WO2005016373A1 - 骨形成促進剤 - Google Patents

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Hiroaki Matsuyama
Yoshikazu Morita
Atsushi Serizawa
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    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention relates to a bone formation promoting agent containing lactoperoxidase and / or a degradation product thereof as an active ingredient. Further, the present invention relates to a food and drink, a medicine or a feed for promoting bone formation, which contains lactoperoxidase and / or a decomposition product thereof.
  • methods for preventing uncoupling and preventing or treating various bone diseases include (1) dietary calcium supplementation, (2) light exercise, (3) sunbathing, and (4) drug treatment.
  • dietary calcium supplementation calcium salts such as calcium carbonate and calcium phosphate and natural calcium agents such as eggshell and fish bone meal are used.
  • these are not necessarily suitable for oral ingestion.
  • light exercise is good for jogging and walking, but when the body is weak, light exercise is troublesome, much less for bedridden elderly people.
  • Sunbathing is good for supplementing activated vitamin D3, but it is not enough.
  • 1-Hydroxyvitamin D3 and calcitonin preparations are used for drug administration, and are known to be effective in treating osteoporosis. However, these substances are medicines themselves and cannot be used as food ingredients.
  • the present inventors have developed a bone formation promoting factor and a bone resorption suppression factor present in milk in order to obtain a substance having a bone formation promoting action or a bone resorption suppressing action that can be used as a food material. I have been searching for factors.
  • lactoperoxidase has an osteogenesis promoting effect by promoting osteoblast differentiation. Osteoblasts play a central role in bone formation, are present on the surface of bone tissue and secrete bone matrix proteins. Calcium phosphate crystals are deposited on this bone matrix protein, resulting in hard bone tissue.
  • Osteoclasts originate from hematopoietic stem cells, are located on the surface of cancellous bone, and are cells that lyse bone. It is thought that bone formation, growth (modeling), and metabolism (remodeling) occur when osteoclasts dissolve bone matrix (bone resorption), and then osteoblasts synthesize bone matrix.
  • the present invention provides an osteogenesis-promoting effect and a bone-strengthening effect by promoting the differentiation of osteoblasts, which play a central role in bone formation in this bone metabolism. It was found that.
  • Lactoperoxidase is a glycoprotein that is abundant in milk and contains heme iron and has a molecular weight of about 80,000. Lactoperoxidase content is higher in human milk than in human milk and less than O.Olmg / lOOml in human milk, whereas it is about 3mg / 100ml in milk. Ratatoperoxidase also oxidizes various substances in the presence of hydrogen peroxide. That is, hypothiocyanate (OSCN-) generated when thiocyanic acid (SCN-) is oxidized by lactoperoxidase inhibits the growth of certain microorganisms.
  • OSCN- hypothiocyanate
  • SCN- thiocyanic acid
  • SCN — is a metabolite in the body and normally present in milk, so that microorganisms that produce hydrogen peroxide are inhibited from growing by lactoperoxidase in milk.
  • lactoperoxidase is considered to function as one of the antibacterial activities of milk, and is also called a lactoperoxidase system.
  • lactoperoxidase a technology that incorporates lactoperoxidase into fermented milk to control excessive sourness during distribution and storage of the product and maintain an appropriate sourness throughout the shelf life (See, for example, Patent Document 1), an anti-aging agent (for example, see Patent Document 2), a low carious nutrition composition (for example, see Patent Document 3), a therapeutic agent for animal skin diseases (for example, see Patent Document 1).
  • Patent Document 4 Although the like are known, having osteoblast differentiation promoting effect has not been clarified yet, have not been utilized for the purposes of bone augmentation.
  • Patent Document 1 WO92 / 13064
  • Patent Document 2 JP-A-5-124980
  • Patent Document 3 JP-A-9-107917
  • Patent Document 4 JP-A-7-233086
  • Patent Document 5 JP-A-8-151331
  • the inventors of the present invention searched for a substance having an osteoblast proliferation promoting action, a bone strengthening action and a bone resorption inhibiting action, and in the process of searching for lactoperoxidase, lactoperoxidase promoted osteoblast differentiation. It has been found that by promoting it, it has a bone formation promoting action and a bone strengthening action. Then, they have found that a degraded product of rata peroxidase has a similar effect by promoting the differentiation of osteoblasts, and thus completed the present invention.
  • an object of the present invention is to provide a novel bone formation promoting agent containing lactoperoxidase and Z or a degradation product thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a food or drink, a pharmaceutical or a feed, which is combined with lactoperoxidase and Z or a decomposition product thereof and has an osteogenesis promoting effect.
  • An object of the present invention is to provide an osteogenesis promoting agent and a food or beverage, a medicine or a feed for promoting osteogenesis, which can be expected to have a preventive or improved therapeutic effect.
