WO2006137311A1 - 糖鎖あるいは複合糖質の解析装置 - Google Patents

糖鎖あるいは複合糖質の解析装置 Download PDF

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lectin
binding protein
sugar
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Jun Hirabayashi
Atsushi Kuno
Noboru Uchiyama
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    • G01N33/548—Carbohydrates, e.g. dextran

Definitions

  • the present invention relates to a sugar chain or complex carbohydrate using evanescent light, or a sample analysis apparatus containing these, and a substrate used by being mounted on the apparatus.
  • Protein power which plays a major role in the vital functions of living organisms. Post-translational modifications including glycosylation play a very important role in orderly functioning in the cellular society. Most proteins in the body are modified by sugar chains, and the sugar chains added to the proteins are virus infections, protozoan parasites, infections, toxin binding, hormone binding, fertilization, developmental differentiation, protein In recent years, it has become clear that it plays an important role in various fields of life phenomena such as stability, cancer cell metastasis, and apoptosis.
  • a microarray is a generic term for a variety of immobilized samples such as DNA'proteins that are immobilized in a spot shape on a solid support (glass 'membrane' silicon chip) at high density. It is possible to detect the presence or absence of molecules that specifically bind to spots (hereinafter referred to as probes). In general, fluorescently labeled probe molecules are used. After the probe solution reacts with the array surface, the probe molecules bound to each sample spot are quantitatively observed by a fluorescence detection scanner. Analysis can be performed.
  • Kd dissociation constant
  • the binding between sugar chains and proteins that interact with sugar chains consists of relatively fast dissociation-association reactions, resulting in general protein-protein interactions and complementary nucleosides. Compared to the interaction between tide fragments, the equilibrium tends to be inclined to the dissociation side by washing operation or the like. For example, when a lectin is purified on a glycoprotein-immobilized column or the like, if the binding of the lectin is weak, a phenomenon in which the lectin flows out of the column during the washing operation is often observed.
  • the probe solution is washed and removed after the probe solution is brought into contact with an immobilized sample to reach a binding reaction, and then a jet gas or a centrifuge is used. After removing the water adhering to the glass slide, perform imaging using a microarray scanner. This is due to the fact that a general microarray reader cannot observe the fluorescence on the slide glass with moisture attached. Even if the probe solution is removed in the previous stage of scanning, the dissociation rate constant is sufficiently small for interactions that show strong binding, such as complementary nucleotide fragments and antigen-antibody reactions. The reaction is not likely to proceed easily.
  • DNA microarrays are currently in widespread use. Protein microarrays are also used in basic research fields such as elucidating the functions of proteins, which are transcription products of DNA in vivo, and in applications such as judgments based on quantitative and qualitative changes in proteins. However, it is expected to be used in the future, and active research has been conducted around the world. However, the development and spread of protein microarrays is currently far behind that of DNA microarrays. One reason for this is that the process of immobilizing protein samples with different properties while maintaining their activity at a certain rate is extremely difficult in the past. It has been pointed out by more researchers.
  • Non-patent Document 1 a method of physically adsorbing proteins on a membrane typified by a PVDF membrane
  • there was a limit to increasing the density of the array In order to achieve high density, research has been conducted in the direction of immobilizing proteins on solid surfaces such as metal and glass, but in general, proteins are brought into contact with solid surfaces such as metal and glass. It has the property of being easily denatured. For this reason, an immobilization method using some kind of linker for cross-linking the solid surface and the protein has been extensively researched and developed.
  • Non- Patent Documents 2 and 3 As an example of a method for reducing the problem of protein denaturation, a method of spotting proteins on a slide glass by bonding a polyacrylamide pad of 10 to 100 zm in thickness is mentioned (non- Patent Documents 2 and 3).
  • the protein is immobilized in a three-dimensional space, so it can be expected to increase more than 100 times in quantity compared to the method of immobilizing on a two-dimensional surface.
  • these methods are expensive and require the production of special glass slides, and have not yet been popular.
  • the thickness of the immobilized protein layer may not be preferable depending on the detection method.
  • Such a method is considered to be an effective method in terms of immobilization while maintaining the activity of the protein, or making the immobilization rate uniform. It takes a lot of cost and enormous labor to tag all proteins to be immobilized on the microarray at the gene level and to express and purify them in E. coli or cell-free systems. At this point, it is difficult for a general researcher to use it freely and in a way that meets individual requirements.
  • a method of using a functional group of a protein for immobilization on a solid phase carrier can be used as a microarray by immobilizing a protein extracted from nature or a commercially available protein sample as it is.
  • the immobilization method to the solid phase carrier via the amino group in the protein include a method of immobilizing the protein via an active ester group bonded to the solid phase surface, and an epoxy group disposed on the solid phase surface.
  • immobilization via protein amino groups is a simple method Because it can be easily immobilized on commercially available proteins, biological extracts / components, recombinant proteins without specific tags, etc.
  • Patent Document 1 Patent Application 2001- 520104
  • Patent Document 2 Patent Publication No. 8-201383
  • Patent Document 3 Patent Publication 2002—544485
  • Non-Patent Document 1 L. J. Holt, K. Bussow, G. Walter, I. M. Tomlinson, Nucleic Acids Res., 15, E72, 2000
  • Non-Patent Document 2 D. Guschin, G. Yershov, A. Zaslavsky, A. Gemmell'V. Shick, D. Prou dnikov, P. Arenkov, A. Mirzabekov, Anal. Biochem., 250, 203-211, 1997
  • Non-Patent Document 3 A. Lueking, M. Horn, H. Eickhoff, K. Bussow, H. Lehrach, G. Walter, Anal. Biochem., 270, 103-111, 1999
  • Non-Patent Document 4 P. Mitchell, Nat. Biotechnol., 20, 225-229, 2002
  • Non-Patent Document 5 H. Zhu, M. Bilgin, R. Bangham, D. Hall, A. Casamayor, P. Bertone, N. Lan, R. Jansen, S. Bidlingmaier, T. Houfek, T. Mitchell, P Miller, RA Dean, M. Gerstein, M. Snyder, Science, 293, 2101-2105, 2001
  • Patent 6 H. Zhu, JF Klemic, S. Chang, P. Bertone, A. Casamayor, KGKle mic, D. Smith, M. Gerstein, MA Reed, M. Snyder, Nat. Genetics. 26,283- 289, 20 00
  • An object of the present invention is to provide a device for analyzing sugar chains or complex carbohydrates, or a sample containing them with high speed, high sensitivity, and high accuracy, and a microarray substrate to be mounted on the device. There is.
  • a lectin is used as a sugar chain-binding protein, a substrate in which a plurality of the lectins are arranged and immobilized on the surface, and a binding state between the lectin on the substrate and a fluorescently labeled sugar chain or sugar protein.
  • a device for analyzing sugar chains or complex carbohydrates using evanescent waves as excitation light to measure glycan or complex carbohydrates was actually analyzed.
  • a washing step of a fluorescently labeled sugar chain or the like that did not bind to the lectin is required.
  • a washing step is not performed. It is unnecessary, can be analyzed easily and at high speed, and the information on the intermediate part, that is, only the presence or absence of binding (0 or 1) as in the conventional lectin plot, that is, the binding intensity information can be obtained from the fluorescence intensity value. (For example, from 0 to 6 steps), high sensitivity and high accuracy were confirmed, and the present invention was completed.
  • the present invention is as shown in the following (1) to (24).
  • it is an apparatus for analyzing a sample containing these, and a light guide material force having a plurality of sugar chain-binding proteins arranged and fixed, and light is introduced into the side end face of the substrate, and the substrate surface
  • a means for generating an evanescent wave to excite a fluorescent label and a fluorescence intensity measuring means for measuring the intensity of the fluorescence generated by the means for each position where the sugar chain-binding protein is arranged.
  • sugar chain binding protein is a sugar chain recognition antibody belonging to the lectin or IgM class.
  • It has a storage means for storing the fluorescence intensity measured by the fluorescence intensity measurement means for each position of the sugar chain binding protein corresponding to the test sugar chain or the test complex carbohydrate used.
  • the device according to any one of (1) to (4) above.
  • the substrate is a substrate in which a plurality of the same sugar chain-binding proteins are arranged and immobilized for each type.
  • the fluorescent intensity information for a known sugar chain or complex carbohydrate is stored in the storage means, according to any one of (5), (6), (9) and (10) above Equipment.
  • the sugar chain-binding protein is immobilized on a substrate coated with a compound containing an epoxy group as an active group, according to any one of (15) to (: 18) above substrate.
  • the analysis device of the present invention eliminates the need to wash and remove the probe solution, which is a major problem in accurately analyzing the interaction information between the sugar chain-binding protein such as lectin and the sugar chain in an equilibrium state. As a result, it was possible to detect weak interactions that would be washed away by the conventional method.
  • FIG. 2 is a diagram showing an outline of a method for producing a substrate used for analysis of a sugar chain or complex carbohydrate of the present invention.
  • FIG. 3 A diagram showing an example of an apparatus for analyzing a sugar chain or complex carbohydrate of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing an example of an information processing system of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of a system in which a database is stored outside a computer.
  • FIG. 6 is a diagram showing an example of a system in which a database is stored in a computer.
  • FIG. 7 is a diagram showing an example of a computer configuration diagram in the system of the present invention.
  • FIG. 8 is a flowchart showing a program patterning process used in the analysis apparatus of the present invention.
  • FIG. 9 is a diagram showing patterning information indicating the result processed by the program of FIG.
  • FIG. 10 A diagram showing an example of the appearance of the sugar chain or complex carbohydrate analyzer of the present invention.
  • Sono 11 is a view showing a substrate on which eight reaction tanks used in this example are formed.
  • FIG. 12 is a conceptual diagram of a lectin array performance experiment in which a Cy3-ASF solution is added to an array on which two types of lectins are immobilized.
  • FIG. 15 is a graph showing the effect of inhibitory sugars on lectin-sugar chain interactions.
  • FIG. 19 is a photograph showing the results of analysis using a lectin array when a crude sample derived from a living body is probed.
  • FIG. 20 A graph showing changes in net signal intensity over time when a 100 ng / mL Cy3_ASF probe was reacted with two lectins (RCA120, ECA) using a real-time scanning function.
  • FIG. 21 shows changes in the sugar chain profile of ushitransferrin upon digestion with carbohydrate hydrolase.
  • Solid line A lectin in which an increase in signal was observed by enzymatic digestion.
  • Dotted line A lectin in which a decrease in signal was observed by enzyme digestion.
  • FIG. 22 is a diagram and a photograph showing the results of a glycopeptide array detection experiment in which the HPLC fraction of a mouse liver-derived glycopeptide sample was immobilized.
  • Fuc is a fucose recognition lectin group
  • Sia is a sialic acid recognition lectin group
  • Lac is a latatose recognition lectin group
  • Gal is a galactose recognition lectin group
  • GalNAc is an N-acetylethylgalatatosamine recognition lectin group
  • Man is a mannose Recognition lectin group
  • Chitin means chitin recognition lectin group.
  • FIG. 23 is a schematic diagram showing a state of binding between sugar chain-related arrays and sugar chains.
  • A Schematic diagram showing the binding state of a probe to an array when a lectin array and a sugar chain are used as a probe.
  • B Schematic diagram showing the binding state of the probe to the array when a lectin array and a glycoprotein are used as the probe.
  • C A schematic diagram showing the binding state of a probe to an array when a lectin is used as a glycopeptide array and a probe. It can be used for analogy of the sugar chain structure on the fractionated peptide.
  • D A schematic diagram showing the binding state of a probe to an array when a lectin is used as a probe and a glycoprotein array.
  • E A schematic view showing the binding state of the probe to the array when an antibody array and a lectin are used as a probe.
  • the present invention relates to an apparatus for analyzing the sugar chain or complex carbohydrate by measuring the interaction between the sugar chain or complex carbohydrate and the sugar chain binding protein.
  • the apparatus of the present invention is an apparatus for analyzing a sugar chain or a complex carbohydrate in a sample or a sample containing these, a substrate made of a light-guiding material on which a plurality of types of sugar chain-binding proteins are arranged and fixed, and the substrate On the side end face of Means for introducing light and generating an evanescent wave on the substrate surface to excite the fluorescent label; and fluorescence intensity measuring means for measuring the intensity of the fluorescence generated by the means for each position where the sugar-binding protein is arranged And have.
  • the sugar chain or complex carbohydrate to be analyzed by the apparatus of the present invention is not particularly limited.
  • the sugar chain include glycoprotein sugar chains (N-linked sugar chains and O-linked sugar chains).
  • N-linked glycans include N-linked glycans consisting of high mannose, hybrid, and complex types.
  • Glycolipid-type sugar chains include Gandario series ⁇ Globo series 'Latato' Neolacto series sugar chains, etc.
  • Glycosaminodarlican sugar chains include hyaluronic acid, keratan sulfate, heparin, heparan sulfate, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, etc.
  • Polysaccharide-derived oligosaccharide chains include chitin, cellulose, and curdra And oligosaccharide chains derived from starch, laminarin, dextran, starch, glycogen, arabinogalatatan, alginic acid, fructan, fucoidan, xylan and the like.
  • sugar chains include M3'M5A'Hybrid (monoagalacto, bisect)-NA1 ⁇ NA1 (a 1-6F uc) «NA2 (monoagalacto) « NA2 (monoagalacto) « NA2 (monoagalacto, bisect) ⁇ ⁇ 2 ⁇ ⁇ 2 (al_6Fuc ) 'A2'N A2 (bisect) -NA3-NA3 (al-6Fuc) -NA4-NA4 (a 1-6Fuc)' NA5 (pentaagalacto, bise ct) Lactose GA2 GA1 GM3- NeuAc NeuGc ⁇ GM 1 ⁇ GM2 ⁇ GD la ⁇ GD lb ⁇ GD3 ⁇ Gb3 ⁇ Gb4 ⁇ Forssman ⁇ LNnT ⁇ LNT ⁇ Galili pentasaccharide ⁇ B-hexasaccharide ⁇ LNF
  • the complex carbohydrate is a general term for in vivo polymers having a sugar chain.
  • examples of the complex carbohydrate of the present invention include glycoproteins (including glycopeptides), proteodalycan, and glycolipids.
  • lectin is a preferred glycan binding protein immobilized on a substrate.
  • Chins include lectins belonging to various molecular families obtained from animals, plants, fungi, bacteria, viruses, etc., that is, ricin B chain-related “R-type lectins” found in all living organisms including bacteria, true Calcium requirement that contains many typical lectins such as “Calnexin 'calreticulin”, which exists in all nuclei and is involved in glycoprotein folding, and is widely present in multicellular animals.
  • C-type lectin "galectin” which is widely distributed in the animal kingdom and shows specificity to galactose, "legume lectin” which forms a large family in the plant legume family, and has structural similarity with this "L-type lectin” related to lysosomal enzymes, mannose 6-phosphate-binding "P-type lectin” related to intracellular transport of lysosomal enzymes, glycosaminodarlicans, etc.
  • lectins include: ACA (sennin clectin) -BPL (purple lectin) 'ConA (spotted bean lectin)' DBA (Horsegram lectin) 'DSA (Yoshichi Isenagaagalectin)' ECA (Di Sesame lectin) '' EEL (Spindle Tree lectin) '' G NA (Yukinohana lectin) '' GSL I (Glyphonia bean lectin) '' GSL II (Glyphonia bean lectin) '' HHL (Amaryllis lectin) '' Jakarin (Jack fruit lectin) 'LBA (Lima bean lectin)' LCA (Lentil bean lectin) 'LEL (Tomato lectin)' LTL (Lotus bean lectin) ⁇ ⁇ (American harpoon lectin) ⁇ ⁇ (Trap daff
  • the lectin immobilized on the substrate includes those obtained by modifying physical properties, binding specificity, affinity, etc. of the lectin by a method such as site-directed mutagenesis or chemical modification. Also encompasses such lectin variants.
  • the present invention It is a device that makes it possible to analyze interactions between sugar chains and proteins that are relatively weak compared to antigen-antibody reactions, etc., and sugar-binding proteins with weak interactions are not limited to lectins. . That is, generally weak interaction, sugar chain recognition antibodies (for example, sugar chain recognition antibodies classified into the Ig M class) also fall under this category.
  • the substrate in the present invention any glass, quartz glass, or synthetic quartz may be used as long as it has light guiding properties and can generate an evanescent wave on its surface by the light irradiation means of the analysis apparatus of the present invention. Although glass etc. can be illustrated, it is not limited to these.
  • the substrate on which the lectin is immobilized in the present invention is preferably a compound having an epoxy group as an active group, but is not limited to this.
  • This is a substrate in which a sugar chain binding protein such as lectin is immobilized on a substrate coated with a group, amino group, thiol group, isothiocyanate group and the like.
  • the compound having an epoxy group as an active group is preferably a force including 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GTMS).
  • GTMS 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane
  • a silane coupling compound having a plurality of epoxy groups at the tip preferably a compound containing polyethylene glycol, protein, biotin, avidin, etc. as a spacer.
  • the substrate used for the analysis of the sugar chain or complex carbohydrate of the present invention is a substrate in which a plurality of types of sugar chain-binding proteins such as lectins are immobilized on the surface, and can be prepared by the following method, for example. .
  • the substrate is coated with a compound having an epoxy group as an active group.
  • a compound having an epoxy group as an active group when GTMS is used as a compound having an epoxy group as an active group, it can be carried out by the method described in the examples described later. Specifically, the glass slide is immersed in a 10% KOH I MeOH solution and left to stand for 1 hour with the whole container shaken to treat the glass surface. Wash with water (Milli-Q water) and dry in an oven at 60 ° C. Next, immerse the slide glass in a 2% GTMS acetone solution and incubate for 1 hour while shaking the entire container in the dark. The alkoxysilyl group of GTMS is hydrolyzed with water to form a silanol group.
  • This silanol group is unstable, and is partially bonded with time to become an oligomer state, and then hydrogen bonded to the glass surface. Adsorb to. After the reaction, dry the glass slide in a 110 ° C oven for 8 hours. The drying process causes a dehydration condensation reaction with silanol groups on the glass surface, resulting in a strong covalent bond.
  • Figure 1 shows a series of GTMS coating methods.
  • the lectin can be spotted on a substrate coated with a compound having an epoxy group as an active group, and immobilized by reacting using the amino group of the lectin.
  • a plurality of types of lectins are spotted on the same substrate.
  • the substrate on which the lectin is immobilized is preferably a substrate in which a plurality of reaction vessels are formed (see FIG. 2). More preferably, it is a substrate on which a plurality of reaction vessels are formed by attaching a rubber having a plurality of holes.
