WO2006040816A1

WO2006040816A1 - 飼料用添加剤及びそれを含む飼料

Info

Publication number: WO2006040816A1
Application number: PCT/JP2004/015072
Authority: WO
Inventors: Yukiko Kado; Masami Morotomi
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 2004-10-13
Filing date: 2004-10-13
Publication date: 2006-04-20
Anticipated expiration: 2007-04-13
Also published as: AU2004323928A1; EP1808081A4; EP1808081A1; CA2583765A1; US7736883B2; EP1808081B1; US20070286888A1; AU2004323928B2; CA2583765C

Description

明細書

飼料用添加剤及びそれを含む飼料

技術分野

[0001] 本発明は、馬の飼育管理において、抗生物質投与の副作用による消化管障害を予防及び改善する飼料用添加剤、及びそれを含む飼料に関するものである。

背景技術

[0002] 一般に、家畜動物として飼育管理されて、る代表的なものとしては、牛、豚、馬などが挙げられるが、これらの家畜動物は、飼育環境等の変化によってその発育過程や健康状態に影響を受けやすいため、飼育管理に十分な配慮が必要とされている。例えば、馬の場合には、食事などの飼育環境の変化による種々のストレス状態力誘発される下痢などの身体症状を起こしやすいことが知られている。馬（特に仔馬）は、他の家畜動物に比べて腸内に存在する細菌が少なぐその上、これらの細菌は、飼育環境の変化により極端に減少するため、腸内細菌の生態系を構成する腸内フローラが障害を受け、そのバランスを崩すことにより下痢などの症状を起こす。このような症状は、消化吸収能力の低下、成長阻害及び免疫力の低下等の生理学的機能に悪影響を及ぼすことから、軽種馬生産現場に与える損害は大き、。

[0003] 近年、馬の飼育管理にぉ、て、乳酸菌やビフィズス菌に代表される微生物を生菌で含有する飼料が広く利用されている（例えば、特許文献 1一 4参照)。これらの飼料は、含有される微生物が馬の腸内に付着することにより、腸内フローラを改善し、発育促進、下痢改善等の生理効果を期待するものである。

し力しながら、これらの飼料を使用しても投与した微生物が馬の腸内に付着及び増殖しないため、下痢などの身体症状の改善効果を十分に発揮できない場合が多ぐ実際には症状に応じて各種抗生物質を投与しているのが現状である。

[0004] 投与される抗生物質は、馬の身体症状を効果的に改善するものであるが、同時に馬の腸内に存在する細菌を死滅させる等の影響を与え、逆に下痢症状の悪ィ匕等の副作用を引き起こす原因となることが多い。また、これらの抗生物質は、馬の腸内に存在する細菌だけでなぐ飼料等により別途投与される有用微生物も死滅させるため、有用微生物を生菌で含有する飼料を馬に投与した場合であっても、投与した微生物の十分な効果を得ることなぐ逆に下痢などの消化管障害を引き起こす身体症状の改善効果も低!、ものであった。

[0005] このことから、馬の飼育管理上で使用する微生物含有飼料においては、腸内環境を改善する効果を有する乳酸菌やビフィズス菌等の微生物を単に選択するだけでは十分ではなぐ馬の消化管上皮への特異的な付着性と増殖活性を示し、馬の腸内環境を改善する優れた効果を有する微生物を選択すること、さらに、馬の身体症状に応じて随時投与する可能性のある各種抗生物質に対して優れた耐性を有する微生物を選択することが必要である。

[0006] 特許文献 1：特開昭 59— 46208号公報

特許文献 2：特許第 3220699号公報

特許文献 3：特表 2001-519144号公報

特許文献 4:特開 2002-58432号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0007] 従って、本発明の目的は、馬の消化管上皮への特異的な付着性及び増殖活性を示すだけでなぐ抗生物質に対して優れた耐性を有し、抗生物質投与の副作用による下痢等の消化管障害の予防及び改善に有効である飼料用添加剤、及びそれを含む飼料を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0008] 本発明者らは、鋭意研究の結果、ラクトバチルス属に属する菌種のうち、馬の胃粘膜上皮細胞への優れた付着性及び増殖活性を有する 5種類の菌株は、馬 (特に仔馬）の下痢予防'改善効果が高ぐまた、その他の菌に比べ抗生物質に対する耐性に優れていることを見出した。

また、それらのラクトバチルス属に属する 5種類の菌株は、優れた抗生物質耐性を示すと共に、同一の属に属するにもかかわらず、それぞれ異なる抗菌スペクトルを有することを知見し、本発明を完成した。