  • Lactoperoxidase is prepared from mammalian milk. Sources include milk from horses, buffaloes, humans, pigs, sheep, goats, and horses. Lactoperoxidase is a known substance, and can be produced by a known method, for example, contacting a milk material such as skim milk or whey with a cation exchange resin to adsorb a basic protein, 0.1M It can be obtained by eluting at a salt concentration, desalting and concentrating by a reverse osmosis (RO) membrane, an electrodialysis (ED) method, etc., and drying if necessary.
  • RO reverse osmosis
  • ED electrodialysis
  • a method of purifying ratatopa oxidase using a sulfonidai carrier can be industrially advantageously used.
  • ratato peroxidase produced by a genetic engineering technique for example, recombinant LPO described in International Patent Application No. WO91-06639 may also be used.
  • Lactoperoxidase is also commercially available, and is sold by Sigma and Sederma.
  • Lactoperoxidase hydrolyzate is a peptide mixture obtained by decomposing the above lactoperoxidase with proteolytic enzymes such as trypsin, pancreatin, chymotrypsin, pepsin, papain, kallikrein, catebucin, thermolysin, and V8 protease. It is preferable to decompose so that the molecular weight is 10,000 or less.
  • An osteogenesis-promoting agent comprising the lactoperoxidase and / or a degradation product thereof of the present invention as an active ingredient, and a food and beverage, a pharmaceutical, a feed, etc., for promoting osteogenesis containing the lactoperoxidase and / or a degradation product thereof. Since osteoblasts promote differentiation by promoting osteoblast differentiation, they have a bone strengthening effect and are useful for preventing and improving various bone diseases such as osteoporosis.
  • the bone formation promoting agent and the food or beverage for promoting bone formation of the present invention can easily be obtained from raw materials, always have a constant quality, can be manufactured at low cost without requiring complicated steps, and It has the advantage that it can be prepared in large quantities.
  • FIG. 1 shows a comparison of a femoral fracture stress when a lactoperoxidase obtained in Example 1 of the present invention was administered to an osteoporotic rat with a control (without ratatoperoxidase).
  • lactoperoxidase and / or its decomposed product can be used as it is, but if necessary, lactose, starch and the like can be used according to a conventional method.
  • lactose, starch and the like can be used according to a conventional method.
  • this lactoperoxidase and / or its decomposed product can be mixed with milk, milk drink, coffee drink, juice, jelly, biscuit, Bone formation can also be promoted by blending it with foods and drinks such as sausage, sausage, etc. to promote osteoblast differentiation.
  • a calcium agent having good absorbability such as calcium salt derived from calcium salt, calcium carbonate, calcium lactate, eggshell, and milk
  • feed can contain these effective components to promote bone formation in livestock and poultry.
  • the effective amount of the bone formation promoting agent of the present invention and the food or drink for promoting bone formation is defined as lactoperoxidase and / or its degradation product in terms of solid matter in adults. Should be taken orally at a dose of 10 mg / day or more.
  • the bone formation promoter is 5 mg lOOg / lOOg of lactoperoxidase and / or its degradation product in terms of solids
  • the bone formation promoting food and drink is lactoperoxidase and / or its equivalent in terms of solids. It is desirable to incorporate 5mg 10g / 100g of decomposed product.
  • ingestion of the bone formation promoter of the present invention promotes osteoblast differentiation, thereby promoting bone formation and preventing or ameliorating various bone diseases such as osteoporosis.
  • Power S can.
  • a bone strengthening effect was also observed. Lactoperoxidase was originally derived from milk, and no acute toxicity was observed in rats.
  • Example 1 Examples and test examples are shown below to explain the present invention in more detail. These are merely examples, and the present invention is not limited thereto.
  • Example 1
  • a ram (diameter 5cm x height 30cm) filled with 400g of a sulfonated chitopearl (Fujibo Co., Ltd.), which is a cation exchange resin, is sufficiently washed with deionized water, and then unsterilized skim milk is added to the column.
  • 401 (pH 6.7) was passed at a flow rate of 25 ml / min. After the passage, the column was thoroughly washed with deionized water, and eluted with a 0.02 M carbonate buffer (pH 7.0) containing 1.5 M sodium chloride.
  • the eluted fraction containing ratatopa oxidase was adsorbed to a SS-marked harose FF column (Amersham Biosciences), washed thoroughly with deionized water, and equilibrated with 10 mM phosphate buffer (pH 7.0). Thereafter, the adsorbed fraction was eluted with a linear gradient of 0 to 1 M NaCl, and a fraction containing ratatopaboxidase was collected. Then, the fraction was subjected to gel filtration chromatography using HiLoad 16/60 Superdex 75pg (manufactured by Amersham Bioscience) to obtain lactoperoxidase ILg. In addition, the lactopoxy obtained in this manner was The purity of dase is 91%, and it can be used as it is as an osteogenesis promoter.
