WO2006064121A2 - Anticorps cytotoxique dirige contre les proliferations hematopoïetiques lymphoïdes de type b - Google Patents

Anticorps cytotoxique dirige contre les proliferations hematopoïetiques lymphoïdes de type b Download PDF

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    • C12N2510/02—Cells for production

Definitions

  • B-CLL is the most common form of leukemia in western countries, with sometimes poor chemotherapy treatments, with side effects that lead to hematopoietic cell aplasia and immunodeficiency, monoclonal antibodies appear to be innovative remedy. It is therefore of primary importance to develop antibodies capable of specifically targeting the CD20 antigen and making it possible to destroy tumor cells that only weakly express this antigen, such as LLC-B.
  • the antibodies 2F2 and 7D8 proposed by Genmab (Teeling et al. Blood 2004 104 (6) .- 1793-800) to treat B-CLL have a capacity to activate complement greater than that caused by Rituxan ®.
  • these antibodies have a low ADCC activity, similar to Rituxan ® .
  • some clinicians show that the complement activity is the cause of deleterious side effects because the antibodies then trigger an activation system leading to the production of molecules (including anaphylatoxins) with a wide spectrum of non-specific activities ( inflammatory, allergic, vascular reactions ).
  • these antibodies are still in the research stage, and their clinical efficacy is yet to be evaluated.
  • the murine nucleic acid sequences SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7 encode the variable domain of each of the light chains and the variable domain of each of the heavy chains respectively of the antibody produced by the murine CAT-hybridoma. 13.6E12, available from the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) under the number ACC 474.
  • This hybridoma produces a mouse monoclonal antibody of IgG2a type, ⁇ directed against CD20.
  • the antibodies according to the invention also have constant regions of its light and heavy chains belonging to a non-murine species.
  • non-murine mammals all families and species of non-murine mammals are likely to be used, and in particular humans, monkeys, murids (except the mouse), suids, cattle, equines, felids , canids, for example, and birds.
  • the antibodies according to the invention can be constructed using standard techniques of recombinant DNA, which are well known to those skilled in the art, and more particularly by using the "chimeric" antibody construction techniques described, for example, in Morrison et al. ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp. 6851-55 (1984) ' , where the recombinant DNA technology is used to replace the constant region of a heavy chain and / or the constant region of a light chain of an antibody from a non-mammalian mammal. with the corresponding regions of a human immunoglobulin.
  • a particular embodiment will be illustrated below.
  • variable region of each of the light chains of the antibody according to the invention is coded by a sequence having at least 80% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5, and the region variable of each of the heavy chains of the antibody according to the invention is coded by a sequence having at least 80% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 7.
  • variable region of each of the light chains of the antibody according to the invention is coded by a sequence having at least 90% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5, and the region The variable of each of the heavy chains of the antibody according to the invention is encoded by a sequence having at least 90% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 7.
  • variable region of each of the light chains of the antibody according to the invention is coded by a sequence having at least 95% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5, and the region The variable of each of the heavy chains of the antibody according to the invention is encoded by a sequence having at least 95% identity with the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 7.
  • the antibodies of the invention also include any antibody having CDR regions (Complementary Determining Region) of the CAT-13.6E12 antibody, associated with FR regions (framework, highly conserved regions of variable regions, also called "framework").
  • CDR regions Complementary Determining Region
  • FR regions frame, highly conserved regions of variable regions, also called "framework”
  • Such antibodies have a very comparable affinity and specificity, preferably identical, to the murine CAT-13.6E12 antibody.
  • the antibodies of the two embodiments differ in their nucleotide sequence by a single nucleotide: the nucleotide located at position 318 of the sequences SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 25, which respectively correspond to a cytosine and an adenine.
  • the antibodies of the invention corresponding to each of these embodiments have a comparable specificity, preferably identical with respect to the target antigen, CD20, as well as a comparable affinity, preferably identical to CD20.
  • the constant regions of each of the light chains and of each of the heavy chains of the antibody according to the invention are human constant regions.
  • This preferred embodiment of the invention makes it possible to reduce the immunogenicity of the antibody in humans and thereby improve its efficacy during its therapeutic administration in humans.
  • the constant region of each of the light chains of the antibody according to the invention is of type K. Any allotype is suitable for carrying out the invention, for example Km (I), Km (I, 2), Km (I, 2, 3) or Km (3) but the preferred allotype is Km (3).
  • the constant region of each of the light chains of the antibody according to the invention is of type ⁇ .
  • the constant region of each of the heavy chains of the antibody is of type ⁇ .
  • the constant region of each of the heavy chains of the antibody may be of type ⁇ 1, of type ⁇ 2, of type ⁇ 3, these three types of constant regions having the particularity of fixing the human complement, or of type ⁇ 4 .
  • Antibodies possessing a constant region of each of the heavy chains of type ⁇ belong to the class of IgGs.
  • Immunoglobulin type G are heterodimers consisting of 2 heavy chains and 2 light chains, linked together by disulfide bridges. Each chain consists, in the N-terminal position, of a region or variable domain (encoded by the rearranged genes VJ for the light chain and VDJ for the heavy chain) specific for the antigen against which the antibody is directed, and in the C-terminal position, a constant region consisting of a single CL domain for the light chain or 3 domains (CH1, CH2 and CH3) for the heavy chain.
  • variable domains and the CH 1 and CL domains of the heavy and light chains forms the Fab portions, which are connected to the Fc region by a very flexible hinge region allowing each Fab to bind to its antigenic target while the Fc region, mediator of the effector properties of the antibody, remains accessible to effector molecules such as Fc ⁇ R receptors and CIq.
  • the Fc region consisting of the 2 globular domains CH 2 and CH 3 , is glycosylated at the CH 2 domain with the presence, on each of the 2 chains, of a biantennenic JNT-glycan of lactosaminic type, linked to Asn 297. .
  • the constant region of each of the heavy chains of the antibody is of ⁇ 1 type, since such an antibody shows an ability to generate ADCC activity in the largest number of (human) individuals.
  • any allotype is suitable for carrying out the invention, for example GIm (3), GIm (1, 2, 17), GIm (I, 17) or GIm (I, 3).
  • the allotype is GIm (I, 17).
  • each of the light chains of the antibody according to the invention is encoded by the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 13 or by the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ . ID NO: 27, and each of the heavy chains is encoded by the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 19.
  • the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 13 encoding each of the light chains of the antibody is obtained by fusion of the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5 coding for the variable domain of each of the light chains of the antibody and of the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 21 coding for the constant region of each of the light chains of the antibody.
  • the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 27 encoding each of the light chains of the antibody is obtained by fusing the acid sequence murine nucleic acid SEQ ID NO: 25 encoding the variable domain of each of the light chains of the antibody and of the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 21 coding for the constant region of each of the light chains of the antibody.
  • the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 19 coding for each of the heavy chains of the antibody is obtained by melting the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 7 coding for the variable domain of each of the heavy chains of the antibody and the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 23 encoding the constant region of each of the heavy chains of the antibody.
  • each of the light chains of the antibody is encoded by the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 13 and each of the heavy chains is encoded by the sequence of Murine-human chimeric nucleic acid SEQ ID NO: 19,
  • the peptide sequence of each of the light chains, deduced from the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 13 is the sequence SEQ ID NO: 14
  • the peptide sequence of each of the heavy chains, deduced from the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 19 is the sequence SEQ ID NO: 20.
  • the invention also includes antibodies wherein each of the light chains encoded by a murine-human chimeric nucleic acid sequence has at least 70% homology or identity with the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 13 and each of the heavy chains encoded by a murine-human chimeric nucleic acid sequence has at least 70% homology or identity with the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 19, these modifications do not alter the specificity of the antibody nor its effector activities, such as ADCC (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity) activity.
  • ADCC Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity
  • a preferred antibody according to the invention is the EMAB6 antibody produced by the clone R509 deposited on November 8, 2004 under the registration number CNCM 1-3314 with the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM, Pasteur Institute, 25 rue du Dondel Roux, 75724 Paris Cedex 15).
  • Each of the light chains of the EMAB6 antibody is encoded by the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 13, and each of the heavy chains is encoded by the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 19.
  • This chimeric antibody competes with murine antibody CAT-13.6E12 for CD20 uptake and has a much higher cytotoxic activity than Rituxan ® , which can be attributed in part to the particular glycosylation of N-glycan the heavy chain of these antibodies (see Example 4).
  • the clone R509 has the particularity of producing an EMAB6 antibody composition having a fucose / galactose content ratio of less than 0.6, for which it has been demonstrated in the patent application FR 03 12229 that is optimal for conferring strong ADCC activity to antibodies. This antibody is therefore particularly interesting as a therapeutic tool for the treatment of pathologies whose cells to target express CD20.
  • Another subject of the invention relates to the vector pEF-EMAB6-H for the expression of the heavy chain of an antibody according to the invention, of sequence SEQ ID NO: 18.
  • This vector is the vector allowing the expression of an antibody according to the invention whose heavy chain is encoded by the nucleic acid sequence SED ID NO: 19, whose deduced peptide sequence is the sequence SEQ ID NO: 20.
  • This vector is a nucleic acid molecule in which the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 7 coding for the variable domain of each of the heavy chains of the antibody and the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 23 coding for the constant region of each of the heavy chains antibodies were inserted, to introduce and maintain them in a host cell.
  • an antibody produced by coexpression of the vectors pEF-EMAB6-K and pEF-EMAB6-H in the YB2 / 0 cell is illustrated by the anti-CD20 EMAB6 antibody produced by the clone R509 (deposited under the registration number CNCM 1-3314 at the CNCM).
  • This antibody induces a higher cytotoxicity than that induced by Rituxan on both B-CLL cells (on which the CD20 antigen is more weakly expressed) and on Raji cells, used as a model and expressing the CD20 at a higher density compared to cells of patients with B-CLL.
  • the EMAB6 antibody induces an IL-2 secretion (interleukin 2) by the Jurkat ⁇ CD16 cells much stronger than the Rituxan antibody.
  • the EMAB6 antibody which can be produced by culturing the R509 clone in a medium and conditions allowing the expression of previously described vectors, is therefore a most interesting tool likely to advance the therapy and diagnosis of pathologies involving CD20, and more particularly the LLC-B, as well as research in this domain.
  • a particular object of the invention is a stable cell line expressing an antibody according to the invention.
  • the line used is the YB2 / 0 rat hybridoma.
  • This line was chosen because of its ability to produce antibodies with improved ADCC activity compared to antibodies of the same primary structure produced for example in CHO.
  • a particular aspect of the invention relates to the clone R603 deposited under the registration number CNCM 1-3529 to the National Collection of Cultures of Microorganisms (CNCM).
  • Another particular subject of the invention relates to a DNA fragment of sequence SEQ ID NO: 13 encoding the light chain of an antibody according to the invention.
  • the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 13 encodes each of the light chains of the antibody. It is obtained by fusion of the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 5 coding for the variable domain of each of the light chains of the antibody and of the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 21 coding for the constant region of each of the light chains of the antibody.
  • Another particular subject of the invention relates to a DNA fragment of sequence SEQ ID NO: 27 coding for the light chain of an antibody according to the invention.
  • the murine-human chimeric nucleic acid sequence SEQ ID NO: 27 encodes each of the light chains of the antibody. It is obtained by melting the murine nucleic acid sequence SEQ ID NO: 25 coding for the variable domain of each of the light chains of the antibody and of the human nucleic acid sequence SEQ ID NO: 21 coding for the region. constant of each of the light chains of the antibody.
  • a particular object of the invention relates to the use of the antibody according to the invention for activating, in vivo or in vitro, the Fc ⁇ RIIIA receptors of effector immune cells.
  • the antibodies of the invention have the particularity and advantage of being cytotoxic. As such, they have the ability to activate by their region Fc the Fc ⁇ RIIIA receptor. This represents a considerable interest because this receptor is expressed on the surface of cells called "effector cells”: the binding of the Fc region of the antibody to its receptor carried by the effector cell causes the activation of Fc ⁇ RIIIA and the destruction target cells.
  • the effector cells are, for example, NK (Natural Killer) cells, macrophages, neutrophils, CD8 lymphocytes, T ⁇ lymphocytes, NKT cells, eosinophils, basophils or mast cells.
  • the antibody of the invention is used as a medicament.
  • a medicament is intended to treat diseases whose Target cells are cells expressing CD20, such as B-cell malignant lymphomas.
  • Another object of the invention is the use of the antibody according to the invention for the manufacture of a medicament for the treatment of lymphoid leukemia.
  • Another object of the invention is the use of the antibody according to the invention for the manufacture of a medicament for the treatment of chronic lymphocytic leukemia type B (LLC-B).
  • the antibody according to the invention is particularly suitable for treating pathologies for which CD20 is more weakly expressed on B lymphocytes, and preferably B-CLL (Chronic Lymphocytic Leukemia type B).
  • the antibody according to the invention may be used in combination with one or more other antibodies, for example monoclonal antibodies (ux), directed against one or more other antigen (s) expressed (s).
  • lymphoid cells such as, for example, HLA-DR, CD19, CD23, CD22, CD80, CD32 and CD52 antigens, for the manufacture of a medicament for the treatment of leukemia or lymphoma.
  • lymphoid cells such as, for example, HLA-DR, CD19, CD23, CD22, CD80, CD32 and CD52 antigens.
  • the antibody according to the invention may be used in combination with cells expressing Fc ⁇ R such as NK cells, NKT (Natural Killers T) cells, T ⁇ lymphocytes, macrophages, monocytes or dendritic cells, i.e., in combination with cell therapy (Peller S, Kaufman S Blood 1991, 78: 1569, Platsoucas CD et al J Immunol 1982, 129: 2305, Kimby E et al., 1989 Leukemia 3 (7): 501-504; Soorskaar D et al. 1988 Int Arch Allery Appl Immunol 87 (2).-159-164, - Ziegler HW et al. 1981 Int J Cancer 27 (3).-321-327, Chaperot L et al. 2000 Leukemia 14 (9): 1667'-77, - Vuillier F, Dighiero G 2003 Bull Cancer. 90 (8-9): 744-50).