[0009] すなわち、本発明は、（A)ラクトバチルス.イクィ（Lactobacillus equi)の菌体と、（B) ラクトバチルス.サリバリウス（Lactobacillus salivarius)、ラタトバチルス.ロイテリ（ Lactobacillus reuteri)、ラクトノくチノレス'クリスノータス（Lactobacillus crispatus)及びラタトバチルス ·ジョンソニー (Lactobacillus johnsonii)からなる群より選ばれる少なくとも 1種の菌体と、を含む飼料用添加剤を提供するものである。

また、本発明は、（C)セフトリアキソンナトリウム、硫酸カナマイシン、ジヒドロストレブトマイシン、スルファモノメトキシン、バクトラミン、ゲンタマイシン、オフロキサシン、セファロチンナトリウム、アンピシリン、ォキシテトラサイクリン塩酸塩及びベンジルぺ -シリンカなる群より選ばれる少なくとも 1種の抗生物質を更に含む前記飼料用添加剤を提供するものである。

また、本発明は、前記 (C)抗生物質と組合わせて添加するための前記飼料用添カロ剤を提供するものである。

また、本発明は、前記飼料用添加剤を含む飼料を提供するものである。また、本発明は、以下の (ィ）一（二）からなる群より選ばれる少なくとも 1種のラタトバチルス属に属する菌株：（ィ)ラクトバチルス *サリバリウス YIT0479株 (受託番号: F ERM BP— 10095号）；（口）ラクトバチルス ·ロイテリ YIT0480株（受託番号： FER M BP— 10096号）；（ハ）ラクトバチルス 'クリスパータス YIT0481株（受託番号： F ERM BP— 10097号）及び（二）ラクトバチルス 'ジョンソニー YIT0482株（受託番号： FERM BP— 10098号）を提供するものである。

発明の効果

[0010] 本発明によれば、馬の消化管上皮への特異的な付着性及び増殖活性を示すだけでなぐ抗生物質に対して優れた耐性を有し、抗生物質投与の副作用による下痢等の消化管障害の予防及び改善に有効である飼料用添加剤、及びそれを含む飼料が提供される。

図面の簡単な説明

[0011] [図 1]実施例 5の飼料用添加剤の投与群及びコントロール群おける仔馬の軟便の発症率を示した図である。

[図 2]実施例 5の飼料用添加剤の投与群及びコントロール群おける仔馬の重度下痢の発症率を示した図である。発明を実施するための最良の形態

[0012] 本発明の飼料用添加剤は、（A)ラクトバチルス.イクィ（Lactobacillus equi)の菌体と、 (B)ラクトバチルス ·サリバリウス（Lactobacillus salivarius)、ラクトバチルス ·ロイテリ（ Lactobacillus reuteri)、ラクトノくチノレス'クリスノータス（Lactobacillus crispatus)及びラタトバチルス ·ジョンソニー (Lactobacillus johnsonii)からなる群より選ばれる少なくとも 1種の菌体とから構成される。

[0013] 本発明で使用する菌株は、 5種類すベてラクトバチルス属に属し、いずれも馬の糞便から単離された菌株である。単離は、ラクトバチルス属の選択培地として LBS培地を、さら〖こ、非選択培地として MRS培地を使用し、それぞれ嫌気条件下、約 37°Cで培養することによって行われる。単離された菌株は、形態的性質、培養的性質、生理学的性質又は化学分類学的性質等によって特徴付けられる。上記菌株は、ラタトバチルス属に属する菌種の中でも特に馬の胃粘膜上皮細胞への優れた付着性及び増殖活性を示し、並びに抗生物質に対する優れた耐性を有する菌株である。

[0014] (A)ラクトバチルス'ィクイの菌株としては、特に、ラクトバチルス 'イクィ YIT0483 株 (独立行政法人産業技術総合研究所へ 2002年 1月 16日に寄託、微生物受託番号「FERM BP— 10094号」 )が特に付着性及び増殖活性に優れて、る点で好ましい。

[0015] また、 (B)ラクトバチルス属の 4種類の菌株としては、特に、（ィ)ラクトバチルス ·サリバリウス YIT0479株 (独立行政法人産業技術総合研究所へ 2003年 5月 6日に寄託、微生物受託番号「FERM BP— 10095号」）、（口）ラクトバチルス 'ロイテリ YIT 0480株 (独立行政法人産業技術総合研究所へ 2003年 5月 6日に寄託、微生物受託番号「FERM BP— 10096号」）、（ハ）ラクトバチルス 'クリスパータス YIT0481 株 (独立行政法人産業技術総合研究所に 2003年 5月 6日寄託、微生物受託番号「 FERM BP— 10097号」）及び（二）ラクトバチルス 'ジョンソニー YIT0482株（独立行政法人産業技術総合研究所へ 2003年 5月 6日に寄託、微生物受託番号「FER M BP— 10098号」 )がヽずれも抗生物質に対する優れた耐性を有する点で好ましい。

