JPH03109400A - 鉄結合性蛋白質を分離、精製し、採取する方法 - Google Patents
鉄結合性蛋白質を分離、精製し、採取する方法Info
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- JPH03109400A JPH03109400A JP1247326A JP24732689A JPH03109400A JP H03109400 A JPH03109400 A JP H03109400A JP 1247326 A JP1247326 A JP 1247326A JP 24732689 A JP24732689 A JP 24732689A JP H03109400 A JPH03109400 A JP H03109400A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
１１五叫■朋分互
本発明は、多様な生理活性を有し、薬理学的にも重要な
鉄結合性蛋白質であるラクトパーオキシダーゼ及び／又
はラクトフェリンを鉄結合性蛋白質を含有する溶液から
分離、精製し、これを採取する方法に関する。
鉄結合性蛋白質であるラクトパーオキシダーゼ及び／又
はラクトフェリンを鉄結合性蛋白質を含有する溶液から
分離、精製し、これを採取する方法に関する。
従来傅伎歪
ラクトパーオキシダーゼ及びラクトフェリンは乳など外
分泌液中に存在する鉄結合性蛋白質であり、共に殺菌効
果を有することが知られている。
分泌液中に存在する鉄結合性蛋白質であり、共に殺菌効
果を有することが知られている。
このうち、ラクトパーオキシダーゼは蛋白質のヨドラベ
ルに不可欠な物質であり、又、ラクトフェリンはリンパ
球増殖効果、鉄吸収促進効果、白血球分化調整効果、過
酸化脂質生成防止効果、抗ウイルス効果などの種々の生
理機能を有する。このため、ラクトパーオキシダーゼ及
びラクトフェリンは医薬品としての利用が考えられる他
、飼料や食品素材としても重要である。
ルに不可欠な物質であり、又、ラクトフェリンはリンパ
球増殖効果、鉄吸収促進効果、白血球分化調整効果、過
酸化脂質生成防止効果、抗ウイルス効果などの種々の生
理機能を有する。このため、ラクトパーオキシダーゼ及
びラクトフェリンは医薬品としての利用が考えられる他
、飼料や食品素材としても重要である。
従来、ラクトパーオキシダーゼ及びラクトフェリンを乳
から分離する試みがなされていた。しかし、ラクトパー
オキシダーゼ及びラクトフェリンは鉄結合性蛋白質であ
り、分子量及び等電点も類似しているので、この両者を
一度の処理で効率よ（分離することは困難であった。例
えば、アルギネートゲルに乳を接触させてラクトパーオ
キシダーゼ及びラクトフェリンを同時に分離する方法（
特開昭６ｌ−２４６１９８）では、ラクトパーオキシダ
ーゼとラクトフェリンを同一画分中に得ることはできる
ものの、ラクトパーオキシダーゼとラクトフェリンを分
離するには、さらに精製工程を必要としている。また、
カルボキシル基又はスルホン基を導入したデキストラン
で被覆したシリカ粒子を用い、塩濃度勾配によってラク
トパーオキシダーゼとラクトフェリンを系統的に溶出す
る方法（特開平１−８６８３９）も提案されているが、
ラクトパーオキシダーゼとラクトフェリンを完全′に分
離するには、再度クロマトグラフ処理を必要としている
。
から分離する試みがなされていた。しかし、ラクトパー
オキシダーゼ及びラクトフェリンは鉄結合性蛋白質であ
り、分子量及び等電点も類似しているので、この両者を
一度の処理で効率よ（分離することは困難であった。例
えば、アルギネートゲルに乳を接触させてラクトパーオ
キシダーゼ及びラクトフェリンを同時に分離する方法（
特開昭６ｌ−２４６１９８）では、ラクトパーオキシダ
ーゼとラクトフェリンを同一画分中に得ることはできる
ものの、ラクトパーオキシダーゼとラクトフェリンを分
離するには、さらに精製工程を必要としている。また、
カルボキシル基又はスルホン基を導入したデキストラン
で被覆したシリカ粒子を用い、塩濃度勾配によってラク
トパーオキシダーゼとラクトフェリンを系統的に溶出す
る方法（特開平１−８６８３９）も提案されているが、
ラクトパーオキシダーゼとラクトフェリンを完全′に分
離するには、再度クロマトグラフ処理を必要としている
。
一方、スルホン基を導入した多糖類アフィニティ担体に
乳を接触させ、０．３Ｍ食塩を含むｐＨ５〜９の水溶液
又は緩衝液で担体を洗浄した後、１．０Ｍ食塩水でラク
トフェリンを溶出する方法（特開昭６３−２５５３００
）では、ラクトフェリンを一度のクロマトグラフ処理で
得ることができるものの、ラクトフェリンの純度及び回
収率が若干低いという問題点がある。
乳を接触させ、０．３Ｍ食塩を含むｐＨ５〜９の水溶液
又は緩衝液で担体を洗浄した後、１．０Ｍ食塩水でラク
トフェリンを溶出する方法（特開昭６３−２５５３００
）では、ラクトフェリンを一度のクロマトグラフ処理で
得ることができるものの、ラクトフェリンの純度及び回
収率が若干低いという問題点がある。
”しよ゛と る
本発明は、畝上の状況に鑑みなされたものであって、鉄
結合性蛋白質を含有する溶液からラクトパーオキシダー
ゼ及び／又はラクトフェリンを一度のクロマトグラフ処
理によって、効率的、かつ工業的規模で分離、精製し、
これを採取するための方法を提供することにある。
結合性蛋白質を含有する溶液からラクトパーオキシダー
ゼ及び／又はラクトフェリンを一度のクロマトグラフ処
理によって、効率的、かつ工業的規模で分離、精製し、