  • Fc ⁇ R such as NK cells, NKT (Natural Killers T
  • the antibody according to the invention advantageously makes it possible to reduce the doses administered to the patients: advantageously, the dose of the antibody administered to the patient is twice, five times, or else ten times, twenty-five times, fifty times or particularly advantageously 100 times less than a dose of Rituxan.
  • the dose of the antibody administered to the patient is between 2 and 5 times, between 5 and 10 times, between 5 and 25 times, between 5 and 50 times or between 5 and 100 times less than a dose.
  • Rituxan "Thus, the antibody according to the invention, e.g.
  • EMAB6 can advantageously be administered at a dose lower than 187.5 mg / m 2 to 75 mg / m 2, 37.5 mg / m 2 , 15 mg / m 2 , 7.5 mg / m 2 or particularly advantageously less than 3.75 mg / m 2
  • the dose administered is advantageously between 187.5 mg / m 2 and 75 mg / m 2. m 2 , or between 75 mg / m 2 and 37.5 mg / r 2 , between 75 mg / m 2 and 15 mg / m 2 , between 75 mg / m 2 and 7.5 mg / m 2, or between 75 mg / m 2 and mg / m 2 and 3.75 mg / m 2 .
  • the invention also includes a method of treating diseases whose target cells are cells expressing CD20, such as B-cell malignant lymphomas, comprising administering to a patient, at an effective dose, the a composition comprising an antibody according to the invention.
  • the method of treatment is particularly suitable for the treatment of leukemia or lymphoma. More specifically, it is a method for treating a pathology chosen from acute lymphoblastic leukemia B, lymphoblastic lymphoma B, and mature B-cell lymphoma, among which chronic lymphocytic leukemia type B (CLL-B) lymphocytic lymphoma.
  • CLL-B chronic lymphocytic leukemia type B
  • Figure 1 Schematic representation of the vector CKHu used for the chemization of the kappa light chain of the EMAB6 and EMAB603 antibodies.
  • Figure 2 Schematic representation of the pEF-EMABG-K light chain expression vector used for the production of the EMAB6 antibody.
  • Figure 3 Schematic representation of the vector GlHu used for the chemization of the heavy chain of the EMAB6 and EMAB603 antibodies.
  • Figure 4 Schematic representation of the pEF-EMAB6-H heavy chain expression vector used for the production of the EMAB6 antibody.
  • FIG. 5 Competition by the chimeric EMAB6 antibody for the binding of the CAT-13.6E12 murine antibody (CAT13) to CD20 expressed on Raji cells.
  • Figure 8 ADCC induced by anti-CD20 antibodies in the presence of B-lymphocytes of patients with B-CLL.
  • Figure 10 Activation of CD16 (Fc ⁇ RIIIA) induced by anti-CD20 in the presence of B-lymphocytes of patients with B-CLL.
  • Figure 11 IL-2 production induced by the murine antibody CAT-13.6E12 in the presence of Jurkat-CD16 cells (Fc ⁇ RIIIA).
  • Figure 12 Schematic representation of the pRSV-HL-EMAB603 heavy and light chain expression vector used for the production of the EMAB603 antibody.
  • variable domains of light (VK) and heavy chains After reverse transcription, the variable domains of light (VK) and heavy chains
  • VH of the CAT-13.6E12 antibody were amplified by the 5'RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) technique.
  • Murine G2a specific antisense primer (SEQ ID NO: 2) 5'- CTG AGG GTG TAG AGG TCA GAC TG -3 '
  • PCR primers 5'RACE a Murine Kappa Antisense Primer (SEQ ID NO: 3)
  • Murine G2a specific antisense primer SEQ ID NO: 4
  • VH and VK PCR products thus obtained were cloned into the pCR4Blunt-TOPO vector (Zero blunt TOPO PCR cloning kit, Invitrogen, K2875-20) and then sequenced.
  • the nucleotide sequence of the VA: region of the murine antibody CAT-13.6E12 is indicated under the sequence SEQ ID NO: 5 and the deduced peptide sequence is the sequence SEQ ID NO: 6.
  • the VK gene belongs to the V ⁇ 4 family [ Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest," NIH Publication, 91-3242 (1991)].
  • the nucleotide sequence of the VH region of CAT-13.6E12 is the sequence SEQ ID NO: 7 and the deduced peptide sequence is the sequence SEQ ID NO: 8.
  • the VH gene belongs to the VH1 family [Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, "NIH Publication, 91-3242 (1991)].
  • VK sequence cloned into the pCR4Blunt-T0P0 sequencing vector was amplified using the following cloning primers: a) VK sense primer (SEQ ID NO: 9)
  • the VA PCR product thus obtained contains the sequence encoding the natural signal peptide of the murine antibody CAT-13.6E12.
  • This VK PCR was then cloned between the Spe I and Dra III sites of the light chain chimeric vector (FIG 1) which corresponds to the sequence SEQ ID NO: 11, 5 'of the human CK constant region, whose sequence nucleic sequence is the sequence SEQ ID NO: 21 and the deduced peptide sequence is the sequence SEQ ID NO 22.
  • the human CK sequence of this chimerization vector was previously modified by silent mutagenesis to create a Dra III restriction site to allow the cloning of murine VK sequences.
  • This chimerization vector contains an RSV promoter and a bGH (Growth Hormone) polyadenylation sequence as well as the dhfr (dihydrofolate reductase) selection gene.
  • the protocol is the same as for the light chain vector of the EMAB6 antibody (see Example 1, B-I.1), except for the VK antisense primer, which is:
  • VK antisense primer SEQ ID NO: 29
  • nucleotide framed in the sequence of the antisense primer SEQ ID NO: 29 which corresponds to the N106K mutation (see nucleotide sequence and the deduced peptide sequence SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26) with respect to the sequence natural VK of CAT-13.6E12 (see SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6).
  • sequence of the light chain of the chimeric antibody EMAB603 encoded by this vector is presented in SEQ ID NO: 27 for the nucleotide sequence and corresponds to the deduced peptide sequence SEQ ID NO: 28.
  • VH sequence cloned into the vector pCR4Blunt-T0P0 was first amplified using the following cloning primers: a) sense primer VH (SEQ ID NO: 15) 5 '- CTCAGTACTAGTGCCGCCACCA ⁇ GGGATTCAGCAGGATCTTTCTC -3'
  • VH antisense primer SEQ ID NO: 16
  • the amplified VH fragment contains the sequence encoding the natural signal peptide of the murine antibody CAT-13.6E12.
  • This VH PCR was then cloned between the Spe I and Apa I sites of the heavy chain chimeric vector (FIG 3) which corresponds to the sequence SEQ ID NO: 17, 5 'of the human ⁇ 1 constant region whose nucleic sequence is the sequence SEQ ID NO: 23 and the deduced peptide sequence is the sequence SEQ ID NO: 24.
  • This chimerization vector contains an RSV promoter and a bGH (bovine Growth Hormone) polyadenylation sequence as well as the neo selection gene.
  • sequence of the heavy chain of chimeric antibodies EMAB6 and EMAB603 encoded by this vector is presented in SEQ ID NO: 19 for the nucleotide sequence and SEQ ID NO: 20 sequence for the deduced peptide sequence.
  • the RSV promoter of the kappa light chain chimeric vector (see Example 1, B-1.1) was replaced by the EF-I promoter. human alpha.
  • the final light chain expression vector pEF-EMAB6-K is presented in FIG. 2 and corresponds to the sequence SEQ ID NO: 12.
  • sequence of the light chain of the EMAB6 chimeric antibody encoded by this vector is presented in SEQ ID NO: 13 for the nucleotide sequence and corresponds to the deduced peptide sequence SEQ ID NO: 14.
  • a single expression vector containing the two heavy chain and light chain transcription units of the anti-CD20 EMAB-603 antibody was constructed from the two chimeric vectors of the light chain and the heavy chain (cf respectively example 1, B-1.2 and Example 1-B2) by subcloning into the Xho I site of the heavy chain vector a BgI II-Pvu II fragment of the light chain vector containing the light chain transcription unit and the gene. dhfr.
  • This pRSV-HL-EMAB-603 expression vector has two neo (neo-phosphotranspherase II) and dhfr (dihydrofolate reductase) selection genes as well as two heavy chain and light chain transcription units under the control of an RSV promoter ( Figure 12).
  • the YB2 / 0 rat line was cultured in EMS medium (Invitrogen, Cat # 041-95181M) containing 5% fetal calf serum (JRH Biosciences, Cat # 12107).
  • EMS medium Invitrogen, Cat # 041-95181M
  • fetal calf serum JRH Biosciences, Cat # 12107.
  • 5 million cells were electroporated (Biorad electroporator, model 1652077) in Optimix medium (Equibio, ref EKITE 1) with 25 ⁇ g of light chain vector, pEF-EMAB6-K (FIG 2), linearized by Aat II, and 27 ⁇ g heavy chain vector, pEF-EMAB6-H (Fig.
  • transfectants producing the most antibodies were amplified in P24 plates and their supernatant redosed by ELISA in order to estimate their productivity and to select the 3 best producers for limiting dilution cloning (40 cells / plate).
  • the clone R509.6A4 (R509-33903 / 046-6H1 (1) 6A4, productivity: 17 ⁇ g / 10 6 cells), hereinafter referred to as "R509", as well as the clone R603 were selected respectively for the production of the chimeric EMAB6 antibody and that of the EMAB603 antibody and progressively adapted to the CD Hybridoma production medium (Invitrogen, ref 11279-023).
  • the production of the chimeric antibodies EMAB6 and EMAB603 was carried out by expansion of the adapted culture in CD Hybridoma medium, obtained by dilution at 3 ⁇ 10 5 cells / ml in 75 cm 2 and 175 cm 2 flasks and then by dilution to 4.5 ⁇ 10 5 cells. / ml in roller type bottle. After reaching the maximum volume (1 1), the culture was continued until cell viability was only 20%. After production, the chimeric antibodies EMAB6 and EMAB603 were purified by protein A affinity chromatography (purity estimated by HPLC ⁇ 95%) and monitored by polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the specificity of the antigenic recognition of the chimeric EMAB6 antibody was evaluated by a competition study with the CAT-13.6E12 murine antibody for binding to the CD20 antigen expressed by Raji cells.
  • the EMAB6 antibody (10 ⁇ l of 0.5 to 50 ⁇ g / ml) was incubated at 40 ° C. with a fixed quantity of murine CAT-13.6E12 antibody (10 ⁇ l at 5 ⁇ g / ml) for 20 minutes in the presence of Raji cells (50 ⁇ l to 4x10 6 / ml). After washing, an anti-mouse IgG antibody coupled to phycoerythrin (PE) was added to the Raji cells so as to specifically detect the binding of the murine CAT-13.6E12 antibody. MFIs obtained in the different concentrations of EMAB6 are expressed as a percentage, the 100% corresponding to the binding to CAT-13.6E12 cells in the absence of
  • PE phycoerythrin
  • the antigenic recognition specificity of the EMAB603 antibody is comparable to that of the antibody
  • the complement-dependent cytotoxic activity of the EMAB6 and EMAB603 antibodies is studied with Raji cells in the presence of young rabbit serum as complement source; chimeric anti-CD20 Rituxan antibody is included in a test for comparison.
  • the Raji cells are adjusted to 6x10 5 cells / ml in IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 5% FCS.
  • the antibodies are diluted in IMDM + 0.5% FCS.
  • the reaction mixture is composed of 50 ⁇ l of antibody, 50 ⁇ l of young rabbit serum (1/10 dilution in IMDM 0.5% FCS of Cedarlane reagent CL 3441), 50 ⁇ l of target cells and 50 ⁇ l of 0.5% IMDM medium. FCS.
  • the final antibody concentrations are 5,000, 1,250, 250 and 50 ng / ml. A control without antibodies is included in the test.
  • Percent lysis is estimated using a calibration range obtained with different dilutions of triton X100 (2%) lysed target cells corresponding to 100, 50, 25 and 0% lysis respectively.
  • ADCC activity The cytotoxicity of the chimeric EMAB6 antibody was evaluated in the presence of Raji cells or B lymphocytes of CLL patients.
  • the chimeric anti-CD20 Rituxan antibody is included in the tests for comparison.
  • NK cells are isolated from PBMCs using Myltenyi's magnetic bead separation (MACS) technique.
  • the NK cells are washed and resuspended in IMDM + 5% FCS (45x10 5 cells / ml). Effector cells and target cells are used in a ratio of 15: 1.
  • Raji cells or PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cells
  • NK effector cells are replaced by IMDM + 5% FCS.
  • Lyse without antibodies (Ac): the antibodies are replaced by IMDM + 5% FCS.
  • the plates After 4 hours of incubation at 37 ° C. under an atmosphere enriched with 5% CO 2 , the plates are centrifuged and the fluorescence associated with the supernatant measured on a fluorimeter (excitation 485nm / emission 535nm).
  • Percent lysis is estimated using a calibration range obtained with different dilutions of Triton X100 (2%) lysed target cells corresponding to 100, 50, 25 and 0% lysis respectively.
  • % lysis (% lysis with Antibody and NK) - (% lysis without Antibody) - (% lysis without NK), then expressed in relative percentage, 100% being the value obtained at the highest concentration of Rituxan.
  • the CD16 activation (Fc ⁇ RIIIA) induced by the chimeric antibody EMAB6 was determined in the presence of Raji cells or B lymphocytes of patients with CLL. This test assesses the ability of the antibody to bind on the CD16 receptor (Fc ⁇ RIIIA) expressed on Jurkat-CD16 cells and to induce the secretion of IL-2.
