WO2006048256A1 - Verfahren und vorrichtungen zur bearbeitung einzelner biologischer zellen - Google Patents

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biological
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Günter FUHR
Hagen Thielecke
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/04—Mechanical means, e.g. sonic waves, stretching forces, pressure or shear stimuli

Definitions

  • the invention relates to methods for processing a biological cell with the features of the preamble of claim 1. Furthermore, the invention relates to devices for carrying out such methods and their uses.
  • the fusion bio ⁇ represents logic cells.
  • the cell membranes of adjacent cells are chemically To carry out a fusion (eg., By 'certain substances or viruses) or electrically (eg. As a high voltage pulse) is interrupted and so newly melted or annealed, that cell components of the einzel ⁇ nen cells in a common, closed cell membrane is included. Own the conventional fusion techniques the disadvantage 'that an exact and defined cell fusion between two predetermined cells is not available.
  • WO 2004/074426 discloses a method for gentle processing of cell material with a plurality of biological cells, in which a probe is moved through the cell material in such a way that the cells are displaced by the probe.
  • the control of the probe described in WO 2004 / .074426 avoids injuries to the cells. Invasive interventions in the cells, however, are not provided in this technique.
  • the object of the invention is to provide improved methods for processing biological cells, in particular of individual cells, cell pairs or cell groups, with which the disadvantages of the conventional techniques can be overcome and which in particular can be achieved by careful handling of the cell material , a high reliability and accuracy and a high yield.
  • the object of the invention is also to provide improved devices for implementing such methods.
  • the invention is based on the general technical teaching for processing a biological cell with a cell membrane, which in particular envelops the cytoplasm and a cytoskeleton, to move the cell and a tool relative to each other and to interrupt the cell membrane of the cell by action of the tool , Wherein during the relative movement of the tool and the cell whose Zy ⁇ toskelett is in a stable equilibrium.
  • the method according to the invention achieves an in ⁇ vasive intervention in the cell, while the cytoskeleton is mechanically in a state in which it is essentially free of external mechanical stresses and in which the structural and functional relationship between see the cell membrane and internal cell components and the functioning of the internal cell components are preserved. Furthermore, the cell membrane is also in the stable equilibrium during the movement of the tool. During and after the invasive intervention in the cell, the ability to metabolism and thus the viability of the cell or at least a part of the cell is maintained.
  • the relative movement of the tool and the cell is slow so that the cytoskeleton and the cell membrane, which are constantly undergoing a molecular remodeling process, can adapt at all times to the geometric conditions imposed by the surface of the tool, in particular a working surface of the tool , given are.
  • the components of the cytoskeleton which in particular contain filaments of the proteins actin and tubolin and the protein myosin, and keep the nucleus and the other cell constituents relative to one another, have sufficient time during the tool movement for a rearrangement on the cell membrane and / or the ar- working surface of the tool.
  • the method according to the invention therefore advantageously makes it possible for the cell to remain closed by the cell membrane or the working surface of the tool during a cell processing. An invasive procedure in the cell is made possible without causing large, harmful or irreversible cell openings.
  • the inventors have found that individual adherent cells, although in principle they can avoid the slow effects of external probes by their own motion (see WO 2004/074426), can be deformed by a slowly moving tool until the cell membrane is disrupted and surprisingly remain viable. It is particularly advantageous that the processed cell remains closed to the environment during the entire period of manipulation.
  • disruption of the cell membrane is generally understood as meaning any disturbance of the molecular composite of the membrane, in particular composed of phospholipids and proteins, in which molecules which were initially arranged adjacently in the intact membrane are separated from one another by the external action of the tool.
  • the disruption of the cell membrane results in an opening of the cell membrane, at which the inner cell constituents come into contact with the working surface of the tool or other materials in the cell environment, such as other cells or cell constituents or other substances.
  • any change in location of the tool and / or the cell is designated here, which leads to a change in the relative coordinates of the tool and the cell.
  • the method according to the invention is preferably carried out outside the body of an organism. and the cell to be processed is preferably arranged adhesively on a substrate, the relative movement is achieved by at least one of the following movements: movement of the tool, movement of the cell, in particular with the substrate, and movement of both parts.
  • the movement of the tool can be superposed with a tracking movement with which an egg movement of the cell on the substrate is compensated. If, in the following, reference is generally made to the movement of the tool, all the other movements mentioned here, in particular also of the substrate, are included.
  • the movement of the tool takes place at a speed which is less than or equal to the rearrangement speed of the cytoskeleton.
  • the rate of rearrangement is used herein to denote the speed at which parts of the cytoskeleton, such as, for example, characteristic filament structures, due to the ongoing molecular reorganization process of the cell.
  • the transposition speed corresponds, for example, to the speed with which, in the case of an adherently arranged cell, an outer edge of the cytoskeleton moves relative to a substrate.
  • the rearrangement rate is a cell-specific variable which can be easily determined by a measurement in a preliminary experiment (see, for example, BB Alberts et al., In “Molecular Biology of the Cell", Wiely VCH Verlag, Weinheim, 2004, P. Geggier et al. 68, 1999, pp. 505-513, AR Bausch et al., Biophys, J., Vol. 76, 1999, pp. 573-579, TJ Mitchison et al., Appl in "Cell", Vol. 84, 1996, pp. 371-379).
  • Advantages for adjusting the tool speed can result according to a further embodiment of the invention if the movement of the tool takes place at a speed which is less than or equal to a migration speed of adherent cells on a surface.
  • This migration speed can be determined in a preliminary test under the specific working conditions on the cell to be processed. The inventors have stated that the physiological migration rate of the cell is directly related to the above-mentioned rate of rearrangement of the cytoskeleton and can thus be used as a reference for tool movement.
  • the tool is moved at a speed which is less than 500 ⁇ m / h, in particular less than 300 ⁇ m / h.
  • the o. G. Conditions for most fits ⁇ the cell types, such. As fibroblasts, macrophages or cancer cells met, so that, for example, preliminary tests or table values can be dispensed with.
  • the biological cell is arranged on the solid surface of a planar substrate and the tool is moved relative to the substrate, advantages for the cooperation of the tool and the substrate can result.
  • the fixed surface forms a support for generating a counteracting force during the advancing movement of the tool.
  • the propelling movement of the tool relative to the substrate preferably comprises at least one of two phases, by means of which the structure formation during and after the cell processing according to the invention is positively influenced.
  • an approximation phase the tool is moved to the substrate and the cell between the tool and the substrate is deformed and pinched.
  • a translation phase the tool is moved essentially parallel to the surface of the substrate. In this phase, the rearrangement of the cell membrane is promoted.
  • the mentioned types of movement corresponding to the approach and translation phases can be realized individually, in combination successively or in combination simultaneously.
  • a separation of the cell is provided in at least two cell body as in a punching operation.
  • the cell processing according to the invention may further comprise, for example, alone a movement of the tool parallel to the substrate surface.
  • the tool is first placed next to the cell to be processed on the substrate surface.
  • the tool contacts or when placed in a first advancing movement of an edge of the cell and is then according to the method of the invention passes through the cell, divided into this- example. • two cellular bodies is.
  • the substrate surface in this embodiment of the invention forms a guide for the tool movement.
  • Cell membrane and with these parts of the cytoplasm and the cytoskeleton un ⁇ terzogen a deformation, compression and / or elongation.
  • this can promote the interruption of the cell membrane with the formation of new forms of the cell or cell components after the invasive procedure was ⁇ .
  • a healing of the disruption occurs. tion of the cell membrane so that the cell membrane remains closed.
  • the healing can take place as a spontaneous healing, in that the cell membrane closes when the tool is at rest under the effect of the surface tension, or is promoted by a directed movement of the tool.
  • the cell is closed by healing and thus continues to be viable without contact with the working surface.
  • an impurity such as, for example, a marker
  • Embodiments of the invention are characterized in that the tool after processing of the cell, for. B. remains after the separation of the cell in at least two cell body further in contact with the surface of the substrate. A tool used for separation rests on the substrate surface, so that advantageously a mechanical wall is formed between the cell bodies.
  • a feature of the invention which is particularly important for the application of the method according to the invention in cell biology is that the cell membrane after healing has a different shape, composition and / or size than before Formation of the interruption.
  • the cell after healing is separated into at least two cell bodies, each of which has a topologically closed form.
  • the inventive method leads to a constriction of ZeI- Ie, so that the separate cell body are formed.
  • Cell bodies can be used as starting materials for further cultivations, processing or examinations and offer the advantage of being separated from a common precursor cell. It is particularly preferred if one of the separated cell bodies is coreless. In this case, the respective other cell body is fully viable with the cell nucleus, while the coreless cell body may also exhibit metabolic activity as long as ATP is produced by the mitochondria contained in it. The coreless cell body can then be subjected to an investigation, for example, in order to determine the material properties of the other cell body without accessing it directly.
  • Cell membrane after healing with a foreign cell membrane of another biological cell forms at least one topolo ⁇ gisch closed cell body.
  • Be ⁇ particularly preferred in this case is the fusion or pairing of cells, in which the first cell with at least one other Cell is fused.
  • the cell fusion according to the invention has the particular advantage that the abovementioned incorrect treatments or possibly undesired multiple fusions can be avoided and, with virtually 100% yield, even rare or particularly valuable cells, such as, for example, stem cells, are used Can be sited.
  • a preferred application of the cell fusion according to the invention is also given in the hybridoma technique for the production of monoclonal antibodies.
  • a cell manipulator which in particular a tool for processing of individual biological cells with at least ei ⁇ ner work surface, with which the cell membrane of the cell is selectively selectively deformed locally, and a drive means auf ⁇ has, with the tool so It can be moved that the cytoskeleton of the cell is in a mechanically stable equilibrium during the action of the tool on the cell.
  • the cell manipulator can be used to realize precisely and reproducibly invasive procedures on the cell according to the method according to the invention.
  • the drive device of the cell manipulator according to the invention is set up in particular for propelling speeds of the tool in the range from 0.1 ⁇ m / h to 500 ⁇ m / h.
  • a piezoelectric drive or a magnetic drive provided, which facilitate a precise adjustment of such slow tool movements.
  • the working surface of the tool has a characteristic size which is smaller than the size of the cell, in particular smaller than the lateral extent of a cell on a substrate.
  • the characteristic size is preferably smaller than 200 ⁇ m, in particular smaller than 10 ⁇ m.