  • a rubber having a plurality of holes As an example, as described in the examples, an 8-hole rubber designed and developed by the present inventors is pasted at a predetermined position on a glass slide in which a protein that interacts with a sugar chain is immobilized. Make 8 reactors. Eight rectangular holes are regularly formed in this 8-hole rubber, and it is possible to accurately fill the fluorescently labeled sugar probe solution around the spot by bringing it into close contact with the slide glass on a dedicated azimuth. .
  • reaction vessel Filling this reaction vessel with a fluorescently labeled probe solution enables smooth contact with proteins that interact with sugar chains. It is preferable to increase the number of reaction vessels. More preferably, 12 and 16 reaction vessels are preferably arranged at the same intervals as those of the commercially available 96 and 384 wall plates. Also form this reaction tank
  • the material is not limited to silicon rubber. For example, it is possible to form a reaction field by applying a water-repellent coating to a non-spot region on the glass surface or use a 96-well plate standard container.
  • the substrate of the present invention it is desirable to fix and fix a plurality of lectins of the same type. This makes it possible to calculate the average fluorescence intensity based on the interaction of the test sugar chain or glycoconjugate with the same species of lectin, resulting from poor spot size 'shape or non-uniformity of the substrate. Measurement errors due to differences in the measured spot signal intensity due to differences in the amount of immobilized lectin, the number of labeled probe molecules bound to the spot, non-uniformity of excitation light, electrical noise of the detection element, etc. Can be reduced.
  • the substrate of the present invention when analyzing glycoproteins, a plurality of types of sugar chain binding proteins such as lectins can be arranged and immobilized, and antibodies against the protein portion of the glycoprotein can be arranged and immobilized (hybrid array). Production). According to this substrate, the analysis of the sugar chain part of the glycoprotein and the analysis of the protein part can be performed simultaneously. According to this, it is possible to easily identify those having different proteins but the same sugar chain, or those having the same sugar chain but different sugar chains.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of the analysis apparatus of the present invention.
  • This device introduces light into a substrate (1) made of a light-guiding material on which a plurality of types of sugar chain-binding proteins such as lectins are arranged and fixed, and side edges of the substrate, and an evanescent wave is applied to the substrate surface.
  • the substrate (1) is detachably mounted on the substrate mounting means (4), and the substrate mounting means guides the fluorescence generated on the substrate to the fluorescence intensity measuring means without shielding the fluorescence.
  • it is made of a frame.
  • the fluorescent label excitation means (2) and (2 ′) are provided facing the end face of the substrate.
  • the fluorescence label excitation means (2) and (2 ′) are provided so that the light introduction angle with respect to the side surface of the substrate can be adjusted. Further, when the number of sugar-binding proteins arranged and fixed on the substrate is small, for example, in the case of one row, the fluorescence label excitation means may be provided only on one side of the substrate end surface orthogonal to the row.
  • the type of light introduced into the substrate end face by the fluorescent label excitation means (2), (2 ') is, for example, a pulse obtained from a laser, LD, or LED, or continuous monochromatic light, or a metal halide lamp, xenon lamp, or the like.
  • the obtained white light or the light obtained by cutting it into an arbitrary wavelength range with an optical filter can be used.
  • Fluorescence intensity measurement means (3) include, but are not limited to, charge coupled device (CCD) cameras, image intensifier-equipped charge coupled device (ICCD) cameras, chilled PCCD cameras, and photomultiplier tubes (PMT). Can also be used.
  • the substrate mounting means (4) is moved over the fluorescence intensity measuring means (3).
  • the entire surface of the glycan-binding protein-immobilized substrate may be scanned while moving in the XY directions.
  • the substrate (1) may be immobilized and the fluorescence intensity measuring means (3) may be moved for scanning.
  • test sugar chain or the test complex carbohydrate is analyzed using the analysis apparatus of the present invention.
  • the substrate (1) on which the sugar chain-binding proteins such as the plurality of types of lectins are placed and fixed is placed on the substrate placing means (4), and the substrate (1) is placed on the substrate (1).
  • a fluorescently labeled test sugar chain or test carbohydrate-containing sample is introduced, and each sugar chain-binding protein on the substrate (1) is brought into contact with the fluorescently labeled test sugar chain or test complex carbohydrate.
  • the fluorescent labeling agent of the test sugar chain or test complex carbohydrate includes 2-aminopyridine, Cy3, Cy3.5, Cy5, tetramethylrhodamine, various fluorescent pixels having a fluorescein skeleton, molecular probes.
  • Examples of the fluorescent dye Alexa series and quantum dot fluorescent dye manufactured by Susu Co., Ltd. include, but are not limited to, any substance that has the property of fluorescently labeling sugar chains.
  • the test sugar chain or the test complex carbohydrate can be fluorescently labeled directly or indirectly.
  • the test sugar chain can be indirectly fluorescently labeled by binding the test sugar chain to a sugar-binding protein that has been fluorescently labeled in advance.
  • a protein that is fluorescently labeled in advance and binds to a portion other than the sugar chain of the test complex carbohydrate for example, an antibody that interacts with a portion other than the sugar chain of the test complex carbohydrate
  • the test complex carbohydrate By binding the complex carbohydrate, the test complex carbohydrate can be indirectly fluorescently labeled.
  • the test complex carbohydrate can be indirectly fluorescently labeled by binding the pre-fluorescently labeled sugar chain-binding protein and the test complex carbohydrate (in this case, the sugar possessed by the test complex carbohydrate).
  • the chains sugar chains other than the sugar chain to which the sugar chain-binding protein is bound bind to the substrate).
  • a sample containing a target complex carbohydrate sample, a blood, a body fluid, a biological extract component, a food component, etc., that contains a fluorescently labeled antibody that interacts with a portion other than the sugar chain of the target complex carbohydrate By acting on a simple sample, it can be selectively fluorescently labeled without separating and refining the complex sample-targeted complex carbohydrate.
  • only the sugar chain information of the target complex carbohydrate can be selected by bringing a crude sample with the above-mentioned fluorescently labeled antibody into contact with a substrate on which a sugar chain-binding protein such as lectin is immobilized. Can be observed.
  • evanescent excitation method when the excitation light is totally reflected inside the glass, it is known that weak light called evanescent light oozes out in the range of 200 to 300 nm (about half of the excitation wavelength) from the interface. ing.
  • evanescent light When the fluorescent labeling group is excited using this evanescent light in a state where a solution containing a sugar chain or complex carbohydrate labeled with a fluorescent substance is in contact with the slide glass, a fluorescently labeled molecule performing Brownian motion, that is, a binding reaction It is possible to selectively observe the probe molecules in the vicinity of the interface ⁇ in the binding reaction without exciting most of the molecules not deposited.
  • the interaction between a sugar chain-recognizing antibody such as a lectin or IgM class immobilized on a substrate and a test sugar chain or a test complex carbohydrate is weak compared to generally well-known protein-protein interactions.
  • a sugar chain-recognizing antibody such as a lectin or IgM class immobilized on a substrate
  • a test sugar chain or a test complex carbohydrate is weak compared to generally well-known protein-protein interactions.
  • the dissociation reaction between these glycan-binding proteins and the test glycan or test complex carbohydrate proceeds, and accurate interaction information under equilibrium conditions can be obtained. There were cases that could not be obtained.
  • the present inventors have solved the above problem by exciting a fluorescent labeling group with an evanescent wave without washing the probe solution and measuring the intensity of the fluorescence.
  • scanning can be performed without going through a cleaning process, it is possible to follow changes over time in the interaction immediately after probe addition by continuously performing scanning at regular intervals, and it is immobilized on the same glass. It is possible to easily determine whether the interaction reaction between each glycan-binding protein and the probe has reached an equilibrium state.
  • the fluorescence generated by the excitation by the evanescent wave is measured by the fluorescence intensity measuring means (3) for each position where each sugar chain-binding protein is arranged on the substrate (multiple lectins). Is fixed on the substrate, the fluorescence intensity is measured for each lectin position, that is, for each type of lectin). For example, if the fluorescence intensity of each test sugar chain for each lectin is compared with the fluorescence intensity of each known sugar chain measured for each lectin, the difference, similarity, dissimilarity, etc. can be determined.
  • the comparison becomes easier.
  • the present invention is a useful means as a sugar chain profiler that performs sugar chain structure analysis quickly and easily.
  • the profiling method described in Protein Nucleic Acid Enzyme Aug. 2003 Special Issue Vol. 48, NO. 11 can be applied.
  • the measured value of the fluorescence intensity in the apparatus of the present invention is used for sugar chain structure analysis by performing information processing by a computer. Therefore, the apparatus of the present invention includes such a computer information processing system.
  • the structure of the test sugar chain can be identified, and when the test sugar chain has an unknown structure.
  • Even in the test sugar chain Characteristic structure present ⁇ 2-3 sialic acid ⁇ ⁇ 2-6 sialic acid ⁇ ⁇ 1_3 galactose 'a 1-3 fucose. ⁇ 1-6 fucose' bisect ⁇ -acetyl darcosamine 'sulfation etc.) Can be pointed out, or the similarity to known structural sugar chains.
  • a sugar chain or a plurality of types of sugar chain binding proteins that interact with the test sugar chain for example, a plurality of types of lectins, which are placed and immobilized, are brought into contact with a fluorescently labeled test sugar chain. It is a system that automatically displays the sugar chain structure when it is set in the device.
  • the step of bringing a fluorescently labeled test sugar chain into contact with a substrate on which various proteins interacting with the sugar chain are immobilized can be automated.
  • the microchannel system to the reaction tank on the substrate and controlling the flow rate of the solution 'concentration' that is sent into the channel, the blocking and washing solution washing and removal process, the fluorescence labeled sugar chain solution
  • the contact process can be controlled centrally.
  • the test sugar chain is highly specific sialidase (for example, ⁇ 2-3-neuraminidase derived from Macrobdella decora cleaves only ⁇ 2-3 sialic acid, and sialidase A derived from Arthrobacter ureafaciens is higher than ⁇ 2-3 sialic acid.
  • Digestion with ⁇ 2_6 sialic acid is preferred, and the presence or absence of changes in the profile before and after the reaction is examined. Furthermore, it is possible to estimate a wider range of partial sugar chain structures by sequentially reacting various carbohydrate hydrolases. By creating eight reaction vessels on glass, it becomes possible to profile eight types of enzyme digestion reaction products at the same time, making sugar chain structure estimation easier.
  • Carbohydrate hydrolases that can be used for partial sugar chain structure estimation by enzymatic digestion are mainly Jack Bean origin / 3-galactosidase, Green Coffee Bean origin (1_3,4,6) -galac.
  • Tosidase Streptococcus pneumoniae-derived j3 _N_Acetinolehexosaminidase, chicken liver-derived N-acetyl-galatatosaminidase, Jack Bean-derived ⁇ (1-2,3,6) mannosidase, Helix pomatia-derived mannosidase, ushi Examples include ⁇ -fucosidase derived from kidney, 1,2_L-fucosidase derived from Coryneb acterium sp., ⁇ 1,2-xylositase derived from Xanthomonas sp., And all recombinants thereof.
  • FIG. 4 shows an example of the information processing system of the present invention.
  • the system includes at least the following means (a) to (c).
  • the fluorescence intensity measured for each sugar chain-binding protein for example, lectin placement position (for each type of lectin), measured using the analyzer of the present invention. Divide the data into 3 levels, 6 levels, etc.
  • Storage means that stores the interactions with each sugar chain-binding protein in a pattern.
  • the computer includes a calculation means for selecting one or more sugar chains or complex carbohydrates having a known structure matching or similar to the measured data or the above pattern.
  • the measurement data or the patterned information may be combined with the fluorescence intensity information.
  • the database in this system is external to the computer as shown in FIG. In the case of being in the computer as shown in FIG.
  • FIG. 7 shows an example of a computer configuration diagram in the system of the present invention.
  • Input means 1 and output means 2 are connected to bus line 3.
  • Temporary storage means 4 temporarily stores input information, calculated information, and the like.
  • the central processing unit (CPU) 5 performs various operations in response to instructions of the program of the present invention.
  • the storage means (database) 7 stores fluorescence intensity data of each sugar chain-binding protein for known sugar chains or complex carbohydrates, or patterning information similar to the above.
  • the storage means 6 stores various programs including a program for executing the processing of the present invention.
  • the fluorescence intensity data of each sugar chain-binding protein or the pattern information about the inputted sugar chain or complex carbohydrate is stored in a known sugar stored in the database.
  • known structures with similar or similar data patterns structure known sugar chains stored in the database.
  • One or more programs 61, a display program 62, and a program 63 for controlling them are included.
  • the data values may be compared.
  • the value of the inputted fluorescence intensity data is compared with the value of known sugar chain information or complex sugar chain information stored in the database, and the structure existing from the proximity of the value.
  • a single intelligent sugar chain and a function to select multiple sugar chains are built in.
  • Program 62 shows, for example, the average fluorescence intensity data of each spot obtained for the test carbohydrate or complex carbohydrate, and the signal noise ratio (S / N ratio) and its variation 'standard deviation Then, the net luminance value calculated from the fluorescence intensity, the patterning information obtained by patterning the net luminance value (FIG. 9), and the selected structure-known sugar chain information are displayed. In this patterning, it is also possible to normalize the interaction information using an appropriate internal standard.
  • the lectin-immobilized substrate (1) is set in a plurality of analysis apparatuses, and automatically and sequentially transferred to the fluorescence intensity measurement unit, and the fluorescence label excitation means (3) is activated. Then, the fluorescence intensity data obtained by scanning may be automatically input to the computer.
  • the input data can be stored in the storage means or temporary storage means of the computer.
  • the fluorescence intensity data or the patterning information obtained by patterning the fluorescence intensity data is preferably stored in a database together with information such as the origin of the test sugar chain or complex carbohydrate.
  • a calculation means such as a central processing unit (CPU) receives an instruction of the program 62 stored in the storage means, reads the fluorescence intensity information stored in the storage means or the temporary storage means, The fluorescence intensity information can also be displayed.
  • the input fluorescence intensity information is then compared with the fluorescence intensity information of various sugar chains for each sugar chain binding protein stored in the database. Select one or more sugar chains of known structure that match the pattern.
  • a calculation means such as a central processing unit (CPU) receives an instruction of the program 61 in the storage means, and the fluorescence intensity information stored in the storage means or temporary storage means and the known sugar stored in the database. Fluorescence intensity information for chains or complex carbohydrates is collated, and one or more sugar chains with known structures whose information patterns match or approximate are selected.
  • the selected sugar chain information of known structure can be stored in a computer storage means or a temporary storage means.
  • a computing means such as a central processing unit (CPU) receives instructions from the program 61 in the storage means, and the known sugar chain or complex carbohydrate stored in the database is stored. Fluorescence intensity information is input to a computer, the fluorescence intensity information stored in the storage means or temporary storage means of the computer is read out, the respective fluorescence intensity information is collated, and a sugar chain with a known structure whose information pattern matches 1 Select one or more.
  • CPU central processing unit
  • the selection result is then displayed by the display means.
  • arithmetic means such as a central processing unit (CPU) receives instructions from the program 62 in the storage means, reads out and displays the structure-known sugar chain information stored in the storage means or temporary storage means.
  • CPU central processing unit
  • the present invention is useful as a method for quickly and easily examining the state of glycosylation modification of a target protein from a mixture of different glycoconjugates, such as blood, body fluid, biological extract component, food component, etc. It can be applied in fields such as diagnosis and grasping the treatment status by observing the state of glycosylation of the target protein without purifying the mixed solution of various components such as undiluted solution or diluted solution. It is done.
  • Example 1 a sugar chain was actually analyzed using the analyzer of the present invention shown in FIG. The appearance of the analysis device is shown in the device photograph in Fig. 10.
  • Example 2 a sugar chain was actually analyzed using the analyzer of the present invention shown in FIG. The appearance of the analysis device is shown in the device photograph in Fig. 10.
  • Cy3 Mono-reactive Dye (Amersham Falmacia, hereinafter referred to as Cy3), a fluorescent dye having a maximum absorption wavelength near 550 nm, is used as a fluorescently labeled glycoprotein probe.
  • Cy3 Mono-reactive Dye
  • ASF has three N-linked sugar chains and three 0-linked sugar chains in the molecule, and has a sugar chain structure in which the non-reducing terminal sialic acid cap in the sugar chain is partially removed. It has been known.
  • ASF was prepared in 0.1 M carbonate buffer (pH 9.3) to a final concentration of 1 mg / mL, then 1 mL was mixed with 1.0 mg Cy3 powder, and the reaction was performed in a place with proper stirring for 1 hour. I let you.
  • a slide glass (Fig. 1) coated with 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane having an epoxy group as an active group (Shin-Etsu Silicone Co., hereafter GTMS) was used, and the lectin was immobilized on the glass surface.
  • GTMS coating was performed using the following procedure using a slide glass manufactured by Matsunami Glass Industrial Co., Ltd. The glass slide was soaked in a 10% KOH I Me 0H solution and the glass surface was treated by shaking the whole container for 1 hour. This was washed with a sufficient amount of purified water (Milli Q water) and then dried in an oven at 60 ° C.
  • the slide glass was immersed in a 2% GT MS acetone solution and allowed to react for 1 hour while shaking the whole container in the dark. After the reaction, it was dried in an oven at 110 ° C. for 8 hours, washed with a sufficient amount of purified water, and dried.
  • Lectins were spotted on a glass slide coated with GTMS in (2).
  • Microa Using a STAMPMAN made by Nippon Laser Electronics as a ray spotter, using a stamp pin with a tip diameter of 0.40 mm, a spot having a diameter of about 0.6 to 0.7 mm was placed on the slide glass.
  • Each lectin to be spotted was dissolved in phosphate buffered saline, pH 7.4 (hereinafter referred to as PBS) to a concentration of 1 mg / mL (some 0.25 mg / mL depending on the lectin). 10 ⁇ L of this was dispensed into each reaction tank of a 96-well PCR microtiter plate (Cowung) and set in a microarray spotter.
  • PBS phosphate buffered saline, pH 7.4
  • the stamp pin was immersed in an immobilized sample solution in a 96-well PCR microtiter plate for 1 second, then lifted and brought into contact with a predetermined position on the surface of the slide glass for 1 second. While repeating this operation for each spot, four spot spots were made in a horizontal row from the same sample solution, and then the stamp pin was washed.
  • the tip of the stamp pin is immersed in a 0.05% SDS solution for 2 seconds, the stamp pin is dried for 15 seconds in a vacuum device, and further immersed in purified water for 2 seconds, and then dried in a vacuum device for 15 seconds. Finally, it was immersed in ethanol for 2 seconds and then dried for 15 seconds in a vacuum apparatus.