  • the chimeric anti-CD20 Rituxan antibody is included in the tests for comparison.
  • the CD16 activation measurement is carried out on the Jurkat-CD16 line in the presence of Raji cells or of B lymphocytes of patients presenting an LLC as follows:
  • 96-well plate mixture 50 ⁇ l of antibody solution (10,000, 1000, 100 and 10 ⁇ g / ml dilution in 5% FCS IMDM for B-lymphocytes of patients with B-CLL and 10,000, 2000, 1000, 200, 100, 50 and 25 ng / ml for Raji cells), 50 ⁇ l of PMA (Phorbol Myristate Acetate, dilution at 40 ⁇ g / ml in IMDM 5% FCS), 50 ⁇ l of Raji cells or PBMC of patients with a B-CLL obtained after Ficoll (> 95% of B lymphocytes) diluted to 6x10 5 / ml in IMDM 5% FCS, and 50 ⁇ l of Jurkat-CD16 cells (20x10E6 / ml in IMDM 5% FCS).
  • antibody solution 10,000, 1000, 100 and 10 ⁇ g / ml dilution in 5% FCS
  • PMA Phorbol Myristate Acetate, d
  • Antibody-free controls are included in all tests. After incubation overnight at 37 ° C., the plates are centrifuged, and the IL-2 contained in the supernatants evaluated with the commercial kit (Quantikine from R / D). The OD reading is 450nm.
  • IL-2 level as a function of the antibody concentration (from 0 to 2500 ng / ml final concentration), then as a relative percentage, 100% being the value obtained with Rituxan ' at the highest concentration tested.
  • the CD16 activation (Fc ⁇ RIIIA) induced by the chimeric EMAB603 antibody in the presence of Raji cells is comparable with that induced by the EMAB6 antibody.
  • the results obtained, presented in FIG. 10 show that in the presence of the anti-CD20 Rituxan ® and EMAB6 antibodies, Jurkat-CD16 cells secrete IL-2, indicating cell activation via attachment of the Fc portion of the antibodies by CD16. Nevertheless, the EMAB6 antibody has a much greater inducing capacity than the Rituxan antibody.
  • the origin of this larger difference may, among other things, be due to the lower antigenic expression of CD20 on B lymphocytes of patients with B-CLL compared to that of Raji cells.
  • the complement-dependent cytotoxic activity of EMAB6 against lymphocytes of patients with B-CLL should be lower than that induced by Rituxan, thus having the advantage of to be less toxic "in vivo" because of the adverse effects related to a strong activation of the classical pathway of complement.
  • Example 4 Analysis of the glycans of EMAB6 and EMAB603 by HPCE-LIF
  • the structure of the N-glycan of the heavy chain of the EMAB6 and EMAB603 antibodies was analyzed by HPCE-LIF.
  • the N-glycan structure of the Rituxan * heavy chain was also analyzed for comparison.
  • the anti-CD20 monoclonal antibodies were desalted on a Sephadex G-25 column (HiTrap Desalting, Amersham Biosciences), dried by evaporation and resuspended in the PNGase F hydrolysis buffer (Glyko) in the presence 50 mM ⁇ -mercaptoethanol.
  • oligosaccharides thus obtained were either directly labeled with a fluorochrome -.
  • APTS (1-amino-pyrene-3, 6, 8-trisulfonate) is subjected to the action of specific exoglycosidases before labeling with APTS.
  • the oligosaccharides thus labeled were injected onto a W-CHO capillary, separated and quantified by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection (HPCE-LIF).
  • the evaluation of the fucose level was carried out either by the addition of the isolated fucosylated forms, or more specifically after simultaneous action of the neuraminidase, ⁇ -galactosidase and IV-acetylhexosaminidase, making it possible to obtain, on the electrophoregram, 2 peaks corresponding to the pentasaccharide [GlcNac2-Man3], fucosylated or not: Table 1: N-glycans analysis of anti-CD20 antibodies EMAB603 and Rituxan 1
  • the fucose content was calculated using the following formula:
  • the level of galactose was calculated by adding the percentages of oligosaccharide forms containing galactose obtained after action of neuraminidase and fucosidase.
  • the formula used is:
  • Galactose ratio (G1 + G1B) + 2x (G2 + G2B)
  • the fucose ratio / galactose ratio is obtained by dividing the fucose content by the galactose level, the rates being calculated as described above.
  • the Fuc / Gal ratio ratio of Fucose / Galactose content

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Abstract

La présente invention se rapporte à un .anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20, dont la région variable de chacune des chaînes légères est codée par une séquence possédant au moins 70% d' identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 5, la région variable de chacune des chaînes lourdes est codée par une séquence possédant au moins 70% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 7 et les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes sont des régions constantes provenant d'une espèce non-murine, ainsi qu'à l'utilisation de cet anticorps pour activer les récepteurs FcϜRIII de cellules immunitaires effectrices, et pour la fabrication d'un médicament, notamment destiné au traitement d'une leucémie ou d'un lymphome .

Description

ANTICORPS CYTOTOXIQUE DIRIGE CONTRE LES PROLIFERATIONS HEMATOPOÏETIQUES LYMPHOÏDES DE TYPE B
La présente invention se rapporte à un anticorps moήoclonal dirigé contre l'antigène CD20, dont la région variable de chacune des chaînes légères est codée par une séquence possédant au moins 70% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 5, la région variable de chacune des chaînes lourdes est codée par une séquence possédant au moins 70% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 7, et les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes sont des régions constantes provenant d'une espèce non-mûrine, ainsi qu'à l'utilisation de cet anticorps pour activer les récepteurs FcγRIII de cellules immunitaires effectrices, et pour la fabrication d'un médicament, notamment destiné au traitement d'une leucémie ou d'un lymphome.
Introduction et art antérieur
L'antigène CD20 est une protéine transmembranaire hydrophobe d'un poids moléculaire de 35-37 kDa présente à la surface des lymphocytes B matures (Valentine et al. 1987 Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (22) :8085-9 ; Valentine et al. 1989 J.Biol. Chem. 264 (19) :11282-11287) . Il est exprimé au cours du développement des lymphocytes B dès le stade pré-B précoce et ce jusqu'à la différenciation en plasmocyte/ stade où cette expression disparaît. L' antigène CD20 est présent à la fois sur les lymphocytes B normaux et sur les cellules B malignes. Plus particulièrement, l'antigène CD20 est exprimé sur la plupart des lymphomes de phénotype B (80% des lymphomes) : il est exprimé par exemple sur plus de 90% des lymphomes non-Hodgkiniens (NHL) de lymphocytes B, et sur plus de 95% des Leucémies Lymphoides Chroniques de type B (LLC-B) . L'antigène CD20 n'est pas exprimé sur les cellules souches hématopoïétiques ni sur les plasmocytes .
La fonction du CD20 n'est pas encore totalement élucidée, mais il pourrait agir comme un canal calcique et intervenir dans la régulation des premières étapes de la différenciation (Golay et al. 1985 J" Immunol. ;135(6) :3795-801) et de la prolifération (Tedder et al.1986 Sur J" Immunol . 1986 Aug;16(8) :881-7) des lymphocytes B.
Ainsi, bien qu'il subsiste des incertitudes quant à son rôle dans l'activation et la prolifération des lymphocytes B, l'antigène CD20 est, de par sa localisation, une cible importante pour le traitement des pathologies impliquant des lymphocytes B tumoraux, comme par exemple les NHL ou la LLC-B par des anticorps reconnaissant spécifiquement le CD20. De plus, cet antigène est une cible idéale car il s'agit d'une protéine membranaire pour laquelle on ne connaît pas de modulation d'expression ou de polymorphisme.
Un seul anticorps monoclonal anti-CD20 non radiomarqué, le Rituxan® (Genentech) , est actuellement disponible sur le marché pour le traitement des lymphomes de cellules B. Il montre chez les patients atteints de NHL des résultats cliniques encourageants lorsqu'il est associé à une chimiothérapie. Toutefois, son efficacité reste variable et souvent modeste lorsqu' il est utilisé comme agent unique (Teeling et al. 2004 Blood 104(6).-1793-800) .
Par ailleurs, le Rituxan® n'a qu'un effet modeste sur les lymphocytes B de LLC-B. Cette faible efficacité est liée à différents phénomènes : d'une part, les lymphocytes B de LLC-B n'expriment le CD20 qu'en quantité relativement faible, d'autre part, le Rituxan® n'induit qu'une très faible activité ADCC (Antibody-Dépendent Cellular Cytotoxicity) vis à vis de ces cellules in vitro. Ces deux observations pourraient expliquer la corrélation constatée entre le degré d'expression du CD20 sur la tumeur (en cytométrie de flux quantitative) et la réponse au traitement.
Là LLC-B étant la forme de leucémie la plus fréquente dans les pays occidentaux, avec des traitements lourds par chimiothérapie parfois insuffisants, comportant des effets secondaires qui aboutissent à une aplasie des cellules hématopoiétiques et à un déficit immunitaire, les anticorps monoclonaux apparaissent comme un recours innovant. Il est donc de première importance de mettre au point des anticorps capables de cibler spécifiquement l'antigène CD20 et permettant de détruire les cellules tumorales n'exprimant que faiblement cet antigène comme la LLC-B.
Les anticorps 2F2 et 7D8 proposés par Genmab (Teeling et al. 2004 Blood 104 (6).-1793-800) pour traiter la LLC-B possèdent une capacité à activer le complément supérieure à celle engendrée par le Rituxan® . Toutefois, ces anticorps possèdent une activité ADCC faible, similaire au Rituxan®. Or, certains cliniciens montrent que l'activité complément est la cause d'effets secondaires délétères car les anticorps déclenchent alors un système d'activation conduisant à la production de molécules (notamment d'anaphylatoxines) ayant un large spectre d'activités non spécifiques (réactions inflammatoire, allergiques, vasculaires...) . De plus, ces anticorps en sont encore au stade de la recherche, et leur efficacité clinique est encore à évaluer.
Le Demandeur, dans sa demande FR03/02713 (WO 2004/029092) , décrit un anticorps anti-CD20, susceptible d'être produit dans la lignée YB2/0, sélectionné pour ses capacités à induire une forte ADCC et un fort taux de production d' IL-2 par la cellule Jurkat-CD16 en comparaison avec le Rituxan®. En effet, il existe un besoin important de nouveaux anticorps anti-CD20, permettant d' élargir la gamme de traitement de maladies des lymphocytes B par immunothérapie actuellement proposée, tout particulièrement pour les pathologies des lymphocytes B dans lesquelles l'antigène CD20 est faiblement exprimé sur les populations de lymphocytes B impliquées et pour lesquelles un traitement par immunothérapie satisfaisant n'existe pas.
C'est dans ce but que le Demandeur a mis au point de nouveaux anticorps anti-CD20, présentant une activité ADCC particulièrement élevée comparée au Rituxan®.
Description
Un premier objet de l'invention se rapporte ainsi à un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20, dont la région variable de chacune des chaînes légères est codée par une séquence possédant au moins 70% d' identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 5, la région variable de chacune des chaînes lourdes est codée par une séquence possédant au moins 70% d' identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 7, et les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes sont des régions constantes provenant d'une espèce non-murine.
Les anticorps sont constitués de chaînes lourdes et de chaînes légères, liées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne est constituée, en position N- terminale, d'une région (ou domaine) variable (codée par les gènes réarrangés V-J pour les chaînes légères et V-D- J pour les chaînes lourdes) spécifique de l'antigène contre lequel l'anticorps est dirigé, et en position C- terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine CL pour les chaînes légères ou de plusieurs domaines pour les chaînes lourdes .
Aux fins de l'invention, les expressions « anticorps monoclonal » ou « composition d'anticorps monoclonal » se réfèrent à une préparation de molécules d'anticorps possédant une spécificité identique et unique. L'anticorps selon l'invention, dont les régions variables des chaînes légères et lourdes appartiennent à une espèce différente des régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes, est qualifié d'anticorps « chimérique ».
Les séquences d'acide nucléique murines SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 7 codent pour le domaine variable de chacune des chaînes légères et le domaine variable de chacune des chaînes lourdes respectivement de l'anticorps produit par l'hybridome murin CAT-13.6E12, disponible à la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) sous le numéro ACC 474. Cet hybridome produit un anticorps monoclonal murin de type IgG2a,κ dirigé contre le CD20.
Ces séquences murines ont été choisies pour dériver les séquences des régions variables des anticorps selon l'invention en raison de la spécificité de l'anticorps murin CAT-13.6E12 pour l'antigène CD20, antigène également reconnu par Rituxan®. Les régions variables des anticorps selon l'invention comportent au moins 70% d' identité avec les séquences SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 7, cette identité de séquences conférant une identité de spécificité des anticorps selon l'invention avec l'anticorps murin CAT-13.6E12. De préférence, cette identité de séquences confère également une identité d'affinité pour la cible entre l'anticorps selon l'invention et l'anticorps murin CAT-13.6E12. De plus, le Demandeur a montré de manière surprenante que l'anticorps murin CAT-13.6E12 possède la capacité d'induire la sécrétion d'IL-2 en présence de cellules Jurkat-CD16 exprimant les ectodomaines du récepteur FcγRIIIA (comme cela est illustré dans la Figure 11) , indiquant une forte fixation de l'anticorps murin avec le CD16 (FcγRIIIA) humain, ce qui a encore motivé le Demandeur dans son choix.
Les anticorps selon l'invention possèdent en outre des régions constantes de ses chaînes légères et lourdes appartenant à une espèce non-murine. A cet égard, toutes les familles et espèces de mammifères non-murins sont susceptibles d'être utilisées, et en particulier l'homme, le singe, les muridés (sauf la souris), les suidés, les bovidés, les équidés, les félidés, les canidés, par exemple, ainsi que les oiseaux.