  • the characteristic size of the working surface here refers to the expansion of the contact surface which forms when the tool is in contact with the cell before the tool moves. Due to the miniaturization of the working surface, the cell manipulator can advantageously be used for the most diverse cell types.
  • the working surface of the tool has a characteristic size which is less than 1 micron.
  • such small work surfaces can be made sufficiently stable, since the movement of the tool in the method according to the invention is essentially free of forces.
  • the tool and in particular its working surface can be optimized depending on the specific application of the invention.
  • the working surface is formed so that the tool has a straight edge edge, which is aligned parallel to the surface of the substrate during operation.
  • the adaptation of the shape of the side edge to the substrate surface is advantageous for an effective combination of tool and substrate.
  • Structuring with projections, such. B. have pointed elevations Er ⁇ .
  • the structuring on the working surface of the tool facilitates fixation of the cell on the substrate during cell processing.
  • the Working surface have a complex shape with multiple faces that allow a decomposition of the cell in more than two Tei ⁇ le.
  • the work surface z. B. form a cross shape to disassemble a cell into four cell body.
  • the tool carries a coating at least along the working surface, which hinders the adhesion of biological cells, there are advantages for the controllability of the tool movement, since the coating of the working surface hinders independent cell movements of the cell.
  • the cell manipulator is additionally equipped with a positioning device, with which at least one of the components drive device and a substrate is movable with the cell, and / or a sensor device which detects the position of the tool and / or the serves to be processed cell.
  • An extended application range of the cell manipulator can advantageously be achieved if two or more tools are provided, which are moved synchronously with a common drive device or separately with separate drive devices.
  • An independent subject of the invention is the use of the method according to the invention or of the cell manipulator according to the invention for cell fusion.
  • Further preferred applications of the invention are in the Di ⁇ agnose or characterization of individual cells, such. Eg in the material analysis of components of the cytoplasm or in an analysis of the genetic material in the cell, or in tests of the interaction of the individual cell with foreign substances, such as given in the investigation of pharmacological agents.
  • the initially uniform cell can be separated into different parts, but even after the separation represent a physiologically homogeneous system and can be set accessible ⁇ different test and reference substances.
  • Figures IA to ID Illustrations of phases of the inventive processing of a biological
  • FIGS. 2A to 2C are illustrations of various embodiments of the processing of biological cells according to the invention.
  • FIG. 3 shows a schematic representation of an embodiment of a device according to the invention for processing biological cells
  • FIGS. 5 to 8 further illustrations of embodiments of the processing according to the invention of biological cells; and Figure 9: photographic images, the more
  • a biological cell 1 is arranged on a substrate 20.
  • the cell 1 comprises a cell membrane 2, which in particular envelops the cytoskeleton 3, which encloses the cell nucleus and other cell components (not shown).
  • the substrate 20 is, for example, a culture carrier, z.
  • Tool 10 has the shape of a wedge whose upper, in the figure upper, wide foot via other mechanical Komponen ⁇ (see Fig, 3) connected to a drive device is and the lower, free end of the work surface 11 for acting on the cell 1 forms.
  • the tool 10 and the cell 1 are aligned relative to each other so that the working surface 11 of the tool 10 touches the cell membrane 2 from outside (FIG. 1A).
  • This mutual alignment can be done under visual control in a microscope or automated e.g. B. be controlled with an optical sensor.
  • the tool 10 is approximated in a perpendicular direction to the substrate 20 at a speed of 20-100 ⁇ m / h, wherein the cell 1 is de ⁇ formed ( Figure IB).
  • the deformation leads to the formation of a local depression of the cell surface.
  • the parts of the cell membrane and inner cell components which are initially arranged in the reduced distance between the working surface 11 and the substrate 20 are increasingly displaced with the progressive movement of the tool 10.
  • the cytoskeleton 3 is in a state of equilibrium. This means that filaments of the cytoskeleton 3 release compounds with the cell membrane or mutual connections during the tool movement and re-establish in adjacent areas in which no displacement takes place. This release and subsequent new binding of the cytoskeleton (rearrangement) takes place essentially at the same speed as the natural cytoskeletal transposition. Therefore, the tool movement initially only results in a change in shape, which, however, is tolerated and compensated by the cell because of the high shape variability of biological cells.
  • FIG. 2 schematically illustrates various variants of invasive interventions on biological cells using the method according to the invention.
  • penetration of the tool 10, on the working surface 11 of which a chemical substance 13 is arranged is provided in the cell 1.
  • the chemical substance 13 includes, for example, a marker substance for fluorescence measurements or a biologically active macromolecule, such as. B. a DNS section.
  • the tool 10 is introduced with the substance 13 through the cell membrane of the cell 1 and the substance 13 is deposited at a desired position during a resting phase of the tool 10 by the latter into the cytoplasm. Subsequently, the tool 10 is withdrawn.
  • FIG. 2A penetration of the tool 10, on the working surface 11 of which a chemical substance 13 is arranged, is provided in the cell 1.
  • the chemical substance 13 includes, for example, a marker substance for fluorescence measurements or a biologically active macromolecule, such as. B. a DNS section.
  • the tool 10 is introduced with the substance 13 through the cell membrane of the cell 1 and the substance 13 is deposited at
  • FIG. 2A can be modified such that the substance 13 is deposited in the cell nucleus 7 or a substance is removed from the cytoplasm or the cell nucleus with the tool.
  • FIG. 2B shows a sequence analogous to FIG. 1, in which the cell 1 is divided into two cell bodies 4, 5, each of which has a topologically closed shape.
  • the cell body 4 contains the nucleus 7, while the cell body 5 is coreless.
  • FIG. 2C illustrates the removal of a sample 8 from the cell 1.
  • the sample 8 includes, for example, a portion of the cell membrane and / or portions of the cytoskeleton or cytoplasm which have been separated from the cell 1 with the tool, while the living state of the cell 1 is preserved.
  • FIG. 2D The principle of the fusion according to the invention between different cells 1, 1A is shown schematically in FIG. 2D.
  • the cell membranes of the adjacently arranged cells 1, IA are opened with the method according to the invention by a tool and fused into a new composite in which a part of the foreign cell IA in the first cell 1 auf ⁇ taken ( Figure 2D) or both complete were merged.
  • the components of a cell manipulator 100 according to the invention are illustrated schematically in FIG. 3.
  • the tool 10 is connected via a mechanical component such.
  • the substrate 20 can likewise be equipped with a driving device 30A, in order to form a slow propulsion relative to the tool 10. With the drive devices 30 and / or 30A cell movements of the cell on the substrate 20 can be further compensated.
  • the tool 10 is connected to the drive device 30 in all three spatial directions, in particular perpendicular to the surface of the substrate 20 and in a plane parallel to this Ober ⁇ surface movable.
  • the drive device 30 may contain a plurality of individual drives which provide the propulsion movements in the individual spatial directions.
  • the drive devices 30, 30A and / or the individual drives are piezoelectric drives known per se, which are designed to set relative speeds below 300 ⁇ m / h.
  • the substrate 20 is, for example, a culture carrier made of glass or
  • a structured coating may be provided which has adhesive areas (islands), in which cells preferentially adhere, and non-adhesive areas, in which the cells do not adhere or with reduced effectiveness. This allows processing of one or more cells while they are on an adhesive island. A cell migration is prevented by the surrounding non-adhesive regions, so that a separate tracking movement to compensate for cell migration can be avoided.
  • the tool 10 and / or the substrate 20 can be moved with a positioning device 40 relative to one another in all three directions of space.
  • the positioning device 40 is an actuator known per se, with which positioning of the tool 10 relative to the cell to be processed is provided.
  • the reference numeral 50 designates generally an optical sensor device for monitoring the positioning and the
  • the sensor device 50 is part of a light microscope in whose beam path the tool 10 and the substrate 20 are arranged.
  • the drive device 30 and / or 30A, the positioning device 40 and the optical sensor device 50 are monitored and controlled by a control device 60.
  • the control device 60 is, for example, a microcontroller or contained in a control computer.
  • the reference numeral 70 generally refers to an optionally vor ⁇ seen further tool that can optionally be operated independently of the tool 10 (see Fig. 8).
  • FIG. 1 Various designs of the tool 10 of the cell manipulator according to the invention are shown by way of example in FIG.
  • the partial images A and B illustrate, in a schematic side view, the tool 10 with the working surface 11 at a small distance from the surface of the substrate 20.
  • the working surface 11 forms a straight side edge 12 which, when aligned parallel to the surface Sub ⁇ strat 20 and vertical approach movement over its entire length, the surface of the substrate 20 can be contacted on this touching.
  • the working surface 11 is structured, so that there is no smooth, straight side edge as in the case of partial image A, but a structure with a large number of point-shaped projections.
  • the projections form several structured, z. B. arcuate side edge portions 12A, under the action of a cell by a translational movement parallel to the substrate surface can be separated into two cell body.
  • the tools 10 of the partial images A and B are preferably used in a combined movement in the above approach and translation phases.
  • the length of the side edge 12 is, for example, 0.5 mm.
  • the partial images C and D of FIG. 4 illustrate a schematic plan view of two further designs of the tool 10.
  • a wedge-shaped working surface 11 is provided, with which the cell 1 is moved parallel to the substrate surface on the substrate 20 when the tool 10 moves (Translations onsphase) can be separated into two cell bodies.
  • the tool comprises a cross-shaped working surface 11 with which the cell 1 on the substrate 20 can be separated into four parts in the course of an approach movement.
  • the component 14 in each case schematically illustrates a mechanical component (for example a carrier rod), via which the tool 10 is connected to the positioning device 30 (see FIG.
  • FIGS. 5 to 8 schematically illustrate experimental results which the inventors have achieved with the method according to the invention.
  • FIG. 5 shows by analogy with FIGS. 1 and 2B with further details the division of a cell 1 into two cell bodies 4, 5.
  • an adherent cell 1 as is typical for in vitro cultures, is located on the Substrate 20 is arranged.
  • the cell 1 is z.
  • the tool 10 is in the direction of arrow above the cell 1 with the Positioniereinri ⁇ htung (40, see
  • the tool 10 which is shown in a schematic perspective view, is provided with an elongate cutting edge with an elliptical cross-section, the surface of which forms the working surface 11.
