WO2007108557A1 - Ｉｐ３受容体結合タンパク質による細胞内標的分子の制御 - Google Patents

Ｉｐ３受容体結合タンパク質による細胞内標的分子の制御 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to compositions and methods for controlling biological functions in mammalian cells. More specifically, the present invention relates to compositions Contact Yopi method for controlling the biological function of IP 3 receptor binding protein (I RB IT) and its intracellular target fraction Akiko is involved.
  • I RB IT IP 3 receptor binding protein
  • Akiko intracellular target fraction
  • the present invention also provides a method for screening a substance utilizing the control of the biological function.
  • IP 3 IP 3 receptor
  • IP 3 / C a 2 + signaling pathway induces release.
  • the IP 3 receptor is
  • IP 3 receptor is a tetrameric intracellular IP 3 inducible C a 2 + release channel (IP 3 _ gated C a 2 + release channel).
  • IP 3 _ gated C a 2 + release channel IP 3 inducible C a 2 + release channel
  • IP 3 receptor type 1 IP 3 R 1
  • IP 3 R 1 IP 3 receptor type 1
  • Mouse IP 3 R 1 consists of 2749 amino acids and is divided into three functionally distinct regions. That is, there is an IP 3 binding domain near the N-terminus, a channel-forming domain with a 6-transmembrane region near the C-terminus, and a control region between these two regions. Analysis of deletion mutants in the IP 3 binding domain showed that amino acid residues 226 to 578 of the IP 3 receptor are the minimal region required for specific and high affinity ligand binding, and the IP 3 binding core is called.
  • I RB ITP a binding protein release dwithinositol 1, 4, 5— ⁇ risphosphate
  • I RB IT The amino acid and base sequences of human and mouse I RB IT were determined by the present inventors (Japanese Patent Application Publication No. 20 04— 1 2 9 6 1 2, H. An do et al., J. B iol. Ch em. (20 03) 278: 1 0 6 02— 1 06 1 2). These I RB ITs consist of 530 amino acids, and the identity between human and mouse is 100%. The binding region for the IP 3 receptor is present in the N-terminal region of I RB IT (amino acids 1-104 in humans and mice).
  • I RB IT is (1) neutral protein (estimated p I value: 6. 48) force N-terminal region is relatively acidic (estimated pi value: 4.98), (2) N-terminal Multiple areas Phosphorylation sites are localized centrally, phosphorylation is presumed to be necessary for the interaction with IP 3 R 1, (3) essential for binding to IP 3 of IP 3 R 1 is also essential in the interaction of a lysine residue is 508 th is the I RB iT, (4) more dissociated from interaction with the IP 3 R 1 to IP 3, and (5) high salt concentration, Since it is dissociated from the interaction with IP 3 R 1 and extracted from the crude Mikuguchisome fraction, the interaction with IP 3 R 1 is presumed to be due to electrostatic binding. (Japanese Patent Application Publication No. 2004-129612).
  • I RB IT binds to IP 3 binding region of IP 3 receptor, in 1 1: has the property of dissociating from 0 IP 3 receptor by 1 P 3. Therefore, I RB IT is, IP 3 by inhibiting IP 3 binding receptors, also have the function of suppressing the activity of IP 3 receptors are clearly summer (Japanese Patent Application Publication No. 2004 - 1 29 6 1 2).
  • An object of the present invention is to provide a composition and method that enables control of biological functions in cells by utilizing the interaction between IRBIT and its molecular target.
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening a substance that enables control of the biological function by suppressing or enhancing the binding between IRBIT and its molecular target in a cell. It is.
  • I RB IT is a molecule that regulates protein synthesis, a molecule that regulates inositol phospholipids, and an intracellular pH. It was found that it is a molecule.
  • I RB I-cho acts as a tertiary messenger that binds to the three types of target molecules discovered this time and controls the function of these target molecules as one of the important molecules that control intracellular metabolism. Prove that you have.
  • IP 3 receptor binding protein I RB IT
  • composition comprising an antibody to I RB I nucleic controlling the expression / translation of T or I RB I, T,
  • composition for the control of at least one intracellular biological function selected from the group consisting of:
  • the protein synthesis involves cytoplasmic mRNA polyadju- sion by cleaving polyadenylation specificity factor (CPSF).
  • CPSF polyadenylation specificity factor
  • the inositol phospholipid metabolism involves intracellular PIP 2 synthase (PI PK II).
  • the intracellular pH is that involving intracellular p-type NaZHC0 3 cotransporter 1 (pNBCl).
  • control is suppression or enhancement.
  • the I RB I T is derived from human or mouse. .
  • the I RB IT comprises a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, or an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence, and I RB It has a biological activity equivalent to that of IT.
  • the composition is used in any of i n v i v o, i n v i t ro or e x v i v o.
  • the composition is for treatment of a disease.
  • the present invention also provides, in a second aspect, a method of using I RB IT in controlling intracellular protein synthesis in vitro or exvivo.
  • the I RB IT is coupled to the CPSF to provide the CP SF functionality. Control.
  • the present invention also provides, in a third aspect, a method of using IRBIT in controlling intracellular inositol phospholipid metabolism with inVitro or exvivo.
  • the I RB I T inhibits P I PK I I activity.
  • the present invention also provides, in the fourth aspect, a method of using IRBIT in controlling intracellular pH with invitro or exvivo.
  • the I RB I T activates pNBC1.
  • the activation of pNBC1 requires phosphorylation of the IRBIT.
  • the present invention also provides, in the fifth embodiment, a substance that suppresses or promotes the binding by measuring the binding between I RB IT and CP SF, PI PK II, or pNB C 1 in the presence of a candidate substance.
  • a method for screening a substance comprising identifying.
  • the substance is therapeutic or diagnostic.
  • the binding is performed in a mammalian cell.
  • the substance controls at least one intracellular biological function selected from the group consisting of intracellular protein synthesis, inositol phospholipid metabolism, and intracellular pH.
  • I RB IT is a I [rho 3 receptor binding protein derived from a mammal, is bound to I [rho 3 binding site of the receptor, I [rho 3 of the A protein that is released into the cytoplasm upon binding to the receptor.
  • I RB IT is a I [rho 3 receptor binding protein derived from a mammal, is bound to I [rho 3 binding site of the receptor, I [rho 3 of the A protein that is released into the cytoplasm upon binding to the receptor.
  • RB IT consists of CP SF, c 1 eavage / po 1 yadeny 1 ationspecificity factor), PI PK II (phosphatidy 1 inositol — 5—phosphate 4— kinase), or p NBC 1 (pancreastype N a / HCO 3 cotransporter 1).
  • I RB IT target proteins bind to I RB IT, they perform important biological functions involved in protein synthesis, inositol phospholipid metabolism, and maintenance of intracellular ⁇ ⁇ in the cell. Yes. Therefore, I RB IT is responsible for controlling these biological functions.
  • protein synthesis refers to a series of processes for transcription and translation of genes in cells, and in the present invention, regulation of mRNRNpolyadenylation in the cytoplasm is involved.
  • inositol phospholipid metabolism refers to the metabolism of re phospholipids containing IP 3.
  • suppression refers to a decrease, reduction or inhibition of the biological function.
  • the term “enhancement” refers to an increase, elevation or enhancement of the biological function.
  • e X V i V o refers to returning a cell or tissue once taken out of a living body to the living body after being treated with the composition of the present invention.
  • the term “patient” refers to mammals such as humans, mice, rats, dogs, cats, livestock animals (eg, horses, horses, peta, hidges, goats), preferably Point to human.
  • FIG. 1 is a Western blot diagram showing the binding of IRBIT and CPSF160.
  • I. ⁇ . represents Western blotting
  • I.P. represents immunoprecipitation
  • HA represents hemagglutinin as a tag
  • l o a d represents cell extract.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing that IRBIT binds to the mRNA binding site of the CP SF 160 subunit of CP SF.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing inositol phospholipid metabolism involving the IP 3 receptor, I RB IT, PI PK II, and IP 3 .
  • PLC represents phospholipase C.
  • Figure 4 shows the binding of mouse I RB IT to My c-PI PK II ⁇ , ⁇ , ⁇ .
  • ( ⁇ ) shows immunoprecipitation with anti-Myc antibody.
  • (B) shows immune sedimentation by anti-IRB IT antibody.
  • input represents cell extract
  • IP represents immunoprecipitation
  • Control IgG negative control
  • FIG. 5 shows that the mouse cerebellum PIPKIII co-precipitated with anti-mouse IRBIT antibody by immunoprecipitation.
  • i n p u t is the same as in Fig. 4.
  • Figure 6 shows that both IRBIT and Myc— ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ are localized in the cytoplasm. Merge shows the superposition of the stained image of ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ I and the stained image of IRBIT, and the overlapping part is yellow.
  • FIG. 7 shows the identification of the binding site of IRBIT that binds to PIPIKII using the IRBIT deletion mutant.
  • A shows a schematic diagram of a deletion mutant of IRBIT.
  • B shows the binding between the deletion mutant from the N-terminal side of IRBIT and Myc—PIPIKII.
  • C shows the binding of the deletion mutant from the C-terminal side of I RB I ⁇ to My c — P I P K I I a.
  • FIG. 8 shows that I RB I T Ser 6 8 and Ser 7 1 bind to P I P K I I.
  • i n p u t represents a cell extract
  • IP represents immunoprecipitation
  • I B represents Western plotting.
  • FIG. 9A is a Western blot diagram (upper figure) showing the binding of IRBIT and NBC1.
  • I R B I T black triangles
  • pNBCl spleen type
  • Each recombinant protein (1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7) is indicated by a black circle in the SDS polyacrylamide gel electrophoresis diagram (bottom of Fig. 9A), and in Fig. 9B,
  • the structures of pNBCl and kNBCl are shown schematically.
  • MB P indicates the maltose binding protein tag used for purification.
  • C B B represents Coomassie brilliant blue.
  • FIG. 10 shows the binding ability of NB C 1 deletion mutants to IRBIT.
  • Fig. 10B shows the result of Western blotting of the pulled-down sample with anti-HA antibody.
  • Black triangle The migration position of HA-I RB IT indicates the migration position of each deletion mutant protein.
  • FIG. 11 shows the binding ability of the deletion mutant of IRBIT and pNBC1.
  • Various deletion mutants of IRBIT were forcibly expressed in COS 7 cells as fusion proteins with GFP (green fluorescent protein), and binding to pNBC1 was examined by pull-down assay.
  • Fig. 1 1 A and Fig. 1 1 B are obtained by SDS-PAGE of the cell extract (1 ysate) or Punoré downsampnore (pu 1 1 — d own) expressing the respective deletion mutants. The result of Western blotting with an antibody is shown. The black triangle indicates the migration position of each deletion mutant. It can be seen that all I RB I T other than the full length (F L) is no longer bound to pNB C 1.
  • Figure 12 shows the binding of endogenous I RB IT and NB C 1 in the cerebellar membrane fraction.
  • immunoprecipitation IP was performed with the pre-immune antibody (control), anti-NBC 1 antibody, and anti-IRB IT antibody as controls, and the precipitate was subjected to SDS-PAGE.
  • Stamp stamping IB was performed with I RB IT antibody, anti-NB C 1 antibody, and anti-IP 3 receptor antibody. The black triangle indicates the migration position of each protein.
  • Figure 13 shows the binding of endogenous I RB IT and NB C 1 in COS 7 cell extract.
  • Immunoprecipitation IP was performed with the pre-immune antibody (control), anti-IRBIT antibody, and anti-NB C 1 antibody as controls from the extract of CO S 7 cells, and the precipitate was subjected to SDS-PAGE to obtain anti-NB C Western blotting (IB) was performed with 1 antibody or anti-I RB IT antibody.
  • the black triangle indicates the migration position of each protein. Left three rows in 1 2 absence C a C, right three rows are used sediment was respectively immune precipitated with 1 2 presence C a C.
  • Figure 14 shows the activation of pNBC1 by IRBIT as measured by the voltage clamp method.
  • Figure 14A shows the current value ( ⁇ ⁇ ) when the membrane potential is fixed at 1-25mV.
  • Fig. 14B shows the current change as I-V curve when the membrane potential is changed between 1 16 OmV and +6 OmV.
  • Figure 15 shows that phosphorylation of I RB IT is required for pNBC 1 activation.
  • the present invention provides a composition comprising IRBIT, a nucleic acid that controls the expression / translation of IRBIT, or an antibody against IRBIT.
  • the composition of the present invention comprises (1) protein synthesis, (2) inositol phospholipid metabolism, and (3) regulation of at least one intracellular biological function selected from the group consisting of intracellular pH. Used for.
  • control of protein synthesis is control of mRNA polyadenylation through binding of IRBIT and CPSF in cells.
  • CP S F is a complex protein consisting of four subunits: CP S F 1 60, CP SF 100, CP S F 73, and C P S F 30.
  • IRBIT binds to CPSF, particularly CPSF160, from co-precipitation tests by co-expression in COS cells and immunoprecipitation (Fig. 1).
  • CPSF is an indispensable molecule for the polyadrenation reaction of mRNA in the nucleus, but has the function of regulating protein synthesis by extending the length of poly (A) in the cytoplasm. It is known that the mRNA binding site of 160 is an essential region when CPSF recognizes the mRNA that adds poly (A) (C. Barnard Daron et al., Cell 2004, 1 1
  • polyadenylation includes two sequences in the 3 ′ untranslated region of mRNA, namely the cytoplasmic polyadenylation element (CPE) and CPE-binding protein (CPEB) force, a key regulatory protein of polyadenylation, is phosphorylated by a specific protein kinase (Au rora), but the kinase induces CPEB It is described that CPSF and CPEB on the A AU AAA sequence interact to rescue poly (A) polymerase (PAP) and extend the poly (A) tail of mRNA.
  • CPE cytoplasmic polyadenylation element
  • CPEB CPE-binding protein
  • I RB IT has polyadenylation activity in the presence of PAP and F ip 1 (subunit of CPSF) (I. Kaufmann et al., EMBO J. (2004) 23: 6 1 6—626) was further increased. This finding makes it possible to suppress protein synthesis by suppressing IRBIT.
  • IRBIT is involved in the regulation of mRNA polyadenylation, and hence protein synthesis, through binding to CPSF.
  • substances that inhibit or enhance I RB I T, or its production and function allow control of protein synthesis associated with CPSF.
  • IP 3 is PI PK II phosphatidylinositol 4 from phosphatidylinositol 5-phosphate (PI (5) P), an enzyme you synthesize 5-diphosphate (PI (4, 5) P 2), further the PIP 2 hydrolysis IP 3 is produced by the decomposition.
  • IP 3 is
  • I RB IT is a ligand of the receptor by binding to the receptor, considering Then the fact that I RB IT with calcium ions (C a 2+) are both released into the cytoplasm, I RB IT is It can be said that it is involved in the regulation of inositol phospholipid metabolism (Ka tja A. Lamia et al., Mol. Cell B iol.
  • P I PK I I contains three isoforms in mammals: ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ and ⁇ , and I RB I ⁇ binds to any of these enzymes.
  • I RB I T inhibits P I PK I I activity indicate that I RB I T can be used to treat type 2 diabetes.
  • I RB I T further binds to and activates pNBC l.
  • NBC 1 is a 10-fold transmembrane protein that exists on the cell membrane and functions to carry sodium ions and bicarbonate ions in the same direction across the cell membrane at a certain rate. Since the pH in the living body is skillfully adjusted by the concentration balance between bicarbonate ion and carbon dioxide, NB C 1 is considered to be involved in the regulation of pH in the living body (E. Gross and I. Kurtz, Am. J. Physiol. Rena 1 Physiol. 2 002, 283: F 8 7 6—F 8 87).
  • NB C 1 as the causative gene of proximal tubular acidosis, a type of acidemia in which the pH of the blood tends to be acidic, suggests that NB C 1 transports bicarbonate ions. It shows that it plays a role that is indispensable for maintaining pH in the body.
  • kidney type kidneytype: kNB C l
  • lunar pancreas type pancreastype: pNBC l
  • kNBC l kidney type
  • pNBC l lunar pancreas type
  • pNBC l pancreastype
  • I RB IT To clarify which part of NBC 1 I RB IT combines with The NBC 1 cytoplasmic region was expressed as a recombinant protein in E. coli and purified, and binding to IRBIT that was forcibly expressed in cultured cells was examined by pul 1—d own. As a result, I RB IT was found to bind specifically and strongly to the N-terminal 85 amino acid specific to pNBC1 (Fig. 10). It was also found that the binding of I RB IT and pNBCl was controlled by changes in the concentration of specific salts.
  • I RB I T may regulate pH regulation by pNBCl in various organs depending on intracellular conditions.
  • patients with proximal tubular acidosis have various symptoms such as eye diseases such as glaucoma and cataract, short stature, mental retardation, and splenic inflammation, and thus pH regulation by NBC 1 plays an important role in organs other than the kidney. It is considered to have played. Therefore, I RB IT is also useful as a treatment for diseases such as eye diseases such as glaucoma and cataract, short stature, mental retardation, and knee inflammation via pNBC 1 (S eth L. A 1 er R e v. Physiol. 2 002, 64: 8 9 9—923). Therefore, I RB I T, or substances that suppress or enhance its production function, enable the control of intracellular pH associated with pNBC1.
  • I P receptor binding protein (I RB I T)
  • I RB I T used in the present invention is derived from a mammal.
  • I RB IT is known to exist in the intracellular endoplasmic reticulum of tissues such as the mammalian brain, heart, liver, kidney, knee and thymus (Japanese Patent Application Publication No. 2004- 1 29). 6 1 2 gazette).
  • Preferable examples of I RB IT are human I RB IT and mouse I RB IT (Japanese Patent Application Publication No. 2004-129 6 12), H. An do et al., J. B iol. C he m. 200 3, 278: 1 0602— 1 06 1 2).
  • human I RB I T is preferred.
  • NM—006 62 1 The amino acid and nucleotide sequences of human and mouse I RB IT are registered with Gen Bank as NM—006 62 1 (see SEQ ID NOS: 1 and 2) and NM—1 45542 (see SEQ ID NOS: 3 and 4, respectively) Has been.
  • IRBIT is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 and 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and most preferably 99%.
  • Containing amino acid sequences with at least% identity and I RB IT is a protein having biological activity equivalent to that of IT.
  • biological activity is related to CP-SF in protein synthesis in addition to S-adenosyl homocystine hydrolase-like activity that catalyzes the reversible hydrolysis of S-adenosyl homocystine to adenosine and homocystine.
  • Biological functions including regulation of mRNA polyadenylation through binding, regulation of inositol phospholipid metabolism through binding to PI PK II, and regulation of intracellular pH through binding to pNBC1 The activity related to control.
  • examples of DNA encoding preferable I RB IT include 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. Most preferably, the DNA has 99% or more identity, or DNA that can be hybridized with the base sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 under stringent conditions.