[0016] ここで、上記 (B)ラクトバチルス属の 4種類の菌株である、（ィ)ラクトバチルス 'サリバリウス YIT0479株、（口）ラクトバチルス 'ロイテリ YIT0480株、（ハ）ラクトバチルス 'クリスパータス YIT0481株及び（二）ラクトバチルス 'ジョンソニー YIT0482株は、新たに単離された菌株であるので、以下に (a)形態的性質、（b)培養的性質及び（ c)化学分類学的性質等を示す。なお、本発明の (ィ)一 (二)の 4菌株は、それぞれの菌株の (a)— (c)の性質にお、て、有意な差は見られな!/、。

[0017] (a)形態的性質

本発明の (ィ)一（二)の 4菌株は、いずれも以下の性質を示す。また、上記 (ィ)一（二）の 4菌株のグラム染色像は、いずれも陽性であった。

(1)細菌の形:桿状

(2)細菌の大きさ： 0. 6—0. 8 - 1. 3—3. 5 -m

(3)細菌の多形性：無

(4)運動性:無

(5)胞子:無

グラム染色像によれば、（ィ) L.サリバリウス YIT0479株は、大きさが均一の桿菌であり、（口） L.ロイテリ YIT0480株は、大きさが均一の短桿菌であり、（ハ） L.タリスパータス YIT0481株及び（二） L.ジョンソニー YIT0482株は、大きさが均一の桿菌（やや細ヽ）であることが示される。

[0018] (b)培養的性質 (生育状態）

(1)本発明の (ィ）一（二）の 4菌株の MRS寒天平板培養（37°C、 2日間）による生育状態について以下に示す。

(ィ） L.サリバリウス YIT0479株は、直径 lmm程度の白色スムース球形コロニーを生じる。（口） L.ロイテリ YIT0480株は、直径 2mm程度の白色スムース球形コロニーを生じる。（ハ） L.クリスパータス YIT0481株は、直径 2mm程度の灰白色ラフフラットコロニーを生じる。（二） L.ジョンソニー YIT0482株は、直径 lmm程度の灰白色スムースフラットコロニーを生じる。

(2)本発明の (ィ）一（二）の 4菌株の MRS液体培養（37°C、 24時間）による生育状態については、いずれの菌株にも良好な生育が見られ、静置しておくと沈殿を生じる [0019] (c)化学分類学的性質

(GC含量の測定及び DNA— DNAノヽイブリダィゼーシヨン）

本発明の (ィ）一（二) 4菌株の GC含量の測定、及び同 4菌株と縁菌種の基準株との DNA— DNAハイブリダィゼーシヨンは、以下の方法に従って行う。

GC含量の測定方法は、常法の高速液体クロマトグラフィーを用いた Ezakiらの方法 (文献名： FEMS Microbiol Lett 55, 127— 130、 1990)により行うこと力できる。 ¾J定された本発明の (ィ）一（二） 4菌株の GC含量は、それぞれ 33— 41mol%である。

DNA— DNAノヽイブリダィゼーシヨンは、常法の蛍光標識マイクロプレート法 (文献名： Int J Syst Bacteriol 39, 224—229, 1989)により行うこと力できる。以下の 20株の基準株 (全てラクトバチルス (Lactobacillus)属）を、本発明の (ィ）一（二) 4菌株と比較するのに使用する。本発明の (ィ)一（二) 4菌株の各々は、相同性が認められた基準株により同定される。

[0020] し acidophilus YIT 0070 (ATTC 4356 ^τ)、し agilis YIT 0253 OCM 1187 ^T)、し

amylovorus YIT 0211 OCM 1126 ^T)、し animalis YIT 0256 OCM 5670 ^T)、し brevis YIT 0076 (ATTC 14869 ^T)、し buchneri YIT 0077 (ATTC 4005 ^T)、し casei YIT 0180 (ATTC 344 ^T)、し coryniformis subsp. coryniformis YIT 0237(JCM 1164 ^T)、し crispatus YIT 0212 (JCM 1185 ^T)、し fermentum YIT 0081 (ATTC 14931 ^T)、し gasseri YIT 0192 (DSM 20243 ^T)、し graminis YIT 0260 (NRIC 1775 ^T)、し johnsonii YIT 0219 OCM 2012 ^T)、し murinus YIT 0239 (JCM 1717 ^T)、し plantarum YIT 0102 (ATTC 14917 ^T)、し reuteri YIT 0197 (JCM 1112 ^T)、し rhamnosus YIT 0105 (ATTC 7469 ^T)、 L. ruminis YIT 0221 (JCM 1152 ^T)、 L. salivarius subsp. salicinius YIT 0089 (ATTC 11742 ^T)及びし salivarius subsp. salivarius YIT 0104 (ATTC 11741^T)。

