WO2007123386A1 - Método para la detección y cuantificación múltiple y simultánea de patógenos mediante la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real - Google Patents

Método para la detección y cuantificación múltiple y simultánea de patógenos mediante la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real Download PDF

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WO2007123386A1
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Francisco Javier Bosques Padilla
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates, in general, to the detection, identification and quantification of pathogenic bacteria, and particularly to a method for the detection and multiple quantification of any combination of pathogens, such as Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni and / or Escherichia coli O157: H7, by multiplex amplification reaction using the polymerase chain reaction in real time.
  • pathogens such as Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni and / or Escherichia coli O157: H7
  • PCR polymerase chain reaction
  • each pair of primers comprise a first nucleotide sequence complementary to a sequence that borders the end 5 'of a target nucleic acid sequence and a second nucleotide sequence complementary to a sequence that borders the 3' end of the target nucleic acid sequence.
  • the nucleotide sequences must have each pair of oligonucleotide initiators that are specific to the pathogen to be detected, so that they do not react or cross over with other pathogens.
  • the PCR technique is a sensitive and rapid method to detect pathogens individually, it can also be used to simultaneously detect multiple pathogens present in a sample.
  • using the PCR methodology for the simultaneous detection of multiple pathogens in a sample has its problem, since its main obstacle lies in the cross-reaction that may occur due to the use of multiple nucleotide sequences in order to have the preferential amplification of certain target sequences present in the sample at the expense of other target sequences also present.
  • the pathogenic species of Campylobacter to be detected can be Campylobacter jejuni or Campylobacter coli.
  • the complex test sample may be a food sample, water or an enriched food matrix.
  • the method uses the PCR amplification with or without an internal positive control and appropriate pairs of primers. Multiple species can be detected in the same reaction.
  • the steps of the method are (a) extracting DNA present in the sample or test samples; (b) preparing a specific reaction mixture for the pathogens to be detected and quantified, such that the reaction mixture contains the reagents necessary for the enzymatic amplification of the extracted DNA and identification of the pathogens to be detected and quantified; (c) amplifying, by multiplex amplification reaction employed PCR, the reaction mixture; and (d) simultaneously determine the presence or absence and quantification of the pathogens in the sample or test samples;
  • the method has the particularity that (i) the reaction mixture for the enzymatic amplification of the extracted DNA and identification of any combination of Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni and / or Escher ⁇ chia coli 0157: H7 to be detected and quantified contains (a ) a first pair of oligonucle
  • oligonucleotide having a nucleotide sequence selected from the group formed by the sequences identified as SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
  • Another object of the invention is an oligonucleotide having a nucleotide sequence selected from the group formed by the sequences identified as SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9.
  • oligonucleotide having a nucleotide sequence selected from the group formed by the sequences identified as SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12.
  • a labeled probe comprising an oligonucleotide identified as SEQ ID NO: 3; and at least one marker.
  • Another object of the invention is to offer a labeled probe comprising an oligonucleotide identified as SEQ ID NO: 6; and at least one marker.
  • the object of the invention is also a labeled probe comprising an oligonucleotide identified as SEQ ID NO: 9; and at least one marker.
  • Another object of the invention is to offer a labeled probe comprising an oligonucleotide identified as SEQ ID NO: 12; and at least one marker.
  • a diagnostic kit for the multiple and simultaneous detection and quantification of any combination of pathogens such as Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni and / or Escherichia coli O157: H7, in one or more samples of Assay by multiplex amplification reaction using the polymerase chain reaction in real time, the diagnostic set has (a) one or more oligonucleotides according to any of the sequence groups identified as SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7, SEQ , ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9; and / or SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12; (a) one or more oligonu
  • Figure 1 illustrates a calibration curve for Listeria sp according to the invention, where Al: is a reference of higher concentration; A4: It is a reference of lower concentration. The reading of a sample is interpolated in the reference readings to know the CFU / ml.
  • Figure 2 illustrates a calibration curve for Staphylococcus aureus according to the invention, where Al: is a reference of higher concentration; A4: is one reference of lower concentration. The reading of a sample is interpolated in the reference readings to know the CFU / ml.
  • Figure 3 illustrates a calibration curve for Campylobacter jejuni according to the invention, where Al: is a reference of higher concentration; A2: It is a reference of lower concentration. The reading of a sample is interpolated in the reference readings to know the CFU / ml.
  • Figure 4 illustrates a calibration curve for Escherichia coli O157.-H7 according to the invention, where Al: is a reference of higher concentration; A3: It is a reference of lower concentration. The reading of a sample is interpolated in the reference readings to know the CFU / ml.
  • enzyme amplification of DNA means the use of the polymerase chain reaction (PCR) to increase the concentration of a particular DNA sequence within a mixture of DNA sequences
  • objective sequence means the use of the polymerase chain reaction (PCR) to increase the concentration of a particular DNA sequence within a mixture of DNA sequences.
  • pair of primers is used under the meaning of a pair of oligonucleotide primers that are complementary to the sequences that border the target sequence.
  • the pair of primers consists of an "upstream” primer that has a nucleic acid sequence that is complementary to a "upstream” sequence of the target sequence, and a “downstream” primer that has a nucleic acid sequence that is complementary to a sequence "downstream” of the target sequence.
  • multiplex amplification reaction means, in the context of the present description, amplification, by PCR method, of multiple target DNA sequences in a particular test sample.
  • the method provided by this invention allows the simultaneous detection, identification and quantification of multiple pathogens transmitted by contaminated food, surfaces or environments, such as Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni and / or Escherichia coli O157. ⁇ 7, in one or more test samples , by multiplex amplification reaction using the polymerase chain reaction in real time.
  • the test sample can be any sample that contains DNA in which it is desired to know the possible contamination by said pathogens.
  • said test sample is a sample of a food product, for example, meat and dairy products, or a sample of contaminated surfaces or environments.
  • the oligonudeotides of the invention have been designed with the purpose of specifically identifying Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157: H7 that may be present in a test sample without giving false positives due to the presence of other pathogens present in it.
  • each pair of primers comprises a first complementary "upstream” synthetic nucleotide sequence to a nucleotide sequence "upstream” that borders the 5 'end of a target nucleic acid sequence and a second synthetic nucleotide sequence "downstream” complementary to a sequence "downstream” that borders the 3' end of the sequence of target nucleic acid.
  • the nucleotide sequences must have each pair of oligonucleotide initiators that are specific to the pathogen to be detected, so that they do not react or cross over with other pathogens. Likewise, for each of the pathogens to be identified, a synthetic test sequence for the probe was developed. The oligonucleotides developed are shown in Table 1.
  • sequences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 12 used as test probes are labeled at their 5 'end with a fluorophore or dye capable of emitting energy, and at its 3 'end with a damper or a dye capable of capturing the energy emitted from fluorophore excitation.
  • the fluorophores and dampers, used as markers to detect and identify Lister ⁇ a sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni and Escher ⁇ chia coli O157: H7 without producing cross reactions between them and the other components, are shown in Table 2.
  • a washing step is carried out, where a food, surface or environmental sample is subjected to a saline solution forming a suspension that is subsequently centrifuged to obtain a first sediment obtained by the elimination of water-soluble substances present in the suspension.