  • a particular advantage of the invention is that in many applications, the shape of the tool for the processing of cells according to the invention has no or a significantly lower importance than in the conventional techniques with fast horroube ⁇ movements.
  • the length of the cutting edge is selected such that the working surface 11 extends over the entire extent of the cell 1.
  • the width of the cutting edge is considerably smaller than the extent of the adherent cell. It has, for example, a value of 5 ⁇ m as the characteristic size of the work surface.
  • the tool movement comprises two phases. During the approach phase according to FIG.
  • the tool movement takes place along a surface normal of the substrate 20, for example at a speed in the range of 5 to 50 ⁇ m / h.
  • the translation phase follows the tool movement. During this phase, the tool 10 is moved parallel to the surface of the substrate 20. The speed of this movement is likewise selected in the range from 5 to 50 ⁇ m / h.
  • the cell body 4 contains the cell nucleus 7 and is furthermore vital, capable of movement and able to divide with it.
  • the cell body 5 can be used to characterize the original cell by analyzing the membrane components of the cytoplasm, of cell organelles and also of genetic material in the cytoplasm, such as cytoplasmic cells. B. mRNA can be used.
  • the cell components to be investigated can be separated quantitatively for the respective analysis quantitatively without loss of vitality of the nucleated cell body 4.
  • FIG. 6 illustrates an analogous process to that of FIG. 5, but in this case two cells 1, IA, each with a cell membrane 2, 2A adhering to each other, overlap each other. pend are arranged on the substrate 20. Such overlaps often occur spontaneously in cell cultures, for example when a high cell density is present, or when a so-called feeder cell layer is present on the surface of the substrate 20, as is known from the cultivation technique for stem cells.
  • the tool 10 is positioned above the overlapping area of the cells 1, 1A, subsequently with the above-mentioned. Reduced displacement speed and possibly moved in a translation phase parallel to the surface of the substrate 20. As a result of the invasive action of the tool 10, the cell membranes 2, 2A of the cells 1, 1A are opened and closed again during subsequent healing with a correspondingly altered composition and shape. As a result, 6 parts of the cell membrane 2A of the cell IA (hatched drawn) in the cell membrane of the cell 1 (ge points drawn) and vice versa are installed in the fusion cell.
  • FIG. 7 illustrates another example of a fusion process with the use of two tools 10, 10A.
  • a monolayer of the cells 1 of a first cell type is provided on the substrate 20, on which one or more cells IA of a second cell type are cultivated.
  • This arrangement corresponds, for example, to the cultivation of stem cells on a feeder cell layer or the combination of different cell types in so-called tissue engineering.
  • the tools 10, 10A are slowly pressed into the cell material in the approach phase (FIG. 7A) and then, if appropriate, moved parallel to the surface of the substrate 20 in the following translation phase (FIG. 7B).
  • a movement of the tools 10, 10A is provided perpendicular to the longitudinal extension of the respective working surfaces and parallel to the surface of the substrate 20.
  • the method shown in Figure 7 may be further modified as follows.
  • the optical sensor device in particular the microscope
  • the cells 10, 10A are adjusted relative to the cells 1, IA, depending on the requirements, such that both cell nuclei or only one nucleus of one of the cell types are contained in the fusion cell 6. Furthermore, the cells can be pushed together with the tools 10, 10A on the substrate 20 before the fusion takes place. Finally, the cells and in particular the fusion cell ⁇ can be displaced laterally on the substrate 20 with the tools 10, 10A.
  • FIG. 8 illustrates a further complex manipulation using two tools 10, 10A, which are first lowered into a monolayer of the cells 1 on the substrate 20 and subsequently laterally parallel to the surface of the substrate 20 and perpendicular to the longitudinal orientation of the working surfaces 11 be pushed apart (Fig. 8A).
  • a gap in the monolayer (cell lawn) created ge is independent of the arrangement of the cells solely by the positioning and lowering the tools can be set.
  • the artificial object may comprise, for example, a biological or synthetic filler, a sensor device, a microsystem or a tissue part (eg nerve cell or muscle cell associations, endothelia, compositions of these).
  • the photographic images A to E in FIG. 9 show the progress of the separation according to the invention of a cell 1 with the tool 10 into two cell bodies 4, 5 using the example of a concrete experimental result.
  • the illustration shows fibroblast cells on a substrate 20.
  • a tool 10 an extended glass tip is used whose diameter at the pointed end rd. 2 um.
  • the tool 10 is first placed adjacent to the substrate to be processed of the cell 1 ⁇ .
  • the tool 10 is displaced parallel to the surface of the substrate according to the abovementioned translatory movement (to the left in the figures), where partial separation takes place according to sub-images C and D and complete separation takes place in the cell bodies 4, 5.
  • Partial diagram E shows the further movability of the cell bodies 4, 5 after the separation.

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Bearbeitung einer biologischen Zelle (1), die ein von einer Zellmembran (2) umhülltes Zytoskelett (3) aufweist, beschrieben mit den Schritten gegenseitige Ausrichtung der biologischen Zelle (1) und eines Werkzeugs (10), so dass das Werkzeug (10) die biologische Zelle (1) berührt, Bewegung des Werkzeugs (10) und der biologischen Zelle (1) relativ zueinander, und Bildung einer Unterbrechung im molekularen Verbund der Zellmembran (2) der biologischen Zelle (1), wobei während der Bewegung des Werkzeugs (10) das Zytoskelett (3) der biologischen Zelle (1) einen Gleichgewichtszustand aufweist. Es wird auch ein Zellmanipulator zur Durchführung des Verfahrens beschrieben.

Description

Verfahren und Vorrichtungen zur Bearbeitung einzelner biologischer Zellen
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Bearbeitung einer biolo¬ gischen Zelle mit den Merkmalen des Oberbegriffs von Anspruch 1. Des Weiteren betrifft die Erfindung Vorrichtungen zur Durchführung derartiger Verfahren und deren Verwendungen.
Aus der Zellbiologie sind mehrere Verfahren zur invasiven Ma¬ nipulation biologischer Zellen bekannt. Beispielsweise ist bei der Einführung einer Elektrodenspitze in eine Zellmembran für die "patch clamp"-Technik oder bei der Einführung einer Kanüle in die Zelle zur Entnahme von Kernmaterial eine Unter- brechung der Zellmembran und/oder ein Eindringen in das Zell¬ plasma erforderlich. Diese Techniken haben generell den Nach¬ teil, dass mit dem invasiven Eingriff in die Zelle eine Un¬ terbrechung im molekularen Verbund mindestens der Zellmembran verursacht wird, in deren Ergebnis nach der jeweiligen Mani- pulation die Zelle in der Regel nicht mehr lebensfähig ist. Um dennoch die Lebensfähigkeit zu erhalten, dürfen mit den herkömmlichen Techniken nur minimale Verletzungen der Zell¬ membran gebildet werden (zum Beispiel im Mikrometer-Bereich oder darunter) . Dies stellt jedoch eine erhebliche Limitie- rung in der Anwendbarkeit der herkömmlichen Techniken dar.
Eine weitere invasive Zellmanipulation stellt die Fusion bio¬ logischer Zellen dar. Zur Durchführung einer Fusion werden die Zellmembranen benachbarter Zellen chemisch (z. B. durch ' bestimmte Substanzen oder mit Viren) oder elektrisch (z. B. mit einem Hochspannungspuls) unterbrochen und so neu ver¬ schmolzen oder ausgeheilt, dass Zellbestandteile der einzel¬ nen Zellen in einer gemeinsamen, geschlossenen Zellmembran enthalten ist. Die herkömmlichen Fusionstechniken besitzen den Nachteil, 'dass eine exakte und definierte Zellfusion zwi¬ schen zwei vorbestimmten Zellen nicht verfügbar ist. Bisher ist es erforderlich, zur Zellfusion eine Vielzahl von Zellen der jeweiligen chemischen oder elektrischen Behandlung auszu- setzen und dann aus den behandelten Zellen die gewünschten Fusionsprodukte auszusortieren. Dabei können jedoch Fehlbe¬ handlungen oder unerwünschte Mehrfachfusionen (z. B. Drei¬ zeil- oder Vierzellfusionen) auftreten. Dies ist jedoch mit einem erheblichen Verlust an ggf. seltenen oder wertvollen Zellen verbunden.
Aus WO 2004/074426 ist ein Verfahren zur schonenden Bearbei¬ tung von Zellmaterial mit einer Vielzahl von biologischen Zellen bekannt, bei dem eine Sonde so durch das Zellmaterial bewegt wird, dass die Zellen von der Sonde verdrängt werden. Durch die in WO 2004/.074426 beschriebene Steuerung der Sonde werden Verletzungen der Zellen vermieden. Invasive Eingriffe in die Zellen, hingegen sind bei dieser Technik nicht vorgese¬ hen.
Die Aufgabe der Erfindung ist' es, verbesserte Verfahren zur Bearbeitung biologischer Zellen, insbesondere von einzelnen Zellen, Zellpaaren oder Zellgruppen bereitzustellen, mit de¬ nen die Nachteile der herkömmlichen Techniken überwunden wer- den können und die sich insbesondere durch einen schonenden Umgang mit dem Zellmaterial, eine hohe Zuverlässigkeit und Genauigkeit und eine hohe Ausbeute auszeichnen. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, verbesserte Vorrichtungen zur Um¬ setzung derartiger Verfahren bereitzustellen.
Diese Aufgaben werden mit Verfahren und Vorrichtungen mit den Merkmalen der Patentansprüche 1 und 17 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen. Verfahrensbezogen basiert die Erfindung auf der allgemeinen technischen Lehre, zur Bearbeitung einer biologischen Zelle mit einer Zellmembran, die insbesondere Zytoplasma und ein Zytoskelett umhüllt, die Zelle und ein Werkzeug relativ zu¬ einander zu bewegen und durch eine Einwirkung des Werkzeugs die Zellmembran der Zelle zu unterbrechen, wobei sich während der Relativbewegung des Werkzeugs und der Zelle deren Zy¬ toskelett in einem stabilen Gleichgewicht befindet. Vorteil- hafterweise wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ein in¬ vasiver Eingriff in die Zelle realisiert, während sich das Zytoskelett mechanisch in einem Zustand befindet, in dem es im wesentlichen frei von äußeren mechanischen Spannungen ist und in dem die strukturelle und funktionelle Beziehung zwi- sehen der Zellmembran und inneren Zellbestandteilen und die Funktionsfähigkeit der inneren Zellbestandteile erhalten bleiben. Des weiteren befindet sich auch die Zellmembran wäh¬ rend der Bewegung des Werkzeugs in dem stabilen Gleichge¬ wicht. Während und nach dem invasiven Eingriff in die Zelle bleibt die Fähigkeit zum Stoffwechsel und damit die Lebensfä¬ higkeit der Zelle oder wenigstens eines Teils der Zelle er¬ halten.
