WO2006106966A1 - 光測定装置 - Google Patents

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    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence

Definitions

  • the present invention relates to an optical measurement device that can effectively reduce noise light and obtain measurement data having a high SZN ratio.
  • a single-molecule fluorescence analyzer using a confocal optical system requires a complicated optical system.
  • the complicated optical system here means that it is possible to adjust the optical path of the confocal optical system and to change the combination of multiple filters corresponding to various wavelengths.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-244238 discloses an invention relating to a confocal scanning microscope that does not require adjustment of an optical path.
  • the wavelength of light from one wavelength tunable laser is switched using the wavelength selective reflection plate, so that there is no optical path deviation that does not require switching between a plurality of laser light sources.
  • the noise light includes light generated inside the measuring apparatus in addition to disturbance light.
  • a light measurement device that measures the faint light emitted from a biological sample of a single molecule level in a solution using multiple light sources, performs light detection with high sensitivity by narrowing the light to a minute area. Therefore, it is necessary to incorporate optical elements in the measurement optical path, such as pinholes and filters, and adjust their positions with high accuracy.
  • the position adjustment of these optical elements is generally performed by adjusting the optical position attached to each optical element. It is often performed automatically by detecting the position coordinates with a position detector. When detecting weak light of sample force with a high-sensitivity photodetector, the light emitted from the light source built into this optical position detector is also detected by the measurement photodetector, and this is detected as noise. May affect measurement data.
  • An object of the present invention is to provide an optical measurement apparatus that can effectively reduce noise light generated inside the apparatus together with disturbance light, and can obtain measurement data with a high SZN ratio.
  • the light measurement apparatus includes a light source that irradiates a sample with light and a light guide optical system that guides generated light generated as a result of irradiating the sample with the irradiation light to a photodetector.
  • the light guide optical system includes a plurality of optical elements for guiding the generated light to the photodetector, positioning means for adjusting the arrangement of at least one of the optical elements, and at least one A position detecting means for detecting the positions of the two optical elements by an optical method. When adjusting the position of at least one of the optical elements, the position detecting means starts to emit light and the sample is measured. Stops the light emission of the position detecting means.
  • FIG. 1 is a diagram showing a schematic configuration of a light measurement apparatus according to a first embodiment.
  • FIG. 2 is a diagram showing a light shielding box.
  • FIG. 3 is a diagram showing a configuration of a barrier ′ filter switching mechanism.
  • [4A] A diagram showing an optical position detector.
  • [4B] A diagram showing the optical position detector.
  • FIG. 5 is a flowchart showing a procedure for automatically measuring by a computer.
  • FIG. 6 is a flowchart showing an automatic operation procedure of a computer.
  • FIG. 7 is a diagram showing the ON / OFF logic of the optical position detector power supply.
  • FIG. 8 is a flowchart showing an automatic operation procedure of a computer according to a modification.
  • FIG. 9 shows measurement results.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a schematic configuration of the optical measurement device according to the first embodiment.
  • the basic device configuration of the main part of the light measurement device according to this embodiment is based on a confocal optical microscope.
  • the configuration and operation of the optical measurement device will be described with reference to FIG.
  • the light measurement apparatus is provided with two types of light sources.
  • Light source 1 uses a helium neon laser with an oscillation output of 2 mW and a wavelength of 633 nm
  • light source 2 uses an anoregon laser with an oscillation output of 10 mW and a wavelength of 488 ⁇ m.
  • the light irradiated from the light sources 1 and 2 via the shirts 3 and 4 is changed in the traveling direction by the mirror and then synthesized by the dichroic mirror 5 and travels in one optical path.
  • the combined light beam becomes a parallel light beam whose beam diameter is enlarged by the collimator lens, is reflected by the dichroic mirror 6, and reaches the objective lens 7.
  • a microplate 8 is placed on and fixed to the sample stage 9. Then, the horizontal position and vertical position of the microplate 8 are driven on the sample stage XY axis so that the area collected by the objective lens 7, that is, the confocal area is formed in the area within the predetermined well of the microplate 8. Adjust using mechanism 10 and objective lens Z-axis adjustment mechanism 11.
  • the microplate 8 is made of commonly used resin and glass and having 96 wells.
  • the well has a circular or square groove to hold the sample.
  • the bottom of each well is a window made of a material that transmits visible light, such as glass (not shown).
  • Rhodamine Green (RhG) is used as the fluorescent material. Rhodamine 'green is most effectively excited when the wavelength of the excitation light is around 490 nm, and emits light most efficiently around the wavelength of 530 nm. Therefore, rhodamine green is excited with an argon laser. Sci-fi (Cy5) is used and excited by a helium-neon laser. Sci-Five (Cy5) is most effectively excited when the wavelength of the excitation light is around 640 nm, and has the highest emission intensity around the wavelength of 670 nm.
  • the dichroic mirror 6 is manufactured such that one of the flat plates made of glass is coated with a multilayer film to optimize the spectral characteristics of transmission and reflection. Therefore, the fluorescent light passes through the diced opening mirror 6, reaches the condenser lens 12, is reflected by the mirror 13 as focused light, and enters the light shielding box 20.
  • the light shielding box 20 is a hollow box as shown in FIG. 2 and is made of a metal such as stainless steel or aluminum, and is provided with a light introduction hole and a signal line extraction hole on the side wall surface. It is installed over the device.
  • a pinhole 21, a collimator lens 24, a photodetector 26, and the like are housed.
  • a pinhole 21 is arranged at the focus position of the condenser lens 12.
  • An optical position detector (not shown) and a pinhole driving device 23 are attached to the pinhole 21, and the pinhole 21 can be adjusted in the X-Y-Z-axis direction by the pinhole driving device 23. It becomes. Based on the detection value of the optical position detector, the origin position is obtained.
  • the pinhole driving device 23 By operating the pinhole driving device 23 for a predetermined distance from the origin position, the focal plane of the condensing lens 12 and the opening surface of the pinhole 21 can be substantially matched. This is a rough adjustment of the pinhole position.
