.
2. Probenträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Metalloxidpartikel ausgewählt sind aus der Gruppe, die Titandioxid, Zirkoniumdioxid, Nioboxid, Aluminiumtitanoxid, Wolfram-Zirkon-Oxid, Titaniumzirkoniumoxid, Hafhiumdioxid, Wolframoxid, Zinndioxid, Bleioxid, Bleidioxid, Germaniumdioxid und Galliumoxid umfaßt (TiO2, ZrO2, NbO, Al2TiO5, W2ZrO8, TiZrO4, HfO2, WO3, SnO2, PbO, PbO2, GeO2 und Ga2O3).
3. Probenträger nach einem der Ansprüche 1 - 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Film eine mittlere Porengröße < 50 nm hat.
4. Probenträger nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Film eine mittlere Porengröße im Bereich von 1 nm - 25 nm hat.
5. Probenträger nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Film eine mittlere Porengröße im Bereich von 1 nm - 10 nm hat.
6. Probenträger nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Film eine Dicke von 0,1 μm - 10 μm hat.
7. Probenträger nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Film eine Dicke im Bereich von 2 - 4 μm hat.
8. Probenträger nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Film eine Dicke von ungefähr 3 μm hat.
9. Probenträger nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat aus Glas oder beschichtetem Glas besteht.
10. Probenträger nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Glas leitfähiges Glas oder leitfähig beschichtetes Glas ist.
11. Probenträger nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat aus mit Indium-Zinn- Oxid (ITO) beschichtetem Glas besteht.
12. Probenträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der auf der auf dem Substrat befindliche, poröse Film weiterhin umfaßt:
- eine MALDI-Matrix.
13. Probenträger nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die MALDI-Matrix eine Substanz umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe: 2,5-Dihydroxybenzoesäure, 3,5- Dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure, α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure, Ferulasäure, 2,4,6- Trihydroxyacetophenon.
14. Probenträger nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der auf dem Substrat befindliche Film nur an bestimmten, eigens dafür vorgesehenen Bereichen vorliegt und diese abdeckt, während andere, dazwischen liegende Bereiche von dem Film frei bleiben.
15. Probenträger nach einem der Ansprüche 1 - 14, weiterhin umfassend:
Eine oder mehrere auf dem Film aufgebrachte zu analysierende Proben, von denen angenommen wird, daß sie eine oder mehrere Substanzen von Interesse enthält (enthalten).
16. Probenträger nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die eine oder mehrere Probe^) Substanzen enthält (enthalten), die ausgewählt sind aus der Gruppe, umfassend Nukleinsäuren und Proteine.
17. Probenträger nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine phosphoryliert und/oder sulfatiert sind.
18. Verfahren zum selektiven Nachweis von phosphorylierten/sulfatierten Biopolymeren, insbesondere Peptiden/Proteinen aus Peptid/Proteingemischen, umfassend die folgenden Schritte: Bereitstellen eines Probenträgers nach einem der Ansprüche 1 — 17,
- Bereitstellen einer Probe, von der angenommen wird, daß sie phosphorylier- te/sulfatierte Biopolymere, insbesondere Peptide/Proteine, alleine oder in Kombination mit anderen Biopolymeren, insbesondere Peptiden/Proteinen, enthält und Aufbringen der Probe auf den Probenträger,
- Durchführen von MALDI-Massenspektrometrie, unter Verwendung des Probenträgers.
19. Verfahren zur Herstellung eines Probenträgers zur Anwendung bei der MALDI- Massenspektrometrie, wobei der Probenträger ein Substrat und einen auf dem Substrat befindlichen porösen Film, umfassend Metalloxidpartikel, umfaßt, das Verfahren umfassend die folgenden Schritte:
- Herstellung eines Sols aus Metalloxid,
- Induzieren der Gelbildung, beispielsweise durch Einengung und/oder thermische Behandlung,
- Auftragen des Gels auf ein Substrat,
- Trocknung und anschließendes Tempern bei 200 - 600°C, bevorzugt 300 - 450°C, am bevorzugtesten bei ungefähr 400°C, für einen Zeitraum von 30 Minuten - 180 Minuten, bevorzugt 30 Minuten - 60 Minuten, am bevorzugtesten für ungefähr 45 Minuten.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Metalloxid ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Titandioxid, Zirkoniumdioxid, Nioboxid, Aluminiumtitanoxid, Wolfram-Zirkoniumoxid, Titaniumzirkoniumoxid, Hafhiumdioxid, Wolframoxid, Zinndioxid, Bleioxid, Bleidioxid, Germaniumdioxid und Galliumoxid umfaßt (TiO , ZrO2, NbO, Al2TiO5, W2ZrO8, TiZrO4, HfO2, WO3, SnO2, PbO, PbO2, GeO2 und Ga2O3).
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 - 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Film eine mittlere Porengröße von < 50 nm hat.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Film eine mittlere Porengröße im Bereich von 1 nm - 25 nm hat.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Film eine mittlere Porengröße im Bereich von 1 nm - 10 nm hat.
24. Probenträger, herstellbar nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 19 - 22.
25. Probenträger nach Anspruch 24, der einen porösen Film aus Metalloxidpartikeln aufweist, wobei der Film eine mittlere Porengröße von < 50 nm, bevorzugt im Bereich von 1 - 25 nm, am bevorzugtesten im Bereich von 1 nm - 10 nm hat.
26. Verwendung eines Probenträgers nach einem der Ansprüche 1 - 17 oder nach einem der Ansprüche 24 - 25 zum selektiven Nachweis von phosphorylierten/sulfatierten Biopolymeren, insbesondere Peptiden/Proteinen.
27. Verwendung nach Anspruch 26, wobei der Nachweis über MALDI-Massenspektrometrie erfolgt.
28. Verfahren zum Vorbereiten einer Probe für die MALDI-Massenspektrometrie unter Verwendung eines Probenträgers nach einem der Ansprüche 1 - 17 oder nach einem der Ansprüche 24 - 25, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
- Bereitstellen eines Probenträgers und einem der Ansprüche 1 - 17 oder nach einem der Ansprüche 24 - 25,
- Aufbringen, auf den Metalloxidfilm des Probenträgers, einer Probe, von der angenommen wird, daß sie phosphorylierte/sulfatierte Biopolymere, insbesondere Pepti- de/Proteine enthält,
- Waschen des Metalloxidfilms in einem oder mehreren Waschschritten.
- Aufbringen, auf den Metalloxidfilm des Probenträgers, eines phosphathaltigen Mediums.
- Aufbringen einer MALDI-Matrix auf den Metalloxidfilm des Probenträgers.
29. Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 28 zur Durchführung der MALDI- Massenspektrometrie.
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