  • the sediment of the sample is obtained, it is incubated with lysozyme to break the cell wall of the bacteria present there, and then proceed to an incubation with proteinase K to cause the hydrolysis of the proteins and lysozyme previously added.
  • the extraction of the proteins and other fat-soluble compounds present there is done through the application of phenol-chloroform-alcohol, so that once extracted, through a precipitation with ethanol, a selective precipitation of the present DNA is carried out, forming a concentration of DNA that is dried.
  • Example 1 Preparation of DNA sample from a food sample of meat products or cheeses.
  • Example 2 Preparation of DNA sample from an environment or surface sample.
  • reaction cocktail is prepared for 100 reactions by mixing the components described in Table 4.
  • the prepared cocktail is mixed perfectly by inversion and dispensed
  • the multiplex amplification reaction using real-time PCR provides many advantages over the conventional single-purpose PCR method to be detected.
  • the reaction of multiplex amplification using PCR requires the development of oligonucleotide primers and probes specific for the target sequence of the pathogen to be detected, so that said oligonucleotide primers and probes be compatible with one another within the same optimum temperature of 40 0 C at 65 0 C and subjected to them chemical reaction conditions in order to allow the crossing or binding, by hybridization, of two complementary nucleic acid segments.
  • the sets of oligonucleotide initiators and probes must not cross-react or cross or bind, during the amplification, to other nucleic acid sequences for which they were not designed.
  • oligonucleotide primers are used to amplify each of the target nucleic acid sequences of each pathogen to be detected.
  • a pair of oligonucleotide initiators from Lister ⁇ a sp identified as SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 that cross or bind to an objective sequence of the genome of Lister ⁇ a sp.
  • a pair of oligonucleotide initiators from Campylobacter jejuni identified as SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 that cross or bind to an objective sequence of the Campylobacter jejuni genome.
  • a pair of oligonucleotide initiators of Escher ⁇ chia coli O157: H7 identified as SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 that cross or bind to an objective sequence of the Escherichia coli O157.-H7 genome.
  • Each of the probes are marked at its 5 'end with a fluorophore or a dye capable of emitting energy, and at its 3' end with a damper or a dye capable of capturing the energy emitted from the excitation of said fluorophore, such as Nazarenko describes it " al. In US Pat. 5866336 where mention is made of fluorophores that transfer energy and how these are applied to oligonucleotide primers in nucleic amplification methods.
  • the fluorophores used are
  • the DNA sample is prepared for amplification under the following conditions:
  • Dairy or ambient sample A vial with 19.75 ⁇ l of prepared cocktail is thawed and 0.25 ⁇ l of Taq DNA polymerase, 4 ⁇ l of water and 1 ⁇ l of the DNA sample to be analyzed are added.
  • Sample of meat products or cheeses A vial with 19.75 ⁇ l of prepared cocktail is thawed and 0.25 ⁇ l of Taq DNA polymerase and 5 ⁇ l of the DNA sample to be analyzed are added.
  • the multiplex amplification reaction using PCR is performed in an apparatus for the simultaneous control of multiple nucleic acid amplifications, such as the apparatus described by Russell G. Higuchi and Robert M. Watson in European Patent Publication EP-640828, which generally it consists of a thermal cycler with a plurality of holes in which tubes containing the reaction mixture for the enzymatic amplification of DNA of the pathogens to be detected and identified are introduced; a light source coupled to the thermal cycler and adapted to distribute Ia light on the plurality of holes; and a fluorescence sensor or detector adapted to simultaneously detect the emitted light.
  • an apparatus for the simultaneous control of multiple nucleic acid amplifications such as the apparatus described by Russell G. Higuchi and Robert M. Watson in European Patent Publication EP-640828, which generally it consists of a thermal cycler with a plurality of holes in which tubes containing the reaction mixture for the enzymatic amplification of DNA of the pathogens to be detected and identified are introduced; a light source coupled to the
  • calibration curves are prepared by preparing suspensions of each of the pathogens to be detected (Lister ⁇ a sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni and Escher ⁇ chia coli O157: H7), adjusting turbidity to tube 0 , 5 of Mc Farland to prepare dilutions at 10 S 10 "2 , 10 " 3 , 10 4 , 10 5 , 10 6 , 10 7 and 10 8 to subsequently contaminate 25 g of food with each of these suspensions (one food per each dilution), then the DNA is extracted as if it were a sample and a plate count of each of the dilutions prepared to be submitted to the thermal cycler is prepared, assigning the corresponding concentration of pathogens.
  • the cT curve is constructed against log ug / g, thus obtaining a calibration curve for Lister ⁇ a sp (see Figure 1), Staphylococcus aureus (see Figure 2), Campylobacter jejuni (see Figure 3) and Escher ⁇ chia coli O157: H7 ( see Figure 4).
  • the apparatus used comprises a rapid real-time thermal cycler attached to a fluorescence detection system, which allows real-time monitoring of the amplification process after each cycle.
  • a thermal cycler used in the method of the invention is the SMART CYCLER® II of CEPHEID®.
  • the presence or absence and quantification of pathogens in any combination of Lister ⁇ a sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni and / or Escher ⁇ chia coli 0157: 1-17 in the sample or test samples is determined by a fluorescent signal or specific fluorescence emission of each amplified DNA product or sample. For this, a specific wavelength is affected for the excitation of each fluorophore and its emission is detected at specific wavelengths.
  • Table 5 indicates the conditions in which the multiplex amplification reaction was carried out
  • Table 6 the detection limits reached
  • Table 7 shows the readings of the concentrations that were obtained as a result of the detection and quantification of the four pathogens (Lister ⁇ a sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni and / or Escher ⁇ chia coli O157: H7) simultaneously in samples of cold, dairy and ambient meats, using a single device with a single mixture of reagents and four specific oligonucleotides for different pathogens at a single temperature condition and mixture for amplification.
  • Figures 1, 2, 3 and 4 graphically show their detection and quantification.
  • Meat and Cheese (units 1 3 160 16 qenomic / q).
  • the method of the present invention does not require a pre-enrichment, whereby the process time is much shorter, approximately 2.5 h, and it has the ability to detect and quantify viable arable pathogens in addition to viable non-cultivable pathogens. simultaneous.
  • the diagnostic kits of the invention contain each of the pairs of oligonucleotide initiators corresponding to each of the pathogens to be detected (Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni and / or Escher ⁇ chia coli 0157: H7), as well as each of the probes marked for each of said pathogens, in order to be able to choose between performing the detection of a single pathogen (using only the pair of oligonucleotide initiators and their labeled probe), or for the combined or simultaneous detection of the four mentioned pathogens, depending on the needs.
  • the pathogens to be detected Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni and / or Escher ⁇ chia coli 0157: H7
  • each of the probes marked for each of said pathogens in order to be able to choose between performing the detection of a single pathogen (using only the pair of oligonucleotide initiators and their
  • the diagnostic kits provided by this invention can be presented in the form of a case containing, in addition to containers with the pairs of oligonucleotide initiators and / or labeled probes mentioned previously, containers with all or part of the rest of the reagents necessary for the realization of the method in question, for example, ultrapure water, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP), a buffer suitable for the enzymatic amplification reaction, a thermostable DNA polymerase (for example, Taq DNA polymerase), a magnesium salt (for example, MgCI 2 ), among others.
