WO2007073705A2 - Composiciones farmacéuticas que contienen la proteína nma0939 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention is related to the branch of medicine, particularly with the development of pharmaceutical compositions, of preventive or therapeutic application, which allow an increase in the quality of the immune response against vaccine antigens characteristic of diseases of diverse origin. .
  • Neisser ⁇ a meningitidis a Gram negative diplococcus whose only host is man, is the causative agent of meningococcal disease. Usually this bacterium is found in the nasopharynx of people who are asymptomatic carriers, this being the most common route for their microbiological isolation. In the world, children under 2 years of age are the population most susceptible to contracting meningococcal meningitis, however, young adolescents and the population of older adults can also be affected. Meningococcal disease without treatment is fatal in the majority of affected individuals, and vaccination could prevent this situation by avoiding even bacterial colonization.
  • Capsular polysaccharides have been studied and evaluated as vaccine candidates.
  • a tetravalent, polysaccharide-based vaccine that confers protection against serogroups A, C, Y, and W-135 has been licensed in the United States.
  • the antibodies that are generated after vaccination are serogroup-specific (Rosenstein N. ef al. (2001). Meningococcal disease. N. Engl. J. Med 344: 1378-1388).
  • Serogroup B unlike the rest, continues to be an important cause of endemic and epidemic meningococcal disease, largely due to the absence of effective vaccines against it. It has been seen that serogroup B polysaccharide has a low immunogenicity, in addition to the potential risk that vaccines based on this compound can develop immunotolerance and / or induce autoimmunity given its structural homology with oligosaccharide chains present in human fetal structures (Finne J . et al. (1987). An IgG monoclonal antibody to group B meningococci cross-reacts with developmentally regulated polysialic acid units of glycoproteins in neural and extraneural tissue. J. Immunol 138: 4402-4407).
  • Vaccines composed of outer membrane vesicles were significantly more immunogenic parenterally than PME aggregates, and this immunogenicity was initially explained by greater adsorption to the aluminum hydroxide adjuvant (Wang LY and Frasch CE. (1984). Neisseria meningitidis group B serotype 2b protein vaccine and evaluation in mouse model Infeci Immun. 46 (2): 408-14136).
  • the vaccine produced by the Finlay Institute in Cuba (commercially called VA-MENGOC-BC ® ) is produced from strain B: 4,7: P1,19,15 and is composed of a VME preparation of said strain and polysaccharide capsule isolated from serogroup C, adsorbed to aluminum hydroxide (Sierra GV et al. 1991. Vaccine against group B Neisseria meningitidis: protection trial and mass vaccination results in Cuba. NIPH Ann Dis. 14 (2): 195-210). This vaccine contributed to a rapid decline in the epidemic in Cuba (Rodr ⁇ guez AP, et al. (1999). The epidemiological impact of antimeningococcal B vaccination in Cuba. Mem Inst Oswaldo Cruz.
  • VME vaccines appear to be effective in the presentation of PME, arranged in their natural conformation, to allow the generation of bactericidal antibodies, at least in adolescents and adults.
  • the antibody responses generated increased the opsonophagocytosis of the meningococcus.
  • the precise formulation of the vaccines (for example: PME content, LPS content and the presence or absence of the adjuvant) has a significant impact on the immunogenicity, there being great differences from one producer to another according to the strain and / or the methodology used (Lehmann AK, et al. (1991). Immunization against serogroup B meningococci. Opsonin response in vaccinees as measured by chemiluminescence. APMIS.
  • VME vaccines have been more used than any other serogroup B vaccine and are useful in the context of outbreaks of the disease caused by a single type of strain.
  • the immunogens responsible for cross-reactivity induced by this type of preparations have not been fully characterized, and many antigens present in these preparations remain to be identified.
  • VME vaccine in the Netherlands was developed that contained P1 of six different pathogenic isolates (van der Ley P and Poolman JT. (1992). Construction of a multivalent meningococcal vaccine strain based on the class 1 outer membrane protein Infectious Immun. 60 (8): 3156-61; Claassen I, et al. (1996). Production, characterization and control of a Neisseria meningitidis hexavalent class 1 outer membrane protein containing vesicle vaccine. Vaccine 14 (10): 1001-8). In this case, the vesicles were extracted from two variants of the strain H44 / 76, genetically manipulated to express three independent P1 proteins. The search for a universal antigen
  • TbpA and B proteins regulated by iron
  • FbpA and FetA proteins regulated by iron
  • NspA proteins regulated by class 5 proteins
  • Opc class 5 proteins
  • TbpB is part of the transferrin binding complex, together with TbpA.
  • TbpA has a more important function in iron binding (Painter M, et al. (1998). Analysis of TbpA and TbpB functionality in defective mutants of Neisser ⁇ a meningitidis. J Med Microbio! 47 (9): 757-60) and is a more effective immunogen than TbpB.
  • NspA protein a minor, highly conserved PME
  • PME PME
  • J Exp Med 185 (7): 1173-83 B cells from immunized mice were used, and the mAbs were examined to detect cross-reactivity against multiple strains of meningococcus.
  • a monoclonal antibody with cross-reactivity was found that recognized a 22 kDa PME and was designated as NspA.
  • mice with NspA induced bactericidal antibody response against strains of groups A to C. This protein also protects against lethal meningococcal infection (Martin D, et al. (1997). Highly conserveed Neisser ⁇ a meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173-83).
  • the comparison of genetically divergent NspA sequences showed that the protein is highly conserved (97% homology) (Cadieux N, et al. (1999). Bactericidal and Cross-Protective Activities of a Monoclonal Antibody Directed against Neisser ⁇ a meningitidis NspA Outer Membrane Protein Infect Immun 67 (9): 4955-9).
  • NspA The presence of NspA was detected by ELISA in 99.2% of the evaluated strains belonging to serogroups from A to Ia C, using monoclonal antibodies (Martin D, et al. (1997). Highly conserveed Neisser ⁇ a meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173-83). It has been shown that these monoclonal antibodies have bactericidal activity against numerous strains of meningococcus and are capable of reducing the bacteraemia caused by this microorganism in a murine model (Cadieux N, et al. (1999).
  • the components of a vaccine should be selected based on the contribution of the antigens in the pathogenesis of N. meningitidis.
  • the antigens alone can be effective vaccine candidates, or alternatively, attenuated mutants can be considered members of a vaccine.
  • An important problem of the prevention and / or the therapy of meningococcal disease is that none of the vaccines available to date confers universal protection, due to the great heterogeneity of the meningococcal antigens that have been used as a vaccine.
  • This invention contributes to solving the aforementioned problem by providing pharmaceutical compositions containing a protein whose sequence is highly conserved, even between different genera of pathogenic microorganisms.
  • the technical objective pursued with this invention is precisely the development of compositions capable of raising and / or extending the host's systemic and mucosal immune response against several pathogens, or against a broad spectrum of varieties thereof.
  • the use of the NMA0939 protein in pharmaceutical compositions of a therapeutic or preventive nature is reported for the first time.
  • the invention relates to pharmaceutical compositions, containing said protein, to prevent or treat any infection caused by a bacterium of the Neisseria genus.
  • pharmaceutical compositions containing said antigen are useful for the prevention or treatment of diseases caused by N. meningitidis and N. gonorrhoeae, respectively.
  • compositions containing the NMA0939 protein may also contain one or more antigens. of a synthetic, recombinant or natural nature.
  • the combined pharmaceutical compositions contain polysaccharide antigens, including bacterial polysaccharides. More particularly, the invention relates to the capsular polysaccharides of N. meningitidis.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain protein-polysaccharide conjugates, whose polysaccharide component corresponds to a bacterial polysaccharide.
  • compositions containing NMA0939 contain antigens of a peptide nature, in order to broaden their protection spectrum.
  • compositions of the present invention are administered parenterally, or mucosally, including oral administration.
  • the NMA0939 protein can be used as immunopotentiator or carrier of peptides, polysaccharides or other antigens of less immunogenicity, in order to enhance the immune response against them.
  • Example 11 illustrates that the aforementioned protein is capable of significantly raising antibody levels against a peptide derived from a viral antigen, once both molecules have been conjugated.
  • the protective determinants for a given protein antigen be inserted into the sequence of the NMA0939 protein, in order to induce an increased immune response against them, giving rise to hybrid proteins that are part of A pharmaceutical composition
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may contain fragments of the NMA0939 protein, which are capable of generating in the host a protective response against meningococcus or another bacterium of the Neisseria genus.
  • the pharmaceutical compositions contain mimotopes or mimetic peptides of the NMA0939 protein, in synthetic form or obtained by recombinant DNA technology.
  • micromotope means any peptide that is capable of generating antibodies that combine with the NMA0939 protein, and in that way are capable of producing a protective response against Neisseria. Also part of the present invention is the detection of the meningococcal disease through the use of pharmaceutical components containing the NMA0939 protein, or the gene encoding it, either alone or in combination with other components.
  • Figure 1 Vector pM238 used in cloning and expression of the NMA0939 protein.
  • Figure 4 Analysis of the purity of the different fractions of the purification process of the recombinant protein NMA0939, from the rupture precipitate, by SDS-PAGE: Lane 1, precipitate of solubilization with 2M urea in carbonate-bicarbonate buffer; lane 2, solubilization supernatant; lane 3, fraction not adsorbed to the purification matrix; lane 4, pollutant of lower molecular weight eluting at another chromatographic peak; lane 5, purified protein. PM: molecular weight standard.