Les anticorps selon l'invention peuvent être construits en utilisant les techniques standard de l'ADN recombinant, bien connues de l'homme du métier, et plus particulièrement en utilisant les techniques de construction des anticorps « chimériques » décrites par exemple dans Morrison et al., Proc. Natl . Acad. Sci . U.S.A., 81, pp. 6851-55 (1984)', où la technologie de l'ADN recombinant est utilisée pour remplacer la région constante d'une chaîne lourde et/ou la région constante d'une chaîne légère d'un anticorps provenant d'un mammifère non-humain avec les régions correspondantes d'une immunoglobuline humaine. Un mode de réalisation particulier sera illustré plus loin.
De manière avantageuse, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence possédant au moins 80% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 5, et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence possédant au moins 80% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 7. De manière avantageuse, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence possédant au moins 90% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 5, et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence possédant au moins 90% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 7.
De manière avantageuse, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence possédant au moins 95% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 5, et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence possédant au moins 95% d' identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 7.
De manière avantageuse, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence possédant au moins 99% d' identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 5, et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence possédant au moins 99% d' identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 7.
Avantageusement, l'invention s'entend aussi de tout anticorps possédant des régions variables de leur chaînes lourdes et légères présentant une ou plusieurs substitution(s) , insertion(s) ou délétion(s) d'un ou plusieurs acides nucléiques, ces modifications de séquences répondant aux pourcentages d' identités de séquences tels que définis ci-dessus, et n'altérant ni la spécificité de l'anticorps pour sa. cible, ni son affinité pour sa cible.
Les anticorps de l'invention s'entendent aussi de tout anticorps possédant les régions CDR (Complementary Determining Région) de l'anticorps CAT-13.6E12, associées à des régions FR (framework, régions très conservées des régions variables, nommées aussi "charpente") . De tels anticorps possèdent une affinité et une spécificité très comparables, de préférence identiques, à l'anticorps murin CAT-13.6E12.
De manière préférée, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 5 ou par la séquence d' acide nucléique murine SEQ ID NO : 25, et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 7.
Dans un premier mode- de réalisation de l'invention, un anticorps selon l'invention est donc un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20, dont la région variable de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 5, la région variable de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 7, et les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes sont des régions constantes provenant d'une espèce non-murine.
Dans un deuxième mode de réalisation, l'anticorps selon l'invention est donc un anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20, dont la région variable de chacune des chaînes légères est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 25, la région variable de chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 7, et les régions constantes des chaînes légères et des chaînes lourdes sont des régions constantes provenant d'une espèce non-murine.
Les anticorps des deux modes de réalisation diffèrent dans leur séquence nucléotidique par un seul nucléotide : le nucléotide situé en position 318 des séquences SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 25, qui correspond respectivement à une cytosine et à une adénine.
Les anticorps de l'invention répondant à chacun de ces modes de réalisation possèdent une spécificité comparable, de préférence identique par rapport à l'antigène cible, le CD20, ainsi qu'une affinité comparable, de préférence identique par rapport au CD20.
De manière préférée, les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention sont des régions constantes humaines. Ce mode de réalisation préféré de l'invention permet de diminuer l' immunogénicité de l'anticorps chez l'homme et par là même d'améliorer son efficacité lors de son administration thérapeutique chez l'homme. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est de type K. Tout allotype convient à la réalisation de l'invention, par exemple Km(I) , Km(I, 2), Km(I, 2, 3) ou Km(3) mais 1' allotype préféré est Km(3) .
Dans un autre mode de réalisation complémentaire, la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est de type λ. Dans un aspect particulier de l'invention, et notamment lorsque les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention sont des régions humaines, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type γ. Selon cette variante, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps peut être de type γl, de type γ2, de type γ3, ces trois types de régions constantes présentant la particularité de fixer le complément humain, ou encore de type γ4. Les anticorps possédant une région constante de chacune des chaînes lourdes de type γ appartiennent à la classe des IgG. Les immunoglobulines de type G (IgG) , sont des hétérodimères constitués de 2 chaînes lourdes et de 2 chaînes légères, liées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région ou domaine variable (codée par les gènes réarrangés V-J pour la chaîne légère et V-D-J pour la chaîne lourde) spécifique de l'antigène contre lequel l'anticorps est dirigé, et en position C-terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine CL pour la chaîne légère ou de 3 domaines (CHl, CH2 et CH3) pour la chaîne lourde. L'association des domaines variables et des domaines CH1 et CL des chaînes lourdes et légères forme les parties Fab, qui sont connectées à la région Fc par une région charnière très flexible permettant à chaque Fab de se fixer à sa cible antigénique tandis que la région Fc, médiatrice des propriétés effectrices de l'anticorps, reste accessible aux molécules effectrices telles que les récepteurs FcγR et le CIq. La région Fc, constituée des 2 domaines globulaires CH2 et CH3, est glycosylée au niveau du domaine CH2 avec la présence, sur chacune des 2 chaînes, d'un JNT-glycanne biantenné de type lactosaminique, lié à l'Asn 297.
De manière préférée, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type γl, car un tel anticorps montre une capacité à engendrer une activité ADCC chez le plus grand nombre d'individus (humains) . A cet égard, tout allotype convient à la réalisation de l'invention, par exemple GIm(3), GIm (1, 2, 17), GIm(I, 17) ou GIm(I, 3) . De manière préférentielle, l'allotype est GIm(I, 17) .
Dans un aspect particulier de l'invention, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type γl, et elle est codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 23, la région constante de chacune de ses chaînes légères étant codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 21. Ainsi, un tel anticorps possède une région variable murine et une région constante humaine, avec des chaînes lourdes de type γl . Cet anticorps appartient donc à la sous-classe des IgGl. Selon le mode de réalisation de l'anticorps selon l'invention, l'anticorps possède deux chaînes légères dont le domaine variable est codé par la séquence d' acide nucléique murine SEQ ID NO : 5 ou par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 25 et la région constante humaine est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 21, et deux chaînes lourdes dont le domaine variable est codé par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 7 et la région constante est codée par la séquence d' acide nucléique humaine SEQ ID NO : 23.
De manière préférentielle, chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est codée par la séquence d' acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO : 13 ou par la séquence d' acide nucléique chimère murine- humaine SEQ. ID NO : 27, et chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d' acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO : 19. La séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO : 13 codant pour chacune des chaînes légères de l'anticorps est obtenue par fusion de la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 5 codant pour le domaine variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps et de la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 21 codant pour la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps.
La séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO : 27 codant pour chacune des chaînes légères de l'anticorps est obtenue par fusion de la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 25 codant pour le domaine variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps et de la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 21 codant pour la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps.
La séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO : 19 codant pour chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est obtenue par fusion de la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 7 codant pour le domaine variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps et de la séquence d' acide nucléique humaine SEQ ID NO : 23 codant pour la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps.
Dans un aspect particulier de l'invention, lorsque chacune des chaînes légères de l'anticorps est codée par la séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO : 13 , et que chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO : 19, la séquence peptidique de chacune des chaînes légères, déduite de la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 13, est la séquence SEQ ID NO : 14 et la séquence peptidique de chacune des chaînes lourdes, déduite de la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 19, est la séquence SEQ ID NO : 20.
Dans un autre aspect particulier de l'invention, lorsque chacune des chaînes légères de l'anticorps est codée par la séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO : 27, et que chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO : 19, la séquence peptidique de chacune des chaînes légères, déduite de la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 27, est la séquence SEQ ID NO : 28 et la séquence peptidique de chacune des chaînes , lourdes, déduite de la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 19, est la séquence SBQ ID NO : 20. Les séquences peptidiques SEQ ID NO : 14 et SEQ ID NO : 28 diffèrent uniquement par l'acide aminé présent en position 106 de chacune de ces deux séquences. L'acide aminé situé en position 106 est une lysine (K) dans la séquence SEQ ID NO : 28 ; il s'agit d'une asparagine (N) dans la séquence SEQ ID NO : 14.
L'invention s'entend aussi des anticorps dont chacune des chaînes légères codées par une séquence d' acide nucléique chimère murine-humaine possède au moins 70% d'homologie ou d'identité avec la séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO : 13 et chacune des chaînes lourdes codées par une séquence d' acide nucléique chimère murine-humaine possède au moins 70% d'homologie ou d' identité avec la séquence d' acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO : 19, ces modifications n'altérant ni la spécificité de l'anticorps ni ses activités effectrices, comme l'activité ADCC (Antibody- Dependent Cell-mediated Cytotoxicity) .
De manière particulièrement avantageuse, l'anticorps de l'invention est produit par une lignée cellulaire d'hybridome de rat. La lignée productrice de l'anticorps selon l'invention est une caractéristique importante puisqu'elle confère à l'anticorps certaines de ses propriétés particulières. En effet, le moyen d'expression des anticorps est à l'origine des modifications post- traductionnelles, notamment des modifications de la glycosylation, qui peuvent varier d'une lignée cellulaire à l'autre, et ainsi conférer des propriétés fonctionnelles différentes à des anticorps ayant pourtant des structures primaires identiques .
Dans un mode de réalisation préféré, l'anticorps est produit dans l'hybridome de rat YB2/0 (cellule YB2/3HL.P2.GIl .16Ag.20, déposée à l'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL-1662) . Cette lignée a été choisie en raison de sa capacité à produire des anticorps présentant une activité ADCC améliorée par rapport à des anticorps de même structure primaire produits par exemple dans CHO.
Dans un mode de réalisation particulier, un anticorps préféré selon l'invention est l'anticorps EMAB6 produit par le clone R5Û9 déposé le 8 novembre 2004 sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3314 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) . Chacune des chaînes légères de l'anticorps EMAB6 est codée par la séquence d'acide nucléique chimère murine- humaine SEQ ID NO : 13, et chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO : 19. Cet anticorps chimérique entre en compétition avec l'anticorps murin CAT-13.6E12 pour la fixation du CD20 et possède une activité cytotoxique très supérieure à celle du Rituxan®, qui peut être attribuée pour partie à la glycosylation particulière du N-glycanne de la chaîne lourde de ces anticorps (cf. exemple 4) . En effet, le clone R509 a pour particularité de produire une composition d' anticorps EMAB6 possédant un ratio taux de fucose/taux de galactose inférieur à 0,6, pour lequel il a été démontré dans la demande de brevet FR 03 12229 qu'il est optimal pour conférer une forte activité ADCC aux anticorps . Cet anticorps est donc particulièrement intéressant comme outil thérapeutique pour le traitement de pathologies dont les cellules à cibler expriment le CD20. Dans un autre mode de réalisation particulier, un autre anticorps préféré selon l'invention est l'anticorps EMAB603 produit par le clone R603 déposé le 29 novembre 2005 sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3529 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) . Chacune des chaînes légères de l'anticorps EMAB603 est codée par la séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO -. 27, et chacune des chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO : 19. Cet anticorps chimérique entre en compétition avec l'anticorps murin CAT-13.6E12 pour la fixation du CD20 et possède une activité cytotoxique très supérieure à celle du Rituxan®, qui peut être attribuée pour partie à la glycosylation particulière du N-glycanne de la chaîne lourde de ces anticorps (cf. exemple 3) . En effet/ le clone R603 a pour particularité de produire une composition d'anticorps EMAB603 possédant un ratio taux de fucose/taux de galactose inférieur à 0,6 (cf exemple 4) , pour lequel il a été démontré dans la demande de brevet FR 03 12229 qu' il est optimal pour conférer une forte activité ADCC aux anticorps. Cet anticorps est donc particulièrement intéressant comme outil thérapeutique pour le traitement de pathologies dont les cellules à cibler expriment le CD20.
Un autre objet de l'invention se rapporte au vecteur pEF- EMAB6-K d'expression de la chaîne légère d'un anticorps selon l'invention, de séquence SEQ ID NO : 12. Ce vecteur est le vecteur permettant l'expression d'un anticorps selon l'invention dont la chaîne légère est codée par la séquence d'acide nucléique SED ID NO : 13, dont la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 14. Ce vecteur est une molécule d'acide nucléique dans laquelle la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 5 codant pour le domaine variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps et la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 21 codant pour la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps ont été insérées, afin de les introduire et de les maintenir dans une cellule hôte. Il permet l'expression de ces fragments d'acide nucléique étrangers dans la cellule hôte car il possède des séquences indispensables (promoteur, séquence de polyadénylation, gène de sélection) à cette expression. De tels vecteurs sont bien connus de l'homme du métier, et peuvent être un adénovirus, un rétrovirus, un plasmide ou un bactériophage, cette liste n'étant pas limitative. De plus, toute cellule de mammifère peut être utilisée comme cellule hôte, c'est-à-dire comme cellule exprimant l'anticorps selon l'invention, par exemple YB2/0, CHO, CHO dhfr- (par exemple CHO DX BIl, CHO DG44) , CHO Lecl3 , SP2/0, NSO, 293, BHK ou COS.