  • the stringent conditions are not limited to the following, but hybridization in 2 to 6 XSSC (sodium chloride sodium sodium citrate) at about 45 to 50 ° C, followed by: Force consisting of washing with 0.2 to 2 XS SC / 0.1 to 1% SDS at about 50 to 65, or 6 XSSC at 60 to 65 ° C, Denhardt solution, in 0.2% SDS After washing with 0.2 XSSC, 0.1% SDS at 60-65 ° C (eg FM Ausbel et al., Short Protocol Molecular Biology (3 fe) AC om endi um of Methodsfr om Current Protocol Molecular Biology, 1 995, John Wiley & Sons, Inc.).
  • 2 to 6 XSSC sodium chloride sodium sodium citrate
  • I RB I T from other mammals can also be used in the present invention.
  • Such I RB I T is the I R of laboratory animals such as rats, hamsters, and rabbits.
  • I RB IT for pet animals such as BIT, Inu, and cats
  • I RB I for livestock animals such as catfish, horses, pigs, hedges, and goats.
  • the production of these IRB I I is based on the amino acid or nucleotide sequence described in the literature, data bank, etc., or based on the known sequence of human or mouse IRB I ⁇ .
  • primers, DNA cloning method, polymerase chain reaction (PC R) and other methods for example, using a library from commercially available or prepared animal tissue to clone and / or amplify the I RB IT cDNA and then encode the resulting I RB IT.
  • the DNA to be prepared is incorporated into, for example, a commercially available expression vector (for example, plasmid) having an appropriate control sequence, transformed or transfected into an appropriate host cell, and the resulting cell is cultured in an appropriate medium. It can be cultivated to express I RB IT DNA, and the IRBIT protein produced can be recovered.
  • a commercially available expression vector for example, plasmid
  • I Mammalian tissue containing RB IT gene is homogenized using a homogenizer, centrifuged at approximately 10,000 rpm to obtain a supernatant, and then, for example, whole RNA is recovered by the guanidine-acidic phenol method. According to a conventional method, cDNA is synthesized, and from this cDNA, DNA encoding IRBIT can be obtained. Kits for RNA extraction, such as ISQGEN (trademark) of Nippon Gene Co., Ltd., are commercially available.
  • Probe size for detecting DN A encoding I RB I T is usually 3
  • the probe is usually attached with a label such as a fluorescent label (eg, fluoresamine, rhodamine or a derivative thereof), a radioisotope label (eg, 32 P), and so on.
  • a label such as a fluorescent label (eg, fluoresamine, rhodamine or a derivative thereof), a radioisotope label (eg, 32 P), and so on.
  • the binding of DN A encoding BIT to the probe can be detected.
  • the size of the primer for amplifying DN A encoding I RB IT is usually 15 to 30 bases, preferably 20 to 25 bases.
  • the primer should have a complementary sequence on the 3 'end of the sense strand and the antisense strand of the DNA encoding IRBIT.
  • the DNA sequence encoding the I RB IT to be amplified is unknown, prepare multiple primers based on the known I RB IT sequence, amplify the truncated DNA using PCR, and then amplify A formal primer can be prepared based on the obtained vertical DNA, and the desired vertical DNA can be amplified by PCR.
  • PCR consists of about 20 to 40 cycles of DNA denaturation, primer annealing, and extension reaction.
  • DNA denaturation is a process for dissociating double-stranded DNA into single-stranded DNA, and is usually treated at 94 ° C for approximately 15 seconds to 1 minute.
  • Primer annealing is the process of pairing a primer with a complementary single-stranded cage DNA. The optimal temperature and time for annealing depend on the base sequence and length of the primer, but the treatment is usually performed at about 55 to 60 ° C for about 30 seconds to 1 minute.
  • the elongation reaction is a process in which vertical DNA is elongated in the presence of 4 types of dNTPs and heat-resistant DNA polymerase, and is usually treated at 72 ° C for about 30 seconds to 10 minutes. Before starting the cycle, the DNA can be completely denatured by heating at 94 ° C for about 1-5 minutes. In addition, heat treatment can be performed at 72 ° C for about 1 to 5 minutes after the end of the entire cycle.
  • Thermostable DNA polymerases are commercially available, and for example, thermus saq uat ics (T aq) polymerase (sold from Ta Ka Ra, Perkin Elmer, Pharmacia, etc.) can be used.
  • T aq thermus saq uat ics
  • An expression vector is any vector that can be used in prokaryotic or eukaryotic cells.
  • the vector may contain regulatory sequences such as a promoter, an origin of replication, a ribosome binding site, a multicloning site, and a terminator.
  • Expression vectors include plasmids and viruses, especially commercially available vectors such as pGEX-4T-1 (Amersham's Pharmacia Biotech), p Bluescript II SK, pHS 19 , PHS l 5, p G— 1 and P XT l (Stratagene), pMAL and p TYB series (Daiichi Chemicals), p QE series (Qiagen), p ET series (Novagen), p S VK 3 and p SVLSV 40 (Falmacia) ), Pc DNA loppi pc DM8 (Funakoshi), p HB 6, p VB 6, p HM 6, p VM 6 and p XM (Roche Diagnostics) Can do.
  • Host cells include Escherichia genus such as E. coli, Bacillus genus such as Bacillus subtilis, Bacteria such as Syudomonas genus, Corynebacterium genus, Yeasts such as Saccharomyces genus, Pichia genus and Schizosaccharomyces genus, insect cells, plants Examples thereof include mammalian cells such as cells, CHO, COS, and HEK293.
  • Methods for introducing DNA encoding IRBIT into host cells include the calcium phosphate method, the lipofussion method, the electroporation method, methods using adenovirus, retrovirus and other viral infections (experimental). Medical supplement, 4th edition, Masamura Matsumura et al. “New Genetic Engineering Handbook” (2 2003) Yodosha, Tokyo, Japan). More specifically, for mouse I RB I T, I R B I from the mature mouse cerebellum
  • IRBIT 1 The biological activity of IRBIT 1 "is similar to IRBIT because it has homology to S-adenosyl homocystine hydrolase, which catalyzes the reversible hydrolysis of S-adenosyl homocystine to adenosine and homocystine. This method can be measured based on, for example, C. I. S. Yuan et al.
  • the nucleic acid that controls the expression / translation of IRBIT includes DNA encoding IRBIT, and antisense RNA of mRNA encoding IRBIT. Or its fragments, ribozymes that allow cleavage of mRNA encoding IRB IT, functional RNA such as siRNA (small interfering RNA), or their DNA or RNA (actually RNA Vector DNA containing the encoding DNA) is included.
  • IRBIT-encoding DNA is DNA encoding I RB IT from mammals such as humans and mice, and the method described in “IP 3 Receptor Binding Protein (IRB IT)” above. Can be produced.
  • D ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ encoding preferred I RB I ⁇ is a DN A containing a base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, and more preferred DN A is SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO:
  • This DNA encodes human or mouse IRBIT consisting of the nucleotide sequence shown in 4.
  • DNA encoding IRBIT can be inserted into an expression vector (eg, a plasmid or virus vector) and used for expression of IRBIT in the cell.
  • an expression vector eg, a plasmid or virus vector
  • the plasmid vector for expressing the IRA-encoding DNA includes drug resistance genes (eg, neomycin resistance gene, ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene, high-growth gene) Regulatory sequences such as a mycin resistance gene, terminator, multiple cloning site, replication origin, and ribosome binding site.
  • drug resistance genes eg, neomycin resistance gene, ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene, high-growth gene
  • Regulatory sequences such as a mycin resistance gene, terminator, multiple cloning site, replication origin, and ribosome binding site.
  • viral vectors for expressing DNA encoding IRBIT include adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, lentivirus vectors, retrovirus vectors (leukemia virus vectors, etc.), herpes virus vectors, etc. Can be used.
  • the viral vector is preferably of a type lacking, for example, self-replication ability so as not to cause disease when used in humans.
  • a self-replication ability-deficient adenovirus vector lacking the E1 gene and E3 gene (for example, pA deno-X from Invitrogen) can be used.
  • the construction of the quinoles vector can utilize the methods described in the literature (US Pat. No. 52 5247). 9, International Publication WO 94/1 3 788 etc.).
  • promoter a promoter capable of expressing foreign DNA in mammalian cells can be used.
  • promoters include the cytomegalovirus (CMV) promoter, SV40 promoter, EF promoter, etc.
  • the plasmid vector can be introduced into a patient in the form of a complex with a positively charged liposome such as lipophectamine, ribofuctin, self-actin, or positively charged cholesterol (for example, Mamoru Nakanishi, Protein Nucleic Acid Enzyme, 44 ⁇ 1 1, 48-54, 1 999, Kyoritsu Shuppan, Tokyo, Japan; Clinical Cancer Research 5 9: 4325-4 33 3, 1 99 99; Wu et al., J. B iol. C he m. 1 98 7, 26 2: 4429).
  • viral vectors can be introduced into cells by introducing them into affected areas and infecting cells (L. Zender et al., Proc. Natl. Ac ad.
  • adenovirus vectors or adeno-associated virus vectors can introduce genes into various cell types with very high efficiency. This vector is also not integrated into the genome, so its effect is transient and safer than other viral vectors. '
  • the antisense RNA of mRNA that encodes IRBIT can inhibit the translation of the IRBIT gene into the IRBIT protein.
  • the fragment is about 30 bases or more, 50 bases or more, 70 bases or more, 100 bases or more, 150 bases or more, 20 bases or more, or 250 bases or more consecutive in the sequence of the IRB IT gene or mRNA.
  • Antisense RNA or fragments thereof can contain modifying groups such as halogen (fluorine, chlorine, bromine or iodine), methyl, carboxymethyl or thio groups.
  • the antisense nucleic acid can be synthesized using a well-known DNA / RNA synthesis technique or a DNA recombination technique.
  • the target sequence is obtained by performing polymerase chain reaction (PCR) using a primer that sandwiches the sequence to be amplified, using the vector DN A containing the IRB IT base sequence as a saddle. Can be amplified and cloned into a vector as necessary to produce antisense DNA.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the thus obtained DNA having an amplified target sequence can be inserted into a vector, the vector is introduced into a eukaryotic or prokaryotic cell, and an antisense RNA can be obtained using the transcription system.
  • RNAs such as ribozymes, siRNAs that allow cleavage of mRNA encoding IRBIT.
  • the siRNA is, for example, about 18 to 30 consecutive from the mRNA sequence encoded by the base sequence of SEQ ID NO: 2 (human I RB IT) or SEQ ID NO: 4 (mouse IRBIT), preferably about 19 to 25, and more preferably, a sense strand sequence of about 20 to 23 nucleotides and an antisense strand sequence which is a complementary sequence thereof.
  • the sense strand sequence refers to the same base sequence as the target site of the mRNA
  • the antisense strand sequence refers to a base sequence complementary to the sense strand sequence.
  • the sense strand and the antisense strand can pair with each other to form a double-stranded siRNA.
  • the siRNA may further comprise an overhang consisting of 1 to 5 bases, such as UU, at each 3 ′ end of the sense and antisense strands.
  • target I RB I T mR target I RB I T mR
  • siRNA RNA secondary structure prediction program
  • the sequence that can be targeted by siRNA can be determined by estimating based on the above findings and actually confirming the effect.
  • Non-limiting examples of siRNA that can be used in the present invention include the following sequences.
  • IRBIT siRNA-l AAAUCCAGUUUGCUGAUGACA (SEQ ID NO: 5)
  • IRBIT siRNA-2 AACUCAGAAUGAAGUAGCUGC (SEQ ID NO: 6)
  • siRNA can be synthesized using well-known chemical synthesis techniques. For example, chemically synthesized using a conventional automatic DNA / RNA synthesizer, or a contract synthesis company related to siRNA (eg Funakoshi (Tokyo, Japan), Dharma con, Amb ion Etc.) can be obtained by consigning synthesis.
  • a conventional automatic DNA / RNA synthesizer or a contract synthesis company related to siRNA (eg Funakoshi (Tokyo, Japan), Dharma con, Amb ion Etc.)
  • a contract synthesis company related to siRNA eg Funakoshi (Tokyo, Japan), Dharma con, Amb ion Etc.
  • siRNA or vectors can be complexed with ribosomes, such as lipofectamine, lipofectin, self-ectin and other positively charged ribosomes (eg, positively charged cholesterol), or microcapsules and used (for example, Mamoru Nakanishi et al., Protein Nucleic Acid Enzyme, 44-11, 48-54, 1 1999, Kyoritsu Shuppan, Tokyo, Japan; Clinical Cancer Research 59: 432 5-43 3 3, 1 9 9 9; Wu et al., J. B iol. C he m. 1 98 7, 262: 4429).
  • ribosomes such as lipofectamine, lipofectin, self-ectin and other positively charged ribosomes (eg, positively charged cholesterol), or microcapsules and used
  • a vector for expressing siRNA contains a DNA sequence encoding siRNA or a precursor thereof under the control of a promoter.
  • an expression vector is a hairpin vector.
  • This vector contains a DNA encoding a hairpin RNA in which the sense strand RNA sequence and the antisense strand RNA sequence are covalently linked via a single-stranded loop sequence, wherein The DNA is a vector that forms the hairpin RNA by transcription in cells and is processed by Dicer to form the siRNA.
  • a poly-T sequence consisting of 1-6, preferably 1-5 T, as a transcription termination signal sequence or overhang at the 3 'end of hairpin DNA that encodes siRNA are concatenated.
  • Short hairpin RNA (shRNA) as a siRNA precursor transcribed from vector DNA should have an overhang consisting of 2 to 4 U at the 3, end of its antisense strand.
  • the presence can increase the stability of the sense strand RNA and antisense strand RNA against degradation by nucleases.
  • dicer There is one endogenous dicer in humans, which is responsible for converting long dsRNA and precursor microRNA (miRNA) into siRNA and mature miRNA, respectively.
  • dicers are pol III promoters, such as U6 promoter or H 1 promoter from human or mouse, pol II promoter, or cytomegalovirus promoter.
  • an expression vector is a tandem vector.
  • This vector comprises a DNA sequence encoding the sense strand RNA sequence constituting the si RNA and a DNA sequence encoding the antisense strand RNA sequence, and a promoter at the 5th and the end of each strand, In addition, it includes DNA having a poly T sequence linked to the 3 ′ end of each strand, wherein the DNA is hybridized with the sense strand RNA and the antisense strand RNA after transcription in cells.
  • An example of a promoter in a tandem type vector which is a vector that forms siRNA, is a pol III promoter, preferably a human or mouse-derived U 6 promoter or ⁇ 1 promoter, or a cytomegalovirus promoter.
  • the polypod array is a polypod array composed of 1 to 6, preferably 1 to 5 baskets.
  • a tandem vector is introduced into a cell, transcribed into RNA corresponding to a sense strand and an antisense strand, and hybridized with each other to generate a target siRN ⁇ .
  • the hairpin type and tandem type vectors are plasmid vectors or virus vectors.
  • the plasmid vector may be prepared using the methods described in the examples below or the methods described in the literature, or a commercially available vector system such as pi G ENE TM U 6 vectors and pi GENE TM H 1 vectors (Takara Bio Inc., Kyoto, Japan) can also be used (TR Brumme 1 k amp et al., Science (2002), 29 N. S. Lee et al., Ature B iotec h. (2002), 20: 500— 505; M. M iyagishi et al., Nat. B iotechnol. (2002), 20: 49 7-500; P. J.
  • Ribozyme is an RNA having catalytic activity and has an activity of cleaving mRNA corresponding to the target IRBIT gene of the present invention. This cleavage inhibits or suppresses the expression of the gene.
  • Such ribozymes include hammerhead ribozymes.
  • the hammerhead ribozyme is composed of a nucleotide sequence comprising a sensor site, a nucleotide sequence comprising a region capable of forming a cavity that stably captures Mg 2+ ions only when RNA binds to one site of the sensor, and a target RNA.
  • a nucleotide sequence comprising a region that is complementary to the sequence surrounding the cleavage site.
  • the ribozyme of the present invention is encapsulated in a ribosome (preferably a positively charged ribosome) (Japanese Patent Laid-Open No. 9 1 2 1 68 25 (1 997))
  • the drug delivery system can be constructed by a method such as incorporating into a virus vector such as adeno-associated virus (Japanese special table 2002-542805).
  • a ribozyme can be incorporated into a vector so that it can be expressed.
  • Promoters for expressing ribozymes include po 1 II or po 1 III promoters.
  • the preferred promoter is the po 1 III promoter
  • a tRNA promoter derived from a mammal more preferably a tRNA Va 1 promoter (S. Koseki et al., J. Virol., 73: 1 8 6 8— 1 8 7 7, 1 99.9).
  • An antibody against IRBIT or a fragment thereof can also be used to control the biological function.
  • Such antibodies include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, recombinant antibodies, human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies, Fab fragments, F (a b ') 2 fragments, F v Sc F v, bispecific antibodies, synthetic antibodies, etc.
  • Antibody class, subclass may be any type, for example I gG, I gM, I g E, I g D, I gA, I g G 1; I g G 2, I g G 3, I g G 4, I gA and I g A 2 are included.
  • Antibodies may also be derivatized by pegylation, acetylation, glycosylation, amidation, etc.
  • Polyclonal antibodies can be prepared using IRBIT as an immunogen (approximately 1 ⁇ g to 100 g), Freund's complete or incomplete adjuvant, aluminum hydroxide ( a 1 um), muramyl dipeptide, A water-in-oil emulsion containing an adjuvant such as Pido A is immunized intracutaneously or intravenously into non-human animals such as rabbits, guinea pigs, mice, rats, hidge, goats, etc. Weeks later, boost with one or two injections of IRBIT without adjuvant. Blood should be collected experimentally, and after confirming that the antibody titer has risen sufficiently, blood is collected from the animal, and antiserum is collected by centrifugation. If necessary, it can be purified by ammonium sulfate fractionation, DE AE ion exchange chromatography, etc. to obtain Ig G.
  • immunogen approximately 1 ⁇ g to 100 g
  • Freund's complete or incomplete adjuvant aluminum hydrox
  • Hybridomas that secrete monoclonal antibodies can be prepared according to the method of Keller and Milstein (Nature 1 975, 256: 495-49 7).
  • the hybridoma removes the spleen or lymph nodes from the immunized animal, and cell fusion between the antibody-producing cells contained therein and myeloma cells derived from mammals such as mice, rats, and motility Can be obtained by HAT selection.
  • Cell fusion can be achieved with eg polyethylene glycol (eg W 200 molecular weight 1 500-6000).
  • the production of the target antibody can be measured by using conventional methods such as enzyme immunoassay, radioimmunoassay, and fluorescent antibody method for the reactivity of hybridoma culture supernatants to immune antigens.
  • the hybridomas can be cultured in vitro and isolated from the culture supernatant, or in ascites of mice, rats, guinea pigs, etc. It can be cultured in ivo and isolated from ascites.
  • the gene is incorporated into a vector, and then a mammalian cell.