  • Figure 5 Analysis of the purity of the different fractions of the purification process of the recombinant protein NMA0939, from the rupture precipitate, by SDS-PAGE: Lane 1, precipitate of solubilization with 2M urea in carbonate-bicarbonate buffer; lane 2, solubilization supernatant; lane 3, fraction not adsorbed to the purification matrix; lane 4, pollutant of lower molecular weight eluting at another chromatographic peak; lane 5, purified
  • Antibody levels (IgG) against the recombinant protein NMA0939 obtained by immunizing mice with the same antigen adjuvant with Freund's Adjuvant (Freund), Aluminum hydroxide (Alum) or polysaccharide C (PsC) of N. meningitidis, by intraperitoneal route.
  • the results obtained in an ELISA type test are represented, which were expressed as the inverse of the title, calculated as the dilution of the serum sample where the optical density of the preimmune serum sample is doubled.
  • Figure 6 Recognition of antigenic determinants present in the PME of N. meningitidis, strain CU385, using sera from mice immunized with the recombinant protein NMA0939 adjuvant with Freund's Adjuvant (Freund), Aluminum hydroxide (Alum) or polysaccharide C (PsC) intraperitoneally. The results were expressed as the inverse of the title, calculated as the dilution of the serum where the optical density of the preimmune serum is doubled.
  • Figure 7 Results of the search for similarity between the gene coding for the NMA0939 protein (“query”) and the annotated sequences of the genomes of different serogroups of N. meningitidis (“Sbjct”) using the BLAST program.
  • NMA0939 mixed with polysaccharide C of N. meningitidis intraperitoneally.
  • Figure 9 Passive protection experiments against meningococcal infection in the infant rat model, using sera obtained by immunizing with the recombinant protein NMA0939 with Freund's Adjuvant (Freund), with Aluminum hydroxide (Alum) or mixed with polysaccharide C (PsC ) of N. meningitidis.
  • A Infection with strain CU385, and B: Infection with strain 233 (C: 2a: P1.5).
  • C- mixture of sera from untreated animals
  • C + mouse serum immunized with outer membrane vesicles of N. meningitidis of strain CU385 or 233, as appropriate with the experiment.
  • the symbol * represents a statistically significant difference with respect to the negative control group (C-), in terms of bacteremia levels expressed as colony forming units per milliliter (cfu / ml).
  • Figure 10 Recognition of the recombinant protein NMA0939 and a panel of unrelated antigens, by the mAbs generated (mAbs H 10/67, 3H3 / 24 and 7D6 / 18).
  • Antigens P1, class 1 protein of N. meningitidis strain B: 4: P1.15; P64k, N. meningitidis] TT protein, tetanus toxoid; HBsAg, surface antigen of the Hepatitis B virus.
  • the results are represented as the absorbance (492nm) in an ELISA type assay.
  • Figure 11 Recognition of the NMA0939 recombinant protein by sera from convalescent patients of meningococcal disease. As a negative control, sera from healthy donors were used. The results are represented as the absorbance (492nm) in an ELISA type test.
  • Figure 12 Titles of anti-JY1 peptide antibodies corresponding to the sera of animals immunized with the free peptide (JY1), the recombinant protein (NMA0939) and the conjugate JY1-NMA0939.
  • Example 1 Detection of the NMA0939 protein in preparations of outer membrane vesicles of Neisse ⁇ a meningitidis, serogroup B.
  • Peptides generated during digestion were extracted from the solution using microcolumns (ZipTips, Millipore, MA, E. U.) Prior to mass spectrometry analysis the peptides were eluted from the microcolumns with 60% acetonitrile solution and 1% formic acid and immediately the mixture was loaded into nano-needles (Protana, Denmark). Measurements were performed on a spectrometer hybrid mass with quadrupole and flight time (QTof-2 TM, Manchester, United Kingdom), equipped with an ionization source (nanoESI). Mass spectra were acquired in a range of m / z from 400 to 2000 in 0.98 seconds and using 0.02 seconds between each of the scans. The acquisition and processing of the data was carried out through the MassLynx program (version 3.5, Micromass).
  • Protein identification based on the ESI-MS spectra was performed using the ProFound program (Zhang VV and Chait BT. (2000).
  • ProFound an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping information.
  • Search parameters included cysteine modification as well as possible oxidations and deamidations. From the analysis of the data obtained from the identification of the proteins present in external membrane vesicle preparations, a group of peptides was selected. From the sequencing by mass spectrometry of one of them, the existence in serogroup B of a homologue of the NMA0939 protein was verified, which was not identified or predicted from the genomes of serogroup B. This homologous candidate to NMA0939, It is called NMA0939 throughout the entire document.
  • Example 3 Cloning and expression of the nmaO939 gene, coding for the NMA0939 protein of Neisser ⁇ a meningitidis, in Escher ⁇ chia coli.
  • the vector pM238 was used to perform the cloning and expression of the nmaO939 gene. Said vector allows cloning using different restriction enzymes, and obtaining high levels of heterologous protein expression in the form of inclusion bodies in the cytoplasm of E. coli.
  • the vector pM238 ( Figure 1) has the following main elements: tryptophan promoter, sequence corresponding to the N-terminal stabilizing segment of the P64k antigen of N. meningitidis strain CU385 (coding for 47 aa), sequence encoding a histidine C tail -terminal, sequence corresponding to the terminator of transcription of bacteriophage T4 and sequence corresponding to the gene that confers ampicillin resistance as a selection marker.
  • this vector allows the selection of recombinants by means of the blue or white coloration of the colonies, product of the presence of the lac ⁇ subunit alpha gene.
  • a pair of oligonucleotides 704467U and 704467L were designed to amplify the segment of said gene without the sequence encoding the signal peptide, using the genomic DNA of strain CU385 (B: 4: P1.19,15).
  • Xba-I BgI-II 704467U 5 ' GTGGTATCTAGATCTGCCAGCCAGAAACTC ' 3 (SEQ ID No. 1)
  • BamH-l (SEQ ID No. 2)
  • the methods described in the SignalP World Wide Web server http://www.cbs.dtu.dk/services/SiqnalP-2.0) were used to predict the signal peptide.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the plasmid obtained was named pM NMA0939 for later use.
  • the E. coli GC 366 strain was transformed by the chemical method with the plasmid pM NMA0939 ( Figure 2).
  • the expression experiment was performed in minimal M9 saline medium (Miller JH. (1972). Experiments in Molecular Genetics, CoId Spring Harbor Laboratory Press, New York, EU) supplemented with 1% glucose, 1% casein hydrolyzate, extract of 0.1% yeast, 0.1 mM CaCI 2 , 1mM MgSO 4 and 50 ⁇ g / mL ampicillin.
  • the cultures were incubated for 12 h at 37 ° C at 250 rpm.
  • the NMA0939 protein was obtained in the Rupture precipitate, representing 20% of the total proteins present in this fraction ( Figure 3).
  • Samples of the cell precipitate were solubilized with carbonate-bicarbonate buffer (0.1 M sodium carbonate, 0.1 M sodium hydrogen carbonate) containing urea dissolved at different molarities (2M, 4M, 6M and 8M).
  • carbonate-bicarbonate buffer 0.1 M sodium carbonate, 0.1 M sodium hydrogen carbonate
  • urea urea dissolved at different molarities
  • Example 4 Evaluation of the immune response induced by the NMA0939 protein intraperitoneally.
  • an immunization scheme was designed in mice, in which the protein adjuvant with aluminum hydroxide, Freund's adjuvant or polysaccharide C of N. meningitidis was administered.
  • female Balb / c mice from 8 to 10 weeks of age, were immunized, which were divided into 3 groups of 8 mice each. Three immunizations were performed intraperitoneally, separated by an interval of 7 days.
  • the antibody titers (IgG) against the recombinant protein and against antigens present in the bacterium were determined by an ELISA type test, in sera obtained after the booster dose.
  • Figure 5 shows the antibody titers of each of the animals against the recombinant protein. From the second inoculation, antibodies capable of recognizing the administered antigen (data not shown) are detected, although they were higher after the last inoculation. The immunological identification was also performed by Western blotting, detecting the recognition of the band corresponding to the protein (data not shown).
  • the sera obtained after immunizing with the recombinant protein recognized antigenic determinants present in a PME preparation of strain CU385. These results are represented in Figure 6.
  • the antibody titres obtained were transformed to achieve normal distribution of the values and / or homogeneity of variance. In general, the statistical significance of the differences between the groups was analyzed by simple classification variance analysis, followed by the Newman Keuls multiple range test.
  • Example 5 Characterization of the sequence of the gene coding for the NMA0939 protein in different strains of Neisser ⁇ a meningitidis and in Neisser ⁇ a gonorrhoeae.
  • Said sequences have 99% identity in serogroup B, 100% identity in serogroup A and 96% in the case of N. gonorrhoeae, with the sequence of the gene coding for the NMA0939 protein obtained (SEQ ID No. 3). Additionally, the nucleotide sequence of the gene in question was determined for 3 Cuban isolates (SEQ ID No. 5-7) belonging to serogroup B (B: 4: P1.19.15) and sequence alignment was performed using the ClustalX program (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). The results of the alignment show that there is a great conservation in the nucleotide sequence of the nmaO939 gene between the different strains analyzed and generally in the Neisseria genus.
  • NMA0939 protein as a vaccine candidate, taking into account the high degree of similarity between the aforementioned sequences, would allow generating an effective immune response and a broad spectrum of protection against meningococcal disease, product of the wide reactivity.
  • Example 6 Characterization of the immune response of a broad spectrum of action induced by the immunization of Balb / c mice with the NMA0939 protein.
  • an ELISA type test was carried out in which the polystyrene plates were coated with complete cells of 5 Neisseria strains belonging to different serogroups, serotypes and serosubtypes. The plates were incubated with the mixture of the sera obtained against the NMA0939 protein mixed with different adjuvants, as described in Example 4.