  • lectins having various sugar-binding specificities (RCA120, SSA, xylanase-binding domain (hereinafter referred to as XBD) of recombinant actinomycetes-derived xylanase, C-terminal domain derived from recombinant earthworm 29 kDa lectin
  • the following 5 proteins were spotted: EW29 (Ch)) and 1 negative control (usi serum albumin (BSA)) RCA120, BSA were purchased from SIGMA, SSA was purchased from Seikagaku As for XBD and EW29 (Ch), those expressed and purified in E. coli in our laboratory were used.
  • the lectin solution was reacted for 1 hour after spot treatment and immobilized on the glass surface, and then unbound lectin was washed. Washing was carried out by spraying PBS solution (PBST) containing 0.1% Tween20 by spraying the slide glass several times with a pipette, and then further thoroughly washing with PBS.
  • PBST PBS solution
  • An 8-hole rubber designed and developed by the present inventors was attached to a predetermined position on the slide glass after immobilizing the lectin to prepare 8 reaction vessels (Fig. 11).
  • This 8-hole rubber is thick Made of black silicone rubber with lmm force, 8 rectangular holes of 9.5 x 7.5mm in length and breadth are regularly opened, and 8 reaction tanks can be formed when pasted on a slide glass. If about 50 samples are stored in this reaction vessel, the inside can be filled with a sufficient amount of sample solution.
  • the fluorescently labeled glycoprotein probe solution whose interaction was analyzed was added.
  • Fluorescently labeled glycoprotein probes were prepared by dissolving in PBS to a final concentration of 10 ⁇ g / mL, and 50 ⁇ L was dropped into each reaction vessel.
  • excitation light is incident from the end face of the slide glass using GTMAS Scan III (Japan Laser Electronics Co., Ltd.), an evanescent excitation microarray scanner. Fluorescence emission generated by excitation was detected with an ICCD camera placed on the lower surface of the slide glass. A fluorescent image of almost the entire surface of the slide glass was scanned, and the obtained image was stored at about 100 MB per TIFF file format. The parameters for scanning were unified with Gain “5000 times”, integration count “4 times”, and exposure time “33 msec”.
  • Array-Pro Anal a commercially available microarray analysis software, is used to digitize scanned images. yzer (version 4.0 for Windows (registered trademark), Media Cybernetics) was used. The brightness of each spot was calculated using the above analysis software, and the brightness of the non-spot area was used as the background value. The net luminance value was obtained by subtracting the background value from the luminance of each spot, and the average value and standard deviation were calculated for each spot from the same sample arranged in four rows.
  • RCA120 and ConA are representative lectins known to have high affinity for complex and high mannose sugar chains, respectively. These lectins were prepared at various concentrations, and the same sample was spotted in an array with 4 points arranged side by side. After 50 ⁇ L of 10 ⁇ g / mL Cy3_ASF was applied to each reaction tank of this array to cause a binding reaction, fluorescence was observed with a scanner.
  • ASF has three ⁇ -linked sugar chains and three 0-linked sugar chains in the molecule, and the sialic acid cap at the non-reducing end of the sugar chain is removed, and the ratatosamine structure protrudes. It is known to have a sugar chain structure. Therefore, in the experimental system supplemented with Cy3_ASF, it was predicted that RCA120 showed a very strong affinity and ConA showed a weak affinity.
  • the RCA120 spot emitted strong fluorescence, whereas the ConA spot showed only about 1/3 of the fluorescence intensity of the RCA120 spot under the same conditions.
  • ConA is weak, it binds to ASF with complex type sugar chains, but N-linked sugar chains cannot be bound to the three-chain type sugar chains that are mainly present in ASF, but are thought to exist in small amounts 2 This is thought to be due to the ability to bind to this type of sugar chain.
  • the data also showed that the standard deviation (SD) of 4 points from the same sample was about ⁇ 20% (Fig. 13).
  • lectins having various sugar binding specificities as lectins to be immobilized on the lectin array.
  • BSA a protein that does not bind to sugar chains.
  • two anti-fetuin antibodies and anti-RNase antibodies that recognize the core protein portion of the probe were spotted in the same compartment as the lectin.
  • GNA and SNA were purchased from VECTOR
  • BSA was purchased from SIGMA
  • RCA120, ECA, ConA and SSA were purchased from Seikagaku.
  • Model fluorescence-labeled glycoprotein probes include proteins such as ASF, FET, cypress-derived ribonuclease B (RNase B), and sushi-derived ribonuclease A (RNase A), BSA as negative controls ( All were purchased from SIGMA) and prepared by fluorescent labeling using Cy3 Mono-reactive Dye (Amersham Pharmacia, hereinafter referred to as Cy3), a fluorescent dye having an absorption maximum wavelength near 550 nm.
  • Cy3 Mono-reactive Dye Amersham Pharmacia, hereinafter referred to as Cy3
  • the above protein is prepared in 0.1 M carbonate buffer (pH 9.3) to a final concentration of 1 mg / mL, then mixed with 1.0 mg of Cy3 powder, and stirred for 1 hour at a certain point in time. Reacted as carrier, S mark hadex G- Cy3-labeled protein was purified by gel filtration chromatography using 25.
  • a slide glass (Fig. 1) coated with 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (Shin-Etsu Silicone Co., hereafter GTMS) having an epoxy group as an active group was used, and the lectin was immobilized on the glass surface.
  • GTMS coating was performed using the following procedure using a slide glass manufactured by Matsunami Glass Industrial Co., Ltd. The glass slide was soaked in a 10% KOH / MeOH solution and allowed to stand for 1 hour with the whole container shaken to treat the glass surface. 60 after washing this with a sufficient amount of purified water (Milli-Q water). Dry in C oven. Next, the slide glass was immersed in a 2% GTMS acetone solution and allowed to react for 1 hour while shaking the whole container in the dark. After the reaction, 1 dried in an oven at 10 ° C for 8 hours, then washed with a sufficient amount of purified water and dried
  • Lectins were spotted on the GTMS coated slide glass prepared in (2) to prepare lectin arrays.
  • a STAMPMAN made by Nippon Laser Electronics was used as a microarray spotter, and a spot pin having a tip diameter of 0.40 mm was used, and a spot having a diameter of about 0.5 mm was placed on the slide glass.
  • the stamp pin operation program was executed. First, the stamp pin was immersed in an immobilized sample solution in a 96-well PCR microtiter plate for 1 second and then lifted, and brought into contact with a predetermined position on the surface of the slide glass for 1 second.
  • the stamp pin While repeating this operation for each spot, after performing 6 spot spots in a horizontal row from the same sample solution, the stamp pin was washed. In the cleaning process, immerse the tip of the stamp pin in 0.05% SDS solution for 2 seconds, dry the stamp pin in the vacuum device for 15 seconds, then immerse in purified water for 2 seconds, then dry in the vacuum device for 15 seconds, and finally After dipping in ethanol for 2 seconds, a drying operation was performed in a vacuum apparatus for 15 seconds.
  • the probe solution was brought into contact with the array by adding 50 ⁇ L of each fluorescently labeled sugar protein probe solution adjusted to about 100 ng / mL to each reaction vessel on the slide after blocking.
  • excitation light was incident from the end face of the slide glass using GTMAS Scan III (Japan Laser Electronics Co., Ltd.), an evanescent excitation microarray scanner.
  • the fluorescence emission generated by excitation was detected with an ICCD (Image Intensifier with Charge Coupled Device) camera placed on the lower surface of the slide glass. After scanning a fluorescent image over almost the entire surface of the slide glass, the obtained image was saved in the TIFF file format. Each parameter for scanning was unified with Gain “4000 times”, integration count “8 times”, and exposure time “110 msec”.
  • Array-Pro Analyzer Ver. 4.5 Media Cybernetics
  • the brightness of each spot was calculated with the above analysis software, and the brightness of the non-spot area was used as the background value.
  • the net luminance value was obtained by subtracting the background value from the luminance of each spot, and the average value and standard deviation were calculated for each spot from the same sample arranged in five rows.
  • FIGS 16A and B FETs are known to have three N-linked sugar chains and three O-linked sugar chains in the molecule, and the non-reducing end of each sugar chain structure is highly modified with sialic acid.
  • ASF is a protein obtained by removing terminal sialic acid from the FET sugar chain by enzyme or acid treatment, and the ratatosamine structure is exposed. Therefore, RCA120 and ECA spots that recognize ratatosamine were observed when the ASF probe was used, and SSA and SNA spots that recognized sialic acid were expected when the FET probe was used.
  • the core protein portion of the FET spot and the ASF are identical to the antibody spot, it was expected that binding was observed for both probes.
  • Example 2 The method described in (2) was used.
  • the lectins to be immobilized are grouped according to the main sugar recognition ability of each lectin, and then five fucose recognition lectins, six sialic acid recognition lectins, three ratatosamine structure recognition lectins, and a galactose recognition lectin 6
  • a total of 40 types of lectins were selected from 11 species, 11 types of galactosamine-recognizing lectins, 4 types of mannose-recognizing lectins, and 5 types of chitin structure-recognizing lectins.
  • the experimental operation was performed by the method described in Example 2 (3).
  • the glycan profiling of glycoproteins in vivo is analyzed by performing glycan profiling of glycoprotein mixtures, especially biological samples, using lectin arrays.
  • FIG. 19A A clearly different sugar chain profile was observed between the mouse brain-derived glycoprotein probe (FIG. 19A) and the liver-derived glycoprotein probe (FIG. 19B).
  • the lectin group that recognizes sialic acid showed significant differences between the two probes.
  • the brain is known to have less sialic acid addition to glycoproteins, and this fact is consistent with experimental trends.
  • the glycosylation information of the entire sample can be obtained quickly and easily, so the difference in sugar chain structure between individuals and disease states such as blood components and organs. It is suitable for use for the purpose of simultaneous comparative analysis.
  • This device does not require a washing step during scanning, and the interaction in the liquid layer can be observed in an equilibrium state. Therefore, by observing changes in signal intensity over time from the start of the reaction, it is possible to observe the binding / dissociation reaction over time (real-time scanning).
  • Cy3_bTf Cy3-labeled ushitransferrin
  • Example 2 The method described in (2) was used.
  • the lectins to be immobilized are grouped according to the main sugar recognition ability of each lectin, and then five fucose recognition lectins, six sialic acid recognition lectins, three ratatosamine structure recognition lectins, and a galactose recognition lectin 6
  • a total of 40 types of lectins were selected from 11 species, 11 types of galactosamine-recognizing lectins, 4 types of mannose-recognizing lectins, and 5 types of chitin structure-recognizing lectins, and an array immobilized on a slide glass was prepared.
  • the experimental operation was performed by the method described in Example 2 (3). [0102] (4) Non-spot surface blocking
  • a glycan profile reflecting the glycan structure of the reaction product could be obtained by using the lectin array with glycoprotein probes treated with each carbohydrate hydrolase (Fig. 21).
  • the profile of the ⁇ -galactosidase reaction product showed almost the same profile as the unreacted glycoprotein, although there was a large profile change before and after the reaction (Fig. 21). This indicates that most of the non-reducing ends of bTf ⁇ -linked sugar chains are sialic acid-modified.
  • RCA120 which strongly recognizes ratatosamine structure, was used as a lectin probe
  • BSA which has no sugar-binding ability
  • the fluorescently labeled lectin probe was prepared by fluorescent labeling using Cy3, a fluorescent dye.
  • the lectin is dissolved in 0.1 M carbonate buffer (pH 9.3) to a final concentration of 1 mg / mL, then mixed with 1.0 mg of Cy 3 powder per mL, and reacted in a place with proper stirring for 1 hour. I let you. After the reaction, unreacted Cy3 dye was removed using an ultrafiltration filter kit.
  • Glucose peptides are spotted on the GTMS coated glass slide (Fig. 1) prepared in (2).
  • a peptide array was prepared.
  • a STA MPMAN manufactured by Nippon Laser Electronics Co., Ltd. was used as a microarray spotter, and a spot having a diameter of about 0.5 mm was placed on a slide glass by using a stamp pin having a tip diameter of 0.40 mm.
  • the immobilized glycopeptide sample was prepared from the soluble fraction of mouse liver using a lectin column, and the purified glycoprotein fraction was fragmented with trypsin and then fractionated by HPLC. It was.
  • the stamp pin operation program was executed. First, the stamp pin was dipped in an immobilized sample solution in a 96-well PCR microtiter plate for 1 second and then pulled up and brought into contact with a predetermined position on the slide glass surface for 1 second. The force was not repeated for each spot S, and the stamp pin was washed after performing 6 spot spots in a horizontal row from the same sample solution.
  • the tip of the stamp pin is immersed in 0.05% SDS solution for 2 seconds, the stamp pin is dried in a vacuum device for 15 seconds, and further immersed in purified water for 2 seconds, and then dried in a vacuum device for 15 seconds. Finally, it was immersed in ethanol for 2 seconds and then dried for 15 seconds in a vacuum apparatus.
  • the glycopeptide array can be prepared by 1) immobilizing the purified glycopeptide, 2) immobilizing the crude glycopeptide, 3) immobilizing the glycopeptide fraction separated by HPLC, etc. .
  • an array of the fractions separated by HPLC could be prepared and proved useful.
  • FIG. 23 shows a schematic diagram of the interaction between each sugar chain-related array and the sugar chain.