  • This pinhole 21 removes background light that also generates an external force in the confocal region of the light formed in the well. Further, by providing the light shielding box 20, disturbance light having an external force from the apparatus can be removed.
  • the signal light that has passed through the pinhole 21 is converted into parallel light by the collimating lens 24.
  • the signal light reaches the lens 25 and is condensed on the light receiving surface of the photodetector 26 by the lens 25.
  • Light detection A light position detector (not shown) and a light detector driving device 27 are attached to the light detector 26, and the light receiving surface of the light detector is moved along the X, Y, and Z axis directions by the light detector driving device 27.
  • the position can be adjusted.
  • the photodetector driving device 27 By operating the photodetector driving device 27 based on the detection signal of the optical position detector, the position of the photodetector 26 can be set to an almost optimal position. The above is rough adjustment of light detection.
  • a noria / filter switching mechanism 29 is provided between the collimating lens 24 and the lens 25.
  • the barrier / filter switching mechanism 29 holds a plurality of barrier filters for transmitting light having a desired wavelength width from incident signal light.
  • the barrier filter switching mechanism 29 switches the barrier filter by rotation and sets it in the optical path.
  • FIG. 3 is a diagram showing a configuration of the Noria 'filter switching mechanism 29.
  • the Noria 'filter switching mechanism 29 includes an optical position detector 31, a barrier' filter rotation switching device 32, and a barrier 'filter rotation switching device driving device 33 disposed on the gantry 30.
  • the Noria 'filter rotation switching device 32 has a disk shape as shown in FIG. 3, and its central axis is connected to the Noria' filter rotation switching device driving device 33. Therefore, by driving the barrier / filter rotation switching device driving device 33, the center of the disk can be rotated about the rotation axis.
  • the center of the Noria filter 34 coincides with a position away from the rotational center force of the Noria filter rotation switching device 32 by a certain distance. That is, a plurality of barrier filters 34 are arranged on the circumference of a concentric circle of the barrier filter rotation switching device 32 so that the centers thereof coincide with each other. Therefore, the necessary barrier filter 34 can be arranged in the optical path made parallel by the collimating lens 24 by driving the Noria filter rotation switching device driving device 33. Therefore, the barrier filter 34 is surely placed in the optical path.
  • the barrier filter 34 is configured such that the spectrum of the transmitted light is adjusted in accordance with the fluorescence emission spectrum intensity distribution, and only the light in the wavelength region of the fluorescence emission spectrum that becomes the signal light is transmitted. pass.
  • the wavelength of fluorescence and the wavelength of background light are different. Accordingly, the scattered light generated in a predetermined well of the microplate 8 can be cut. Also, when a part of the incident light reflects the force of the wall of the well and returns to the incident optical path The generated noise light can be cut.
  • a position detection target 35 is attached to a predetermined position of the barrier / filter rotation switching device 32.
  • the position detection target 35 rotates in accordance with the rotation of the noria 'filter rotation switch 32.
  • FIG. 4A and 4B are diagrams showing the optical position detector 31.
  • FIG. 4A and 4B are diagrams showing the optical position detector 31.
  • FIG. 4A is a perspective view of the optical position detector 31.
  • the optical position detector 31 has a structure in which a U-shaped detector 37 is provided on an attachment member 36 connected to the gantry 30.
  • the detection unit 37 is provided with a light source for detection on one side and an optical sensor on the other side.
  • FIG. 4B is an enlarged view of the detection unit 37 and also shows the lateral force.
  • the light source for position detection and the optical sensor are held facing each other, and the position detection target 35 passes between them. Therefore, when the position detection target 35 is positioned between the light source of the optical position detector 31 and the optical sensor, the light from the light source is blocked and the output of the optical sensor is lost.
  • the output of this optical sensor is 5V when there is no position detection target 35, and is OV when the position detection target 35 is in front of the optical sensor.
  • the origin of the rotational position of the Noria 'filter rotation switching device 32 can be detected. That is, the rotation position of the Noria 'filter rotation switch 32 can be known by counting the rotation drive pulses of the Noria' filter rotation switch drive device 33 with the position where the output of the optical sensor becomes OV as the origin position. it can.
  • the light source of the optical position detector 31 may be an infrared LED or a semiconductor laser. Further, a semiconductor optical sensor can be used as the optical sensor.
  • the photodetector 26 uses a weak photodetector such as an avalanche photodiode (APD) or a photomultiplier tube.
  • the signal light received by the photodetector 26 is weak light and is a photon pulse.
  • the photodetector 26 the signal light is converted into a photocurrent pulse, which is an electric signal, and enters the signal processing device 40 to be amplified. Subsequently, the photocurrent pulse is waveform-shaped, converted into an on-off voltage pulse, and guided to the converter 41.
  • This voltage pulse is stored in a memory (not shown) of the computer 41, and subsequently correlated. Operations such as analysis are performed. As a result, not only the intensity of the fluorescence but also the analysis result force such as the lifetime of the fluorescence, the autocorrelation function of the obtained fluorescence intensity fluctuation, or the cross-correlation function is displayed on the display device 42 of the computer 41.
  • the optical position detector 31 employs a light detection method as described above.
  • a semiconductor optical position detector is inexpensive, compact, and excellent in handling compared to a contact-type position detector or a detector using electrostatic capacity. Because it is.
  • an optical position detector is used to adjust the position of the optical element, the light emitted from the light source used in the optical position detector becomes noise light for the optical detector used for measurement. In order to detect a correct optical signal, it is necessary to take measures to reduce or block this.
  • FIG. 5 is a flowchart showing a procedure when the computer 41 automatically performs measurement.
  • step S01 when the user turns on the main power supply of the optical measurement device, the computer 41 starts an initialization operation. That is, the positions of various optical elements and movable parts such as the sample stage are adjusted to the initial positions.
  • the initial position is a position where the optical element is driven from the origin by a predetermined step force.