  • dNTPs dATP, dCTP, dGTP, and dTTP
  • a buffer suitable for the enzymatic amplification reaction for example, a thermostable DNA polymerase (for example, Taq DNA polymerase), a magnesium salt (for example, MgCI 2 ), among others.
  • the diagnostic kits provided by this invention may include containers with DNA from Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni and / or Escherichia coli O157.-H7 for use as positive controls.

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Abstract

Un método para la detección y cuantificación múltiple y simultánea de cualquier combinación de Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y/o Escherichia coli O157.-H7, en una o más muestras de ensayo mediante reacción de amplificación múltiplex empleando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real, los pasos del método son (a) extraer ADN presente en la muestra o muestras de ensayo; (b) preparar una mezcla de reacción específica para los patógenos a detectar y cuantificar, tal que la mezcla de reacción contiene los reactivos necesarios para la amplificación enzimática del ADN extraído e identificación de los patógenos a detectar y cuantificar; (c) amplificar, mediante reacción de amplificación múltiplex empleado PCR, la mezcla de reacción; y (d) determinar simultáneamente Ia presencia o ausencia y cuantificación de los patógenos en la muestra o muestras de ensayo; el método tiene la particularidad de que (i) la mezcla de reacción para la amplificación enzimática del ADN cuenta juegos de pares de iniciadores oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, y SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11, y sondas con secuencias oligonucleótidas identificadas como SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 12; (ii) Ia presencia o ausencia y cuantificación de dichos patógenos en cualquier combinación se determina por una señal fluorescente o emisión de fluorescencia especifica de cada patógeno.

Description

MÉTODO PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN MÚLTIPLE Y SIMULTÁNEA DE PATÓGENOS MEDIANTE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA EN
TIEMPO REAL
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona, en general, con Ia detección, identificación y cuantificación de bacterias patógenas, y particularmente a un método para Ia detección y cuantificación múltiple de cualquier combinación de patógenos, tales como Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y/o Escherichia coli O157:H7, mediante reacción de amplificación múltiplex empleando Ia reacción en cadena de Ia polimerasa en tiempo real.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
En Ia actualidad, Ia detección de bacterias patógenas transmisibles por alimentos, tales como Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y Escherichia coli O157:H7, constituye una tarea muy importante en el campo de Ia medicina y de Ia higiene pública y tiene mucho interés en Ia industria agroalimentaria, tanto Ia productora como Ia distribuidora de productos alimenticios (materias primas y/o productos elaborados), por Io que se han descrito diversos métodos para sus detección e identificación.
Una de las metodologías actuales, consideradas entre las más efectivas para Ia detección, cuantificación e identificación de patógenos, es aquella que se basa en técnicas moleculares, como Io es el método de reacción en cadena de Ia polimerasa, comúnmente conocido como PCR. El procedimiento PCR generalmente es considerado como Ia metodología más sensible y rápida empleada para detectar ácidos nucleicos de patógenos en una determinada muestra de ensayo en particular, y Ia podemos encontrar descrita dentro del estado de Ia técnica por Kary B. Mullís et al. en Ia familia de patentes estadounidenses US-4683195, US-4683202, US-4800159, US- 4889818, US-4965188, US-5008182, US-5038852, US-5079352, US-5176995, US- 5310652, US-5310893, US-5322770, US-5333675, US-5352600, US-5374553, US- 5386022, US-5405774, US-5407800, US-5418149, US-5420029 entre otras.
Para llevar a cabo Ia técnica PCR, básicamente se tiene que contar con al menos un par de iniciadores oligonucleótidos para cada uno de los patógenos a identificar, tal que cada par de iniciadores comprenden una primera secuencia nucleótida complementaria a una secuencia que linda con el extremo 5' de una secuencia de ácido nucleico objetivo y una segunda secuencia nucleótida complementaria a una secuencia que linda con el extremo 3' de Ia secuencia de ácido nucleico objetivo. Las secuencias de nucleótidos deben tener cada par de iniciadores de oligonucleótidos que son específicos al patógeno a detectar, de tal manera que no reaccionen o se crucen con otros patógenos.
Al ser Ia técnica PCR un método sensible y rápido para detectar patógenos en forma individual, esta también se puede emplear para detectar simultáneamente múltiples patógenos presentes en una muestra. Sin embargo, emplear Ia metodología PCR para Ia detección simultanea de múltiples patógenos en una muestra tiene su problemática, pues su principal obstáculo radica en Ia reacción cruzada que se pueda presentar debido al empleo de múltiple secuencias de nucleótidos a fin de tener Ia amplificación preferencial de ciertas secuencias objetivo presentes en Ia muestra a expensas de otras secuencias objetivo también presentes.
Ejemplos de aplicaciones de detección múltiple y simultanea de patógenos, empleando Ia metodología de PCR, son descritas por John W. Czajka en Ia publicación de solicitud de patente internacional WO-0314704, y por Linxian Wo y otros en Ia familia de patentes estadounidenses US-5612473, US-5738995, US-5753444, US- 5756701 y US-5846783.
En Ia publicación de solicitud de patente internacional WO-0314704 se describe un método para detectar específica y simultáneamente especies patógenas de Campylobacter en una muestra de ensayo compleja. Las especies patógenas de Campylobacter a detectar pueden ser Campylobacter jejuni o Campylobacter coli. La muestra de ensayo compleja puede ser una muestra de alimento, agua o una matriz enriquecida de alimento. El método utiliza Ia amplificación PCR con o sin un control positivo interno y pares apropiados de iniciadores. Múltiples especies pueden ser detectadas en Ia misma reacción.
Mientras que en Ia familia de patentes estadounidenses US-5612473, US- 5738995, US-5753444, US-5756701 y US-5846783 se describe un método PCR múltiplex para detectar rápida y simultáneamente agentes infecciosos en una muestra. Los agentes infecciosos detectados son Salmonella spp, Shigella spp,
Campylobacter spp, Yersinia spp y Escherichia coli en particular Escheríchia coli
O157:H7. La limitante del método descrito en estas patentes es que permite una reacción cruzada mínima entre los oligonucleótidos y sondas, así como de estos con otras secuencias de ácido nucleico durante Ia amplificación.
De otros métodos moleculares que se emplean actualmente, existen algunos comercializados para detectar patógenos en alimentos, unos mediante hibridación de ADN (Gene-Trak systems, Unipath), que es muy sensible pero requiere de aproximadamente 50 h, y otros mediante amplificación de ácidos nucleicos (BAX,
FOMS Dupont y Probelia, Sanofi Diagnostic Pasteur) que requieren, al menos, 24 h. Ninguno de dichos métodos proporciona resultados en el mismo día de Ia producción del alimento ni realizan una cuantificación de Ia contaminación patógena presente.