Die Relativbewegung des Werkzeugs und der Zelle erfolgt der- art langsam, dass sich das Zytoskelett und die Zellmembran, die laufend einem molekularen ümordnungsprozess unterliegen, zu jedem Zeitpunkt an die geometrischen Bedingungen anpassen können, die durch die Oberfläche des Werkzeugs, insbesondere einer Arbeitsfläche des Werkzeugs, gegeben sind. Die Kompo- nenten des Zytoskeletts, das insbesondere Filamente der Pro¬ teine Aktin und Tubolin und das Protein Myosin enthält und den Zellkern und die übrigen Zellbestandteile relativ zuein¬ ander hält, haben während der Werkzeugbewegung ausreichend Zeit für eine Neuordnung auf der Zellmembran und/oder der Ar- beitsflache des Werkzeugs. Das erfindungsgemäße Verfahren er¬ möglicht daher vorteilhafterweise, dass während einer Zellbe¬ arbeitung die Zelle durch die Zellmembran oder die Arbeits¬ fläche des Werkzeugs geschlossen bleibt. Es wird ein invasi- ver Eingriff in die Zelle ermöglicht, ohne dass große, schäd¬ liche oder irreversible Zellöffnungen entstehen.
Die Erfinder haben festgestellt, dass einzelne adhärente Zel¬ len, obwohl diese grundsätzlich durch ihre Eigenbewegung langsamen Einwirkungen äußerer Sonden ausweichen können (sie¬ he WO 2004/074426) , durch ein langsam bewegtes Werkzeug bis zu einer Unterbrechung der Zellmembran deformiert werden kön¬ nen und dabei überraschenderweise lebensfähig bleiben. Von besonderem Vorteil ist es, dass die bearbeitete Zelle während des gesamten Zeitraums der Manipulation gegenüber der Umwelt abgeschlossen bleibt.
Als Unterbrechung der Zellmembran wird hier allgemein jede Störung des molekularen Verbundes der insbesondere aus Phospholipiden und Proteinen aufgebauten Membran verstanden, bei der Moleküle, die zunächst in der intakten Membran be¬ nachbart angeordnet waren, durch die äußere Einwirkung des Werkzeugs voneinander getrennt werden. Die Unterbrechung der Zellmembran ergibt eine Öffnung der Zellmembran, an der die inneren Zellbestandteile mit der Arbeitsfläche des Werkzeugs oder anderen Materialien in der Zellumgebung, wie zum Bei¬ spiel anderen Zellen oder Zellbestandteilen oder anderen Sub¬ stanzen in Kontakt gelangt.
Mit der Relativbewegung des Werkzeugs und der Zelle wird hier jede Ortsänderung des Werkzeugs und/oder der Zelle bezeich¬ net, die zu einer Änderung der Relativkoordinaten des Werk¬ zeugs und der Zelle führt. Da das erfindungsgemäße Verfahren vorzugsweise außerhalb des Körpers eines Organismus durchge- führt wird und die zu bearbeitende Zelle vorzugsweise adhä- rent auf einem Substrat angeordnet ist, wird die Relativbewe¬ gung durch wenigstens eine der folgenden Bewegungen erreicht: Bewegung des Werkzeugs, Bewegung der Zelle, insbesondere mit dem Substrat, und Bewegung von beiden Teilen. Die Bewegung des Werkzeugs kann insbesondere zusätzlich zu der gewünschten Verdrängungs- und Deformationsbewegung hin zu der Zelle mit einer Nachführungsbewegung überlagert sein, mit der eine Ei¬ genbewegung des Zelle auf dem Substrat kompensiert wird. Wenn im folgenden in der Regel auf die Bewegung des Werkzeugs Be¬ zug genommen wird, sind alle hier genannten anderen Bewegun¬ gen, insbesondere auch des Substrates eingeschlossen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Bewegung des Werkzeugs mit einer Geschwindigkeit, die kleiner oder gleich der Umordnungsgeschwindigkeit des Zy- toskeletts ist. Vorteilhafterweise wird damit der o. g. Gleichgewichtszustand der Zelle sichergestellt. Mit der Um¬ ordnungsgeschwindigkeit wird hier die Geschwindigkeit be- zeichnet, mit der sich Teile des Zytoskeletts, wie zum Bei¬ spiel charakteristische Filamentstrukturen aufgrund des stän¬ dig ablaufenden molekularen Umordnungsprozesses der Zelle be¬ wegen. Die Umordnungsgeschwindigkeit entspricht bspw. der Ge¬ schwindigkeit, mit der sich bei einer adhärent angeordneten Zelle ein äußerer Rand des Zytoskeletts relativ zu einem Sub¬ strat bewegt. Die Umordnungsgeschwindigkeit ist eine zellspe¬ zifische Größe, die in einem Vorversuch problemlos durch eine Messung ermittelt werden kann (siehe z. B. B. Alberts et al. in "Molekularbiologie der Zelle", Wiely VCH Verlag, Weinheim, 2004, P. Geggier et al. in "Appl. Phys . A", Bd. 68, 1999, S. 505 - 513; A. R. Bausch et al. in "Biophys. J.", Bd. 76, 1999, S. 573 - 579, T. J. Mitchison et al. in "Cell", Bd. 84, 1996, S. 371 - 379) . Vorteile für die Einstellung der Werkzeuggeschwindigkeit kön¬ nen sich gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ergeben, wenn die Bewegung des Werkzeugs mit einer Geschwin¬ digkeit erfolgt, die kleiner oder gleich einer Wanderungsge- schwindigkeit von adhärenten Zellen auf einer Oberfläche sind. Diese Wanderungsgeschwindigkeit kann in einem Vorver¬ such unter den konkreten Arbeitsbedingungen an der zu bear¬ beitenden Zelle ermittelt werden. Die Erfinder haben festge¬ stellt, dass die physiologische Wanderungsgeschwindigkeit der Zelle unmittelbar mit der o. g. Umordnungsgeschwindigkeit des Zytoskeletts in Zusammenhang steht und so als Bezugsgröße für die Werkzeugbewegung verwendet werden kann.
Vorzugsweise wird das Werkzeug mit einer Geschwindigkeit be- wegt, die kleiner als 500 μm/h, insbesondere kleiner als 300 um/h ist. Vorteilhafterweise sind in diesem Geschwindigkeits¬ bereich die o. g. Bedingungen für die meisten interessieren¬ den Zelltypen, wie z. B. Fibroblasten, Makrophagen oder Krebszellen erfüllt, so dass zum Beispiel auf Vorversuche o- der Tabellenwerte verzichtet werden kann.
Wenn gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Er¬ findung die biologische Zelle auf der festen Oberfläche eines ebenen Substrats angeordnet ist und das Werkzeug relativ zu dem Substrat bewegt wird, können sich Vorteile für die Zusam¬ menwirkung des Werkzeugs und des Substrates ergeben. Die fes¬ te Oberfläche bildet eine Auflage zur Erzeugung einer Gegen¬ kraft während der Vortriebsbewegung des Werkzeugs.
Die Vortriebsbewegung des Werkzeugs relativ zu dem Substrat umfasst vorzugsweise wenigstens eine von zwei Phasen, durch welche die Strukturbildung während und nach der erfindungsge- mäßen Zellbearbeitung positiv beeinflusst wird. In einer An¬ näherungsphase wird das Werkzeug zu dem Substrat bewegt und die Zelle zwischen dem Werkzeug und dem Substrat deformiert und eingeschnürt. In einer Translationsphase wird das Werk¬ zeug im Wesentlichen parallel zur Oberfläche des Substrats bewegt. In dieser Phase wird die Umordnung der Zellmembran gefördert.
Die genannten Bewegungsarten entsprechend den Annäherungs¬ und Translationsphasen können erfindungsgemäß einzeln, in Kombination aufeinanderfolgend oder in Kombination gleichzei- tig realisiert werden. Beispielsweise ist bei der Bewegung gemäß der Annäherungsphase (Verminderung des Werkzeug- Substrat-Abstandes) eine Trennung der Zelle in mindestens zwei Zellkörper wie bei einem Stanzvorgang vorgesehen. Die erfindungsgemäße Zellbearbeitung kann ferner beispielsweise allein eine Bewegung des Werkzeugs parallel zur Substratober¬ fläche umfassen. Hierzu wird das Werkzeug zunächst neben der zu bearbeitenden Zelle auf der Substratoberfläche aufgesetzt. Das Werkzeug berührt beim Aufsetzen oder nach einer ersten Vorschubbewegung einen Rand der Zelle und wird dann gemäß dem Verfahren der Erfindung durch die Zelle hindurchbewegt, wobei diese- in bspw. zwei Zellkörper zerteilt •wird. Vorteilhafter¬ weise bildet die Substratoberfläche bei dieser Ausführungs¬ form der Erfindung eine Führung für die Werkzeugbewegung.
Vorzugsweise werden während der Bewegung des Werkzeugs die
Zellmembran und mit dieser Teile des Zytoplasmas und des Zy- toskeletts einer Deformation, Stauchung und/oder Dehnung un¬ terzogen. Vorteilhafterweise kann dadurch die Unterbrechung der Zellmembran mit der Bildung neuer Formen der Zelle oder Zellbestandteile nach dem invasiven Eingriff gefördert wer¬ den.
Besonders bevorzugt ist, wenn während und/oder nach dem inva¬ siven Eingriff in die Zellmembran eine Heilung der Unterbre- chung der Zellmembran erfolgt, so dass die Zellmembran ge¬ schlossen bleibt bzw. wird. Die Heilung kann als Spontanhei¬ lung erfolgen, indem sich die Zellmembran bei ruhendem Werk¬ zeug unter der Wirkung der Oberflächenspannung schließt, oder durch eine gerichtete Bewegung des Werkzeugs gefördert wer¬ den. Vorteilhafterweise wird die Zelle durch die Heilung ge¬ schlossen und damit auch ohne den Kontakt mit der Arbeitsflä¬ che weiterhin lebensfähig.