  • the Noria 'filter rotation switching device 32 when the Noria 'filter rotation switching device 32 is set to the initial position, it is operated as follows. First, the position detection target 35 is rotated, and the position where the optical position detector 31 detects the position detection target 35 is set as the origin. Then, the Noria 'filter rotation switching device 32 is rotated by a predetermined angle from this origin, and that position is set as the initial position. Similarly, for the initial position of the pinhole 10 and the initial position of the photodetector 26, while monitoring the output signal of the optical position detector (not shown), based on the output value and the predetermined number of rotational drive pulses, To set the initial position.
  • step S02 measurement conditions such as measurement time, designation of a light source used for measurement, and designation of a plurality of wells to be measured are acquired. These measurement conditions are entered directly by the user.
  • step S03 the horizontal position of the sample stage 9 is positioned by driving the sample stage XY axis drive mechanism 10 so that the measurement target well is positioned directly above the objective lens 7.
  • step S04 it is checked whether or not the position of the optical element needs to be adjusted.
  • a predetermined reconditioning condition such as when measuring for the first time, measuring more than a predetermined number of wells, or measuring wells in a specific area of microplate 8.
  • step S04 the optical position detector is turned on in steps S05 to S06 to position the optical element.
  • the shutters 3 and 4 corresponding to the light sources 1 and 2 are opened, and the sample solution in the well is irradiated through the objective lens 7.
  • the fluorescence signal emitted from the sample is detected by the measurement photodetector 26, the position of the optical element in the optical path through which the signal light passes is adjusted in the optical axis direction and in the XY direction (horizontal direction). Optimize the installation position of the optical element.
  • an optical position detector is used to adjust the position of each optical element.
  • the pinhole driving device is determined according to the origin position obtained from the output value of the optical position detector (not shown) and a predetermined number of rotational drive pulses. 23 and the photodetector driving device 27 are driven to perform rough adjustment. After that, after opening the shatter, fine adjustment of the position of the pinhole drive unit 23 and the photodetector drive unit 27 is performed so that the output of the photodetector 26 is maximized as described above. Position it at the correct position.
  • step S07 After the position adjustment of all of the plurality of optical elements is completed and the optical axis adjustment of the measuring apparatus is completed, the computer 41 turns off the optical position detector and stops the generation of noise light. .
  • the disturbance light is cut by the light shielding box 20, and the optical noise generated in the light shielding box is also cut by turning off the optical position detector. This eliminates noise light other than the measurement signal.
  • step S09 When the measurement is completed in step S08, it is checked in step S09 whether or not the force has been measured for all of the plurality of wells designated by the user. Then, if there are still wells to be measured, repeat steps S03 to S09.
  • the sample stage 9 is driven, the horizontal position of the microplate 8 is moved, and the sample in the well of the microplate 8 to be measured next is aligned.
  • the optical position detector is turned on and the position adjustment is performed again. After the adjustment is completed, turn off the optical position detector.
  • step S09 when all the measurements for the plurality of wells designated by the user are completed, the data obtained by the measurement is displayed on the display device 42 in step S11.
  • FIG. 6 is a flowchart showing an automatic operation procedure of the computer 41 corresponding to the operations in steps S05 to S08 in FIG.
  • steps T01 to T03 the computer 41 turns on the power of the optical position detector and adjusts the position of the required optical element. Then turn off the optical position detector.
  • a measurement start command is output. Receiving this measurement start command, each part of the optical measurement device executes a series of operations for starting a predetermined measurement. For example, open shirts 3 and 4.
  • the computer 41 outputs a measurement end command. Receiving this measurement end command, each unit of the optical measurement device executes a series of operations for predetermined measurement end. For example, closing shirts 3 and 4.
  • the optical element that requires position adjustment is surrounded by the light shielding box 20 that prevents ambient light in the apparatus.
  • the light shielding box 20 that prevents ambient light in the apparatus.
  • Modification 1 of the first embodiment the operation of turning off the optical position detector at the time of measurement and turning on the optical position detector at the end of measurement is the same as in the first embodiment. The difference is that the determination is performed using the logic circuit of the light measuring device.
  • FIG. 7 is a diagram showing ON / OFF logic of the optical position detector.
  • step T10 when the optical element position drive power supplied to the motor for adjusting the position of the optical element is working, or as shown in step T11, the shutter of the laser light source is closed. When it is, it is determined that no measurement is performed.
  • step T12 the optical position detector is turned on. On the other hand, both of these two conditions are met! If this is the case, it is considered that the measurement is being performed, and the optical position detector is turned off.
  • the laser shatter used as the light source is open, and the drive source for switching all the optical elements is operated.
  • control to turn off the optical position detector is performed electrically, that is, on the electric circuit.
  • infrared rays which are light emitted from the optical position detector force during measurement, from being detected by the photodetector as stray light.
  • the optical position detector is turned off at the time of measurement, and the optical position detector is turned on at the end of the measurement.
  • a switch that can turn on and off the optical position detector is provided in the optical measurement device body.
  • the optical position detector is turned on during optical adjustment and the optical position detector is used during measurement. When the power is turned off, the operator manually performs the operation.
  • FIG. 8 is a diagram illustrating a procedure according to the second modification corresponding to the operations of steps S05 to S08 in FIG.
  • step T16 the operator operates the switch to turn on the optical position detector and instructs the computer 41 to start position adjustment of the optical element. Receiving this instruction, the computer 41 performs necessary optical element position adjustment in step T17. Then, a position adjustment end message is displayed on the display device 42. In step T18, the operator who confirmed this message operates the switch to turn off the optical position detector. Then, the computer is instructed to start measurement.
  • step T19 the computer 41 starts a series of measurement operations.
  • a measurement start command is output.
  • Each part of the optical measurement device uses this measurement start command.
  • the computer 41 outputs a measurement end command. Receiving this measurement end command, each part of the optical measurement device executes a series of operations for a predetermined measurement end.
  • Modified Example 2 as a method for preventing stray light, in addition to electrical automatic control, the same effect can be obtained by manually turning off the optical position detector when optical adjustment is completed. be able to. Therefore, a desired effect, that is, reduction of noise light can be realized by a device having a simple configuration.