De los métodos antes descritos, en algunos casos será necesario sólo aumentar Ia sensibilidad del método para detectar de forma fiable y rápida Ia presencia o ausencia de patógenos en particular, mientras que, en otros casos será necesario, además, cuantificar los patógenos eventualmente presentes con el fin de establecer los límites de concentración a partir de los cuales Ia presencia del patógeno puede presentar un problema para la salud del consumidor.
En vista de Io anterior, es de sumo interés para Ia industria de alimentos y de Ia salud contar con un método rápido, que emplee menos de 5 h, para detectar y cuantificar simultáneamente cuatro de los más importantes agentes infecciosos o patógenos transmisibles por alimentos y/o por superficies ambientales contaminadas, como Io son Listería sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y Escheríchia coli 0157:H. Esta detección y cuantificación múltiple, simultanea y rápida de patógenos, mediante reacción de amplificación múltiplex empleando Ia reacción en cadena de Ia polimerasa en tiempo real, permitirá ahorrar costos y tiempo en una industria en donde los tiempos de anaquel de los productos son extremadamente cruciales.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En vista de Io anteriormente descrito y con el propósito de dar solución a las limitantes encontradas, es objeto de Ia invención ofrecer un método para Ia detección y cuantificación múltiple y simultánea de cualquier combinación de patógenos, tales como üsteria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y/o Escheríchia coli
O157.-H7, en una o más muestras de ensayo mediante reacción de amplificación múltiplex empleando Ia reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR) en tiempo real, los pasos del método son (a) extraer ADN presente en Ia muestra o muestras de ensayo; (b) preparar una mezcla de reacción específica para los patógenos a detectar y cuantificar, tal que Ia mezcla de reacción contiene los reactivos necesarios para Ia amplificación enzimática del ADN extraído e identificación de los patógenos a detectar y cuantificar; (c) amplificar, mediante reacción de amplificación múltiplex empleado PCR, Ia mezcla de reacción; y (d) determinar simultáneamente Ia presencia o ausencia y cuantificación de los patógenos en Ia muestra o muestras de ensayo; el método tiene Ia particularidad de que (i) Ia mezcla de reacción para Ia amplificación enzimática del ADN extraído e identificación de cualquier combinación de Listería sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y/o Escheríchia coli 0157: H7 a detectar y cuantificar contiene (a) un primer par de iniciadores oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 y una sonda identificada como SEQ ID NO: 3 que reaccionan con una primera secuencia objetivo de ácido nucleico de Listería sp; (b) un segundo par de iniciadores oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 y una sonda identificada como SEQ ID NO: 6 que reaccionan con una segunda secuencia objetivo de ácido nucleico de Staphylococcus aureus; (c) un tercer par de iniciadores oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 y una sonda identificada como SEQ ID NO: 9 que reaccionan con una tercera secuencia objetivo de ácido nucleico de Campylobacter jejuni; y/o (d) un cuarto par de iniciadores oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11 y una sonda identificada como SEQ ID NO: 12 que reaccionan con una cuarta secuencia objetivo de ácido nucleico de Escheríchia coli O157:H7; (ii) Ia presencia o ausencia y cuantificación de dichos patógenos en cualquier combinación de Listería sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y/o Escheríchia coli 0157:H7 en Ia muestra o muestras de ensayo se determina por una señal fluorescente o emisión de fluorescencia especifica de cada producto amplificado. Otro objeto de Ia presente invención es ofrecer un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.
Es también objeto de Ia invención ofrecer un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.
Otro objeto de Ia invención es un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9.
Es también objeto de Ia invención ofrecer un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12.
Aunado a Io anterior es también objeto de Ia invención ofrecer una sonda marcada que comprende un oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 3; y al menos un marcador.
Otro objeto de Ia invención es ofrecer una sonda marcada que comprende un oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 6; y al menos un marcador.
Es también objeto de Ia invención una sonda marcada que comprende un oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 9; y al menos un marcador.
Otro objeto de Ia invención es ofrecer una sonda marcada que comprende un oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 12; y al menos un marcador. Finalmente es objeto de Ia invención ofrecer un juego de diagnóstico para Ia detección y cuantificación múltiple y simultánea de cualquier combinación de patógenos, tales como Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y/o Escherichia coli O157:H7, en una o más muestras de ensayo mediante reacción de amplificación multiplex empleando Ia reacción en cadena de Ia polimerasa en tiempo real, el juego de diagnóstico tiene (a) uno o más oligonucleótidos según cualquiera de los grupos de secuencias identificadas como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7, SEQ, ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9; y/o SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12; (b) una o más sondas marcadas que tienen cualquiera de oligonucleótidos con las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 12; y un marcador diferente para cada secuencia; y (c) otros reactivos o composiciones necesarias para llevar a cabo el ensayo.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS
Los detalles característicos de Ia invención se describen en los siguientes párrafos en conjunto con las figuras que Io acompañan, las cuales son con el propósito de definir al invento pero sin limitar el alcance de éste.
Figura 1 ilustra una curva de calibración para Listeria sp de acuerdo al invento, donde Al: es una referencia de mayor concentración; A4: es una referencia de menor concentración. La lectura de una muestra se interpola en las lecturas de las referencias para conocer las UFC/ml.
Figura 2 ilustra una curva de calibración para Staphylococcus aureus de acuerdo al invento, donde Al: es una referencia de mayor concentración; A4: es una referencia de menor concentración. La lectura de una muestra se interpola en las lecturas de las referencias para conocer las UFC/ml.
Figura 3 ilustra una curva de calibración para Campylobacter jejuni de acuerdo al invento, donde Al : es una referencia de mayor concentración; A2: es una referencia de menor concentración. La lectura de una muestra se interpola en las lecturas de las referencias para conocer las UFC/ml.
Figura 4 ilustra una curva de calibración para Escherichia coli O157.-H7 de acuerdo al invento, donde Al: es una referencia de mayor concentración; A3: es una referencia de menor concentración. La lectura de una muestra se interpola en las lecturas de las referencias para conocer las UFC/ml.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
El termino "amplificación enzimática de ADN", como es empleado en el contexto de Ia presente descripción, significa el empleo de Ia reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR) para incrementar Ia concentración de una secuencia en particular de ADN dentro de una mezcla de secuencias de ADN. La secuencia particular de ADN que es amplificada es referida como una "secuencia objetivo".
El término "par de iniciadores" es empleado bajo el significado de un par de iniciadores oligonucleótidos que son complementarios a las secuencias que lindan con Ia secuencia objetivo. El par de iniciadores consiste de un iniciador "corriente arriba" que tiene una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia "corriente arriba" de Ia secuencia objetivo, y un iniciador "corriente abajo" que tiene una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia "corriente abajo" de Ia secuencia objetivo. El término "reacción de amplificación múltiplex" significa, en el contexto de la presente descripción, amplificación, por procedimiento de PCR, de múltiples secuencias objetivo de DNA en una muestra de ensayo en particular.