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Abstract

　本発明は、糖鎖結合性タンパク質を複数種配置固定した導光性材料からなる基板と、該基板の側部端面に光を導入し、該基板表面にエバネッセント波を発生させて蛍光標識を励起する手段と、該手段により生じた蛍光の強度を上記糖鎖結合性タンパク質の配置位置毎に測定する蛍光強度測定手段とを有する、糖鎖あるいは複合糖質の解析装置に関する。該装置は簡便、かつ高速、高感度、高精度に糖鎖あるいは複合糖質を解析することを可能とする。

Description

明 細 書
糖鎖あるいは複合糖質の解析装置
技術分野
[0001] 本発明は、エバネッセント光を利用した糖鎖あるいは複合糖質、又はこれらを含有 する試料の解析装置及び該装置に装着して使用する基板に関する。 背景技術
[0002] 生体の生命機能を担う主役であるタンパク質力 細胞社会の中において秩序正しく 機能を発揮するためには、糖鎖修飾をはじめとする翻訳後修飾が大変に重要な役割 を担っている。生体内のほとんどのタンパク質は糖鎖による修飾をうけており、タンパ ク質に付加した糖鎖がウィルスの感染、原虫の寄生、感染、毒素の結合、ホルモンの 結合、受精、発生分化、タンパク質の安定性、がん細胞転移、アポトーシスなど、生 命現象の様々な場で重要な役割を果たしていることが近年次々と明らかになつてき た。
[0003] 糖鎖機能の解析のためには、まずその糖鎖の構造解析が欠かせない。今後も糖鎖 構造解析法の重要性は増すことが予想される。しかし糖鎖の構造解析は多大な時間 と労力、経験を要することから、従来の手法に基づき完全な構造決定を目指すので はなぐより簡便に、高速、高感度、かつ高精度に多彩な糖鎖構造の特徴を抽出し、 相互識別できるシステム開発が期待されていた。
[0004] マイクロアレイは多種の DNA'タンパク質等の固定化試料を高密度に固相担体（ガ ラス'メンブレン'シリコンチップ）上にスポット状に固定化したものの総称であり、固定 化した多種の試料スポットに対して特異的に結合する分子（以下プローブ）の有無を 検出することが可能である。プローブ分子には一般的には蛍光標識化されたものが 用いられており、プローブ溶液をアレイ表面と反応させた後に、蛍光検出スキャナー で観察することにより各試料スポットに結合したプローブ分子の定量的解析を行うこと ができる。米国 Affimetrix社が DNAマイクロアレイを開発して以来、マイクロアレイは非 常に広範な研究分野において使用され、人類に様々な新しい知見をもたらしてきた [0005] 第三の生命鎖と呼ばれる糖鎖の構造'機能情報を研究する上で、マイクロアレイを 利用した糖鎖と糖鎖に相互作用を示すタンパク質 (糖結合性タンパク質、例えば、レ クチン等）の迅速かつ高感度な大規模相互作用解析が可能となれば、基礎研究から 医療診断や産業応用に至るまで、広範囲に利用されうる非常に有用なツールになる ことが考えられる。
[0006] 糖鎖と糖鎖に相互作用を示すタンパク質間の結合は抗原抗体反応の一般的な解 離定数 (Kd= 10— 8 M以下)等に比べて、一般的に弱レ、相互作用であることが知られて おり、これらの解離定数 (Kd)は 10— 6 Mかそれ以上であることが多レ、。また糖鎖と糖鎖 に相互作用を示すタンパク質間の結合は比較的速い解離-会合反応から成り立って レ、ることが知られており、結果的に一般的なタンパク質間相互作用や相補的ヌクレオ チド断片間の相互作用に比べ、洗浄操作などにより解離側に平衡が傾きやすい。例 えば、レクチンを糖タンパク質固定化カラム等にて精製を行う際にも、レクチンの結合 が弱い場合は洗浄操作中にレクチンがカラム外に流出してしまう現象がしばしば観 察される。
[0007] 従来のスライドガラスを用いた一般的なマイクロアレイ技術では、プローブ溶液を固 定化試料と接触させて結合反応に至らしめる過程後にプローブ溶液を洗浄 ·除去し 、ジェットガスや遠心機を用いてスライドガラスに付着している水分を完全に除去する 操作を行った後に、マイクロアレイスキャナーを用いてイメージングを行う。これは一 般的なマイクロアレイリーダーが、水分の付着した状態でスライドガラス上の蛍光を観 察することが出来ないことに起因している。このようにスキャニングの前段階でプロ一 ブ溶液を除去しても、相補的ヌクレオチド断片や抗原-抗体反応等、強い結合を示す 相互作用においては解離速度定数が十分に小さいため、プローブ分子の解離反応 は容易に進行しないと考えられる。しかし、糖鎖と糖鎖に相互作用を示すタンパク質 間に一般的に見られる解離速度定数の大きい、すなわち弱い相互作用の観察に際 しては、プローブ溶液の除去'洗浄操作を行う時点で糖鎖と糖鎖に相互作用を示す タンパク質間の解離反応が進行してしまい、平衡状態下での正確な相互作用情報を 得ること力 S困難になる。このため、マイクロアレイにおいて糖鎖と糖鎖に相互作用を示 すタンパク質間の平衡状態での相互作用情報を精密に解析する場合、このプローブ 溶液の洗浄操作が大きな問題点となる。
[0008] DNAマイクロアレイは現在非常に広範囲に利用されている。タンパク質のマイクロア レイについても DNAの転写産物であるタンパク質の生体内での機能を解明する等の 基礎研究分野やタンパク質の量的'質的な変化に基づいた診断'判断等の応用分 野においても、将来の利用が期待されており、研究面においても世界中で活発な研 究が行われてきた。し力、しタンパク質マイクロアレイの開発 ·普及は DNAマイクロアレイ に比べ、圧倒的に遅れているのが現状である。この原因の一つとして、様々に異なる 性質を持つタンパク質試料を、活性を保ったままの状態で、一定の割合で固定化し てレ、くという工程が技術的に大変に難しいということが、以前より多くの研究者によつ て指摘されている。
[0009] タンパク質をアレイ上に固定化する方法として、最も初期に開発された方法として P VDF膜 (非特許文献 1)に代表されるメンブレン上にタンパク質を物理的に吸着させる 方法が挙げられる。転写因子など一部のタンパク質では、ある程度の活性を維持で きると報告されている力 一般性には乏しい。またメンブレン上に固定化する場合、ァ レイの高密度化に限界があった。高密度化を達成するために、金属やガラスなどの 固体表面に対してタンパク質を固定化していく方向で研究が進められてきたが、一般 にタンパク質は金属やガラスなどの固体表面への接触によって変性しやすいという性 質を持つ。このため、固体表面とタンパク質を架橋するための何らかのリンカ一を使 用する固定化方法が、鋭意研究 '開発されてきた。
[0010] タンパク質の変性の問題を軽減する手法の一例としては、スライドガラス上に厚さ 10 〜100 z mのポリアクリルアミドのパッドを接合して、これにタンパク質をスポットする手 法が挙げられる（非特許文献 2および 3)。この場合、タンパク質は 3次元空間に固定 化されるために、 2次元表面に固定化する手法に比べて、量的に 100倍以上の向上 が望めるという。また、タンパク質を多孔性ポリアクリルアミドゲル内にアミノ基を介して 固定化する方法もある（非特許文献 4)。し力、しこれらの方法は高価で特殊なスライド ガラスを作製する必要があり、一般的な普及には至っていない。また固定化されたタ ンパク質の層に厚みがあることは、検出法によっては好ましくないこともある。 [0011] 現在最も精力的に研究されている固相へのタンパク質固定化法として、何らかのタ グを付加した形でタンパク質を発現し、タンパク質のタグ部分を介した固相担体への 固定化を行う方法がある。この方法ではタンパク質の有効リガンド濃度が向上すると レ、つた効果やタンパク質の向きをそろえることが原理的に可能であるといわれている 。このような手法の一例として、オリゴヒスチジンタグを介して、ニッケル錯体で表面修 飾した基板へ固定化する方法や (非特許文献 5)、アビジン-ピオチンを介した固定化 法 (特許文献 1)を挙げることができる。
[0012] このような方法はタンパク質の活性を保ったまま固定化する、あるいは固定化率を そろえるという点で有効な方法であると考えられる。し力、しマイクロアレイに固定化しよ うとするすべてのタンパク質について遺伝子レベルでタグを付カ卩し、大腸菌、ないし 無細胞系等で発現及び精製を行うことは多額のコストと莫大な労力が必要となると考 えられる点で、現時点で一般的な研究者が自在かつ個々の要求に合わせる形で気 軽に利用することは難しい。
[0013] これに対し、タンパク質の官能基を固相担体との固定化に利用する方法は、天然か ら抽出したままのタンパク質や市販のタンパク質試料をそのまま固定化し、マイクロア レイに利用できるという特徴をもつ。タンパク質中のアミノ基を介した固相担体への固 定化方法としては、固相表面に結合させた活性エステル基を介してタンパク質を固 定化する方法や、固相表面に配置したエポキシ基を介してタンパク質を固定化する 手法が挙げられる（非特許文献 6)。タンパク質のアミノ基を介して固定化する方法は シンプルな方法である力 市販のタンパク質や生体抽出 ·成分、特定のタグのない組 み換えタンパク質等においても簡便に固定化することができるため、個々の使用者が 自分の目的に合わせ、 自在にタンパク質を選択し、迅速かつ安価に目的にあったマ イクロアレイに最適化して使用することができる。タンパク質のアミノ基を介した固定化 方法の欠点としては、タンパク質中のリジン残基の数が個々のタンパク質によって異 なることや、固定化に用いられるリジン残基の位置によってはタンパク質の不活化が 起こる可能性等が挙げられる。
[0014] 特許文献 1 :特許出願 2001— 520104
特許文献 2：特許公開平 8— 201383 特許文献 3：特許公表 2002— 544485
非特許文献 1 : L. J. Holt, K. Bussow, G. Walter, I. M. Tomlinson,Nucleic Acids Res. ， 15, E72, 2000
非特許文献 2 : D. Guschin, G. Yershov, A. Zaslavsky, A. Gemmell'V. Shick, D. Prou dnikov, P. Arenkov, A. Mirzabekov, Anal. Biochem., 250, 203-211, 1997 非特許文献 3 : A. Lueking, M. Horn, H. Eickhoff, K. Bussow, H. Lehrach, G. Walter ,Anal. Biochem., 270, 103-111, 1999
非特許文献 4 : P. Mitchell, Nat. Biotechnol., 20, 225-229, 2002
非特許文献 5 : H. Zhu, M. Bilgin, R. Bangham, D. Hall, A. Casamayor, P. Bertone, N.Lan, R. Jansen, S. Bidlingmaier, T. Houfek, T. Mitchell, P. Miller, R. A. Dean,M. Gerstein,M. Snyder, Science, 293, 2101-2105, 2001
^^特許文献 6 : H. Zhu, J. F. Klemic, S. Chang, P. Bertone, A. Casamayor, K. G.Kle mic, D. Smith, M. Gerstein, M. A. Reed, M. Snyder, Nat. Genetics. 26,283-289， 20 00
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0015] 本発明の目的は、より簡便に、高速、高感度、かつ高精度に糖鎖あるいは複合糖 質、又はこれらを含有する試料を解析する装置及び該装置に装着するマイクロアレイ 基板を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0016] 本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った。
その結果、糖鎖結合性タンパク質としてレクチンを使用して、該レクチンを表面に複 数種配置固定した基板と、該基板上のレクチンと蛍光標識された糖鎖あるいは糖タ ンパク質との結合状態を測定するための励起光としてエバネッセント波を利用した、 糖鎖あるいは複合糖質の解析装置を製作し、実際に糖鎖あるいは複合糖鎖含有試 料の解析を行った。
従来のレクチンプロット法によれば、レクチンと結合しなかった蛍光標識された糖鎖 等の洗浄工程が必要となるが、本発明の解析装置によれば、このような洗浄工程は 不要で、簡便、高速に解析可能であり、しかも従来のレクチンプロットのような結合の 有無（0か 1か）のみではなぐ中間部分の情報、すなわち結合の強度情報を蛍光強 度値から得ることができ（例えば 0から 6段階）、高感度、高精度であることを確認し、 本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下（1)〜（24)に示すとおりである。
(1) 被験糖鎖あるいは被験複合糖質を、精製又は精製することなく蛍光標識し、糖 鎖あるいは複合糖質とタンパク質の結合状態を測定することにより、被験糖鎖あるい は被験複合糖質あるいはこれらを含有する試料を解析する装置であって、糖鎖結合 性タンパク質を複数種配置固定した導光性材料力もなる基板と、該基板の側部端面 に光を導入し、該基板表面にエバネッセント波を発生させて、蛍光標識を励起する 手段と、該手段により生じた蛍光の強度を上記糖鎖結合性タンパク質の配置位置毎 に測定する蛍光強度測定手段と、を有することを特徴とする、上記装置。
(2) 糖鎖結合性タンパク質がレクチン又は IgMクラスに属する糖鎖認識抗体である ことを特徴とする、上記（1)に記載の装置。
(3) 基板が、糖鎖結合性タンパク質をその種類に応じて所定のパターンで配置固 定化したものであることを特徴とする、上記（1)〜（2)のいずれかに記載の装置。
(4) 基板上に糖鎖結合性タンパク質とともに、複合糖質の糖鎖以外の部分に対す る抗体が配置固定化されていることを特徴とする、上記（1)〜（3)のいずれかに記載 の装置。
(5) 蛍光強度測定手段により測定された蛍光強度を、使用した被験糖鎖あるいは 被験複合糖質に対応させて糖鎖結合性タンパク質の配置位置毎に記憶する記憶手 段を有することを特徴とする、上記（1)〜 (4)のいずれかに記載の装置。
(6) 糖鎖結合性タンパク質の配置位置毎に測定された蛍光強度を段階分けして記 憶する手段を有することを特徴とする、上記（1)〜（5)に記載の装置。
(7) 段階分けされた蛍光強度を、各糖鎖結合性タンパク質の種類毎に区分して表 示する手段を有することを特徴とする、上記（6)に記載の装置。
(8) 基板が、同一の糖鎖結合性タンパク質を、その種類毎に複数配置固定化した ものであることを特徴とする、上記（1)〜（7)のいずれかに記載の装置。
(9) 同一の糖鎖結合性タンパク質に対して測定された蛍光強度の平均値を算出し て記憶する手段を有することを特徴とする、上記 (8)に記載の装置。
(10) 同一の糖鎖結合性タンパク質に対して測定された蛍光強度の平均値を段階 分けして記憶する手段を有することを特徴とする、上記（9)に記載の装置。
(11) 段階分けされた蛍光強度を、糖鎖結合性タンパク質の種類毎に区分して表示 する手段を有することを特徴とする、上記（10)に記載の装置。
(12) 記憶手段に既知の糖鎖あるいは複合糖質に対する蛍光強度情報が記憶され ていることを特徴とする、上記（5)、（6)、（9)及び（10)のいずれかに記載の装置。
(13) 既知の糖鎖あるいは複合糖質に対する蛍光強度情報と解析対象の糖鎖ある いは糖タンパク質の蛍光強度情報を照合し、同一あるいは近似する糖鎖あるいは複 合糖質を選定する手段を有することを特徴とする、上記（12)に記載の装置。
(14) 基板上に糖鎖結合性タンパク質とともに、複合糖質の糖鎖以外の部分に対す る抗体が配置固定化されていることを特徴とする、上記（1)〜（： 12)のいずれかに記 載の装置。 (15) 蛍光標識の励起をエバネッセント波により行い、糖鎖あるいは複合糖質の解 祈に用いる基板であって、表面に糖鎖結合性タンパク質を複数種配置固定した導光 性材料力 なる、上記基板。
(16) 糖鎖結合性タンパク質が、レクチン又は IgMクラスの糖鎖認識抗体であること を特徴とする、上記（15)に記載の基板。
(17) 糖鎖結合性タンパク質がその種類に応じて所定のパターンで配置固定化さ れたものであることを特徴とする、上記（15)又は（16)に記載の基板。
(18) 基板が、同一の糖鎖結合性タンパク質をその種類毎に複数配置固定化したも のであることを特徴とする、上記（15)〜（17)のいずれかに記載の基板。
(19) エポキシ基を活性基として含有する化合物がコートされた基板に、糖鎖結合 性タンパク質が固定化されたことを特徴とする、上記（15)〜（： 18)のいずれかに記載 の基板。
(20) エポキシ基を活性基として含有する化合物が 3-グリシドキシプロピルトリメトキ シシラン、 2-(3，4エポキシシクロへキシル)ェチルトリメトキシシラン、 3-グリシドキシプロ ピルメチルジェトキシシラン、 3-グリシドキシプロピルトリエトキシシランであることを特 徴とする、上記（19)に記載の基板。
(21) エポキシ基を活性基として含有する化合物が分岐したスぺーサ一の先端にェ ポキシ基を一つ又は複数持つシランカップリング化合物であることを特徴とする、上 記（19)に記載の基板。
(22) スぺーサ一が炭化水素鎖、ポリエチレングリコール、タンパク質、またはビォチ ン 'アビジンであることを特徴とする、上記（21)に記載の基板。 (23) 糖鎖結合性タンパク質の固定面が反応槽を形成していることを特徴とする、上 記（15)〜（22)のレ、ずれかに記載の基板。
(24) 基板上に糖鎖結合性タンパク質とともに、複合糖質の糖鎖以外の部分に対す る抗体が配置固定化されていることを特徴とする、上記（15)〜（23)のいずれかに記 載の基板。
発明の効果
本発明の解析装置により、レクチン等の糖鎖結合性タンパク質と糖鎖間の平衡状 態での相互作用情報を精密に解析する上での大きな問題点であつたプローブ溶液 の洗浄除去操作が不要となり、従来法では洗浄時に洗い流されてしまうような弱い相 互作用をも検出することが可能となった。
すなわち、糖鎖結合性タンパク質—糖鎖間の相互作用を溶液中で平衡状態のまま 観察する手段が初めて実用化された。この装置の使用により、従来のレクチンブロッ トのような結合の有無（0か 1か)ではなぐ中間部分の情報、すなわち結合の強度情 報を得ることができる（例えば 0から 6段階)。このことは n種の糖鎖結合性タンパク質 —糖鎖間の相互作用において、従来は 2n通りであった情報量が 6n通りへと格段に増 したことを意味する。この技術は今後さらに高密度化、高精度化してレ、くことにより糖 鎖構造解析、及び関連するその他の糖鎖工学諸分野の発展に大きな貢献をもたら す。さらには、様々な用途に向け糖鎖結合性タンパク質—糖鎖間の相互作用解析用 のアレイを作製することで、例えば、血液 '体液'組織抽出物等の原液または希釈溶 液等の生体試料中の糖タンパク質の糖鎖及びその量比等を解析することにより、種 々疾病の診断'判定へ利用でき、また、糖タンパク質製剤の品質管理等への広い応 用が可能である。 図面の簡単な説明 園 1]ガラス表面に対する GTMSの反応過程を示す模式図である。
園 2]本発明の糖鎖あるいは複合糖質の解析に用いる基板の作製方法の概略を示 す図である。
園 3]本発明の糖鎖あるいは複合糖質の解析装置の一例を示す図である。
[図 4]本発明の情報処理システムの一例を示す図である。
[図 5]コンピューターの外部にデータベースを格納したシステムの一例を示す図であ る。
[図 6]コンピューター内部にデータベースを格納したシステムの一例を示す図である。
[図 7]本発明のシステムにおけるコンピューター構成図の一例を示す図である。
[図 8]本発明の解析装置において用いるプログラムのパターン化処理のフローチヤ一 トを示す図である。
園 9]図 8のプログラムにより処理された結果を示すパターン化情報を示す図である。 園 10]本発明の糖鎖あるいは複合糖質の解析装置の外観の一例を示す図である。 園 11]本実施例で用いた 8つの反応槽を形成させた基板を示す図である。
[図 12]2種のレクチンを固定化したアレイ上に Cy3-ASF溶液を加えた、レクチンアレイ の性能実験の概念図である。
園 13]固定化時のレクチン溶液濃度とスポットの蛍光強度との関係を示す図及び写 真である。
園 14]レクチン-糖鎖相互作用の検出と、阻害糖による相互作用への影響を示す図 及び写真である。
園 15]阻害糖のレクチン-糖鎖相互作用への影響をグラフとして示す図である。
園 16]レクチン-抗体ハイブリッドアレイの実施例を示す写真である。
園 17]8つの反応槽を使用して、同一スライド上に異なる濃度の阻害糖を共存させて 、相互作用の阻害を観察した結果を示す写真及び図である。 （A) RCA120と ASFの結 合にラタトースを加えたケース、（B) ConAと RNaseBの結合にマンノースを加えたケー スである。