  • the mic plate 8 is installed on the sample stage 9, and a phosphate buffer solution (PBS) as a buffer solution is accommodated in the well.
  • PBS phosphate buffer solution
  • This well was irradiated with helium 'neon laser light with a wavelength of 633 nm and an output of 300 W.
  • the output value from the photodetector 26 obtained at this time, that is, the count rate was measured.
  • the phosphate buffer solution used as the buffer solution does not contain fluorescent substances.
  • an output value when the optical position detector was turned on was compared with an output value when the optical position detector was turned off.
  • the measurement time is 10 seconds.
  • Fig. 9 shows the measurement results. Even when the excitation light was irradiated to the solution containing the sample that did not contain the fluorescent substance, the count rate of the optical pulse signal output from the photodetector 26 was 0.2 to 0.5 kHz. At this time, it is considered that the signal obtained as an output signal is due to the soot current. On the other hand, when the optical position detector was turned on, the optical noise signal output from the optical detector 26 was 5 to 6 kHz.
  • the light source of the position detector necessary for optical adjustment is a large internal noise light. Then, it can be seen that the influence of the noise light can be effectively reduced by the ON-OFF operation of the optical position detector according to the present invention.
  • the light handled by the present optical measurement device is not limited to a laser.
  • a tungsten lamp can also be used as the light source, and the light to be detected may be phosphorescence, emission, scattered light, or reflected light that is not only fluorescent.
  • the position of the optical element is detected by the optical position detector and the position is adjusted, it is possible to arrange a complicated optical system using a plurality of light sources. Since the noise light generated at that time can be cut off, highly accurate measurement can be performed.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiments as they are, but can be embodied by modifying the constituent elements without departing from the scope of the invention when it is practiced. Further, various inventions can be formed by appropriately combining a plurality of constituent elements disclosed in the above embodiment. For example, some components may be deleted from all the components shown in the embodiment. Furthermore, you may combine suitably the component covering different embodiment.
  • the present invention can be widely used in an industry for manufacturing an optical measurement device that can effectively reduce the influence of noise light generated inside the device and obtain measurement data with a high SZN ratio.

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Abstract

　導光光学系は、発生光を光検出器に導くための複数の光学素子（２１、２４、２５、２６、２９）と、少なくとも一つの光学素子の配置を調整するための位置決め手段（２３、２７、３３）と、少なくとも一つの光学素子の位置を光学的方法で検出する位置検出手段（３１）とを備え、少なくとも一つの光学素子の位置を調整するときは位置検出手段の発光を開始し、試料を測定するときは位置検出手段の発光を停止する光測定装置である。