  • Example 1 The lactoperoxidase obtained in Example 1 and the degraded lactoperoxidase obtained in Example 2 were examined for their osteoblast differentiation promoting effect. That is, MG63 cells derived from human-derived preosteoblasts were seeded in a 96-well plate at a cell count of 2 ⁇ 10 4 / ml in DMEM medium (manufactured by Flow Laboratories) containing 10% fetal bovine serum, in the presence of 5% CO. Incubate at 37 ° C for 4 days
  • Example 2 And cultured cells for testing. Then, the medium was replaced with a medium containing 1% fetal bovine serum, and the lactoperoxidase solution obtained in Example 1 was adjusted to a final concentration of 0 and 100 ⁇ g / ml. The lactoperoxidase hydrolyzate solution (heat-treated at 90 ° C for 5 minutes and unheated) obtained in step 2 was added to the medium to a final concentration of 100 zg / ml, and the solution was added at 37 ° C. For 5 days.
  • the culture supernatant was collected, and the osteoblast differentiation promoting activity was examined by measuring the amount of type I collagen in the culture supernatant using a Procollagen Typel C_p-labeled EIA Kit (Takara MK101).
  • a control lactoperoxidase-free calo was used.
  • the amount of collagen was expressed as a ratio (%) of the measured amount of type I collagen of each sample to the measured amount of type I collagen of the control. The results are shown in Table 1.
  • lactoperoxidase hydrolyzate tended to produce more type I collagen than lactoperoxidase and had stronger osteoblast proliferation activity.
  • Example 1 The lactoperoxidase obtained in Example 1 was examined for its bone strengthening effect by animal experiments.
  • 4-week-old SD female rats were used. After pre-breeding for one week, the animals were subjected to ovariectomy, and then reared on a calcium-deficient diet for 5 weeks for animal experiments. Rats exposed to the ovaries and bred for 5 weeks on a calcium-deficient diet clearly had osteoporotic symptoms.
  • the rats in which this osteoporosis state was induced were divided into two test groups, a group of 6 rats per group, a control group of lactoperoxidase-free calo (group A) and a group of lactoperoxidase 1.0% by weight administration (group B). They were reared for 4 months and 1 week on the test feed shown in Table 2 below. The test feed was adjusted with casein so that the nitrogen content (17.06%) was the same. For each test feed, 300 mg of calcium, 230 mg of phosphorus and 50 mg of magnesium were blended per 100 g.
  • Lactoperoxidase (implementation 1.0
  • Example 1 The lactoperoxidase obtained in Example 1 was added to raw milk at a rate of lg / 11.
  • the mixture was sterilized by heating at 75 ° C. for 15 seconds to produce a milk drink for promoting bone formation of the present invention.
  • Lactoperoxidase 0.005 (% by weight) obtained in Example 1, flour 50.0 (% by weight), sugar 20.0 (% by weight), salt 0.5 (% by weight), margarine 12.5 (% by weight), egg 12.1 (% by weight) ), Water 4.1 (wt%), sodium bicarbonate 0.1 (wt%), ammonium bicarbonate 0.2 (wt%), calcium carbonate 0.5 (wt%) Then, the biscuit for promoting bone formation of the present invention was produced.
  • the raw materials were mixed at a ratio of 0.1% by weight, 0.1% by weight of water, and 58.79% by weight of water, filled in a container, and sterilized by heating to produce a jelly for promoting bone formation of the present invention.
  • Example 1 lactoperoxidase O Kishida over peptidase 0.005 (wt 0/0), Gouda cheese 43.0 (wt%) Cheddar cheese 43.5 (weight%), sodium Kuen acid 2.0 (wt%), milk-derived Karushiu arm 1.0 ( (% By weight) and water at 10.5 (% by weight), then emulsified at 85 ° C. A processed cheese for promoting bone formation of Ming was produced.
  • Lactoperoxidase 0.001 (% by weight) obtained in Example 1, skim milk 75.61 (% by weight), whey protein concentrate 2.36 (% by weight), lactose 13.86 (% by weight), mineral mixture 0.32 (% by weight) Ingredients were mixed at a ratio of 0.32 (% by weight) of a water-soluble vitamin mixture and 7.53 (% by weight) of fat containing fat-soluble vitamins to produce an infant formula for promoting bone formation according to the present invention.