  • Figure 8 shows the recognition of antigens present in strains of serogroups A, B and C of N. meningitidis, by sera obtained after immunization with the recombinant protein NMA0939 mixed with polysaccharide C of N. meningitidis.
  • the sera generated after the inoculation of the protein with the other adjuvants had a similar behavior.
  • Example 7 Protection induced by murine sera generated against protein NMA0939 in the infant rat model
  • a passive protection test was performed in the meningococcal infection model in infant rats. In this test, 24 rats of 5 to 6 days old were used, divided into groups of 6 animals each. It was determined if the sera that were administered by the intraperitoneal route protected the rats from the meningococcal infection caused by the strain CU385, inoculated by the same route one hour later. Sera from each group of immunized mice were mixed before being inoculated in infant rats and diluted 1: 10 in sterile PBS. Four hours after the challenge, the animals were sacrificed and a viable bacteria count was made in their blood.
  • Example 8 Generation of monoclonal antibodies against the NMA0939 protein, capable of mediating bactericidal activity against Neisser ⁇ a meningitidis
  • the immunization scheme was performed in Balb / c mice (H-2 d , female sex, 5-6 weeks) and had a total of 4 doses distributed as follows: on days 0, 15 and 30 of the scheme were inoculated 10 ⁇ g of the NMA0939 antigen per mouse (total volume 100 ⁇ l), administered subcutaneously, emulsified the first dose with Freund's complete adjuvant, and the remaining doses with Freund's Incomplete Adjuvant; Day 50, 10 .mu.g of antigen were administered per mouse in phosphate buffer (NaCl 140 mM, KCI 270 mM, KH 2 PO 4 1.5 mM, Na 2 HPO 4 x 2H 2 O 6.5 mM, pH 7.2) intraperitoneally. Extractions were performed on days 0 and 45 of the scheme.
  • Figure 10 shows the results obtained in this experiment, in total 3 positive clones were obtained (mAbs H 10/67, 3H3 / 24 and 7D6 / 18) that specifically recognize the NMA0939 protein, and not the amino acid sequence corresponding to segment N -term of Ia P64k, also to the rest of the panel of unrelated antigens tested.
  • bactericidal assay was performed.
  • the bactericidal antibody titer was expressed as the reciprocal of the highest antibody dilution evaluated, capable of killing 50% or more of the bacteria;
  • Two of the generated mAbs (3H3 / 24 and 7D6 / 18) had bactericidal titres greater than 1: 128 against the homologous strain B: 4: P1.19,15 and one (H10 / 67) greater than 1: 80.
  • a SPOTScan type assay was performed. A series of overlapping peptides that cover the protein sequence were synthesized on a cellulose support and the membrane was incubated with a mixture of sera diluted 1: 100. The antigen-antibody reaction was detected by incubation with an alkaline murine-alkaline phosphatase conjugate, followed by the addition of a solution containing the Bromo-Chloro-Indolyl-Phosphate substrate. Several common antigenic regions present in the protein were observed, regardless of the preparation that was used in the immunization (data not shown). However, it was noted that in the groups immunized with protein adjuvant with Freund's Adjuvant a much broader recognition pattern was obtained.
  • Example 12 Evaluation of the immune response induced by the NMA0939 protein, mucosally.
  • mice To evaluate the immunogenicity of the NMA0939 protein by mucosal route, an immunization scheme was designed in mice, in which the protein encapsulated in liposomes or mixed with polysaccharide C of N. meningitidis was adiministrated. Liposomes were obtained by the dehydration-rehydration method as previously described (Carménate T, et al. (2001).
  • mice Female Balb / c mice were immunized, 8 to 10 weeks of age, which received 3 doses of 50 ⁇ g of the protein intranasally, separated by a 15-day interval.
  • Figure 13 shows the levels of IgA antibodies detected in the two groups analyzed.

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Abstract

La presente invención se relaciona con el campo de la medicina, particularmente con el desarrollo de composiciones farmacéuticas que contienen la proteína NMA0939. Las composiciones de la presente invención confieren protección contra diferentes enfermedades, causadas o no por patógenos. La proteína NMA0939 se identificó como componente de las preparaciones de vesículas de membrana externa de Neisseria meningitidis, se obtuvo mediante la tecnología del ADN recombinante y se evaluó su inmunogenicidad y actividad protectora en modelos animales. Por el elevado grado de conservación del gen que codifica para la proteína NMA0939, las composiciones que la contienen poseen alto valor como antígeno inductor de una respuesta inmune de amplia reactividad. Las composiciones de esta invención son aplicables en la medicina humana.

Description

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS QUE CONTIENEN LA PROTEÍNA NMA0939.
Campo de Ia técnica La presente invención está relacionada con Ia rama de Ia medicina, particularmente con el desarrollo de composiciones farmacéuticas, de aplicación preventiva o terapéutica, que permitan un aumento en Ia calidad de Ia respuesta inmune contra antígenos vacunales característicos de enfermedades de origen diverso.
Estado de Ia técnica anterior
Neissería meningitidis, un diplococo Gram negativo cuyo único hospedero es el hombre, es el agente causal de Ia enfermedad meningocóccica. Usualmente esta bacteria se encuentra en Ia nasofaringe de personas que son portadores asintomáticos, siendo esta Ia vía más común para su aislamiento microbiológico. En el mundo los niños menores de 2 años de edad son Ia población más susceptible a contraer Ia meningitis meningocóccica, sin embargo, los adolescentes jóvenes y Ia población de adultos mayores también pueden ser afectados. La enfermedad meningocóccica sin tratamiento es fatal en Ia mayoría de los individuos afectados, y Ia vacunación podría prevenir esta situación evitando incluso Ia colonización bacteriana.
Diversas estrategias se han desarrollado con el objetivo de obtener un preparado vacunal que satisfaga los requisitos necesarios para proteger a Ia población contra esta enfermedad. Para ello se han tenido en cuenta los antígenos capsulares cuya especificidad inmunológica ha permitido Ia clasificación de este microorganismo en serogrupos. En Ia actualidad se han definido 5 de estos serogrupos como los responsables de Ia mayoría de los casos de enfermedad meningocóccica en el mundo. El serogrupo A es el principal responsable de las epidemias en África subsahariana. Los serogrupos B y C están asociados a Ia mayor parte de los casos que ocurren en los países desarrollados. Los serogrupos Y y W135 están presentes en Ia mayoría de los casos remanentes de Ia enfermedad y de infección prevalente en algunas regiones de los Estados Unidos, con un marcado incremento en los últimos años. De ahí que los polisacáridos capsulares hayan sido objeto de estudio y evaluación como candidatos vacunales. Una vacuna tetravalente, basada en polisacáridos, que confiere protección contra los serogrupos A, C, Y, y W-135 ha sido licenciada en los Estados Unidos. Los anticuerpos que son generados tras Ia vacunación son serogrupo- específico (Rosenstein N. ef al. (2001). Meningococcal disease. N. Engl. J. Med 344: 1378-1388).
El serogrupo B, a diferencia del resto, continúa siendo una importante causa de enfermedad meningocóccica endémica y epidémica, en gran parte debido a Ia no existencia de vacunas efectivas contra el mismo. Se ha visto que el polisacárido del serogrupo B posee una baja inmunogenicidad, además del riesgo potencial que existe de que vacunas basadas en este compuesto puedan desarrollar inmunotolerancia y/o inducir autoinmunidad dada su homología estructural con cadenas oligosacarídicas presentes en estructuras fetales humanas (Finne J. et al. (1987). An IgG monoclonal antibody to group B meningococci cross-reacts with developmentally regulated polysialic acid units of glycoproteins in neural and extraneural tisúes. J. Immunol 138: 4402-4407). Por este motivo, el desarrollo de vacunas contra el serogrupo B se ha concentrado en el uso de antígenos subcapsulares. Vacunas de vesículas y proteínas de membrana externa En Ia década de los años 70 Ia producción de vacunas de proteínas de membrana externa (PME), estuvo basada en Ia eliminación del lipopolisacárido (LPS) de las preparaciones proteicas mediante Ia utilización de detergentes (Frasch CE and Robbins JD. (1978). Protection against group B meningococcal disease. III. Immunogenicity of serotype 2 vaccines and specificity of protection in a guinea pig model. J Exp Med 147(3): 629-44). Después, las PME fueron precipitadas para producir agregados resuspendidos en cloruro de sodio. A pesar de los buenos resultados obtenidos en estudios realizados en animales, estas vacunas no indujeron anticuerpos bactericidas ni en adultos ni en niños (Zollinger WD, et al. (1978). Safety and immunogenicity of a Neisseria meningitidis type 2 protein vaccine ¡n animáis and humans. J. Infecí Dis 137(6):728-39), resultado que fue atribuido a Ia desnaturalización de las proteínas presentes en Ia preparación, como resultado de Ia precipitación. Los próximos pasos en Ia búsqueda de un nuevo candidato fueron: diseñar una vacuna que presenta las proteínas en su conformación nativa formando vesículas de membrana externa (VME) (Zollinger WD, et al. (1979). Complex of meningococcal group B polysaccharide and type 2 outer membrane protein immunogenic ¡n man. J. Clin. Invest. 63(5): 836-48; Wang LY and Frasch CE. (1984). Development of a Neisseria meningitidis group B serotype 2b protein vaccine and evaluation in a mouse model. Infect Immun. 46(2):408-14136).
Las vacunas compuestas por vesículas de membrana externa fueron significativamente más inmunogénicas por vía parenteral que los agregados de PME, y esta inmunogenicidad fue explicada inicialmente por una mayor adsorción al adyuvante hidróxido de aluminio (Wang LY and Frasch CE. (1984). Neisseria meningitidis group B serotype 2b protein vaccine and evaluation ¡n a mouse model. Infecí Immun. 46(2): 408-14136).