Un autre objet de l'invention se rapporte au vecteur pEF- EMAB6-H d'expression de la chaîne lourde d'un anticorps selon l'invention, de séquence SEQ ID NO : 18. Ce vecteur est le vecteur permettant l'expression d'un anticorps selon l'invention dont la chaîne lourde est codée par la séquence d'acide nucléique SED ID NO : 19, dont la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 20. Ce vecteur est une molécule d'acide nucléique dans laquelle la séquence d' acide nucléique murine SEQ ID NO : 7 codant pour le domaine variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps et la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 23 codant pour la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps ont été insérées, afin de les introduire et de les maintenir dans une cellule hôte. Il permet l'expression de ces fragments d' acide nucléique étrangers dans la cellule hôte car il possède des séquences indispensables (promoteur, séquence de polyadénylation, gène de sélection) à cette expression. Tout comme indiqué précédemment, le vecteur peut être par exemple un plasmide, un adénovirus, un rétrovirus ou un bactériophage, et la cellule hôte peut être toute cellule de mammifère, par exemple YB2/0,- CHO, CHO dhfr- (CHO DX BIl, CHO DG44) , CHO Lecl3, SP2/0, NSO, 293, BHK ou COS. Un anticorps produit par co-expression des vecteurs pEF- EMAB6-K et pEF-EMAB6-H dans la cellule YB2/0 est illustré par l'anticorps anti-CD20 EMAB6, produit par le clone R509 (déposé sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3314 à la CNCM) . Cet anticorps induit une cytotoxicité supérieure à celle induite par Rituxan à la fois sur les cellules de patients atteints de LLC-B (sur lesquelles l'antigène CD20 est plus faiblement exprimé) et sur des cellules Raji, utilisées en tant que modèle et exprimant le CD20 à une densité plus importante par rapport aux cellules de patients atteints de LLC-B. De plus, l'anticorps EMAB6 induit une sécrétion d'IL-2 (interleukine 2) par les cellules Jurkat~CD16 beaucoup plus forte que l'anticorps Rituxan". L'anticorps EMAB6, pouvant être produit par culture du clone R509 dans un milieu de culture et à des conditions permettant l'expression des vecteurs précédemment décrits, est donc un outil des plus intéressants susceptibles de faire progresser la thérapie et le diagnostic des pathologies impliquant le CD20, et plus particulièrement la LLC-B, ainsi que la recherche dans ce domaine.
Un objet particulier de l'invention est une lignée cellulaire stable exprimant un anticorps selon 1' invention.
De manière avantageuse, la lignée cellulaire stable exprimant un anticorps selon l'invention est choisie parmi le groupe consistant en : SP2/0, YB2/0, IR983F, un myélome humain comme Namalwa ou toute autre cellule d'origine humaine comme PERC6, les lignées CHO, notamment CHO-K-I, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO-Lecl3, CHO Pro-5, CHO dhfr- (CHO DX BIl, CHO DG44), ou d'autres lignées choisies parmi Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293- HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/θ-Ag 14 et P3X63Ag8.653. De manière préférée, la lignée utilisée est l'hybridome de rat YB2/0. Cette lignée a été choisie en raison de sa capacité à produire des anticorps présentant une activité ADCC améliorée par rapport à des anticorps de même structure primaire produits par exemple dans CHO. Dans un aspect particulier de l'invention, la lignée cellulaire stable exprimant un anticorps selon l'invention, et plus particulièrement choisie dans le groupe précédemment décrit, a intégré les deux vecteurs d'expression pEF-EMAB6-K et pEF-EMAB6-H, tels que précédemment décrits .
Un aspect particulier de l'invention se rapporte au clone R509 déposé sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3314 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) .
Un aspect particulier de l'invention se rapporte au clone R603 déposé sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3529 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) .
Un autre objet de l'invention se rapporte à un fragment d'ADN de séquence SEQ ID NO : 19 codant pour la chaîne lourde d'un anticorps selon l'invention. La séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO : 19 code pour chacune des chaînes lourdes de l'anticorps. Elle est obtenue par fusion de la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 7 codant pour le domaine variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps et de la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 23 codant pour la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps.
Un autre objet particulier de l'invention se rapporte à un fragment d'ADN de séquence SEQ ID NO : 13 codant pour la chaîne légère d'un anticorps selon l'invention. La séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO : 13 code pour chacune des chaînes légères de l'anticorps. Elle est obtenue par fusion de la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 5 codant pour le domaine variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps et de la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 21 codant pour la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps.
Un autre objet particulier de l'invention se rapporte à un fragment d'ADN de séquence SEQ ID NO : 27 codant pour la chaîne légère d'un anticorps selon l'invention. La séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO : 27 code pour chacune des chaînes légères de l'anticorps. Elle est obtenue par fusion de la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 25 codant pour le domaine variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps et de la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 21 codant pour la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps.
Un objet particulier de l'invention se rapporte à l'utilisation de l'anticorps selon l'invention pour activer, in vivo ou in vitro, les récepteurs FcγRIIIA de cellules immunitaires effectrices . En effet, les anticorps de l'invention ont pour particularité et avantage d'être cytotoxiques . A ce titre, ils présentent la capacité d'activer par leur région Fc le récepteur FcγRIIIA. Ceci représente un intérêt considérable, car ce récepteur est exprimé à la surface 'de cellules appelées « cellules effectrices » : la liaison de la région Fc de l'anticorps à son récepteur porté par la cellule effectrice provoque l'activation du FcγRIIIA et la destruction des cellules cibles. Les cellules effectrices sont par exemple des cellules NK (Natural Killer) , des macrophages, des neutrophiles, les lymphocytes CD8, les lymphocytes Tγδ, les cellules NKT, les éosinophiles, les basophiles ou les mastocytes .
Dans un aspect particulier, l'anticorps de l'invention est utilisé comme médicament. Avantageusement, un tel médicament est destiné à traiter les maladies dont les cellules cibles sont des cellules exprimant le CD20, comme les lymphomes malins à cellules B.
Dans un aspect avantageux, l'anticorps selon l'invention est utilisé pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une leucémie ou d'un lymphome. Un objet particulier de l'invention est l'utilisation de l'anticorps selon l'invention, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une pathologie choisie parmi les leucémies aiguës lymphoblastiques B, les lymphomes lymphoblastiques B, les lymphomes à lymphocytes B matures, parmi lesquels la leucémie lymphoïde chronique de type B (LLC-B) , le lymphome lymphocytique à petits lymphocytes B, la leucémie prolymphocytaire B, le lymphome lymphoplasmocytaire, le lymphome à cellules du manteau, le lymphome folliculaire, le lymphome de la zone marginale de type MALT, le lymphome ganglionnaire de la zone marginale avec ou sans cellule B monocytoïde, le lymphome splénique de la zone marginale (avec ou sans lymphocyte villeux) , la leucémie à tricholeucocytes, le lymphome diffus à grandes cellules B, le lymphome de Burkitt ainsi que toute pathologie dysimmunitaire impliquant des cellules de la lignée lymphoïde B dont les maladies auto-immunes.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation de l'anticorps selon l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une leucémie lymphoïde.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation de l'anticorps selon l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de la leucémie lymphoïde chronique de type B (LLC-B) . En outre, l'anticorps selon l'invention est particulièrement adapté à traiter des pathologies pour lesquelles le CD20 est plus faiblement exprimé sur les lymphocytes B, et de manière préférée la LLC-B (Leucémie Lymphoïde Chronique de type B) . A cet égard, l'anticorps selon l'invention peut être utilisé en combinaison avec un ou plusieurs autre (s) anticorps, par exemple monoclonal (ux) , dirigé (s) contre un ou plusieurs autre (s) antigène (s) exprimé (s) sur les cellules lymphoides, comme par exemple les antigènes HLA-DR, CD19, CD23, CD22, CD80, CD32 et CD52, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une leucémie ou d'un lymphome. Ainsi, l'anticorps humanisé Campath-IH®
(alentuzumab, MabCampathR®) qui cible une molécule abondamment exprimée sur les cellules lymphoïdes, l'antigène CD52, et permet d'induire une lyse cellulaire en mobilisant les mécanismes effecteurs de l'hôte
(fixation du complément, c'ytotoxicité dépendant des anticorps) est utilisé dans le traitement de la LLC
(Moreton P, Hillmen P 2003 Semin. Oncol . , 30(4) .-493- 501 ; Rawstron AC et al 2004 Blood, 103(6) .-2027-2031 ; Robak T 2004 Leuk. Lymphoma, 45(2) .-205-219 ,- Stanglmaier M et al 2004 Ann Hematol. , 83(10) .-634-645) . Des essais cliniques sont également en cours pour l'évaluation d'anticorps ou d' immunotoxines ciblant les antigènes HLA- DR, CD22, CD23, CD80 chez des patients atteints de LLC
(Mavromatis BH, Cheson BD 2004 Blood Rev. 18 (2) :137-148 ; Mavromatis B, Cheson BD 2003 J" Clin. Oncol. 21(9) :1874- 1881, Coleman M et al 2003 Clin. Cancer Res. 9.-3991S- 3994S ; Salvatore G et al 2002 Clin. Cancer Res. 8:995- 1002) .
Dans un autre mode de réalisation, l'anticorps selon l'invention peut être utilisé en association avec des cellules exprimant des FcγR telles que les cellules NK, les cellules NKT (Natural Killers T) , les lymphocytes Tγδ, les macrophages, les monocytes ou les cellules dendritiques, c'est-à-dire en association avec une thérapie cellulaire (Peller S, Kaufman S Blood 1991, 78:1569, Platsoucas CD et al J Immunol 1982, 129:2305 ; Kimby E et al. 1989 Leukemia 3 (7) :501-504 ; Soorskaar D et al. 1988 Int Arch Allery Appl Immunol 87(2) .-159-164 ,- Ziegler HW et al. 1981 Int J Cancer 27(3) .-321-327 ,- Chaperot L et al. 2000 Leukemia 14 (9) :1667'-77 ,- Vuillier F, Dighiero G 2003 Bull Cancer. 90 (8-9) :744-50) .
Par ailleurs, l'anticorps selon l'invention permet de manière avantageuse de réduire les doses administrées aux patients : avantageusement, la dose de l'anticorps administrée au patient est 2 fois, 5 fois, ou encore 10 fois, 25 fois, 50 fois ou de manière particulièrement avantageuse 100 fois moins élevée qu'une dose de Rituxan . De manière avantageuse, la dose de l'anticorps administrée au patient est entre 2 et 5 fois, entre 5 et 10 fois, entre 5 et 25 fois, entre 5 et 50 fois ou encore entre 5 et 100 fois moins élevée qu'une dose de Rituxan". Ainsi, l'anticorps selon l'invention, par exemple l'anticorps EMAB6, peut être administré avantageusement à une dose inférieure à 187,5 mg/m2, à 75 mg/m2, à 37,5 mg/m2, 15 mg/m2, 7,5 mg/m2 ou de manière particulièrement avantageuse inférieure à 3,75 mg/m2. La dose administrée est avantageusement comprise entre 187,5 mg/m2 et 75 mg/m2, ou entre 75 mg/m2 et 37,5 mg/rα2, entre 75 mg/m2 et 15 mg/m2, entre 75 mg/m2 et 7,5 mg/m2 ou encore entre 75 mg/m2 et 3,75 mg/m2.
Ainsi, l'invention s'entend aussi d'une méthode de traitement des maladies dont les cellules cibles sont des cellules exprimant le CD20, comme les lymphomes malins à cellules B, comprenant l'administration à un patient, à une dose efficace, d'une composition comprenant un anticorps selon l'invention. Plus particulièrement, la méthode de traitement est particulièrement adaptée au traitement d'une leucémie ou d'un lymphome. De manière encore plus spécifique, il s'agit d'une méthode de traitement d'une pathologie choisie parmi les leucémies aiguës lymphoblastiques B, les lymphomes lymphoblastiques B, les lymphomes à cellules B matures, parmi lesquels la leucémie lymphoïde chronique de type B (LLC-B) , le lymphome lymphocytique à . petits lymphocytes B, la leucémie prolymphocytaire B, le lymphome lymphoplasmocytaire, le lymphome à cellules du manteau, le lymphome folliculaire, le lymphome de la zone marginale de type MALT, le lymphome ganglionnaire de la zone marginale avec ou sans cellule B monocytoïde, le lymphome splénique de la zone marginale (avec ou sans lymphocyte villeux) , la leucémie à tricholeucocytes, le lymphome diffus à grandes cellules B, le lymphome de Burkitt ainsi que toute pathologie dysimmunitaire impliquant des cellules la lignée lymphoïde B dont les maladies auto-immunes, comprenant l'administration, à une dose efficace, d'un anticorps ou- d'une composition comprenant l'anticorps selon l'invention.
Un objet particulier de l'invention est l'utilisation d'un anticorps selon l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de la maladie chronique du greffon contre l'hôte afin de traiter les manifestations impliquant les lymphocytes B du receveur. Enfin un dernier objet de l'invention est l'utilisation d'un anticorps selon l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du rejet de greffes d'organes, notamment de rein.
En effet, des études récentes (Ratanatharathorn et al. 2003 Biol Blood Marrow Transplant. 2003 Aug;9 (8) :505-11 ; Becker et al. 2004 Am J Transplant. 2004 Jun;4 (6) :996- 1001) ont montré l'intérêt d'anticorps anti-CD20 dans le traitement de ces pathologies .
D'autres aspects et avantages de l'invention seront décrits dans les exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et ne limitent pas l'étendue de l'invention. Description des Figures
Figure 1 : Représentation schématique du vecteur CKHu utilisé pour la chimêrisation de la chaîne légère kappa des anticorps EMAB6 et EMAB603.
Figure 2 : Représentation schématique du vecteur d'expression chaîne légère pEF-EMABG-K utilisé pour la production de l'anticorps EMAB6.
Figure 3 : Représentation schématique du vecteur GlHu utilisé pour la chimêrisation de la chaîne lourde des anticorps EMAB6 et EMAB603.
Figure 4 : Représentation schématique du vecteur d'expression chaîne lourde pEF-EMAB6-H utilisé pour la production de l'anticorps EMAB6.
Figure 5 : Compétition par l'anticorps chimérique EMAB6 pour la fixation de l'anticorps murin d'origine CAT- 13.6E12 (CAT13) au CD20 exprimé sur les cellules Raji.