Wenn während der Unterbrechung und der folgenden Heilung' der Zellmembran der Innenraum der Zelle von der Umgebung stoff¬ lich getrennt ist, kann eine unerwünschte oder nicht reprodu¬ zierbare Veränderung der Struktur und Funktion der Zelle, insbesondere des Stoffwechsels und des Erbmaterials "vermieden werden, wobei dies vorteilhafterweise einen positiven Ein- fluss auf die weitere Verwendung der Zelle für Kultivierungs¬ oder Messzwecke hat.
Alternativ kann erfindungsgemäß vorgesehen sein, dass während der Unterbrechung ein Fremdstoff, wie zum Beispiel ein Mar¬ kierungsstoff in die 'Zelle eingeschleust wird.
Weitere .Ausführungsformen der Erfindung zeichnen sich dadurch aus, dass das Werkzeug nach der Bearbeitung der Zelle, z. B. nach der Trennung der Zelle in mindestens zwei Zellkörper weiter in Kontakt mit der Oberfläche des Substrats bleibt. Ein zur Trennung verwendetes Werkzeug ruht auf der Substrat¬ oberfläche, so dass vorteilhafterweise eine mechanische Wand zwischen den Zellkörpern gebildet wird.
Ein für die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Zellbiologie besonders wichtiges Merkmal der Erfindung be¬ steht darin, dass die Zellmembran nach der Heilung eine ande¬ re Form, Zusammensetzung und/oder Größe aufweist als vor der Bildung der Unterbrechung. Diese Veränderungen ermöglichen, dass Untersuchungen und/oder Veränderungen an der Zelle in definierter und reproduzierbarer Weise durchgeführt werden können.
Beispielsweise kann vorgesehen sein, dass die Zelle nach der Heilung in wenigstens zwei Zellkörper getrennt ist, die je¬ weils eine topologisch geschlossene Form aufweisen. Das er¬ findungsgemäße Verfahren führt zu einer Abschnürung der ZeI- Ie, so dass die getrennten Zellkörper gebildet werden. Die
Zellkörper können als Startmaterialien für weitere Kultivie¬ rungen, Bearbeitungen oder Untersuchungen verwendet werden und bieten dabei den Vorteil, von einer gemeinsamen Vorläu¬ ferzelle abgetrennt zu sein. Besonders bevorzugt ist, wenn einer der getrennten Zellkörper kernlos ist. In diesem Fall ist der jeweils andere Zellkörper mit dem Zellkern voll le¬ bensfähig, während der kernlose Zellkörper ebenfalls Stoff¬ wechselaktivitäten zeigen kann, so lange ATP von den in die¬ sem enthaltenen Mitochondrien produziert wird. Der kernlose Zellkörper kann anschließend beispielsweise einer Untersu¬ chung unterzogen werden, um stoffliche Eigenschaften des an¬ deren Zellkörpers zu ermitteln, ohne direkt auf diesen zu¬ zugreifen.
Alternativ kann beispielsweise vorgesehen sein, dass die
Zellmembran nach der Heilung mit einer fremden Zellmembran einer weiteren biologischen Zelle mindestens einen topolo¬ gisch geschlossenen Zellkörper bildet. Vorteilhafterweise kann damit die Oberfläche der (ersten) bearbeiteten Zelle mit Stoffen oder Strukturen der Oberfläche der zweiten Zelle mo¬ difiziert werden, beispielsweise um bestimmte Antigene oder Markierungsstoffe auf der ersten Zelle zu präsentieren. Be¬ sonders bevorzugt ist hierbei die Fusion oder Paarbildung von Zellen, bei der die erste Zelle mit mindestens einer weiteren Zelle fusioniert wird. Die erfindungsgemäße Zellfusion hat gegenüber den herkömmlichen Fusionsmethoden den besonderen Vorteil, dass die o. g. Fehlbehandlungen oder ggf. uner¬ wünschten Mehrfachfusionen vermieden werden können und ge- zielt mit praktisch 100-%iger Ausbeute selbst seltene oder besonders wertvolle Zellen, wie zum Beispiel Stammzellen, fu¬ sioniert werden können. Eine bevorzugte Anwendung der erfin¬ dungsgemäßen Zellfusion ist auch bei der Hybridomatechnik zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegeben.
Weitere Vorteile für die Steuerbarkeit und Reproduzierbarkeit der Modifizierung der ersten Zelle mit Material von einer fremden Zelle, insbesondere bei der Zellfusion, können sich ergeben, wenn die Zellen während der Bearbeitung mit dem Werkzeug auf einem Substrat einander zumindest teilweise überlappend und insbesondere übereinander angeordnet sind.
Vorrichtungsbezogen wird die o. g. Aufgabe durch einen Zell¬ manipulator gelöst, der insbesondere ein Werkzeug zur Bear- beitung von einzelnen biologischen Zellen mit mindestens ei¬ ner Arbeitsfläche, mit der die Zellmembran der Zelle lokal selektiv deformierbar ist, und eine Antriebseinrichtung auf¬ weist, mit der das Werkzeug so bewegt werden kann, dass sich das Zytoskelett der Zelle während der Einwirkung des Werk- zeugs auf die Zelle in einem mechanisch stabilen Gleichge¬ wicht befindet. Vorteilhafterweise können mit dem Zellmanipu¬ lator genau und reproduzierbar invasive Eingriffe an der Zel¬ le entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren realisiert werden.
Die Antriebseinrichtung des erfindungsgemäßen Zellmanipula¬ tors ist insbesondere für Vortriebsgeschwindigkeiten des Werkzeugs im Bereich von 0.1 um/h bis 500 μm/h eingerichtet ist. Hierzu ist vorzugsweise ein piezoelektrischer Antrieb oder einen Magnetantrieb vorgesehen, die eine genaue Einstel¬ lung derart langsamer Werkzeugbewegungen erleichtern.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist die Arbeitsfläche des Werkzeugs eine charakteristische Größe aufweist, die geringer als die Größe der Zelle, insbesondere geringer als die laterale Ausdehnung einer Zelle auf einem Substrat ist. Die charakteristische Größe ist vorzugsweise kleiner als 200 μm, insbesondere kleiner als 10 um. Mit der charakteristische Größe der Arbeitsfläche wird hier die Aus¬ dehnung der Kontaktfläche bezeichnet, die sich bei einer Be¬ rührung des Werkzeugs mit der Zelle vor der Bewegung des Werkzeugs bildet. Durch die Miniaturisierung der Arbeitsflä¬ che kann der Zellmanipulator vorteilhafterweise für die ver- schiedensten Zelltypen verwendet werden. Besonders bevorzugt weist die Arbeitsfläche des Werkzeugs eine charakteristische Größe auf, die geringer als 1 μm ist. Vorteilhafterweise kön¬ nen auch derart kleine Arbeitsflächen ausreichend stabil be¬ reitgestellt werden, da die Bewegung des Werkzeugs beim er- findungsgemäßen Verfahren im Wesentlichen kräftefrei erfolgt.
Vorteilhafterweise kann das Werkzeug und insbesondere dessen Arbeitsfläche in Abhängigkeit von der konkreten Anwendung der Erfindung optimiert werden. Gemäß einer Variante ist die Ar- beitsfläche so gebildet, dass das Werkzeug eine gerade Sei¬ tenkante aufweist, die im Betrieb parallel zur Oberfläche des Substrats ausgerichtet ist. Die Anpassung der Form der Sei¬ tenkante an die Substratoberfläche ist für eine effektive Zu¬ sammenwirkung von Werkzeug und Substrat von Vorteil. Gemäß einer alternativen Variante kann die Arbeitsfläche eine
Strukturierung mit Vorsprüngen, wie z. B. spitzenförmigen Er¬ hebungen aufweisen. Die Strukturierung an der Arbeitsfläche des Werkzeugs erleichtert eine Fixierung der Zelle auf dem Substrat während der Zellbearbeitung. Schließlich kann die Arbeitsfläche eine komplexe Form mit mehreren Teilflächen aufweisen, die eine Zerlegung der Zelle in mehr als zwei Tei¬ le ermöglichen. Vorteilhafterweise kann die Arbeitsfläche z. B. eine Kreuzform bilden, um eine Zelle in vier Zellkörper zu zerlegen.
Wenn das Werkzeug zumindest entlang der Arbeitsfläche eine BeSchichtung trägt, die ein Anhaften von biologischen Zellen behindert, ergeben sich Vorteile für die Steuerbarkeit der Werkzeugbewegung, da durch die Beschichtung der Arbeitsfläche eigenständige Zellbewegungen der Zelle behindert werden.
Gemäß einer weiteren Modifizierung der Erfindung ist der Zellmanipulator zusätzlich mit einer Positioniereinrichtung, mit der wenigstens eine der Komponenten Antriebseinrichtung und ein Substrat mit der Zelle beweglich ist, und/oder einer Sensoreinrichtung ausgestattet, die der Erfassung der Positi¬ on des Werkzeugs und/oder der zu bearbeitenden Zelle dient.
Ein erweiterter- Anwendungsbereich des Zellmanipulators kann vorteilhafterweise erreicht werden, wenn zwei oder mehr Werk¬ zeuge vorgesehen sind, die synchron mit einer gemeinsamen An¬ triebseinrichtung oder separat mit getrennten Antriebsein- richtungen bewegt werden.
Einen unabhängigen Gegenstand der Erfindung stellt die Ver¬ wendung des erfindungsgemäßen Verfahrens oder des erfindungs¬ gemäßen Zellmanipulators zur Zellfusion dar.
Weitere bevorzugte Anwendungen der Erfindung sind bei der Di¬ agnose oder Charakterisierung einzelner Zellen, wie z. B. bei der stofflichen Analyse von Bestandteilen des Zytoplasmas o- der bei einer Analyse des genetischen Materials in der ein- zelnen Zelle, oder bei Tests der Wechselwirkung der einzelnen Zelle mit fremden Stoffen, wie bspw. bei der Untersuchung von pharmakologischen Wirkstoffen gegeben. Für die Testanwendung ist von besonderem Vorteil, dass die zunächst einheitliche Zelle in verschiedene Teile getrennt werden kann, die jedoch auch nach der Trennung ein physiologisch homogenes System darstellen und verschiedenen Test- und Referenzstoffen ausge¬ setzt werden können.