  • Lactoperoxidase 0.001 (% by weight) obtained in Example 1, soybean meal 12.0 (% by weight), skim milk powder 14.0 (% by weight), soybean oil 4.0 (% by weight), corn oil 2.0 (% by weight), palm Oil 28.0 (wt%), corn starch 15.0 (wt%), flour 9.0 (wt%), bran 2.0 (wt%), vitamin mix 9.0 (wt%), mineral mix 2.0 (wt%), cellulose 3.0 (wt%) (% By weight) to prepare a feed for dogs for raising bone formation (dog food) of the present invention.
  • An osteogenesis promoter containing the lactoperoxidase and / or a degradation product thereof of the present invention as an active ingredient, and a food, beverage, medicine, or feed for promoting osteogenesis containing lactoperoxidase and / or a degradation product thereof. are useful for strengthening bones in humans and livestock, and are also useful for preventing and improving various bone diseases such as osteoporosis, because bone formation is promoted by promoting osteoblast differentiation. .

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Abstract

　骨芽細胞の分化を促進することによって、骨形成を促進する骨形成促進剤及び骨形成促進用飲食品、医薬又は飼料を提供する。 　ラクトパーオキシダーゼ及び／又はラクトパーオキシダーゼをトリプシン等のプロテアーゼで分解した分解物を有効成分とする、骨芽細胞の分化を促進することによって骨形成を促進する骨形成促進剤、及びラクトパーオキシダーゼ及び／又はその分解物を配合した骨形成促進用飲食品、医薬又は飼料が提供される。  

Description

明 細 書
骨形成促進剤
技術分野
[0001] 本発明は、ラクトパーォキシダーゼ及び/又はその分解物を有効成分とする骨形 成促進剤に関する。さらに、ラクトパーォキシダーゼ及び/又はその分解物を配合し た骨形成促進用飲食品、医薬又は飼料に関する。
背景技術
[0002] 近年、高齢化に伴い、骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患が増加する傾向にあ る。骨組織においては、絶えず骨形成と骨吸収が営まれており、若い時には骨形成 と骨吸収のバランスが保たれている力 加齢に伴い種々の原因でそのバランスが骨 吸収に傾 アンカップリング)。そして、この状態が長期間続くと骨組織が脆くなり、 骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患を生じることになる。このアンカップリングを防 止することができれば、骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患を予防することができ ると考えられている。
従来より、アンカップリングを防止し、各種骨疾患を予防あるいは治療する方法とし て、 （1)食餌によるカルシウム補給、 （2)軽い運動、（3)日光浴、（4)薬物治療等が行 われている。食餌によるカルシウム補給には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等の カルシウム塩や卵殻、魚骨粉等の天然カルシウム剤が使用されている。しかし、これ らは必ずしも経口摂取に適している素材であるとはいえなレ、。軽い運動はジョギング や散歩等が良いとされるが、体が弱っている場合は軽い運動も厄介なものであり、ま して寝たきりの老人では殆ど運動できない。 日光浴は活性化ビタミン D3の補給という 点では良いとされているが、これだけでは不充分である。薬物投与には、 1ひ—ヒドロ キシビタミン D3やカルシトニン製剤等が使用されており、骨粗鬆症の治療には有効 であるということが知られている。しかし、これらの物質は医薬そのものであり、食品素 材として使用可能なものではない。