[0021] 本発明の飼料用添加剤に含まれる菌体は各種抗生物質に対して優れた耐性を有するので、馬の健康管理上必要に応じて、各種抗生物質と混合して混合物として飼料に添加してもよい。また、菌体のみで構成される飼料用添加剤を単独で飼料に添加するだけでなぐ各種抗生物質と組合わせて使用してもよい。このように飼料用添加剤は、馬の身体症状にあわせて各種抗生物質を適宜選択し如何なる場合にも組合わせることができるので、馬の健康管理、身体症状の改善に有効である。

[0022] 本発明で使用する (C)抗生物質としては、馬の健康管理用に一般的に使用される抗生物質でよぐ例えば、仔馬の下痢及び白痢症状等に有用なゲンタマイシン、ォキシテトラサイクリン塩酸塩等、肺炎及び関節炎による各種感染症に有用な硫酸カナマイシン、スルファモノメトキシン、バクトラミン、セフトリアキソンナトリウム、セファロチンナトリウム、オフロキサシン、ジヒドロストレプトマイシン等、及び外傷による感染症予防及び輸送熱予防並びに蓴麻疹予防に有用なベンジルペニシリン、アンピシリン等が挙げられる。

[0023] 上記 (C)抗生物質のうち、ずれを使用するかは、選択された (B)ラクトバチルス属の種類に応じて決定される。例えば、硫酸カナマイシン、スルファモノメトキシン、及びノ《クトラミン等は、（B)ラクトバチルス属の 4種菌株の、ずれに対しても使用することができる。また、オフロキサシンは、（B)ラクトバチルス 'ロイテリ、ラクトバチルス 'クリスパ一タス及びラクトバチルス 'ジョンソニーに対して使用することができる。さらに、セファロチンナトリウム、ォキシテトラサイクリン塩酸塩、ベンジルペニシリン及びアンピシリン等は、（B)ラクトバチルス ·ロイテリに対して使用することができる。

[0024] 次に、飼料用添加剤の製造方法について示す。

飼料用添加剤は、（A)ラクトバチルス 'ィクイの菌株と、（B)ラクトバチルス ·サリバリウス、ラクトバチルス 'ロイテリ、ラクトバチルス 'クリスパータス及びラクトバチルス'ジョンソニー力もなる群より選ばれる少なくとも 1種の菌株とをそれぞれ培養し、培養した菌体を回収し、 (A)菌体と (B)菌体とを混合することにより製造される。

上記培養及び回収は通常の方法で行うことができる。使用する培地としては、ラクトバチルス属細菌の増殖可能な MRS broth (Difco Laboratories社製）培地、 GAM broth (日水社製)培地などが挙げられる。培養条件はいずれの菌株も 37°Cで 12— 2 0時間である。菌体の回収には通常使用される遠心分離等の手段を用いることができる。得られた飼料用添加剤は、用途に応じて適当な形態にすればよい。

[0025] 上記製造方法では、菌株によって増殖の程度が異なるため、上記培地以外に、それぞれの菌株に最適な培地を選択して培養することが望ましい。例えば、ラタトバチルス.ロイテリ YIT0480株には、 PSYL培地 [組成： 20%PSM*)5%、ミースト P2G ( 日本製薬社製） l%、CH COONa (和光社製) 0. 3%、（NH ) SO (和光社製) 0.

3 4 2 4

3%、 KH PO (和光社製) 1%、 K HPO (和光社製) 0. 2%、 Met sol**)0. 5%]が

2 4 2 4

好ましい。

*):脱脂粉乳（四つ葉社製) 200g、オリエンターゼ 5N (阪急バイオ社製) 4gZlL **^}: MgSO · 7Η O 115g、 FeSO · 7Η Ο 6. 8g、 MnSO · 7Η Ο 24g (和光社製

4 2 4 2 4 2

) /lL

[0026] また、菌株の増殖性を向上させる手段として、必要に応じて、資化性糖を培地に添加することが望ましい。例えば、ラクトバチルス 'イクィ YIT0483株及びラクトバチルス.クリスパータス ΥΓΓ0481株には、培地に資化性糖としてラタトースを添加することが好ましい。また、ラクトバチルス 'サリバリウス YIT0479株及びラクトバチルス 'ジヨンソニー YIT0482株には、培地に資化性糖としてグルコースを添加することが好ましい。