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen be¬ schrieben. Es zeigen:
Figuren IA bis ID: Illustrationen von Phasen der erfindungs- gemäßen Bearbeitung einer biologischen
Zelle;|
Figuren 2A bis 2C: Illustrationen verschiedener Ausführungs¬ formen der erfindungsgemäßen Bearbeitung biologischer Zellen;
Figur 3: eine schematische Darstellung einer Aus¬ führungsform einer erfindungsgemäßen Vor¬ richtung zur Bearbeitung biologischer ZeI- len;
Figur 4: schematische Illustrationen verschiedener
Werkzeuggestaltung;
Figuren 5 bis 8: weitere Illustrationen von Ausführungsfor¬ men der erfindungs-gemäßen Bearbeitung bio¬ logischer Zellen; und Figur 9: fotografische Abbildungen, die mehrere
Phasen einer erfindungsgemäßen Trennung einer Zelle in zwei Zellkörper zeigen.
Die Erfindung wird im Folgenden unter beispielhaftem Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben, welche die Ver¬ wendung eines Werkzeugs illustrieren, das als Arbeitsfläche eine keil- oder kegelstumpfförmige Schneide aufweist. Es wird betont, dass die Umsetzung der Erfindung nicht auf die ge- zeigten Beispiele beschränkt, sondern entsprechend den oben genannten Merkmalen abgewandelt auch mit anderen Werkzeugfor¬ men realisierbar ist (siehe z. B. Figur 4). Des Weiteren wird betont, dass die biologischen Zellen in den beigefügten Zeichnungen lediglich schematisch gezeigt sind und in der Praxis je nach Zelltyp andere Formen aufweisen können. Ein¬ zelheiten der herkömmlichen Techniken zur Zellkultivierung und zur Beobachtung von Zellkulturen z. B. mit einem Mikro¬ skop, werden im Einzelnen nicht beschrieben, da sie an sich bekannt sind.
Die Schrittfolge einer ersten Ausführungsform des erfindungs¬ gemäßen Verfahrens ist schematisch in den Teilbildern A bis D von Figur 1 illustriert. Gemäß Figur IA ist eine biologische Zelle 1 auf einem Substrat 20 angeordnet. Die Zelle 1 umfasst eine Zellmembran 2, die insbesondere das Zytoskelett 3 um¬ hüllt, das den Zellkern und weitere Zellbestandteile (nicht dargestellt) umhüllt. Das Substrat 20 ist bspw. ein Kultur¬ träger, z. B. aus Glas oder Kunststoff, der in einem Kultur¬ gefäß (nicht dargestellt) angeordnet oder als Teil von diesem gebildet ist. Das in schematischer Schnittansicht gezeigte
Werkzeug 10 weist die Gestalt eines Keils auf, dessen in der Figur oberer, breiter Fuß über weitere mechanische Komponen¬ ten (siehe Fig, 3) mit einer Antriebseinrichtung verbunden ist und dessen unteres, freies Ende die Arbeitsfläche 11 zur Einwirkung auf die Zelle 1 bildet.
Bei der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform der Erfindung werden zunächst das Werkzeug 10 und die Zelle 1 relativ zu¬ einander so ausgerichtet, dass die Arbeitsfläche 11 des Werk¬ zeugs 10 die Zellmembran 2 von außen berührt (Fig. IA) . Diese gegenseitige Ausrichtung kann unter visueller Kontrolle in einem Mikroskop oder automatisiert z. B. mit einem optischen Sensor gesteuert werden. Anschließend wird das Werkzeug 10 mit einer Geschwindigkeit von 20 - 100 μm/h in senkrechter Richtung an das Substrat 20 angenähert, wobei die Zelle 1 de¬ formiert wird (Fig. IB) . Die Deformation führt zur Bildung einer lokalen Vertiefung der Zelloberfläche. Die zunächst in dem sich verminderten Abstand zwischen der Arbeitsfläche 11 und dem Substrat 20 angeordneten Teile der Zellmembran und inneren Zellbestandteile werden mit der fortschreitenden Be¬ wegung des Werkzeugs 10 zunehmend verdrängt. Während dieser Verdrängung befindet sich das Zytoskelett 3 in einem Gleich- gewichtszustand. Dies bedeutet, dass Filamente des Zytoske- letts 3 während der Werkzeugbewegung Verbindungen mit der Zellmembran oder gegenseitige Verbindungen freigeben und in benachbarten Bereichen, in denen keine Verdrängung erfolgt, neu knüpfen. Diese Freigabe und darauffolgend neue Bindung des Zytoskeletts (Umordnung) erfolgt im Wesentlichen mit der¬ selben Geschwindigkeit wie die natürliche Zytoskelettumord- nung. Daher ergibt die Werkzeugbewegung zunächst lediglich eine Formänderung, die jedoch von der Zelle aufgrund der ho¬ hen Formvariabilität biologischer Zellen toleriert und kom- pensiert wird.
Wenn der Abstand zwischen dem Werkzeug 10 und dem Substrat 20 im Wesentlichen der doppelten Membrandicke entspricht, kommt es zur Abschnürung zwischen den Teilen der Zelle 1 auf den beiden Seiten des Werkzeugs 10 (Fig. IC) . Die Erfinder haben festgestellt, dass in dieser Phase der molekulare Verbund der Zellmembran 2 unterbrochen werden kann, ohne dass sich die Zelle gegenüber der Umgebung öffnet. Stattdessen führt die weitere Bewegung des Werkzeugs 10 nach der Abschnürung zu ei¬ ner Verschmelzung der sich berührenden Abschnitte der Zell¬ membran 2, bis die Arbeitsfläche 11 des Werkzeugs 10 das Sub¬ strat 20 berührt und zwei getrennte Zellkörper 4, 5 gebildet sind (Figur ID) . Beide Zellkörper 4, 5 sind von einer topolo- gisch geschlossenen Zellmembran umhüllt und jeweils lebensfä¬ hig, solange der Stoffwechsel im jeweiligen Zellkörper mit genügend Energie versorgt wird. Im weiteren Verfahren können in Abhängigkeit von der jeweiligen Anwendung an den Zellkör¬ pern 4, 5 weitere Manipulationen, Kultivierungen oder Unter- suchungen vorgenommen werden.
Figur 2 illustriert scherαatisch verschiedene Varianten inva¬ siver Eingriffe an biologischen Zellen mit dem erfindungsge¬ mäßen Verfahren. Gemäß Figur 2A ist ein Eindringen des Werk- zeugs 10, auf dessen Arbeitsfläche 11 eine chemische Substanz 13 angeordnet ist, in die Zelle 1 vorgesehen. Die chemische Substanz 13 umfasst bspw. eine Markersubstanz für Fluores¬ zenzmessungen oder ein biologisch wirksames Makromolekül, wie z. B. einen DNS-Abschnitt. Das Werkzeug 10 wird mit der Sub- stanz 13 durch die Zellmembran der Zelle 1 eingeführt und die Substanz 13 an einer gewünschten Position während einer Ruhe¬ phase des Werkzeugs 10 von diesem in das Zytoplasma abgege¬ ben. Anschließend wird das Werkzeug 10 zurückgezogen. Der Ab¬ lauf gemäß Fig. 2A kann dahingehend abgewandelt sein, dass die Substanz 13 im Zellkern 7 abgelegt oder eine Substanz aus dem Zytoplasma oder dem Zellkern mit dem Werkzeug entnommen wird. Figur 2B zeigt einen Ablauf analog zu Fig. 1, bei dem die Zelle 1 in zwei Zellkörper 4, 5 zerteilt wird, die jeweils eine topologisch geschlossene Form aufweisen. Der Zellkörper 4 enthält den Zellkern 7, während der Zellkörper 5 kernlos ist.
Figur 2C illustriert die Entnahme einer Probe 8 von der Zelle 1. Die Probe 8 umfasst bspw. einen Abschnitt der Zellmembran und/oder Teile des Zytoskeletts oder des Zytoplasmas, die mit dem Werkzeug von der Zelle 1 abgetrennt wurden, während der lebende Zustand der Zelle 1 erhalten bleibt.
Das Prinzip der erfindungsgemäßen Fusion zwischen verschiede¬ nen Zellen 1, IA ist in Fig. 2D schematisch gezeigt. Die Zellmembranen der aneinander angrenzend angeordneten Zellen 1, IA werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren durch ein Werkzeug geöffnet und zu einem neuen Verbund verschmolzen, in dem ein Teil der fremden Zelle IA in der ersten Zelle 1 auf¬ genommen (Fig. 2D) oder beide komplett verschmolzen wurden.
Die Komponenten eines erfindungsgemäßen Zellmanipulators 100 sind schematisch in Fig. 3 illustriert. Das Werkzeug 10 ist über eine mechanische Komponente wie z. B. einen Trägerstab, mit der Antriebseinrichtung 30 verbunden, die zur Einstellung der langsamen Verdrängungsbewegung des Werkzeugs 10 relativ zu einer Zelle (nicht dargestellt) auf dem Substrat 20 einge¬ richtet ist. Das Substrat 20 kann ebenfalls mit einer An¬ triebseinrichtung 3OA ausgestattet sein, um einen langsamen Vortrieb relativ zum Werkzeug 10 zu bilden. Mit den An- triebseinrichtungen 30 und/oder 3OA können ferner Zellbewe¬ gungen der Zelle auf dem Substrat 20 kompensiert werden.
Das Werkzeug 10 ist mit der Antriebseinrichtung 30 in allen drei Raumrichtungen, insbesondere senkrecht zur Oberfläche des Substrats 20 und in einer Ebene parallel zu dieser Ober¬ fläche beweglich. Hierzu kann die Antriebseinrichtung 30 meh¬ rere Einzelantriebe enthalten, die die Vortriebsbewegungen in die einzelnen Raumrichtungen bereitstellen. Die Antriebsein- richtungen 30, 3OA und/oder die Einzelantriebe sind an sich bekannte piezoelektrische Antriebe, die für die Einstellung von Relativgeschwindigkeiten unterhalb von 300 μm/h einge¬ richtet sind.