これを採取するための方法を提供することにある。
晋 ７゛ るための
すなわち、本発明は
（ａ）鉄結合性蛋白質を含有する溶液をスルホン基を導
入した多糖類アフィニティ担体と接触させて鉄結合性蛋
白質を吸着させ、 （ｂ）イオン強度０．２以下でｐＨ５以下の水溶液又は
緩衝液で該担体を洗浄し、 （ｃ）イオン強度０．２〜０．７でｐＨ５以下の水溶液
又は緩衝液で該担体に吸着されたラクトパーオキシダー
ゼを溶出し、 （ｄ）次いで、イオン強度０．５以上でｐＨ５以上の水
溶液又は緩衝液で該担体に吸着されたラクトフェリンを
溶出し、 （ｅ）これらのラクトパーオキシダーゼ及び／又はラク
トフェリンを採取することよりなる、鉄結合性蛋白質含
有溶液から鉄結合性蛋白質のラクトパーオキシダーゼ及
び／又はラクトフェリンを分離、精製し、採取する方法
に関する。
入した多糖類アフィニティ担体と接触させて鉄結合性蛋
白質を吸着させ、 （ｂ）イオン強度０．２以下でｐＨ５以下の水溶液又は
緩衝液で該担体を洗浄し、 （ｃ）イオン強度０．２〜０．７でｐＨ５以下の水溶液
又は緩衝液で該担体に吸着されたラクトパーオキシダー
ゼを溶出し、 （ｄ）次いで、イオン強度０．５以上でｐＨ５以上の水
溶液又は緩衝液で該担体に吸着されたラクトフェリンを
溶出し、 （ｅ）これらのラクトパーオキシダーゼ及び／又はラク
トフェリンを採取することよりなる、鉄結合性蛋白質含
有溶液から鉄結合性蛋白質のラクトパーオキシダーゼ及
び／又はラクトフェリンを分離、精製し、採取する方法
に関する。
本発明では、上記（ａ）処理と（ｂ）処理との間に、イ
オン強度０．１以下でｐＨ５以上の水溶液又は緩衝液で
担体を洗浄する処理を行ってもよい。又、（ｃ）のラク
トパーオキシダーゼ溶出処理と（ｄ）のラクトフェリン
溶出処理とは、前記した（ｃ）（ｄ）の順で処理するほ
か、（ｃ）処理又は（ｄ）処理を行ってラクトフェリン
又はラクトパーオキシダーゼを？岩田し、これを採取し
てもよい。
オン強度０．１以下でｐＨ５以上の水溶液又は緩衝液で
担体を洗浄する処理を行ってもよい。又、（ｃ）のラク
トパーオキシダーゼ溶出処理と（ｄ）のラクトフェリン
溶出処理とは、前記した（ｃ）（ｄ）の順で処理するほ
か、（ｃ）処理又は（ｄ）処理を行ってラクトフェリン
又はラクトパーオキシダーゼを？岩田し、これを採取し
てもよい。
本発明では、まずラクトパーオキシダーゼとラクトフェ
リンにのみ特異的親和性を有するアフィニティ担体を用
いて、実質的にラクトパーオキシダーゼ及びラクトフェ
リン以外の蛋白質を除去し、ラクトパーオキシダーゼと
ラクトフェリンとを吸着させ、−度のクロマトグラフ処
理で分離できるようにする。
リンにのみ特異的親和性を有するアフィニティ担体を用
いて、実質的にラクトパーオキシダーゼ及びラクトフェ
リン以外の蛋白質を除去し、ラクトパーオキシダーゼと
ラクトフェリンとを吸着させ、−度のクロマトグラフ処
理で分離できるようにする。
このようなラクトパーオキシダーゼ及びラクトフェリン
のみに特異的親和性を有するアフィニティ担体として、
ヘパリンセファロース（ファルマシア社製）やブルーセ
ファロース（ファルマシア社製）などあるいはスルホン
基をセルロースに導入したスルホン化セルロファイン（
チッソ社製）やスルホン基をキトサンに導入したスルホ
ン基キトパール（富士紡績社製）などの多″１）Ｈ［ア
フィニティ担体が市販されている。しかし、ヘパリンセ
ファロース、ブルーセファロースなどは、高流速に耐え
られず、高価であって、工業的規模で用いることができ
ない、一方、スルホン化セルロファイン、スルホン化キ
トバールなどは、高流速に耐え、工業的規模での使用に
適している。
のみに特異的親和性を有するアフィニティ担体として、
ヘパリンセファロース（ファルマシア社製）やブルーセ
ファロース（ファルマシア社製）などあるいはスルホン
基をセルロースに導入したスルホン化セルロファイン（
チッソ社製）やスルホン基をキトサンに導入したスルホ
ン基キトパール（富士紡績社製）などの多″１）Ｈ［ア
フィニティ担体が市販されている。しかし、ヘパリンセ
ファロース、ブルーセファロースなどは、高流速に耐え
られず、高価であって、工業的規模で用いることができ
ない、一方、スルホン化セルロファイン、スルホン化キ
トバールなどは、高流速に耐え、工業的規模での使用に
適している。
本発明者らは、ラクトパーオキシダーゼ及びラクトフェ
リン以外の蛋白質の吸着をできるだけ抑制し、かつラク
トパーオキシダーゼ及びラクトフェリンの吸着をできる
だけ向上させるために、これらの多糖類アフィニティ担
体に導入するスルホン基の量が重要であることを見出し
た。
リン以外の蛋白質の吸着をできるだけ抑制し、かつラク
トパーオキシダーゼ及びラクトフェリンの吸着をできる
だけ向上させるために、これらの多糖類アフィニティ担
体に導入するスルホン基の量が重要であることを見出し
た。
担体に導入するスルホン基の量は、担体ｌＩｎ１当り１
０〜５０μｅｑ、好ましくは担体１Ｉｌｉ当り２７〜４
０μｓｑに調整する必要がある。スルホン基導入量が１
０μ０９以下の場合、ラクトパーオキシダーゼ及びラク
トフェリンの吸着量が少なく、従って、回収率が低くな
る。スルホン基導入量が５０μｓｑ以上の場合、ラクト
パーオキシダーゼ及びラクトフェリン以外の蛋白質が吸
着され、純度が低くなる。スルホン基を導入する担体と
しては、セルロファイン（チッソ社製）やキトバール（
富士紡績社製）などがあるが、回収されるラクトパーオ
キシダーゼ及びラクトフェリンの量は、スルホン化キト
バールを用いた場合が最も多い。
０〜５０μｅｑ、好ましくは担体１Ｉｌｉ当り２７〜４