Figure 6 : Activité cytotoxique complément dépendante des anticorps anti-CD20 sur les cellules Raji. (A) Rituxan triangle vide, EMAB6 losange plein. La lyse des cellules est estimée par mesure de la LDH intracellulaire libérée dans le surnageant. Résultats exprimés en pourcentage de lyse, le 100% étant la valeur obtenue avec Rituxan (à 5000ng/ml d'anticorps anti-CD20) . Moyenne de 5 essais. (B) Comparaison des activités cytotoxiques complément dépendante des anticorps EMAB6 (losange plein) et EMAB603 (losange vide) . Figure 7 : ADCC induite par les anticorps anti-CD20 vis à vis des cellules Raji. (A) Rituxan triangle vide, EMAB6 losange plein. La lyse des cellules est estimée par mesure de la LDH intracellulaire libérée dans le surnageant. Résultats exprimés en pourcentage de lyse, le 100% étant la valeur obtenue avec Rituxan (à 250ng/ml d'anticorps anti-CD20) . Moyenne de 3 essais. (B) Comparaison de l'ADCC induite par les anticorps EMAB6 (losange plein) et EMAB603 (losange vide) .
Figure 8 : ADCC induite par les anticorps anti-CD20 en présence de lymphocytes B de patients présentant une LLC- B.
Rituxan8 triangle vide, EMAB6 losange plein. Ratio E/T = 15. La lyse des cellules est estimée par mesure de la calcéine libérée dans le surnageant. Résultats exprimés en pourcentage, le 100% étant la valeur obtenue avec Rituxan® (à 500ng/ml d'anticorps anti-CD20) . Moyenne de 4 expériences correspondant à 4 patients différents.
Figure 9 : Activation du CD16 (FcγRIIIA) induite par les anticorps anti-CD20 en présence de cellules Raji. (A) Rituxan9 triangle vide, EMAB6 losange plein. Résultats exprimés en pourcentage d'IL-2, celle-ci étant mesurée dans les surnageants par ELISA ; 100% étant la valeur obtenue avec Rituxan" (à 2500ng/ml d'anti-CD20) . Moyenne de 4 essais. (B) Comparaison entre l' activation du CD16 (FcγRIIIA) induite par les anticorps EMAB6 (losange plein) et EMAB603 (losange vide) .
Figure 10 : Activation du CD16 (FcγRIIIA) induite par les anti-CD20 en présence de lymphocytes B de patients présentant une LLC-B. Rituxan® triangle vide, EMAB6 losange plein. Résultats exprimés en pourcentage d'IL-2, celle-ci étant mesurée dans les surnageants par ELISA ; 100% étant la valeur obtenue avec Rituxan (à 2500ng/ml d'anticorps anti-CD20) . Moyenne de 12 patients.
Figure 11 : Production d'IL-2 induite par l'anticorps murin CAT-13.6E12 en présence des cellules Jurkat-CD16 (FcγRIIIA) .
Figure 12 : Représentation schématique du vecteur d'expression des chaînes lourde et légère pRSV-HL-EMAB603 utilisé pour la production de l'anticorps EMAB603.
Exemples
Exemple 1 : Construction des vecteurs d'expression des anticorps chimériques anti-CD20 EMAB6 et EMAB603
A. Détermination de la séquence des régions variables de l'anticorps murin CAT-13.6E12
L'ARN total de l'hybridome murin CAT-13.6E12
(fournisseur : DSMZ, réf. ACC 474) produisant une immunoglobuline de type IgG2a,κ a été isolé (kit RNAeasy,
Qiagen réf. 74104) . Après transcription inverse, les domaines variables des chaînes légères (VK) et lourdes
(VH) de l'anticorps CAT-13.6E12 ont été amplifiées par la technique de 5'RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)
(kit GeneRacer, Invitrogen réf. L1500-01) . Les amorces utilisées pour ces deux étapes sont les suivantes :
1. amorces de transcription inverse a. Amorce antisens spécifique Kappa murin (SEQ ID NO : 1)
5' - ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT GAC -3' b. Amorce antisens spécifique G2a murin (SEQ ID NO : 2) 5'- CTG AGG GTG TAG AGG TCA GAC TG -3'
2. amorces de PCR 5'RACE a. Amorce antisens spécifique Kappa murin (SEQ ID NO : 3)
5'- TTGTTCAAGAAGCACACGACTGAGGCAC -3' b. Amorce antisens spécifique G2a murin (SEQ ID NO : 4)
5'- GAGTTCCAGGTCAAGGTCACTGGCTCAG -3'
Les produits de PCR VH et VK ainsi obtenus ont été clones dans le vecteur pCR4Blunt-TOPO (Zéro blunt TOPO PCR cloning kit, Invitrogen, réf. K2875-20) puis séquences. La séquence nucléotidique de la région VA: de l'anticorps murin CAT-13.6E12 est indiquée sous la séquence SEQ ID NO : 5 et la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 6. Le gène VK appartient à la famille Vκ4 [Kabat et al., "Séquences of Proteins of Immunological Interest", NIH Publication, 91-3242 (1991)] . La séquence nucléotidique de la région VH de CAT-13.6E12 est la séquence SEQ ID NO : 7 et la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 8. Le gène VH appartient à la famille VHl [Kabat et al., "Séquences of Proteins of Immunological Interest", NIH Publication, 91- 3242 (1991)] .
B. Construction des vecteurs d'expression chaîne lourde et chaîne légère des anticorps chimériques EMAB6 et EMAB603
1. Vecteur chaîne légère Kappa
1.1 Vecteur de chaîne légère de l'anticorps EMAB6 La séquence VK clonée dans le vecteur de séquençage pCR4Blunt-T0P0 a été amplifiée à l'aide des amorces de clonage suivantes : a) amorce sens VK (SEQ ID NO : 9)
5'- CTCAGTACTAGTGCCGCCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG -3' La séquence soulignée correspond au site de restriction Spe I, la séquence en gras correspond à une séquence de Kozak consensus, l'ATG initiateur est en italiques. b) amorce antisens VA: (SEQ ID NO : 10)
5'- TGAAGACACTTGGTGCAGCCACAGTCCGGTTTATTTCCAGCCTGGT -3' Cette amorce réalise la jonction des séquences VK murine (en italique) et région constante (CK) humaine (en gras) . La séquence soulignée correspond au site de restriction Dra III.
Le produit de PCR VA; ainsi obtenu contient la séquence codant le peptide signal naturel de l'anticorps murin CAT-13.6E12. Cette PCR VK a été ensuite clonée entre les sites Spe I et Dra III du vecteur de chimérisation chaîne légère (Fig. 1) qui correspond à la séquence SEQ ID NO : 11, en 5' de la région constante CK humaine, dont la séquence nucléique est la séquence SEQ ID NO : 21 et la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO 22. La séquence CK humaine de ce vecteur de chimérisation avait été préalablement modifiée par mutagénèse silencieuse afin de créer un site de restriction Dra III pour permettre le clonage de séquences VK murines . Ce vecteur de chimérisation contient un promoteur RSV et une séquence de polyadénylation bGH (bovine Growth Hormone) ainsi que le gène de sélection dhfr (dihydrofolate reductase) .
La séquence de la chaîne légère de l'anticorps chimérique EMAB6 codée par ce vecteur est présentée en SEQ ID NO : 13 pour la séquence nucléotidique et correspond à la séquence peptidique déduite SEQ ID NO : 14. 1.2 Vecteur de chaîne légère de l'anticorps EMAB603
Le protocole est le même que pour le vecteur de chaîne légère de l'anticorps EMAB6 (cf exemple 1, B-I.1), hormis l'amorce antisens VK qui est :
b' ) amorce antisens VK (SEQ ID NO : 29)
5'- TGAAGACACTTGGTGCAGCCACAGTCCC^TTTATTTCCAGCCTGGT -3' Cette amorce réalise la jonction des séquences VK murine
(en italique) et région constante (CK) humaine (en gras) . La séquence soulignée correspond au site de restriction Dra III. Cette amorce introduit également la mutation AAC -> AAA
(nucléotide encadré dans la séquence de l'amorce antisens SEQ ID NO : 29) qui correspond à la mutation N106K (cf. séquence nucléotidique et la séquence peptidique déduite SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 26) par rapport à la séquence naturelle VK de CAT-13.6E12 (cf. SEQ ID NO : 5 et SEQ ID NO : 6) .
La séquence de la chaîne légère de l'anticorps chimérique EMAB603 codée par ce vecteur est présentée en SEQ ID NO : 27 pour la séquence nucléotidique et correspond à la séquence peptidique déduite SEQ ID NO : 28.
2. Vecteur chaîne lourde
Une démarche similaire a été appliquée pour la chimérisation de la chaîne lourde des anticorps EMAB6 et EMAB603.
La séquence VH clonée dans le vecteur pCR4Blunt-T0P0 a été tout d'abord amplifiée à l'aide des amorces de clonage suivantes : a) amorce sens VH (SEQ ID NO :15) 5 ' - CTCAGTACTAGTGCCGCCACCAΓGGGATTCAGCAGGATCTTTCTC -3 '
La séquence soulignée correspond au site de restriction Spe I, la séquence en gras correspond à une séquence de Kozak consensus, l'ATG initiateur est en italiques. b) amorce antisens VH (SEQ ID NO :16)
5'- GACCGATQGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCC -3' Cette amorce réalise la jonction des séquences VH murine (en italique) et région constante Gl humaine (en gras) . La séquence soulignée correspond au site de restriction Apa I .
Le fragment VH amplifié contient la séquence codant le peptide signal naturel de l'anticorps murin CAT-13.6E12. Cette PCR VH a été ensuite clonée entre les sites Spe I et Apa I du vecteur de chimérisation chaîne lourde (Fig. 3) qui correspond à la séquence SEQ ID NO : 17, en 5' de la région constante γl humaine dont la séquence nucléique est la séquence SEQ ID NO : 23 et la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 24. Ce vecteur de chimérisation contient un promoteur RSV et une séquence de polyadénylation bGH (bovine Growth Hormone) ainsi que le gène de sélection néo.
La séquence de la chaîne lourde des anticorps chimériques EMAB6 et EMAB603 codée par ce vecteur est présenté en SEQ ID NO : 19 pour la séquence nucléotidique et en séquence SEQ ID NO : 20 pour la séquence peptidique déduite.
3. Vecteurs d' expression finaux
3.1 Vecteurs d'expression de l'anticorps EMAB6
Pour l'expression de l'anticorps EMAB6, le promoteur RSV du vecteur de chimérisation de la chaîne légère kappa (cf exemple. 1, B-1.1) a été remplacé par le promoteur EF-I alpha humain. Le vecteur final d'expression chaîne légère pEF-EMAB6-K est présenté en Fig. 2 et correspond à la séquence SEQ ID NO : 12.
La séquence de la chaîne légère de l'anticorps chimérique EMAB6 codée par ce vecteur est présentée en SEQ ID NO : 13 pour la séquence nucléotidique et correspond à la séquence peptidique déduite SEQ ID NO :14.
Pour l'expression de l'anticorps EMAB6, le promoteur RSV du vecteur de chimérisation de la chaîne lourde (cf exemple 1, B-2) a été remplacé par le promoteur EF-I alpha humain. Le vecteur final d'expression chaîne lourde pEF-EMAB6-H ainsi obtenu est présenté en Fig. 4 et correspond a la séquence SEQ ID NO : 18.
3.2 Vecteur d'expression de l'anticorps EMAB603
Un vecteur d'expression unique contenant les deux unités de transcription chaîne lourde et chaîne légère de l'anticorps anti-CD20 EMAB-603 a été construit à partir des deux vecteurs de chimérisation de la chaîne légère et de la chaîne lourde (cf respectivement exemple 1, B-1.2 et exemple 1-B2) par sous-clonage, dans le site Xho I du vecteur chaîne lourde, d'un fragment BgI II-Pvu II du vecteur chaîne légère contenant l'unité de transcription chaîne légère et le gène dhfr. Ce vecteur d'expression pRSV-HL-EMAB-603 présente deux gènes de sélection néo (neo-phosphotransphérase II) et dhfr (dihydrofolate reductase) ainsi que deux unités de transcription chaîne lourde et chaîne légère sous le contrôle d'un promoteur RSV (Figure 12) .
Exemple 2 : Création de lignées cellulaires dérivées de la lignée YB2/0 productrices de l'anticorps chimérique anti-CD20 EMAB6 et de l'anticorps chimérique anti-CD20 EMAB603
La lignée de rat YB2/0 (ATCC # CRL-1662) a été cultivée en milieu EMS (Invitrogen, réf. 041-95181M) contenant 5% de sérum de veau fœtal (JRH Biosciences, réf. 12107) . Pour la transfection, 5 millions de cellules ont été électroporés (électroporateur Biorad, modèle 1652077) en milieu Optimix (Equibio, réf. EKITE 1) avec 25 μg de vecteur chaîne légère, pEF-EMAB6-K (Fig. 2), linéarisé par Aat II, et 27 μg de vecteur chaîne lourde, pEF- EMAB6-H (Fig. 4) , linéarisé par Sca I pour l'expression de l'anticorps EMAB6, ou avec le vecteur pRSV-HL-EMAB-603 pour l'expression de l'anticorps EMAB603. Les conditions d' électroporation appliquées étaient de 230 volts et 960 microfarads pour une cuvette de 0,5 ml. Chaque cuvette d'électroporation a été ensuite répartie sur 5 plaques P96 avec une densité de 5000 cellules/puits. La mise en milieu sélectif RPMI (Invitrogen, ref 21875- 034) contenant 5% de sérum dialyse (Invitrogen, réf. 10603-017), 500 μg/ml de G418 (Invitrogen, réf. 10131- 027) et 25 nM de methotrexate (Sigma, réf. M8407) , a été réalisée 3 jours après la transfection.