Das Substrat 20 ist bspw. ein Kulturträger aus Glas oder
Kunststoff. Auf der Oberfläche 21 des Substrats 20 kann eine strukturierte Beschichtung vorgesehen sein, die adhäsive Be¬ reiche (Inseln) , in denen Zellen bevorzugt anhaften, und nicht-adhäsive Bereiche aufweist, in denen die Zellen nicht oder mit verminderter Effektivität anhaften. Dies ermöglicht eine Bearbeitung von einer oder mehreren Zellen, während die¬ se sich auf einer adhäsiven Insel befinden. Eine Zellwande¬ rung wird durch die umgebenden nicht-adhäsiven Bereiche un¬ terbunden, so dass eine gesonderte Nachführbewegung zur Kom- pensation der Zellwanderung vermieden werden kann.
Das Werkzeug 10 und/oder das Substrat 20 sind mit einer Posi¬ tioniereinrichtung 40 relativ zueinander in allen drei Raum¬ richtungen verfahrbar. Die Positioniereinrichtung 40 ist ein an sich bekannter Stellantrieb, mit dem eine Positionierung des Werkzeugs 10 relativ zu der zu bearbeitenden Zelle be¬ reitgestellt wird.
Das Bezugszeichen 50 bezeichnet allgemein eine optische Sen- soreinrichtung zur Überwachung der Positionierung und der
Verdrängungsbewegung des Werkzeugs 10 relativ zur Zelle. Ty¬ pischerweise ist die Sensoreinrichtung 50 Teil eines Licht¬ mikroskops, in dessen Strahlengang das Werkzeug 10 und das Substrat 20 angeordnet sind. Die Antriebseinrichtung 30 und/oder 3OA, die Positionierein¬ richtung 40 und die optische Sensoreinrichtung 50 werden mit einer Steuereinrichtung 60 überwacht und gesteuert. Die Steu- ereinrichtung 60 ist bspw. ein Mikrokontroller oder in einem Steuerrechner enthalten.
Das Bezugszeichen 70 verweist allgemein auf ein optional vor¬ gesehenes weiteres Werkzeug, das ggf. unabhängig vom Werkzeug 10 betätigt werden kann (siehe Fig. 8) .
Verschiedene Gestaltungen des Werkzeugs 10 des erfindungsge¬ mäßen Zellmanipulators sind beispielhaft in Figur 4 gezeigt. Die Teilbilder A und B illustrieren in schematischer Seiten- ansieht jeweils das Werkzeug 10 mit der Arbeitsfläche 11 mit einem geringen Abstand von der Oberfläche des Substrats 20. Gemäß Teilbild A bildet die Arbeitsfläche 11 eine gerade Sei¬ tenkante 12, die bei paralleler Ausrichtung relativ zum Sub¬ strat 20 und senkrechter Annäherungsbewegung über ihre gesam- te Länge die Oberfläche des Substrats 20 berührend auf diesem aufges-etzt werden kann.' Gemäß Teilbild B' ist die Arbeitsflä¬ che 11 strukturiert, so dass keine glatte, gerade Seitenkante wie bei Teilbild A, sondern ein Gebilde mit einer Vielzahl von spitzenförmigen Vorsprüngen gegeben ist. Die Vorsprünge formen mehrere strukturierte, z. B. bogenförmige Seitenkan- tenabschnitte 12A, unter deren Einwirkung eine Zelle durch eine Translationsbewegung parallel zur Substratoberfläche in zwei Zellkörper getrennt werden kann.
Die Werkzeuge 10 der Teilbilder A und B werden vorzugsweise bei einer kombinierten Bewegung in den o. g. Annäherungs- und Translationsphasen verwendet. Die Länge der Seitenkante 12 beträgt bspw. 0.5 mm. Die Teilbilder C und D der Figur 4 illustrieren in schemati- scher Draufsicht zwei weitere Gestaltungen des Werkzeugs 10. Gemäß Teilbild C ist eine keilförmige Arbeitsfläche 11 vorge¬ sehen, mit der die Zelle 1 auf dem Substrat 20 bei Bewegung des Werkzeugs 10 parallel zur Substratoberfläche (Translati¬ onsphase) in zwei Zellkörper aufgetrennt werden kann. Gemäß Teilbild D umfasst das Werkzeug eine kreuzförmige Arbeitsflä¬ che 11, mit der die Zelle 1 auf dem Substrat 20 im Verlauf einer Annäherungsbewegung in vier Teile getrennt werden kann.
Die Komponente 14 illustriert jeweils schematisch ein mecha¬ nisches Bauteil (z. B. einen Trägerstab), über den das Werk¬ zeug 10 mit der Positioniereinrichtung 30 (siehe Figur 3) verbunden ist.
Die Figuren 5 bis 8 illustrieren schematisch experimentelle Ergebnisse, welche die Erfinder mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielt haben. Figur 5 zeigt analog zu Fig. 1 und Fig. 2B mit weiteren Einzelheiten die Zerteilung einer Zelle 1 in zwei Zellkörper 4, 5. Gemäß Teilbild A ist eine adhären- te Zelle 1, wie sie für in vitro-Kulturen typisch ist, auf dem Substrat 20 angeordnet. Die Zelle 1 ist z. B. eine Fibroblastenzelle oder eine adhärent auf einem Substrat ange¬ ordneten Stammzelle. Das Werkzeug 10 wird in Pfeilrichtung über der Zelle 1 mit der Positioniereinriσhtung (40, siehe
Fig. 3) ausgerichtet. Das in schematischer Perspektivansicht gezeigte Werkzeug 10 ist mit einer langgezogenen Schneide mit einem ellipsenförmigen Querschnitt ausgestattet, deren Ober¬ fläche die Arbeitsfläche 11 bildet. Ein besonderer Vorteil der Erfindung ist es, dass bei zahlreichen Anwendungen die Form des Werkzeugs für die erfindungsgemäße Bearbeitung von Zellen keinen oder eine wesentlich geringere Bedeutung hat als bei den herkömmlichen Techniken mit schnellen Werkzeugbe¬ wegungen. Die Länge der Schneide ist so gewählt, dass sich die Arbeits¬ fläche 11 über die gesamte Ausdehnung der Zelle 1 erstreckt. Die Breite der Schneide hingegen ist erheblich geringer als die Ausdehnung der adhärenten Zelle. Sie besitzt als charak¬ teristische Größe der Arbeitsfläche bspw. einen Wert von 5 um. Die Werkzeugbewegung umfasst zwei Phasen. Während der Annäherungsphase gemäß Figur 5A erfolgt die Werkzeugbewegung entlang einer Oberflächennormalen des Substrats 20 bspw. mit einer Geschwindigkeit im Bereich von 5 bis 50 μm/h. Wenn die Abschnürung der Zelle beidseitig des Werkzeugs 10 erreicht ist (Fig. 5B) , folgt die Translationsphase der Werkzeugbewe¬ gung. Während dieser Phase wird das Werkzeug 10 parallel zur Oberfläche des Substrats 20 bewegt. Die Geschwindigkeit die- ser Bewegung ist ebenfalls im Bereich von 5 bis 50 μm/h ge¬ wählt.
Nach dem Verschmelzen und Ausheilen der Zellmembranen der beiden Zellteile liegen die getrennten Zellkörper 4, 5 vor, die sich durch die eigenständige Zellwanderung sogar vonein¬ ander entfernen können (Fig. 5C) . Der Zellkörper 4 enthält den Zellkern 7 und ist mit diesem weiterhin vital, bewegungs¬ fähig und teilungsfähig. Der Zellkörper 5 kann zur Charakte¬ risierung der ursprünglichen Zelle durch eine Analyse der Membrankomponenten des Zytoplasmas, von Zellorganellen und auch von genetischem Material im Zytoplasma, wie z. B. mRNS verwendet werden. Vorteilhafterweise können die zu untersu¬ chenden Zellbestandteile quantitativ für die jeweilige Analy¬ se ausreichend ohne einen Vitalitätsverlust des kernhaltigen Zellkörpers 4 abgetrennt werden.
Figur 6 illustriert einen analogen Verfahrensverlauf wie Fig. 5, wobei in diesem Fall jedoch zwei Zellen 1, IA jeweils mit einer Zellmembran 2, 2A adhärent, sich gegenseitig überlap- pend auf dem Substrat 20 angeordnet sind. Derartige Überlap¬ pungen erfolgen in Zellkulturen häufig spontan, bspw. wenn eine hohe Zelldichte gegeben ist, oder wenn auf der Oberflä¬ che des Substrats 20 eine sog. Feeder-Zellschicht vorhanden ist, wie es von der Kultivierungstechnik für Stammzellen be¬ kannt ist.
Gemäß Figur 6A wird das Werkzeug 10 über dem Überlappungsbe¬ reich der Zellen 1, IA positioniert, anschließend mit der o. g. Verdrängungsgeschwindigkeit abgesenkt und ggf. in einer Translationsphase parallel zur Oberfläche des Substrats 20 bewegt. Durch die invasive Einwirkung des Werkzeugs 10 werden die Zellmembranen 2, 2A der Zellen 1, IA geöffnet und bei der anschließenden Heilung mit einer entsprechend veränderten Zu- sammensetzung und Form wieder verschlossen. Im Ergebnis sind in der Fusionszelle 6 Teile der Zellmembran 2A der Zelle IA (schraffiert gezeichnet) in die Zellmembran der Zelle 1 (ge¬ punktet gezeichnet) und umgekehrt eingebaut.
Mit dem in Figur 6 gezeigten Verfahren ist eine definierte paarweise Fusion biologischer Zellen möglich, wie sie bspw. bei der Ausstattung der ersten Zelle mit Antikörpern von der zweiten Zelle gewünscht ist.
Figur 7 illustriert ein weiteres Beispiel eines Fusionsvor¬ gangs mit der Verwendung von zwei Werkzeugen 10, 10A. Auf dem Substrat 20 ist eine Monolage der Zellen 1 eines ersten Zell¬ typs vorgesehen, auf der eine oder mehrere Zellen IA eines zweiten Zelltyps kultiviert werden. Diese Anordnung ent- spricht bspw. der Kultivierung von Stammzellen auf einer Fee¬ der-Zellschicht oder der Kombination verschiedener Zelltypen beim sog. Tissue Engineering. Analog zu den oben beschriebenen Verfahren werden die Werk¬ zeuge 10, 10A in der Annäherungsphase langsam in das Zellma¬ terial gedrückt (Fig. 7A) und dann ggf. in der folgenden Translationsphase parallel zur Oberfläche des Substrats 20 bewegt (Fig. 7B) . Durch die gleichzeitige Bewegung der Werk¬ zeuge 10, 10A können neben der Fusion der Zellen 1, IA im Be¬ reich zwischen den Werkzeugen 10, 10A des Weiteren Teile des Zellmaterials von der Fusionszelle 6 separiert werden. Hierzu ist eine Bewegung der Werkzeuge 10, 10A senkrecht zur longi- tudinalen Ausdehnung der jeweiligen Arbeitsflächen und paral¬ lel zur Oberfläche des Substrats 20 vorgesehen.