En Ia presente invención se detectaron y cuantificaron simultáneamente cuatro bacterias utilizando Ia técnica de PCR en tiempo real, que en comparación con las otras técnicas, no se requirió de un pre-enriquecimiento, ni de preparar serie de tubos con una mezcla de reacción específica para cada bacteria a detectar; es necesario resaltar que representa un avance el hecho de detectar cuatro bacterias de manera simultánea y reducir el tiempo total de análisis a 2,5 h mínimo representando una ventaja competitiva en Ia disminución del costo de análisis, utilizando una misma mezcla para Ia prueba de detección. Además de lograr una mejor sensibilidad, ya que Ia preparación de la muestra (que ya está incluida en el tiempo de 2,5 h) ha permitido obtener mejores resultados porque se ha adecuado de tal forma que no existen factores que puedan influir desfavorablemente en Ia amplificación.
El método proporcionado por esta invención permite detectar, identificar y cuantificar simultáneamente múltiple patógenos transmisibles por alimentos, superficies o ambientes contaminados, tales como Listería sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y/o Escherichia coli O157.Η7, en una o más muestras de ensayo, mediante reacción de amplificación múltiplex empleando Ia reacción en cadena de Ia polimerasa en tiempo real. La muestra de ensayo puede ser cualquier muestra que contiene ADN en Ia que se desea conocer Ia posible contaminación por dichos patógenos. En una realización particular, dicha muestra de ensayo es una muestra de un producto alimenticio, por ejemplo, productos cárnicos y lácteos, o una muestra de superficies o ambientes contaminados. OLIGONUCLEÓTIDOS: DISEÑO E INFORMACIÓN DE SECUENCIA
Los oligonudeótidos de Ia invención han sido diseñados con el propósito de identificar específicamente a Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y Escherichia coli O157:H7 que puedan estar presentes en un muestra de ensayo sin dar falsos positivos debido a Ia presencia de otros patógenos presentes en Ia misma.
Se cuenta con un par de iniciadores oligonudeótidos para cada uno de los patógenos a identificar {Listería sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y Escherichia coli O157:H7), tal que cada par de iniciadores comprenden una primera secuencia nucleótida sintética "corriente arriba" complementaria a una secuencia nucleótida "corriente arriba" que linda con el extremo 5' de una secuencia de ácido nucleico objetivo y una segunda secuencia nucleótida sintética "corriente abajo" complementaria a una secuencia "corriente abajo" que linda con el extremo 3' de Ia secuencia de ácido nucleico objetivo. Las secuencias de nucleótidos deben tener cada par de iniciadores de oligonucleótidos que son específicos al patógeno a detectar, de tal manera que no reaccionen o se crucen con otros patógenos. Así mismo, para cada uno de los patógenos a identificar se desarrolló una secuencia sintética de prueba para sonda. Los oligonucleótidos desarrollados se muestran en Ia Tabla 1.
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Tabla 1
En una realización preferente de Ia invención las secuencias SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 12 empleadas como sondas de prueba son marcadas en su extremo 5' con un fluoróforo o un colorante capaz de emitir energía, y en su extremo 3' con un apagador o un colorante capaz de capturar Ia energía emitida de Ia excitación del fluoróforo. Los fluoróforos y apagadores, empleados como marcadores para poder detectar e identificar Listería sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y Escheríchia coli O157:H7 sin producir reacciones cruzadas entre ellos y los demás componentes, son mostrados en Ia Tabla 2.
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Tabla 2 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA O MUESTRAS DE ENSAYO DE ADN
Para el desarrollo de Ia metodología del invento se consideraron los siguientes pasos para Ia preparación de una muestra de ensayo:
Se procede a una etapa de lavado, donde una muestra de alimento, superficie o ambiental se somete a una solución salina formando una suspensión que posteriormente es centrifugada para obtener un primer sedimento obtenido por Ia eliminación de sustancias hidrosolubles presentes en Ia suspensión.
Una vez obtenido el sedimento de Ia muestra, éste se incuba con lisozima para romper Ia pared celular de las bacterias ahí presentes, para posteriormente proceder a una incubación con proteinasa K para provocar Ia hidrólisis de las proteínas y de Ia lisozima previamente adicionada.
La extracción de las proteínas y demás compuestos liposolubles ahí presentes se hace por medio de aplicación de fenol-cloroformo-alcohol, a fin de que una vez extraídas, por medio de una precipitación con etanol, se proceda a una precipitación selectiva del ADN presente, formando una concentración de ADN que es secada.
Finalmente con Ia concentración de ADN obtenida, se forma una suspensión que es calentada a aproximadamente 65 0C que origina una rápida disolución de Ia muestra de ADN.
En cada uno de los elementos probados se hicieron pruebas de cantidad de reactivo adicionado, tiempos de centrifugación-incubación, repetición de los lavados, hasta encontrar las condiciones óptimas. La preparación de Ia muestra se realizó tomando en cuenta que todos los reactivos y muestras deben mantenerse en temperatura de refrigeración durante su proceso.
Ejemplos del proceso de preparación de Ia muestra o muestras de ensayo de ADN son descritos a continuación:
Ejemplo 1: Preparación de muestra de ADN a partir de una muestra de alimento de productos cárnicos o quesos.
1. Colocar 25 g de Ia muestra de alimento en un tubo cónico de 50 mi estéril, y aforar a 40 mi con solución salina estéril a temperatura ambiente.
2. Dejar reposar el tubo con Ia muestra de alimento por 10 min en posición vertical.
3. Eliminar el alimento, centrifugar a 3500 min"1 por 15 min y extraer cuidadosamente el sobrenadante para no perder el sedimento.
4. Agitar en vórtex el sedimento por 10 s. 5. Transferir Ia totalidad del sedimento a un tubo Eppendorf de 2 mi, enjuagar el tubo cónico con 1 mi de salina estéril y reunir el lavado con el obtenido previamente.
6. Centrifugar a 14 000 min"1 por 8 min.
7. Eliminar todo el sobrenadante con pipeta automática.
8. Añadir 100 μl de Tris-HCI de 100 mmol y pH=8, y 30 μg de lisozima, y mezclar en vórtex por 10 s.
9. Incubar a 37 0C por 30 min en baño de agua.
10. Añadir 100 μl de TE IX con SDS al 1% y 3 μl de Proteinasa K (20 mg/ml).
11. Mezclar e incubar a 55 0C por 30 min.
12. Agregar 500 μl de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (24:24: 1) y 100 μl de TE IX y agitar 5 min por inversión.
13. Centrifugar por 8 min a 13 500 min"1 y transferir 250 μl de Ia fase superior a otro tubo.
14. Añadir 582,5 μl de etanol absoluto y mantener en el congelador por 10 min. 15. Centrifugar por 8 min a 13 500 min"1.
16. Decantar y secar.
17. Redisolver en 25 μl de TE IX y asegurar que el botón de DNA se disuelva.
18. Calentar a 65 0C por 15 min. 19. Dejar a temperatura ambiente por 30 min y procesar.
Ejemplo 2: Preparación de muestra de ADN a partir de una muestra de ambiente o de superficie.
1. Pasar una esponja estéril por una superficie de 20 cm x 20 cm a analizar para obtener una muestra.
2. Exprimir Ia esponja en una bolsa para proceder a decantar el líquido en un tubo cónico de 50 mi, y aforar a 40 mi con solución salina estéril.
3. Centrifugar a 3500 min * por 15 min y extraer cuidadosamente el sobrenadante para no perder el sedimento. 4. Agitar en vértex el sedimento por 10 s.