本発明では、使用する培地は上記に限られるものではなぐ一般に使用される培地に含まれる組成を適宜組合わせて各菌株に最適な培地を作製したものを用いてもよい。

[0027] 本発明の飼料用添加剤では、使用する菌体が生菌体であることが望ましぐ生菌体であればいかなる状態のものでもよい。例えば、各菌株の培養回収菌体、培養物、凍結乾燥菌体等が挙げられる。なかでも、生菌体の保存性が高い凍結乾燥菌体を使用することが望ましい。なお、死菌体は、馬に投与した時の下痢などの消化管障害の予防及び改善や、早期腸内フローラ形成促進等の生理効果が低いため好ましくない。

[0028] 本発明の飼料用添加剤は、馬の胃粘膜上皮細胞への優れた付着性及び増殖活性を示し、並びに抗生物質に対する優れた耐性を有する。これにより、この飼料用添加剤は、早期の腸内フローラ形成により下痢等の馬の消化管 (特に腸管）障害を早期に予防及び改善すると共に、予防及び改善された馬の消化管内環境が、馬の健康管理上必要に応じて使用される上記 (C)抗生物質の影響を受けることなく良好に維持され、種々のストレス力誘発される馬の身体症状を効果的に改善することができる。さらに、本発明では、特に (A)ラクトバチルス'ィクイの菌体と、（B)ラクトバチルス属の 4種類の全ての菌体とを含む飼料用添加剤は、上記のような馬の身体症状の改善効果が顕著であるので好まし、。

[0029] 本発明の飼料用添加剤の投与量は、馬一頭に対して 1日あたり上記 (A)と（B)との菌体総数として 1 · 10⁹個以上、好ましくは 1 · 10¹。個一 5 · 10¹。個投与することが望ましい。 1日の投与量が 1 · 10⁹個より少ない場合には、馬の身体症状に十分な改善効果が得られないため好ましくない。さらに、投与する飼料用添加剤における各種菌株の菌体数割合は、該飼料用添加剤に含有させる菌株の組合わせによって任意に調整することが可能であるが、（Α)ラクトバチルス 'イクィを菌体総数の 5%— 25%、好ましくは 10%— 20%の範囲で含有させることにより、馬の身体症状改善に顕著な効果を有する。

[0030] また、本発明の飼料用添加剤の馬への投与方法は、特に限定されるものではなぐ注射器などを用いて直接馬の腸内に投与してもよぐ各種糖質、タンパク質、脂質、繊維質、ビタミン類、及びミネラル類などと共に、常法により粉剤、錠剤、顆粒剤、ぺレットなどの製剤にして経口投与してもよ!/、。

[0031] 本発明は、これらの飼料用添加剤と、他の成分、例えば脂質や繊維質等とを含有する飼料を提供する。脂質や繊維質としては、飼料成分として一般的に使用可能なものであればいずれでもよぐ例えば、大豆粕、アルファルファミール、及びふすま等が挙げられる。本発明の飼料を馬に投与することにより、消化管障害の予防及び改善され、飼料効率を向上させることができるので軽種馬経営上好まヽ。

実施例

[0032] 以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

[0033] <製造例 1 >

(各菌株の菌体の製造）

下記表 1に示す組成の培地を、 5Lコルベン〖こ 4. 5Lずつ作製し、 ρΗを 6. 8に調整後、高圧加熱殺菌した。次いで、下記表 1に示す (Α)及び (Β)ラクトバチルス属の 5 種類の菌株の前培養菌体のクレット値を測定し、クレット 300に希釈した菌液 450ml を前記培地に植菌し、 37°C、 16時間静置培養して培養液を得た。この培養液を 1, 5 00 'Gで遠心分離し、 5種菌株の菌体をそれぞれ集菌した。各菌株の菌体の 4. 5Lあたりの集菌量 (湿重量）は表 1の通りである。

[0034] [表 1]