０μｓｑに調整する必要がある。スルホン基導入量が１
０μ０９以下の場合、ラクトパーオキシダーゼ及びラク
トフェリンの吸着量が少なく、従って、回収率が低くな
る。スルホン基導入量が５０μｓｑ以上の場合、ラクト
パーオキシダーゼ及びラクトフェリン以外の蛋白質が吸
着され、純度が低くなる。スルホン基を導入する担体と
しては、セルロファイン（チッソ社製）やキトバール（
富士紡績社製）などがあるが、回収されるラクトパーオ
キシダーゼ及びラクトフェリンの量は、スルホン化キト
バールを用いた場合が最も多い。
次に、イオン強度及びｐＨを調整した溶出溶液を用いて
ラクトパーオキシダーゼとラクトフェリンを分離する。
ラクトパーオキシダーゼとラクトフェリンを分離する。
ラクトパーオキシダーゼとラクトフェリンは分子量及び
等電点が類似しているので、通常行われているようなイ
オン強度の差のみでラクトパーオキシダーゼとラクトフ
ェリンを分離することは不可能である。
等電点が類似しているので、通常行われているようなイ
オン強度の差のみでラクトパーオキシダーゼとラクトフ
ェリンを分離することは不可能である。
まず、イオン強度０．２以下でｐＨ５以下の水溶液また
は緩衝液で該担体を洗浄し、担体の間に詰まっている不
純物を除去する。この際、イオン強度０．２及びｐＨ５
を越えると担体に吸着しているラクトパーオキシダーゼ
が溶出してくるおそれがあるので、イオン強度０．０５
〜０．１５でｐＨ２，５〜４．５で洗浄を行うことが好
ましい。
は緩衝液で該担体を洗浄し、担体の間に詰まっている不
純物を除去する。この際、イオン強度０．２及びｐＨ５
を越えると担体に吸着しているラクトパーオキシダーゼ
が溶出してくるおそれがあるので、イオン強度０．０５
〜０．１５でｐＨ２，５〜４．５で洗浄を行うことが好
ましい。
この洗浄処理に先立ってラクトパーオキシダーゼ及びラ
クトフェリンを吸着した担体をイオン強度０．１以下で
ｐＨ５以上の水溶液又は緩衝液で予備洗浄してもよい、
この洗浄には、水又は温湯を用いてもよい。この予備洗
浄を充分行ってお（とその後の洗浄で使用するイオン強
度０．２以下でｐＨ５以下の水溶液又は緩衝液の液量を
減少させ、節約することができるので、製造コストを考
慮すると有利である。
クトフェリンを吸着した担体をイオン強度０．１以下で
ｐＨ５以上の水溶液又は緩衝液で予備洗浄してもよい、
この洗浄には、水又は温湯を用いてもよい。この予備洗
浄を充分行ってお（とその後の洗浄で使用するイオン強
度０．２以下でｐＨ５以下の水溶液又は緩衝液の液量を
減少させ、節約することができるので、製造コストを考
慮すると有利である。
これらの洗浄に用いる緩衝液は特に限定されるものでは
なく、イオン強度０．２以下でｐＨ５以下の緩衝能があ
るものであれば何れの緩衝液でもよく、酢酸緩衝液、ク
エン酸緩衝液などの有機酸緩衝液或いはグリシン緩衝液
、ジメチルグルタル酸緩衝液などを例示することができ
る。リン酸緩衝液も使用可能であるが、ｐＨ５以下では
緩衝能が低下する。
なく、イオン強度０．２以下でｐＨ５以下の緩衝能があ
るものであれば何れの緩衝液でもよく、酢酸緩衝液、ク
エン酸緩衝液などの有機酸緩衝液或いはグリシン緩衝液
、ジメチルグルタル酸緩衝液などを例示することができ
る。リン酸緩衝液も使用可能であるが、ｐＨ５以下では
緩衝能が低下する。
次に、該担体に吸着しているラクトパーオキシダーゼと
ラクトフェリンとを分離して溶出させる。
ラクトフェリンとを分離して溶出させる。
本発明では特定のイオン強度とｐＨをもつ洗浄液で洗浄
を行い、さらに溶出液として特定のイオン強度とｐＨと
を有する水溶液または緩衝液を用いるので一度のクロマ
トグラフ処理で両者を効率よ（分離し、溶出することが
できる。
を行い、さらに溶出液として特定のイオン強度とｐＨと
を有する水溶液または緩衝液を用いるので一度のクロマ
トグラフ処理で両者を効率よ（分離し、溶出することが
できる。
担体に吸着しているラクトパーオキシダーゼを溶出させ
るには、イオン強度０．２〜０．７でｐＨ５以下、好ま
しくは、イオン強度０．４〜０．６でｐｔｔ２．５〜４
．５の水溶液又は緩衝液を用いる。イオン強度が０．２
以下ではラクトパーオキシダーゼが溶出しないか、溶出
しても極めて少量である。イオン強度が０．７以上にな
るとｐＨが５以下であっても同時にラクトフェリンが溶
出するためラクトパーオキシダーゼの純度が低下し、更
には、ラクトフェリンの回収量も低下する。一方、ｐＨ
が５以上になるとイオン強度が０．２以下でも少量のラ
クトフェリンが同時に溶出するのでラクトパーオキシダ
ーゼの純度が低下する。
るには、イオン強度０．２〜０．７でｐＨ５以下、好ま
しくは、イオン強度０．４〜０．６でｐｔｔ２．５〜４
．５の水溶液又は緩衝液を用いる。イオン強度が０．２
以下ではラクトパーオキシダーゼが溶出しないか、溶出
しても極めて少量である。イオン強度が０．７以上にな
るとｐＨが５以下であっても同時にラクトフェリンが溶
出するためラクトパーオキシダーゼの純度が低下し、更
には、ラクトフェリンの回収量も低下する。一方、ｐＨ
が５以上になるとイオン強度が０．２以下でも少量のラ
クトフェリンが同時に溶出するのでラクトパーオキシダ
ーゼの純度が低下する。
ここで用いる緩衝液も特に限定されるものではなく、酢
酸緩衝液、クエン酸緩衝液等の有機酸緩衝液或いはグリ
シン緩衝液、ジメチルグルタル酸緩衝液などを用いるこ
とができ、イオン強度を高めるために食塩などを添加す
ればよい、このようにして得られたラクトパーオキシダ
ーゼの純度は５０％以上であり、通常は純度８０％以上