Varios estudios de eficacia se han llevado a cabo utilizando vacunas basadas en VME, en diferentes formulaciones. Las dos vacunas más ampliamente estudiadas fueron desarrolladas en los años 80, en respuesta a brotes de Ia enfermedad meningocóccica en Cuba (Sierra GV et al. (1991). Vaccine against group B Neisseria meningitidis: protection trial and mass vaccination results in Cuba. NIPH Ann Dis. 14(2): 195-210) y Noruega (Bjune G, eí al. (1991). Effect of outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease in Norway. Lancet 338(8775): 1093-6), respectivamente. La vacuna producida por el Instituto Finlay en Cuba (comercialmente denominada VA-MENGOC-BC®) es producida a partir de Ia cepa B:4,7:P1.19,15 y está compuesta por una preparación de VME de dicha cepa y polisacárido capsular aislado del serogrupo C, adsorbidas a hidróxido de aluminio (Sierra GV et al. 1991. Vaccine against group B Neisseria meningitidis: protection trial and mass vaccination results in Cuba. NIPH Ann Dis. 14(2): 195-210). Esta vacuna contribuyó a un rápido descenso de Ia epidemia en Cuba (Rodríguez AP, et al. (1999). The epidemiológica! impact of antimeningococcal B vaccinatíon in Cuba. Mem Inst Oswaldo Cruz. 94(4):433- 40). La vacuna producida por el Instituto Nacional de Salud Pública de Noruega (NIPH) fue inicialmente utilizada durante un período hiperendémico de Ia enfermedad causada por una cepa perteneciente al clon ET-5 (B:15:P1.7,16). Esta vacuna monovalente también fue producida a partir de VME purificadas y adsorbidas a hidróxido de aluminio (Bjune G, et al. (1991). Effect of outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease in Norway. Lancet. 338(8775): 1093-6).
Las vacunas de VME parecen ser efectivas en Ia presentación de las PME, dispuestas en su conformación natural, para permitir Ia generación de anticuerpos bactericidas, al menos en adolescentes y adultos. Las respuestas de anticuerpos generadas incrementaron Ia opsonofagocitosis del meningococo. La formulación precisa de las vacunas (por ejemplo: contenido de PME, contenido de LPS y Ia presencia o ausencia del adyuvante) tiene un significativo impacto en Ia inmunogenicidad, existiendo grandes diferencias de un productor a otro según Ia cepa y/o Ia metodología empleada (Lehmann AK, et al. (1991). Immunization against serogroup B meningococci. Opsonin response in vaccinees as measured by chemiluminescence. APMIS. 99(8):769-72; Gómez JA, ef al. (1998). Effect of adjuvants in the isotypes and bactericidal activity of antibodies against the transferrin-binding proteins of Neissería meningitidis. VaccineΛQ (17): 1633-9 ; Steeghs L, ef al. (1999). Immunogenicity of Outer Membrane Proteins in a Lipopolysaccharide-Deficient Mutant of Neissería meningitidis: Influence of Adjuvants on the Immune Response. Infecí Immun. 67(10):4988-93). Sin embargo, el perfil antigénico de los aislamientos obtenidos de pacientes cambia rápidamente y una vacuna abarca sólo un limitado número de cepas, por tanto puede ser inefectiva en unos años, si las cepas que Ia componen no se corresponden con Ia epidemia local existente.
Hasta el momento, las vacunas de VME han sido más utilizadas que cualquier otra vacuna del serogrupo B y son útiles en el contexto de los brotes de Ia enfermedad causada por un solo tipo de cepa. Los inmunógenos responsables de Ia reactividad cruzada inducida por este tipo de preparados no han sido completamente caracterizados, y muchos antígenos presentes en estos preparados restan por ser identificados. Estudios realizados con los sueros provenientes de ensayos clínicos del Instituto Finlay y el NIPH, sugieren que los anticuerpos contra Ia proteína de clase 1 (P1 , también llamada PorA) y Opc (otra PME mayoritaria) (Wedege E, et al. (1998). Immune Responses against Major Outer Membrane Antigens of Neissería meningitidis in Vaccinees and Controls Who Contracted Meningococcal Disease during the Norwegian Serogroup B Protection Trial. Infecí Immun. 66(7): 3223-31), son importantes mediadores de Ia actividad bactericida del suero (fundamentalmente P1) y en ambas proteínas se observó una marcada variabilidad de cepa a cepa. La proteína P1 es un antígeno con un significativo nivel de variabilidad, el cual parece experimentar variación continua entre y durante los brotes (Jelfs J, et al. (2000). Sequence Variation in the porA Gene of a Clone of Neissería meningitidis during Epidemic Spread. Clin Diagn Lab Immunol. 7(3):390-5). Hacia este antígeno van dirigidos predominantemente los anticuerpos bactericidas después de Ia vacunación y después de Ia enfermedad. Sin embargo su variabilidad hace cuestionable que Ia protección producto de Ia inmunización con vacunas de VME de una sola cepa (monovalentes) sea de amplio espectro. Para resolver este problema, se desarrolló una vacuna de VME en Holanda (RIVM) que contenía P1 de seis aislamientos patogénicos diferentes (van der Ley P and Poolman JT. (1992). Construction of a multivalent meningococcal vaccine strain based on the class 1 outer membrane protein. Infecí Immun. 60(8):3156-61 ; Claassen I, et al. (1996). Production, characterization and control of a Neisseria meningitidis hexavalent class 1 outer membrane protein containing vesicle vaccine. Vaccine 14 (10):1001-8). En este caso las vesículas fueron extraídas de dos variantes de Ia cepa H44/76, genéticamente manipulada para expresar tres proteínas P1 independientes. La búsqueda de un antígeno universal
Aunque las PME pueden inducir una respuesta inmune funcional contra el serogrupo B, ninguna de las vacunas confiere una protección universal, debido a Ia gran heterogeneidad de las regiones expuestas en Ia superficie de las PME. La discreta reactividad cruzada inducida por las vacunas de VME ha incentivado Ia búsqueda de un antígeno de membrana extema (o de un grupo de antígenos), que induzca anticuerpos funcionales y esté presente en todas las cepas del meningococo. Estos antígenos deben ser Ia base para una vacuna antimeningocóccica realmente universal, Ia cual eliminará el potencial problema de Ia modificación capsular en las cepas patogénicas, después de Ia vacunación con polisacárido.
Debido a Ia variabilidad de Ia proteína inmunodominante P1 , su uso en una vacuna universal está limitado y por tanto otras PME mayoritarias fueron consideradas candidatos para una vacuna y muchas de ellas se encuentran en desarrollo. Algunas de las que han sido incluidas son: proteínas reguladas por hierro (TbpA y B, FbpA y FetA), NspA y proteínas de clase 5 (Opc). TbpB forma parte del complejo de unión de transferrina, junto con TbpA. Recientes trabajos sugieren que Ia TbpA tiene una función más importante en Ia unión al hierro (Pintor M, et al. (1998). Analysis of TbpA and TbpB functionality ¡n defective mutants of Neissería meningitidis. J Med Microbio! 47(9): 757-60) y es un inmunogéno más efectivo que Ia TbpB.
La proteína NspA, una PME minoritaria, altamente conservada, ha sido descubierta a través de una técnica novedosa, Ia que consiste en emplear combinaciones de PME provenientes de diferentes cepas para inmunizar ratones (Martin D, et al. (1997). Highly Conserved Neissería meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173-83). Para producir hibridomas se utilizaron células B de ratones inmunizados, y los mAbs se examinaron para detectar Ia reactividad cruzada contra múltiples cepas del meningococo. Como resultado se encontró un anticuerpo monoclonal con reactividad cruzada que reconoció una PME de 22 kDa y fue designada como NspA. La inmunización de ratones con NspA indujo respuesta de anticuerpos bactericidas contra cepas de los grupos A hasta C. Esta proteína también protege contra Ia infección meningocóccica letal (Martin D, et al. (1997). Highly Conserved Neissería meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173-83). La comparación de secuencias de NspA genéticamente divergentes, demostró que Ia proteína está altamente conservada (97% homología) (Cadieux N, et al. (1999). Bactericidal and Cross-Protective Activities of a Monoclonal Antibody Directed against Neissería meningitidis NspA Outer Membrane Protein. Infect Immun 67 (9): 4955-9). La presencia de NspA se detectó por ELISA en un 99.2% de las cepas evaluadas pertenecientes a los serogrupos desde Ia A hasta Ia C, utilizando anticuerpos monoclonales (Martin D, et al. (1997). Highly Conserved Neissería meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection. J Exp Med 185 (7): 1173-83). Se ha comprobado que estos anticuerpos monoclonales presentan actividad bactericida contra numerosas cepas del meningococo y son capaces de reducir Ia bacteriemia provocada por este microorganismo en un modelo murino (Cadieux N, et al. (1999). Bactericidal and Cross-Protective Activities of a Monoclonal Antibody Directed against Neissería meningitidis NspA Outer Membrane Protein. Infect Immun 67 (9): 4955-9). Aunque estos resultados sugieren que Ia NspA es un prometedor candidato vacunal capaz de conferir protección contra varios serogrupos, un suero policlonal de ratón contra Ia proteína recombinante no se asoció a Ia superficie en un 35% de las cepas de meningococo del serogrupo B, a pesar de Ia presencia del gen nspA en estos organismos (Moe GR et al. (1999). Differences in Surface Expression of NspA among Neisseria meningitidis Group B Strains. Infecí Immun 67 (11): 5664-75).