9 4 g

g

*)： (脱脂粉乳（四つ葉） 200g、オリタ-セ、、 (阪急バイォ） 4g) / 1 L

* *'： (MgS04-7H₂0 115g、 FeS〇 '7H₂0 6.8g、 MnS04-7H₂0 24g)/ l L

[0035] <実施例 1 >

(増殖活性試験及び馬の胃粘膜上皮細胞に対する菌体の付着性試験）

10%スキムミルク（SM)、 0. 1%酵母抽出物（Difco社製） + 10%スキムミルク (YE) 、0. 1%ペプトン（Difco社製） + 10%スキムミルク（P)及び 0. 1%酵母抽出物（Difco 社製） +0. 1 %ペプトン（Difco社製） + 10%スキムミルク（YP)の 4種類の培地を 115 °Cで 15分間高圧加熱滅菌した後、それぞれの培地 3mlに前記製造例 1で得られた（ A)及び (B)の 5種類の菌株の各菌体培養液を 30 · 1 (各菌株の菌体数：約 3 · 10⁸個 Zml)ずつ接種し、 37°Cで 24時間及び 48時間培養した。増殖活性試験は、増殖した菌体により培養液が完全に凝固しているものを〇、菌体は僅かに増殖したが培養液が半流動状態のものを△、菌体が増殖せずに培養液が液状のままのものを'とした判断基準に基づいて、判定を行った。

[0036] また、前記製造例 1で得られた (A)及び (B)の 5種類の菌株の各菌体培養液 3ml ( 各菌株の菌体数:約 3 · 10⁸個/ ml)に馬から採取した胃粘膜上皮組織片 lcm²を入れ、 37°Cで振とう培養した後、この胃粘膜上皮組織片を緩衝液 (組成: 0. 8%NaCl; 0. 121%K ΗΡΟ ;0. 034%ΚΗ ΡΟ ； ρΗ7. 2)で数回洗浄して、実体顕微鏡下で

2 4 2 4

胃粘膜上皮組織片から胃粘膜上皮細胞を搔き取り、ギムザ染色を行った。これを用

Vヽて顕微鏡下で一つの胃粘膜上皮細胞に付着した各菌株の菌体数を測定し、付着性を判定した。表 2にその結果を示す。

[0037] [表 2]

表 2 ：増殖活性及び付着性

+ +： 1つの胃粘膜上皮細胞に 1 0 ~ 9 9個の菌が付着したもの

+： 1つの胃粘膜上皮細胞に 1 ~ 9個の菌が付着したもの

[0038] 表 2の結果から、本発明で使用する (A)及び (B)ラクトバチルス属の 5種類の菌株の各菌体は、各培地条件において優れた増殖活性を示すと共に、馬の胃粘膜上皮細胞に対しても良好な付着性を示す。また、 5種菌株の中でも、 (A) L.ィクイ YITO 483株が他の（B)の 4種菌株に比べて増殖活性及び馬の胃粘膜上皮細胞への付着性に優れていることが認められた。なお、増殖活性試験において、僅かに増殖したが培養液が半流動状態（△判定)のものはなかった。

[0039] <実施例 2 >

(抗生物質耐性試験）

下記表 3に示された各抗生物質（11種類)を 100、 10、 1、0. 1及び O'gZmlの濃度となるようにそれぞれ添加して MRS寒天培地 (Difco社製)を作製した。次に、製造例 1で得られた (A)及び (B)の 5種類の各菌株の菌体培養液を、それぞれの抗生物質含有 MRS寒天培地に 10·1ずつ接種し (各菌株の菌体数:約 1 · 10⁸個 Zml)、嫌気条件下で 37°C、 48時間塗抹培養した。増殖した菌を肉眼で判定し、各抗生物質に対する最小発育濃度（ · gZml)を求めた結果を表 3に示す。 [0040] [表 3]

[0041] 表 3の結果から、 (A)及び (B)ラクトバチルス属の 5種類の各菌株は、、ずれも各種抗生物質、特に硫酸カナマイシン、スルファモノメトキシン、ジヒドロストレプトマイシン、バクトラミンなどに優れた耐性を示した。特に、 L.イクィ株はセフトリアキソンナトリウムに、 L.ジョンソニー株はゲンタマイシンに、 L.ロイテリ株、 L.クリスパータス株及び L.ジョンソニー株はオフロキサシンに、それぞれ特異的に優れた耐性を示していた。このように、用いた 5種類の各菌株は、同属に属するにもかかわらず、それぞれ異なる抗菌スペクトルを示した。 L.ロイテリ株は 5種類の菌株の中でもとりわけ耐性に優れ、特にセファロチンナトリウム、ォキシテトラサイクリン塩酸塩及びアンピシリンに対して優れていた。また、このしロイテリ株は、他の 4種類の菌株よりもベンジルペニシリンに対して耐性が強、ので、ベンジルペニシリンを使用する場合に特に有用である。

[0042] また、（A) L.ィクイ YIT0483株と（B)ラクトバチルス属の 4種類の菌株カも選ばれる 1種以上の菌株とを組合わせた菌体培養液を用いて、抗生物質存在下での増殖活性試験を行った。

[0043] (増殖活性試験 1)