のラクトパーオキシダーゼを容易に得ることができる。
酸緩衝液、クエン酸緩衝液等の有機酸緩衝液或いはグリ
シン緩衝液、ジメチルグルタル酸緩衝液などを用いるこ
とができ、イオン強度を高めるために食塩などを添加す
ればよい、このようにして得られたラクトパーオキシダ
ーゼの純度は５０％以上であり、通常は純度８０％以上
のラクトパーオキシダーゼを容易に得ることができる。
また、一方担体に吸着しているラクトパーオキシダーゼ
を溶出した後、イオン強度０．５以上でｐｔｉ５以上、
好ましくはイオン強度０．７〜２．０でｐＨ６〜８の水
溶液または緩衝液でラクトフェリンの溶出を行う。イオ
ン強度が０．５以下ではラクトフェリンの溶出量が少な
く、又、ｐＨが５以下でもラクトフェリンの溶出量が少
ない。
を溶出した後、イオン強度０．５以上でｐｔｉ５以上、
好ましくはイオン強度０．７〜２．０でｐＨ６〜８の水
溶液または緩衝液でラクトフェリンの溶出を行う。イオ
ン強度が０．５以下ではラクトフェリンの溶出量が少な
く、又、ｐＨが５以下でもラクトフェリンの溶出量が少
ない。
ここで用いる水溶液又は緩衝液は特に限定されるもので
はなく、水に食塩を溶解してイオン強度を０．５以上に
調整した水溶液やクエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、マレイ
ン酸緩衝液等の有機酸緩衝液或いはリン酸緩衝液、イミ
ダゾール緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝
液、トリス緩衝液などを例示することができる。このよ
うにして得られたラクトフェリンの純度は７０％以上で
あり、通常は８０％以上のラクトフェリンを得ることが
できる。
はなく、水に食塩を溶解してイオン強度を０．５以上に
調整した水溶液やクエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、マレイ
ン酸緩衝液等の有機酸緩衝液或いはリン酸緩衝液、イミ
ダゾール緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝
液、トリス緩衝液などを例示することができる。このよ
うにして得られたラクトフェリンの純度は７０％以上で
あり、通常は８０％以上のラクトフェリンを得ることが
できる。
これらのラクトパーオキシダーゼのｔ登山処理やラクト
フェリンの溶出処理は、必要に応じてどちらか一方の処
理を行ってもラクトパーオキシダーゼ又はラクトフェリ
ンを高純度に得ることができる。
フェリンの溶出処理は、必要に応じてどちらか一方の処
理を行ってもラクトパーオキシダーゼ又はラクトフェリ
ンを高純度に得ることができる。
最後に、水又は温湯で洗浄し、再生することによって、
再度、担体をラクトパーオキシダーゼ及びラクトフェリ
ンの精製に用いることができるようになる。
再度、担体をラクトパーオキシダーゼ及びラクトフェリ
ンの精製に用いることができるようになる。
これらの吸着及び溶出に用いる反応器は特に限定される
ものではなく、充填層型、流動層型及び攪拌層などを用
いることができるが、高い流速でもチャネリングを起こ
さず、かつ圧密も生じさせない反応器として、回転型カ
ラムが好ましい。
ものではなく、充填層型、流動層型及び攪拌層などを用
いることができるが、高い流速でもチャネリングを起こ
さず、かつ圧密も生じさせない反応器として、回転型カ
ラムが好ましい。
原料となる鉄結合性蛋白質を含有する溶液として、脱脂
乳やホエーを例示することができる。加熱殺菌されたも
のであってもよいが、加熱されることによって、ラクト
パルオキシダーゼが活性を失ったり、ラクトフェリンが
変性するのみならず、他の蛋白質と相互作用して、純度
が低下したり、回収率も低下するため好ましくは未加熱
のものがよい。
乳やホエーを例示することができる。加熱殺菌されたも
のであってもよいが、加熱されることによって、ラクト
パルオキシダーゼが活性を失ったり、ラクトフェリンが
変性するのみならず、他の蛋白質と相互作用して、純度
が低下したり、回収率も低下するため好ましくは未加熱
のものがよい。
上述のようにして得られたラクトパーオキシダーゼ及び
ラクトフェリンは、限外濾過や電気透析等の手段によっ
て脱塩された後、通常の手法で乾燥され、医薬品、食品
その他の用途に供される。
ラクトフェリンは、限外濾過や電気透析等の手段によっ
て脱塩された後、通常の手法で乾燥され、医薬品、食品
その他の用途に供される。
主班東塾来
本発明に従ってラクトパーオキシダーゼ及びラクトフェ
リンを分離採取すると、従来法にみられるように再度ク
ロマトグラフ処理を行ってラクトパーオキシダーゼ及び
ラクトフェリンを分離、精製する必要がなく、工程を簡
略化することができる。すなわち、本発明によれば一回
のクロマトグラフ処理によって、純度８０％以上のラク
トパーオキシダーゼ及びラクトフェリンを回収すること
ができる。更に、限外濾過工程を付することによって、
僅かに含まれる低分子の不純物を除去することができ、
最終的には純度９０％以上のラクトパーオキシダーゼ及
びラクトフェリンを得ることができる。
リンを分離採取すると、従来法にみられるように再度ク
ロマトグラフ処理を行ってラクトパーオキシダーゼ及び
ラクトフェリンを分離、精製する必要がなく、工程を簡
略化することができる。すなわち、本発明によれば一回
のクロマトグラフ処理によって、純度８０％以上のラク
トパーオキシダーゼ及びラクトフェリンを回収すること
ができる。更に、限外濾過工程を付することによって、