Secuenciación del genoma de Neisseria meningitidis y su impacto en el desarrollo de vacunas. La secuenciación del genoma de MC58, una cepa de meningococo del serogrupo B fue publicada durante el año 2000 (Tettelin H, et al. (2000). Complete Genome Sequence of Neisseria meningitidis Serogroup B Strain MC58. Science 287 (5459): 1809-15172), y de Z2491 , una cepa de serogrupo A (Parkhill J, et al. (2000). Complete DNA sequence of a serogroup A strain of Neisseria meningitidis Z2491. Nature 404 (6777):502-6173). La disponibilidad de las secuencias de ADN ha tenido una gran influencia en Ia investigación de una vacuna antimeningocóccica. Mientras Ia secuenciación del genoma de MC58 continuaba su desarrollo, Pizza y colaboradores comenzaron identificando los marcos abiertos de lectura (ORFs) que según las predicciones codificaban para las proteínas expuestas en Ia superficie, las unidas a membrana y las que se exportan. Este grupo de investigadores identificó 570 ORFs, amplificados a través de Ia reacción en cadena de Ia polimerasa y los clonó en Escherichia coli, para permitir Ia expresión de proteínas de fusión con cola de histidina o glutatión S- transferasa (Pizza M, et al. (2000). Identification of Vaccine Candidates Against Serogroup B Meningococcus by Whole-Genome Sequencing. Science 287 (5459): 1816-20). El 61 % (350) de los ORFs seleccionados fueron expresados exitosamente. En Ia mayoría de los casos, aquellos que no lograron expresarse tenían más de un dominio hidrofóbico de transmembrana. Las proteínas recombinantes fueron purificadas y se utilizaron para inmunizar ratones. Los sueros obtenidos fueron evaluados por ELISA, citometría de flujo y se les determinó Ia actividad bactericida contra 2 cepas. Posteriormente se seleccionaron 7 proteínas que en los 3 ensayos resultaron positivas. Las formulaciones vacunales empleando algunas de estas proteínas combinadas con adyuvantes, indujeron títulos significativos de anticuerpos bactericidas contra Ia cepa homologa (MC58), pero ninguno de ellos fue tan alto como los inducidos por una vacuna de VME de esta misma cepa (Giuliani MM, et al. 2000. Proceedings 12th IPNC. p. 22). Por otro lado, existen evidencias de que combinaciones de estas proteínas resultan más inmunogénicas que cada proteína por separado (Santini L. eí al. (2000). Proceedings 12th IPNC. p. 25). Los numerosos ORFs excluidos en ese trabajo, por Ia falta de Ia expresión proteica o por modificaciones de las propiedades inmunológicas, necesitan una investigación más profunda. Los componentes de una vacuna deben seleccionarse en base a Ia contribución de los antígenos en Ia patogénesis de N. meningitidis. Los antígenos por sí solos pueden ser efectivos candidatos vacunales, o alternativamente, los mutantes atenuados pueden ser considerados integrantes de una vacuna. Un importante problema de Ia prevención y/o Ia terapia de Ia enfermedad meningocóccica es que ninguna de las vacunas disponibles hasta Ia fecha confiere una protección universal, debido a Ia gran heterogeneidad de los antígenos del meningococo que se han empleado como vacuna.
Descripción de Ia invención
Esta invención contribuye a resolver el problema antes mencionado al proporcionar composiciones farmacéuticas que contienen una proteína cuya secuencia está altamente conservada, incluso entre diferentes géneros de microorganismos patógenos. El objetivo técnico que se persigue con esta invención es precisamente el desarrollo de composiciones capaces de elevar y/o ampliar Ia respuesta inmune sistémica y mucosal del hospedero contra varios patógenos, o contra un espectro amplio de variedades del mismo. Se reporta por primera vez el uso de Ia proteína NMA0939 en composiciones farmacéuticas de carácter terapéutico o preventivo.
Más particularmente Ia invención se refiere a composiciones farmacéuticas, que contienen dicha proteína, para prevenir o tratar cualquier infección provocada por una bacteria del género Neisseria. En una realización particular de Ia invención, las composiciones farmacéuticas que contienen dicho antígeno son útiles para Ia prevención o el tratamiento de enfermedades causadas por N. meningitidis y N. gonorrhoeae, respectivamente.
En otra materialización de Ia invención las composiciones farmacéuticas que contienen Ia proteína NMA0939, pueden contener también uno o varios antígenos de naturaleza sintética, recombinante o natural. En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas combinadas contienen antígenos polisacarídicos, incluyendo los polisacáridos bacterianos. Más particularmente Ia invención se refiere a los polisacáridos capsulares de N. meningitidis. La composición farmacéutica de Ia presente invención puede contener conjugados proteína- polisacárido, cuyo componente polisacarídico se corresponda con un polisacárido bacteriano.
En otra realización preferida, las composiciones farmacéuticas que contienen NMA0939, contienen antígenos de naturaleza peptídica, con el fin de ampliar el espectro de protección de las mismas.
Las composiciones de Ia presente invención son administradas por ruta parenteral, o por ruta mucosal, incluyendo Ia administración por vía oral. En otra materialización de Ia invención, Ia proteína NMA0939 puede ser empleada como inmunopotenciadora o portadora de péptidos, polisacáridos u otros antígenos de menor inmunogenicidad, con el fin de potenciar Ia respuesta inmune contra los mismos. El ejemplo 11 ¡lustra que Ia proteína mencionada anteriormente es capaz de elevar significativamente los niveles de anticuerpos contra un péptido derivado de un antígeno viral, una vez que han sido conjugadas ambas moléculas. También es parte de Ia presente invención, que los determinantes protectores para un antígeno proteico dado sean insertados dentro de Ia secuencia de Ia proteína NMA0939, con el fin de inducir una repuesta inmune aumentada contra los mismos, dando lugar a proteínas híbridas que formen parte de una composición farmacéutica. En otra realización preferida, las composiciones farmacéuticas de Ia presente invención pueden contener fragmentos de Ia proteína NMA0939, que sean capaces de generar en el hospedero una respuesta protectora contra el meningococo u otra bacteria del género Neisseria. En una realización particular de Ia invención, las composiciones farmacéuticas contienen mimotopos o péptidos miméticos de Ia proteína NMA0939, en forma sintética u obtenidos mediante tecnología del ADN recombinante. El término "mimotopo" significa cualquier péptido que sea capaz de generar anticuerpos que se combinen con Ia proteína NMA0939, y por esa vía sean capaces de producir una respuesta protectora contra Neisseria. También es parte de Ia presente invención Ia detección de Ia enfermedad meningocóccica mediante el empleo de componentes farmacéuticos que contengan Ia proteína NMA0939, o el gen codificante para Ia misma, ya sea por sí solos o en combinación con otros componentes.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Vector pM238 empleado en el clonaje y Ia expresión de Ia proteína NMA0939.
Figura 2. Construcción final obtenida del clonaje de Ia secuencia nucleotídica correspondiente al gen nmaO939 en el vector pM238.
Figura 3. Análisis mediante SDS-PAGE de las fracciones obtenidas en Ia ruptura celular; carril 1, células totales; carril 2, precipitado de ruptura; carril 3, sobrenadante de ruptura. PM: patrón de peso molecular.
Figura 4. Análisis de Ia pureza de las diferentes fracciones del proceso de purificación de Ia proteína recombinante NMA0939, a partir del precipitado de ruptura, mediante SDS-PAGE: Carril 1 , precipitado de solubilización con urea 2M en tampón carbonato- bicarbonato; carril 2, sobrenadante de solubilización; carril 3, fracción no adsorbida a Ia matriz de purificación; carril 4, contaminante de menor peso molecular que eluye en otro pico cromatográfico; carril 5, proteína purificada. PM: patrón de peso molecular. Figura 5. Niveles de anticuerpos (IgG) contra Ia proteína recombinante NMA0939, obtenidos al inmunizar ratones con el mismo antígeno adyuvado con Adyuvante de Freund (Freund), hidróxido de Aluminio (Alum) o polisacárido C (PsC) de N. meningitidis, por vía intraperitoneal. Se representan los resultados obtenidos en un ensayo tipo ELISA, que fueron expresados como el inverso del título, calculado como Ia dilución de Ia muestra de suero donde se duplica Ia densidad óptica de Ia muestra de suero preinmune.
Figura 6. Reconocimiento de determinantes antigénicos presentes en las PME de N. meningitidis, cepa CU385, utilizando sueros de ratones inmunizados con Ia proteína recombinante NMA0939 adyuvada con Adyuvante de Freund (Freund), hidróxido de Aluminio (Alum) o polisacárido C (PsC) por vía intraperitoneal. Los resultados fueron expresados como el inverso del título, calculado como Ia dilución del suero donde se duplica Ia densidad óptica del suero preinmune. Figura 7. Resultados de Ia búsqueda de similitud entre el gen que codifica para Ia proteína NMA0939 ("query") y las secuencias anotadas de los genomas de diferentes serogrupos de N. meningitidis ("Sbjct") empleando el programa BLAST.
Figura 8. Reconocimiento de antígenos presentes en 5 cepas de N. meningitidis, por sueros producidos después de Ia inmunización con Ia proteína recombinante
NMA0939 mezclada con polisacárido C de N. meningitidis por vía intraperitoneal.
Los sueros generados después de Ia inmunización de Ia proteína con otros adyuvantes tuvieron un comportamiento similar. Los resultados fueron expresados como el inverso del título, calculado como Ia dilución del suero donde se duplica Ia densidad óptica del suero preinmune.