抗生物質としてォキシテトラサイクリン塩酸塩を 10、 5、 2及び O'gZmlの濃度となるようにそれぞれ添加した MRS寒天培地 (Difco社製)を作製した。次に、製造例 1で得られた (A) L.イクィ株単独の菌体培養液と、 (A) L.イクィ株及び (B) L.ロイテリ株の混合菌体培養液とを、それぞれの抗生物質含有 MRS寒天培地に 10 · 1ずつ接種し（各菌体数:約 1 · 10⁶個 Zml)、嫌気条件下で 37°C、 48時間塗抹培養した後、菌の増殖活性を肉眼で判定した。

[0044] (増殖活性試験 2)

抗生物質としてゲンタマイシンを 100、 50、 20及び O'gZmlの濃度となるようにそれぞれ添加した MRS寒天培地 (Difco社製)を作製した。次に、製造例 1で得られた（ A) L.イクィ株単独の菌体培養液と、 (A) L.イクィ株及び (B) L.ジョンソニー株の混合菌体培養液とを、それぞれの抗生物質含有 MRS寒天培地に 10 · 1ずつ接種し (各菌体数:約 1 · 10⁶個 Zml)、嫌気条件下で 37°C、 48時間塗抹培養した後、菌の増殖活性を肉眼で判定した。

[0045] (増殖活性試験 3)

抗生物質としてオフロキサシンを 100、 50、 20及び O'gZmlの濃度となるようにそれぞれ添加した MRS寒天培地 (Difco社製)を作製した。製造例 1で得られた (A) L. イクィ株単独の菌体培養液と、 (A) L.イクィ株及び (B) L.ジョンソニー株又は (A) L .イクィ株及び (B) L.クリスパータス株の混合菌体培養液とを、それぞれの抗生物質含有 MRS寒天培地に 10·1ずつ接種し (各菌体数:約 1 · 10⁶個 Zml)、嫌気条件下で 37°C、 48時間塗抹培養した後、菌の増殖活性を肉眼で判定した。

以上の増殖活性試験 1一 3の結果を表 4 1一 3に示す。

[表 4] 表 4—1

結果の判定基準：

〇：十分な増殖の確認ができたもの

厶：やや少な、が増殖の確認ができたもの

X ：増殖の確認ができなかったもの

表 4-1一 3の結果から、抗菌スペクトルの異なる (A)ラクトバチルス'ィクイ YIT04 83株と（B)ラクトバチルス属の 4種類の菌株から選ばれる 1種以上の菌株とを組合わせた菌体培養液を用いれば、抗生物質存在下でも優れた増殖活性を有することが認められた。 [0048] <製造例 2 >

(凍結乾燥菌体の製造）

製造例 1により得られた (A)及び (B) 5種類の菌株の菌体培養液を、それぞれ ION 水酸ィ匕ナトリウムで PH6. 8-7. 0に調整した。次いで、 5,000回転で 10分間遠心して上清を除去後、残った菌体に分散媒 (組成:スキムミルク 20%、及びトレハロース 2 0%水溶液)を 8%の割合で添加して均一化した。次いで、— 30°C、 3時間の予備凍結の後、常法に従い凍結乾燥処理をした。凍結乾燥後の重量を測定し、等量の乾燥澱粉を加えて 4°Cで保存した。

[0049] <実施例 3 >

(早期腸内フローラ形成促進効果）

出生直後の 6頭のサラブレッド種仔馬に、製造例 2で得られた凍結乾燥菌体 5g ( (A )及び (B)ラクトバチルス属の 5種菌株を生菌体総数で 3. 8 · 10^ω個 /5g含有する）を 5%ブドウ糖 50mlに溶解したものを毎日計 7回経口投与した。出生後 1、 2、 3、 5、 7及び 14日毎に直腸便を採取し、希釈液を加えて均一化した後、さらに適宜希釈し、 LBS寒天培地（Becton Dickinson社製）に接種し、嫌気条件下 37°Cで 4日間培養し、増殖したコロニー数と希釈率から直腸便の乳酸桿菌数を算出した。コントロールとして、凍結乾燥菌体を投与しない 6頭の仔馬からも同様に直腸便の乳酸桿菌数を算出した。なお、表 5には、（乳酸桿菌が検出された仔馬数) Z (調べた全ての仔馬数） • 100から算出された検出率 (％)を示す。

[0050] [表 5]

表 5

[0051] 表 5の結果から、投与群では、投与 5日目で全ての仔馬の腸内に乳酸桿菌の付着が確認され、コントロール群より 2日も早い腸内フローラ形成促進効果が認められた。

[0052] <実施例 4 >

(下痢の改善効果検討 1)