Description

明 細 書
光測定装置
技術分野
[0001] 本発明は、ノイズ光を有効に低減して SZN比の高い測定データを得ることのできる 光測定装置に関する。
背景技術
[0002] 共焦点光学系を用いた 1分子蛍光分析装置では、複雑な光学系が必要である。こ こでいう複雑な光学系とは、共焦点光学系の光路調整や、各種波長に対応した複数 のフィルタの組み合わせを変えられるように構成されて 、ると!/、うことである。
[0003] 特開平 7— 244238号公報には、光路の調整の必要のない共焦点走査型顕微鏡 についての発明が開示されている。この発明では、 1台の波長可変レーザからの光を 波長選択反射板を用いて波長を切り換えるため、複数のレーザ光源を切り換える必 要がなぐ光路のズレは生じない。
[0004] 一般に、生体試料から発せられる蛍光や生物発光などは極めて微弱な光であるこ とが多ぐこれを測定するための共焦点光学顕微鏡を基本とする測定装置では、光 電子増倍管ゃァバランシ ·フォトダイオード (APD)などと 、つた高感度光検出器が 用いられている。
[0005] 特開平 7— 244238号公報に開示された発明では、必要な波長以外のレーザ光が カットされるので光強度のロスとなり、出力が低減する。励起用レーザ光の強度が弱 いと試料力 発せられる蛍光強度も微弱となるため、光検出器の感度を上げる必要 があるが、同時にノイズ光も信号光と一緒に増幅されてしまう。
[0006] ここで、ノイズ光には、外乱光とは別に、測定装置内部で発生する光も含まれる。例 えば、複数の光源を用いて溶液中の単一分子レベルの生体試料カゝら発せられる微 弱な光を測定する光測定装置では、微小領域に光を絞り込み、高感度に光検出を 行なうためにピンホールやフィルタなど、測定光路内光学素子を組み込み、その位 置調整を精度良く行なう必要がある。
[0007] これらの光学素子の位置調整は一般には各々の光学素子に取り付けられた光位 置検出器により位置座標を検出して自動的に行われることが多い。高感度光検出器 で試料力 の微弱光を検出する場合、この光位置検出器の内部に組み込まれた光 源力 発せられる光も測定用の光検出器によって検出されてしまい、これがノイズとし て測定データに影響を与えることがある。
[0008] したがって、微弱な光を信号光として扱うような測定装置では、従来よりももっと厳密 なノイズ光を低減する対策が必要となる。
発明の開示
[0009] 本発明は、外乱光とともに、装置内部で発生するノイズ光を有効に低減して SZN 比の高!、測定データを得ることのできる光測定装置を提供することを目的とする。
[0010] 本発明における光測定装置は、試料に光照射する光源と、前記照射光を前記試料 に照射した結果として発生する発生光を光検出器に導く導光光学系とを有する光測 定装置であって、前記導光光学系は、前記発生光を前記光検出器に導くための複 数の光学素子と、少なくとも一つの前記光学素子の配置を調整するための位置決め 手段と、少なくとも一つの前記光学素子の位置を光学的方法で検出する位置検出手 段とを備え、少なくとも一つの前記光学素子の位置を調整するときは前記位置検出 手段の発光を開始し、前記試料を測定するときは前記位置検出手段の発光を停止 する。
[0011] 従って、装置内部で発生するノイズ光の影響を有効に低減して SZN比の高い測 定データを得ることができる。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1]第 1の実施の形態に係る光測定装置の概略の構成を示す図。
[図 2]遮光ボックスを示す図。
[図 3]バリア'フィルタ切り替え機構の構成を示す図。
圆 4A]光位置検出器を示す図。
圆 4B]光位置検出器を示す図。
[図 5]コンピュータにより自動的に測定を行う場合の手順を示すフロー図。
[図 6]コンピュータの自動操作手順を示すフロー図。
[図 7]光位置検出器の電源の ON— OFFのロジックを示す図。 [図 8]変形例に係るコンピュータの自動操作手順を示すフロー図。
[図 9]測定結果を示す図。
発明を実施するための最良の形態
[0013] [第 1の実施の形態]
図 1は、第 1の実施の形態に係る光測定装置の概略の構成を示す図である。本実 施の形態による光測定装置の本体部分の基本的な装置構成は共焦点光学顕微鏡 をベースとしている。以下、図 1を参照しつつ、光測定装置の構成と動作について説 明する。
[0014] 本光測定装置には 2種類の光源が設けられている。光源 1には発振出力 2mW、波 長 633nmのヘリウムネオン ·レーザを用い、光源 2には発振出力 10mW、波長 488η mのァノレゴン ·レーザを用いる。
[0015] 光源 1、 2からそれぞれシャツタ 3、 4を介して照射された光は、ミラーによって進行方 向が変えられた後、ダイクロイツク 'ミラー 5で合成されて 1つの光路を進行する。 1つ にされた光ビームは、コリメートレンズでビーム直径を拡大した平行光ビームとなり、ダ ィクロイツク.ミラー 6で反射され、対物レンズ 7に到達する。
[0016] 対物レンズ 7の上方には、マイクロプレート 8が試料ステージ 9に載置されて固定さ れている。そして、マイクロプレート 8の所定のゥエル内の領域に、対物レンズ 7で集 光した領域即ち、共焦点領域が形成されるように、マイクロプレート 8の水平位置、垂 直位置を試料ステージ XY軸駆動機構 10、及び対物レンズ Z軸調整機構 11により調 整する。
[0017] なお、マイクロプレート 8は一般的に用いられる榭脂、及びガラス製で 96個のゥエル を備えたものを用いる。ここでゥエルは試料を収容する円形あるいは四角形の溝を ヽ う。各ゥエルの底面はガラスなどの可視光を透過する素材で作成された窓となって 、 る（図示しない)。
[0018] また、対物レンズ 7としては、例えば X 40で NA=0. 9の水浸対物レンズを用いて いる。そのため、マイクロプレート 8の底面と対物レンズ 7との先端部の間には、水が 満たされている。
[0019] 対物レンズ 7で集光されたレーザ光は試料内に浮遊する蛍光分子を励起するので 、蛍光分子力も蛍光が発せられる。蛍光物質としてローダミン ·グリーン (Rhodamine Green :RhG)を用いる。ローダミン'グリーンは励起光の波長が 490nm付近で最も 効果的に励起され、波長 530nm付近で最も効率良く発光する。従ってアルゴン'レ 一ザでローダミン ·グリーンを励起する。またサイファイヴ (Cy5)を用い、ヘリウムネオ ン 'レーザで励起する。サイファイヴ (Cy5)は励起光の波長が 640nm付近で最も効 果的に励起され、波長 670nm付近で最も発光強度が大き 、と 、う特性を持って 、る
[0020] この蛍光は再び対物レンズ 7、続いてダイクロイツク 'ミラー 6に入射する。ここで、ダ ィクロイツク.ミラー 6はガラス製の平板の一方に多層膜コーティングを施して、透過、 反射のスペクトル特性が最適になるように製作されている。そこで、蛍光は、ダイク口 イツク 'ミラー 6を通過して、集光レンズ 12に到達し、集束光となってミラー 13で反射さ れ、遮光ボックス 20内に入射する。