Les surnageants des puits de transfection résistants ont été criblés pour la présence d' immunoglobuline (Ig) chimérique par dosage ELISA spécifique des séquences Ig humaines .
Les 10 transfectants produisant le plus d'anticorps ont été amplifiés en plaques P24 et leur surnageant redosé par ELISA afin d' estimer leur productivité et de sélectionner les 3 meilleurs producteurs pour le clonage par dilution limite (40 cellules/plaque) .
A l'issue du clonage, le clone R509.6A4 (R509-33903/046- 6H1(1)6A4, productivité : 17 μg/106 cellules), dénommé ci-après « R509 », ainsi que le clone R603 ont été sélectionnés respectivement pour la production de l'anticorps chimérique EMAB6 et celle de l'anticorps EMAB603 et adaptés progressivement au milieu de production CD Hybridoma (Invitrogen, réf. 11279-023) . La production des anticorps chimériques EMAB6 et EMAB603 a été réalisée par expansion de la culture adaptée en milieu CD Hybridoma, obtenue par dilution à 3xlO5 cellules/ml en flacons de 75 cm2 et 175 cm2 puis par dilution à 4,5xlO5 cellules/ml en flacon de type roller. Après avoir atteint le volume maximal (1 1), la culture a été poursuivie jusqu'à ce que la viabilité cellulaire ne soit plus que de 20%. Après production, les anticorps chimériques EMAB6 et EMAB603 ont été purifiés par chromatographie d'affinité sur protéine A (pureté estimée par HPLC < 95 %) et contrôlés par électrophorèse en gel de polyacrylamide.
Exemple 3 : Caractërisation de l'activité fonctionnelle des anticorps chimériques EMAB6 et EMAB603
A. Spécificité
La spécificité de la reconnaissance antigénique de l'anticorps chimérique EMAB6 a été évaluée par une étude de compétition avec l'anticorps murin d'origine CAT- 13.6E12 pour la fixation à l'antigène CD20 exprimé par les cellules Raji.
Pour cela, l'anticorps EMAB6 (lOμl de 0,5 à 50μg/ml) a été incubé à 40C avec une quantité fixe de l'anticorps murin CAT-13.6E12 (lOμl à 5μg/ml) pendant 20 minutes en présence de cellules Raji (50μl à 4xlO6/ml) . Après lavage, un anticorps anti-IgG de souris couplé à la phycoérythrine (PE) a été ajouté aux cellules Raji de façon à détecter spécifiquement la fixation de l'anticorps murin CAT-13.6E12. Les MFI obtenues en présence des différentes concentrations de EMAB6 sont traduites en pourcentage, le 100% correspondant à la fixation aux cellules de CAT-13.6E12 en absence de
1' anticorps EMAB6.
On obtient ainsi une courbe d' inhibition de la fixation de l'anticorps CAT-13.6E12 (CAT13) sur les cellules Raji en présence de concentrations croissantes de EMAB6 (Fig.
5) .
Cette étude démontre que le processus de chimérisation n'a pas altéré la spécificité de l'anticorps EMAB6 qui entre bien en compétition avec l'anticorps murin parental
CAT-13.6E12 pour la fixation du CD20 exprimé à la surface des cellules Raji.
La spécificité de reconnaissance antigénique de l'anticorps EMAB603 est comparable à celle de l'anticorps
EMAB6.
B. Activité Cytotoxique Dépendante du Complément
L'activité cytotoxique dépendante du complément des anticorps EMAB6 et EMAB603 est étudiée avec les cellules Raji en présence de sérum de jeune lapin comme source de complément ; l'anticorps anti-CD20 chimérique Rituxan est inclus dans un test pour comparaison.
Pour ce test les cellules Raji sont ajustées à 6xlO5 cellules/ml en IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Médium) 5% SVF. Les anticorps sont dilués en IMDM+0,5% SVF. Le mélange réactionnel est composé de 50μl d'anticorps, 50μl de sérum de jeune lapin (dilution au 1/10 en IMDM 0,5% SVF du réactif Cedarlane CL 3441) , 50μl de cellules cibles et 50μl de milieu IMDM 0,5% SVF. Les concentrations finales d'anticorps sont de 5 000, 1 250, 250 et 50 ng/ml . Un contrôle sans anticorps est inclus dans le test. Après Ih d'incubation à 37°C sous atmosphère enrichie en 5% CO2, les plaques sont centrifugées et les taux de LDH intracellulaire libérée dans le surnageant évalués par un réactif spécifique (Cytotoxicity Détection Kit 1 644 793) .
Le pourcentage de lyse est estimé en utilisant une gamme de calibration obtenue avec différentes dilutions de cellules cibles lysées au triton XlOO (2%) , correspondant à 100, 50, 25 et 0% de lyse respectivement.
Les résultats présentés en Fig. 6 (A) indiquent que les anticorps EMAB6 et Rituxan" induisent tous deux une lyse des cellules Raji dépendante du complément. Néanmoins, l'activité complément de l'anticorps EMAB6 apparaît légèrement inférieure a celle de Rituxan . Cette différence est plus importante aux faibles concentrations d'anticorps utilisées dans ce test. Ainsi, pour les concentrations de 50 et 250ng/ml, l'activité de l'anticorps EMAB6 est de l'ordre de 45% de celle de Rituxan". Cette différence s'amenuise lorsque la concentration d'anticorps est augmentée, le pourcentage d'activité cytotoxique dépendante du complément de l'anticorps EMAB6 représentant 92% de celle de Rituxan à la plus forte concentration testée, c'est à dire 5000ng/ml .
Cette activité cytotoxique dépendante du complément de l'anticorps EMAB6 plus faible que celle de Rituxan" peut être considérée comme un avantage car elle limite la toxicité potentielle de l'EMAB6 « in vivo » comparé à Rituxan liée à l'activation de la voie classique du complément conduisant à la production de différentes molécules ayant des activités inflammatoires, allergiques et vasculaires indésirables.
L'activité complément de l'anticorps EMAB603 apparaît Figure 6 (B) .
C. Activité ADCC La cytotoxicité de l'anticorps chimérique EMAB6 a été évaluée en présence de cellules Raji ou bien de lymphocytes B de patients atteints de LLC. L'anticorps anti-CD20 chimérique Rituxan est inclus dans les tests pour comparaison.
La technique de mesure d'ADCC en marquage calcéine utilisée est la suivante :
Les cellules NK sont isolées à partir des PBMC en utilisant la technique de séparation sur billes magnétiques (MACS) de chez Myltenyi . Les cellules NK sont lavées et resuspendues en IMDM+5% SVF (45xlO5 cellules/ml) . Les cellules effectrices et les cellules cibles sont utilisées dans un ratio 15/1. Les cellules Raji ou les PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) de patients présentant une LLC-B obtenues après Ficoll (>95% de lymphocytes B) sont préalablement marquées à la calcéine (1ml de cellules à 3xlO6 cellules/ml en IMDM +5% SVF + 20μl calcein (20μM) incubation 20min à 37°C puis lavage en HBSS (Hank's Buffered Saline Solution)) et ajustées à 3xlO5 cellules/ml en IMDM 5% SVF. Les anticorps sont dilués en IMDM 0,5% SVF (concentration finale 500 ; 50 ; 5 ; 0,5, ; 0,005 et 0,005 ng/ml) . Le mélange réactionnel est composé de 50μl d'anticorps, 50μl de cellules effectrices, 50μl de cellules cibles et de 50μl de milieu IMDM en plaque de microtitration P96. Deux témoins négatifs sont établis :
Lyse sans NK : les cellules effectrices NK sont remplacées par de l'IMDM + 5% SVF.
Lyse sans anticorps (Ac) : les anticorps sont remplacées par de l'IMDM + 5% SVF.
Après 4h d'incubation à 37°C sous atmosphère enrichie en 5% CO2, les plaques sont centrifugées et la fluorescence associée au surnageant mesurée sur un fluorimètre (excitation 485nm /émission 535nm) .
Le pourcentage de lyse est estimé en utilisant une gamme de calibration obtenue avec différentes dilutions de cellules cibles lysées au Triton XlOO (2%) correspondant à 100, 50, 25 et 0% de lyse respectivement.
Les résultats sont calculés dans un premier temps selon la formule suivante :
% de lyse = (%lyse avec Anticorps et NK) - (%lyse sans Anticorps) - (% de lyse sans NK) , puis exprimés en pourcentage relatif, 100% étant la valeur obtenue à la plus forte concentration de Rituxan .
Les résultats obtenus pour l'anticorps EMAB6 sur les cellules de la lignée Raji, présentés en Fig. 7 (A), montrent que quelle que soit la concentration testée, la cytotoxicité induite par l'anticorps EMAB6 est supérieure à celle induite par Rituxan . Cette différence est particulièrement importante pour les faibles concentrations d'anticorps. Ainsi, à la concentration de 0,5ng/ml, les pourcentages de lyse sont de 96 et 4% pour EMAB6 et Rituxan" respectivement. En augmentant de 500 fois la dose (250ng/ml) la différence est encore appréciable puisque les pourcentages respectifs d'ADCC sont de 164 et 100% pour EMAB6 et Rituxan® respectivement. Lorsque l'on calcule les EC50 (concentration d'anticorps correspondant à 50% du E Max, efficacité maximale obtenue à la concentration d' anticorps la plus élevée et au plateau) par estimation graphique (en ng/ml) et selon l'hypothèse que Rituxan et EMAB6 atteignent le même E Max, le rapport EC50 Rituxana/EC50 EMAB6 dans ce test est alors égal à 300. La cytotoxicité de l'anticorps chimérique EMAB603 a été évaluée en présence de cellules Raji selon le même procédé que pour l'anticorps EMAB6. Son activité est comparable à celle de l'anticorps EMΑB6 (cf. Figure 7 (B)) .
Avec les lymphocytes de patients présentant une LLC-B, les résultats obtenus, présentés en Fig. 8, démontrent que - quelle que soit la concentration testée, la cytotoxicité induite par l'anticorps EMAB6 est supérieure à celle induite par Rituxan . Comme déjà observée avec les cellules Raji, cette différence est particulièrement importante pour les faibles concentrations d'anticorps. Une concentration de 0, 5ng/ml de EMAB6 induit le même pourcentage de lyse que 500ng/ml de Rituxan soit un rapport de concentrations de 1000. A la concentration de 5ng/ml, les pourcentages de lyse sont de 269 et 9% pour EMAB6 et Rituxan", respectivement. A la dose maximale testée (500ng/ml) , la différence est encore très importante puisque les pourcentages d'ADCC sont de 350 et 100% pour EMAB6 et Rituxan", respectivement. Un résultat intéressant correspond aux concentrations qui donnent 50% de lyse. Le rapport EC50 Rituxanβ/EC50 EMAB6 dans ce test est estimé à 10 000 (estimation graphique en ng/ml de EC50 selon l'hypothèse que Rituxan et EMAB6 atteignent le même E Max) .
Dans ces tests les activités cytotoxiques de EMAB6 et celle de EMAB603 sont donc très supérieures à celle de Rituxan .
D. Activation du CD16 (sécrétion d'IL-2)
L'activation CD16 (FcγRIIIA) induite par l'anticorps chimérique EMAB6 a été déterminée en présence de cellules Raji ou bien de lymphocytes B de patients présentant une LLC. Ce test évalue la capacité de l'anticorps à se fixer sur le récepteur CD16 (FcγRIIIA) exprimé sur les cellules Jurkat-CD16 et à induire la sécrétion d'IL-2. L'anticorps anti-CD20 chimérique Rituxan est inclus dans les tests pour comparaison.
La mesure d'activation CD16 est réalisée sur la lignée Jurkat-CD16 en présence de cellules Raji ou de lymphocytes B de patients présentant une LLC de la façon suivante :
Mélange en plaque de 96 puits : 50μl d'une solution d'anticorps (dilution à 10 000, 1 000, 100 et 10 ng/ml en IMDM 5% SVF pour les lymphocytes B de patients présentant une LLC-B et 10 000, 2 000, 1 000, 200, 100, 50 et 25 ng/ml pour les cellules Raji), 50μl de PMA (Phorbol Myristate Acétate, dilution à 40ng/ml en IMDM 5% SVF), 50μl de cellules Raji ou de PBMC de patients présentant une LLC-B obtenues après Ficoll (>95% de lymphocytes B) diluées à 6xlO5/ml en IMDM 5% SVF, et 50μl de cellules Jurkat-CD16 (20xl0E6/ml en IMDM 5% SVF) . Des contrôles sans anticorps sont inclus dans tous les tests. Après incubation 1 nuit à 37°C, les plaques sont centrifugées, et l'IL-2 contenue dans les surnageants évaluée avec le kit commercial (Quantikine de chez R/D) . La lecture de la DO se fait à 450nm.
Les résultats sont exprimés dans un premier temps en taux d' IL-2 en fonction de la concentration d'anticorps (de 0 à 2500ng/ml concentration finale) , puis en pourcentage relatif, 100% étant la valeur obtenue avec Rituxan' à la plus forte concentration testée.
Les résultats obtenus avec les cellules de la lignée Raji, présentés en Fig. 9 (A), indiquent qu'en présence de l'anticorps EMAB6 et de Rituxan , les cellules Jurkat- CD16 sécrètent de l'IL-2, indiquant une activâtion cellulaire via la fixation de la portion Fc des anticorps sur le CDl6. Néanmoins l'anticorps EMAB6 possède une activité inductrice beaucoup plus forte que l'anticorps Rituxan . Ainsi, à la concentration de 6,25ng/ml les pourcentages d'IL-2 - sont de 112 et 21% pour EMAB6 et Rituxan respectivement. A 50ng/ml, la différence est encore importante, les pourcentages d'IL-2 étant de 112 et 65% respectivement. Aux plus fortes concentrations, cette différence diminue, puisque à 2500ng/ml, les pourcentages respectifs d'IL-2 entre EMAB6 et Rituxan sont de 124 et 100%. Le rapport EC50 RituxanΘ/EC50 EMAB6 dans ce test est estimé à 15 (estimation graphique en ng/ml de EC50 selon l'hypothèse que Rituxan® et EMAB6 atteignent le même E Max) .