上記実施例 3と同様の試験を出生直後の仔馬 54頭 (コントロール群 27頭、投与群 27頭）において実施し、出生 30日目までの下痢の発生を観察した。下痢は、肉眼的に軟便、軽度下痢 (下痢便を排泄するが、回数が少なく肛門附近の付着性が僅かなもの)及び重度下痢 (悪臭のある水様性の下痢を何度となく排泄し、肛門から臂部に力けて多量の下痢便を付着して!/、るもの）の 3段階として、それぞれの発症率 (％)を表 6に示す。

[0053] [表 6] 表 6

* ：治療処置率 = (治療を受けた仔馬数） / (調べた全ての仔馬数） X 1 0 0

**：抗生物質使用率二（抗生物質を投与した仔馬数） / (調べた全ての仔馬数） X 1 0 0

[0054] 表 6の結果から、軟便の発症率は、 3週目に投与群で有意に低い値となった。また、軽度下痢、重度下痢の発症率については、 3週目以降に投与群で有意に低い傾向が見られ、特に、重度下痢の発症は、投与群では全く見られず、 4週目では、治療処置及び抗生物質の投与もしなくても良いほど改善の効果が見られた。

[0055] <実施例 5 >

(下痢の改善効果検討 2)

22頭のサラブレッド種仔馬に、製造例 2で得られた凍結乾燥菌体 5g ( (A)及び (B) ラクトバチルス属の 5種菌株を生菌体総数で 1. 4· 10^1Q個 /5g含有する）を 5%ブドウ糖 50mlに溶解したものを 1日目一 7日目の投与期間に、 1日当たり計 7回経口投与した。 0日目（投与なし)から 14日目までの下痢の発生を観察した。コントロールとして、凍結乾燥菌体を投与していない 6頭の仔馬についても下痢の発生を観察した。下痢は、肉眼的に軟便、重度下痢 (悪臭のある水様性の下痢を何度となく排泄し、肛門カ臂部にかけて多量の下痢便を付着しているもの）の 2段階とした。軟便の発症率 ( %)を図 1に、重度下痢の発症率 (％)を図 2にそれぞれ示す。

[0056] 図 1及び図 2の結果から、軟便の発症において、投与群ではコントロール群と比較して投与 6日目で顕著に減少する傾向が見られた。また、下痢の発症において、コントロール群では発症していた下痢症状が、投与群では投与 5日目以降全く確認されなかった。産業上の利用の可能性

本発明によれば、馬の消化管上皮への特異的な付着性及び増殖活性を示すだけでなぐ抗生物質に対して優れた耐性を有し、抗生物質投与の副作用による下痢等の消化管障害の予防及び改善に有効である飼料用添加剤、及びそれを含む飼料の提供が可能となる。そして、本発明は家畜動物の飼育、特に馬の飼育管理には有用である。

Claims

22 請求の範囲

[1] (A)ラクトバチルス ·ィクイ（Lactobacillus equi)の菌体と、

(B)ラクトバチルス'サリバリウス（Lactobacillus salivarius)、ラクトバチルス.ロイテリ（ Lactobacillus reuteri)、ラクトバチノレス'クリスノヽータス（Lactobacillus crispatus)及びラクトバチルス.ジョンソニー（Lactobacillus johnsonii)力なる群より選ばれる少なくとも 1種の菌体と、

を含む飼料用添加剤。

[2] (C)セフトリアキソンナトリウム、硫酸カナマイシン、ジヒドロストレプトマイシン、スルファモノメトキシン、パクトラミン、ゲンタマイシン、才フロキサシン、セファロチンナトリウム、アンピシリン、ォキシテトラサイクリン塩酸塩及びべンジルペニシリンからなる群より選ばれる少なくとも 1種の抗生物質を更に含む請求項 1記載の飼料用添加剤。

[3] 前記 (C)抗生物質と組合わせて添加するための請求項 1記載の飼料用添加剤。

[4] 請求項 1な！、し 3の！/、ずれかに記載の飼料用添加剤を含む飼料。

[5] 以下の (ィ）〜（二)からなる群より選ばれる少なくとも 1種のラクトバチルス属に属する菌株：

(ィ）ラタトパチルス 'サリバリウス YIT0479株 (受託番号: FERM BP— 10095号）

(口）ラクトバチルス.ロイテリ YIT0480株 (受託番号: FERM BP— 10096号）； (ハ）ラクトバチルス 'クリスパ一タス YIT0481株（受託番号: FERM BP— 10097 号)及び

(二）ラクトバチルス'ジョンソ-— YIT0482株 (受託番号: FERM BP— 10098号

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差替"え用紙（規則' 26)