[0021] 遮光ボックス 20は、図 2に示すように中空の箱状で、ステンレス、アルミ-ュムなどの 金属からなり、側壁面に光導入孔と信号線取出し孔とが設けられており、装置の上か ら被せるように設置されている。この遮光ボックス内には、ピンホール 21、コリメ一トレ ンズ 24、光検出器 26などが収められている。
[0022] 遮光ボックス 20内で、集光レンズ 12のフォーカス位置には、ピンホール 21が配置 されている。このピンホール 21には光位置検出器 (不図示）とピンホール駆動装置 2 3が取り付けられており、ピンホール 21はピンホール駆動装置 23により、 X— Y— Z軸 方向に位置調整できるようになって 、る。光位置検出器の検出値に基づ 、て原点位 置が求められる。この原点位置からの所定の距離だけピンホール駆動装置 23を動作 させることにより、集光レンズ 12の焦点面とピンホール 21の開口面とをほぼ一致させ ることができる。これはピンホール位置の粗調整である。このピンホール 21により、ゥ エル内に形成された光の共焦点領域外力も生じるバックグラウンド光が除去される。 更に、遮光ボックス 20を設けることによって装置外部力もの外乱光を除去することが できる。
[0023] ピンホール 21を通過した信号光はコリメートレンズ 24により平行光とされる。そして 信号光はレンズ 25に達し、レンズ 25で光検出器 26の受光面に集光される。光検出 器 26には光位置検出器 (不図示)と光検出器駆動装置 27が取り付けられており、光 検出器の受光面は光検出器駆動装置 27により、 X— Y— Z軸方向に沿って位置調 整できるようになつている。光位置検出器の検出信号に基づいて光検出器駆動装置 27を動作させることにより、光検出器 26の位置をほぼ最適な位置に設定することが できる。以上を光検出の粗調整とする。
[0024] 一方、コリメートレンズ 24とレンズ 25との間には、ノリア.フィルタ切り替え機構 29が 設けられている。バリア'フィルタ切り替え機構 29は、入射する信号光から所望の波 長の幅の光を透過させるためのバリア ·フィルタを複数個保持して!/、る。バリアフィル タ切り換え機構 29は回転によりバリア'フィルタを切り替えて光路中に設定する。
[0025] 図 3は、ノリア'フィルタ切り替え機構 29の構成を示す図である。
[0026] ノリア'フィルタ切り替え機構 29は、架台 30上に配設された光位置検出器 31、バリ ァ 'フィルタ回転切り替え器 32及びバリア'フィルタ回転切り替え器駆動装置 33で構 成されている。
[0027] ノリア'フィルタ回転切り替え器 32は、図 3に示すように円板形状であり、その中心 軸がノリア'フィルタ回転切り替え器駆動装置 33と接続している。従って、バリア'フィ ルタ回転切り替え器駆動装置 33を駆動することにより、その円板の中心を回転軸とし て回転できる。
[0028] ノリア'フィルタ回転切り替え器 32の回転中心力ら一定距離離れた位置にノリアフ ィルタ 34の中心が一致している。即ちバリアフィルタ回転切り替え器 32の同心円の 円周上にその中心を一致させて、複数のバリア ·フィルタ 34が配列されている。従つ て、ノリア'フィルタ回転切り替え器駆動装置 33を駆動することにより、必要なバリア' フィルタ 34をコリメートレンズ 24により平行とされた光路中に配置することができる。従 つて、バリア'フィルタ 34は確実に光路中に配置される。
[0029] バリア.フィルタ 34は蛍光の発光スペクトル強度分布に合わせて、透過光のスぺタト ルが調整されるようになっており、信号光となる蛍光の発光スペクトルの波長域の光 のみが通過する。一方、蛍光の波長とバックグラウンド光の波長とは異なっている。従 つて、マイクロプレート 8の所定のゥエル内で発生する散乱光をカットすることができる 。また、入射光の一部がゥエルの壁など力も反射して、入射光路に戻ってくるときに 発生するノイズ光をカットすることができる。
[0030] また、バリア'フィルタ回転切り替え器 32の所定の位置には、位置検出用ターゲット 35が取り付けられている。位置検出用ターゲット 35は、ノ リア'フィルタ回転切り替え 器 32の回転に伴って回転する。
[0031] 図 4A、図 4Bは、光位置検出器 31を示す図である。
[0032] 図 4Aは、光位置検出器 31の斜視図である。光位置検出器 31は、架台 30と接続 する取付部材 36上に U字型の検出部 37が設けられた構造である。この検出部 37の 、一方の側面には検出用の光源が設けられ、他方の側面には光センサが設けられて いる。
[0033] 図 4Bは、検出部 37を拡大して横力も見た図である。位置検出用の光源と光センサ が向き合って保持され、これらの間を位置検出用ターゲット 35が通過する。従って、 位置検出用ターゲット 35が光位置検出器 31の光源と光センサとの間に位置したとき は、光源からの光が遮られるため、光センサの出力がなくなる。例えば、この光センサ の出力は位置検出用ターゲット 35がないときには 5Vであり、位置検出用ターゲット 3 5が光センサの前にあるときには OVとなる。この光センサの出力変化を観測すること により、ノリア'フィルタ回転切り替え器 32の回転位置の原点を検知することができる 。即ち、光センサの出力が OVになった位置を原点位置として、ノリア'フィルタ回転 切り替え器駆動装置 33の回転駆動パルスをカウントすることにより、ノリア'フィルタ 回転切り替え器 32の回転位置を知ることができる。
[0034] なお、光位置検出器 31の光源は赤外の LED、または半導体レーザを用いることが できる。また、光センサは半導体光センサを用いることができる。
[0035] 図 1において、光検出器 26は例えばァバランシ 'フォトダイオード (APD)、あるい は光電子増倍管などの微弱光検出器を用いる。ここで、光検出器 26で受光する信 号光は微弱光であり、フオトン'パルスとなっている。光検出器 26によって、信号光は 電気信号である光電流パルスに変換され、信号処理装置 40に入り、増幅される。つ づいて光電流パルスは波形整形されて、 on— off電圧パルスに変換されて、コンビュ ータ 41に導かれる。
[0036] この電圧パルスはコンピュータ 41のメモリ（図示しない）に記憶され、続いて相関解 析などの演算が行なわれる。これによつて蛍光の強度はもとより、蛍光の寿命や、得 られた蛍光の強度ゆらぎの自己相関関数、あるいは相互相関関数などの解析結果 力 Sコンピュータ 41の表示装置 42に提示される。