Ces résultats confortent les résultats d'ADCC, tous deux dépendants du CD16. Ils indiquent que l'engagement du CD16 (FcγRIIIA) par la portion Fc de l'anticorps EMAB6 est suivie d'une forte activation cellulaire conduisant à l'induction de fonctions effectrices .
L' activation CD16 (FcγRIIIA) induite par l'anticorps chimérique EMAB603 en présence de cellules Raji est comparable avec celle induite par l'anticorps EMAB6.
Avec les lymphocytes de patients présentant une LLC-B, les résultats obtenus, présentés en Fig. 10, montrent qu'en présence des anticorps anti-CD20 Rituxan® et EMAB6, les cellules Jurkat-CD16 sécrètent de l'IL-2, indiquant une activation cellulaire via la fixation de la portion Fc des anticorps par le CD16. Néanmoins l'anticorps EMAB6 possède une capacité inductrice beaucoup plus importante que l'anticorps Rituxan". En effet, l'activité d'induction de sécrétion d'IL-2 de Rituxan* est proche de la ligne de base pour les concentrations de 2,5 et 25ng/ml, alors que celle de l'anticorps EMAB6 est significative. Ainsi, à la concentration de 25ng/τnl, les pourcentage d'IL-2 sont de 132 et 34% pour EMAB6 et Rituxan" respectivement. A la plus forte concentration (2500ng/ml) , les pourcentages d'IL-2 sont de 148 et 100% respectivement. Le rapport EC50 Rituxan"/EC50 EMAB6 dans ce test est supérieur à 100 : il est estimé à 300 (estimation graphique en ng/ml de EC50 selon l'hypothèse que Rituxan" et EMAB6 atteignent le même E Max) . En. conclusion, l'ensemble des tests effectués sur les cellules Raji démontre que les anticorps EMAB6 et EMAB603, contrairement à Rituxan" sont fortement cytotoxiques et induisent une activation des cellules exprimant le CD16 (FcγRIIIA) et cela particulièrement aux faibles concentrations d'anticorps. Par contre dans- ces mêmes conditions, l'activité cytotoxique dépendante du complément de l'anticorps EMAB6 diminue d'environ 50% comparée à celle de Rituxan .
Ces résultats sont renforcés par les études réalisées avec des cellules isolées à partir de patients présentant une LLC-B qui indiquent que l'anticorps EMAB6 est beaucoup plus cytotoxique que Rituxan vis à vis des lymphocytes B de patients atteints de LLC-B. Les différences entre les deux anticorps sont plus marquées avec les cellules issues de patients atteints de LLC-B qu'avec les cellules Raji, démontrant un intérêt thérapeutique important pour EMAB6 comparé à Rituxan dans cette pathologie.
L'origine de cette différence plus importante peut, entre autres, être due à la plus faible expression antigénique du CD20 sur les lymphocytes B de patients atteints de LLC-B par rapport à celle des cellules Raji. Par analogie avec les cellules Raji, on peut suggérer que l'activité cytotoxique dépendante du complément de l'anticorps EMAB6 vis à vis des lymphocytes de patients atteints de LLC-B doit être inférieure à celle induite par Rituxan , présentant ainsi l'avantage d'être moins toxique « in vivo » du fait des effets indésirables liés à une forte activation de la voie classique du complément.
Exemple 4 : Analyse des glycannes de EMAB6 et EMAB603 par HPCE-LIF
La structure du N-glycanne de la chaîne lourde des anticorps EMAB6 et EMAB603 a été analysée par HPCE-LIF. La structure du N-glycanne de la chaîne lourde de Rituxan* a aussi été analysée pour comparaison. A cette fin les anticorps monoclonaux anti-CD20 ont été dessalés sur une colonne de Sephadex G-25 (HiTrap Desalting, Amersham Biosciences) , séchés par évaporation et remis en suspension dans le tampon d'hydrolyse de la PNGase F (Glyko) en présence de 50 mM de β- mercaptoéthanol . Après 16 h d'incubation à 37°C, la fraction protéique a été précipitée par l'ajout d'éthanol absolu et le surnageant, qui contient les N-glycannes, séché par évaporation. Les oligosaccharides ainsi obtenus ont été soit marqués directement par un fluorochrome -. l'APTS (l-amino-pyrène-3, 6, 8-trisulfonate) , soit soumis à l'action d' exoglycosidases spécifiques avant marquage par l'APTS. Les oligosaccharides ainsi marqués ont été injectés sur un capillaire W-CHO, séparés et quantifiés par électrophorèse capillaire à détection de fluorescence induite par laser (HPCE-LIF) .
L'évaluation du taux de fucose a été réalisée soit par l'addition des formes fucosylées isolées, soit plus spécifiquement après action simultanée de la neuraminidase, la β-galactosidase et la iV- acétylhexosaminidase, permettant d'obtenir, sur 1' électrophorégramme, 2 pics correspondant au pentasaccharide [GlcNac2-Man3] , fucosylé ou non: Tableau 1 : analyse des N-glycannes des anticorps anti- CD20 EMAB603 et Rituxan1
Figure imgf000044_0001
Le taux de fucose, exprimé en %, a été calculé en utilisant la formule suivante :
[GlcNac2-Man3] fucosylé x 100
Taux de' [GlcNac2-Man3+ GlcNac2-Man3 fucose = fucosylé]
Le taux de galactose, exprimé en %, a été calculé en additionnant les pourcentages des formes oligosaccharidiques contenant du galactose obtenues après action de la neuraminidase et de la fucosidase. La formule utilisée est la suivante : Taux de galactose = (G1+G1B) + 2x(G2+ G2B) Le rapport taux de fucose/taux de galactose est obtenu en divisant le taux de fucose par le taux de galactose, les taux étant calculés comme décrit ci-dessus.
D'après cette analyse (cf. Tableau 1), il apparaît que les anticorps EMAB6 et EMAB603 sont peu fucosylés (% Fucose inférieur à 25) comparé à Rituxan (% Fucose = 93) . De plus, le ratio Fuc/Gal (ratio taux de Fucose / taux de Galactose) de EMAB6 et de EMAB603 est faible (ratio Fuc/Gal inférieur à 0,6) contrairement aux anticorps exprimés dans CHO comme Rituxan (ratio Fuc/Gal = 1,63) .

Claims

Revendications
1. Anticorps monoclonal dirigé contre l'antigène CD20, caractérisé en ce que la région variable de chacune de ses chaînes légères est codée par une séquence possédant au moins 70% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 5, la région variable de chacune de ses chaînes lourdes est codée par une séquence possédant au moins 70% d' identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 7, et les régions constantes de ses chaînes légères et de ses chaînes lourdes sont des régions constantes provenant d'une espèce non-murine.
2. Anticorps selon la revendication 1, caractérise en ce que ladite région variable de chacune de ses chaînes légères est codée par une séquence possédant au moins 80% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 5, et en ce que ladite région variable de chacune de ses chaînes lourdes est codée par une séquence possédant au moins 80% d' identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 7.
3. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite région variable de chacune de ses chaînes légères est codée par une séquence possédant au moins 90% d' identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 5, et en ce que ladite région variable de chacune de ses chaînes lourdes est codée par une séquence possédant au moins 90% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 7.
4. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite région variable de chacune de ses chaînes légères est codée par une séquence possédant au moins 95% d' identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 5, et en ce que ladite région variable de chacune de ses chaînes lourdes est codée par une séquence possédant au moins 95% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 7.
5. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite région variable de chacune de ses chaînes légères est codée par une séquence possédant au moins 99% d' identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 5, et en ce que ladite région variable de chacune de ses chaînes lourdes est codée par une séquence possédant au moins 99% d'identité avec la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 7.
R.T]
[&**. jAnticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la région variable de chacune de ses chaînes légères est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 5 ou par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 25, la région variable de chacune de ses chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique murine SEQ ID NO : 7, et les régions constantes de ses chaînes légères et de ses chaînes lourdes sont des régions constantes provenant d'une espèce non-murine.
7. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les régions constantes de chacune de ses chaînes légères et de chacune de ses chaînes lourdes sont des régions constantes humaines .
8. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la région constante de chacune de ses chaînes légères est de type K .
9. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la région constante de chacune de ses chaînes lourdes est de type γ.
10. Anticorps selon la revendication 9, caractérisé en ce que la région constante de chacune de ses chaînes lourdes est de type γl .
11. Anticorps selon la revendication 10, caractérisé en ce que la région constante de chacune de ses chaînes lourdes est de type γl et codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 23 et en ce que la région constante de chacune de ses chaînes légères est codée par la séquence d'acide nucléique humaine SEQ ID NO : 21.
12. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que chacune de ses chaînes légères est codée par la séquence d'acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO : 13 ou par la séquence d' acide nucléique chimère murine-humaine SEQ ID NO : 27 et en ce que chacune de ses chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique chimère murine- humaine SEQ ID NO : 19.
13. Anticorps selon la revendication 12, caractérisé en ce que la séquence peptidique déduite de la séquence SEQ ID NO : 13 est la séquence SEQ ID NO : 14 et en ce que la séquence peptidique déduite de la séquence SEQ ID NO : 19 est la séquence SEQ ID NO : 20.
14. Anticorps selon la revendication 12, caractérisé en ce que la séquence peptidique déduite de la séquence SEQ ID NO : 27 est la séquence SEQ ID NO : 28 et en ce que la séquence peptidique déduite de la séquence SEQ ID NO : 19 est la séquence SEQ ID NO : 20.
15. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est produit par une lignée cellulaire d'hybridome de rat.
16. Anticorps selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il est produit dans l'hybridome de rat YB2/0 (cellule YB2/3HL.P2.GIl.16Ag.20, déposée à 1'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL-1662) .
17. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'il s'agit de l'anticorps EMAB6 produit par le clone R509 déposé sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3314 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) .
18. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 et 14, caractérisé en ce qu'il s'agit de l'anticorps EMAB603 produit par le clone R603 déposé sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3529 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) .
19. Vecteur pEF-EMAB6-K d'expression de la chaîne légère d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 de séquence SEQ ID NO : 12.
20. Vecteur pEF-EMAB6-H d'expression de la chaîne lourde d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 de séquence SEQ ID NO : 18.
21. Lignée cellulaire stable exprimant un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 18.
22. Lignée cellulaire stable selon la revendication 21 choisie parmi le groupe consistant en : SP2/0, YB2/0, IR983F, le myélome humain Namalwa, PERC6, les lignées CHO, notamment CHO-K-I, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO-Lecl3, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653.
23. Lignée cellulaire stable selon la revendication 21 ou 22, ayant intégré les deux vecteurs d'expression pEF-EMAB6-K et pEF-EMAB6-H selon les revendications 19 et 20.
24. Clone R509 déposé sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3314 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) .
25. Clone R602 déposé sous le numéro d'enregistrement CNCM 1-3529 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) .
26. Fragment d'ADN de séquence SEQ ID NO : 19 codant pour la chaîne lourde d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 18.
27. Fragment d'ADN de séquence SEQ ID NO : 13 codant pour la chaîne légère d'un anticorps selon l'une des revendications 1 à 13.
28. Fragment d'ADN de séquence SEQ ID NO : 27 codant pour la chaîne légère d'un anticorps selon l'une des revendications 1 à 12 et 14.
29. Utilisation d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, pour activer in vitro les récepteurs FcγRIII de cellules immunitaires effectrices.
30. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, pour son utilisation comme médicament.
31. Utilisation d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une leucémie ou d'un lymphome.
32. Utilisation d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une pathologie choisie parmi les leucémies aiguës lymphoblastiques B, les lymphomes lymphoblastiques B, les lymphomes à cellules B matures, parmi lesquels la leucémie lymphoide chronique de type B (LLC-B) , le lymphome lymphocytique à petits lymphocytes B, la leucémie prolymphocytaire B, le lymphome lymphoplasmocytaire, le lymphome à cellules du manteau, le lymphome folliculaire, le lymphome de la zone marginale de type MALT, le lymphome ganglionnaire de la zone marginale avec ou sans cellule B monocytoïde, le lymphome splénique de la zone marginale (avec ou sans lymphocyte villeux) , la leucémie à tricholeucocytes, le lymphome diffus à grandes cellules B, le lymphome de Burkitt, ainsi que toute pathologie dysimmunitaire impliquant des cellules de la lignée lymphoïde B dont les maladies auto-immunes.
33. Utilisation d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une leucémie lymphoïde.
34. Utilisation d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de la leucémie lymphoïde chronique de type B (LLC-B) .
35. Utilisation d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de la maladie du greffon contre l'hôte chronique.
36. Utilisation d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du rejet de greffes d'organes, notamment de rein.
37. Utilisation d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 18 en combinaison avec un ou plusieurs autre (s) anticorps dirigé (s) contre un ou plusieurs autre (s) antigène (s) exprimé (s) sur les cellules lymphoïdes, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une leucémie ou d'un lymphome.
38. Utilisation d'un anticorps selon la revendication 37, caractérisée en ce que ledit antigène exprimé sur les cellules lymphoïdes est choisi parmi le HLA-DR, le CD19, le CD23, le CD80, le CD22, le CD32 et le CD52.
39. Utilisation d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, en association avec des cellules exprimant des FcγR, telles que les cellules NK (Natural Killer) , les cellules NKT (Natural Killers T) , les lymphocytes Tγδ, les macrophages, les monocytes ou les cellules dendritiques, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une leucémie ou d'un lymphome.
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