Figura 9. Experimentos de protección pasiva contra infección meningocóccica en el modelo de rata infante, utilizando los sueros obtenidos inmunizando con Ia proteína recombinante NMA0939 con Adyuvante de Freund (Freund), con hidróxido de Aluminio (Alum) o mezclada con el polisacárido C (PsC) de N. meningitidis. A: Infección con Ia cepa CU385, y B: Infección con Ia cepa 233 (C: 2a: P1.5). C-: mezcla de sueros de animales no tratados, C+: suero de ratón inmunizado con vesículas de membrana externa de N. meningitidis de Ia cepa CU385 o 233, según corresponda con el experimento. El símbolo * representa una diferencia estadísticamente significativa respecto al grupo control negativo (C-), en cuanto a los niveles de bacteremia expresados como unidades formadoras de colonias por mililitro (ufc/ml).
Figura 10: Reconocimiento de Ia proteína recombinante NMA0939 y de un panel de antígenos no relacionados, por los mAbs generados (mAbs H 10/67, 3H3/24 y 7D6/18). Antígenos: P1 , proteína de clase 1 de N. meningitidis cepa B:4:P1.15; P64k, proteína de N. meningitidis] TT, toxoide tetánico; HBsAg, antígeno de superficie del virus de Ia Hepatitis B. Los resultados se representan como Ia absorbancia (492nm) en un ensayo tipo ELISA.
Figura 11. Reconocimiento de Ia proteína recombinante NMA0939 por sueros de pacientes convalecientes de Ia enfermedad meningocóccica. Como control negativo se emplearon sueros de donantes sanos. Los resultados se representan como Ia absorbancia (492nm) en un ensayo tipo ELISA. Figura 12. Títulos de anticuerpos anti-péptido JY1 correspondientes a ios sueros de los animales inmunizados con el péptido libre (JY1), Ia proteína recombinante (NMA0939) y el conjugado JY1-NMA0939.
Figura 13. Niveles de anticuerpos (IgA) contra Ia proteína recombinante NMA0939 presentes en muestras de lavados pulmonares de ratones inmunizados por vía intranasal con Ia proteína mezclada con polisacárido C de N. meningitídis (NMA0939+PsC) o con Ia proteína incorporada en liposomas (NMA0939JJp).
Ejemplos de realización
Ejemplo 1. Detección de Ia proteína NMA0939 en preparaciones de vesículas de membrana externa de Neisseήa meningitidis, serogrupo B.
Con el objetivo de estudiar las proteínas presentes en preparaciones de vesículas de membrana externa de N. meningitidis serogrupo B (cepa CU385, clasificación B:4:P1.19,15), se realizó una electroforesis bidimensional según Io descrito en Ia literatura (Sabounchi-Schutt F, et al. (2000). An immobiline DryStrip application method enabling high-capacity two-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis 21 : 3649-3656. A continuación se realizó una digestión enzimática de las proteínas extraídas del gel empleando Ia enzima tripsina (Promega, Madison, Wl, E. U). Los péptidos generados durante Ia digestión fueron extraídos de Ia solución empleando microcolumnas (ZipTips, Millipore, MA, E. U). Previo al análisis por espectrometría de masas los péptidos fueron eluídos de las microcolumnas con solución de acetonitrilo al 60% y 1% de ácido fórmico e inmediatamente Ia mezcla se cargó en nanoagujas (Protana, Dinamarca). Las mediciones se realizaron en un espectrómetro de masas híbrido con cuadrupolo y tiempo de vuelo (QTof-2™, Manchester, Reino Unido), equipado con una fuente de ionización (nanoESI). Los espectros de masas fueron adquiridos en un rango de m/z desde 400 hasta 2000 en 0.98 segundos y utilizando 0.02 segundos entre cada uno de los barridos. La adquisición y procesamiento de los datos fue realizada a través del programa MassLynx (versión 3.5, Micromass).
La identificación de proteínas basada en los espectros ESI-MS se realizó empleando el programa ProFound (Zhang VV and Chait BT. (2000). ProFound: an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping information. Anal Chem 72:2482-2489; http://prowl.rockefeller.edu/cgi- bin/ProFound). La búsqueda se subscribió a las secuencias de genes y proteínas de bacterias contenidas en las bases de datos SwissProt (http://www.ebi.ac.uk/swissprot/) y NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), considerando Ia oxidación de metioninas, Ia desamidación y Ia carboxiamidometilación de cisteínas como posibles modificaciones presentes. La identificación de las proteínas basada en los espectros MS/MS se realizó a través del programa MASCOT (Perkins DN, ef al. (1999). Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Eledrophoresis 20:3551-3567. http://www.matrixscience.com/). Entre los parámetros de búsqueda se incluyó Ia modificación de cisteínas así como las posibles oxidaciones y desamidaciones. A partir del análisis de los datos obtenidos de Ia identificación de las proteínas presentes en preparaciones de vesículas de membrana externa se seleccionó para secundar un grupo de péptidos. A partir de Ia secuenciación por espectrometría de masas de uno de ellos se verificó Ia existencia en el serogrupo B de un homólogo de Ia proteína NMA0939, que no estaba identificado ni predicho a partir de los genomas de serogrupo B. Este candidato homólogo al NMA0939, es denominado NMA0939 a Io largo de todo el documento.
Ejemplo 2. Análisis de homología de Ia proteína NMA0939 con productos génicos reportados en bases de datos
Para el análisis de homología de Ia proteína NMA0939, se realizó una búsqueda de similitud de secuencias en Ia base de datos del NCBl empleando el programa BLAST (Altschul SF, et al. (1990). Basic local alignment search tool. J Mol BIoI 215:403-410; http://www.ncbi.nlm.nih.gOv/BLAST/V Con este procedimiento se identificó el correspondiente homologo en el caso de N. gonorrhoeae y el de serogrupo A de N. meningitidis, no siendo así en el caso de Ia cepa MC58 del serogrupo B de esta especie. Sin embargo, Ia realización de una búsqueda de homología empleando Ia secuencia nucleotídica del gen nmaO939 sí demostró Ia presencia del mismo en dicha cepa, Io que indica en este caso un error de anotación para el correspondiente genoma. El gen en cuestión anotado se corresponde con el ORF r?A77aO939, con homólogos presentes también en N. gonorrhoeae (NGO0306). En el serogrupo B el homólogo a esta proteína está codificado en Ia región de ADN comprendida entre las posiciones 761673 y 762295, ubicada inmediatamente a continuación del gen nmbO729 y antes del gen nmb0730. Este es, por tanto, el primer reporte de Ia existencia de un homólogo de Ia proteína NMA0939 en el serogrupo B. En otros microorganismos no se logró identificar ninguna proteína con valores significativos de similitud, Io que indica a un posible antígeno género específico.
Ejemplo 3. Clonaje y expresión del gen nmaO939, codificante para Ia proteína NMA0939 de Neissería meningitidis, en Escheríchia coli.
Para realizar el clonaje y Ia expresión del gen nmaO939 se utilizó el vector pM238. Dicho vector permite realizar el clonaje empleando diferentes enzimas de restricción, y obtener elevados niveles de expresión de proteínas heterólogas en forma de cuerpos de inclusión en el citoplasma de E. coli. El vector pM238 (Figura 1) cuenta con los siguientes elementos principales: promotor triptófano, secuencia correspondiente al segmento estabilizador N- termínal del antígeno P64k de N. meningitidis cepa CU385 (codificante para 47 a.a), secuencia que codifica para una cola de histidina C-terminal, secuencia correspondiente al terminador de Ia transcripción del bacteriófago T4 y secuencia correspondiente al gen que confiere resistencia a ampicillina como marcador de selección. Además, este vector permite Ia selección de los recombinantes mediante Ia coloración azul o blanca de las colonias, producto de Ia presencia del gen lac∑ subunidad alfa. A partir de Ia secuencia nucleotídica correspondiente al gen que codifica para Ia proteína NMA0939 (Ejemplo 1) se procedió a diseñar un par de oligonucleótidos (704467U y 704467L) para amplificar el segmento de dicho gen sin Ia secuencia que codifica para el péptido señal, utilizando el ADN genómico de Ia cepa CU385 (B:4:P1.19,15).
Xba-I BgI-II 704467U: 5'GTGGTATCTAGATCTGCCAGCCAGAAACTC '3 (SEQ ID No. 1)
704467L: 5' CAACCCGGGATCCTTCCTTGTCCAAATC 3Λ
BamH-l (SEQ ID No. 2) Para la predicción del péptido señal se utilizaron los métodos descritos en el SignalP World Wide Web server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SiqnalP-2.0). A continuación de Ia amplificación del gen codificante para Ia proteína NMA0939 mediante Ia reacción en cadena de Ia polimerasa (RCP) (Saiki R K, et al. (1988). S Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487-491), utilizando los oligonucleótidos 704467U y 704467L1 se digirió dicho producto de RCP, empleando las enzimas BgIII y BamH-l, y se clonó en el vector pM238 digerido previamente de Ia misma forma. La construcción final obtenida se muestra en Ia Figura 2, Ia proteína recombinante NMA0939 se obtuvo fusionada al segmento N-terminal de Ia P64k. La secuenciación del segmento del gen nmaO939 clonado se realizó empleando el secuenciador automático ALFexpressIl (Termo Sequenase™ Cy™ 5 Dye Terminator Kit, Amersham Biosciences) y los oligonucleotidos 1573 (SEQ ID No. 8) y 6795 (SEQ ID No. 9), que hibridan en Ia secuencia correspondiente al segmento estabilizador de Ia P64k y en el terminador de Ia transcripción del bacteriófago T4, respectivamente. El plasmidio obtenido se nombró pM NMA0939 para su posterior utilización.