Das in Figur 7 gezeigte Verfahren kann des Weiteren wie folgt modifiziert werden. Mit der optischen Sensoreinrichtung, ins- besondere dem Mikroskop kann die Ausrichtung der Werkzeuge
10, 10A relativ zu den Zellen 1, IA je nach den Anforderungen so eingestellt werden, dass in der Fusionszelle 6 beide Zell¬ kerne oder lediglich ein Zellkern von einem der Zelltypen enthalten ist. Des Weiteren können die Zellen mit den Werk- zeugen 10, 10A auf dem Substrat 20 zusammengeschoben werden, bevor die Fusion erfolgt. Schließlich können die Zellen und insbesondere die Fusionszelle β mit den Werkzeugen 10, 10A lateral auf dem Substrat 20 verschoben werden.
Figur 8 illustriert eine weitere komplexe Manipulation unter Verwendung von zwei Werkzeugen 10, 10A, die zunächst in eine Monolage der Zellen 1 auf dem Substrat 20 abgesenkt und an¬ schließend lateral parallel zur Oberfläche des Substrats 20 und senkrecht zur longitudinalen Ausrichtung der Arbeitsflä- chen 11 auseinander geschoben werden (Fig. 8A) . Bei diesem Vorgang wird eine Lücke in der Monoschicht (Zellrasen) ge¬ schaffen. Ein wichtiger Vorteil der Erfindung besteht darin, dass die Form dieser Lücke unabhängig von der Anordnung der Zellen ausschließlich durch die Positionierung und Absenkung der Werkzeuge festgelegt werden kann. Am umlaufenden Rand der Lücke werden im Unterschied zu herkömmlichen Ausschnittver¬ fahren keine unerwünschten Wundränder, sondern geschlossene, ausgeheilte Membranformen gebildet. In die Lücke zwischen den Zellen 1 kann dann mit dem weiteren Werkzeug 70 (siehe auch Figur 3) eine oder mehrere Zellen oder ein künstliches Objekt eingesetzt werden. Das künstliche Objekt kann bspw. ein bio¬ logischer oder synthetischer Füllstoff, eine Sensoreinrich¬ tung, ein Mikrosystem oder ein Gewebeteil (z. B. Nervenzell- verbände oder Muskelzellverbände, Endothelien, Zusammenset¬ zungen aus diesen) umfassen.
Die fotografischen Abbildungen A bis E in Figur 9 zeigen den Fortschritt der erfindungsgemäßen Trennung einer Zelle 1 mit dem Werkzeug 10 in zwei Zellkörper 4, 5 am Beispiel eines konkreten experimentellen Ergebnisses. Die Darstellung zeigt Fibroblastenzellen auf einem Substrat 20. Als Werkzeug 10 wird eine ausgezogene Glasspitze verwendet, deren Durchmesser am spitzen Ende rd. 2 um beträgt. Gemäß Teilbild A wird das Werkzeug 10 zunächst neben der zu bearbeitenden Zelle 1 auf ■ dem Substrat aufgesetzt. Anschließend wird das Werkzeug 10 gemäß der o. g. Translationsbewegung parallel zur Oberfläche des Substrats verschoben (in den Abbildungen nach links) , wo¬ bei gemäß den Teilbildern C und D zunächst eine teilweise und im weiteren Bewegungsverlauf eine vollständige Trennung in die Zellkörper 4, 5 erfolgt. Teilbild E zeigt die weitere Be¬ weglichkeit der Zellkörper 4, 5 nach der Trennung.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeu¬ tung sein.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bearbeitung einer biologischen Zelle (1, IA), die ein von einer Zellmembran (2) umhülltes Zytoskelett (3) aufweist, mit den Schritten:
- gegenseitige Ausrichtung der biologischen Zelle (1, IA) und eines Werkzeugs (10, 10A), so dass das Werkzeug (10, 10A) die biologische Zelle (1, IA) berührt,
- Bewegung des Werkzeugs (10, 10A) und der biologischen Zelle (1, IA) relativ zueinander, und
- Bildung einer Unterbrechung im molekularen Verbund der Zellmembran (2) der biologischen ZeIIe(I, IA), dadurch gekennzeichnet, dass
- während der Bewegung des Werkzeugs (10, 10A) das Zytoske¬ lett (3) der biologischen Zelle (1, IA) einen Gleichgewichts¬ zustand aufweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Bewegung des Werk¬ zeugs (10, 10A) mit einer Geschwindigkeit erfolgt, die klei¬ ner oder gleich einer Umordnungsgeschwindigkeit des Zytoske- letts (3) ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Bewegung des Werkzeugs (10, 10A) mit einer Geschwindigkeit erfolgt, die kleiner oder gleich einer Wanderungsgeschwindigkeit von adhä- renten Zellen auf einer Oberfläche sind.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, bei dem die Bewegung des Werkzeugs (10, 10A) mit einer Geschwindigkeit erfolgt, die kleiner als 500 μm/h ist.
5. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprü¬ che, bei dem die biologische Zelle (1, IA) auf einem Substrat (20) angeordnet ist und das Werkzeug (10, 10A) relativ zu dem Substrat (20) bewegt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Bewegung des Werk¬ zeugs (10, 10A) relativ zu dem Substrat (20) eine Annähe¬ rungsphase, bei welcher der Abstand des Werkzeugs (10, 10A) relativ zu dem Substrat (20) verringert wird, und/oder eine Translationsphase umfasst, bei welcher das Werkzeug (10, 10A) parallel zur Oberfläche des Substrats (20) verschoben wird.
7. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprü¬ che, bei dem während der Bewegung die Zellmembran (2) mit dem Werkzeug (10, 10A) einer Deformation, Stauchung und/oder Deh¬ nung unterzogen wird.
8. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprü¬ che, mit dem weiteren Schritt: - Heilung der Unterbrechung, so dass die Zellmembran (2) ge¬ schlossen wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem während der Bildung und der folgenden Heilung der Unterbrechung der Zellmembran (2) eine Trennung eines Innenraumes der Zelle (1, IA) von der Um¬ gebung gegeben ist .
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, bei dem die Zellmembran (2) nach der Heilung eine andere Form, Zusammensetzung und/oder Größe besitzt als vor der Bildung der Unterbrechung.
11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die Zelle (1, IA) nach der Heilung in zwei Zellkörper (4, 5) getrennt ist, die jeweils eine topologisch geschlossene Form aufweisen.
12. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem einer der getrennten Zellkörper (5) kernlos ist.
13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem der kernlose Teil (5) einer Untersuchung unterzogen wird.
14. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die Zellmembran (2) nach der Heilung mit einer fremden Zellmembran (2A) einer weiteren biologischen Zelle (IA) mindestens einen topologisch geschlossenen Zellkörper bildet.
15. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die biologische Zelle (1) mit mindestens einer weiteren biologischen Zelle (IA) zu einer Fusionszelle (6) fusioniert wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem die Zellen (1, IA) während der Fusion auf einem Substrat (20) übereinander ange¬ ordnet sind.
17. Zellmanipulator (100), insbesondere zur Bearbeitung von biologischen Zellen (1, IA), der umfasst:
- ein Substrat (20) zur Aufnahme einer Zelle (1, IA) ,
- ein Werkzeug (10, 10A) zur Bearbeitung der biologischen Zelle (1, IA) , und
- eine Antriebseinrichtung (30, 30A) zur Bewegung des Werk¬ zeugs (10, 10A) relativ zum Substrat (20) , dadurch gekennzeichnet, dass
- das Werkzeug (10, 10A) eine Arbeitsfläche (11) aufweist, unter deren Wirkung die Zellmembran (2) der biologischen Zel¬ le (1, IA) lokal selektiv deformierbar ist.
18. Zellmanipulator nach Anspruch 17, bei dem die Arbeits¬ fläche (11) des Werkzeugs (10, 10A) eine charakteristische Größe aufweist, die geringer als 200 um ist.
19. Zellmanipulator nach Anspruch 18, bei dem die Arbeits¬ fläche (11) des Werkzeugs (10, 10A) eine charakteristische Größe aufweist, die geringer als 10 um ist.
20. Zellmanipulator nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 19, bei dem die Arbeitsfläche (11) des Werkzeugs (10,
10A) eine Beschichtung (12) trägt, die ein Anhaften von Zel¬ len behindert.
21. Zellmanipulator nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 20, bei dem die Antriebseinrichtung (30, 30A) zur Bewe¬ gung des Werkzeugs (10, 10A) mit Geschwindigkeiten im Bereich von 0.1 μm/h bis 500 μm/h eingerichtet ist.
22. Zellmanipulator nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 21, bei dem die Antriebseinrichtung (30, 30A) einen pie¬ zoelektrischen Antrieb oder einen Magnetantrieb aufweist.
23. Zellmanipulator nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 22, der eine Positioniereinrichtung (40) zur Positionie- rung der Antriebseinrichtung (30, 30A) und/oder eines Sub¬ strats (20) mit der biologischen Zelle (1, IA) aufweist.
24. Zellmanipulator nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 23, der eine Sensoreinrichtung (50) zur Erfassung der Po- sition des Werkzeugs (10, 10A) und/oder der biologischen Zel¬ le (1, IA) aufweist.
25. Zellmanipulator nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 24, der mindestens zwei Werkzeuge (10, 10A) aufweist.
26. Zellmanipulator nach mindestens einem der Ansprüche 17 bis 25, bei dem das Werkzeug (10, 10A) eine gerade Seitenkan¬ te (12) oder strukturierte Seitenkantenabschnitte (12A) auf- weist.
27. Verwendung eines Verfahrens oder eines Zellmanipulators nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche zur:
- Fusion biologischer Zellen, und/oder - Diagnose oder Charakterisierung einzelner Zellen,
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