  • Human antibodies can be obtained from, for example, the phage display library (phargedisplay 1 ibrary) method (TC Thomas et al., Mol. I mmu no 1. 33: 1 38 9—1401, 1 99 6) or human antibody-producing animals. (For example, mouse, bush, etc.) (I. I shida et al., Cloning Stem Cell 4: 9 1 1 1 02, 2002).
  • a human chromosome fragment containing a human antibody-producing gene is introduced into a human artificial chromosome, and then the artificial chromosome is incorporated into, for example, the mouse embryonic stem cell genome using a microcell method.
  • Sex stem cells are injected into blastocysts, transplanted into the uterus of the surrogate parent mouse, and chimeric mice are born.
  • mice Through crossbreeding of male and female chimeric mice, or chimeric mice and wild-type mice, contain human antibody genes, and therefore It can be produced by a method such as production of a homozygous offspring mouse capable of producing a human antibody (for example, Japanese Table 02Z0 928 1 2 publication, international publication WO 98 / 24 8 93, WO 9 6 Z 34096, etc.).
  • the human antibody-producing transgenic mice are immunized with the IRBIT protein of the present invention as an antigen, and then the spleen is removed and the spleen cells and mouse myeloma cells are fused to form a hybridoma.
  • the monoclonal antibody can be selected.
  • the phage display library method can be used directly from untreated human lymphocytes.
  • the DNA encoding the antibody of interest is screened from the library of immune globulin genes placed in the DNA, and a physical association is established between this DNA and the antibody chain using phage particles. And enriching the phage presenting antibodies with affinity for the target by affinity screening.
  • antibodies having binding affinity for the target can be synthesized in a large amount by a conventional method (for example, Japanese National Publication 2003-5278 3 2).
  • compositions of the invention can be used for the treatment of a disease or disorder.
  • the disease or disorder is caused by abnormalities in protein synthesis, inositol phospholipid metabolism, and intracellular pH.
  • IRBIT promotes protein synthesis, and a substance that suppresses the action of IRBIT (the above-described nucleic acid or antibody) can inhibit protein synthesis.
  • An example of protein synthesis abnormalities involving C P S F is swelling.
  • I RB I T has the effect of suppressing P I PK I I activity and can therefore be used to treat type 2 diabetes.
  • p NBC 1 plays an important role in maintaining intracellular pH, but especially for diseases caused by the acidic pH, eye diseases such as glaucoma and cataract, short stature, Includes diseases such as mental retardation and splenic inflammation.
  • I RB I T binds to pNBC1 and allows regulation of intracellular pH to a normal state.
  • the content of the active ingredient in the composition of the present invention is not limited, but is about 1 ⁇ g to 100 mg. Its content can vary depending on the type of active ingredient.
  • I RB IT doses of the compositions of the present invention is from about 1 G ⁇ lmg per dosage unit, and preferably from about 50 ⁇ ⁇ ⁇ 500 ⁇ g, but is not limited to this range.
  • the dose of nucleic acid in the composition of the present invention is not limited to the following when converted to siRNA, antisense nucleic acid, or ribozyme, but about 1 In per dosage unit
  • the dose of the antibody or fragment thereof in the composition of the present invention is not limited to:
  • the above dose or dose may vary depending on the patient's condition, age, gender, severity, etc., and the dose or dose should be determined at the discretion of a specialist.
  • compositions of the present invention are typically pharmaceutically acceptable carriers (ie, excipients or diluents), such as sterile water, saline, buffers, non-aqueous liquids (eg, almond oil, vegetable oil). , Ethanol, etc.).
  • the composition further includes a pharmaceutically acceptable stabilizer (for example, amino acids such as methionine), a preservative (methyl p-hydroxybenzoate, sorbic acid), a tonicity agent (for example, sodium chloride).
  • An emulsifying agent for example, lecithin, gum arabic
  • a suspending agent for example, a cellulose derivative
  • Preferred pharmaceutical preparations are solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • the administration method of the composition of the present invention includes oral administration, parenteral administration, for example, intravenous administration, local administration and the like.
  • Local administration includes direct injection into the affected area under surgery or endoscopy.
  • the patient can receive this book at regular intervals such as 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 1 month, 2 months, 6 months, 1 year, etc.
  • the composition of the invention can be administered in 1 to several divided doses. Delivery of an antibody or fragment thereof to a patient is usually performed alone or in a form in which the antibody or fragment thereof is encapsulated in a ribosome (preferably positively charged liposome), a microphone mouth capsule or a nanoparticle. Can be administered in combination with an appropriate carrier (excipient or diluent) by the oral route or parenteral route (for example, intravenous administration or topical administration).
  • an appropriate carrier excipient or diluent
  • compositions of the present invention can be used in i n v i t ro, i n v i v o or e x v o v o.
  • composition of the present invention can be used for screening of therapeutic substances (see below).
  • cells and tissues once removed from a patient are removed from the body. After being treated with a light active ingredient, it can be returned to the body. This confirms that cells and tissues in which protein synthesis, inositol phospholipid metabolism, or intracellular pH abnormalities have occurred are restored to normal.
  • the present invention also provides the following method using I RB I T in i n v i t ro or e x v i v o.
  • the present invention provides a method of using IRBIT in controlling intracellular protein synthesis with i n vitro or exvivo.
  • This method is based on the fact that I RB I T is coupled to CP S F to control the function of CP S F.
  • the present invention provides a method of using IRBIT in the control of intracellular inositol phospholipid metabolism with invitro or exvivo.
  • This method is based on the fact that IRBIT has the action of suppressing PIPKII activity.
  • the present invention provides a method of using IRBIT in controlling intracellular pH with invitro or exvivo.
  • This method is based on the effect that I RB IT activates pNBC1.
  • activation of pNBCl requires phosphorylation of IRBIT.
  • I RB IT the in V Nitro, protein synthesis in a cell to be used for screening of substances that allow control of phosphatidylinositol metabolism or intracellular p H, also, e XV ivo can be used to return cells and tissues that have undergone protein synthesis, inositol phospholipid metabolism or intracellular pH abnormalities to normal.
  • the present invention further includes measuring a binding between IRBIT and CPSF, PIPK II, or pNBCl in the presence of a candidate substance, and identifying a substance that suppresses or enhances the binding. Provide a method.
  • the above binding is measured in vitro or in cells (especially mammalian cells) in the presence of a candidate substance with IRBIT and CPSF, PI PK II or pNBCl. Can be determined.
  • Mammalian cells include, for example, CHO, COS, HEK293, HeLa, NIH 3 T 3 and the like.
  • the identified substance can be used for therapeutic or diagnostic purposes, for example.
  • the substance controls at least one intracellular biological function selected from the group consisting of intracellular protein synthesis, inositol phospholipid metabolism, and intracellular ⁇ .
  • IRBIT and CP SF, PI PK II or pNB C 1 are present in an appropriate buffer, and a weather trap is added thereto, and I RB IT and CP SF are added.
  • the level of binding to PI PK II or pNBCl can be detected by SDS-PAGE and tymunoblotting. This system is effective in detecting a substance that suppresses or inhibits the binding.
  • Production of a recombinant protein of IRBIT, CPFS, PIPKII or pNBC1 can be carried out by the same method as described in the above section of IRBIT.
  • DNA encoding each protein must be the same or different vector so that I RB IT and CPSF, PI PK II or p NBC 1 can be expressed simultaneously or separately. And transforming or transfecting mammalian cells with the vector.
  • the vector DNA does not contain a differentiation signal sequence so that the translated protein is present in the cell, particularly in the cytoplasm.
  • the amino acid and base sequence of CP SF, PI PK II or pNBC 1 can be obtained from Gen Bank or literature, for example (AB 09 2 504), (AF 0305 58, AF 033 35 5), ( NM_0 03 75 9, NM—0 1 8 760).
  • the amino acid and base sequence of IRBIT are as described above.
  • the expression vector is preferably any vector that can be used in mammalian cells.
  • Vectors can contain regulatory sequences such as promoters, enhancers, origins of replication, ribosome binding sites, multiple cloning sites, terminators, and poly ⁇ signals.
  • Expression vectors include pSG5, pXT1 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG and pSVL SV40 (Falmacia) ), PHM6, pVM6 and pXM (Roche Diagnostics) can be appropriately selected and used.
  • promoters examples include CMV promoter, SV40 promoter, EF promoter and the like.
  • I RB IT, CPSF, PI PK II, or DNA encoding pNBC l can be introduced into host cells by viral infections such as the calcium phosphate method, ribofunction method, electroporation method, adenovirus, and retrovirus. Methods included (Experimental Medicine, separate volume, 4th edition, Masamura Matsumura et al. “New Genetic Engineering Handbook” (2003) Yodosha, Tokyo, Japan).
  • transgenic non-human animal for example, a mouse
  • the IRB IT gene is exogenously integrated into the genome using a non-human oocyte or embryonic stem cell by a known technique to allow for forced expression.
  • a transgenic non-human animal for example, a mouse
  • CPSF, PI PK II, or pNBC1 gene has been exogenously integrated into the genome and allowed to be forcibly expressed.
  • a chimeric non-human animal and its progeny capable of expressing the IRB IT gene and the CPSF, PI PK II or pNBC1 gene can be produced.
  • the binding of I RB IT, which is forcibly expressed in cells or transgenic non-human animals, to CPSF, PI PK II, or p NBC 1 is a candidate substance that has been incorporated into cells or animals. It is examined how it is affected in the presence by measuring the binding by a pull-down method, immunoprecipitation method or the like. At the same time, we investigate the effect on the intracellular synthesis of a specific protein, the effect on inositol phospholipid metabolism, and the effect on intracellular pH.
  • the effect of protein on intracellular synthesis can be measured, for example, by Western blotting using an antibody against a specific protein.
  • the effect on inositol phospholipid metabolism can be measured, for example, by [ 3 H] labeling or PIP 2 quantification using PIP 2 binding protein.
  • the effect on intracellular pH can be measured, for example, by measuring intracellular pH using a fluorescent pH indicator.
  • Candidate substances include, but are not limited to, small organic molecules, peptides, polypeptides, proteins, nucleosides, oligonucleotides, polynucleotides, nucleic acids (DNA or RNA), and the like.
  • I RB IT is very difficult to regulate intracellular metabolism, pH change, ion balance, regulation of phospholipid metabolism, control of protein synthesis, control of Ca 2+ release, etc. It has important significance in all cells. It has now been found that various biological functions described above can be controlled by controlling the concentration and expression pattern of IRBIT. Substances identified by the screening method of the present invention are useful for such control.
  • CP SF is a complex protein group consisting of four sub-units: CP SF 1 60, CP SF 1 00, CP SF 7 3 and CPSF 30, so first bind to any of these 4 sub-units.
  • c DNA with my c tag added to each subunit was expressed in various combinations with CORB cells along with IRBIT, and when IRBIT or CPSF was immunoprecipitated. We investigated how co-precipitation was done.
  • CPSF is a CPSF derived from a mouse and was cloned by RT_PCR based on the full length of Gen Bank accession number AB 09 2504 and the base sequence of each of the four subunits (H. Ando et al., 2003, above). ).
  • I RB IT is a mouse-derived I RB IT that was cloned by RT-PCR based on the nucleotide sequence of Gen Ban registration number NM-1 45 542 (H. Ando et al., 2003, above). ).
  • a DNA was prepared by fusing the full-length CPSF or the cDNA encoding each subunit with the DNA encoding the my c tag, and inserted into a mammalian vector.
  • the cDNA encoding IRBIT was also inserted into the same vector.
  • the prepared vector was transformed into COS cells to co-express the above DNA.
  • the cells are separated by centrifugation, the cells are lysed, the cytoplasmic fraction is collected, and the binding between IRBIT and CPSF is performed using anti-I RB IT antibody (Japanese Patent Application Publication No. 2 0 0 4-1 2 9 6 1 No. 2) and anti-myc antibody.
  • IRBIT binds to this region.
  • CPSF is an essential molecule for the polyadenylation reaction of mRNA, but the place where it works is mainly in the nucleus. For RNA just transcribed from DNA, it becomes mRNA and becomes the nucleus. It works as one of the maturity reactions before going out. However, as an exception, in the process of oocyte maturation or in the synthesis of new proteins locally in neurons, it is involved in the polyadenylation of mRNA in the cytoplasm, and the length of poly (A) is reduced. By regulating it, the protein synthesis of the target molecule is regulated (Daron C. Barnard et al., Cell 2 0 0 4, 1 1 9: 6 4 1 — 6 5 1).
  • This cytoplasmic polyadenylation reaction is an exceptional phenomenon, and is an essential phenomenon in establishing oocyte maturation and neuroplasticity.
  • I R B I T Intracellular distribution of I R B I T was examined, it was scarcely present in the nucleus. Therefore, the present inventors focused on the involvement of I R B I T in the cytoplasmic polyadenylation reaction.
  • the Xenopus oocyte system In examining the cytoplasmic polyadenylation reaction, the Xenopus oocyte system is superior, so the inventors first derived from the Xenopus oocyte.
  • I RB IT cDNA was cloned and isolated according to standard methods.
  • X e Unlike mammalian cells, nopus oocytes express three types of I RB IT mRNA, and these three types were found to bind to CPSF 160.
  • IP 3 receptor mRNA has a sequence that can undergo an intracytoplasmic polyadenylation reaction. Actually, in the cerebellar Purkinje cells, this mRNA is present in the rod process. Yes. This is, IRBIT released from IP 3 receptor via binding to CPSF, shows the possibility of controlling the protein synthesis of the IP 3 receptor itself.
  • I RB IT has polyadenylation activity (I. Kaufmann et al., EMB OJ. (2 0 0) 4) We found that 2 3: 6 1 6— 6 2 6) can be further increased.
  • PIPKII ⁇ , PI PK II y is the enzyme that synthesizes PIP 2, considering that IP 3 is produced by the hydrolysis PIP 2, 1 3 receptor, IRBIT,
  • NB C 1 sodium umbacarte-transportelel
  • NB C 1 is known to have two splicing variants, p-type and k-type S (S eth L. A lper, An n. R e v. Physio 1.2 0 0 2, 6 4: 8 9 9— 9 2 3), IRBIT binds to p-type NBC 1 (recognized by pNB C 1), and some serine residues in I RB IT It was revealed that phosphorylation of is required for binding to pNBC1. The specific experiments and results are shown below.
  • the p-type specific N-terminal sequence of pNBC1 (1 85 amino acids) was essential for binding to IRBIT. Further deletion mutants were prepared at 85 amino acid residues, and the binding of these mutants to IRBIT was examined using a pull-down assay (p u l l d o wn a s sa y). Specifically, the following experiment was conducted.
  • a cell extract was prepared by overexpressing HA-IRBIT in CO S-7 cells.
  • T was detected by Western blotting using an anti-HA antibody.
  • mice IRBIT full length 530 amino acids; SEQ ID NO: 3
  • SEQ ID NO: 3 full length 530 amino acids
  • CO S-7 cells were overexpressed with deletion mutants of GFP—IRBIT, and cell extracts were prepared.
  • Recombinant protein of MB P_p NBC l (1-8 5) was added, and after the reaction, the bound protein was pulled down with a my lose resin.
  • a deletion mutant of GFP—IRBIT was detected by Western plotting using an anti-GFP antibody.
  • Fig. 11 The results are shown in Fig. 11. The figure shows that even the deletion mutants (1-104, 1-277) expressing the N-terminal side of I RB IT that have been confirmed to bind to the IP 3 receptor cannot bind to p NBC 1. all right.
  • a deletion mutant (1 05-53 0) expressing the C-terminal side of IRBIT which has already been confirmed to be unable to bind to the IP 3 receptor, also failed to bind to pNBC1.
  • There is a short pNBC1 binding sequence in 1-104 because the serine phosphorylation sites shown to be required for binding to pNBC1 are all contained in 1-104 Nevertheless, it was considered that the binding to pNBC1 might be inhibited by some three-dimensional structure. Therefore, a deletion mutant in which 1-104 was further finely deleted was prepared and the binding to pNBC1 was analyzed, but no binding to pNBC1 was observed.
  • NBC 1 was identified as an I RB IT binding protein in the cerebellar membrane fraction, so immunoprecipitation was first performed using the cerebellar membrane fraction extract.
  • I RB IT also binds to the IP 3 receptor in the cerebellar membrane fraction, so whether or not it can form a ternary complex consisting of NBC 1, I RB IT, and IP 3 receptor. I examined it. Specifically, the following experiment was conducted.
  • Anti-RB I T antibody, anti-NBC antibody, or control antibody was added to the cell extract of CO S-7 cells and allowed to react. Furthermore, protein G sepharose was added to extract immune complexes. Thereafter, Western blotting was performed using an anti-IRBT antibody or an anti-NBC antibody.
  • Mouse I RB IT cRNA and human pNBC l or kNB C l cRNA were co-injected into cultured Xenopus oocyte cells, and the j ⁇ potential was reduced to 25 mV.
  • ND 96 the solution (9 6mM N a C 1, 2 mM KC 1, 1 mM M g C 1 2, 5 mM HE PES, p H 7. 4) power et al ND 96 + HC0 3 - current change when varying the solution It was measured.
  • I RB IT, p NBC l, and kNBC l were used for the control.
  • I RB IT mutants (S 68 A, S 71 A, S 74 A or S 7 7 A) in which the phosphorylation site of I RB IT was replaced with alanine (A) were prepared as described above.
  • compositions and methods of the present invention provide that I RB I T is expressed in mammalian cells as C P S F, P
  • I RB IT has very important significance in regulating intracellular metabolism, pH change, ion balance, regulation of phospholipid metabolism, control of protein synthesis, control of Ca 2+ release, etc. It was found to have in all cells.
  • Various biological functions can be controlled by controlling the concentration and expression pattern of IRBIT.
  • I RB IT for example, is strongly expressed in the choroid plexus (choroidp 1 exus), nerve cells, and glial cells in the cranial nervous system, and contributes to functional control of the cranial nervous system.
  • I RB IT activates pNBC1, which is important for maintaining intracellular pH, and is especially associated with diseases caused by acidic pH, such as eye diseases such as glaucoma and cataract, short stature, etc. Useful for the treatment of diseases such as mental retardation and splenic inflammation.
  • IRBIT can be used to treat type 2 diabetes because it has the effect of suppressing or inhibiting PI PK II activity.
  • the present invention has identified three proteins targeted by IRB IT, thereby controlling IRB IT and its inhibitors, enhancers, and biological functions performed by the target protein in vivo. To help.