Para Ia expresión del gen nmaO939 se transformó por el método químico Ia cepa de E. coli GC 366 con el plasmidio pM NMA0939 (Figura 2). El experimento de expresión se realizó en medio mínimo salino M9 (Miller JH. (1972). Experiments in Molecular Genetics, CoId Spring Harbor Laboratory Press, New York, EU) suplementado con glucosa al 1 %, hidrolizado de caseína al 1%, extracto de levadura 0.1%, CaCI2 0.1 mM, MgSO4 1mM y ampicillina 50 μg/mL. Los cultivos se incubaron durante 12 h a 37°C a 250 r.p.m. Al cabo de este tiempo se centrifugaron y se realizó Ia ruptura del precipitado celular mediante disrupción ultrasónica (IKA LABORTECHNIK). Fracciones de sobrenadante y precipitado obtenidas se analizaron mediante electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE, del inglés Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide GeI Electrophoresis) (Laemmli UK. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 277:680) y tinción con Azul Brillante de Coomassie R-250; analizándose el porciento de expresión mediante densitometría del gel (LKB Bromma 2202 Ultrascan láser densitometer; Amersham Pharmacia Biotech, Reino Unido). La proteína NMA0939 se obtuvo en el precipitado de ruptura, representando un 20% del total de las proteínas presentes en esta fracción (Figura 3). Muestras del precipitado celular se solubilizaron con tampón carbonato-bicarbonato (carbonato de sodio 0.1 M, hidrógeno carbonato de sodio 0.1 M) conteniendo urea disuelta a diferentes molaridades (2M, 4M, 6M y 8M). Cuando se utilizó el tampón antes descrito que contiene disuelto urea 2M, se solubiliza Ia proteína NMA0939 presente en el precipitado de ruptura. El sobrenadante después de Ia solubilización se sometió a una cromatografía de afinidad por quelatos metálicos para realizar Ia purificación de Ia proteína de interés y se obtuvo una muestra con un 80% de pureza, como se muestra en Ia Figura 4. Por último se realizó una diálisis y se procedió a su evaluación en animales de laboratorio.
Ejemplo 4. Evaluación de Ia respuesta inmune inducida por Ia proteína NMA0939 por vía intraperitoneal. Para evaluar la inmunogenicidad de Ia proteína NMA0939, se diseñó un esquema de inmunización en ratones, en el que se administró Ia proteína adyuvada con hidróxido de aluminio, adyuvante de Freund o polisacárido C de N. meningitidis. Con estas preparaciones se inmunizaron ratones Balb/c hembras, de 8 a 10 semanas de edad, los cuales fueron divididos en 3 grupos de 8 ratones cada uno. Se realizaron 3 inmunizaciones por vía intraperitoneal, separadas por un intervalo de 7 días. Se empleó un grupo control que recibió PBS en las tres primeras inmunizaciones, pero al igual que el resto de los grupos recibió una dosis de refuerzo con Ia proteína adyuvada con hidróxido de Aluminio, a los 45 días después de iniciado el experimento. En Ia Tabla 1 se describe Ia composición de los grupos:
Tablai : Grupos de ratones Balb/C utilizados para Ia inmunización
Figure imgf000017_0001
Los títulos de anticuerpos (IgG) contra Ia proteína recombinante y contra antígenos presentes en Ia bacteria se determinaron mediante un ensayo tipo ELISA, en sueros obtenidos después de Ia dosis de refuerzo. En Ia Figura 5 se muestran los títulos de anticuerpos de cada uno de los animales contra Ia proteína recombinante. Desde Ia segunda inoculación se detectan anticuerpos capaces de reconocer el antígeno administrado (datos no mostrados), aunque fueron superiores luego de Ia última inoculación. También se realizó Ia identificación inmunológica por Western blotting, detectándose el reconocimiento de Ia banda correspondiente a Ia proteína (datos no mostrados). Los sueros obtenidos después de inmunizar con Ia proteína recombinante reconocieron determinantes antigénicos presentes en un preparado de PME de Ia cepa CU385. Estos resultados se representan en Ia Figura 6. Para el análisis estadístico se transformaron los títulos de anticuerpos obtenidos para lograr distribución normal de los valores y/o homogeneidad de varianza. En general, Ia significación estadística de las diferencias entre los grupos se analizó por análisis de varianza de clasificación simple, seguido por Ia prueba de rangos múltiples de Newman Keuls.
Ejemplo 5. Caracterización de Ia secuencia del gen codificante para Ia proteína NMA0939 en distintas cepas de Neissería meningitidis y en Neissería gonorrhoeae.
Para analizar Ia conservación de Ia secuencia del gen codificante para Ia proteína NMA0939 entre distintas cepas, se realizó una búsqueda de similitud con los genomas de N. meningitidis (serogrupos A y B) y N. gonorrhoeae anotados en Ia base de datos del NCBI (NC 003116.1 , NC 003112.1 , NC 002946), empleando el programa BLAST (Altschul SF, et al. (1990). Basic- local alignment search tool. J Mol Biol 215:403-410; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). La Figura 7 muestra los resultados de Ia comparación para aquellas secuencias que producen un alineamiento significativo en cada uno de los genomas analizados. Dichas secuencias presentan un 99% de identidad en el serogrupo B, un 100% de identidad en el serogrupo A y un 96% en el caso de N. gonorrhoeae, con Ia secuencia del gen codificante para Ia proteína NMA0939 obtenida (SEQ ID No. 3). Adicionalmente, se determinó Ia secuencia nucleotídica del gen en cuestión para 3 aislamientos cubanos (SEQ ID No. 5-7) pertenecientes al serogrupo B (B:4:P1.19,15) y se realizó un alineamiento de secuencia empleando el programa ClustalX (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). Los resultados del alineamiento evidencian que existe una gran conservación en Ia secuencia nucleotídica del gen nmaO939 entre las distintas cepas analizadas y de manera general en el género Neisseria.
El empleo de Ia proteína NMA0939 como candidato vacunal, tomando en cuenta el alto grado de similitud existente entre las secuencias anteriormente citadas, permitiría generar una respuesta inmune efectiva y de amplio espectro de protección contra Ia enfermedad meningoccócica, producto de Ia amplia reactividad.
Ejemplo 6. Caracterización de Ia respuesta inmune de amplio espectro de acción inducida por Ia inmunización de ratones Balb/c con Ia proteína NMA0939. Con el objetivo de evaluar si Ia inmunización con Ia proteína NMA0939 induce una respuesta de amplia reactividad con diversas cepas de Neisseria, se realizó un ensayo tipo ELISA en el que las placas de poliestireno se recubrieron con células completas de 5 cepas de Neisseria pertenecientes a diferentes serogrupos, serotipos y serosubtipos. Las placas se incubaron con Ia mezcla de los sueros obtenidos contra Ia proteína NMA0939 mezcladas con diferentes adyuvantes, según se describe en el Ejemplo 4.
En Ia Figura 8 se muestra el reconocimiento de antígenos presentes en cepas de los serogrupos A, B y C de N. meningitidis, por los sueros obtenidos después de Ia inmunización con Ia proteína recombinante NMA0939 mezclada con el polisacárido C de N. meningitidis. Los sueros generados después de Ia inoculación de Ia proteína con los otros adyuvantes tuvieron un comportamiento similar.
Ejemplo 7. Protección inducida por los sueros murinos generados contra Ia proteína NMA0939 en el modelo de rata infante
Para determinar Ia actividad funcional de los antisueros obtenidos, se realizó un ensayo de protección pasiva en el modelo de infección meningocóccica en ratas infantes. En dicho ensayo se emplearon 24 ratas de 5 a 6 días de nacidas, divididas en grupos de 6 animales cada uno. Se determinó si los sueros que se administraron por Ia ruta intraperitoneal protegían a las ratas de Ia infección meningocóccica causada por Ia cepa CU385, inoculada por Ia misma ruta una hora después. Los sueros de cada grupo de ratones inmunizados se mezclaron antes de ser inoculados en ratas infantes y se diluyeron 1 :10 en PBS estéril. Cuatro horas después del reto, los animales se sacrificaron y se hizo un conteo de las bacterias viables en su sangre. Para Ia interpretación de los resultados se realizó una pueba t de student de una sola cola, donde se compara cada grupo en estudio con el control negativo (mezcla de sueros de animales no tratados). Como se observa en Ia Figura 9A el grupo que recibió anticuerpos de los ratones que fueron inmunizados con Ia proteína NMA0939 mezclada con polisacárido C de N. meningitidis mostró diferencias significativas respecto al control negativo, o sea los anticuerpos fueron protectores en el modelo de rata infante. Los anticuerpos generados después de Ia inmunización con Ia proteína mezclada con Hidróxido de Aluminio también fueron protectores en este modelo (datos no mostrados).
Un ensayo similar fue realizado infectando las ratas infantes con Ia cepa 233 (C:2a: P1.5) y los resultados se muestran en Ia Figura 9B detectándose al igual que en el experimento anterior que los anticuerpos de ratones inmunizados con Ia proteína adyuvada con Hidróxido de Aluminio ó polisacárido C protegieron a las ratas de Ia infección meningocóccica en el modelo utilizado.
Se realizaron otros ensayos infectando a las ratas con las cepas H44/48 y 120/90, aisladas de pacientes en Cuba, cuya clasificación serológica es homologa a Ia de Ia cepa CU385. Además, se realizó un experimento de reto con Ia cepa H44/76 (B:15:P1.7,16) del serogrupo B. En todos los casos los antisueros de ratones inmunizados con Ia proteína NMA0939 adyuvada con Hidróxido de Aluminio o mezclada con polisacárido C de N. meningitidis protegieron a las ratas infantes contra Ia infección meningocóccica.