園 18]レクチンアレイの検出に糖ペプチドプローブを用いる実験の結果を示す写真 及び図である。 [図 19]生体由来のクルードな試料をプローブ化した際のレクチンアレイによる解析結 果を示す写真である。
[図 20]2種のレクチン（RCA120，ECA)に対して、 100ng/mLの Cy3_ASFプローブを反 応させた際の正味のシグナル強度の経時変化をリアルタイムスキャン機能を用いて 観察した図である。
[図 21]糖質加水分解酵素消化によるゥシトランスフヱリンの糖鎖プロファイル変化を示 した図である。実線:酵素消化によりシグナルの増加が観察されたレクチン。点線:酵 素消化によりシグナルの低下が観察されたレクチン。
[図 22]マウス肝由来糖ペプチドサンプルの HPLC分画フラクションを固定化した、糖 ペプチドアレイの検出実験の結果を示す図及び写真である。図中、 Fucはフコース認 識レクチン群、 Siaはシアル酸認識レクチン群、 Lacはラタトース認識レクチン群、 Galは ガラクトース認識レクチン群、 GalNAcは N-ァセチルガラタトサミン認識レクチン群、 Ma nはマンノース認識レクチン群、 Chitinはキチン認識レクチン群を意味する。
[図 23]各糖鎖関連アレイと糖鎖の結合の様子を示す模式図である。 A：レクチンァレ ィ、およびプローブとして糖鎖を用いた場合の、アレイに対するプローブの結合状態 を示す模式図である。 B :レクチンアレイ、およびプローブとして糖タンパク質を用いた 場合の、アレイに対するプローブの結合状態を示す模式図である。 C :糖ペプチドァ レイ、およびプローブとしてレクチンを用いた場合の、アレイに対するプローブの結合 状態を示す模式図である。分画したペプチド上の糖鎖構造の類推に用いることがで きる。 D :糖タンパク質アレイ、およびプローブとしてレクチンを用いた場合の、アレイ に対するプローブの結合状態を示す模式図である。 E :抗体アレイ、およびプローブ としてレクチンを用いた場合の、アレイに対するプローブの結合状態を示す模式図で ある。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、糖鎖あるいは複合糖質と糖鎖結合性タンパク質との相互作用を測定し、 糖鎖あるいは複合糖質を解析する装置に関する。本発明の装置は、試料中の糖鎖 あるいは複合糖質あるいはこれらを含有する試料の解析装置であって、糖鎖結合性 タンパク質を複数種配置固定した導光性材料からなる基板と、該基板の側部端面に 光を導入し、該基板表面にエバネッセント波を発生させて蛍光標識を励起する手段 と、該手段により生じた蛍光の強度を上記糖鎖結合性タンパク質の配置位置毎に測 定する蛍光強度測定手段とを有する。
本発明の装置による解析対象となる糖鎖あるいは複合糖質については特に制限は ないが、糖鎖としては、例えば、糖タンパク質系糖鎖（N-結合型糖鎖と〇-結合型糖 鎖）、糖脂質系糖鎖、グリコサミノダリカン系糖鎖、又は多糖類由来オリゴ糖鎖などが 挙げられる。又、 1)N -結合型糖鎖としては、高マンノース型 ·混成型 ·複合型からなる N-結合型糖鎖など、 2)0-結合型糖鎖としては、ムチン型（〇-GalNAc) '〇_Fuc型 ·0 -Man型 'O-Glc型などからなる〇_結合型糖鎖など、 3)糖脂質系糖鎖としては、ガン ダリオ系列 ·グロボ系列 'ラタト'ネオラクト系列糖鎖など、 4)グリコサミノダリカン系糖鎖 としては、ヒアルロン酸 ·ケラタン硫酸 ·へパリン'へパラン硫酸 'コンドロイチン硫酸 ·デ ルマタン硫酸など、 5)多糖類由来オリゴ糖鎖としては、キチン、セルロース、カードラ ン、ラミナリン、デキストラン、デンプン、グリコーゲン、ァラビノガラタタン、アルギン酸、 フルクタン、フコィダン、キシランなどに由来するオリゴ糖鎖などが例示できる。
[0021] その他の糖鎖としては、 M3'M5A'Hybrid (monoagalacto,bisect) - NA1 · NA1( a 1-6F uc)«NA2 (monoagalacto)«NA2 (monoagalacto, bisect) ·ΝΑ2·ΝΑ2 ( a l_6Fuc)'A2'N A2 (bisect) -NA3-NA3 ( a l-6Fuc)-NA4-NA4 ( a 1— 6Fuc)'NA5 (pentaagalacto, bise ct) · Lactose · GA2 · GA1 · GM3- NeuAc · GM3- NeuGc · GM 1 · GM2 · GD la · GD lb · GD3 · Gb3 · Gb4 · Forssman · LNnT · LNT · Galili pentasaccharide · B-hexasaccharide · LNFP-I •LNFP-II (Lea).LNFP- III (LeX) · LNFP- II (Leb) - A-hexasaccharide - A-heptasaccharid e*B_pentasaccharide*り—Sialyl lactose *pLNH* β GalLac · β Gal Lac *LN3*GN3*GN
4 · maltotriose · Sialyl LeXなどを挙げることができる。
[0022] また、本発明において、複合糖質とは、糖鎖を持つ生体内高分子の総称である。本 発明の複合糖質としては、糖タンパク質 (糖ペプチドも含む）、プロテオダリカン、糖脂 質が挙げられる。
基板に固定する糖鎖結合性タンパク質としては、例えばレクチンが好ましぐレク チンとしては、動'植物、真菌、細菌、ウィルスなどから得られる様々な分子家系に属 するレクチン、すなわち、細菌を含むすべての生物界で見出されるリシン B鎖関連の「 R型レクチン」、真核生物全般に存在し糖タンパク質のフォールデイングに関与する「 カルネキシン'カルレティキュリン」、多細胞動物に広く存在し、「セレクチン」、「コレク チン」等代表的なレクチンを多く含むカルシウム要求性の「C型レクチン」、動物界に 広く分布しガラクトースに特異性を示す「ガレクチン」、植物豆科で大きな家系を形成 する「豆科レクチン」、およびこれと構造類似性をもち動物細胞内輸送に関わる「L型 レクチン」、リソソーム酵素の細胞内輸送に関わるマンノース 6-リン酸結合性の「P型レ クチン」、グリコサミノダリカンをはじめとする酸性糖鎖に結合する「ァネキシン」、免疫 グロブリン超家系に属し「シグレック」を含む「I型レクチン」などが挙げられる。
[0023] その他のレクチンとしては、 ACA (センニンコクレクチン） -BPL (ムラサキモクワンジュ レクチン） ' ConA (タチナタマメレクチン) ' DBA (Horsegramレクチン) ' DSA (ヨウシュチ ヨウセンアサガオレクチン) ' ECA (ディゴマメレクチン) ' EEL (Spindle Treeレクチン) ' G NA (ユキノハナレクチン) ' GSL I (グリフォニアマメレクチン) ' GSL II (グリフォニアマメ レクチン) 'HHL (ァマリリスレクチン) 'ジャカリン (ジャックフルーツレクチン) 'LBA (リマ マメレクチン) 'LCA (レンズマメレクチン) 'LEL (トマトレクチン) 'LTL (ロータスマメレク チン) ·ΜΡΑ (アメリカハリグヮレクチン) ·ΝΡΑ (ラッパズイセンレクチン) ·ΡΗΑ- Ε (インゲ ンマメレクチン) ·ΡΗΑ- L (インゲンマメレクチン) ·ΡΝΑ (ピーナッツレクチン) 'PSA (ェン ドウレクチン) 'PTL-I (シカクマメレクチン) 'PTL-II (シカクマメレクチン) 'PWM (ヨウシ ュャマゴボウレクチン) RCA120 (ヒママメレクチン) ' SBA (ダイズレクチン) ' SJA (ェンジ ユレクチン) ' SNA (セィヨウニヮトコレクチン) ' SSA (二ホンニヮトコレクチン) ' STL (ジャ ガイモレクチン) 'TJA-I (キカラスゥリレクチン) 'TJA-II (キカラスゥリレクチン) 'UDA (C ommon Stinging Nettleレクチン） 'UEA I (ハリエニシダレクチン） 'VFA (ソラマメレクチ ン) 'VVA (ヘアリーべッチレクチン) 'WFA (フジレクチン) 'WGA (パンコムギレクチン） などを挙げることができる。
[0024] また基板に固定するレクチンは、上記レクチンを部位特異的変異導入や化学修飾 などの方法で物性や結合特異性、および親和力などを改変したものも挙げられ、本 明細書でいうレクチンとしてはこのようなレクチン変異体も包含する。さらに本発明は 抗原 抗体反応などに比べ比較的弱い糖鎖—タンパク質間の相互作用を解析する ことを可能にする装置であり、相互作用の弱い糖鎖結合性タンパク質はレクチンに限 定されるものではなレ、。すなわち一般的に相互作用の弱レ、糖鎖認識抗体（例えば Ig Mクラスに分類される糖鎖認識抗体など)もそれに該当する。
[0025] 本発明における基板としては、導光性を有し、本発明の解析装置の光照射手段に より、その表面にエバネッセント波を発生できるものであればよぐガラス、石英ガラス 、合成石英ガラスなどが例示できるが、これらに限定されるものではない。また、本発 明におけるレクチンが固定化された基板は、好ましくは、エポキシ基を活性基として 有する化合物であるがこれに限定されるものではなぐビュルスルホン基、活性エス テル基、アルデヒド基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、イソチオシァネート基 等がコートされた基板上にレクチン等の糖鎖結合性タンパク質が固定化された基板 である。
エポキシ基を活性基として有する化合物としては、好ましくは 3-グリシドキシプロピ ルトリメトキシシラン（GTMS)が挙げられる力 これに限定されなレ、。その他に、 2-(3,4 エポキシシクロへキシノレ)ェチノレトリメトキシシラン、 3-グリシドキシプロピノレメチノレジェ トキシシラン、 3-グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、又は分岐したスぺーサ一の 先端にエポキシ基を複数持つシランカップリング化合物で、好ましくはスぺーサ一と してポリエチレングリコールやタンパク質、ビォチン.アビジン等を含む化合物などが 例示できる。
[0026] 本発明の糖鎖あるいは複合糖質の解析に用いる基板は、レクチン等の糖鎖結合性 タンパク質がその表面に複数種配置固定化された基板であり、例えば、下記の方法 で作製できる。
以下に糖鎖結合性タンパク質としてレクチンを使用する場合を例にして説明する。
[0027] まず、基板にエポキシ基を活性基として有する化合物をコートする。例えば、ェポキ シ基を活性基として有する化合物として GTMSを用いる場合、後記する実施例に記載 の方法で行うことができる。具体的には、スライドガラスを 10% KOH I MeOH溶液に浸 し、容器ごと振盪させた状態で 1時間放置しガラス表面を処理し、これを十分量の精 製水（ミリ Q水）により洗浄した後、 60°Cのオーブン内で乾燥させる。次にスライドガラ スを 2% GTMSアセトン溶液に浸し、遮光下で容器ごと振盪させながら 1時間反応させ る。 GTMSのアルコキシシリル基は水で加水分解されてシラノール基となっており、こ のシラノール基は不安定で、経時変化により部分的に結合してオリゴマー状態になり 、続いてガラス表面に水素結合的に吸着する。反応後、スライドガラスを 110°Cのォー ブン内で 8時間乾燥させる。乾燥処理により、ガラス表面のシラノール基と脱水縮合 反応が起こり、強力な共有結合となる。一連の GTMSコーティング方法を図 1に示す。
[0028] 次に、エポキシ基を活性基として有する化合物をコーティングした基板に、レクチン をスポットし、該レクチンのアミノ基を利用して反応させることで固定化することができ る。本発明においては、同一基板上に複数種のレクチンをスポットする。
また、この際、複数種のレクチンは、その種類に応じて所定のパターンでスポットす ることにより配置固定することが望ましい。これにより、試料の糖鎖あるいは複合糖質 間の、あるいは既知の糖鎖あるいは複合糖質との異同判定、近似性判定が容易に 行える。
アレイの作製においては、市販の DNAマイクロアレイ作製用ピンタイプスポッターや 非接触式インクジェットスポッターが利用できる。レクチンのスポット後は Tween20を含 む PBS溶液 (PBST)で洗浄することにより、未結合レクチンを除去することができる。
[0029] 上記レクチンが固定化された基板は、複数の反応槽を形成させた基板であることが 好ましい（図 2参照）。より好ましくは、複数の穴を有するラバーを貼り付けることで、複 数の反応槽を形成させた基板である。一例としては、実施例に記載のように、糖鎖に 相互作用を示すタンパク質を固定化したスライドガラスに対し、本発明者らが設計'開 発した 8穴ラバーを所定の位置に貼り付け、 8つの反応槽を作製させる。この 8穴ラバ 一には 8つの長方形の穴が規則正しく空いており、専用のアジヤスター上でスライドガ ラスと密着させることによってスポット周囲に正確に蛍光標識化糖プローブ溶液を満 たすことが可能となる。この反応槽に蛍光標識化プローブ溶液を満たすことで、糖鎖 に相互作用を示すタンパク質との接触を円滑に行うことが可能になる。また反応槽は 多数化することが好ましぐより好ましくは 12， 16の反応槽を市販の 96， 384ゥヱルプレ ートの規格と同じ間隔をおいて配置することが好ましい。また、この反応槽を形成する 素材はシリコンラバーに限定されるものではなぐ例えばガラス表面の非スポット領域 を撥水コートすることで反応場を形成することや 96ゥエルプレート規格の容器を利用 することも可能である。
一方、本発明の基板においては、同一種のレクチンを複数配置固定化することが 望ましい。これにより同一種のレクチンに対する被験糖鎖あるいは複合糖質の相互 作用に基づく蛍光強度の平均値を算出することが可能となり、スポットの大きさ'形状 の不良や、基盤の不均一性に由来するレクチンの固定化量の相違、あるいはスポット に結合した標識プローブ分子数、励起光の不均一性や検出素子の電気的雑音等に 由来する、測定したスポットシグナル強度のバラツキ等に起因する測定誤差を軽減で きる。
また、本発明の基板においては、糖タンパク質を解析する際に、レクチン等の糖鎖 結合タンパク質を複数種配置固定するとともに、さらに糖タンパク質のタンパク質部分 に対する抗体を配置固定することができる（ハイブリッドアレイの作製)。この基板によ れば、糖タンパク質の糖鎖部分の解析とタンパク質部分の解析を同時に行うことがで きる。これによれば、タンパク質が異なるが糖鎖が同じもの、あるいは糖鎖が異なるが 同じタンパク質であるもの等を簡便に識別できる。
図 3は本発明の解析装置の一例を示す図である。
この装置は、レクチン等の糖鎖結合性タンパク質を複数種配置固定した導光性材 料からなる基板（1)と、該基板の側部端面に光を導入し、該基板表面にエバネッセン ト波を発生させて蛍光標識を励起する手段（2)、（2' )と、該手段により生じた蛍光の 強度を上記糖鎖結合性タンパク質の配置位置毎に測定する蛍光強度測定手段（3) とを有し、基板（1)は、基板載置手段 (4)上に着脱自在に載置され、基板載置手段 は、基板上に生じた蛍光を遮蔽することなぐ蛍光強度測定手段に導くため、枠体か らなることが好ましい。上記蛍光標識励起手段（2)、（2' )は基板端面に面して設けら れる。エバネッセント波は、物質境界面で光が全反射するとき発生するが、この全反 射させるための入射角は、物質 ·材料によって異なる。本発明においては種々の材 料基板に対応するよう入射角度を調製するため、上記蛍光標識励起手段（2)、 (2' ) は、基板側部端面に対する光導入角度を調節可能に設ける。 また、蛍光標識励起手段は、基板上に配置固定される糖鎖結合性タンパク質の列 が少ない場合、例えば 1列の場合には該列に直交する基板端面側の片方にのみ設 ければよいが、糖鎖結合性タンパク質の列が多数の場合は、例えば基板両側に設け て、基板表面に均一なエバネッセント波を発生することが好ましい。蛍光標識励起手 段（2)、（2' )が基板端面に導入する光の種類は、例えばレーザーや LD、 LEDより得 られるパルス'又は連続した単色光、又はメタルハライドランプ、キセノンランプ等によ り得られるそのままの白色光や、これを光学フィルタ一により任意の波長範囲に切り 出した光を用いることができる。 蛍光強度測定手段（3)としては、特に制限はなぐ電荷結合素子 (CCD)カメラ、ィメ ージインテンシファイア一付電荷結合素子（ICCD)カメラ、冷去 PCCDカメラ、光電子増 倍管 (PMT)を使用することもできる。
[0031] エバネッセント波の励起により基板（1)上に生じた蛍光の強度を測定する場合、蛍 光強度測定手段（3)上にぉレ、て、基板載置手段 (4)を移動させて糖鎖結合性タンパ ク質固定化基板全面を例えば XY方向に動かしてスキャンするが、この場合基板（1) を固定し蛍光強度測定手段（3)を移動してスキャンしてもよい。
以下に、本発明の上記解析装置を用いて、被験糖鎖あるいは被験複合糖質を解 析する場合について具体的に説明する。
[0032] 本発明においては、まず、上記複数種のレクチン等の糖鎖結合性タンパク質を配 置固定した基板（1)を基板載置手段 (4)に載置し、該基板（1)上に、蛍光標識した 被験糖鎖または被験複合糖質含有試料を導入し、基板（1)上の各糖鎖結合性タン パク質と蛍光標識した被験糖鎖または被験複合糖質を接触させる。
[0033] 本発明において、被験糖鎖または被験複合糖質の蛍光標識剤としては、 2-アミノビ リジン、 Cy3、 Cy3.5、 Cy5、テトラメチルローダミン、フルォレセイン骨格を持つ蛍光色 素各種、モレキュラープローブス社製蛍光色素 Alexaシリーズ、量子ドット蛍光色素が 挙げられるが、糖鎖を蛍光標識する性質を有する物質であれば、これらに限定され ない。 [0034] 被験糖鎖又は被験複合糖質は、直接的又は間接的に蛍光標識することができる。 被験糖鎖と、予め蛍光標識した糖鎖結合性タンパク質を結合させることにより、被験 糖鎖を間接的に蛍光標識できる。
[0035] また、予め蛍光標識したタンパク質であって、被験複合糖質の糖鎖以外の部分に 結合するタンパク質 (例えば被験複合糖質の糖鎖以外の部分に相互作用を示す抗 体)と被験複合糖質を結合させることにより、被験複合糖質を間接的に蛍光標識でき る。
[0036] また、予め蛍光標識した糖鎖結合性タンパク質と被験複合糖質を結合させることに よっても、被験複合糖質を間接的に蛍光標識できる (この場合、被験複合糖質が有 する糖鎖のうち、糖鎖結合性タンパク質が結合した糖鎖以外の糖鎖が基板に結合す る)。
[0037] 例えば、標的複合糖質の糖鎖以外の部分に相互作用を示す予め蛍光標識した抗 体を、標的複合糖質試料を含むサンプル ·血液 ·体液 ·生体抽出成分 ·食品成分等 のクルードな試料に作用させることで、クルードな試料力 標的複合糖質を分離 ·精 製することなく選択的に蛍光標識できる。また、予め蛍光標識した上記抗体を作用さ せたクルードな試料を、例えばレクチン等の糖鎖結合性タンパク質が固定化された 基板に接触させることで、標的複合糖質の糖鎖情報だけを選択的に観察できる。
[0038] 本発明の装置を使用する場合においては、次いで、基板（1)を洗浄せずに、蛍光 標識励起手段（2)、（2 ' )から該基板の側部端面に光を導入し、該基板表面にエバ ネッセント波を発生させて、被験糖鎖あるいは複合糖質の蛍光標識基を励起する。
[0039] エバネッセント励起方式では励起光をガラス内部で全反射させた際に界面から 200 〜300 nm (励起波長の半分程度）の範囲に、エバネッセント光と呼ばれる微弱光がし み出すことが知られている。蛍光物質で標識した糖鎖あるいは複合糖質を含む溶液 をスライドガラス上に接触させた状態でこのエバネッセント光を利用して蛍光標識基 を励起すると、ブラウン運動をしている蛍光標識分子すなわち結合反応に預からない 分子をほとんど励起することなぐ結合反応に預力^)界面近傍のプローブ分子を選択 的に観察することができる。 例えば、基板に固定されたレクチンあるいは IgMクラス等の糖鎖認識抗体と被験糖 鎖又は被験複合糖質の相互作用は、一般的に良く知られているタンパク質間相互作 用などに比べて弱いため、プローブ溶液の除去 ·洗浄操作を行うことで、これらの糖 鎖結合性タンパク質と被験糖鎖または被験複合糖質間の解離反応が進行してしまい 、平衡状態下での正確な相互作用情報を得ることが出来ないケースが生じていた。
[0040] 本発明者らは上記問題を、プローブ溶液の洗浄を行うことなぐエバネッセント波に より蛍光標識基を励起させ、蛍光の強度を測定することで解決したものである。また 洗浄工程を経ずにスキャンできるため、一定時間ごとに連続的にスキャンを実行する ことで、プローブ添加直後から相互作用の経時変化を追跡することが可能となり、同 一ガラス上に固定化されている各糖鎖結合性タンパク質とプローブ間の相互作用反 応がそれぞれ平衡状態に達しているか否かを容易に判断することができる.