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Abstract

この発明は、ＩＰ３受容体結合タンパク質（ＩＲＢＩＴ）、ＩＲＢＩＴの発現／翻訳を制御する核酸、またはＩＲＢＩＴに対する抗体を含む組成物であって、（１）タンパク質合成、（２）イノシトールリン脂質代謝、および（３）細胞内ｐＨ、からなる群から選択される少なくとも１つの細胞内生物学的機能の制御のための組成物を提供する。

Description

I P 3受容体結合タンパク質による細胞内標的分子の制御 技術分野
本発明は、 哺乳動物細胞における生物学的機能を制御するための組成物および 方法に関する。 さらに具体的には、 本発明は、 I P 3受容体結合タンパク質 （ I RB I T) およびその細胞内標的分明子が関与する該生物学的機能を制御するため の組成物およぴ方法に関する。
本発明はまた、 前記生物学的機能の制御を利用する物質のスクリーニング方法 書
を提供する。 背景技術
細胞膜上の受容体の活性化に伴いホスファチジルイノシトーノレ 4， 5—ビスホ スフエー卜 (p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 4， 5— b i s p h o s p h a t e) が加水分角早されると、 細胞内セカンドメッセンジャーであるィ ノシト一ノレ 1， 4 , 5—三リ ン酸 （ i n o s i t o l 1， 4 , 5 _ t r i s p h o s p h a t e ( I P3)) が生成する。 I P 3は I P3受容体 （ I P 3R) に結 合することにより、 細胞内カルシウム貯蔵オルガネラ （主に小胞体） からの C a
2+放出を誘導する。この I P 3/C a 2 +シグナル経路において、 I P 3受容体は、
I P 3のシグナルを C a 2 +のシグナルへ変換する役割を担っている (M. J . B e r r i d g e , N a t u r e ( 1 9 9 3) 3 6 1 : 3 1 5— 3 2 5 ; M. J .
B e r r i d g eら， N a t . R e v. Mo l . C e 1 1 B i o l . (2 0 0 0)
1 : 1 1一 2 1 ; T. F u r u i c h iおよび K. M i k o s h i b a , J .
N e u r o c h e m. (1 9 9 5) 6 4 : 9 5 3— 9 6 0)。
I P 3受容体は、 4量体の細胞内 I P 3誘導性 C a 2 +放出チャネル （ I P3_ g a t e d C a 2 + r e l e a s e c h a n n e l ) である。 哺乳動物では、
3種の異なる I ?3受容体 （すなわち、 タイプ 1、 タイプ 2およびタイプ 3) が 存在する （T. F u r u i c h i ら， N a t u r e (1 9 8 9) 3 4 2 : 3 2 -38 ； T. S u d h o f ら， ΕΜΒΟ J . (1 9 9 1) 1 0 : 3 1 99— 3 206 ; O. B l o n d e l ら， J . B i o l . C h e m. (1 993) 2 68 ： 1 1 3 5 6— 1 1 3 6 3)。 このうち、 I P 3受容体タイプ 1 ( I P 3 R 1 ) は、 中枢神経系、 特に小脳において高発現している （P. F. Wo r l e yら， N a t u r e (1 98 7) 3 25 : 1 5 9- 1 6 1 ; T. F u r u i c h i ら， Re c e p t . Ch a n n e l s (1 99 3) 1 : 1 1— 24)。 マウス I P3R 1は、 2749アミノ酸からなり、 3つの機能的に異なる領域に分かれている。 すなわち、 N末端近傍に I P3結合ドメイン、 C末端近傍に 6回膜貫通領域を有 するチャネル形成ドメイン、およびこれら 2つの領域の間に制御領域が存在する。 I P 3結合ドメインの欠失突然変異体解析より、 I P3受容体のアミノ酸 226〜 578残基が特異的かつ高親和性のリガンド結合に必要な最小領域であることが 示され、 I P3結合コアと呼ばれている。
I P3受容体の活性化による細胞質 C a 2+濃度の増加によって、 多種多様な下 流標的分子の活性が制御される。 これら下流標的分子は、 受精、 発生、 増殖、 分 泌、 シナプス可塑性など多岐に渡る細胞応答において重要な役割を担つている。 本発明者らは、 先に、 新規の I 3受容体結合タンパク質を見出し、 I RB I T P a — b i n d i n g p r o t e i n r e l e a s e d w i t h i n o s i t o l 1， 4， 5—丄 r i s p h o s p h a t e) と命名した (曰 本国特許出願公開第 2004— 1 29 61 2号公報）。 I P3受容体は、 ヒ ト、 マ ウスなどの哺乳動物の例えば脳、 心臓、 肝臓、 腎臓、 膝臓、 胸腺などの種々の組 織や細胞に広く分布することから、 I RB I Tもそのような組織や細胞に存在す ると推定される。 ヒ トおよびマウス I RB I Tのアミノ酸および塩基配列は、 本 発明者らによって決定された （日本国特許出願公開第 20 04— 1 2 9 6 1 2号 公報、 H. An d oら， J . B i o l . Ch em. (20 03) 278 : 1 0 6 02— 1 06 1 2)。 これらの I RB I Tは 5 30アミノ酸からなり、 ヒ トおよび マウス間の同一性は 1 00 %である。 I P 3受容体との結合領域は、 I RB I T の N末端領域 （ヒ トおよびマウスにおいて、 アミノ酸 1〜 1 04) に存在する。
I RB I Tは、 （1) 中性タンパク質である （推定 p I値： 6. 48) 力 N末 端領域は比較的酸性である （推定 p i値： 4. 9 8)、 (2) N末端領域に複数の リン酸化部位が集中的に局在しており、 リン酸化が I P3R 1との相互作用に必 要であると推測される、 （3) I P3R 1の I P3との結合に必須である 508番 目のリジン残基が I RB I Tとの相互作用においても必須である、 （4) I P3に より I P3R 1との相互作用から解離する、 および （5) 高塩濃度により、 I P3 R 1との相互作用から解離し、かつ粗ミク口ソーム画分から抽出されることから、 I P3R 1との相互作用は静電気的結合によると推測される、 などの特徴を有す る （日本国特許出願公開第 2 004- 1 296 1 2号公報）。
I RB I Tは、 I P 3受容体の I P 3結合領域に結合し、 i n 1 1: 0で1 P 3により I P 3受容体から解離するという性質をもつ。このため、 I RB I Tは、 I P3受容体の I P 3結合を抑制することにより、 I P 3受容体の活性を抑制する 機能をもつことも明らかになつている （日本国特許出願公開第 2004 - 1 29 6 1 2号公報）。
本発明者らは、 今回、 以下に説明するように、 I RB I Tの標的分子を明らか にし、 さらに I RB I Tが生体内で三次メッセンジャーとして重要な生物学的機 能をもつことを明らかにした。 発明の開示
本発明の目的は、 I RB I Tとその分子標的との相互作用を利用して細胞内の 生物学的機能の制御を可能にする組成物および方法を提供すること.である。
本発明の別の目的は、 細胞内において I RB I Tとその分子標的との間の結合 を抑制または亢進することによって、 前記生物学的機能の制御を可能にする物質 のスクリーニング方法を提供することである。
本発明者らは、 今回、 上記課題を解決するために鋭意研究を行い、 I RB I T の標的が、 タンパク質合成を制御する分子、 イノシトールリン脂質を制御する分 子、 および細胞内の pHを制御する分子であることを見出した。 また、 I RB I 丁が、 細胞内代謝を制御する重要な分子の 1つとして、 今回見出された 3種類の 標的分子と結合して該標的分子の働きを制御する三次メッセンジャーとしての役 割を有することを証明している。
発明の概要 したがって、 本発明は、 要約すると、 以下の特徴を有する。
本発明は、第 1の態様において、 I P 3受容体結合タンパク質（ I RB I T)、 I RB I Τの発現/翻訳を制御する核酸、 または I RB I Τに対する抗体を含む 組成物であって、
(1) タンパク質合成、
(2) イノシトールリ ン脂質代謝、 および
(3) 細胞内 ρΗ、
からなる群から選択される少なく とも 1つの細胞内生物学的機能の制御のための 上記組成物を提供する。
一の実施形態において、 前記タンパク質合成が、 切断 Ζポリアデニレーシヨン 特異性因子 （C P S F) による細胞質の mRNAポリアデュレーシヨンが関与す るものである。
別の実施形態において、 前記イノシトールリ ン脂質代謝が、 細胞内での P I P 2合成酵素 （P I PK I I) が関与するものである。
別の実施形態において、 前記細胞内 pHが、 細胞内でのp型NaZHC03共 トランスポーター 1 (p NBC l) が関与するものである。
別の実施形態において、 前記制御が、 抑制または亢進である。
別の実施形態において、 前記 I RB I Tが、 ヒ トまたはマウス由来のものであ る。 .
別の実施形態において、 前記 I RB I Tが、 配列番号 1または配列番号 3に示 されるアミノ酸配列からなるタンパク質、 あるいは該アミノ酸配列と 9 0%以上 の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつ I RB I Tと同等の生物学的活性を有 するタンパク質である。
別の実施形態において、 前記組成物が、 i n v i v o、 i n v i t r oま たは e x v i v oのいずれかで使用されるものである。
別の実施形態において、 前記組成物が、 疾患の治療用である。
本発明はまた、 第 2の態様において、 i n V i t r oまたは e x v i v o での細胞内のタンパク質合成の制御におけ,る I RB I Tの使用方法を提供する。 その実施形態において、 前記 I RB I Tが C P S Fに結合し CP S Fの機能を 制御する。
本発明はまた、 第 3の態様において、 i n V i t r oまたは e x v i v o での細胞内のィノシトールリ ン脂質代謝の制御における I RB I Tの使用方法を 提供する。
その実施形態において、 前記 I RB I Tが P I PK I I活性を抑制する。
本発明はまた、 第 4の態様において、 i n v i t r oまたは e x v i v o での細胞内 pHの制御における I RB I Tの使用方法を提供する。
その一の実施形態において、 前記 I RB I Tが p NB C 1を活性化する。
別の実施形態において、 前記 p NB C 1の活性化が前記 I RB I Tのリン酸化 を必要とする。
本発明はまた、 第 5の態様において、 候補物質の存在下で、 I RB I Tと CP S F、 P I PK I Iまたは p NB C 1との結合を測定し、 該結合を抑制または宂 進する物質を同定することを含む、 物質のスクリーニング方法を提供する。
その実施形態において、 前記物質が治療用または診断用である。
別の実施形態において、 前記結合が哺乳動物細胞内で行われる。
さらに別の実施形態において、 前記物質が、 細胞内のタンパク質合成、 イノシ トールリン脂質代謝および細胞内 pHからなる群から選択される少なくとも 1つ の細胞内生物学的機能を制御するものである。
定 fe
本明細書中で使用する 「 I RB I T」 なる用語は、 哺乳動物由来の I Ρ3受容 体結合タンパク質であり、 該受容体の I Ρ3結合部位に結合しており、 I Ρ3の該 受容体への結合とともに細胞質に放出されるタンパク質である。 本発明では、 I
RB I Tは、 CP S F、c 1 e a v a g e / p o 1 y a d e n y 1 a t i o n s p e c i f i c i t y f a c t o r)、 P I PK I I (p h o s p h a t i d y 1 i n o s i t o l — 5— p h o s p h a t e 4— k i n a s e)、または p N B C 1 (p a n c r e a s t y p e N a / H C O 3 c o t r a n s p o r t e r 1) と結合するが、 これらの I RB I T標的タンパク質は I RB I Tと の結合を介してそれぞれタンパク質合成、 イノシトールリン脂質代謝、 細胞内 Ρ Ηの維持に関与する重要な生物学的機能を細胞内で果たしている。 したがって、 I RB I Tは、 これらの生物学的機能の制御を担っている。
本明細書で使用する 「タンパク質合成」 なる用語は、 細胞内での遺伝子の転写 と翻訳の一連の過程をいい、 本発明では、 細胞質での mRN Αポリアデニレーシ ヨンの制御が関与する。 また、 イノシトールリン脂質代謝は、 I P3を含むリ ン 脂質の代謝を指す。
本明細書で使用する 「抑制」 なる用語は、 上記生物学的機能の減少、 低下また は阻害をいう。
本明細書で使用する 「亢進」 なる用語は、 上記生物学的機能の増加、 上昇また は増進をいう。
本明細書で使用する 「e X V i V o」 なる用語は、 一旦生体外に取り出され た細胞や組織を本発明の組成物で処理した後、 生体内に戻すことをいう。
本明細書で使用する 「患者」 なる用語は、 ヒト、 マウス、 ラット、ィヌ、 ネコ、 家畜動物 （例えばゥシ、 ゥマ、 プタ、 ヒッジ、 ャギなど） などの哺乳動物、 好ま しくはヒ トを指す。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2006-77607 号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 I RB I Tと CP S F 160との結合を示すウェスタンブロット図で ある。 図中、 I . Β·. はウェスタンブロッテイングを表し、 I . P. は免疫沈降 を表わし、 HAはタグとしてのへマグルチニンを表し、 l o a dは細胞抽出液を 表す。
図 2は、 I RB I Tが CP S Fの CP S F 1 60サブュニットの mRN A結合 部位に結合することを示す模式図である。
図 3は、 I P3受容体、 I RB I T、 P I PK I I、 I P3が関与するイノシト 一ルリ ン脂質代謝を示す模式図である。図中、 P LCはホスホリパーゼ Cを表す。 図 4は、マウス I RB I Tと My c— P I PK I I α, β， γとの結合を示す。
(Α) は抗 My c抗体による免疫沈降を示す。 （B) は抗 I RB I T抗体による免 疫沈降を示す。 図中、 i n p u tは細胞抽出液を表し、 I Pは免疫沈降を表し、 対照 I g G (陰性対照） はこれを用いて免疫沈降を行ったサンプルを表す。
図 5は、 マウス小脳の P I PK I I ひが抗マウス I RB I T抗体と免疫沈降で 共沈したことを示す。 i n p u tは、 図 4と同じである。
図 6は、 I RB I Tと My c— Ρ Ι Ρ Κ Ι Ι γがともに細胞質に局在すること を示す。 Me r g eは Ρ Ι Ρ Κ Ι Iの染色像と I R B I Tの染色像の重ね合わせ を示し、 重なっている部分が黄色となる。
図 7は、 I RB I T欠失変異体を用いて、 P I PK I I と結合する I R B I T の結合部位の特定を示す。 （A) は I R B I Tの欠失変異体の模式図を示す。 （B) は I RB I Tの N末端側からの欠失変異体と My c— P I P K I I ο;との結合を 示す。 （C) は I RB I Τの C末端側からの欠失変異体と My c — P I P K I I a との結合を示す。
図 8は、 I RB I Tの S e r 6 8及び S e r 7 1が P I P K I I と結合するこ とを示す。 図中、 i n p u tは細胞抽出液を表し、 I Pは免疫沈降を表し、 I B はウェスタンプロッティングを表す。
図 9 Aは、 I RB I Tと NB C 1 との結合を示すウェスタンブロット図 （上図） である。 p NB C l (滕臓型） に特異的な'部分を含む組換え型タンパク質 2と 5 にのみ I R B I T (黒三角） が結合する。 各組換え型タンパク質 （1、 2、 3、 4、 5、 6または 7) は、 S D Sポリアクリルアミ ドゲル電気泳動図 （図 9 Aの 下図） 中、 黒丸で示し、 かつ、 図 9 Bに、 p NB C lおよび k NB C l (腎臓型） の構造とともに、 それらの構造を模式的に示した。 図中、 MB Pは精製のために 用いたマルトース結合タンパク質タグを示す。 また、 C B Bはクマシーブリ リア ントプルーを表す。
図 1 0は、 NB C 1の欠失変異体と I R B I Tとの結合能を示す。図 1 0 Aは、
P NB C 1の欠失変異体をそれぞれ大腸菌で発現精製し、 CO S 7細胞に強制発 現した H A— I RB I T (ここで、 HAはへマグルチュンを表わす） との結合（ま たは、 相互作用） をプルダウンアツセィ (p u l l d o w n a s s a y) で 検討した結果を示す。 また、 図 1 0 Bの上図は、 プルダウンしたサンプルを S D
S— P AG Eし C B Bで染色した結果を示す。 図 1 0 Bの下図は、 プルダウンし たサンプルを抗 HA抗体でウェスタンブロッティングした結果を示す。 黒三角は HA- I RB I Tの泳動位置を、 黒点は各欠失変異体タンパク質の泳動位置をそ れぞれ示している。
図 1 1は、 I RB I Tの欠失変異体と p NB C 1との結合能を示す。 I RB I Tの各種欠失変異体を GF P (緑色蛍光タンパク質） との融合タンパク質として COS 7細胞に強制発現し、 p NBC 1との結合をプルダウンアツセィで検討し た。図 1 1 A、図 1 1 Bともに、それぞれの欠失変異体を発現した細胞抽出液（ 1 y s a t e) もしくはプノレダウンサンプノレ (p u 1 1 — d own) を SDS— P AGEし抗 GF P抗体でウェスタンブロッティングした結果を示す。 黒三角は各 欠失変異体の泳動位置を示している。 全長 （F L) 以外の I RB I Tがいずれも pNB C 1と結合しなくなっていることがわかる。
図 1 2は、 小脳膜画分における内在性 I RB I Tと NB C 1との結合を示す。 小脳膜画分の抽出液から、 コントロールとなる免疫前の抗体（対照）、抗 NBC 1 抗体、 抗 I RB I T抗体でそれぞれ免疫沈降 （I P) を行い、 沈降物を SDS— PAGEして、 抗 I RB I T抗体、 抗 NB C 1抗体、 抗 I P3受容体抗体でゥェ スタンプロッテイング （I B) を行った。 黒三角はそれぞれのタンパク質の泳動 位置を示している。
図 1 3は、 COS 7細胞抽出液中の内在性 I RB I Tと NB C 1との結合を示 す。 CO S 7細胞の抽出液からコントロールとなる免疫前の抗体（対照）、抗 I R B I T抗体、 抗 NB C 1抗体でそれぞれ免疫沈降 （ I P) を行い、 沈降物を S D S— PAGEして、 抗 NB C 1抗体もしくは抗 I RB I T抗体でウェスタンブロ ッティング （I B) を行った。 黒三角はそれぞれのタンパク質の泳動位置を示し ている。 左三列は C a C 12非存在下で、 右三列は C a C 1 2存在下でそれぞれ免 疫沈降を行った沈降物を用いている。
図 1 4は、 電圧クランプ法によって測定された、 I RB I Tによる p NB C 1 の活性化を示す。 図 1 4Aは、 膜電位を一 25mVに固定したときの電流値 （μ Α) である。 また、 図 1 4Bは、 膜電位を一 1 6 OmV〜+ 6 OmVの間で変化 させたときの電流変化を I一 V曲線で示した。
図 1 5は、 I RB I Tのリン酸化が pNBC 1の活性化に必要であることを示 す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明をさらに詳細に説明する。
1. 組成物
本発明は、 第 1の態様により、 I RB I T、 I RB I Tの発現/翻訳を制御す る核酸、 または I RB I Tに対する抗体を含む組成物を提供する。 本発明の組成 物は、 （1) タンパク質合成、 （2) イノシトールリン脂質代謝、 および （3) 細 胞内 p Hからなる群から選択される少なく とも 1つの細胞内生物学的機能の制御 のために使用される。
以下に、 上記 3つの生物学的機能の制御について説明する。
タンパク質合成の制御
本発明において、 前記タンパク質合成の制御は、 細胞内での I RB I Tと C P S Fとの結合を介する mRNAポリアデ二レーションの制御である。
CP S Fは、 CP S F 1 60、 CP SF 100、 CP S F 7 3および C P S F 30の 4つのサブュ-ットからなる複合タンパク質である。本発明者らは、今回、 COS細胞での共発現と免疫沈降による共沈試験から、 I RB I Tが CP S F、 特に CP S F 1 60に結合することを見出した （図 1)。
C P S Fは、 核内での mRN Aのポリアデュレーション反応に必須の分子であ るが、 細胞質でポリ （A) の長さを伸長することによるタンパク質合成を調節す る働きを有すること、 また、 C P S F 16 0の mRNA結合部位は、 CP S Fが ポリ （A) を付加する mRNAを認識する際に必須の領域であること、 などが知 られている （C. B a r n a r d Da r o nら， C e l l 2004， 1 1
9 : 641— 65 1、 および E. K l a n nら， "S y n a p t i c P I a s t i c i t y a n d T r a n s l a t i o n I n i t i a t i o n ,
L e a r n i n g & Me mo r y 2 004, 1 1 : 36 5— 3 72， C o l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y P r e s s)。具 体的には、 E. K l a n nら （上記） の 「細胞質ポリアデニレーシヨンと C P
EB」 （3 6 7〜 3 68頁） の項には、 ポリアデニレーシヨンは、 mRNAの 3' 非翻訳領域中の 2つの配列、 すなわち細胞質ポリアデニル化要素 （CPE) およ び AAUAAA、 によって調節されており、 ポリアデ-レーシヨンの重要な調節 タンパク質である CPE結合タンパク質 （CPEB) 力 特定のプロテインキナ ーゼ （Au r o r a) によってリン酸化されるが、 該キナーゼが、 C P E Bを誘 導して該 A AU AAA配列上の C P S Fと C P E Bが相互作用することによって ポリ （A) ポリメラーゼ （PAP) を救済し mRNAのポリ （A) 尾部を伸長さ せることが記載されている。
上記の知見を考慮すると、 I RB I Tが CP S F 1 60の mRNA結合部位に 結合することによって、 CP S Fの機能が制御されると考えられる （図 2)。
さらにまた、 本発明者らは今回、 I RB I Tが、 P AP及び F i p 1 (C P S Fのサブユニット） の存在下でのポリアデニレーシヨン活性 （ I . Ka u f m a n nら， EMBO J . (2004) 23 : 6 1 6— 626) をさらに増大させ る働きがあるという知見を得た。 この知見から、 I RB I Tを抑制することによ つてタンパク質合成を抑制することが可能になる。
このように、 I RB I Tは、 C P S Fとの結合を介して、 mRNAポリアデニ レーションの制御、 したがってタンパク質合成の制御に関わっている。
したがって、 I RB I T、 あるいはその生成および機能を抑制または亢進する 物質は、 C P S Fが関連するタンパク質合成の制御を可能にする。
イノシトールリン脂質代謝の制御
I RB I Tはまた、 P I PK I I と結合して、 該酵素の活性を抑制する （実施 例 2)。
P I PK I Iは、 ホスファチジルイノシトール 5リン酸 （P I (5) P) から ホスファチジルイノシトール 4， 5—二リン酸 （P I (4， 5) P 2) を合成す る酵素であり、 さらに P I P2の加水分解により I P3が産生される。 I P3は、
1 P 3受容体のリガンドであり、 該受容体に結合することによって、 カルシウム イオン （C a 2+) と I RB I Tがともに細胞質内に放出されるという事実を考慮 すると、 I RB I Tは、 イノシトールリン脂質代謝の制御に関わっているという ことができる（Ka t j a A. L a m i a ら， Mo l . C e l l B i o l .