[0003] 一方、本発明者らは、食品素材として使用可能な骨形成促進作用や骨吸収抑制 作用を有する物質を得るために、乳中に存在する骨形成促進因子及び骨吸収抑制 因子を探索し続けてきた。本発明者らは、その過程において、ラクトパーォキシダー ゼが骨芽細胞の分化を促進することによって、骨形成促進作用を有することを見出し た。骨芽細胞は骨形成で中心的な役割を果たしている細胞で、骨組織表面に存在し 、骨基質タンパク質を分泌している。この骨基質タンパク質にリン酸カルシウムの結晶 が沈着し硬い骨組織が出来上がる。
一方、破骨細胞は造血幹細胞から発生し、海綿骨表面に存在し、骨を溶解する細 胞である。破骨細胞が骨基質を溶解し (骨吸収）、その後、骨芽細胞が骨基質を合成 することによって、骨の形成や成長 (モデリング）、代謝 (リモデリング）が起こると考え られている。本願発明は、ラクトパーォキシダーゼが、この骨代謝において骨形成で 中心的な役割を果たしている骨芽細胞の分化を促進することによって、骨形成促進 作用を有し、また、骨強化作用を有することを見出したものである。
ラクトパーォキシダーゼは、乳中に多く存在し、ヘム鉄を含む分子量約 8万の糖タン パク質である。ラクトパーォキシダーゼ含量は、人乳中に比べ牛乳中に多ぐ人乳中 では O.Olmg/lOOml以下であるのに対し、牛乳中では約 3mg/100mlである。また、ラタ トパーォキシダーゼの機能としては、過酸化水素の存在下で、様々な物質を酸化す る。すなわち、チォシアン酸（SCN— )がラクトパーォキシダーゼにより酸化された場合 に生ずるヒポチオシァネート（OSCN—)は、ある種の微生物の増殖を阻害する。 SCN —は体内での代謝産物であり、通常乳中に存在しているため、過酸化水素を産生する 微生物は牛乳中でのラクトパーォキシダーゼによる増殖阻害を受けてしまう。このよう にラクトパーォキシダーゼは、乳が有する抗菌作用の一つとして機能していると考え られ、ラクトパーォキシダーゼシステムとも呼ばれている。ラクトパーォキシダーゼの利 用に関しては、発酵乳にラクトパーォキシダーゼを配合することによって、製品の流 通及び保存中の過度の酸味上昇を抑制し、賞味期間を通して適切な酸味を維持す る技術 (例えば、特許文献 1参照。）、老化防止剤 (例えば、特許文献 2参照。）、低う 蝕栄養組成物 (例えば、特許文献 3参照。）、動物の皮膚病治療剤 (例えば、特許文 献 4参照。）等が知られているが、骨芽細胞分化促進作用を有することは未だ明らか にされておらず、骨強化の目的では利用されていない。
乳の骨強化作用について、本出願人は、乳中に微量にしか存在しない塩基性タン パク質に骨芽細胞増殖促進作用、骨強化作用及び骨吸収抑制作用があることを見 出し特許出願した (例えば、特許文献 5参照。）。しかし、その塩基性タンパク質中に含 まれているラクトパーォキシダーゼに骨形成促進作用があることは知られていない。 特許文献 1： WO92/13064号公報
特許文献 2：特開平 5-124980号公報
特許文献 3：特開平 9-107917号公報
特許文献 4：特開平 7-233086号公報
特許文献 5：特開平 8-151331号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明者らは、骨芽細胞増殖促進作用、骨強化作用及び骨吸収防止作用を有す る物質を探索してレ、る過程で、ラクトパーォキシダーゼが骨芽細胞の分化を促進する ことによって、骨形成促進作用及び骨強化作用を有することを見出した。そして、ラタ トパーォキシダーゼの分解物も骨芽細胞の分化を促進することによって、同様の作 用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明は、ラクトパーォキシダーゼ及び Z又はその分解物を有効成分 とする新規な骨形成促進剤を提供することを課題とする。また、本発明は、ラクトパー ォキシダーゼ及び Z又はその分解物を配合して骨形成促進作用を賦与した飲食品 、医薬品又は飼料を提供することを課題とする。
骨粗鬆症という疾病の性質上、 日常の食事の中で、嗜好的にも問題なぐ長期的， 直接的に経口摂取することができ、また、直接的に骨形成促進作用を骨に付与し、 骨粗鬆症の予防又は改善治療効果が期待できるような、骨形成促進剤及び骨形成 促進用飲食品、医薬又は飼料の提供を課題とする。
課題を解決するための手段