僅かに含まれる低分子の不純物を除去することができ、
最終的には純度９０％以上のラクトパーオキシダーゼ及
びラクトフェリンを得ることができる。
このように工程が簡略化できること、純度が高いこ七、
又、回収率が高いことから、生産コストを安価にするこ
とが可能となるばかりでなく感染予防用の食品や医薬品
、貧血予防用の食品や医薬品或いは治療剤として利用す
ることが可能である。
又、回収率が高いことから、生産コストを安価にするこ
とが可能となるばかりでなく感染予防用の食品や医薬品
、貧血予防用の食品や医薬品或いは治療剤として利用す
ることが可能である。
次に本発明の実施例を示す。
実施例１
スルホン基導入１２９．４μｅｑ／ｄ・ゲルのスルホン
化キトバール（富士紡績社製）１ｍ１を１．０Ｃ鵬Ｘ４
．Ｏｃ鋼のカラムに充填し、１００ｊｄの未殺菌脱脂乳
を２４０ｄ／ｈｒの速度で通液した。この脱脂乳中には
ラクトパーオキシダーゼ（ＬＰ）が３＋ａｇ、ラクトフ
ェリン（ＬＦ）が１０■含まれていた０通液後、１００
−の脱イオン水で洗浄し、更に、Ｏ，ＩＭの食塩水を含
み、希塩酸でｐＨを３．５に調整した水溶液５０Ｉｄで
ゲルを洗浄した０次に０．４Ｍ食塩を含む０．０１Ｍフ
タル酸緩衝液（ｐ Ｈ４，５） １００ｄを通液しＬＰ
を回収した。
化キトバール（富士紡績社製）１ｍ１を１．０Ｃ鵬Ｘ４
．Ｏｃ鋼のカラムに充填し、１００ｊｄの未殺菌脱脂乳
を２４０ｄ／ｈｒの速度で通液した。この脱脂乳中には
ラクトパーオキシダーゼ（ＬＰ）が３＋ａｇ、ラクトフ
ェリン（ＬＦ）が１０■含まれていた０通液後、１００
−の脱イオン水で洗浄し、更に、Ｏ，ＩＭの食塩水を含
み、希塩酸でｐＨを３．５に調整した水溶液５０Ｉｄで
ゲルを洗浄した０次に０．４Ｍ食塩を含む０．０１Ｍフ
タル酸緩衝液（ｐ Ｈ４，５） １００ｄを通液しＬＰ
を回収した。
更に、１．０Ｍ食塩を含む０．ＯＩＭりん酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，６）ｌｏａｄを通液し、ＬＦを回収した。カラム
には脱イオン水３００Ｊｄを通液し、再生した。
Ｈ７，６）ｌｏａｄを通液し、ＬＦを回収した。カラム
には脱イオン水３００Ｊｄを通液し、再生した。
このようにして、２．４■のＬＰ及び８．２■のしＦを
回収した。得られたＬＰ及びＬＦの純度はそれぞれ８２
および８５％であった。
回収した。得られたＬＰ及びＬＦの純度はそれぞれ８２
および８５％であった。
実施例２
スルホン基導入量３３μｅｑ／＃！ｌ！・ゲルのスルホ
ン化セルロファイン（チッソ社製）１０ｒｊ！を５００
Ｍｅのビーカーに入れ、未殺菌脱脂乳２００ｄと共に４
０分間室温にて攪拌した。脱脂乳をデカンテーションに
より捨てた後、０．０５Ｍの食塩を含む、０．００５Ｍ
酢酸緩衝液（ｐＨ６，０）でゲルを洗浄後、０．１５Ｍ
食塩を含む０．００５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）で更
にゲルを洗浄した。緩衝液をデカンテーションによって
捨てた後、０．５Ｍ食塩を含む０．００５Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ４，０）５０ｄとゲルを１０分間攪拌し、デカン
テーションによって上澄液４０．ｄを得、この上澄液か
らＬＰを得た０次いで、０．８Ｍ食塩を含み、希カセイ
ソーダでｐＨを８．０に調整した水溶液５０ｄとゲルを
１０分間攪拌し、デカンテーションによって上澄液を得
た。
ン化セルロファイン（チッソ社製）１０ｒｊ！を５００
Ｍｅのビーカーに入れ、未殺菌脱脂乳２００ｄと共に４
０分間室温にて攪拌した。脱脂乳をデカンテーションに
より捨てた後、０．０５Ｍの食塩を含む、０．００５Ｍ
酢酸緩衝液（ｐＨ６，０）でゲルを洗浄後、０．１５Ｍ
食塩を含む０．００５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）で更
にゲルを洗浄した。緩衝液をデカンテーションによって
捨てた後、０．５Ｍ食塩を含む０．００５Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ４，０）５０ｄとゲルを１０分間攪拌し、デカン
テーションによって上澄液４０．ｄを得、この上澄液か
らＬＰを得た０次いで、０．８Ｍ食塩を含み、希カセイ
ソーダでｐＨを８．０に調整した水溶液５０ｄとゲルを
１０分間攪拌し、デカンテーションによって上澄液を得
た。
この繰作を２回繰り返し計７５Ｉｄの上澄液を得、この
上澄液からＬＦを得た。最後に温湯（４０℃）１００−
でゲルを１０分間攪拌した。この操作を５回繰り返しゲ
ルを再生した。
上澄液からＬＦを得た。最後に温湯（４０℃）１００−
でゲルを１０分間攪拌した。この操作を５回繰り返しゲ
ルを再生した。
このようにして、純度８３％のＬＰを３ 、８ｒａｇ
、純度８５％のＬＦを１２．５■回収した。
、純度８５％のＬＦを１２．５■回収した。
実施例３
スルホン暴導入ｆｆ１３８．９μｓｑ／−・ゲルのスル
ホン化キトバール（富士紡績社製）１．１を内容積２．
３１の回転型吸脱着装置に充填した。
ホン化キトバール（富士紡績社製）１．１を内容積２．
３１の回転型吸脱着装置に充填した。
未殺菌チーズホエーをタラリファイヤーに通し、混在し
ていたカードを除去したもの１００１を２００ｊ！／ｈ
ｒの流速で１時間循環した。このチーズホエー中にはＬ
Ｐが約４ｇ、ＬＦが約８ｇ含まれていた０通液後４０ｆ
ｆｉの温湯を通液し、次いで０．１Ｍ食塩を含む０．０
０５ＭクエンｆｌＩ緩衝液（ｐ Ｈ４，０） ２０１で