2004, 24 : 508 0— 508 7)。
したがって、 I RB I T、 あるいはその生成および機能を抑制または亢進する 物質は、 P I P K I Iが関係するイノシトールリン脂質代謝の制御を可能にする (図 3)。
例えば、 P I PK I Iは、 哺乳動物において、 Ρ Ι ΡΚ Ι Ι α、 および γの 3種類のィソフォームを含むが、 I RB I Τはそのいずれの酵素にも結合する。 特に P I PK I I |3については、 その酵素をノックアウトしたトランスジェ-ッ クマウスが高いインスリン感受性をもつことから、 該酵素の阻害が 2型糖尿病の 治療に有用であることが示されている（K a t j a A. L am i aら，上記）。 I RB I Tが P I PK I I活性を抑制するという、 本発明者らによる知見は、 I RB I Tが 2型糖尿病の治療に使用しうることを示している。
細胞内 p Hの制御
I RB I Tはさらに、 pNBC lに結合し、 それを活性化する。
具体的には、 アフリカッメガエル卵母細胞に I RB I Tの c RNAと NBC 1 の cRNAを注入することにより細胞内 pH変化で検出する pNB C 1の応答が、 約 6〜 7倍高い応答が得られた （図 1 4)。 この結果は、 I RB I Tが p NB C l 活性を顕著に増強することを示した。
NBC 1は、 細胞膜上に存在する 1 0回膜貫通型タンパク質であり、 ナトリウ ムイオンと重炭酸ィオンとを一定の割合で細胞膜を横切つて同じ方向に運ぶ働き をする。 生体内の pHは重炭酸イオンと炭酸ガスとの濃度バランスによって巧妙 に調節されているので、 NB C 1は生体内の p Hの調節に関与していると考えら れる（E. G r o s sと I . Ku r t z, Am. J . P h y s i o l . R e n a 1 P h y s i o l . 2 002， 283 : F 8 7 6— F 8 87)。 特に、 血液の p Hが酸性に傾く酸血症の一種である近位尿細管型ァシドーシスの原因遺 伝子として NB C 1が同定されたことは、 NB C 1による重炭酸イオンの輸送が 生体内の p Hの維持に欠くことのできなレ、役割を果たしていることを示している。
NB C 1には、 これまでに腎臓型 （k i d n e y t y p e : kNB C l) と 月萃臓型 （p a n c r e a s t y p e ： pNBC l) の 2つのスプライシング変 異体が報告されており、 kNBC lは主に腎臓に、 p NB C 1は腌臓を中心とし て脳神経系を含めた比較的多くの組織に、 それぞれ発現している。 本発明者らは
I RB I Tがどちらの NBC 1のどの部分と結合するのか明らかにするために、 NBC 1の細胞質領域を大腸菌に組換え型タンパク質として発現させて精製し、 培養細胞に強制発現した I R B I Tとの結合をブルダゥン（p u l 1— d own) アツセィで検討した。 その結果、 I RB I Tは p NB C 1に特異的な N末側 8 5 アミノ酸と特異的かつ強力に結合することがわかった（図 1 0)。更に特定の塩の 濃度変化によって I RB I Tと p NB C lの結合が制御されていることもわかつ た。
これらの結果は、 種々の臓器における p NB C lによる pH調節を I RB I T が細胞内の状況依存的に制御している可能性を強く示唆している。 また、 近位尿 細管型アシドーシス患者は緑内障や白内障といった眼の疾患、低身長、精神遅滞、 滕臓炎といった様々な症状を呈することから、 NBC 1による pHの調節が腎臓 以外の臓器でも重要な役割を果たしていると考えられる。 それゆえ、 I RB I T は、 pNBC 1を介して緑内障や白内障などの眼の疾患、 低身長、 精神遅滞、 膝 臓炎などの疾患の治療法としても有用である（S e t h L. A 1 e r , A n n u . R e v. P h y s i o l . 2 002, 64 : 8 9 9— 923)。 したがって、 I RB I T、 あるいはその生成おょぴ機能を抑制または亢進する 物質は、 p NB C 1が関係する細胞内 p Hの制御を可能にする。
I P 受容体結合タンパク質 （I RB I T)
本発明で使用する I RB I Tは、 哺乳動物由来のものである。 I RB I Tは、 哺乳動物の脳、 心臓、 肝臓、 腎臓、 膝臓、 胸腺などの組織の細胞内小胞体に存在 していることが知られている （日本国特許出願公開第 2004— 1 29 6 1 2号 公報）。好ましレ、 I RB I Tの例は、 ヒ ト I RB I Tおよびマウス I RB I Tであ る （日本国特許出願公開第 2004 - 1 29 6 1 2号公報、 H. An d o ら， J . B i o l . C h e m. 200 3, 278 : 1 0602— 1 06 1 2)。 特にヒ ト I RB I Tが好ましい。 ヒ トおよびマウス I RB I Tのアミノ酸および塩基配 列は、 G e n B a n kにそれぞれ NM— 006 62 1 (配列番号 1、 2参照） お よび NM— 1 45542 (配列番号 3、 4参照） として登録されている。
また、 好ましい I RB I Tの別の例は、 配列番号 1または配列番号 3に示され るァミノ酸配列と 9 0 %以上、 好ましくは 95 %以上、 より好ましくは 98 %以 上、 もっとも好ましくは 99 %以上の同一性を有するアミノ酸配列を含みかつ I RB I Tと同等の生物学的活性を有するタンパク質である。 ここで、 生物学的活 性は、 S—アデノシルホモシスティンのアデノシンとホモシスティンへの可逆的 加水分解を触媒する S—アデノシルホモシスティンヒ ドロラーゼ様活性に加えて タンパク質合成における CP S Fとの結合を介する mRNAポリアデ二レーショ ンの制御、 P I PK I I との結合を介するイノシトールリン脂質代謝の制御、 お よび p NB C 1 との結合を介する細胞内 p Hの制御を含む生物学的機能の制御に 関わる活性をいう。
同様に、 好ましい I RB I Tをコードする DNAの例は、 配列番号 2または配 列番号 4に示される塩基配列と 9 0%以上、 好ましくは 9 5%以上、 より好まし くは 98%以上、 もっとも好ましくは 99 %以上の同一性を有する DNA、 ある いは、 ストリンジェントな条件下で該配列番号 2または配列番号 4の塩基配列と ハイプリダイズ可能な DN Aである。 ここで、 ストリンジヱントな条件とは、 以 下のものに限定されないが、 約 45〜50°Cで 2〜6 X S S C (塩化ナトリ ウム Zクェン酸ナトリウム） 中でのハイブリダイゼーシヨンと、 それに続く、 約 50 〜6 5 での0. 2〜 2 X S SC/0. 1〜 1 % S D Sによる洗浄からなる力、、 あるいは 60〜 65°Cで 6 X S S C、 D e n h a r d t溶液、 0. 2%SDS中 でのハイブリダィゼーシヨンののち、 60〜 65°Cでの 0. 2 X S S C、 0. 1 % SDSによる洗浄からなる （例えば、 F. M. Au s b e l ら， S h o r t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o l o g y ( 3 fe) A C om e n d i um o f Me t h o d s f r om C u r r e n t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o l o g y, 1 9 95 年， J o h n Wi l e y & S o n s , I n c. )。
他の哺乳動物由来の I RB I Tもまた、 本発明において使用可能である。 その ような I RB I Tは、 例えばラット、 ハムスター、 ゥサギなどの実験動物の I R
B I T、 ィヌ、 ネコなどのぺット動物の I RB I T、 ゥシ、 ゥマ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギなどの家畜動物の I RB I Τなどを含む。 これらの I RB I Τの作製につい ては、 文献、 データバンク等に記載のアミノ酸または塩基配列に基づいて、 ある いはヒ トまたはマウス I RB I Τの公知の配列に基づいて、 プローブおよび ま たはプライマーを作製し、 DNAクロー-ング法、 ポリメラーゼ連鎖反応 （P C R) などの慣用の手法によって、 例えば市販のまたは調製された動物組織からの ライブラリーを用いて、 I RB I T c DNAをクローン化および/または増幅 し、 さらに、 得られた I RB I Tをコードする DNAを、 適当な制御配列を有す る例えば市販の発現ベクター （例えばプラスミ ド） に組み込み、 適当な宿主細胞 に形質転換またはトランスフエクシヨンし、 得られた細胞を、 適当な培地にて培 養して I RB I T DNAを発現させ、 生成した I R B I Tタンパク質を回収す ることができる。 これらの一連の手法については、 例えば J . S amb r o o kら， Mo l e c u l a r C l o n i n g A L a b o r a t o r y M a n u a 1 , 1 9 89年， C o l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , F . M. Au s b e l ら， S h o r t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o l o g y (3版) A C omp e n d i um o f Me t h o d s f r om C u r r e n t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o l o g y, 1 9 9 5年, J o h n Wi l e y & S o n s , I n c .,実験医学別冊 4版松村正實ら 編 「新遺伝子工学ハンドブック」 （2003年） 羊土社、 東京、 日本などに記載さ れており、 ここに記載されるような手法に従って、 種々の哺乳動物由来の I RB I Tホモログを得ることが可能である。
I RB I T遺伝子を含む哺乳動物組織をホモゲナイザーを用いて均質化し、 約 10， 000 r pmで遠心分離して上清を得た後、例えばグァニジン ·酸性フエノ ール法で全 RN Aを回収し、 定法に従い c DNAを合成し、 この c DNAから I RB I Tをコードする DN Aを得ることができる。 RN Aの抽出のためのキット、 例えば日本ジーン社の I SQGEN (商標）、 が市販されているので、 それを利用 してもよい。
I RB I Tをコードする DN Aを検出するためのプローブのサイズは、 通常 3
0塩基以上、好ましくは 50〜 1 00塩基またはそれ以上である。プローブには、 通常、 蛍光標識 （例えばフルォレサミン、 ローダミンまたはそれらの誘導体）、 放 射性同位元素標識 （例えば32 P) などの標識を結合し、 これによつて目的の I R
B I Tをコードする DN Aとプローブとの結合を検出することができる。
I RB I Tをコードする DN Aを増幅するためのプライマーのサイズは、 通常 1 5〜30塩基、 好ましくは 20~2 5塩基である。 プライマーは、 I RB I T をコードする DNAのセンス鎖おょぴアンチセンス鎖の 3'末端側に相補的な配 列を有しているべきである。 しかし、 増幅すべき I RB I Tをコードする DNA の配列が不明の場合には、 公知の I RB I T配列に基づいて複数のプライマーを 準備し、 P CRによって錶型 DNAを増幅し、 さらに、 増幅された鎳型 DNAに 基づいて正式のプライマーを作製し、 P CRによって目的の铸型 DNAを増幅す ることができる。
PCRは、 一般に、 DNAの変性、 プライマーのアニーリングおよび伸長反応 を 1サイクルとして約 20〜40サイクル行うことからなる。 DNAの変性は、 二本鎖 DNAを一本鎖の DN Aに解離するための工程であり、 通常 94°Cで約 1 5秒〜 1分の処理を行う。 プライマーのアニーリングは、 プライマーと、 相補的 な一本鎖錶型 DNAとを対合させる工程である。 ァニーリングに至適な温度や時 間はプライマーの塩基配列や長さに依存するが、 通常約 5 5〜 60 °Cで約 30秒 〜1分の処理を行う。 伸長反応は、 4種類の d NT Pと耐熱性 DN Aポリメラー ゼの存在下で铸型 DN Aを伸長する工程であり、 通常 72°Cで約 3 0秒〜 1 0分 の処理を行う。 サイクルを開始する前に、 94°Cで約 1〜 5分加熱し完全に DN Aを変性することもできる。 また、 全サイクルの終了後に、 72°Cで約 1〜5分 の加熱処理を行うこともできる。耐熱性 DNAポリメラーゼは、市販されており、 例えば Th e r mu s a q u a t i c s (T a q) ポリメラーゼ （ T a K a R a、 パーキンエルマ一、 フアルマシアなどから販売） を使用することができる。 PCRの手法については、 例えば蛋白質核酸酵素 「P CR法最前線 基礎技術か ら応用まで」 第 41卷第 5号 1 9 96年 4月増刊号、 共立出版、 東京、 日本を参 照することができる。
発現ベクターは、 原核生物または真核生物由来の細胞で使用可能な任意のベタ ターである。 ベクターは、 プロモーター、 複製開始点、 リボソーム結合部位、 マ ルチクローニング部位、 ターミネータ一などの制御配列を含むことができる。 発 現ベクターとしては、 プラスミ ド、 ウィルスなどのベクター、 特に市販のべクタ 一、例えば p GEX—4 T— 1 (アマ一シャム'フアルマシア'バイオテック社）、 p B l u e s c r i p t I I SK、 pHS 1 9、 pHS l 5、 p G— 1およ び p XT l (ス トラタジーン社）、 pMALおよび p TYBシリーズ （第一化学薬 品）、 p Q Eシリーズ （キアゲン社）、 p E Tシリーズ （ノバジェン社）、 p S VK 3および p S V L S V 4 0 (フアルマシア社）、 p c DNA lぉょぴp c DM8 (フナコシ）、 p HB 6、 p VB 6、 p HM 6、 p VM 6および p XM (ロシュダ ィァグノスティック社） などを適宜選択して使用することができる。
宿主細胞としては、 大腸菌などのェシエリヒア属、 枯草菌などのバチルス属、 シユードモナス属、 コリネバクテリゥム属などの細菌類、 サッカロマイセス属、 ピチア属、 シゾサッカロマイセス属などの酵母類、昆虫細胞、植物細胞、 CHO、 CO S、 HEK 2 9 3などの哺乳動物細胞などを挙げることができる。
I R B I Tをコードする DN Aを宿主細胞に導入する方法には、 リン酸カルシ ゥム法、 リポフエクシヨン法、 エレク ト口ポレーシヨン法、 アデノウイルス、 レ トロウィルスなどのウィルス感染による方法などが含まれる （実験医学別冊 4版 松村正實ら編 「新遺伝子工学ハンドブック」 （2 0 0 3年） 羊土社、東京、 日本）。 より具体的には、 マウス I RB I Tについて、 成熟マウス小脳からの I R B I
Tの精製、 c DNAクローニングおよび発現が日本国特許出願公開第 2 0 0 4 -
1 2 9 6 1 2号公報に記載されており、 それらの開示を参照可能である。
I R B I Tの生物学的活 1"生は、 I R B I Tが、 S—アデノシルホモシスティン のアデノシンとホモシスティンへの可逆的加水分解を触媒する S—アデノシルホ モシスティンヒ ドロラーゼと相同性を有するため、 類似のアツセィ.法に基づいて 測定することができる。 このアツセィ法は、例えば C. 一 S . Y u a nら （J .