5. Transferir Ia totalidad del sedimento a un tubo Eppendorf de 2 mi. Enjuagar el tubo cónico con 1 mi de salina estéril y reunir el lavado con el obtenido previamente.
6. Centrifugar a 14 000 min"1 por 8 min.
7. Lavar 2 veces más con 1.5 mi de solución salina estéril. 8. Eliminar todo el sobrenadante con pipeta automática.
9. Añadir 100 μl de Tris-HCI de 100 mmol y pH=8, y 30 μg de lisozima, y mezclar en vórtex por 10 s.
10. Incubar a 37 0C por 30 min en baño de agua.
11. Añadir 100 μl de TE IX con SDS al 1% y 3 μl de Proteinasa K (20 mg/ml). 12. Mezclar e incubar a 55 0C por 30 min.
13. Agregar 500 μl de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (24:24: 1) y 100 μl de TE IX y agitar 5 min por inversión. 14. Centrifugar por 8 min a 13 500 min"1 y transferir 250 μl de Ia fase superior a otro tubo.
15. Añadir 582,5 μl de etanol absoluto y mantener en el congelador por 10 min.
16. Centrifugar por 8 min a 13 500 min"1. 17. Decantar y secar.
18. Redisolver en 25 μl de TE IX. Asegurarse de que el botón de DNA se disuelva.
19. Calentar a 65 0C por 15 min.
20. Dejar a temperatura ambiente por 30 min y procesar.
PREPARACIÓN DE LA MEZCLA DE REACCIÓN
Una vez obtenida Ia muestra o muestras de ensayo de ADN se prepara una mezcla de reacción utilizando los componentes descritos en Ia Tabla 3.
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Tabla 3
Posteriormente, se procede a preparar un cóctel de reacción para 100 reacciones mezclando los componentes descritos en Ia Tabla 4.
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Tabla 4
El cóctel preparado se mezcla perfectamente por inversión y se dispensan
19,75 μl en viales Eppendorf de 0,5 mi para ser almacenados en congelación protegidos de Ia luz.
REACCIÓN DE AMPLIFICACIÓN MÚLTIPLEX EMPLEANDO PCR EN TIEMPO REAL Y DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PATÓGENOS
En una realización preferente del invento, Ia reacción de amplificación múltiplex empleando PCR en tiempo real proporciona muchas ventajas sobre el método de PCR convencional de un solo objetivo a detectar. La reacción de amplificación múltiplex empleando PCR requiere del desarrollo de las iniciadores oligonucleótidos y sondas específicas para Ia secuencia objetivo del patógeno a detectar, de tal manera que dichos iniciadores oligonucleótidos y sondas sean compatibles entre sí dentro de una misma temperatura óptima de entre 40 0C a 65 0C y sometidas a las mismas condiciones de reacción química a fin de permitir el cruzamiento o atadura, por hibridación, de dos segmentos de ácido nucleico complementarios. Aunado a esto, los juegos de iniciadores oligonucleótidos y sondas no deben reaccionar cruzadamente ni cruzarse o atarse, durante Ia amplificación, a otras secuencias de ácido nucleico para las cuales no fueron diseñados.
Teniendo en cuenta Io anterior, los siguientes pares de iniciadores oligonucleótidos son usados para amplificar cada una de las secuencias objetivo de ácido nucleico de cada patógeno a detectar. Un par de iniciadores oligonucleótidos de Listería sp identificados como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 que se cruzan o atan a una secuencia objetivo del genoma de Listería sp. Un par de iniciadores oligonucleótidos de Staphylococcus aureus identificados como SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 que se cruzan o se atan a una secuencia objetivo del genoma de Staphylococcus aureus. Un par de iniciadores oligonucleótidos de Campylobacter jejuni identificados como SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 que se cruzan o se atan a una secuencia objetivo del genoma de Campylobacter jejuni. Y un par de iniciadores oligonucleótidos de Escheríchia coli O157:H7 identificados como SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11 que se cruzan o se atan a una secuencia objetivo del genoma de Escherichia coli O157.-H7.
Cada sonda identificadas como SEQ ID N0:3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 12, que es empleada en Ia reacción de amplificación múltiplex empleando PCR en tiempo real, es un secuencia oligonucleótida doblemente marcada que es complementaria a cada una de las secuencias intermedias en los productos amplificados obtenidos. Cada una de las sondas están marcadas en su extremo 5' con un fluoróforo o un colorante capaz de emitir energía, y en su extremo 3' con un apagador o un colorante capaz de capturar Ia energía emitida de Ia excitación de dicho fluoróforo, tal como Io describe Nazarenko eí" al. en Ia patente estadounidense US- 5866336 donde se hace mención a fluoróforos que transfieren energía y cómo estos son aplicados en los iniciadores oligonucleótidos en los métodos de amplificación nucleica.
En una realización preferente de Ia invención, los fluoróforos empleados son
TET, TxR, Cy5, FAM; mientras que los apagadores empleados son BHQ-I, BHQ-2 y BHQ-3. Tal que Ia secuencias oligonucleótidas empleadas como sondas (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 12) son marcadas en sus extremos 5' y 3' conforme a Ia combinación indicada en Ia Tabla 2 antes mencionada.
En un ejemplo particular de realización, Ia muestra de ADN es preparada para su amplificación en las siguientes condiciones:
Muestra de lácteos o de ambiente: Se descongela un vial con 19,75 μl de cóctel preparado y se añaden 0,25 μl de ADN polimerasa Taq, 4 μl de agua y 1 μl de Ia muestra de ADN a analizar.
Muestra de productos cárnicos o quesos: Se descongela un vial con 19,75 μl de cóctel preparado y se añaden 0,25 μl de ADN polimerasa Taq y 5 μl de Ia muestra de ADN a analizar.
La reacción de amplificación múltiplex empleando PCR se realiza en un aparato para el control simultáneo de múltiples amplificaciones de ácido nucleico, como el aparato descrito por Russell G. Higuchi y Robert M. Watson en Ia publicación de patente europea EP-640828, él cual generalmente consiste de un termociclador con una pluralidad de orificios en los que se introducen tubos que contienen Ia mezcla de reacción para Ia amplificación enzimática de ADN de los patógenos a detectar e identificar; una fuente de luz acoplada al termociclador y adaptada para distribuir Ia luz sobre Ia pluralidad de orificios; y un sensor o detector de fluorescencia adaptado para detectar simultáneamente Ia luz emitida.
Con el objeto de cuantificar los microorganismo presentes en Ia muestra, se elaboran curvas de calibración preparando suspensiones de cada una de los patógenos a detectar (Listería sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y Escheríchia coli O157:H7), ajustando Ia turbidez al tubo 0,5 de Mc Farland para preparar diluciones al 10 S 10"2, 10"3, 104, 105, 106, 107 y 108 para posteriormente contaminar 25 g de alimento con cada una de estas suspensiones (un alimento por cada dilución), después se procede a Ia extracción de DNA como si fuera una muestra y se prepara una cuenta en placa de cada una de las diluciones preparadas para ser sometidas al termociclador, asignando Ia concentración de patógenos correspondiente. Finalmente se construye Ia curva de cT contra log ug/g, obteniéndose así una curva de calibración para Listería sp (ver Figura 1), Staphylococcus aureus (ver Figura 2), Campylobacter jejuni (ver Figura 3) y Escheríchia coli O157:H7 (ver Figura 4).