Ejemplo 8. Generación de anticuerpos monoclonales contra Ia proteína NMA0939, capaces de mediar actividad bactericida contra Neissería meningitidis
Con el objetivo de generar anticuerpos monoclonales (mAbs) específicos contra Ia proteína NMA0939, y estudiar su capacidad funcional de mediar actividad bactericida contra cepas homologas y heterólogas de N. meningitidis, se empleó en un esquema de inmunización una preparación de Ia proteína NMA0939 con un porciento de pureza del 80% (Ejemplo 3). El esquema de inmunización se realizó en ratones Balb/c (H-2d , sexo femenino, 5-6 semanas) y contó con un total de 4 dosis distribuidas de Ia siguiente manera: los días 0, 15 y 30 del esquema se inocularon 10 μg del antígeno NMA0939 por ratón (volumen total 100 μl), administrados por vía subcutánea, emulsificada Ia primera dosis con Adyuvante completo de Freund, y las restantes dosis con Adyuvante Incompleto de Freund; el día 50, se administraron 10 μg del antígeno por ratón en solución tampón fosfato (NaCI 140 mM, KCI 270 mM, KH2PO4 1.5 mM, Na2HPO4 x 2H2O 6.5 mM, pH 7.2) por vía intraperitoneal. Las extracciones se realizaron los días 0 y 45 del esquema.
Los esplenocitos del animal de mejor título, evaluados mediante un ELISA indirecto empleando Ia proteína NMA0939 en el recubrimiento, se fundieron con las células de mieloma X63 Ag8 653 y los hibridomas resultantes se aislaron y pesquisaron según métodos establecidos (Gavilondo JV. (1995). Anticuerpos Monoclonales: Teoría y Práctica, Elfos Scientiae, La Habana, Cuba). La reactividad de los anticuerpos secretados por los hibridomas obtenidos contra Ia proteína NMA0939, así como su reactividad contra un grupo de antígenos no relacionados, se evaluó mediante un ELISA indirecto empleando en el recubrimiento 5 μg/ml de cada uno de los antígenos, e igual concentración de los mAbs a ensayar. La Figura 10 muestra los resultados obtenidos en este experimento, en total se obtuvieron 3 clones positivos (mAbs H 10/67, 3H3/24 y 7D6/18) que reconocen específicamente Ia proteína NMA0939, y no a Ia secuencia aminoacídica correspondiente al segmento N-term de Ia P64k, tampoco al resto del panel de antígenos no relacionados ensayados.
Para determinar Ia capacidad de los mAbs generados contra Ia proteína NMA0939 de mediar actividad bactericida contra cepas homologas y heterólogas de N. meningitidis se realizó un ensayo bactericida. El título de anticuerpos bactericidas fue expresado como el recíproco de Ia mayor dilución de anticuerpos evaluada, capaz de matar el 50% ó más de las bacterias; dos de los mAbs generados (3H3/24 y 7D6/18) tuvieron títulos bactericidas superiores a 1 :128 contra Ia cepa homologa B:4:P1.19,15 y uno (H10/67) superior a 1 :80. Además tuvieron títulos superiores a 1 :64 contra las cepas heterólogas cuyas clasificaciones son B:15:P1.7,16 y C:2a:P1.5, respectivamente.
Ejemplo 9. Caracterización de las regiones blanco de Ia respuesta inmune murina contra Ia proteína NMA0939
Con el objetivo de identificar las regiones dentro de Ia proteína, que son más reconocidas por los antisueros murinos generados contra el antígeno recombinante se realizó un ensayo de tipo SPOTScan. Una serie de péptidos sobrelapados que cubren Ia secuencia de Ia proteína se sintetizaron sobre un soporte de celulosa y Ia membrana se incubó con una mezcla de sueros diluida 1 :100. La reacción antígeno-anticuerpo se detectó mediante Ia incubación con un conjugado anti-lgG murina- fosfatasa alcalina, seguido de Ia adición de una solución que contenía el sustrato Bromo-Cloro-Indolil-Fosfato. Se observaron varias regiones antigénicas comunes presentes en Ia proteína, con independencia de Ia preparación que se empleó en Ia inmunización (datos no mostrados). No obstante, se apreció que en los grupos inmunizados con proteína adyuvada con Adyuvante de Freund se obtuvo un patrón de reconocimiento mucho más amplio.
Ejemplo 10. Reconocimiento de Ia proteína NMA0939 por sueros humanos.
Una batería de sueros humanos, provenientes de individuos convalecientes se empleó en este estudio, que se realizó en un ensayo tipo ELISA. Las placas se recubrieron con Ia proteína NMA0939 obtenida mediante electroforesis preparativa (5 μg/ml). Después de bloquear las placas con leche descremada en polvo al 3% en PBS con Tween-20, los sueros se diluyeron (1 :50) en Ia misma solución y se incubaron en las placas. El inmunoensayo prosiguió como ha sido ampliamente reportado. Como control negativo se emplearon sueros de donantes sanos. También se empleó como control no relacionado una mezcla de sueros de vacunados con vacuna recombinante contra Ia Hepatitis B (datos no mostrados). La Figura 11 muestra los resultados obtenidos con 5 sueros de convalecientes en este ensayo. Como se aprecia, los sueros de convalescientes reconocieron Ia proteína Io que indica que Ia misma se expresa durante Ia infección meningocóccica y que es inmunogénica. Ejemplo 11. Proteína NMA0939 como portadora de un péptido.
Para demostrar Ia capacidad portadora de Ia proteína recombinante NMA0939, se conjugó a Ia misma un péptido sintético de 15 residuos aminoacídicos, derivado de Ia región V3 de Ia proteína gp120 del VIH-1 , aislamiento JYl La conjugación se realizó por el método del glutaraldehído. El péptido JY1 libre, Ia proteína recombinante NMA0939 y el conjugado JY1-NMA0939, se administró a ratones adultos en un esquema de 3 dosis, donde los ¡nmunógenos se emulsificaron con Adyuvante de Freund. Dos semanas después de Ia tercera dosis se obtuvieron muestras del suero de los animales inmunizados, los que se analizaron por ELISA para determinar los niveles de anticuerpos anti-péptido. Para ello las placas se recubrieron con el péptido libre (20μg/ml) y el inmunoensayo prosiguió como se ha descrito previamente. Los resultados del experimento (Figura 12) evidencian Ia capacidad portadora de Ia proteína NMA0939, capaz de potenciar significativamente Ia respuesta de anticuerpos contra el péptido JY1 , tras su conjugación al mismo.
Ejemplo 12. Evaluación de Ia respuesta inmune inducida por Ia proteína NMA0939, por vía mucosal.
Para evaluar Ia inmunogenicidad de Ia proteína NMA0939 por vía mucosal, se diseñó un esquema de inmunización en ratones, en el cual se adiministró Ia proteína encapsulada en liposomas o mezclada con polisacárido C de N. meningitidis. Los liposomas se obtuvieron por el método de deshidratación- rehidratación como ha sido descrito previamente (Carménate T, et al. (2001).
Recombinant Opc protein from Neissería meningitidis reconstituted into liposomes elicits opsonic antibodies following immunization. Biotechnol. Appl. Biochem. 34:
63-69). Con ambas preparaciones se inmunizaron ratones Balb/c hembras, de 8 a 10 semanas de edad, los cuales recibieron 3 dosis de 50 μg de Ia proteína por vía intranasal, separadas por un intervalo de 15 días. Para realizar un análisis de
Ia respuesta a nivel mucosal se detectaron anticuerpos IgA presentes en muestras de lavados pulmonares de los ratones inmunizados. En Ia Figura 13 se muestran los niveles de anticuerpos IgA detectados en los dos grupos analizados.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Composición farmacéutica caracterizada por contener Ia proteína NMA0939 identificada como Seq. ID. No 4.
2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1 , para ser empleada en Ia prevención o tratamiento de infecciones causadas por una bacteria del género Neissería.
3. Composición farmacéutica según Ia reivindicación 1 , para ser empleada en Ia prevención o tratamiento de infecciones causadas por Neissería meningitidis o Neissería gonorrhoeae.
4. Composición farmacéutica según Ia reivindicación 1 , caracterizada por contener además uno o varios antígenos de diferente naturaleza, obtenidos por vía recombinante, sintética o natural.
5. Composición farmacéutica según Ia reivindicación 4, caracterizada por contener antígenos polisacarídicos, incluyendo los polisacáridos bacterianos.
6. Composición farmacéutica según Ia reivindicación 5, caracterizada por contener polisacáridos capsulares de Neissería meningitidis.
7. Composición farmacéutica según Ia reivindicación 4, caracterizada por contener conjugados proteína-polisacárido, cuyo componente polisacarídico se corresponda con un polisacárido bacteriano.
8. Composición farmacéutica según Ia reivindicación 4, caracterizada por contener antígenos peptídicos.
9. Composición farmacéutica según la reivindicación 1 , para ser administrada por vía parenteral o mucosal.
10. Composición farmacéutica según Ia reivindicación 1 , caracterizada porque Ia proteína NMA0939 se emplea como inmunopotenciadora o portadora de antígenos de diversa naturaleza.
11. Composición farmacéutica caracterizada por contener fragmentos o péptidos miméticos del antígeno NMA0939.
12. Componente farmacéutico caracterizado por contener Ia proteína NMA0939 identificada como Seq. ID. No 4, para ser empleado en Ia detección de Ia enfermedad meningocóccica en humanos, de forma independiente o en conjunto con otros componentes.
13. Componente farmacéutico caracterizado por contener el gen codificante para Ia proteína NMA0939, identificado como Seq. ID. No 3, para ser empleado en Ia detección de Ia enfermedad meningocóccica en humanos, de forma independiente o en conjunto con otros componentes.
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