[0041] 上記エバネッセント波による励起により生じた蛍光は、蛍光強度測定手段（3)により 、基板上の各糖鎖結合性タンパク質の配置位置毎にその蛍光強度が測定される (複 数種のレクチンを基板に配置固定した場合、各レクチンの配置位置、すなわちレクチ ンの種類毎に蛍光強度が測定される）。例えば、被験糖鎖の各レクチンに対する蛍 光強度と、同様に測定した既知の糖鎖の各レクチンに対する蛍光強度を対比すれば 、その異同、類似性、非類似性等を判定できる。
この場合、例えば蛍光強度手段として ICCDカメラ上で基板をスキャンし、各レクチ ンに対する蛍光強度を画像として表示すれば、対比がさらに容易になる。
本発明は、糖鎖構造解析を迅速 ·簡便に行う糖鎖プロファイラ一としての有用な手 段である。これには、例えば、蛋白質核酸酵素 2003年 8月号増刊 Vol. 48, NO. 11に 記載のプロフアイリング手法が応用可能である。
[0042] すなわち、本発明の装置における上記蛍光強度の測定値は、コンピューターによる 情報処理を行うことにより、糖鎖構造分析に用いられる。したがって、本発明の装置 にはこのようなコンピューターによる情報処理システムを包含する。このような情報処 理を行うことにより、被験糖鎖が既知構造を有している場合は被験糖鎖の構造を同 定することができ、被験糖鎖が未知構造を有している場合であっても被験糖鎖中に 存在する特徴的な構造（ α 2-3シアル酸 · α 2-6シアル酸 · α 1_3ガラクトース' a 1-3フ コース. α 1-6フコース'バイセクト Ν-ァセチルダルコサミン'硫酸化など）の予測、ない し既知構造糖鎖との類似性を指摘することができる。
この手段は、蛍光標識した被験糖鎖を接触させた、糖鎖あるいは被験糖鎖に相互 作用を示す複数種の糖鎖結合性タンパク質、例えば複数種のレクチンがそれぞれ配 置固定化された基板を装置にセットすると、 自動的に、糖鎖構造が表示されるシステ ムである。
このようなシステムを有する装置においては、糖鎖に相互作用を示す種々のタンパ ク質がそれぞれ固定化された基板に蛍光標識した被験糖鎖を接触させる工程を自 動化することもできる。すなわち、微小流路系を基板上の反応槽に導き、流路内に送 液する溶液の種類 '濃度'流速をコントロールすることで、ブロッキングやブロッキング 液の洗浄除去工程、蛍光標識糖鎖溶液の接触工程を一元的にコントロールすること ができる。これらの方法を用いることで、さらに信頼度の高いデータを得ることができ るため、大変に有用である。
また本発明の装置による被験糖鎖の部分糖鎖構造を推定する場合、糖質加水分 解酵素による酵素消化を併用することで、より信頼度の高いデータを得ることができる 。例えば、被験糖鎖の非還元末端部分糖鎖構造にシアル酸が含まれているかどうか 、さらに含まれてレ、る場合その結合位は α 2-3および α 2_6のレ、ずれであるかを判定 する場合、被験糖鎖を特異性の高いシァリダーゼ（例えば Macrobdella decora由来 α 2-3-ノィラミニダーゼは α 2-3シアル酸のみを切断し、 Arthrobacter ureafaciens由来 シァリダーゼ Aは α 2-3シアル酸よりも α 2_6シアル酸を好んで切断する）で消化し、 反応前後のプロファイルの変化の有無を調べることで、容易に行うことができる。さら に多種の糖質加水分解酵素を逐次反応させることで、より広範囲な部分糖鎖構造を 推定することが可能になる。ガラス上に 8つの反応槽を作製することで、 8通りの酵素 消化反応物を同時にプロファイルすることが可能になり、糖鎖構造推定がより容易に なる。
酵素消化による部分糖鎖構造推定に用いることのできる糖質加水分解酵素は、ほ 力、に Jack Bean由来 /3 -ガラクトシダーゼ、 Green Coffee Bean由来ひ（1_3,4，6)-ガラク トシダーゼ、 Streptococcus pneumoniae由来 j3 _N_ァセチノレへキソサミニダーゼ、トリ 肝臓由来ひ- N-ァセチルガラタトサミニダーゼ、 Jack Bean由来 α (1-2,3,6)マンノシダ ーゼ、 Helix pomatia由来 マンノシダーゼ、ゥシ腎臓由来 α _フコシダーゼ、 Coryneb acterium sp.由来ひ 1,2_L-フコシダーセ、 Xanthomonas sp.由来 β 1,2—キシロシター ゼ、およびそれらすベての組換え体などが挙げられる。
また被験糖タンパク質中の Ν結合型および α結合型糖鎖の存在およびその構造推 定を行う場合、エンド型糖質加水分解酵素を併用すると、より構造推定のデータの信 用度が高くなる。この際に使用できるエンド型糖質加水分解酵素は、 Streptomyces pi icatus由来ェントクリコ、ンダーゼ H、 Flavobacterium meningosepticum由来 PNGase F、 streptococcus pneumoniae由 0-ク、リカァ1 ~ "t 、し hryseobactermm memngosepticu m由来エンドグリコシダーゼ Fl、およびそれら全ての組換え体などが挙げられる。
[0043] 図 4に本発明の情報処理システムの一例を示す。
該システムは、以下の（a)〜（c)の手段を少なくとも含む。
(a)構造既知の各糖鎖あるいは複合糖質について、本発明の上記解析装置を用い て測定された、糖鎖結合性タンパク質、例えば、レクチンの配置位置毎（レクチンの 種類毎）に蛍光強度データを強、中、弱等の 3段階あるいは 6段階等に段階分けして
、各糖鎖結合性タンパク質に対する相互作用をパターンィ匕して記憶した記憶手段（ データベース）。
(b)被験糖鎖あるいは被験複合糖質に対して本発明の上記解析装置を用いて測定 された、基板上の各糖鎖結合性タンパク質の配置位置毎の蛍光強度側定データと、 (a)の記憶手段に記憶されているデータと照合し、測定データあるいは上記パターン がー致あるいは類似する構造既知の糖鎖あるいは複合糖質を 1つないし複数選定す る演算手段を含むコンピューター
(c)選定結果を表示する表示手段
なお、以下の記載においては、上記測定データあるいは上記パターン化した情報 を合わせて蛍光強度情報とレ、う場合がある。
[0044] このシステムにおけるデータベースについては、図 5のようにコンピューターの外部 にある場合、図 6のようにコンピューター内部にある場合、共に許容される。また、該 データベースを利用することで、蛍光強度を測定した糖鎖結合性タンパク質の種類 が限定された数であっても、多種類の糖鎖を識別することが可能である。例えば、測 定したシグナル強度を 6段階に分けて認識する場合、十分に性質の異なる 10種類の レクチンを利用すれば、理論的には識別可能な糖鎖の種類は 61Q=60，466,176となり 、事実上自然界に存在する殆どの糖鎖構造の識別が可能である。
[0045] 図 7に、本発明のシステムにおけるコンピューター構成図の一例を示す。入力手段 1と出力手段 2がバス線 3に接続されている。一時記憶手段 4は、入力された情報、お よび算出された情報などを一時的に記憶する。中央処理装置 (CPU) 5は、本発明の プログラムの命令を受けて各種演算を行う。記憶手段（データベース） 7には、既知の 糖鎖あるいは複合糖質についての各糖鎖結合性タンパク質の蛍光強度データある いは上記と同様なパターン化情報が記憶されている。
このほか、他の実験系によって得られた、糖鎖あるいは複合糖質と糖鎖結合性タン パク質との結合性に関する情報を記憶してもよい。
[0046] 記憶手段 6には、本発明の処理を実行するためのプログラムを含む各種プログラム が格納されている。本発明の処理を実行するためのプログラムには、入力された糖鎖 あるいは複合糖質についての各糖鎖結合性タンパク質の蛍光強度データあるいは そのパターンィ匕情報を、データベースに記憶されている既知の糖鎖あるいは複合糖 質についての同様な蛍光強度情報あるいはそのパターン化情報と照合し、データな ぃレ ターンが一致あるいは類似する構造既知糖鎖（データベースに格納されてい る構造既知糖鎖情報）を 1つないし複数選出するプログラム 61、表示プログラム 62、 およびこれらを制御するためのプログラム 63が少なくとも含まれる。
[0047] 上記したことから明ら力、なように、既知糖鎖あるいは複合糖質との蛍光強度データと そのパターンィ匕情報の照合過程においては、データの値同士を比較してもよい。プ ログラム 61には、例えば、入力された蛍光強度データの値とデータベースに記憶さ れている既知糖鎖あるいは複合糖鎖情報の値を比較して、その値の近さから構造既 知糖鎖を 1つなレ、し複数選出する機能が組み込まれてレ、てもよレ、。
[0048] プログラム 62 (図 8)は、例えば、被験糖質あるいは複合糖質について得られた各ス ポットの平均蛍光強度データや、シグナルノイズ比 (S/N比）とそのばらつき '標準偏 差、該蛍光強度から算出した正味輝度値とこれをパターンィ匕したパターン化情報（図 9)、選出された構造既知糖鎖情報の表示などを行う。このパターン化に際しては、適 切な内部標準を用いて相互作用情報の規格化を行うことも可能である。
本発明においては、上述のプログラムを 1つのプログラムにまとめることもできる。
[0049] 本発明の解析装置においては、レクチン固定基板（1)を、複数枚解析装置にセット して、自動的に順次、蛍光強度測定部に移行させ、蛍光標識励起手段（3)を作動さ せて、スキャンし、得られた蛍光強度データを自動的にコンピューターに入力するよう にしてもよい。入力されたデータは、コンピューターの記憶手段又は一時記憶手段に 記憶しておくことができる。また、蛍光強度データあるいはこれをパターン化したパタ ーン化情報は、被験糖鎖あるいは複合糖質の由来等の情報とともにデータベースに 記憶するのが好ましい。さらに糖鎖構造が判明次第順次構造情報も蓄積することに より、今まで存在しえなかった大規模かつ実用性の高い、糖鎖あるいは複合糖質と各 種糖鎖結合タンパク質の結合状態に基づく糖鎖構造解析のための情報データべ一 スを構築することができる。
[0050] 本発明によれば、中央処理装置 (CPU)などの演算手段が記憶手段中に格納され たプログラム 62の指令を受け、記憶手段又は一時記憶手段に記憶された蛍光強度 情報を読み出し、該蛍光強度情報を表示することもできるが、例えば、あらかじめ性 状を十分に調査した基準となる糖鎖に相互作用を示す特定の糖鎖結合性タンパク 質試料スポット（内部標準スポット）の発する蛍光強度を基準として、各スポットの輝度 値を補正した値を表示することができる。内部標準スポットは複数であってもよレ、。
[0051] 処理のフローの一例としては、次いで、入力された蛍光強度情報を、データベース に記憶されている各糖鎖結合性タンパク質に対する各種糖鎖の蛍光強度情報と照 合し、パターンが一致する構造既知糖鎖を 1つないし複数選出する。この処理工程は 、中央処理装置（CPU)などの演算手段が記憶手段中のプログラム 61の指令を受け 、記憶手段又は一時記憶手段に記憶された蛍光強度情報とデータベースに格納さ れている既知糖鎖あるいは複合糖質についての蛍光強度情報を照合し、情報のパ ターンが一致ないし近似する構造既知糖鎖を 1つないし複数選出する。選出された 構造既知糖鎖情報は、コンピューターの記憶手段又は一時記憶手段に格納しておく こと力 Sできる。
[0052] データベースがコンピューターの外部にある場合は、中央処理装置（CPU)などの 演算手段が記憶手段中のプログラム 61の指令を受け、データベースに記憶されてい る既知糖鎖あるいは複合糖質についての蛍光強度情報をコンピューターに入力し、 コンピューターの記憶手段又は一時記憶手段に記憶された蛍光強度情報を読み出 し、それぞれの蛍光強度情報を照合し、情報のパターンが一致する構造既知糖鎖を 1つないし複数選出する。
[0053] 処理のフローの一例としては、次いで、選出結果が表示手段によって表示される。
この処理工程では、中央処理装置（CPU)などの演算手段が記憶手段中のプロダラ ム 62の指令を受け、記憶手段又は一時記憶手段に格納された構造既知糖鎖情報を 読み出し、表示する。
[0054] 本発明は、異なる複合糖質の混合物中から、 目的としたタンパク質の糖鎖修飾の 状況を迅速かつ簡便に調べる方法として有用であり、血液 ·体液 ·生体抽出成分 ·食 品成分等の原液又は希釈溶液等の様々な成分の混合溶液を精製することなぐ 目 的タンパク質の糖鎖修飾の状況を観察することで、診断'治療状況の把握等を行うよ うな分野での応用が考えられる。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書 に組み入れられる。
以下に本発明の実施例を示す。該実施例は、図 3に示す本発明の解析装置を使 用して、実際に糖鎖を解析したものである。なお、解析装置の外観は図 10の装置写 真に示される。 実施例
[0055] 以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例 に制限されるものではない。
〔実施例 1〕レクチンアレイを利用した糖鎖とレクチンとの相互作用解析
( 1 )蛍光標識化糖タンパク質プローブ (Cy3_ASF)の調製
蛍光標識化糖タンパク質プローブとして、ァシァ口フェツイン（SIGMA社、以下 ASF) を 550 nm付近に吸収極大波長を持つ蛍光色素である Cy3 Mono-reactive Dye (アマ シャムフアルマシア社、以下 Cy3)を用いて蛍光標識化して調製した。 ASFは N-結合 型糖鎖と 0-結合型糖鎖を 3本ずつ分子中に持ち、かつ糖鎖中の非還元末端のシァ ル酸キャップが部分的に外れている糖鎖構造を持つことが知られている。 ASFを 0. 1 M炭酸緩衝液（pH 9.3)に終濃度 1 mg/mLになるよう調製した後、 1 mLについて 1.0 mgの Cy3粉末と混合させ、 1時間、適時攪拌しながら喑所で反応させた。
[0056] 次に担体として S印 hadex G-25を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより、遊離の C y3と Cy3_ASFを分離回収し、精製した Cy3_ASFについて吸光光度計を用いて濃度 及び蛍光標識効率を測定した。タンパク質ベースの収率は 35-40%、蛍光標識効率（ 1タンパク質分子あたりの蛍光色素数）は約 3.0であった。
[0057] ( 2)スライドガラスへの GTMSコーティング
エポキシ基を活性基として有する 3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン (信越シリ コーン社、以降 GTMS)をコーティングしたスライドガラス（図 1 )を用レ、、レクチンをガラ ス表面に固定化した。 GTMSコーティングは、松浪硝子工業社製のスライドガラスを用 レ、、以下の手順で行った。スライドガラスを 10% KOH I Me〇H溶液に浸し、容器ごと 振盪させた状態で 1時間放置しガラス表面を処理した。これを十分量の精製水 (ミリ Q 水）により洗浄した後、 60°Cのオーブン内で乾燥させた。次にスライドガラスを 2% GT MSアセトン溶液に浸し、遮光下で容器ごと振盪させながら 1時間反応させた。反応 後、 1 10°Cのオーブン内で 8時間乾燥させた後、十分量の精製水により洗浄し、乾燥 させた。
[0058] ( 3)スライドガラスへのレクチンの固定化
( 2)の GTMSコーティングを施したスライドガラスにレクチンをスポットした。マイクロア レイスポッターとして日本レーザ電子社製 STAMPMANを使用し、先端直径 0.40mmの スタンプピンを使用してスポットを行ことで、直径約 0.6-0.7mmのスポットをスライドガラ ス上に配置した。スポットする各レクチンを濃度 lmg/mL (レクチンによっては一部 0.25 mg/mL)となるようにリン酸緩衝生理食塩水、 pH7.4 (以下 PBS)に溶解した。これを 96 穴の PCR用マイクロタイタープレート（コーユング社）の各反応槽に 10 μ Lずつ分注し たものを、マイクロアレイスポッターにセットした。
[0059] スライドガラスへのレクチンの固定化操作に際しては、以下の条件をマイクロアレイ スポッター付属のコンピューターに記憶させ、スタンプピン動作プログラムを実行させ た。まずスタンプピンを 96穴 PCR用マイクロタイタープレート内の固定化試料溶液中 に 1秒間浸した後に引き上げ、スライドガラス表面の所定の位置に 1秒間接触させた。 この動作を 1スポットごとに繰り返しながら、同一試料溶液から横 1列に 4点スポットを 行った後、スタンプピンの洗浄工程を行った。洗浄工程ではスタンプピンの針先を 0.0 5% SDS溶液に 2秒間浸し、スタンプピンをバキューム装置内で 15秒間乾燥させ、さら に精製水に 2秒間浸した後に、バキューム装置内で 15秒間乾燥、最後にエタノール に 2秒間浸してからバキューム装置内で 15秒間の乾燥操作を行った。
[0060] 本実施例では様々な糖結合特異性をもったレクチン 4種 (RCA120、 SSA、組み換え 放線菌由来キシラナーゼのキシラン結合ドメイン（以下 XBD)、組み換えミミズ 29 kDa レクチン由来の C末端側ドメイン（以下 EW29 (Ch) )と、ネガティブコントロール 1種 (ゥ シ血清アルブミン（以下 BSA) )の計 5種のタンパク質をスポットした。 RCA120、 BSAに ついては SIGMAより購入したもの、 SSAは生化学工業より購入したもの、 XBD, EW29 ( Ch)については本発明者らの研究室で大腸菌にて発現 '精製したものを用いた。
[0061] (4)非スポット面のブロッキング
レクチン溶液をスポット処理後 1時間反応させガラス表面に固定化した後、未結合 レクチンを洗浄した。洗浄は 0. l%Tween20を含む PBS溶液 (PBST)を数回ピペットでス ライドガラスに吹き付けるようにかけて洗浄した後、 PBSを用いてさらに十分に洗浄し た。
[0062] このレクチン固定化後のスライドガラスに対し、本発明者らが設計 '開発した 8穴ラバ 一を所定の位置に貼り付け、 8つの反応槽を作製した（図 11)。この 8穴ラバーは厚さ lmm力らなる黒色のシリコンゴム製で、縦横 9.5 X 7.5mmからなる 8つの長方形の穴が 規則正しく空いており、スライドガラスに貼り付けたときに 8つの反応槽を形成すること ができる。この反応槽に 50 し程度の試料をカ卩えれば、内部を十分量の試料溶液で 満たすことができる。