更にゲルを洗浄した。次に、０．５Ｍ食塩を含む０．０
０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐ Ｈ４，０） ２０１を通液
しＬＰを溶出した。この時のＬＰ純度は８５％であった
。更に、１．０Ｍ食塩水に重炭酸ソーダを添加し、ｐＨ
を６．８に調整した水溶ｆｉ２ｏ ｆを通液しＬＦを溶
出した。この時のＬＰ純度は８５％であった。最後に温
湯（４０°Ｃ）を６０１！、通液しゲルを再生した。
ていたカードを除去したもの１００１を２００ｊ！／ｈ
ｒの流速で１時間循環した。このチーズホエー中にはＬ
Ｐが約４ｇ、ＬＦが約８ｇ含まれていた０通液後４０ｆ
ｆｉの温湯を通液し、次いで０．１Ｍ食塩を含む０．０
０５ＭクエンｆｌＩ緩衝液（ｐ Ｈ４，０） ２０１で
更にゲルを洗浄した。次に、０．５Ｍ食塩を含む０．０
０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐ Ｈ４，０） ２０１を通液
しＬＰを溶出した。この時のＬＰ純度は８５％であった
。更に、１．０Ｍ食塩水に重炭酸ソーダを添加し、ｐＨ
を６．８に調整した水溶ｆｉ２ｏ ｆを通液しＬＦを溶
出した。この時のＬＰ純度は８５％であった。最後に温
湯（４０°Ｃ）を６０１！、通液しゲルを再生した。
得られたＬＰ及びＬＦ溶液は分子量ｃｕｔ−ｏｆｆ ５
０にの限外濾過膜（日東電工ＮＰｔ１３１５０ Ｓ２）
を備えた限外濾過装置（日東電工ＲｔｌＷ−４）で限外
濾過し、更に同装置を用いてダイアフィルトレージョン
して脱塩した。脱塩後、各々凍結乾燥し、ＬＰを３．８
ｇ、ＬＦを７．４ｇ得た。最終的な純度はＬＰで９２％
、ＬＦも同じり９２％であった。
０にの限外濾過膜（日東電工ＮＰｔ１３１５０ Ｓ２）
を備えた限外濾過装置（日東電工ＲｔｌＷ−４）で限外
濾過し、更に同装置を用いてダイアフィルトレージョン
して脱塩した。脱塩後、各々凍結乾燥し、ＬＰを３．８
ｇ、ＬＦを７．４ｇ得た。最終的な純度はＬＰで９２％
、ＬＦも同じり９２％であった。
実施例４
実施例３と同様にチーズホエー１００Ｑを循環通液し、
温湯、続いて０．１Ｍ食塩を含む０．００５Ｍクエン酸
緩衝液でスルホン化キトバールを洗浄した後、炭酸カリ
ウムでｐＨを７．５に調整し、食塩を０．８Ｍ含む水溶
液２０ｆｆｉを通液した。この溶出液を実施例３と同様
に限外濾過して濃縮した後にダイアフィルトレージョン
し脱塩した。凍結乾燥物中にはＬ Ｐ ３．５ｇ 、
Ｌ Ｆ ７．３ｇが含まれていた。
温湯、続いて０．１Ｍ食塩を含む０．００５Ｍクエン酸
緩衝液でスルホン化キトバールを洗浄した後、炭酸カリ
ウムでｐＨを７．５に調整し、食塩を０．８Ｍ含む水溶
液２０ｆｆｉを通液した。この溶出液を実施例３と同様
に限外濾過して濃縮した後にダイアフィルトレージョン
し脱塩した。凍結乾燥物中にはＬ Ｐ ３．５ｇ 、
Ｌ Ｆ ７．３ｇが含まれていた。
手続主甫正書（方式）
％式％
事件の表示 平成１年特許願第２４１３２Ｇ号発明の名
称 鉄結合性蛋白質を分離、精製し、採取する方法 補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 （６６９）雪印乳業株式会社 ４、代理人 住 所 東京都千代田区麹町５丁目４番７、補正の内容 明細書中、発明の名称の欄に「鉄結合性乳蛋白質を分離
、精製し、採取する方法」とあるを「鉄結合性蛋白質を
分離、精製し、採取する方法」と補正する。
称 鉄結合性蛋白質を分離、精製し、採取する方法 補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 （６６９）雪印乳業株式会社 ４、代理人 住 所 東京都千代田区麹町５丁目４番７、補正の内容 明細書中、発明の名称の欄に「鉄結合性乳蛋白質を分離
、精製し、採取する方法」とあるを「鉄結合性蛋白質を
分離、精製し、採取する方法」と補正する。
補正命令の日付
平成１年１２月２６日（発送口）
手続（１ｎ正占
平成２年７月３１、
発明の名称
補正をする者
事件との関係
名
称
鉄結合性蛋白質を分離、精製し、
採取する方法
Claims (5)
- （１）スルホン基を導入した多糖類アフィニティ担体を
用いて、鉄結合性蛋白質を含有する溶液からラクトパー
オキシダーゼ及び／又はラクトフェリンを分離、精製し
、これを採取するに際して、 （ａ）鉄結合性蛋白質を含有する溶液をスルホン基を導
入した多糖類アフィニティ担体と接触させて鉄結合性蛋
白質を吸着させ、 （ｂ）イオン強度０．２以下でｐＨ５以下の水溶液又は
緩衝液で該担体を洗浄し、 （ｃ）イオン強度０．２〜０．７でｐＨ５以下の水溶液
又は緩衝液で該担体に吸着されたラクトパーオキシダー
ゼを溶出し、 （ｄ）次いで、イオン強度０．５以上でｐＨ５以上の水
溶液又は緩衝液で該担体に吸着されたラクトフェリンを
溶出する、 以上の（ａ）〜（ｄ）の処理を順次行うか、あるいは（
ａ）、（ｂ）の処理を行った後（ｃ）又は（ｄ）の処理
を行うことを特徴とする鉄結合性蛋白質含有溶液から鉄
結合性蛋白質のラクトパーオキシダーゼ及び／又はラク
トフェリンを分離、精製し、これを採取する方法。 - （２）スルホン基を導入した多糖類アフィニティ担体を
用いて、鉄結合性蛋白質を含有する溶液からラクトパー
オキシダーゼ及び／又はラクトフェリンを分離、精製し
、これを採取するに際して、 （ａ）鉄結合性蛋白質を含有する溶液をスルホン基を導
入した多糖類アフィニティ担体と接触させて鉄結合性蛋
白質を吸着させ、 （ｂ）イオン強度０．１以下でｐＨ５以上の水溶液又は
緩衝液で該担体を洗浄し、 （ｃ）さらに、イオン強度０．２以下でｐＨ５以下の水