B i o l . C h e m. 1 9 9 6， 2 7 1 ： 2 8 0 0 9 - 2 8 0 1 6 ) の方法に準 ずることができる。 簡単に説明すると、 I R B I T (約 3 g) およびゥサギ S 一アデノシルホモシスティンヒ ドロラーゼ (シグマ社) (約 2. 5 μ g ) を用いて 上記の加水分解反応を行ない、 その生成産物 （ホモシスティン） を 5， 5，—ジチ オピス （2—二トロ安息香酸） （シグマ社） と反応させて得られる発色を、 4 1 2 nmで分光光度計にて測定し吸光度を求めることを含む。
I RB I Tの発現 Z翻訳を制御する核酸
本発明において、 I RB I Tの発現/翻訳を制御する核酸には、 I R B I Tを コードする DNA、 I R B I Tをコードする mRNAのアンチセンス RNAもし くはその断片、 I RB I Tをコードする mRN Aの切断を可能にするリボザィム、 s i RNA (s ma l l i n t e r f e r i n g RNA) などの機能的 R N A、 あるいは、 それらの DNAもしくは RNA (実際的には、 RNAをコードす る DNA) を含むベクター DNAが包含される。
I R B I Tをコードする DNAは、 ヒ ト、 マウスなどの哺乳動物由来の I RB I Tをコードする DNAであり、 上記の 「 I P 3受容体結合タンパク質 （ I RB I T)」 の項で説明したような手法で作製することができる。好ましい I RB I Τ をコードする D Ν Αは、 配列番号 1または配列番号 3に示されるァミノ酸配列を コードする塩基配列を含む DN Aであり、 さらに好ましい DN Aは、 配列番号 2 または配列番号 4に示される塩基配列からなるヒ トまたはマウス I RB I Tをコ 一ドする DNAである。
I RB I Tをコードする DNAは、 発現ベクター （例えばプラスミ ドまたはゥ ィルスベクター） に挿入されて、 細胞内での I RB I Tの発現のために使用可能 である。
I R B I Tをコードする DN Aを発現するためのプラスミ ドベクタ一は、 I R B I Tをコードする DNA配列及びプロモーターの他に、 薬剤耐性遺伝子 （例え ば、 ネオマイシン耐性遺伝子、 アンピシリン耐性遺伝子、 ピュー口マイシン耐性 遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子など）、 ターミネータ一、マルチプルクロー ユングサイ ト、 複製開始点、 リボソーム結合部位などの制御配列を含むことがで きる。
また、 I RB I Tをコードする DN Aを発現するためのウィルスベクターは、 たとえばアデノウィルスベクター、 アデノ随伴ウィルスベクター、 レンチウィル スベクター、 レトロウイルスベクタ一 （白血病ウィルスベクターなど）、 ヘルぺス ウィルスベクターなどを使用することができる。 ウィルスベクターは、 ヒ トに使 用する際に疾病を引き起こさないように例えば自己複製能を欠損したタイプのも のが好ましい。 たとえばアデノウイルスベクターの場合には、 E 1遺伝子及び E 3遺伝子を欠失した自己複製能欠損型アデノウイルスベクター （例えば I n v i t r o g e n社の p A d e n o— X) を使用することができる。 ゥイノレスべクタ 一の構築は、 文献記載の方法を利用することができる （米国特許第 52 5247 9号、 国際公開 WO 94/1 3 788など）。
プロモーターは、 哺乳動物細胞内で外来 D N Aの発現が可能なプロモーターを 使用することができる。 プロモーターの例は、 サイ トメガロウィルス （CMV) プロモーター、 SV40プロモーター、 E Fプロモータ一などを含む。
プラスミ ドベクタ一は、 例えばリポフエクタミン、 リボフヱクチン、 セルフエ クチン、 正電荷コレステロールなどの正電荷リポソームと複合体を形成しカプセ ル化された状態で患者の体内に導入することができる （例えば、 中西守ら， 蛋白 質核酸酵素， 44卷 1 1号， 48〜 54頁， 1 99 9年， 共立出版、 東京、 日本； C l i n i c a l C a n c e r r e s e a r c h 5 9 ： 4325—4 33 3， 1 9 99 ;Wuら， J . B i o l . C h e m. 1 98 7, 26 2 : 4429)。 また、 ウィルスベクターは患部に導入し細胞感染させることによって細胞内に遺 伝子導入することができる （L. Z e n d e rら， P r o c . Na t l . Ac a d. S c i . USA (2003), 1 00 : 77 797- 7802 ; H. X i a ら， N a t u r e B i o t e c h. (2002), 20 : 1 006— 1 0 1 0 ; X. F. Q i nら， P r o c. N a t l . A c a d . S c i . USA (2003)， 1 00 ： 1 8 3 - 1 88 ； G. M. B a r t o nら， P r o c . N a t l . Ac a d., S c i . USA (2002), 99 ： 14 943- 1 4945 ； J . D. Homme 1 ら， Na t u r e Me d. (2003), 9 : 1 5 3 9— 1 544)。 特にアデノウィルスベクター又はアデノ随伴ウィルスベクターは種々の細胞種に 非常に高い効率で遺伝子導入可能であることが確認されている。 このベクターは また、 ゲノム中に組み込まれることがないため、 その効果は一過性であり安全性 も他のウィルスベクタ一と比べて高いと考えられる。 '
さらに、 I RB I Tをコードする mRN Aのアンチセンス RN Aもしくはその 断片は、 I RB I T遺伝子の I RB I Tタンパク質への翻訳を阻害することが可 能である。
前記断片は、 I RB I T遺伝子又は mRN Aの配列において連続する約 3 0塩 基以上、 5 0塩基以上、 70塩基以上、 1 00塩基以上、 1 50塩基以上、 20 塩基以上又は 25 0塩基以上から全長以下の塩基数からなる配列を含むことがで きる。 アンチセンス RNAもしくはその断片は、 ハロゲン （フッ素、 塩素、 臭素又は ョゥ素）、メチル、カルボキシメチル又はチォ基などの修飾基を含むことができる。 上記アンチセンス核酸は、 周知の DNA/RNA合成技術又は DNA組換え技 術を用いて合成することができる。 DN A組換え技術によって合成する場合、 I RB I Tの塩基配列を含むベクター DN Aを錡型にして、 増幅しようとする配列 を挟み込むプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応 （PCR) を行って標的配 列を増幅し、 必要に応じてベクター中にクローユングして、 アンチセンス DNA を生成することができる。 あるいは、 このようにして得られた増幅標的配列を有 する DNAをベクターに挿入し、 該ベクターを真核又は原核細胞に導入し、 その 転写系を利用してアンチセンス RNAを得ることができる。
同様の阻害はまた、 I RB I Tをコードする mRN Aの切断を可能にするリボ ザィム、 s i RNAなどの機能的 RNAによっても可能である。
s i RNAは、 例えば配列番号 2 (ヒ ト I RB I T) または配列番号 4 (マウ ス I R B I T) の塩基配列によってコードされる mRNA配列からの連続する約 1 8〜 3 0、 好ましくは約 1 9〜 25、 さらに好ましくは約 2 0〜 23ヌクレオ チドのセンス鎖配列と、 その相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むこと ができる。 ここで、 センス鎖配列とは、 前記 mRNAの標的サイ トと同一の塩基 配列をいい、 また、 アンチセンス鎖配列とは、 このセンス鎖配列に相補的な塩基 配列をいう。 センス鎖とアンチセンス鎖は互いに対合して二本鎖の s i RNAを 形成することができる。 s i RNAはさらに、 センス鎖およびアンチセンス鎖の 各 3 ' 末端に 1〜5個の塩基からなるオーバーハング、 例えば UUを含むことが できる。
s i RNAのセンス鎖配列を選択するためには、 例えば標的 I RB I T mR
N Aの標的サイ トの選択のための公知の知識、 例えば、 （a) GC含量が約 3 0〜
70%、 好ましくは約 5 0%である、 (b) すべてのヌクレオチドが均等であり、 また Gが連続していない、 （c) アンチセンス鎖の 5'末端のヌクレオチドが A、
Uである、 などの基準を使用することができる （D. M. D y k X h o o r nら，
Na t u r e R e v. Mo l . C e l l B i o l . (20 03), 7 7 : 7 1
74— 71 8 1 ; A. Kh v o r o v a ら， C e l l (200 3), 1 1 5 : 20 9一 2 1 6)。また、 RNA二次構造予測プログラムである m f o 1 dを用いて上 記 s i RNAの標的サイ トである I RB I T m R N A上の候補遺伝子部位を推 定することもできる （J . A. J a e g e rら， Me t h o d s i n En z ymo l o g y 1 98 9， 1 8 3 ： 28 1 -306 ； D. H. Ma t h e w s ら， J . Mo l . B i o l . 1 9 99, 288 : 9 1 1— 940)。 例えば、 s i RNAが標的とすることができる配列は、 上記の知見に基づいて推定し、 実際に その効果を確認することによって決定することができる。 本発明で使用可能な s i RNAは、 非限定的な例として以下の配列を挙げることができる。
IRBIT siRNA-l: AAAUCCAGUUUGCUGAUGACA (配列番号 5 )
IRBIT siRNA-2: AACUCAGAAUGAAGUAGCUGC (配列番号 6 )
s i RNAは、 周知の化学合成技術を用いて合成することができる。 例えば、 慣用の DNA/RNA自動合成装置を使用して化学的に合成するか、 あるいは、 s i RNA関連の受託合成会社 （例えばフナコシ株式会社 （東京、 日本）、 Dh a rma c o n社、 Amb i o n社など） に合成を委託することによって入手可能 である。
s i RNAを細胞または組織内に導入するときには、 s i RNAを直接細胞ま たは組織内に注入するか、 又は s i RNAの発現が可能なベクターを使用するこ とが好ましい。 あるいは、 s i RNA又はベクターを、 リボソーム、 例えばリポ フエクタミン、 リポフエクチン、 セルフエクチン及びその他の正電荷リボソーム (例えば、 正電荷コレステロール）、又はマイクロカプセル、 と複合体形成し、 こ れを使用することもできる （例えば、中西守ら，蛋白質核酸酵素， 44卷 1 1号， 48〜 54頁， 1 9 99年， 共立出版、 東京、 日本； C l i n i c a l C a n c e r r e s e a r c h 59 : 432 5— 43 3 3, 1 9 9 9 ;Wuら， J . B i o l . C h e m. 1 98 7, 262 : 4429)。
s i RNAを発現するためのベクターでは、 s i RNAまたはその前駆体をコ 一ドする DN A配列をプロモーターの調節下に含む。
発現ベクターの 1つの例は、 ヘアピン型ベクターである。 このベクターは、 前 記センス鎖 R N A配列と前記アンチセンス鎖 R N A配列とがー本鎖ループ配列を 介して共有結合されているヘアピン型 RN Aをコードする DN Aを含み、 ここで 該 DNAは、 細胞内で転写により該ヘアピン型 RNAを形成し、 ダイサ一により プロセシングされて前記 s i RNAを形成するベクターである。 s i RNAをコ ードするヘアピン型 DNAの 3'末端には、転写停止シグナル配列として、 あるい はオーバーハングのために、 1〜6個、 好ましくは 1〜5個の Tからなるポリ T 配列が連結される。 ベクター DNAから転写された s i RNA前駆体としてのシ ョートヘアピン RN A ( s h RNA) は、 そのアンチセンス鎖の 3，末端に 2〜 4 個の Uからなるオーバーハングを有することが望ましく、 オーバーハングの存在 によって、 センス鎖 RN A及びアンチセンス鎖 RN Aはヌクレアーゼによる分解 に対して安定性を増すことができる。 ヒ トには内在性のダイサ一が 1つ存在し、 これが長鎖 d s RNAや前駆体マイクロ RNA (m i RNA) をそれぞれ s i R NAと成熟 m i RNAに変換する役割をもつ。 プロモーターの例は、 p o l I I Iプロモーター、 例えばヒ トもしくはマウス由来の U 6プロモーター又は H 1 プロモーター、 p o l I Iプロモーター、 或いはサイ トメガロウィルスプロモ 一ターである。
発現ベクターの別の例は、 タンデム型ベクターである。 このベクターは、 前記 s i RNAを構成するセンス鎖 RNA配列をコードする D N A配列とアンチセン ス鎖 RN A配列をコードする DN A配列とを連続して含み、 かつ各鎖の 5， 末端 にプロモーターが、 また各鎖の 3 ' 末端にポリ T配列がそれぞれ連結された DN Aを含み、 ここで該 DNAは、 細胞内で転写後に該センス鎖 RNAと該アンチセ ンス鎖 RN Aとがハイブリダイズして前記 s i RNAを形成するベクターである タンデム型ベクターにおけるプロモーターの例は、 p o l I I Iプロモータ 一、 ί列えばヒ トもしくはマウス由来の U 6プロモーター又は Η 1プロモーター、 或いはサイ トメガロウィルスプロモーターである。 また、 ポリ Τ配列は、 1〜6 個、好ましくは 1〜 5個の Τからなるポリ Τ配列である。タンデム型ベクターは、 細胞内に導入されたのち、 センス鎖とアンチセンス鎖に相当する RNAに転写さ れ、 互いにハイブリダィズして目的の s i RN Αを生成することができる。
上記ヘアピン型及びタンデム型べクターは、 プラスミ ドベクター又はウィルス ベクターである。 プラスミ ドベクターは、 後述の実施例に記載の手法又は文献記 載の方法を用いて調製してもよいし、 或いは市販のベクター系、 たとえば p i G ENE™U 6系ベクター及ぴ p i GENETMH 1系べクタ一（タカラバイオ株式 会社、 京都、 日本） を利用することもできる （T. R. B r umme 1 k amp ら， S c i e n c e (2002), 29 6 : 5 5 0— 5 53 ; N. S . L e e ら， a t u r e B i o t e c h. (2002)， 20 : 500— 505 ; M. M i y a g i s h i ら， Na t. B i o t e c h n o l . (2002), 20 : 49 7 - 500 ； P . J . P a d d i s o nら， Ge n e s &D e v. (2002), 1 6 ： 948 - 9 58 ； T. T u s c h , Na t u r e B i o t e c h (200 2), 20 : 446-448 ; C. P. P a u l ら， N a t u r e B i o t e c h. (2002)， 20 ： 505 - 508 ； 多比良和誠ら編、 RNA i実験プロ ト コル、 羊土社 （東京、 日本）、 2 003年）。
本発明の組成物の有効成分である別の核酸は、 リボザィムである。 リボザィム は、 触媒活性をもつ RN Aであり、 本発明の標的 I RB I T遺伝子に対応する m RNAを切断する活性を有している。 この切断によって該遺伝子の発現が阻害又 は抑制される。
リボザィムの切断可能な標的配列は、 一般には NUX (N = A, G， C, U ； X = A, C， U)、例えば GUC トリプレッ トを含む配列であることが知られてい る。 このようなリボザィムには、 ハンマーへッ ド型リボザィムが含まれる。 ハン マーヘッ ド型リボザィムは、 センサー部位を構成するヌクレオチド配列、 センサ 一部位に RN Aが結合したときのみ安定に Mg 2 +イオンを捕捉する空洞を形成 しうる領域を含むヌクレオチド配列、 及び標的 RN Aの切断部位周辺の配列に相 補的である領域を含むヌクレオチド配列を含むことができる。
本発明のリボザィムを細胞内または患者体内に送達するために、 リボザィムを リボソーム （好ましくは、 正電荷リボソーム） に封入する （3本国特開平 9一 2 1 68 25号公報 （1 9 9 7年））、 アデノ随伴ウィルスなどのウィルスベクタ一 に組み込む （日本国特表 2002— 542805号公報） などの方法によってド ラッグデリバリー系を構築することができる。
リボザィムは、 それが発現可能なようにベクターに組み込むことができる。 リ ボザィムを発現するためのプロモーターには、 p o 1 I I又は p o 1 I I I プロモーターが含まれる。 好ましいプロモーターは、 p o 1 I I Iプロモータ 一、 例えば哺乳動物由来の t RNAプロモーター、 より好ましくは t RNAVa 1 プロモーターである （S. K o s e k i ら， J . V i r o l ., 73 : 1 8 6 8— 1 8 7 7， 1 99.9)。
体
I RB I Tに対する抗体又はその断片もまた、 上記生物学的機能の制御のため に使用できる。
このような抗体には、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体、 組換え型抗 体、 ヒ ト抗体、 ヒ ト化抗体、 キメラ抗体、 単鎖抗体、 F a b断片、 F (a b') 2 断片、 F v、 s c F v、 二重特異抗体、 合成抗体などが含まれる。
抗体のクラス、 サブクラスは任意のタイプでよく、 例えば I gG， I gM, I g E, I g D, I gA、 I g G1; I g G2, I g G3, I g G4, I gAい I g A2などが含まれる。
抗体はまた、 ぺグ化、 ァセチル化、 グリコシル化、 アミ ド化などによって誘導 体化されていてもよレ、。
ポリクローナル抗体の作製は、 I R B I Tを免疫原 （約 1 μ g〜 1 00 g ) として、 必要に応じて F r e u n dの完全'もしくは不完全アジュバント、 水酸化 アルミニウム（a 1 um)、 ムラミルジペプチド、 リ ピド Aなどのアジュバントを 含む油中水型乳濁液を、 ゥサギ、 モルモッ ト、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギな どの非ヒ ト動物に皮内もしくは静脈内に免疫注射し、 約 2〜4週間後に、 アジュ バント非含有の I RB I Tを 1〜 2回注射し、ブース トを行う。試験的に採血し、 抗体価が十分に上がったことを確認したあとで、 動物から採血し、 遠心分離によ り抗血清を回収する。 必要に応じて、 硫安分画、 DE AEイオン交換クロマトグ ラフィーなどにより精製し I g Gを得ることができる。
モノクローナル抗体を分泌するハイブリ ドーマの作製は、 ケラーとミルシユタ ィンの方法 （Na t u r e 1 9 75, 256 ： 495 -49 7) に準じて行 うことができる。 すなわち、 ハイプリ ドーマは、 免疫感作された動物から脾臓ま たはリンパ節を取り出し、 それに含まれる抗体産生細胞と、 マウス、 ラット、 モ ルモッ トなどの哺乳動物に由来のミエローマ細胞との細胞融合、 HAT選択によ つて得ることができる。 細胞融合は、 例えばポリエチレングリコール （例えば分 W 200 子量1 5 00〜6000) を用いて行うことができる。 目的の抗体の産生は、 ハ イブリ ドーマの培養上清の免疫抗原に対する反応性を酵素免疫測定法、 放射性免 疫測定法、 蛍光抗体法などの慣用の方法を用いて測定することができる。
また、 ハイプリ ドーマからのモノクローナル抗体の作製は、 ハイブリ ドーマを i n V i t r oで培養してその培養上清から単離してもよいし、 あるいはマウ ス、 ラッ ト、 モルモッ トなどの腹水等で i n V i v oで培養し、 腹水から単離 してもよレ、。