[0037] なお、光位置検出器 31は、上述のように光検出方式を採用している。この理由は、 接触式位置検出器や静電容量を利用した検出器などと比較すると、例えば半導体 光位置検出器は安価で、また小型であり取り扱いにも優れて 、ると 、う特徴を備えて いるからである。し力しながら、光学素子の位置調整に光位置検出器を用いた場合、 光位置検出器で用いられている光源力 発せられる光が、測定に用いられる光検出 器にとってはノイズ光となるので、正しい光信号の検出を行なうためには、これを低減 、または遮断する対策が必要である。
[0038] 次に、このノイズ光対策内容を含め、光測定装置の測定動作について図 5乃至図 8 を参照しつつ説明する。
[0039] 図 5は、コンピュータ 41により自動的に測定を行う場合の手順を示すフロー図であ る。
[0040] ステップ S01にお 、て、ユーザが光測定装置のメイン電源を投入したときは、コンビ ユータ 41は、初期化動作を開始する。即ち、各種の光学素子や試料ステージなどの 可動部品の位置を初期位置に合わせる。初期位置とは、原点から所定のステップ力 ゥントだけ光学素子を駆動した位置である。
[0041] 例えば、ノリア'フィルタ回転切り替え器 32を初期位置に合わせる場合には、次の ように動作させる。まず、位置検出用ターゲット 35を回転し、光位置検出器 31がこの 位置検出用ターゲット 35を検出した位置を原点とする。そして、この原点から予め定 めた所定角度だけノリア'フィルタ回転切り替え器 32を回転し、その位置を初期位置 とする。ピンホール 10の初期位置、光検出器 26の初期位置についても同様に、光位 置検出器 (不図示)の出力信号をモニターしながら、その出力値と所定の回転駆動 パルス数に基づ 、て初期位置に設定する。
[0042] ステップ S02にお 、て、計測時間、測定に使用する光源の指定、測定対象とする 複数ゥエルの指定などの測定条件を獲得する。これらの測定条件はユーザが直接入 力する。 [0043] ステップ S03において、測定対象のゥエルが対物レンズ 7の直上に位置するように 、試料ステージ XY軸駆動機構 10を駆動して試料ステージ 9の水平位置を位置決め する。
[0044] ステップ S04において、光学素子の位置を調整する必要があるかどうかを調べる。
例えば、最初に測定する場合、または所定数以上のゥエルを測定した場合、または マイクロプレート 8の特定の領域にあるゥエルを測定する場合など、予め定めた再調 整の条件に合致するかどうかを調べる。
[0045] ステップ S04において Yesの場合は、ステップ S05〜S06において、光位置検出器 の電源をオンして、光学素子位置の位置決めを行う。まず光源 1、 2に対応するシャツ タ 3、 4を開放して、対物レンズ 7を通してゥエル内の試料溶液に照射する。試料から 発せられる蛍光信号を測定用の光検出器 26で検出しながら、信号光が通過する光 路内の光学素子を光軸方向、さらに X— Y軸方向（水平方向）にそれぞれ位置調整 し、光学素子の設置位置を最適化する。この際にも、各光学素子の位置調整のため に光位置検出器を用いる。
[0046] 例えば、ピンホール 20、光検出器 26の位置については、光位置検出器 (不図示） の出力値で求められた原点位置と、所定の回転駆動パルス数に従い、ピンホール駆 動装置 23、および光検出器駆動装置 27を駆動して粗調整を行う。その次に、その後 、シャツタを開いて、上述のように光検出器 26の出力が最も大きくなるようにピンホー ル駆動装置 23、および光検出器駆動装置 27の位置の微調整を行うことで最適な位 置に位置決めする。
[0047] そして、光学素子全ての位置調整が終了すると光位置検出器を使用する必要はな くなる。ここで光位置検出器の電源をオン状態にしたままにすると、光位置検出器に 用いられて ヽる光源カゝら発せられる光がノイズとして光検出器 26で検出されてしまう 。そこで、ステップ S07において、複数の光学素子全ての位置調整が終了し、測定装 置の光軸調整が終了した後、コンピュータ 41は、光位置検出器の電源を切り、ノイズ 光の発生を停止させる。遮光ボックス 20で外乱光をカットし、遮光ボックス内で生じる 光ノイズも光位置検出器の電源を切ることによってカットする。これにより、測定信号 以外のノイズ光を除去する。 [0048] ステップ S08において、計測が終了すると、ステップ S09において、ユーザが指定 した複数のゥエルについて全ての計測が終了した力どうかを調べる。そして、まだ計 測するゥエルが残って 、る場合は、ステップ S03から S09の処理を繰り返す。
[0049] 即ち、試料ステージ 9を駆動して、マイクロプレート 8の水平位置を移動し、次に測 定を行なうマイクロプレート 8のゥエル内の試料に位置合わせを行なう。このとき、ステ ップ S04において、光学素子の位置を調整する必要がある場合は、光位置検出器の 電源を ONし、位置調整を再度実施する。そして、調整終了後、光位置検出器の電 源を OFFする。
[0050] ステップ S09において、ユーザが指定した複数のゥエルについて全ての計測が終 了した場合は、ステップ S11において、計測によって得られたデータを表示装置 42 に表示する。
[0051] 図 6は、図 5のステップ S05〜S08の動作に対応したコンピュータ 41の自動操作手 順を示すフロー図である。
[0052] ステップ T01から T03において、コンピュータ 41は、光位置検出器の電源を ONと して、必要な光学素子の位置調整を行う。その後、光位置検出器の電源を OFFとす る。そして、ステップ T04において、計測スタートのコマンドを出力する。この計測スタ 一トコマンドを受け取った、光測定装置の各部は所定の計測開始の一連の動作を実 行する。例えば、シャツタ 3, 4を開放する。そして、計測が終了したときは、ステップ T 06において、コンピュータ 41は、計測終了のコマンドを出力する。この計測終了コマ ンドを受け取った、光測定装置の各部は所定の計測終了の一連の動作を実行する。 例えば、シャツタ 3, 4を閉止するなどである。
[0053] 第 1の実施の形態によれば、位置調整を必要とする光学素子は、装置内の外乱光 を防止する遮光ボックス 20に囲まれている。上述の光位置検出器の発光調整と遮光 ボックス 20との組み合わせによって、外乱光と光位置検出器力 の迷光の両者を力 ットすることができる。従って、測定時のノイズ光を大幅に低減することができる。
[0054] 〔第 1の実施の形態の変形例 1〕
第 1の実施の形態の変形例 1では、計測時に光位置検出器の電源を OFFし、計測 終了で光位置検出器の電源を ONするという動作は第 1の実施の形態と同じだが、 光測定装置のロジック回路を用いてその判断を行う点が異なっている。
[0055] 図 7は、光位置検出器の電源の ON— OFFのロジックを示す図である。ステップ T1 0に示すように、光学素子の位置調整を行うためのモーターに供給する光学素子位 置駆動電源が働いているとき、あるいは、ステップ T11に示すように、レーザ光源のシ ャッタが閉じているときは、計測が行われていないと判断する。そしてステップ T12に おいて、光位置検出器の電源を ONする。一方、これらの 2つの条件がともに成立し て!、な 、ときは計測中と見なし、光位置検出器の電源を OFFする。