[0063] レクチンをスポットした領域以外のガラス表面には活性基であるエポキシ基が残存 しているため、非スポット面に対するブロッキング操作を行った。なお、ブロッキング剤 には高純度 BSA (SIGMA)を使用した。 8つの反応槽内に 1% BSAを含む PBS溶液を 50 z Lずつ満たし、湿度を 90%以上に保った保存容器中で 4°C、 1時間放置し、スライド ガラス上の非スポット面へのブロッキングを行った。反応の間はガラス表面の乾燥防 止に留意した。
[0064] 次にスライドガラス上のブロッキング溶液を除去し、 PBSを用いて十分に洗浄した後 、水分を除去した。タンパク質固定化後はガラス表面の乾燥によるタンパク質の変性 や、乾燥に伴うバックグラウンドの上昇を防ぐため、可及的速やかに次の操作に移つ た。
[0065] (5)プローブ溶液の添加とスキャン
(4)で作製したレクチン固定化スライドガラス上の反応槽に、相互作用を解析したレヽ 蛍光標識化糖タンパク質プローブ溶液を加えた。蛍光標識化糖タンパク質プローブ は終濃度 10 μ g/mLになるよう PBSに溶解したものを調製し、それぞれの反応槽に 50 μ Lを滴下した。
[0066] レクチン-糖鎖間の反応が平衡に達するまで静置した後に、エバネッセント励起方 式マイクロアレイスキャナーである GTMAS Scan III (日本レーザ電子社）を使用してス ライドガラス端面より励起光を入射し、励起されて生じた蛍光発光を、スライドガラス下 面に配置されている ICCDカメラで検出した。スライドガラスのほぼ全面に対する蛍光 イメージをスキャンし、得られたイメージ画像を TIFFファイル形式 枚につき約 100 M B)にて保存した。スキャン時のパラメータ一は Gain「5000倍」、積算回数「4回」、露光 時間「33 msec」で統一した。
[0067] (6)スキャン画像の数値化
スキャン画像の数値化には市販のマイクロアレイ用解析ソフトである Array-Pro Anal yzer (version 4.0 for Windows (登録商標）、 Media Cybernetics社）を使用した。各ス ポットの輝度を、上記解析ソフトを用いて算出し、非スポット領域の輝度をバックグラウ ンド値とした。各スポットの輝度からバックグラウンド値を差し引いたものを正味の輝度 値とし、横列に 4点並べた同一試料由来のスポットごとに平均値と標準偏差を算出し た。
[0068] 以降各レクチン試料に対するプローブの結合に対しては、この同一試料由来の 4点 の平均輝度値を用いて評価を行った。以降に示す各レクチンアレイの性能評価は操 作（2)〜（6)の一連の工程を経た後に行われた。
[0069] (7) GTMSコートスライドガラスの性能評価
上述のように作製した GTMSコートスライドガラスの性能を、既存のスライドガラス（6 種）と比較評価した。すなわち表面コートされた各スライドガラスに、あらかじめ Cy3標 識したレクチン（100 g/mL)をアレイ状に固定化し、 (3)〜（6)の工程を経た後に、 スポッティング領域の輝度値 (S)と非スポッティング表面の輝度値 (N)から S/N比を算 出した。その結果、表 1に示すように（2)の行程で作製した GTMSコートスライドガラス の輝度値は、最高値を示したスライドガラス Aの 2分の 1程度にとどまった力 ノくッタグ ラウンドが非常に低いため、その S/Nは 16.1となり、今回評価したスライドガラスの中で 最良値を示した。
[0070] [表 1] 各スライドガラスの性能評価
100 jt g/ml Cy3 RCA- 120 in 30% glycerol/PBS
スポット 4点の平均値 ブランク 4点の平均値
S/N比
(Gain X I 000)注 (Gain x 1000)
市販スライドガラス A 60617 5971 10.2 市販スライドガラス B 52059 4013 13.0 市販スライドガラス C 36462 2865 12.7
GTMSスライドガラス 28220 1753 16.1 市販スライドガラス D 13838 4520 3.1 市販スライドガラス E 12802 3105 4.1 市販スライドガラス F 5902 1621 3.6 注)同一 Cy3欉識レクチンスポットの平均輝度値を比較 [0071] (8)アレイ上の固定化レクチン濃度の検討（図 12および 13)
RCA120と ConAはそれぞれ複合型糖鎖と高マンノース型糖鎖に対し高い親和性を もつことが知られる代表的なレクチンである。これらのレクチンを様々な濃度で調製し 、同一試料について横に 4点並べてアレイ状にスポットした。このアレイの各反応槽に 対して 10 μ g/mLの Cy3_ASFを各 50 μ Lずつアプライして結合反応を起こさせた後に 、スキャナーで蛍光を観察した。
[0072] 上述したように ASFは Ν-結合型糖鎖と 0-結合型糖鎖を 3本ずつ分子中に持ち、か つ糖鎖中の非還元末端のシアル酸キャップが外れラタトサミン構造が突出した糖鎖 構造を持つことが知られている。よって RCA120と ConAを固定化したレクチンアレイに 対し、 Cy3_ASFを添カ卩した実験系においては、 RCA120が非常に強い親和性を示し 、 ConAが弱レ、親和性を示すことが予想された。
[0073] 実験の結果、 RCA120のスポットが強い蛍光を発したのに対し、 ConAのスポットは同 条件の RCA120のスポットに比べて 1/3程度の蛍光強度を示すに止まった。 ConAが 弱いながらも複合型糖鎖を持つ ASFに結合したのは、 N-結合型糖鎖のうち ASFに主 として存在する 3本鎖型糖鎖には結合できないものの、少量存在するとされる 2本鎖 型糖鎖には結合できるためと考えられた。またこのデータから、同一試料由来の 4点 につレ、ての標準偏差 (SD)は約 ± 20%程度になるとレ、うことが分かった（図 13)。
[0074] 次にスポット時のレクチン濃度と蛍光強度の関係をグラフ化したところ、スポット時の レクチン濃度と蛍光強度の間に正の相関関係があり、スポットするレクチン試料の濃 度を 1 mg/mL以上に高濃度化することで、効果的にシグナル強度を向上することが できることが分かった。すなわち親和定数の小さい（結合の弱レ、）レクチン-糖鎖間の 相互作用の検出は固定化レクチン濃度を上げる事により可能となることが分かった（ 図 13)。
[0075] (9)レクチンアレイの性能評価
様々な糖特異性をもったレクチン 4種（RCA120、 SSA、 XBD、 EW29 (Ch) )、とネガ ティブコントロール 1種 (BSA)の計 5種のタンパク質を同一試料にっレ、て横に 4点並べ てアレイ状にスポットした。このアレイにっレ、て 10 μ g/mLの Cy3_ASFを各 50 μ Lずつ 滴下し、スキャナーで蛍光を観察した。 [0076] 実験の結果、フロンタルァフィ二ティークロマトグラフィー（FAC)でラタトサミン構造 に親和性があると確認することができた RCA120、 EW29(Ch)の 2種のレクチンのスポ ットにおいて、蛍光シグナルが観察された（図 14)。またそれぞれの蛍光強度を比較 すると、 RCA120のスポットにおいて強い蛍光力 S、 EW29(Ch)のスポットにおいては中 程度の蛍光が観察され、 FAC解析データと一致した。
[0077] また同条件のアレイに対しラタトース (競合阻害糖)共存下で同様の実験を行ったと ころ、阻害糖の濃度上昇に伴って、スポットの蛍光強度の減少が観察された（図 15) 。このこと力、ら、蛍光糖タンパク質プローブとの結合はレクチンと糖鎖間の糖特異的結 合反応によるものであることを確認することが出来た。
[0078] 〔実施例 2〕 レクチン-抗体を同一区画内にスポットしたハイブリッドアレイによる解析
(図 16)
1.材料と方法
( 1)モデル糖タンパク質の蛍光標識化プローブの調製
本実験例ではレクチンアレイ上に固定化するレクチンとして、様々な糖結合特異性 を持つレクチンとして 6種（RCA120、 ECA、 ConA、 GNA、 SSA、 SNA)を選択した。また ネガティブコントロールとして糖鎖と結合しなレ、タンパク質である BSAを選択した。また 今回の実験では、プローブのコアタンパク部分を認識する抗フェツイン抗体と抗 RNas e抗体の 2種を、レクチンと同じ区画内にスポットした。 GNA、 SNAは VECTOR社より購 入したもの、 BSAについては SIGMA社より購入したもの、 RCA120、 ECA、 ConA、 SSA は生化学工業より購入したものを用いた。
[0079] モデル蛍光標識化糖タンパク質プローブは、 ASF、 FET、ゥシ瞎由来リボヌクレア一 ゼ B (RNase B)、またネガティブコントロールとしてゥシ陴由来リボヌクレアーゼ A (RNa se A)、 BSAなどのタンパク質（全て SIGMA社より購入）を 550 nm付近に吸収極大波 長を持つ蛍光色素である Cy3 Mono-reactive Dye (アマシャムフアルマシア社、以下 Cy3)を用いて蛍光標識化することで調製した。プローブ作製時は前述のタンパク質 を 0.1 M炭酸緩衝液（pH 9.3)に終濃度 1 mg/mLになるよう調製した後、 1.0 mgの Cy3 粉末と混合させ、 1時間、適時攪拌しながら喑所で反応させ、担体として S印 hadex G- 25を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより、 Cy3標識タンパク質を精製した。
[0080] (2)スライドガラスへの GTMSコーティング
エポキシ基を活性基として有する 3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン (信越シリ コーン社、以降 GTMS)をコーティングしたスライドガラス（図 1)を用レ、、レクチンをガラ ス表面に固定化した。 GTMSコーティングは、松浪硝子工業社製のスライドガラスを用 レ、、以下の手順で行った。スライドガラスを 10%KOH/MeOH溶液に浸し、容器ごと振 盪させた状態で 1時間放置しガラス表面を処理した。これを十分量の精製水 (ミリ Q水 )により洗浄した後、 60。Cのオーブン内で乾燥させた。次にスライドガラスを 2% GTMS アセトン溶液に浸し、遮光下で容器ごと振盪させながら 1時間反応させた。反応後、 1 10°Cのオーブン内で 8時間乾燥させた後、十分量の精製水により洗浄し、乾燥させた
[0081] (3)レクチンアレイの作製
(2)で作製した GTMSコートスライドガラスに対してレクチンをスポットし、レクチンァレ ィを作製した。マイクロァレイスポッターとして日本レーザ電子社製 STAMPMANを使 用し、先端直径 0.40 mmのスタンプピンを用い、直径約 0.5 mmのスポットをスライドガ ラス上に配置した。スライドガラスへのレクチンの固定化操作に際しては、以下の条 件をマイクロアレイスポッター付属のコンピューターに記憶させ、スタンプピン動作プ ログラムを実行させた。まずスタンプピンを 96穴 PCR用マイクロタイタープレート内の 固定化試料溶液中に 1秒間浸した後に引き上げ、スライドガラス表面の所定の位置に 1秒間接触させた。この動作を 1スポットごとに繰り返しながら、同一試料溶液から横 1 列に 6点スポットを行った後、スタンプピンの洗浄を行った。洗浄工程ではスタンプピ ンの針先を 0.05% SDS溶液に 2秒間浸し、スタンプピンをバキューム装置内で 15秒間 乾燥させ、さらに精製水に 2秒間浸した後に、バキューム装置内で 15秒間乾燥、最後 にエタノールに 2秒間浸してからバキューム装置内で 15秒間の乾燥操作を行った。
[0082] (4)非スポット面のブロッキング
上記の操作でレクチンをスポットしたスライド上に、シリコンゴム製の 8穴ラバーを接 着して 8つの反応槽を作製した。この反応槽に 0.1% Tween20を含む PBS溶液（PBST) を満たすことで、スライド固層に結合しなかった余剰レクチンを洗浄 '除去した。次に 1 % BSAを溶解した PBS溶液を各反応槽に 200 /i Lずつ満たした後に、湿度を 90%以上 に保つた保存容器中で 4°C、 1時間放置することで非レクチンスポット領域のブロッキ ング操作を行った。
[0083] (5)プローブ溶液の添加とスキャン
ブロッキングを終えたスライドに対し、約 100 ng/mLに調整した各蛍光標識化糖タン パク質プローブ溶液を各反応槽に 50 μ Lずつ加えることで、アレイ上にプローブ溶液 を接触させた。
[0084] レクチン-糖鎖間の反応が平衡に達するまで静置した後に、エバネッセント励起方 式マイクロアレイスキャナーである GTMAS Scan III (日本レーザ電子社）を使用してス ライドガラス端面より励起光を入射し、励起されて生じた蛍光発光を、スライドガラス下 面に配置されてレ、る ICCD (イメージインテンシファイア一付電荷結合素子）カメラで検 出した。スライドガラスのほぼ全面に対する蛍光イメージをスキャンした後、得られたィ メージ画像を TIFFファイル形式にて保存した。スキャン時の各パラメータ一は、 Gain「 4000倍」、積算回数「8回」、露光時間「110 msec」で統一した。
[0085] (6)スキャン画像の数値化
スキャン画像の数値化には市販のマイクロアレイ用解析ソフトである Array-Pro Anal yzer Ver. 4.5 (Media Cybernetics社）を使用した。各スポットの輝度を上記解析ソフト で算出し、非スポット領域の輝度をバックグラウンド値とした。各スポットの輝度からバ ックグラウンド値を差し引いたものを正味の輝度値とし、横列に 5点並べた同一試料 由来のスポットごとに平均値と標準偏差を算出した。
以降各レクチン試料に対するプローブの結合に対しては、この同一試料由来の 5 点の平均輝度値を用いて評価を行った。
[0086] 2.結果と考察
上記の実験では多様な特異性を持つレクチンを並べたアレイを作製し、既知の糖 鎖構造を持つ糖タンパク質プローブをアプライした際の各レクチンスポットの蛍光バタ ーンから、レクチンアレイとしての性能評価を行った。また本実験では、プローブのコ ァタンパク部分の情報も同時に取得することを目指し、糖タンパク質プローブのコアタ ンパク部分を認識する抗体もレクチンと並べてスポットしたハイブリッドアレイを作製し た。モデル糖タンパク質としては、コアタンパク部分の構造は同一だが修飾糖鎖部分 の構造が異なるタンパク質として、 ASFと FETの組み合わせと、 RNase Aと RNase Bの 組み合わせを選択した。
[0087] 実験（A)、 (B)では、プローブとして用いた ASFと FETの糖鎖プロファイルを比較した
(図 16A及び B)。 FETは N-結合型糖鎖と〇-結合型糖鎖を 3本ずつ分子中に持ち、 各糖鎖構造の非還元末端が高度にシアル酸で修飾されていることが知られている。 一方、 ASFは FET糖鎖のうち末端シアル酸を酵素或いは酸処理によって除去したタ ンパク質であり、ラタトサミン構造が露出している。このため ASFプローブを用いた場 合、ラタトサミンを認識する RCA120や ECAのスポットが観察され、 FETプローブを用い た場合、シアル酸を認識する SSA、 SNAのスポットが観察されると予想された。また抗 体スポットに対しては FETも ASFもコアタンパク部分は同一であるため、両プローブ共 に結合が観察されると予想された。実験の結果、末端ラタトサミン構造を持つ ASFプロ ーブでは RCA120や ECAの非常に明るいスポットが検出されたカ 図 16A)、ラタトサミ ン構造がシアル酸でキヤッビングされてレ、る FETプローブでは RCA120、 ECAのスポッ トは非常に暗くなつた（図 16B)。この結果は RCA120、 ECA力 Sラタトサミン構造を強く 認識し、ラタトサミン構造の末端がシアル酸でキャップされると親和性が大幅に低下 するという従来の知見と一致していた。また実験（B)では FETプローブに特徴的なシ アル酸の存在に対応して、シアル酸認識レクチンである SSAや SNAのスポットが観察 された（図 16B)。 ConAのスポットでは実験 (A)、（B)共に弱い蛍光が観察された（図 16A及び B)。これは N-結合型糖鎖のうち、主として存在する 3本鎖型糖鎖には結合 できないものの、少量存在するとされる 2本鎖型糖鎖には結合できるためと考えられ た。共通コアタンパク部分を認識する FET抗体のスポットは、実験 (A)、 （B)において 蛍光が観察された（図 16A及び B)。
[0088] 実験（C)、 (D)では RNase Aと RNase Bプローブの糖鎖プロファイルの相違を比較 した（図 16C及び D)。 RNase Bは、高マンノース型の N_結合型糖鎖を分子内に 1本の み持ち、 RNase Aは、コアタンパク部分は RNase Bと同一の構造を持つが糖鎖を全く 持たないことが知られている。これらのプローブをレクチンアレイに接触させた場合、 両プローブ共に抗 RNase抗体スポットに対しては親和性を示す力 レクチンのスポット に対する反応性に相違が生じる（RNase Bプローブは ConAなどのマンノース認識レク チンに親和性を示すのに対し、 RNase Aは親和性を示さなレ、）ことが予想された。実 験の結果、抗体に対する反応性では、両プローブにおいて共通コアタンパク部分を 認識する RNase抗体との結合が観察された。一方レクチンに対する反応性では、高マ ンノース構造を持つ RNase Bで ConAのスポットにおいて結合が観察された力 糖鎖を 持たなレ、 RNase Aではレクチンのスポットにおいて、結合による蛍光は観察されなか つた。実験（E)ではネガティブコントロールとして、糖鎖を持たないタンパク質である B SAを用いた。 BSAプローブでは予想通り、抗体 'レクチンスポットともに結合は観察さ れなかった（図 16E)。
[0089] 実験 (A)〜（E)を通して、微量の糖タンパク質試料力 迅速に、レクチンの糖結合 特異性を反映したプロファイルを得ることができた（図 16A〜E)。また今回の実験で は、レクチンと抗体を同一アレイ上にスポットすることで、糖タンパク質のコアタンパク 部分と、修飾糖鎖部分の情報を同時並行的に一枚のスライド上で取得することがで きた。同一スライド上で同時並行解析を行うことで、各反応槽間の実験条件 (温度、 反応時間等）を揃えた形での観察が可能となるという利点が生じた。