あるいは、 ハイブリ ドーマ等の抗体産生細胞からモノクローナル抗体をコード する遺伝子をクローユングしたのち、 これをベクターに組み込み、 哺乳動物細胞
(例えば CHO) などに導入し、組換え型抗体を作製することもできる （P. J . D e l v e s ら， ANT I BODY PRODUCT I ON E S S ENT I A L TECHN I QUE S.' 1 997， J o h n W i l e y&S o n s)。 ヒ ト抗体は、 例えばファージジスプレイライブラリー (p h a r g e d i s p l a y 1 i b r a r y) 法 (T. C. Th oma s ら， Mo l . I mmu n o 1. 33 : 1 38 9— 1401， 1 99 6) 又はヒ ト抗体産生動物 （例えばマ ウス、 ゥシなど） を用いる方法 （ I . I s h i d aら， C l o n i n g S t em C e l l 4 : 9 1一 1 02， 2002) によって製造できる。
例えば、 ヒ ト抗体産生マウスは、 ヒ ト人工染色体にヒ ト抗体産生遺伝子を含む ヒ ト染色体断片を導入したのち、 ミクロセル法を用いて例えばマウス胚性幹細胞 ゲノムに人工染色体を組み込み、 組換え胚性幹細胞を胚盤胞に注入し、 仮親マウ スの子宮に移植し、 キメラマウスを出産し、 雌雄のキメラマウス、 またはキメラ マウスと野生型マウス、 の交配を通して、 ヒ ト抗体遺伝子を含み、 したがってヒ ト抗体の産生が可能である、 ホモ接合型の子孫マウスを作出するなどの方法によ つて作製することができる （例えば、 日本国再表 02Z0 928 1 2号公報、 国 際公開 WO 98/24 8 93, WO 9 6 Z 34096など）。 このヒ ト抗体産 生トランスジヱニックマウスに、 本発明の I R B I Tタンパク質を抗原として免 疫したのち、 脾臓を摘出し、 この脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを融合して ハイブリ ドーマを形成し、 目的のモノクローナル抗体を選抜することができる。 ファージディスプレイライブラリ一法は、 未処置のヒ トリンパ細胞から直接手 に入れた免疫グロプリン遺伝子のライブラリーから、 目的の抗体をコードする D NAをスク リーニングし、 この DNAと、 抗体鎖との間に、 ファージ粒子を用い て物理的会合を確立し、 これによつて、 標的に親和性をもつ抗体を提示するファ ージを親和性スクリ一ユングによって富化することを含む。 この方法を用いて、 標的に対する結合親和性をもつ抗体を、 通常の手法によって大量に合成すること ができる （例えば、 日本国特表 2003— 5278 3 2号公報）。
本発明の組成物は、 疾患または障害の治療のために用いることができる。
治療用組成物
本発明において、 該疾患または障害とは、 タンパク質合成、 イノシトールリン 脂質代謝、 および細胞内 p Hの異常によって引起されるものである。
タンパク質合成の場合、 CP S Fに対する I RB I Tの結合に伴うタンパク質 合成の制御が挙げられる。 この場合、 I RB I Tはタンパク質合成を宂進し、 I RB I Tの働きを抑制する物質 （上記の核酸または抗体） はタンパク質合成を抑 制することができる。 C P S Fが関与するタンパク質合成の異常には、 例えば腫 揚がある。
イノシトールリン脂質代謝の場合、 Ρ ΡΚ Ι Iの異常な活性化に伴う疾患、 例えば 2型糖尿病が挙げられる。 I RB I Tは P I PK I I活性を抑制する作用 があるため、 2型糖尿病の治療のために使用できる。
細胞内 pHの場合、 細胞内の pHの維持に p NBC 1が重要な働きをしている が、 特に pHが酸性に傾くことによる疾患に、 緑内障や白内障などの眼の疾患、 低身長症、 精神遅滞、 滕臓炎などの疾患が含まれる。 I RB I Tは、 p NB C 1 と結合し、 細胞内 p Hの正常な状態への調節を可能にする。
本発明の組成物中の有効成分の含有量は、 制限されないが、 約 1 μ g〜l 00 mgである。 その含有量は、 有効成分の種類に応じて変化しうる。
本発明の組成物中の I RB I Tの用量は、 1投与単位あたり約 1 g〜lmg、 好ましくは約 50 μ §〜500 μ gであるが、 この範囲に限定されない。
本発明の組成物中の核酸の用量は、 s i RNA、 アンチセンス核酸、 又はリボ ザィムに換算すると、 以下のものに限定されないが、 1投与単位あたり、 約 I n
M〜 1 00 ^Μ、 好ましくは約 1 0 nM〜50 である。 本発明の組成物中の抗体又はその断片の用量は、以下のものに限定されないが、
1投与単位あたり、 約:！〜 l O Omg /m 1、 好ましくは約 5〜 70 m g /m 1 である。
しかし、 上記の用量又は投与量は、 患者の状態、 年齢、 性別、 重篤度などに応 じて変化しうるものであり、 専門医の判断により用量又は投与量が決定されるべ きである。
本発明の組成物は、 通常、 製薬上許容可能な担体 （すなわち、 賦形剤又は希釈 剤）、 例えば滅菌された水、 生理食塩水、 緩衝液、 非水性液体 （例えば、 ァーモン ド油、植物油、エタノールなど）などを含むことができる。該組成物にはさらに、 製薬上許容可能な安定剤 （例えばメチォ-ンなどのアミノ酸類）、保存剤 （p -ヒ ド ロキシ安息香酸メチル、 ソルビン酸）、 等張化剤 （例えば塩化ナトリウム）、 乳化 剤 （例えばレシチン、 アラビアガム）、 懸濁化剤 （例えばセルロース誘導体） など を含有させることができる。
好ましい医薬製剤は、 溶液剤、 懸濁液剤、 乳剤などである。
本発明の組成物の投与方法は、 経口投与、 非経口投与、 例えば静脈内投与、 局 所投与などを含む。 局所投与には、 外科手術又は内視鏡下で患部に直接注射する 方法などが含まれる。 また、 専門医が決定した治療計画に基づいて、 一定の時間 間隔、 例えば 1週間、 2週間、 3週間、 1ヶ月、 2ヶ月、 6ヶ月、 1年などの間 隔で、患者に対して、本発明の組成物を 1〜数回に分けて投与することができる。 また、 患者への抗体又はその断片の送達は、 単独か又は例えばリボソーム （好 ましくは、正電荷リポソ一ム）、マイク口カプセル又はナノ粒子中に抗体又はその 断片を封入した形態で、通常は適当な担体（賦形剤又は希釈剤） と組み合わせて、 経口経路、 非経口経路 （例えば、 静脈内投与又は局所投与） にて行うことができ る。
本発明の組成物は、 i n v i t r o, i n v i v oまたは e x v o v o で使用可能である。
i 11 v i t r oでは、 治療用物質のスクリーニングのために、 本発明の組成 物を利用することができる （下記参照）。
e x v o v oでは、 一旦患者から生体外に取り出された細胞や組織を、 本発 明の有効成分で処理した後、 体内に戻すことができる。 これによつて、 タンパク 質合成、 イノシトールリン脂質代謝または細胞内 p Hの異常が生じた細胞や組織 を正常に復することが可肯 となる。
2. I RB I Tの使用例
本発明はまた、 I RB I Tを i n v i t r oまたは e x v i v oで使用す る下記の方法を提供する。
第 1に、 本発明は、 i n v i t r oまたは e x v i v oでの細胞内のタン パク質合成の制御における I RB I Tの使用方法を提供する。
この方法は、 I RB I Tが CP S Fに結合して CP S Fの機能を制御するとい う作用をもつことに基づく。
第 2に、 本発明は、 i n v i t r oまたは e x v i v oでの細胞内のイノ シトールリン脂質代謝の制御における I RB I Tの使用方法を提供する。
この方法は、 I RB I Tが P I PK I I活性を抑制するという作用をもつこと に基づく。
第 3に、 本発明は、 i n v i t r oまたは e x v i v oでの細胞内 pHの 制御における I R B I Tの使用方法を提供する。
この方法は、 I RB I Tが pNBC lを活性化するという作用をもつことに基 づく。 また、 p NBC lの活性化には、 I RB I Tのリン酸化が必要である。 上記のとおり I RB I Tは、 i n V i t r oでは、 細胞内でのタンパク質合 成、 イノシトールリン脂質代謝または細胞内 p Hの制御を可能にする物質のスク リーニングのために使用できるし、また、 e X V i v oでは、タンパク質合成、 ィノシトールリン脂質代謝または細胞内 p Hの異常が生じた細胞や組織を正常な 状態に戻すために使用することができる。
3. スクリ一二 /グ
本発明はさらに、 候補物質の存在下で、 I RB I Tと C P S F、 P I PK I I または pNBC l との結合を測定し、 該結合を抑制または亢進する物質を同定す ることを含む、 物質のスクリーニング方法を提供する。
上記結合は、 試験管内で、 あるいは細胞 （特に哺乳動物細胞） 内で、 候補物質 の存在下で I RB I Tと C P S F、 P I PK I Iまたは p NB C l との結合を測 定することができる。哺乳動物細胞には、例えば CHO、 COS、 HEK293、 He L a、 N I H 3 T 3などが含まれる。
同定された物質は、 例えば治療用または診断用として使用できる。 特に、 該物 質は、 細胞内のタンパク質合成、 イノシトールリン脂質代謝および細胞内 ρΗか らなる群から選択される少なく とも 1つの細胞内生物学的機能を制御するもので ある。
上記結合を試験管内で実施するときには、 例えば、 適当なバッファ中に、 I R B I Tと CP S F、 P I PK I Iまたは p NB C 1とを存在させ、 これに候捕物 質を加え、 I RB I Tと CP S F、 P I PK I Iまたは p NB C lとの結合のレ ベルを、 SDS— PAGEおよびィツムノブロッ ト法で検出することができる。 この系は、上記結合を抑制または阻害する物質の検出に有効である。 I RB I T、 C P S F、 P I PK I Iまたは p NB C 1の組換えタンパク質の作製は、 上記の I RB I Tの項で記載したと同様の手法で行うことができる。
上記結合を細胞内で実施するときには、 I RB I Tと C P S F、 P I PK I I または p NBC 1とを同時にまたは別個に発現させうるように、 それぞれのタン パク質をコードする DNAを同一のまたは異なるベクターに組込み、 該ベクター で哺乳動物細胞を形質転換またはトランスフヱクションする。 翻訳されたタンパ ク質は細胞内、 特に細胞質に存在するように、 好ましくは、 ベクター DNAは分 泌シグナル配列を含まないようにするのがよい。
CP S F、 P I PK I Iまたは pNBC 1のアミノ酸および塩基配列は、 G e n B a n kや文献などから入手可能であり、それぞれ例えば（A B 09 2 504)、 (AF 0305 58、 AF 033 35 5)、 (NM_0 03 75 9、 NM— 0 1 8 760) の登録番号が付与されている。 I RB I Tのアミノ酸および塩基配列に ついては、 上記のとおりである。
発現ベクターは、好ましくは哺乳動物細胞で使用可能な任意のベクターである。 ベクターは、 プロモーター、 ェンハンサー、 複製開始点、 リボソーム結合部位、 マルチクローニング部位、 ターミネータ一、 ポリ Αシグナルなどの制御配列を含 むことができる。 発現ベクターとしては、 p SG 5、 p XT 1 (ストラタジーン 社）、 p SVK3、 p B PV、 pMSGおよび p SVL S V 40 (フアルマシア 社）、 pHM6、 p VM 6および p XM (ロシュダイァグノスティック社） などの 市販のベクターを適宜選択して使用することができる。
プロモーターには、 例えば CMVプロモーター、 SV40プロモーター、 EF プロモーターなどが含まれる。
I RB I T、 C P S F、 P I PK I Iまたは p NBC lをコードする DNAを 宿主細胞に導入する方法には、 リン酸カルシウム法、 リボフヱクシヨン法、 エレ ク トロポレーシヨ ン法、 アデノウイルス、 レトロウイルスなどのウィルス感染に よる方法などが含まれる （実験医学別冊 4版松村正實ら編 「新遺伝子工学ハンド ブック」 （2003年） 羊土社、 東京、 日本）。
或いは、 公知の手法により非ヒ ト動物の卵母細胞または胚性幹細胞を使用して I RB I T遺伝子を外来的にゲノムに組込み、 強制的に発現可能にしたトランス ジエニック非ヒ ト動物 （例えばマウス）、 ならびに、 C P S F、 P I PK I Iまた は p N B C 1遺伝子を外来的にゲノムに組込み、 強制的に発現可能にしたトラン スジエニック非ヒ ト動物（例えばマウス） をそれぞれ作製し、両動物を交配して、 I RB I T遺伝子と、 C P S F、 P I PK I Iまたは p NB C 1遺伝子とを発現 可能にしたキメラ非ヒ ト動物およびその子孫を作製することができる。
細胞内またはトランスジエニック非ヒ ト動物内で強制的に発現された I RB I Tと、 CP S F、 P I PK I Iまたは; p NBC 1 との結合が、 細胞内または動物 内に取り込んだ候補物質の存在下でどのように影響を受けるかを、.該結合をプル ダウン法、 免疫沈降法などによって測定することによって調べる。 同時に、 ある 特定のタンパク質の細胞内合成に及ぼす影響、 イノシトールリン脂質代謝に及ぼ す影響、 細胞内の p Hに及ぼす影響を調べる。
タンパク質の細胞内合成に及ぼす影響は、 例えば、 特定のタンパク質に対する 抗体を用いたウェスタンブロット法などによって測定することができる。
イノシトールリン脂質代謝に及ぼす影響は、 例えば [3H] ラベル、 あるいは P I P 2結合タンパク質を用いた P I P 2量定量などによって測定することがで きる。
細胞内の p Hに及ぼす影響は、 例えば蛍光 p H指示薬を用いた細胞内 p H測定 などによって測定することができる。 候補物質は、 有機小分子、 ペプチド、 ポリペプチド、 タンパク質、 ヌクレオシ ド、 オリゴヌクレオチド、 ポリヌクレオチド、 核酸 （DNA又はRNA) などを 含むが、 これらに限定されない。
上で説明したように、 I RB I Tは、 細胞内での代謝、 pH変化、 イオンバラ ンス、 リン脂質代謝の調節、 タンパク質合成の制御、 C a 2+放出の制御などを調 節する上で大変重要な意義を全ての細胞で有している。 I RB I Tの濃度や発現 パターンを制御することにより、 上記の様々な生物学的機能を制御しうることが 今回判明した。 本発明のスクリーニング法で同定される物質は、 このような制御 のために有用である。 実施例
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明するが、 本発明の範囲は、 これらの実施例によって限定されないものとする。
<実施例 1 >
細胞質内 P o 1 y (A) 付加反応への I RB I Tの関与
CP S Fは、 CP S F 1 6 0、 CP SF 1 00、 CP S F 7 3および C P S F 30の 4つのサブユニッ トからなる複合タンパク質群であるため、 まず、 この 4 つのサブュニットの内、どのサブュニットに結合するのかを明らかにするために、 各サブュニットに m y cタグを付けた c DN Aを様々のコンビネーションで、 I RB I Tと共に CO S細胞等に発現し、 I RB I Tまたは C P S Fを免疫沈降し た時の共沈のされ方を調べた。
CP S Fは、 マウス由来の C P S Fであり、 G e n B a n k登録番号 AB 09 2504の全長および 4つの各サブュニッ トの塩基配列に基づき、 RT_ P CR によってクローニングした （H. An d oら， 2003, 上記）。 また、 I RB I Tは、 マウス由来の I RB I Tであり、 G e n B a n k登録番号 NM— 1 45 542の塩基配列に基づき、 RT— P CRによってクローニングした （H. A n d oら， 2003， 上記）。
C P S Fの全長または各サブュニッ トをコ一ドする c DNAに、 my cタグを コードする DNAを融合した DNAを作製し、 哺乳動物用べクターに揷入した。 一方、 I R B I Tをコードする c DNAもまた、 同じベクターに挿入した。 作製 されたベクターを、 C O S細胞に形質転換し、 上記 DNAを共発現した。
細胞を遠心分離によって分離し、 細胞を溶解し、 細胞質画分を回収し、 I R B I Tと C P S Fとの結合を、 抗 I RB I T抗体 （日本国特許出願公開第 2 0 0 4 - 1 2 9 6 1 2号公報） およぴ抗 my c抗体を用いて検出した。
その結果、 I R B I Tは、 C P S F 1 6 0サブユニットを介して、 C P S Fと 結合することが判明した （図 1)。
さらにまた、 C P S F 1 6 0の欠失変異体を使った同様の実験から、 I R B I Tは C P S F 1 6 0の mRN A結合部位に結合することが判明した （図 2)。
C P S F 1 6 0の mRNA結合部位は、 C P S Fが p o l y (A) を付加する mRN Aを認識する際に必須の領域であることから、 I R B I Tがこの領域に結 合することは、 I R B I Tが C P S F機能を阻害する可能性があり、 これを確か めるために、 精製蛋白質を用いた i n v i t r o再構成系で、 1 1 8 1丁と〇 P S Fとの結合、 及びそれによるポリアデ二レーション反応への影響を調べた。
C P S Fは、 mRN Aのポリアデ-レーシヨン反応に必須の分子であるが、 そ れが働く場所は主に核の中であり、 DNAから転写されたばかりの RNAに対し て、それが mRNAとなって核外へ出て行くまでの成熟反応の一つとして、働く。 しかし例外的に、 卵母細胞の成熟過程、 あるいは、 神経細胞の局所での新たなタ ンパク質合成といった局面では、 細胞質で mRNAのポリアデ-レーションに関 与し、 p o l y (A) の長さを調節することで、 目的分子のタンパク質合成を調 節する （D a r o n C. B a r n a r dら， C e l l 2 0 0 4, 1 1 9 : 6 4 1 — 6 5 1 )。 この細胞質内ポリアデ二レーション反応は、例外的現象である 、卵母細胞の成熟、神経可塑性を成立させる上では、必須の現象となっている。 I R B I Tの細胞内分布を調べてみると、 核内には殆ど存在しないことから、 本 発明者らは、 I R B I Tの細胞質内ポリアデニレーシヨン反応への関与に焦点を 絞って検討した。
細胞質内ポリアデ二レーション反応を調べる上で、 X e n o p u s卵母細胞の 系が優れていることから、 本発明者らは、 先ず、 X e n o p u s卵母細胞からの
I RB I T c DNAのクローニングおよび単離を、 定法に従って行った。 X e n o p u s卵母細胞には、 哺乳動物細胞とは異なり、 3種類の I RB I T mR N Aが発現しており、 この 3種類とも、 C P S F 1 6 0と結合することが判明し た。
I P 3受容体 mRNAの 3'末端は、 細胞質内ポリアデニレーション反応を受け る可能性のある配列を有しており、 実際、 小脳 P u r k i n j e細胞では、 榭状 突起内にこの mRNAが存在している。 このことは、 I P 3受容体から放出され た I R B I Tが C P S Fとの結合を介して、 I P 3受容体自身のタンパク質合成 を制御している可能性を示している。
さらに、 本発明者らは、 I RB I Tが、 PAP及び F i p 1 (C P S Fのサブ ュ-ット）の存在下でのポリアデ二レーション活性（ I . K a u f m a n nら， EMB O J . ( 2 0 0 4) 2 3 : 6 1 6— 6 2 6) をさらに増大させる働きがあ ることを見出した。