[0056] 変形例 1では光源として用いているレーザのシャツタが開いていて、かつすベての 光学素子を切り替えるための駆動源が働 、て 、な 、とき、すなわち光学調整が終了 して測定できる状態では光位置検出器の電源を切るという制御を電気的に、即ち電 気回路上で行なう。これにより、測定時に光位置検出器力 発せられる光である赤外 線が迷光として光検出器で検出されることを防ぐことができる。
[0057] 〔第 1の実施の形態の変形例 2〕
第 1の実施の形態の変形例 2では、計測時に光位置検出器の電源を OFFし、計測 終了で光位置検出器の電源を ONするという動作を行う。これは第 1の実施の形態と 同じだが、光測定装置本体に光位置検出器の電源をオン、オフできるスィッチを設け 、光学調整時には光位置検出器の電源を ON、測定時には光位置検出器の電源を OFFと!、う動作をオペレーターが手動で行なう。
[0058] 図 8は、図 5のステップ S05から S08の動作に対応した変形例 2に係る手順を示す 図である。
[0059] ステップ T16において、オペレータは、スィッチを操作して光位置検出器の電源を ONとして、光学素子の位置調整開始をコンピュータ 41に指示する。この指示を受け 取ったコンピュータ 41は、ステップ T17において、必要な光学素子の位置調整を行 なう。そして、表示装置 42に位置調整終了のメッセージを表示する。このメッセージを 確認したオペレータは、ステップ T18において、スィッチを操作して光位置検出器の 電源を OFFとする。そして、計測開始をコンピュータに指示する。
[0060] ステップ T19において、コンピュータ 41は、一連の計測作業を開始する。即ち、計 測スタートのコマンドを出力する。光測定装置の各部は、この計測スタートコマンドを 受け取り、所定の計測開始の一連の動作を実行する。例えば、シャツタ 3, 4を開放す るなどである。そして、計測が終了したときは、コンピュータ 41は、計測終了のコマン ドを出力する。この計測終了コマンドを受け取った、光測定装置の各部は所定の計 測終了の一連の動作を実行する。
[0061] 変形例 2では、迷光を防止する方法として、電気的な自動制御のほかに、光学調整 が終わった時点で手動で光位置検出器の電源を切るなどによっても同様の効果を得 ることができる。従って、簡易な構成の装置によって、所望の効果、すなわちノイズ光 の低減を実現することができる。
[0062] 〔実機適用結果〕
以上説明した構成の光測定装置を用いて、光軸調整完了後、試料ステージ 9にマ イク口プレート 8を設置し、ゥエルに緩衝液であるリン酸バッファー液 (PBS)を収容す る。そして、このゥエルに波長 633nm,出力 300 Wのヘリウム 'ネオンレーザの光 を照射した。この時得られる光検出器 26からの出力値、すなわちカウントレートを測 定した。なお、緩衝液として用いたリン酸バッファー液には蛍光物質は入っていない
[0063] そして、光位置検出器の電源を ONにしたときの出力値と、光位置検出器の電源を OFFにしたときの出力値とを比較した。なお、測定時間は 10秒である。
[0064] 測定結果を図 9に示す。蛍光物質が入っていない試料を含む溶液に励起光を照射 しても、光検出器 26から出力される光パルス信号のカウントレートは 0. 2〜0. 5kHz であった。このとき、出力信号として得られたのは喑電流によるものと考えられる。一 方、光位置検出器の電源を ONにしたときは、光検出器 26から出力される光ノ ルス 信号は、 5〜6kHzであった。
[0065] この図 9に示す結果から、光学調整に必要な位置検出器の光源が大きな内部ノィ ズ光となっていることがわかる。そして、本発明に係る光位置検出器の ON— OFF操 作によってこのノイズ光の影響が効果的に低減できることがわかる。
[0066] なお、本光測定装置で取り扱う光は、レーザに限定されるものではない。光源として タングステンランプを用いることもでき、また検出する光は、蛍光のみでなぐ燐光、発 光、散乱光、反射光を対象とするものであっても良い。 [0067] 〔本実施の形態の効果〕
光位置検出器による光学素子の位置や角度を検出して位置調整を行うため、複数 の光源を用いた複雑な光学系の配置が可能である。その際生じるノイズ光をカットす ることができるので、精度の高い測定ができる。
[0068] 光位置検出器の電源制御と遮光ボックスを組み合わせることによって、外乱光と装 置内のノイズ光のどちらもカットできるので、 SZN比の高い測定データを得ることが できる。
[0069] 光学素子の調整時には光位置検出器を用い、試料を測定する時には電源を切ると いう制御を行うことで、正しい光軸調整と高感度測定のどちらも実施することができる
[0070] なお、この発明は、上記実施形態そのままに限定されるものではなぐ実施段階で はその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体ィ匕できる。また、上記実施 形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合せにより種々の発明を形成 できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除して もよい。更に、異なる実施形態に亘る構成要素を適宜組み合せてもよい。
産業上の利用可能性
[0071] 本発明は装置内部で発生するノイズ光の影響を有効に低減して SZN比の高い測 定データを得ることができる光測定装置を製造する産業に広く利用することができる

Claims

請求の範囲
[1] 試料に光照射する光源と、前記照射光を前記試料に照射した結果として発生する 発生光を光検出器に導く導光光学系とを有する光測定装置において、
前記導光光学系は、
前記発生光を前記光検出器に導くための複数の光学素子と、
少なくとも 1つの前記光学素子の配置を調整するための位置決め手段と、 少なくとも 1つの前記光学素子の位置を光学的方法で検出する位置検出手段とを 備え、
少なくとも 1つの前記光学素子の位置を調整するときは前記位置検出手段の発光 を開始し、前記試料を測定するときは前記位置検出手段の発光を停止することを特 徴とする光測定装置。
[2] 複数の前記光学素子、前記位置決め手段及び前記位置検出手段は外乱光を遮 断する遮光装置内に配置してなることを特徴とする請求項 1に記載の光測定装置。
[3] 複数の前記光学素子は、少なくともピンホールと、入射光の波長を選択的に透過、 または反射する機能を備えたフィルタとを含むことを特徴とする請求項 1に記載の光 測定装置。
[4] 複数の前記光学素子、前記位置決め手段及び前記位置検出手段は外乱光を遮 断する遮光装置内に配置してなることを特徴とする請求項 2に記載の光測定装置。
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