[0006] ラクトパーォキシダーゼは哺乳動物の乳から調製する。給源としては、ゥシ、水牛、 ヒト、ブタ、ヒッジ、ャギ、ゥマ等の乳があげられる。ラクトパーォキシダーゼは、公知の 物質であって、それを製造するには、公知の方法、例えば脱脂乳や乳清等の乳原料 を陽イオン交換樹脂と接触させて塩基性タンパク質を吸着させ、これを 0.1 1.0Mの 塩濃度で溶出し、逆浸透 (RO)膜や電気透析 (ED)法等により脱塩及び濃縮し、必要 に応じて乾燥することにより得ることができる。また、スルホンィ匕担体を用いてラタトパ 一ォキシダーゼを精製する方法 (特開平 3-109400号公報)を工業的に有利に利用 することもできる。また、本願発明では、遺伝子工学的手法により生産されたラタトパ ーォキシダーゼ、例えば国際特許出願 WO91-06639号明細書に記載された組換え LPO等も使用し得る。なお、ラクトパーォキシダーゼは市販の製品もあり、シグマ（ Sigma)社及びセデルマ（Sederma)社等から販売されてレ、る。
[0007] ラクトパーォキシダーゼ分解物は、上記のラクトパーォキシダーゼをトリプシン、パン クレアチン、キモトリブシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテブシン、サーモライ シン、 V8プロテアーゼ等のタンパク質分解酵素で分解したペプチド混合物であり、 分子量が 10,000以下となるように分解するのが好ましい。
発明の効果
[0008] 本発明のラクトパーォキシダーゼ及び/又はその分解物を有効成分とする骨形成 促進剤及びラクトパーォキシダーゼ及び/又はその分解物を配合した骨形成促進 用飲食品、医薬、飼料等は、骨芽細胞の分化を促進することによって、骨形成作用 が促進されることから、骨強化作用を有し、また骨粗鬆症等の各種骨疾患の予防や 改善に有用である。また、本発明の骨形成促進剤及び骨形成促進用飲食品は、原 料の入手が容易であり、常に一定の品質が得られ、複雑な工程を必要としないで安 価に製造でき、また大量調製することができるという利点がある。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1]骨粗鬆症ラットに本発明の実施例 1で得られたラクトパーォキシダーゼを投与し た場合の大腿骨破断応力の対照（ラタトパーォキシダーゼ無添加）との比較を表す。 発明を実施するための最良の形態
[0010] 本発明の骨形成促進剤を投与するに際しては、ラクトパーォキシダーゼ及び/又 はその分解物をそのままの状態で用いることもできるが、必要に応じ、常法に従い、 乳糖、澱粉等で賦型して、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤としたり、あるいはドリ ンク剤等に製剤化して用いることもできる。さらには、このラクトパーォキシダーゼ及び /又はその分解物を、牛乳、乳飲料、コーヒー飲料、ジュース、ゼリー、ビスケット、パ ン、麵、ソーセージ等の飲食品に配合して、骨芽細胞の分化を促進することによって 、骨形成促進を図ることも可能である。さらに、塩ィ匕カルシウム、炭酸カルシウム、乳 酸カルシウム、卵殻、牛乳由来のカルシウム等の吸収性が良好なカルシウム剤を併 用することにより、骨形成促進作用を一層高めることができる。また、これらの有効成 分を飼料に含有させて、家畜や家禽等の骨形成を促進させることもできる。
[0011] 骨形成促進効果を得るためには、本発明の骨形成促進剤、及び骨形成促進用飲 食品の有効量として、成人において、固形物換算でラクトパーォキシダーゼ及び/ 又はその分解物を 10mg/日以上、経口摂取することが望ましい。そして、骨形成促進 剤には、固形物換算でラクトパーォキシダーゼ及び/又はその分解物を 5mg lOOg/lOOg,骨形成促進用飲食品には、固形物換算でラクトパーォキシダーゼ及び /又はその分解物を 5mg 10g/100g配合することが望ましい。
[0012] このように、本発明の骨形成促進剤を摂取することにより、骨芽細胞の分化を促進 することによって、骨形成が促進され、骨粗鬆症等の各種骨疾患を予防又は改善す ること力 Sできる。また、骨強化作用も認められた。なお、ラクトパーォキシダーゼは、元 来、乳由来の成分であり、ラットにおける急性毒性は認められなかった。
[0013] 以下に実施例及び試験例を示し、本発明についてより詳細に説明する力 これら は単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。 実施例 1
[0014] 陽イオン交換樹脂であるスルホン化キトパール（富士紡績社製) 400gを充填した力 ラム（直径 5cm X高さ 30cm)を脱イオン水で十分に洗浄した後、このカラムに未殺菌 脱脂乳 401(pH6.7)を流速 25ml/minで通液した。通液後、カラムを脱イオン水で十分洗 浄し、 1.5M塩化ナトリウムを含む 0.02M炭酸緩衝液 (pH7.0)で溶出した。そしてラタトパ 一ォキシダーゼを含有する溶出画分を S-S印 harose FFカラム（アマシャムバイオサイ エンス社製）に吸着させ、脱イオン水で十分洗浄し、 10mMリン酸緩衝液 (pH7. 0)で 平衡化した後、 0— 1M NaClのリニアグラジェントで吸着した画分を溶出し、ラタトパ 一ォキシダーゼを含む画分を回収した。そしてその画分を HiLoad 16/60 Superdex 75pg (アマシャムバイオサイエンス社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーで処理 し、ラクトパーォキシダーゼ l lgを得た。なお、このようにして得られたラクトパーォキシ ダーゼの純度は 91 %であり、そのまま骨形成促進剤として使用可能である。