上記の結果から、 I R B I Tが、 細胞内で C P S Fとの結合を介して、 タンパ ク質合成を制御していることが示された。
ぐ実施例 2 >
I R B I Tと P I Pキナーゼ I I型 （Ρ ΓΡ Κ Ι I ) との相互作用
本発明者らはさらに、 I R B I Tと相互作用する分子を探索した。
実施例 1と同様の手順で、 H E K 2 9 3細胞に F L AG— I RB I Tを過剰発
¾し、 抗 F LAG抗体で免疫沈降して I R B I Tと共沈してくるタンパク質を、 質量分析器で解析した。 その結果、 リン脂質リン酸化酵素である p h o s p h a t l d y 1 l n o s ι t o l — o — p h o s p h a t e 4— k i n a s e y
(P I PK I I y) が同定された。 P I P K I Iファミリー （P I P K I I a,
P I P K I I β , P I PK I I y ) は P I P 2を合成する酵素であり、 P I P 2の 加水分解により I P 3が産生されることを考えると、 1 3受容体、 I R B I T、
P I P K I I γからなる情報伝達機構が存在する可能性が考えられる （図 3)。 さらに、 次の実験を行い、 同時にその結果も以下に示す。
( 1 ) マウス I RB I Tと My c — Ρ Ι Ρ Κ Ι Ι ο;, β, γを CO S— 7に過剰 発現し、 免疫沈降を行った。 具体的には、 L y s i sバッファー （1 O mM H e p e s , 1 0 OmM N a C 1 , 2 mM ED TA, 1 % P - 4 0 , p H 7. 4) で細胞を可溶化し、 遠心 （20000 X g, 30分） して上清を回収後、 抗 My c抗体あるいは抗 I RB I T抗体を添加し、 1時間反応させた。 さらにプロ ティン Gセファロースを添加して 1時間反応後、 免疫複合体を L y s i sバッフ ァ一で洗浄し、 S D S— PAGEサンプルバッファーで溶出した。 その後、 抗 M y c抗体あるいは抗 I RB I T抗体を用いてウェスタンブロッテイングを行った その結果、 I R B I Tは My c— P I PK I I ひ， β , γのいずれとも共沈した (図 4)0
(2) マウス小脳から抗 I RB I Τ抗体で免疫沈降を行ったところ、 Ρ Ι ΡΚ I Iひが共沈した （図 5)。 その結果から、 i n V i v。での I RB I Tと P I PK I Iとの結合が確認された。
(3)マウス I RB I Tと My c— Ρ Ι ΡΚ Ι Ι γを CO S— 7に過剰発現し、 免疫染色を行った。 具体的には、 4%パラフオルムアルデヒ ドで固定、 0. 1 % T r i t o n X- 1 00で膜透過処理、 2 %ャギ血清でプロッキング処理を行 つた後、 マウス抗 My c抗体おょぴゥサギ抗 I RB I T抗体を添加し、 室温で 1 時間反応させた。 A 1 e X a 48 8結合抗マウス I g G抗体および A 1 e x a 5 94結合抗ゥサギ I g G抗体を二次抗体として添加し、 3 7°Cで 45分反応させ た。 その結果、 I RB I Tと My c— P I PK I I γのいずれも細胞質に局在す ることが判かった （図 6)。
(4) マウス I RB I Τの欠失変異体 （配列番号 3のアミノ酸配列における 6 0 -5 30, 78 - 5 3 0, 1 0 5— 530， 1一 2 77， 1一 1 04， 1— 9 0および 1— 7 7) は対応する配列を P CRで増幅し、 GF P融合タンパク発現 ベクター p EGF P— C I (C I o n t e c h) にクローニングして作製し、 こ れらの変異体の各々と P I P K I I aとの結合を調べたところ、 I RB I Tの N 末端領域にあるセリンに富む領域が上記結合に重要であることが明らかになつた
(図 7)。
(5) マウス I RB I Tのセリンに富む領域の点突然変異体 （配列番号 3のァ ミノ酸配列における T 5 2 A， T 58 A， S 62 A, S 64 A, S 6 6 A, S 6
8 A, S 70A， S 7 1 A, T 7 2 A, S 74A, S 76 G, S 7 7 A, S 8 0
A, D 83 A, S 9 OAおよび T 9 7 A) は、 部位特異的変異体作成キット （S t r a t a g e n e ) を用いて作製し、 これらの変異体の各々と P I P K I I a との結合を調べた。 その結果、 I RB I Tの S e r 6 8及び S e r 7 1が上記結 合に重要であった （図 8)。
以上の結果より、 I RB I Tが P I PK I I フアミリーに結合することが確認 された。 さらに予備的データから、 I RB I Tは P I PK I I活性を抑制するこ とを見いだしているため、 I RB I Tはイノシトールリ ン脂質代謝の活性制御を おこなっていると結論づけられた。
<実施例 3 >
I RB I Tによる NB C 1 (N a /HC Oq c o t r a n s p o r t e r 1) の活性化
本発明者らはさらに、 I RB I Tに結合する蛋白質として、 細胞膜上でナトリ ゥムイオンと重炭酸イオンの輸送を行う NB C 1 ( s o d i um b i c a r b o n a t e c o— t r a n s p o r t e r l) 蛋白質を同定した。
NB C 1には、 p型と k型の 2つのスプライシング変異体が存在することが知 られている力 S (S e t h L. A l p e r , An n u. R e v. P h y s i o 1 . 2 0 0 2, 6 4 : 8 9 9— 9 2 3)、 I R B I Tは、 そのうち p型の N B C 1 (p NB C 1 とレヽう） と結合すること、 また、 I RB I Tにおけるいくつかのセリン 残基のリン酸化が p NB C 1 との結合に必要であることが明らかになった。 以下 に、 具体的に実験および結果を示す。
( 1) p NB C 1における I RB I T結合領域の同定
p NB C 1の p型特異的な N末端配列 （1一 8 5アミノ酸） が I RB I Tとの 結合に必要不可欠であった。 この 8 5アミノ酸內に更なる欠失変異体を作製し、 それら変異体と I RB I Tとの結合をプルダウンアツセィ （p u l l d o wn a s s a y) を用いて検討した。 具体的には、 以下の実験を行った。
CO S— 7細胞に HA— I RB I Tを過剰発現し、 細胞抽出液を調製した。 M
B P— p NB C lの欠失変異体のリコンビナントタンパク質を添加し、 反応後、 結合したタンパク質を a my 1 o s e レジンでプルダウンした。 HA— I R B I
Tを抗 HA抗体を用いたウェスタンブロッテイングで検出した。
その結果、 p型特異的な配列のうち N末端 6 2アミノ酸があれば I RB I Tと 結合しうることが示された （図 9、 図 1 0)。 しかしこの 62アミノ酸から更に N 末側や C末側を削ると、 I RB I Tとの結合が見られなくなり、 これ以上 I RB I T結合領域を狭めるのは難しいと考えられた。 この結果から I RB I Tとの結 合には p NB C 1の特定の数アミノ酸の配列が関与しているのではなく、 数十ァ ミノ酸からなる三次元的な構造が必要である可能性が示唆された。
(2) I RB I Tにおける p NB C 1結合領域の同定
次に、 マウス I RB I T (全長 530アミノ酸；配列番号 3) の各種欠失変異 体を COS 7細胞に発現させ、 それぞれの変異体の pNBC 1結合能をプルダウ ンアツセィで調べた。 具体的には、 以下の実験を行った。
CO S- 7細胞に GF P— I RB I Tの欠失変異体を過剰発現し、 細胞抽出液 を調整した。 MB P_ p NBC l (1 -8 5) のリコンビナントタンパク質を添 加し、 反応後、 結合したタンパク質を a my l o s eレジンでプルダウンした。 G F P— I RB I Tの欠失変異体を抗 GF P抗体を用いたウェスタンプロッティ ングで検出した。
その結果を図 1 1に示す。 図から、 I P 3受容体との結合が確認されている I RB I Tの N末側を発現する欠失変異体 （1— 1 04、 1 - 277) ですら p N B C 1とは結合できないことがわかった。 また I P3受容体と結合できないこと が既に確認されている I RB I Tの C末側を発現する欠失変異体 （1 05— 53 0) もまた p NB C 1とは結合できなかった。 p NB C 1との結合に必要である ことが示されているセリンリン酸化部位は 1— 1 04に全て含まれること力 ら、 1 - 1 04の中に短い p NB C 1結合配列が存在するにも関わらず何らかの立体 構造によって p NB C 1との結合が阻害されている可能性も考えられた。そこで、 1 - 1 04を更に細かく欠失させた欠失変異体を作製し p NB C 1との結合を解 析したが、 いずれも p NB C 1との結合は見られなかった。
以上の結果から、 I R B I Tの N末側と C末側を含む全体の構造が p NB C 1 との結合に必要であることが明らかとなり、 I RB I Tの N末側だけで十分であ るとされる I RB I Tと I P 3受容体との結合様式との違いが明らかとなった。
(3) 内在性 I RB I Tと NBC 1との結合
次に、 内在性の I RB I Tと NB C 1との結合を、 免疫沈降法を用いて確認す る実験を行った。
そもそも NBC 1は小脳の膜画分における I RB I T結合蛋白質として同定さ れたので、 まず小脳膜画分抽出液を用いて免疫沈降を行った。 また小脳膜画分に おいて I RB I Tは I P 3受容体とも結合していることがわかっているので、 N B C 1、 I RB I T, I P3受容体からなる三者複合体を形成しうるか否かを検 討した。 具体的には、 以下の実験を行った。
小脳膜画分を界面活性剤で可溶化後、 抗 I RB I T抗体、 抗 NB C抗体、 ある いはコントロール抗体を添加して反応させた。 さらにプロティン Gセファロース を添加して免疫複合体を抽出した。 その後、 抗 I RB I T抗体、 抗 NBC抗体あ るいは抗 I P 3 R抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。
その結果、 抗 NB C 1抗体免疫沈降物中に内在性の I RB I Tが、 また抗 I R B I T抗体免疫沈降物中に内在性の NBC 1力 S、それぞれ含まれることがわかり、 内在性の I RB I Tと NBC 1が小脳膜画分で複合体を形成することが確認され た （図 1 2)。 一方で、 既に An d oら （2003， 上記） によって報告されてい るように、 抗 I RB I T免疫沈降物中には I P 3受容体が検出されたが、 抗 NB C 1沈降物中には I P 3受容体が検出できなかった。 この結果から、 内在性 NB C 1の多くが I RB I Tと I P 3受容体を含む三者複合体を形成していないこと が示された。
さらに I RB I Tと NBC 1との結合が普遍的であることを確認するために、 COS 7細胞の抽出液を用いて内在性の I RB I Tと NB C 1との結合を、 先ほ どと同様の免疫沈降法を用いて検討した。 具体的には、 以下の実験を行った。
CO S— 7細胞の細胞抽出液に抗 I RB I T抗体、 抗 NBC抗体、 あるいはコ ント口ール抗体を添加して反応させた。 さらにプロティン Gセファロースを添加 して免疫複合体を抽出した。 その後、 抗 I RB I T抗体あるいは抗 NBC抗体を 用いてウェスタンブロッティングを行った。
その結果を図 1 3に示す。 図から、 小脳膜画分の抽出液を調製する時に用いた ものと同じバッファーで CO S 7細胞を抽出した場合、 内在性の I RB I Tと N
BC 1の結合が検出されないことがわかった。 し力 し、 このバッファーに 2mM
C a C 1 2を加えて同様の実験を行ったところ、 内在性の I RB I Tと NB C 1 の結合が検出された。 このバッファ一は既に 2 mMの EDT Aを含んでいること から、 2mM C a C 1 2を加えた時のカルシウムイオン濃度は数 μΜであると 考えられる。 これらの結果から、 内在性の NB C 1と I RB I Τとの結合が小脳 膜画分と CO S 7細胞とでは異なった様式で制御されている可能性が示唆された。
(4) I RB I Tによる NB C 1の活性化
アフリカッメガエル卵母細胞 （Xe n o p u s e O o c y t e) の培養細胞 にマウス I RB I Tの c RNAとヒト pNBC lまたは kNB C lの c RNAを 同時注入し、 j摸電位を一 25mVにし、 ND 96溶液 （9 6mM N a C 1 , 2 mM KC 1 , 1 mM M g C 1 2, 5 mM HE P E S , p H 7. 4) 力 ら N D 96 +HC03—溶液に変えた時の電流変化を測定した。 コントロールには、 I RB I T、 p NBC l、 kNBC lを使用した。
その結果、 p NBC l活性のみが、 I RB I Tの同時注入によって約 6〜 7倍 増強された （図 1 4A)。 同様に、 ND 96 +HC〇3—溶液中で膜電位を一 1 6 OmVから + 6 OmVの範囲で変化させたときにも、 p NBC l活性のみが、 I RB I Tの同時注入によって顕著に増強された （図 1 4 B)。
さらにまた、 I RB I Tのリン酸化部位'をァラニン （A) に置換した I RB I T変異体 （S 6 8A， S 71 A, S 74 Aまたは S 7 7 A) を作製し、 上記と同 様に、 アフリカッメガエル卵母細胞に I R B I T変異体の c RNAとヒ ト p NB C 1の c RNAを同時注入し、 膜電位を— 2 5 mVにし、 ND 9 6.溶液から ND 9 6 +H CO 3—溶液に変えた時の電流変化を測定した。
その結果、 リン酸化部位をァラニンに置換したすべての I RB I T変異体にお いて、 I RB I Tの p NB C 1活性への増強作用は消失した （図 1 5)。 このこと は、 I RB I Tのリン酸化が p NB C 1の活性化に必要であることを示している。 産業上の利用可能性
本発明の組成物および方法は、 I RB I Tが、 哺乳動物細胞内で C P S F、 P
I PK I Iまたは p NB C 1との結合を介してそれぞれ、 タンパク質合成、 ィノ シトールリン脂質代謝、 または細胞内 pHの維持に関与しているため、 このよう な生物学的機能を制御する I RB I T、 I RB I Τの発現/翻訳を制御する核酸、 または I RB I Tに対する抗体は、該機能の異常に伴う疾患の治療に有用である。 本発明により、 I RB I Tは、 細胞内での代謝、 pH変化、 イオンバランス、 リン脂質代謝の調節、 タンパク質合成の制御、 C a 2+放出の制御などを調節する 上で大変重要な意義を全ての細胞で有していることが判明した。 I RB I Tの濃 度や発現パターンを制御することにより、 このような様々な生物学的機能を制御 しうる。 I RB I Tは、 例えば脳神経系では脈絡叢 （c h o r o i d p 1 e x u s) や神経細胞、 グリア細胞で強く発現しており、 脳神経系の機能制御にも貢 献している。 また、 I RB I Tは、 細胞内の pHの維持に重要な p NB C 1の働 き活性化して、 特に pHが酸性に傾くことによる疾患、 例えば緑内障や白内障な どの眼の疾患、 低身長症、 精神遅滞、 瞵臓炎などの疾患の治療に有用である。 さ らにまた、 I RB I Tは、 P I PK I Iの活性を抑制または阻害する働きがある ため、 2型糖尿病の治療に使用することができる。 このように、 本発明により、 I RB I Tが標的とする 3つのタンパク質が特定されたことによって、 I RB I Tおよびその抑制剤、 亢進剤 、 標的タンパク質が生体内で果たす生物学的機能 の制御のために役立つ。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許 'および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲 I . I P3受容体結合タンパク質 （ I RB I T)、 I RB I Τの発現/翻訳を 制御する核酸、 または I RB I Τに対する抗体を含む組成物であって、
(1) タンパク質合成、
(2) イノシトールリン脂質代謝、 および
(3) 細胞内 ρΗ、
からなる群から選択される少なく とも 1つの細胞内生物学的機能の制御のための 上記組成物。
2. 前記タンパク質合成が、 切断/ポリアデニレーシヨン特異性因子 （CP S F) による細胞質の mRN Aポリアデュレーシヨンが関与するものである、 請 求項 1に記載の組成物。
3. 前記イノシトールリン脂質代謝が、 細胞内での P I P 2合成酵素 （P I PK I I ) が関与するものである、 請求項 1に記載の組成物。
4. 前記細胞内 pHが、 細胞内での p型 N a ZH CO 3共トランスポーター 1 (p NB C l) が関与するものである、 請求項 1に記載の組成物。
5. 前記制御が、 抑制または亢進である、 請求項 1に記載の組成物。
6. 前記 I RB I Tが、 ヒ トまたはマウス由来のものである、 請求項 1に記 載の組成物。
7. 前記 I R B I Tが、 配列番号 1または配列番号 3に示されるアミノ酸配 列からなるタンパク質、 あるいは該アミノ酸配列と 9 0%以上の同一性を有する アミノ酸配列を含みかつ I RB I Tと同等の生物学的活性を有するタンパク質で ある、 請求項 1または 6に記載の組成物。
8. 目 iJ G糸且成物力 s、 i n v i v o、 i n v i t r oまたは e x v i v oのいずれかで使用される、 請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載の組成物。
9. 前記組成物が、 疾患の治療用である、 請求項 1に記載の組成物。
1 0. i n v i t r oまたは e x v i v oでの細胞内のタンパク質合成 の制御における I RB I Tの使用方法。
I I . 前記 I RB I Tが C P S Fに結合し C P S Fの機能を制御する、 請求 項 1 0に記載の方法。
1 2. i n v i t r oまたは e x v i v oでの細胞内のイノシトーノレリ ン脂質代謝の制御における I RB I Tの使用方法。
1 3. 前記 I R B I Tが P I P K I I活性を抑制する、 請求項 1 2に記載の 方法。
14. i n V i t r oまたは e x v i v oでの細胞内 p Hの制御におけ る I RB I Tの使用方法。
1 5. 前記 I RB I Tが p NB C lを活性化する、請求項 14に記載の方法。
1 6. 前記 pNBC 1の活性化が前記 I RB I Tのリン酸化を必要とする、 請求項 1 5に記載の方法。
1 7. 候補物質の存在下で、 I RB I Tと C P S F、 P I PK I Iまたは p NBC 1との結合を測定し、 該結合を抑制または亢進する物質を同定することを 含む、 物質のスクリーニング方法。
1 8. 前記物質が治療用または診断用である、 請求項 1 7記載の方法。
1 9. 前記結合を哺乳動物細胞内で行う、 請求項 1 7記載の方法。
20. 前記物質が、 細胞内のタンパク質合成、 イノシトールリン脂質代謝お よび細胞内 p Hからなる群から選択される少なく とも 1つの細胞内生物学的機能 を制御するものである、 請求項 1 7に記載の方法。
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