[0090] 〔実施例 3〕 レクチンアレイを用いた阻害濃度解析（図 17)
1.材料と方法
先の実験で観察されたレクチンとプローブ分子間の結合が、糖鎖を介した特異的 結合であることを確認する為に、競合阻害糖を用いた阻害実験を行った。実験 (A)で はスライドガラス上の 8つの反応槽内に RCA120をスポットしてアレイを構成した上で、 競合阻害糖 (ラタトース）の濃度を変えた 8種類の ASFプローブ溶液を同時に接触さ せ、結合反応の阻害を観察した（図 17A)。実験（B)では固定化レクチンとして ConA を用レ、、プローブとして RNase B、競合阻害糖としてマンノースを用レ、、同様の操作で 結合の阻害を観察した（図 17B)。アレイ作製時に要した材料 ·操作は、実施例 2と同 じであるため記述を省略する。
[0091] 2.結果と考察
実験の結果、競合阻害糖の濃度上昇に伴ってスポットの蛍光強度の減少が観察さ れ (図 17)、阻害曲線をカーブフィッティングすることにより、阻害物質固有の半阻害 濃度を算出することができた。この結果から、蛍光糖タンパク質プローブとの結合はレ クチンと糖鎖間の特異的結合反応によるものであることを確認できた。またこのような 阻害実験を用い、半阻害濃度を算出することで結合の強さを評価したり、結合する相 手分子を探索したりすることが可能であることが示された。
[0092] 〔実施例 4〕 レクチンアレイの糖ペプチドプローブによる検出（図 18)
1.材料と方法
(1)糖ペプチドプローブの調製
実施例 2 (1)に記述した方法で Cy3_ASFを調製した後に、この Cy3_ASFをトリプシ ン処理により断片化し、 Cy3-ASFペプチドを調製した。
(2)スライドガラスへの GTMSコーティング
実施例 2 (2)に記述した方法で行った。
(3)レクチンアレイの作製
固定化するレクチンは、各レクチンの持つ主要な糖認識能ごとにグループ分けを行 つた上で、フコース認識レクチン 5種、シアル酸認識レクチン 6種、ラタトサミン構造認 識レクチン 3種、ガラクトース認識レクチン 6種、ガラクトサミン認識レクチン 11種、マン ノース認識レクチン 4種、キチン構造認識レクチン 5種の計 40種類のレクチンを選択し 、スライドガラスに固定化したアレイを作製した。実験操作は実施例 2 (3)に記述した 方法で行った。
(4)非スポット面のブロッキング
(5)プローブ溶液の添加とスキャン
(6)スキャン画像の数値化
上記（4)〜（6)の操作については、 Cy3_ASFペプチドプローブを用い、実施例 2 (4 )〜（6)に記述した方法と同様の操作にて、実験を行った。
[0093] 2.結果と考察
実験の結果、レクチンアレイに糖ペプチドプローブを供することで、糖鎖構造を反 映した糖鎖プロファイルを得ることができた。得られた糖鎖プロファイルは酵素消化す る前の ASFと同等であり、レクチンアレイに糖タンパク質だけでなく糖タンパク質のぺ プチド消化産物をプローブとして利用できることが示された。この技術を用いれば糖 ペプチドを HPLC等で分画した後にプローブとしてレクチンアレイに供することで、糖 ペプチド各成分の糖鎖プロファイルの観察が可能になり、有用である。
[0094] 〔実施例 5〕レクチンアレイに対し、クルードな生体試料をプローブとして用いた実験（ 図 19)
1.材料と方法
レクチンアレイを用いて糖タンパク質混合物、特に生体由来混合試料の糖鎖プロフ アイリングを行うことで、生体内の糖タンパク質の糖鎖付加状態を解析する。
[0095] マウス肝臓より抽出'精製した糖タンパク質サンプルと、マウス脳より抽出'精製した 糖タンパク質サンプルを Cy3標識化してプローブとした後に、 40種レクチンの固定化 されたレクチンアレイと接触させて、マウス抽出糖タンパク質混合物全体の糖鎖プロ ファイルを観察した。
アレイ作製時に要した材料 ·操作は、実施例 2と同じであるため記述を省略する。
[0096] 2.結果と考察
マウス脳由来糖タンパク質プローブ（図 19A)と肝臓由来糖タンパク質プローブ（図 19B)では、明らかに異なった糖鎖プロファイルが観察された。特にシアル酸認識の レクチン群で、両プローブ間に顕著な相違が見られた。脳では糖タンパク質に対する シアル酸の付加が少ないことが知られており、この事実は実験結果の傾向と一致した 。このようにクルードな試料を用いた実験でも、試料全体の糖鎖付加情報を迅速'簡 便に得ることができるため、血液成分や臓器等の、個体間や病態間での糖鎖構造の 差を一斉比較解析する目的での使用に適している。
[0097] 次に先の実験で用いた脳由来糖タンパク質プローブに対し、競合阻害糖としてラタ トースを 10 mM加え、糖鎖プロファイルを観察した (図 19C)。その結果、競合阻害に より蛍光シグナルのパターンに変化が観察され、主にラタトサミン認識レクチンのシグ ナルの減弱が観察された。この実験で示したように、よりクルードな試料に対するレク チンアレイによる糖鎖プロフアイリングにおいても、様々な阻害糖の添加実験を併用 し、取得される情報を絞り込んだ上で比較解析することで、より簡便かつ迅速に個体 間の比較解析を行うことができる。 [0098] 〔実施例 6〕レクチン-糖タンパク質間相互作用の経時的観察（図 20) 本装置はスキャンの際に洗浄工程を必要とせず、液層中の相互作用を平衡状態の まま観察できるため、反応開始から時間を追ってシグナル強度の変化を観察すること で、相互作用の結合 ·解離反応の経時的観察（リアルタイムスキャン）が可能である。
[0099] 特異性の異なる多種のレクチンを固定化した基板に対し、 100 ng/mLの Cy3_ASFを 蛍光糖タンパクプローブとして反応槽内に加え、結合反応を開始させた直後からの シグナル強度の経時変化を観察した。他の実験条件は実施例 1と重複するので省略 する。本実験ではスキャン間隔を 60秒ごととし、スキャンを行った。結果、反応速度の 相違による結合反応の速さの相違が観察された（図 20)。このようなリアルタイムスキ ヤンは、反応速度を観察することを可能とするだけでなぐ測定条件における平衡反 応の終点を見極める上でも有用である。
[0100] 〔実施例 7〕酵素消化を併用した糖タンパク質の糖鎖構造推定法（図 21)
1.材料と方法
(1)糖タンパク質プローブの調製および酵素消化
実施例 2 (1)に記述した方法で Cy3標識ゥシトランスフェリン (Cy3_bTf)を調製した 後に、 Cy3-bTf¾r糖質加水分解酵素（シァリダーゼ Aもしくは βガラクトシダーゼ）で消 化した。
[0101] (2)スライドガラスへの GTMSコーティング
実施例 2 (2)に記述した方法で行った。
(3)レクチンアレイの作製
固定化するレクチンは、各レクチンの持つ主要な糖認識能ごとにグループ分けを行 つた上で、フコース認識レクチン 5種、シアル酸認識レクチン 6種、ラタトサミン構造認 識レクチン 3種、ガラクトース認識レクチン 6種、ガラクトサミン認識レクチン 11種、マン ノース認識レクチン 4種、キチン構造認識レクチン 5種の計 40種類のレクチンを選択し 、スライドガラスに固定化したアレイを作製した。実験操作は実施例 2 (3)に記述した 方法で行った。 [0102] (4)非スポット面のブロッキング
(5)プローブ溶液の添加とスキャン
(6)スキャン画像の数値化
上記（4)〜（6)の操作については、 Cy3_bT藤素消化物プローブを用レ、、実施例 2 ( 4)〜（6)に記述した方法と同様の操作にて、実験を行った。
[0103] 2.結果と考察
実験の結果、レクチンアレイに各糖質加水分解酵素処理した糖タンパク質プローブ を供することで、反応産物の糖鎖構造を反映した糖鎖プロファイルを得ることができ た（図 21)。シァリダーゼ A消化した場合、反応前後で大きなプロファイルの変動を示 したが、 βガラクトシダーゼ反応産物は未反応糖タンパク質とほぼ同一のプロフアイ ルを示した（図 21)。これは bTfの Ν結合型糖鎖の非還元末端のほとんどがシアル酸 修飾を受けていることを示している。以上のように各糖質加水分解酵素の基質特異 性をもとに酵素反応前後の糖鎖プロファイルを比較することで、標的糖タンパク質の 糖鎖構造をより正確に推定することが可能になった。
[0104] 〔参考例 1〕 糖ペプチドアレイによる、糖ペプチド上の糖鎖プロフアイリング（図 22) 1.材料と方法
( 1)レクチンプローブの調製
本実施例ではレクチンプローブとして、ラタトサミン構造を強く認識する RCA120、ネ ガティブコントロールとして糖結合能を持たなレ、BSAを使用した。蛍光標識レクチンプ ローブは蛍光色素である Cy3を用いて蛍光標識して調製した。レクチンは 0.1 M炭酸 緩衝液（pH 9.3)中に終濃度 1 mg/mLになるよう溶解した後、 1 mL当たり 1.0 mgの Cy 3粉末と混合させ、 1時間、適時攪拌しながら喑所で反応させた。反応後は限外ろ過 フィルターキットを用いて未反応の Cy3色素を除去した。
(2)スライドガラスへの GTMSコーティング
GTMSコートスライドは実施例 1 (2)に記述した方法で行った。
[0105] (3)糖ペプチドアレイの作製
(2)で作製した GTMSコートスライドガラス（図 1 )に対して糖ペプチドをスポットして糖 ペプチドアレイを作製した。マイクロァレイスポッターとして日本レーザ電子社製 STA MPMANを使用し、先端直径 0.40 mmのスタンプピンを使用してスポットを行ことで、直 径約 0.5 mmのスポットをスライドガラス上に配置した。
本実験では固定化した糖ペプチドサンプルは、マウス肝臓の可溶性画分からレク チンカラムを用レ、て精製した糖タンパク質画分をトリプシンによりペプチド断片化後、 HPLCにより分画'分取した糖ペプチドを用いた。スライドガラスへの糖ペプチドの固 定化操作に際しては、以下の条件をマイクロアレイスポッター付属のコンピューター に記憶させ、スタンプピン動作プログラムを実行させた。まずスタンプピンを 96穴 PCR 用マイクロタイタープレート内の固定化試料溶液中に 1秒間浸した後に引き上げ、ス ライドガラス表面の所定の位置に 1秒間接触させた。この動作を 1スポットごとに繰り返 しな力 Sら、同一試料溶液から横 1列に 6点スポットを行った後、スタンプピンの洗浄を 行った。洗浄工程ではスタンプピンの針先を 0.05% SDS溶液に 2秒間浸し、スタンプピ ンをバキューム装置内で 15秒間乾燥させ、さらに精製水に 2秒間浸した後に、バキュ ーム装置内で 15秒間乾燥、最後にエタノールに 2秒間浸してからバキューム装置内 で 15秒間の乾燥操作を行つた。
[0106] (4)非スポット面のブロッキング
(5)プローブ溶液の添加とスキャン
(6)スキャン画像の数値化
上記（4)〜（6)の操作については、 Cy3-RCA120プローブと Cy3-BSAプローブを用 レ、、実施例 2 (4)〜(6)に記述した方法に従い、実験操作を行った。
[0107] 2.結果と考察
本実験の結果、糖ペプチドをアレイ化することで、糖ペプチドに付加した糖鎖の構 造情報を、ハイスループットかつ容易に得られることが示された。糖ペプチドアレイの 作製方法としては、 1)精製糖ペプチドを固定化する、 2)クルードの糖ペプチドを固 定化する、 3) HPLCで分離した糖ペプチドフラクションを固定化する、などが考えられ る。今回の実験では HPLCで分離した各フラクションをアレイ化したものを作製でき、 有用であることを示すことができた。
[0108] 従来、 HPLCで分画したフラクションのうち、どこに糖ペプチドが含まれているかとレヽ う情報を得ることは、 UV吸収や蛍光等でモニターできないために容易ではなかった。 本実験の結果、各糖ペプチドフラクションを固定化したアレイを用いることで、どのフ ラタシヨンにどのような糖鎖構造を持った糖ペプチドがあるの力を容易に知ることが可 能となることが分かった。
[0109] 本法を利用することで、解析対象の糖鎖を持つ糖ペプチドがどのフラクションに含 まれているのかといつた情報を迅速に得ることができるため、多数のフラクションから 効率的に糖鎖の含まれるフラクションのみを選出し、質量分析など他の解析へと供す ること等が可能になる。また解析対象の糖ペプチドの糖鎖構造情報や、どのようなレ クチンが結合するかとレ、う情報がなレ、場合、トリプシン消化前の糖タンパク質の状態 でレクチンアレイを用いた分析を行レ、、糖鎖プロフアイリングを行うことで、当該糖タン パク質に結合するレクチンを数十種類のレクチンの中から絞り込むことが出来る。この ような情報が得られることで、従来多数のレクチンを用いて総当り的に行っていたレク チンプロットなどの操作が簡略化され、大幅に時間と労力を節約できるなどの利点が ある。
[0110] 〔参考例 2〕他の糖鎖関連アレイへの応用
糖鎖関連アレイには、糖鎖をプローブに用いるレクチンアレイの他、糖タンパク質を プローブに用いるレクチンアレイ、レクチンをプローブに用いる糖ペプチドアレイ、レク チンをプローブに用いる糖タンパク質アレイ、レクチンをプローブに用いる抗体アレイ の 5タイプが挙げられる。図 23に、各糖鎖関連アレイと糖鎖の相互作用の模式図を 示す。

Claims

請求の範囲
[1] 被験糖鎖あるいは被験複合糖質を、精製又は精製することなく蛍光標識し、糖鎖あ るいは複合糖質とタンパク質の結合状態を測定することにより、被験糖鎖あるいは被 験複合糖質あるいはこれらを含有する試料を解析する装置であって、糖鎖結合性タ ンパク質を複数種配置固定した導光性材料力 なる基板と、該基板の側部端面に光 を導入し、該基板表面にエバネッセント波を発生させて、蛍光標識を励起する手段と 、該手段により生じた蛍光の強度を上記糖鎖結合性タンパク質の配置位置毎に測定 する蛍光強度測定手段と、を有することを特徴とする、上記装置。
[2] 糖鎖結合性タンパク質がレクチン又は IgMクラスに属する糖鎖認識抗体であることを 特徴とする、請求項 1に記載の装置。
[3] 基板が、糖鎖結合性タンパク質をその種類に応じて所定のパターンで配置固定化し たものであることを特徴とする請求項 1〜2のいずれかに記載の装置。
[4] 基板上に糖鎖結合性タンパク質とともに、複合糖質の糖鎖以外の部分に対する抗体 が配置固定化されていることを特徴とする、請求項 1〜3のいずれかに記載の装置。
[5] 蛍光強度測定手段により測定された蛍光強度を、使用した被験糖鎖あるいは被験複 合糖質に対応させて糖鎖結合性タンパク質の配置位置毎に記憶する記憶手段を有 することを特徴とする、請求項 1〜4のいずれかに記載の装置。
[6] 糖鎖結合性タンパク質の配置位置毎に測定された蛍光強度を段階分けして記憶す る手段を有することを特徴とする、請求項 1〜5に記載の装置。
[7] 段階分けされた蛍光強度を、各糖鎖結合性タンパク質の種類毎に区分して表示する 手段を有することを特徴とする、請求項 6に記載の装置。 [8] 基板が、同一の糖鎖結合性タンパク質を、その種類毎に複数配置固定化したもので あることを特徴とする、請求項 1〜7のいずれかに記載の装置。
[9] 同一の糖鎖結合性タンパク質に対して測定された蛍光強度の平均値を算出して記 憶する手段を有することを特徴とする、請求項 8に記載の装置。
[10] 同一の糖鎖結合性タンパク質に対して測定された蛍光強度の平均値を段階分けし て記憶する手段を有することを特徴とする、請求項 9に記載の装置。
[11] 段階分けされた蛍光強度を、糖鎖結合性タンパク質の種類毎に区分して表示する手 段を有することを特徴とする、請求項 10に記載の装置。
[12] 記憶手段に既知の糖鎖あるいは複合糖質に対する蛍光強度情報が記憶されている ことを特徴とする、請求項 5、 6、 9及び 10のいずれかに記載の装置。
[13] 既知の糖鎖あるいは複合糖質に対する蛍光強度情報と解析対象の糖鎖あるいは糖 タンパク質の蛍光強度情報を照合し、同一あるいは近似する糖鎖あるいは複合糖質 を選定する手段を有することを特徴とする、請求項 12に記載の装置。 基板上に糖鎖結合性タンパク質とともに、複合糖質の糖鎖以外の部分に対する抗体 が配置固定化されていることを特徴とする、請求項 1〜： 12のいずれかに記載の装置
蛍光標識の励起をエバネッセント波により行レ、、糖鎖あるいは複合糖質の解析に用 いる基板であって、表面に糖鎖結合性タンパク質を複数種配置固定した導光性材料 からなる上記基板。
[16] 糖鎖結合性タンパク質が、レクチン又は IgMクラスの糖鎖認識抗体であることを特徴 とする、請求項 15に記載の基板。
[17] 糖鎖結合性タンパク質がその種類に応じて所定のパターンで配置固定化されたもの であることを特徴とする、請求項 15又は 16に記載の基板。
[18] 基板が、同一の糖鎖結合性タンパク質をその種類毎に複数配置固定化したものであ ることを特徴とする、請求項 15〜： 17のいずれかに記載の基板。
[19] エポキシ基を活性基として含有する化合物がコートされた基板に、糖鎖結合性タンパ ク質が固定化されたことを特徴とする、請求項 15〜： 18のいずれかに記載の基板。
[20] エポキシ基を活性基として含有する化合物が 3-グリシドキシプロピルトリメトキシシラン 、 2-(3,4エポキシシクロへキシル)ェチルトリメトキシシラン、 3-グリシドキシプロピルメチ ノレジェトキシシラン、 3-グリシドキシプロピルトリエトキシシランであることを特徴とする 、請求項 19に記載の基板。
[21] エポキシ基を活性基として含有する化合物が分岐したスぺーサ一の先端にエポキシ 基を一つ又は複数持つシランカップリング化合物であることを特徴とする、請求項 19 に記載の基板。
[22] スぺーサ一が炭化水素鎖、ポリエチレングリコール、タンパク質、またはピオチン'ァ ビジンであることを特徴とする、請求項 21に記載の基板。
[23] 糖鎖結合性タンパク質の固定面が反応槽を形成していることを特徴とする、請求項 1 5〜22のいずれかに記載の基板。
[24] 基板上に糖鎖結合性タンパク質とともに、複合糖質の糖鎖以外の部分に対する抗体 が配置固定化されていることを特徴とする、請求項 15〜23のいずれかに記載の基 板。
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