実施例 2
[0015] 実施例 1で得られたラクトパーォキシダーゼ 5mgを水 10mlに懸濁し、最終濃度 0.01 重量％となるようタンパク質分解酵素であるトリプシン (シグマ社製）を加え、 37°Cで 1 時間酵素処理した。そして、 90°Cで 5分間加熱処理して酵素を失活させた後、凍結乾 燥してラクトパーォキシダーゼ分解物 4. lmgを得た。このようにして得られたラクトパー ォキシダーゼ分解物をゲルろ過法で分析したところ、このラクトパーォキシダーゼ分 解物の分子量は 10,000以下であることがわかった。
試験例 1
[0016] 実施例 1で得られたラクトパーォキシダーゼ及び実施例 2で得られたラクトパーォキ シダーゼ分解物について骨芽細胞分化促進作用を調べた。すなわち、ヒト由来前骨 芽細胞 MG63細胞を 10%牛胎児血清を含む DMEM培地 (Flow Laboratories社製)で 、 2 X 104/mlの細胞数で 96穴プレートに播種し、 5%CO存在下、 37°Cで 4日間培養し
2
、試験用培養細胞とした。そして、培地を 1%牛胎児血清を含む培地に交換し、実施 例 1で得られたラクトパーォキシダーゼ溶液を最終濃度力 0、及び 100 μ g/mlとなるよ うに、また、実施例 2で得られたラクトパーォキシダーゼ分解物溶液 (90°Cで 5分間加 熱処理したものと未加熱処理のもの）を最終濃度 100 z g/mlとなるように培地に添カロ して、 37°Cで 5日間培養した。培養上清を回収し、 Procollagen Typel C_p印 tide EIA Kit(Takara MK101)にて培養上清中の I型コラーゲン量を測定することにより骨 芽細胞分化促進活性を調べた。コントロールとして、ラクトパーォキシダーゼ無添カロ のものを用いた。コラーゲン量は、それぞれのサンプルの I型コラーゲン測定量の、コ ントロールの I型コラーゲン測定量に対する割合（％)で表した。その結果を表 1に示 す。
[0017] [表 1] 最終濃度 コラーゲン量 （％)
コントロール （無添加） ― 100 ± 6
実施例 1 10 μ g/ml 191 ± 4
実施例 1 100 μ g/ml 188 ± 6
実施例 2 100 μ g/ml 191 ± 13
実施例 2 (未加熱） 100 μ g/ml 224 ± 11
[0018] 実施例 1で得られたラクトパーォキシダーゼ及び実施例 2で得られたラクトパーォキ シダーゼ分解物を添加した群はいずれもコントロール (ラタトパーォキシダーゼ無添 カロ)群に比べ I型コラーゲン量が増加しており、骨芽細胞分化促進作用を有すること が判った。
また、ラクトパーォキシダーゼ分解物のほうが、ラクトパーォキシダーゼより I型コラー ゲン量の産生が多くなる傾向があり、より強い骨芽細胞増殖活性を有することが判つ た。
試験例 2
[0019] 実施例 1で得られたラクトパーォキシダーゼについて、動物実験により骨強化作用 を調べた。動物実験には 4週齢の SD系雌ラットを用いた。 1週間の予備飼育後、卵 巣摘出手術を施し、その後、カルシウム欠乏食で 5週間飼育して動物実験に供した。 なお、卵巣を出し、カルシウム欠乏食で 5週間飼育したラットは、明らかに骨粗鬆症状 態にあった。
この骨粗鬆症状態を惹起したラットを 1群 6匹ずつ、ラクトパーォキシダーゼ無添カロ の対照群 (A群）、ラクトパーォキシダーゼ 1.0重量％投与群（B群）の 2試験群に分け 、それぞれ次の表 2に示す試験飼料で 4ヶ月と 1週間飼育した。なお、各試験飼料の 窒素含量 (17.06%)が同様となるようカゼインで調整した。また、各試験飼料について は、 100g当たり、カルシウム 300mg、リン 230mg及びマグネシウム 50mgを配合した。
[0020] [表 2] A群 B群 カゼィン 20. 0 18. 9 (重量％)
コーンスターチ 15. 0 15. 0
セルロース 5. 0 5. 0
コーン油 5. 0 5. 0
ビタミン混合 1. 0 1. 0
ミネラル混合 2. 65 2. 65
蔗糖 51. 05 51. 15
D L—メチォニン 0. 3 0. 3
1
ラク トパーォキシダーゼ（実施 1. 0
[0021] 4ヶ月と 1週間後、各試験群のラットの両側大腿骨及び脛骨を摘出し、大腿骨につ いては骨破断力測定装置（レオメータ'マックス RX-1600型、アイテクノ製）で骨強度 を測定した。その結果を図 1に示す。これによると、大腿骨破断応力は、対照群 (A群 ： LPO添加）に比べ、ラクトパーォキシダーゼ投与群（B群: LPO)で高い値を示した。 実施例 3
[0022] (骨形成促進剤の製造）
実施例 1で得られたラクトパーォキシダーゼ lOOmgに、含水結晶ぶどう糖 93.4g、炭 酸カルシウム 5g、シュガーエステル lg、香料 0.5gを加え、混和した後、タブレット状に 打錠して、本発明の骨形成促進剤を製造した。
実施例 4
[0023] (骨形成促進用乳飲料の製造）
実施例 1で得られたラクトパーォキシダーゼを、 11当たり lgとなるように生乳に添加し
、均質圧力 120kgん m2でホモゲナイズした後、 75°Cで 15秒間加熱殺菌して、本発明 の骨形成促進用乳飲料を製造した。
実施例 5
[0024] (骨形成促進用乳飲料の製造） 実施例 2で得られたラクトパーォキシダーゼ分解物を、 11当たり lgとなるように生乳 に添カ卩し、均質圧力 120kgん m2でホモゲナイズした後、 75°Cで 15秒間加熱殺菌して、 本発明の骨形成促進用乳飲料を製造した。
実施例 6
[0025] (骨形成促進用飲料の製造）
実施例 1で得られたラクトパーォキシダーゼ 40gを、乳酸で pH3.2に調整した脱ィォ ン水 501に溶解した後、砂糖 lkg、香料 10gを溶解して、 90°Cで 15秒間加熱殺菌を行つ た。これを 50mlずつ蓋付きガラスビンに密封充填し、本発明の骨形成促進用飲料を 製造した。
実施例 7
[0026] (骨形成促進用ビスケットの製造）
実施例 1で得られたラクトパーォキシダーゼ 0.005(重量％)、小麦粉 50.0(重量％)、 砂糖 20.0(重量％)、食塩 0.5(重量％)、マーガリン 12.5(重量％)、卵 12.1(重量％)、水 4.1(重量％)、炭酸水素ナトリウム 0.1(重量％)、重炭酸アンモユウム 0.2(重量％)、炭酸 カルシウム 0.5(重量％)の割合で原料を混合し、ドウを作成して成型した後、焙焼して 、本発明の骨形成促進用ビスケットを製造した。
実施例 8
[0027] (骨形成促進用ゼリーの製造）
実施例 1で得られたラクトパーォキシダーゼ 0.0005(重量％)、果糖 20.0(重量％)、グ ラニュー糖 15.0(重量％)、水飴 5.0(重量％)、寒天 1.0(重量％)、香料 0.11(重量％)、力 ルシゥム 0.1(重量％)、水 58.79(重量％)の割合で原料を混合した後、容器に充填し、 加熱滅菌して、本発明の骨形成促進用ゼリーを製造した。
実施例 9
[0028] (骨形成促進用プロセスチーズの製造）
実施例 1で得られたラクトパーォキシダーゼ 0.005 (重量0 /0)、ゴーダチーズ 43.0(重量 %)、チェダーチーズ 43.5(重量％)、クェン酸ナトリウム 2.0(重量％)、乳由来カルシゥ ム 1.0(重量％)、水 10.5(重量％)の割合で原料を混合した後、 85°Cで乳化して、本発 明の骨形成促進用プロセスチーズを製造した。
実施例 10
[0029] (骨形成促進用乳児用調製粉乳の製造）
実施例 1で得られたラクトパーォキシダーゼ 0.001(重量％)、脱脂乳 75.61(重量％)、 乳清タンパク質濃縮物 2.36(重量％)、乳糖 13.86(重量％)、ミネラル混合物 0.32(重量 %)、水溶性ビタミン混合物 0.32(重量％)、脂溶性ビタミンを含む脂肪 7.53(重量％)の 割合で原料を混合し、本発明の骨形成促進用乳児用調製粉乳を製造した。
実施例 11
[0030] (ドッグフードの製造）
実施例 1で得られたラクトパーォキシダーゼ 0.001(重量％)、大豆粕 12.0(重量％)、 脱脂粉乳 14.0(重量％)、大豆油 4.0(重量％)、コーン油 2.0(重量％)、パーム油 28.0(重 量％)、トウモロコシ澱粉 15.0(重量％)、小麦粉 9.0(重量％)、ふすま 2.0(重量％)、ビタ ミン混合物 9.0(重量％)、ミネラル混合物 2.0(重量％)、セルロース 3.0(重量％)の割合 で原料を混合して、本発明の骨形成促進用ィヌ飼育用飼料 (ドッグフード）を製造し た。
産業上の利用可能性
[0031] 本発明のラクトパーォキシダーゼ及び/又はその分解物を有効成分とする骨形成 促進剤、及びラクトパーォキシダーゼ及び/又はその分解物を配合した骨形成促進 用飲食品、医薬、飼料等は、骨芽細胞の分化を促進することによって骨形成作用が 促進されることから、ヒトゃ家畜の骨強化に有用であり、また骨粗鬆症等の各種骨疾 患の予防や改善に有用である。

Claims

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ラクトパーォキシダーゼ及び Z又はその分解物を有効成分とする骨形成促進剤。 ラクトパーォキシダーゼ及び z又はその分解物を配合した骨形成促進用飲食品、 医薬又は飼料。
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