En una realización particular, el aparato utilizado comprende un termociclador rápido en tiempo real unido a un sistema de detección por fluorescencia, Io que permite Ia supervisión en tiempo real del proceso de amplificación tras cada ciclo. Un ejemplo de termociclador empleado en el método del invento es el SMART CYCLER® II de CEPHEID®.
DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PATÓGENOS PRESENTES EN LA MUESTRA DE ADN
La presencia o ausencia y cuantificación de patógenos en cualquier combinación de Listería sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y/o Escheríchia coli 0157:1-17 en Ia muestra o muestras de ensayo se determina por una señal fluorescente o emisión de fluorescencia específica de cada producto o muestra de ADN amplificada. Para esto se hace incidir una longitud de onda específica para Ia excitación de cada fluoróforo y se detecta su emisión a longitudes de onda específicas.
RESULTADOS
En un ejemplo de realización, Ia Tabla 5 indica las condiciones en que se llevó a cabo Ia reacción de amplificación múltiplex, Ia Tabla 6 los limites de detección alcanzados y Ia Tabla 7 muestra las lecturas de las concentraciones que se obtuvieron como resultado de Ia detección y cuantificación de los cuatro patógenos (Listería sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y/o Escheríchia coli O157:H7) en forma simultánea en muestras de carnes frías, lácteos y ambiente, mediante Ia utilización de un sólo dispositivo con una sola mezcla de reactivos y cuatro oligonucleótidos específicos para diferentes patógenos a una sola condición de temperaturas y mezcla para su amplificación. Así como también las Figuras 1, 2, 3 y 4 muestran gráficamente su detección y cuantificación.
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Tabla 5
. Lístería Staphylococcus Campylobacter Escheríchia
Tipo de muestra sp aureus jejuni coli 0157 :H7
ALIMENTOS
Cárnicos y Quesos (unidades 1 3 160 16 qenómicas/q).
AMBIENTE
Drenaje (unidades 1 3 160 16 genómicas/muestra)
Pisos (unidades 1 3 160 16 genómicas/muestra)
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Tabla 6
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Tabla 7
La método del presente invento no requiere un pre-enriquecimiento, por Io cual el tiempo de proceso es mucho más corto, aproximadamente 2,5 h, y se tiene Ia capacidad de detectar y cuantificar patógenos viables cultivables además de patógenos viables no cultivables de forma simultánea.
UJEGQ DE DIAGNOSTICO
En general, los juegos de diagnóstico de Ia invención contienen cada una de las parejas de iniciadores oligonucleótidos correspondientes a cada uno de las patógenos a detectar (Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y/o Escheríchia coli 0157:H7), al igual que cada una de las sondas marcadas para cada uno de dichos patógenos, con el fin de poder elegir entre realizar Ia detección de un solo patógeno (usando solo el par de iniciadores oligonucleótidos y su sonda marcada), o bien para Ia detección combinada o simultánea de los cuatro patógenos mencionados, dependiendo de las necesidades.
Los juegos de diagnóstico proporcionados por esta invención pueden presentarse en forma de estuche conteniendo, además de unos recipientes con los pares de iniciadores oligonucleótidos y/o sondas marcadas mencionados previamente, unos recipientes con Ia totalidad o parte del resto de los reactivos necesarios para Ia realización del método en cuestión, por ejemplo, agua ultrapura, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, y dTTP), un tampón adecuado para Ia reacción de amplificación enzimática, una ADN polimerasa termoestable (por ejemplo, ADN polimerasa Taq), una sal magnésica (por ejemplo, MgCI2), entre otros. Adicional y opcionalmente, los juegos de diagnóstico proporcionados por esta invención pueden incluir unos recipientes con ADN de Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y/o Escherichia coli O157.-H7 para su empleo como controles positivos.
Basado en las realizaciones descritas anteriormente, se contempla que las modificaciones de los ambientes de realización descritos, así como los ambientes de realización alternativos serán considerados evidentes para una persona experta en el arte de Ia técnica bajo Ia presente descripción. Es por Io tanto, contemplado que las reivindicaciones abarcan dichas modificaciones y alternativas que estén dentro del alcance del presente invento o sus equivalentes.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un método para Ia detección y cuantificación múltiple y simultánea de cualquier combinación de patógenos, seleccionados de un grupo consistente de Listería sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y Escheríchia coli 0157:1-17, en una o más muestras de ensayo mediante reacción de amplificación múltiplex empleando Ia reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR) en tiempo real, el método comprende los pasos de: a) extraer ADN presente en dicha muestra o muestras de ensayo; b) preparar una mezcla de reacción específica para dichos patógenos a detectar y cuantificar, comprendiendo dicha mezcla de reacción los reactivos necesarios para Ia amplificación enzimática del ADN extraído e identificación de dichos patógenos a detectar y cuantificar; c) amplificar, mediante reacción de amplificación múltiplex empleado PCR, dicha mezcla de reacción; y d) determinar simultáneamente Ia presencia o ausencia y cuantificación de dichos patógenos en dicha muestra o muestras de ensayo; en donde dicho método se caracteriza porque i) dicha mezcla de reacción para Ia amplificación enzimática del ADN extraído e identificación de cualquier combinación de Listería sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y/o Escheríchia coli 0157: H7 a detectar y cuantificar comprende: un primer par de iniciadores oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 y una sonda identificada como SEQ ID NO: 3, los cuales se cruzan o se atan a un primera secuencia objetivo de ácido nucleico de Listería sp; un segundo par de iniciadores oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 y una sonda identificada como SEQ ID NO: 6, los cuales se cruzan o se atan a una segunda secuencia objetivo de ácido nucleico de Staphylococcus aureus; un tercer par de iniciadores oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 y una sonda identificada como SEQ ID NO: 9, los cuales se cruzan o se atan a una tercera secuencia objetivo de ácido nucleico de Campylobacter jejuni; y/o un cuarto par de iniciadores oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11 y una sonda identificada como SEQ ID NO: 12, los cuales se cruzan o se atan a una cuarta secuencia objetivo de ácido nucleico de Escherichia coli 0157:H7; ii) Ia presencia o ausencia y cuantificación de dichos patógenos en cualquier combinación de Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y/o Escherichia coli 0157.-H7 en dicha muestra o muestras de ensayo se determina por una señal fluorescente o emisión de fluorescencia específica de cada patógeno.
2. El método de Ia reivindicación 1, caracterizado porque dicha muestra o muestras de ensayo es una muestra de alimentos procesados o de ambiente.
3. El método de Ia reivindicación 1, caracterizado porque dicho paso de extraer ADN presente en dicha muestra o muestras de ensayo, incluye los pasos de: colocar dicha muestra de ensayo en una solución salina estéril; remover los elementos solubles en agua; y obtener un concentrado.