溶液又は緩衝液で該担体を洗浄し、 （ｄ）イオン強度０．２〜０．７でｐＨ５以下の水溶液
又は緩衝液で該担体に吸着されたラクトパーオキシダー
ゼを溶出し、 （ｅ）次いで、イオン強度０．５以上でｐＨ５以上の水
溶液又は緩衝液で該担体に吸着されたラクトフェリンを
溶出する、 以上の（ａ）〜（ｅ）の処理を順次行うか、あるいは（
ａ）〜（ｃ）の処理を順次行った後（ｄ）又は（ｅ）の
処理を行うことを特徴とする鉄結合性蛋白質含有溶液か
ら鉄結合性蛋白質のラクトパーオキシダーゼ及び／又は
ラクトフェリンを分離、精製し、これを採取する方法。 - （３）スルホン基を導入した多糖類アフィニティ担体が
担体１ｍｌ当り１０〜５０μｅｑのスルホン基を導入し
た多糖類アフィニティ担体である請求項（１）又は（２
）に記載の鉄結合性蛋白質のラクトパーオキシダーゼ及
び／又はラクトフェリンを分離、精製し、これを採取す
る方法。 - （４）スルホン基を導入した多糖類アフィニティ担体が
キトサンである請求項（１）〜（３）のいずれかに記載
の鉄結合性蛋白質のラクトパーオキシダーゼ及び／又は
ラクトフェリンを分離、精製し、これを採取する方法。 - （５）鉄結合性蛋白質を含有する溶液が、脱脂乳または
ホエーである請求項（１）〜（４）のいずれかに記載の
鉄結合性蛋白質のラクトパーオキシダーゼ及び／又はラ
クトフェリンを分離、精製し、これを採取する方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1247326A JP2686831B2 (ja) | 1989-09-22 | 1989-09-22 | 鉄結合性蛋白質を分離、精製し、採取する方法 |
| EP90117442A EP0418704B1 (en) | 1989-09-22 | 1990-09-11 | Process of separating, purifying and recovering milk proteins capable of binding iron |
| NZ235325A NZ235325A (en) | 1989-09-22 | 1990-09-14 | Separation, purification and recovery of lactoperoxidase and lactoferrin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1247326A JP2686831B2 (ja) | 1989-09-22 | 1989-09-22 | 鉄結合性蛋白質を分離、精製し、採取する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03109400A true JPH03109400A (ja) | 1991-05-09 |
| JP2686831B2 JP2686831B2 (ja) | 1997-12-08 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1247326A Expired - Fee Related JP2686831B2 (ja) | 1989-09-22 | 1989-09-22 | 鉄結合性蛋白質を分離、精製し、採取する方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0418704B1 (ja) |
| JP (1) | JP2686831B2 (ja) |
| NZ (1) | NZ235325A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| WO2005016373A1 (ja) | 2003-08-15 | 2005-02-24 | Snow Brand Milk Products Co., Ltd. | 骨形成促進剤 |
| JP2008069073A (ja) * | 2006-09-12 | 2008-03-27 | Yokohama Tlo Co Ltd | ラクトフェリン複合体及びその製造方法 |
| WO2008096826A1 (ja) | 2007-02-08 | 2008-08-14 | Snow Brand Milk Products Co., Ltd. | 自己免疫疾患予防剤 |
| JP2012516319A (ja) * | 2009-01-28 | 2012-07-19 | ペローデイン，ジヤン−ポール | ラクトフェリンの製造方法 |
| WO2013051572A1 (ja) | 2011-10-04 | 2013-04-11 | 雪印メグミルク株式会社 | 感覚改善剤 |
| WO2020059600A1 (ja) | 2018-09-20 | 2020-03-26 | 株式会社Ｎｒｌファーマ | 子宮内細菌叢改善用剤及び組成物、ならびに子宮内細菌叢が改善又は正常化された状態の判定方法 |
| EP3756478A1 (en) | 2016-02-04 | 2020-12-30 | Megmilk Snow Brand Co. Ltd. | Food composition for improving cartilage function |
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|---|---|---|---|---|