4. El método de Ia reivindicación 1, caracterizado porque dicha mezcla de reacción comprende: al menos 200 pmol del iniciador oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: i; al menos 200 pmol del iniciador oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 2; al menos 50 pmol del oligonucleótido de Ia sonda identificada como SEQ ID
NO: 3; al menos 200 pmol del iniciador oligonucleótido identificado como SEQ, ID NO: 4; al menos 200 pmol del iniciador oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 5; al menos 50 pmol del oligonucleótido de Ia sonda identificada como SEQ ID NO: 6; al menos 300 pmol del iniciador oligonucleótido identificado como SEQ ID NO:
7; al menos 200 pmol del iniciador oligonucleótido identificado como SEQ ID NO:
8; al menos 350 pmol del oligonucleótido de Ia sonda identificada como SEQ ID NO: 9; al menos 200 pmol del iniciador oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 10; al menos 200 pmol del iniciador oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: ii; y/o al menos 50 pmol del oligonucleótido de Ia sonda identificada como SEQ ID NO: 12.
5. El método de Ia reivindicación 1, caracterizado porque incluye una o más sondas para detectar producto o productos amplificados de PCR, en donde cada sonda es complementaria a una secuencia dentro de Ia secuencia a detectar de cualquier combinación de Listeria sp, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y/o Escheríchia coli O157:H7.
6. El método de Ia reivindicación 5, caracterizado porque una primera sonda comprende: un oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 3; y al menos un marcador.
7. El método de Ia reivindicación 6, caracterizado porque dicha primera sonda está marcada en su extremo 5' con fluoróforo o un colorante capaz de emitir energía y en su extremo 3' con un apagador o un colorante capaz de capturar Ia energía emitida de Ia excitación de dicho fluoróforo.
8. El método de Ia reivindicación 7, caracterizado porque dicho fluoróforo es TET.
9. El método de Ia reivindicación 7, caracterizado porque dicho apagador es BHQ-I.
10. El método de Ia reivindicación 5, caracterizado porque una segunda sonda comprende: un oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 6; y al menos una marcador.
11. El método de Ia reivindicación 10, caracterizado porque dicha segunda sonda está marcada en su extremo 5' con fluoróforo o un colorante capaz de emitir energía y en su extremo 3' con un apagador o un colorante capaz de capturar Ia energía emitida de Ia excitación de dicho fluoróforo.
12. El método de Ia reivindicación 11, caracterizado porque dicho fluoróforo es TxR.
13. El método de Ia reivindicación 11, caracterizado porque dicho apagador es BHQ-2.
14. El método de Ia reivindicación 5, caracterizado porque una tercera sonda comprende: un oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 9; y al menos un marcador.
15. El método de Ia reivindicación 14, caracterizado porque dicha tercera sonda está marcada en su extremo 5' con fluoróforo o un colorante capaz de emitir energía y en su extremo 3' con un apagador o un colorante capaz de capturar Ia energía emitida de Ia excitación de dicho fluoróforo.
16. El método de Ia reivindicación 15, caracterizado porque dicho fluoróforo es Cy5.
17. El método de Ia reivindicación 15, caracterizado porque dicho apagador es BHQ-3.
18. El método de Ia reivindicación 5, caracterizado porque una cuarta sonda comprende: un oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 12; y al menos un marcador.
19. El método de Ia reivindicación 18, caracterizado porque dicha cuarta sonda está marcada en su extremo 5' con fluoróforo o un colorante capaz de emitir energía y en su extremo 3' con un apagador o un colorante capaz de capturar Ia energía emitida de Ia excitación de dicho fluoróforo.
20. El método de Ia reivindicación 19, caracterizado porque dicho fluoróforo es FAM.
21. El método de Ia reivindicación 19, caracterizado porque dicho apagador es BHQ-I.
22. El método de Ia reivindicación 5, caracterizado porque dichas sondas están marcadas en su extremo 5' con fluoróforo o un colorante capaz de emitir energía, y en su extremo 3' con un apagador o un colorante capaz de capturar Ia energía emitida de Ia excitación de dicho fluoróforo.
23. El método de Ia reivindicación 22, caracterizado porque dicho fluoróforo es seleccionado de un grupo que consiste de TET, TxR, Cy5 y FAM.
24. El método de Ia reivindicación 22, caracterizado porque dicho apagador es seleccionado de un grupo que consiste de BHQ-I, BHQ-2 y BHQ-3.
25. Un oligonucleótido que se caracteriza por tener una secuencia de nucleótidos seleccionada de un grupo formado por las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.
26. Un oligonucleótido que se caracteriza por tener una secuencia de nucleótidos seleccionada de un grupo formado por las secuencias identificadas como SEQ ID
NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.
27. Un oligonucleótido que se caracteriza por tener una secuencia de nucleótidos seleccionada de un grupo formado por las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9.
28. Un oligonucleótido que se caracteriza por tener una secuencia de nucleótidos seleccionada de un grupo formado por las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12.
29. Una sonda marcada que se caracteriza por comprender: un oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 3; y al menos un marcador.
30. La sonda marcada de Ia reivindicación 29, caracterizada porque dicha sonda está marcada en su extremo 5' con fluoróforo o un colorante capaz de emitir energía y en su extremo 3' con un apagador o un colorante capaz de capturar Ia energía emitida de Ia excitación de dicho fluoróforo.
31. La sonda marcada de Ia reivindicación 30, caracterizada porque dicho fluoróforo es TET.
32. La sonda marcada de Ia reivindicación 30, caracterizada porque dicho apagador es BHQ-I.
33, Una sonda marcada que se caracteriza por comprender: un oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 6; y al menos un marcador.
34. La sonda marcada de Ia reivindicación 33, caracterizada porque dicha sonda está marcada en su extremo 5' con fluoróforo o un colorante capaz de emitir energía y en su extremo 3' con un apagador o un colorante capaz de capturar Ia energía emitida de Ia excitación de dicho fluoróforo.
35. La sonda marcada de Ia reivindicación 34, caracterizada porque dicho fluoróforo es TxR.
36. La sonda marcada de Ia reivindicación 34, caracterizada porque dicho apagador es BHQ-2.
37. Una sonda marcada que se caracteriza por comprender: un oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 9; y al menos un marcador.
38. La sonda marcada de Ia reivindicación 37, caracterizada porque dicha sonda está marcada en su extremo 5' con fluoróforo o un colorante capaz de emitir energía y en su extremo 3' con un apagador o un colorante capaz de capturar Ia energía emitida de Ia excitación de dicho fluoróforo.
39. La sonda marcada de Ia reivindicación 38, caracterizada porque dicho fluoróforo es Cy5.
40. La sonda marcada de Ia reivindicación 38, caracterizada porque dicho apagador es BHQ-3.
41. Una sonda marcada que se caracteriza por comprender: un oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 12; y al menos un marcador.
42. La sonda marcada de Ia reivindicación 41, caracterizada porque dicha sonda está marcada en su extremo 5' con fluoróforo o un colorante capaz de emitir energía y en su extremo 3' con un apagador o un colorante capaz de capturar Ia energía emitida de Ia excitación de dicho fluoróforo.
43. La sonda marcada de Ia reivindicación 42, caracterizada porque dicho fluoróforo es FAM.
44. La sonda marcada de Ia reivindicación 42, caracterizada porque dicho apagador es BHQ-I.
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