| NZ249235A (en) * | 1992-01-15 | 1995-12-21 | Campina Melkunie Bv | Isolating lactoperoxidase or lactoferrin from milk and/or milk derivatives |
| JPH05202098A (ja) * | 1992-01-29 | 1993-08-10 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | 乳質原料から生理活性物質の製造法 |
| JP2572931B2 (ja) * | 1993-04-28 | 1997-01-16 | 雪印乳業株式会社 | 美白剤 |
| IT1310354B1 (it) * | 1999-04-09 | 2002-02-13 | Univ Bologna | Metodo per la rimozione totale o parziale della lattoperossidasi daliquidi alimentari e la sua purificazione, mediante l' uso di pectina |
| JP3946747B2 (ja) | 2004-02-17 | 2007-07-18 | 森永乳業株式会社 | ラクトパーオキシダーゼの製造方法 |
| AU2013204858B2 (en) | 2012-10-08 | 2015-06-25 | Saputo Dairy Australia Pty Limited | Improved process for purifying milk proteins and products thereof |
| CZ2013885A3 (cs) * | 2013-11-15 | 2015-08-19 | Univerzita PalackĂ©ho | Způsob separace syrovátkových proteinů z mléčného média a zařízení k provádění tohoto způsobu |
| KR20210091206A (ko) | 2018-11-06 | 2021-07-21 | 아르헬 프로젝티랜제 인 인제나이어링 디.오.오. | 우유, 초유 및 산 또는 스위트 유청으로부터 고도로 정제된 락토페린 및 락토퍼옥시다제를 제조하는 방법 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BE901672A (fr) * | 1985-02-07 | 1985-08-07 | Oleofina Sa | Procede de purification de proteines du lait et de ses derives. |
| FR2616628B1 (fr) * | 1987-06-19 | 1989-09-29 | Entremont Sa | Procede pour extraire des proteines du lactoserum par adsorption et elution |
-
1989
- 1989-09-22 JP JP1247326A patent/JP2686831B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-09-11 EP EP90117442A patent/EP0418704B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-09-14 NZ NZ235325A patent/NZ235325A/en unknown
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005016373A1 (ja) | 2003-08-15 | 2005-02-24 | Snow Brand Milk Products Co., Ltd. | 骨形成促進剤 |
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| WO2013051572A1 (ja) | 2011-10-04 | 2013-04-11 | 雪印メグミルク株式会社 | 感覚改善剤 |
| EP3756478A1 (en) | 2016-02-04 | 2020-12-30 | Megmilk Snow Brand Co. Ltd. | Food composition for improving cartilage function |
| EP3935963A1 (en) | 2016-02-04 | 2022-01-12 | Megmilk Snow Brand Co., Ltd. | Food composition for improving cartilage function |
| WO2020059600A1 (ja) | 2018-09-20 | 2020-03-26 | 株式会社Ｎｒｌファーマ | 子宮内細菌叢改善用剤及び組成物、ならびに子宮内細菌叢が改善又は正常化された状態の判定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0418704B1 (en) | 1993-12-15 |
| JP2686831B2 (ja) | 1997-12-08 |
| NZ235325A (en) | 1992-04-28 |
| EP0418704A1 (en) | 1991-03-27 |
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |