WO2007132806A1

WO2007132806A1 - ポリエチレングリコールを利用した磁気共鳴造影剤及び磁気共鳴撮像方法

Info

Publication number: WO2007132806A1
Application number: PCT/JP2007/059849
Authority: WO
Inventors: Yoshikazu Suzuki; Iwao Miura; Mitsuru Iida
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2006-05-17
Filing date: 2007-05-14
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2008-11-17
Also published as: CA2652264C; KR101463634B1; EP2020244B1; KR20090019842A; TWI400091B; CN104324393A; JPWO2007132806A1; CN101448529A; JP5435940B2; EP2020244A4; AU2007250851A1; ES2454968T3; EP2020244A1; TW201336515A; CA2652264A1; TW200812624A; US20090162291A1; TWI501780B; BRPI0712066A2

Abstract

　本発明の目的は、安全性及び定量性を備えつつ、短い繰り返し時間で磁気共鳴画像を連続的に取得することができる技術を提供することである。　天然存在比以上の割合で13Cを含むポリエチレングリコール、又は該ポリエチレングリコールで標識された化合物を含有する磁気共鳴造影剤を用いて、６０秒以下の繰り返し時間で励起パルスを印加して磁気共鳴信号を連続的に取得する。

Description

明細書

ポリエチレングリコールを利用した磁気共鳴造影剤及び磁気共鳴撮像方法

技術分野

[0001] 本発明は、ポリエチレングリコールを利用した磁気共鳴造影剤、より詳細には、 60秒以下 (好ましくは 1秒以下、更に好ましくは 250ミリ秒以下、特に好ましくは 100ミリ秒以下）の繰り返し時間で励起パルスを印加して磁気共鳴信号を連続的に取得するために使用される磁気共鳴造影剤に関する。更に、本発明は、前記磁気共鳴造影剤を使用した磁気共鳴信号の取得方法及び磁気共鳴撮像方法に関する。

背景技術

[0002] 最近の造影剤を利用した画像診断としては、陽電子又は放射線標識造影剤を用いた撮像技術（PET、 SPECT等）や磁気共鳴現象を利用した MRI (magnetic resonance i maging)が実用化されている。 PETや SPECTによる撮像技術では、病変部位の定量的な情報を得ることも不可能ではないが、その反面、放射能の半減期の問題があるため、造影剤を安定に保存することができないという欠点がある。また、放射性化合物は人体に悪影響を及ぼす危険があるという点も被験者にとっては望ましくない。これに対して、 MRIは、安定同位体核を測定するため、人体にとっては安全な撮像技術であり、放射性同位体の不安定性から生じる上記欠点も排除できるという利点がある。このような理由から、 MRIによる撮像技術は、今後益々その利用が拡大していくと考えられている。

[0003] 従来、 MRIには、核磁気共鳴の対象核として 1Hが一般的に使用されており、その造影剤として、ガドリニウム (Gd)の配位ィ匕合物である Gd造影剤、酸化鉄微粒子を利用した超常磁性酸ィ匕鉄コロイド製剤 (SPIO)等が知られてヽる。このような造影剤では、被験体内で周囲に存在する水分子の 1Hの緩和時間を短縮させることにより、その存在を間接的に可視化するという原理を利用している。しかしながら、核磁気共鳴の対象核として 1Hを利用する MRIでは、 1Hによる磁気共鳴信号と造影剤濃度の線形性が完全ではな、ため、分子イメージング等にぉ、て定量分析を可能にする画像の取得は困難であるという欠点がある。また、プロトン以外の核種では、プロトンとほぼ同感度の 19F核が MRIによる分子イメージングへの応用を目指して研究されて、るが、フッ素原子含有化合物の合成の困難さ等が原因で、実用化までには至っていない。更に、酸化鉄やガドリニウムを利用した造影剤、或いはフッ素等の原子を利用した造影剤では、それらを使用するにあたり、ある程度の毒性も考慮しなければならない。

[0004] 一方、 13Cを含む分子を被験体内に存在させて、 13Cによる磁気共鳴信号を測定することによつても、 MRIによる撮像が可能であり、 13Cを含む分子を MRI用の造影剤として使用できることが分力つている。この 13Cによる磁気共鳴信号は、 1Hの場合に比べて、被験体内でのバックグランド値が低いため、定量的な評価に使用される画像の取得に有用であると考えられている。しかしながら、 13Cによる磁気共鳴信号は、該分子の構造によって影響を受け易いという欠点がある。そのため、 13Cによる磁気共鳴信号を増強するために単一分子に複数の 13Cが導入されている場合、分子内の各 13Cの化学シフトが分散して測定精度を下げるという問題点が生じることがある。また、抗体等の比較的分子量が大き、タンパク質に対して 13Cを導入した分子を結合させると、 13Cによる磁気共鳴信号が減弱されるという不具合が生じたりする場合もある。

[0005] また、 MRIによる撮像では、被験者の負担の軽減等のために、磁気共鳴画像を短時間で取得することが求められており、 MRI用の造影剤には T1緩和（縦緩和）時間が適度に短い分子の利用が有効であると考えられている。しかしながら、 13Cを含む分子を利用した磁気共鳴信号の取得において、 T1緩和時間はその分子構造等に大きく依存するので、如何なる構造の分子の T1緩和時間が短ぐ磁気共鳴画像を短時間で連続的に取得するのに有用であるかは分力つていないのが現状である。

[0006] このような従来技術を背景として、安全性が高ぐ定量的な評価にも使用可能であり、しかも磁気共鳴信号を短時間で連続的に取得できる技術の開発が切望されていた発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0007] 本発明は、安全性及び定量性を備えつつ、短い繰り返し時間で磁気共鳴信号を連続的に取得することができる造影剤、及びこれを用いた磁気共鳴信号の取得方法及び磁気共鳴撮像方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0008] 本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、天然存在比以上の割合で 13Cを含むポリエチレングリコール、又は該ポリエチレングリコールで標識された化合物を含む造影剤を使用して、繰り返し時間を 60秒以下 (好ましくは 1秒以下、更に好ましくは 100ミリ秒以下）に設定して励起パルスを繰り返し印加し、 13Cによる磁気共鳴信号を連続的に定量的に測定することができ、定量的な分析に使用可能な磁気共鳴画像を短時間で取得できることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に改良を重ねることにより完成したものである。

[0009] 即ち、本発明は、下記に掲げる造影剤を提供する。

項 1. 60秒以下の繰り返し時間で励起磁場のパルスを印加して磁気共鳴信号を連続的に取得し画像化するために使用される、

天然存在比以上の割合で 13Cを含むポリエチレングリコール、又は該ポリエチレングリコールで標識されたィ匕合物を含有することを特徴とする、

磁気共鳴造影剤。

項 2. 前記ポリエチレングリコールの 13Cの割合力全炭素原子の 20〜100%である、項 1に記載の磁気共鳴造影剤。

項 3. 前記ポリエチレングリコールの重量平均分子量が 470〜10000000である、項 1 に記載の磁気共鳴造影剤。

項 4. 前記化合物が、天然存在比以上の割合で 13Cを含むポリエチレングリコールで標識された抗体である、項 1に記載の磁気共鳴造影剤。

[0010] また、本発明は、下記に掲げる磁気共鳴撮像方法を提供する。

項 5. 天然存在比以上の割合で 13Cを含むポリエチレングリコール、又は該ポリエチレンダリコールで標識された化合物を含有する磁気共鳴造影剤が投与された被験体に対して、 60秒以下の繰り返し時間で励起磁場のパルスを印加することにより磁気共鳴信号を連続的に取得し画像化することを特徴とする、磁気共鳴撮像方法。

項 6. 前記ポリエチレングリコールの 13Cの割合力全炭素原子の 20〜100%である、項 5に記載の磁気共鳴撮像方法。

項 7. 前記ポリエチレングリコールの重量平均分子量が 470〜10000000である、項 5 に記載の磁気共鳴撮像方法。

項 8. 前記化合物が、天然存在比以上の割合で 13Cを含むポリエチレングリコールで標識された抗体である、項 5に記載の磁気共鳴撮像方法。

[0011] 更に、本発明は、下記に掲げる磁気共鳴信号の取得方法を提供する。

項 9. 天然存在比以上の割合で 13Cを含むポリエチレングリコール、又は該ポリエチレンダリコールで標識された化合物を含有する磁気共鳴造影剤が投与された被験体に対して、 60秒以下の繰り返し時間で励起磁場のパルスを印加することにより磁気共鳴信号を連続的に取得することを特徴とする、磁気共鳴信号の取得方法。

項 10. 前記ポリエチレングリコールの 13Cの割合力全炭素原子の 20〜100%である、項 9に記載の方法。

項 11. 前記ポリエチレングリコールの重量平均分子量が 470〜10000000である、項 9に記載の方法。

項 12. 前記化合物が、天然存在比以上の割合で 13Cを含むポリエチレングリコールで標識された抗体である、項 9に記載の方法。

[0012] 更に、本発明は、下記に掲げる天然存在比以上の割合で 13Cを含むポリエチレングリコール、又は該ポリエチレングリコールで標識された化合物の使用を提供する。項 13. 天然存在比以上の割合で 13Cを含むポリエチレングリコール、又は該ポリエチレングリコールで標識されたィ匕合物の、

60秒以下の繰り返し時間で励起磁場のパルスを印加して磁気共鳴信号を連続的に取得し画像化するために用いられる磁気共鳴造影剤の製造のための使用。

項 14. 前記ポリエチレングリコールの 13Cの割合力全炭素原子の 20〜100%である、項 13に記載の使用。

項 15. 前記ポリエチレングリコールの重量平均分子量が 470〜10000000である、項 13に記載の使用。

項 16. 前記化合物が、天然存在比以上の割合で 13Cを含むポリエチレングリコールで標識された抗体である、項 13に記載の使用。項 17. 天然存在比以上の割合で 13Cを含むポリエチレングリコール、又は該ポリエチレングリコールで標識されたィヒ合物の、 60秒以下の繰り返し時間で励起磁場のパルスを印加して磁気共鳴信号を連続的に取得し画像化するための使用。

項 18. 前記ポリエチレングリコールの 13Cの割合力全炭素原子の 20〜100%である、項 17に記載の使用。

項 19. 前記ポリエチレングリコールの重量平均分子量が 470〜10000000である、項 17に記載の使用。

項 20. 前記化合物が、天然存在比以上の割合で 13Cを含むポリエチレングリコールで標識された抗体である、項 17に記載の使用。

発明の効果

[0013] 本発明の造影剤によれば、繰り返し時間を 60秒以下 (好ましくは 1秒以下、更に好ましくは 250ミリ秒以下、特に好ましくは 100ミリ秒以下）に設定して励起パルスを繰り返し印カロしても精度の高ヽ磁気共鳴信号を得られるので、高速で鮮明な磁気共鳴画像を取得するのに有用である。

[0014] 本発明の造影剤で使用されるポリエチレングリコールは、 13Cを複数含有していても、各 13Cの化学シフトが分散することなく一点に集中するので、精度の高い磁気共鳴信号の取得が可能になる。また、本発明の造影剤によれば、 13Cによる磁気共鳴信号を利用するので、 1Hの場合に比べて、被験体内でのノックグランド値が低ぐ定量的な評価が可能な画像を取得できる。

[0015] 更に、天然存在比以上の割合で 13Cを含むポリエチレングリコールは、タンパク質等の高分子量の他の化合物に結合しても、その磁気共鳴信号に影響が殆どない。従って、本発明によれば、以下の (1)〜(4)に示す診断、判定、可視化等を短時間で実施することが可能になる。

(1)特定の病巣部位を特異的に認識する抗体に、上記ポリエチレングリコールを結合させ、これを造影剤として使用することにより、病巣部位の可視化による診断。

(2)特定の細胞を特異的に認識する抗体に、上記ポリエチレングリコールを結合させ、これを造影剤として使用することにより、当該細胞の体内動態の可視化。

(3)リボソーム製剤等の DDS製剤に、上記ポリエチレングリコール又はそれを結合させた化合物を含有させ、これを投与することにより、目的部位への製剤の集積度の判定

(4)13Cを含むポリエチレングリコールを直接人体に投与して、それが特定の臓器や部位に一定時間蓄積させることにより、特定の臓器や部位の可視化。

[0016] そして更に、本発明の造影剤では、 13Cを使用しているので、 PETや SPECT等で使用されている放射性化合物を含む造影剤に比べて、安全性が高いだけでなぐ経時的にも安定であるので、時間的余裕を持って磁気共鳴撮像を行うことができると、う禾 IJ点ちある。

発明を実施するための最良の形態

[0017] 本発明の造影剤は、天然存在比以上の割合で 13Cを含むポリエチレングリコール（以下、「13C- PEG」と表記する）、又は該 13C- PEGで標識されたィ匕合物を含有するものである。

[0018] 本発明に使用される 13C-PEGは、天然存在比以上の割合 (即ち、全炭素原子の内約 1%以上)で、 13Cを含むものであればよい。磁気共鳴信号の検出感度を高めるという観点から、全炭素原子の内 13Cが占める割合が 20〜100%、好ましくは 50〜100 %、更に好ましくは 90〜100%、特に好ましくはほぼ 100%のものが好適である。ポリエチレングリコールは、— CH CH 0-の繰り返し構造力なり、全ての炭素原子の化学

2 2

的環境が同一であるため、同一分子内に複数の 13Cが含まれていても、各 13Cの化学シフトが分散することなぐ一点に集中するので、磁気共鳴信号が増強されて検出されるという利点がある。

[0019] また、本発明に使用される 13C-PEGの分子量としては、特に制限されるものではなぐ 13Cの含有割合等に基づいて適宜設定される。例えば、 13Cの含有割合が低い場合には、 13C-PEGの分子量が高いものが望ましぐまた 13Cの含有割合が高い場合には、 13C-PEGの分子量が低いものであってもよい。本発明に使用される 13C-PE Gの一例として、重量平均分子量が、 470〜10000000、好ましくは 6000〜2000000のものが例示される。

[0020] 本発明では、上記 13C- PEGをそのまま使用してもよいが、上記 13C- PEGで標識された化合物（以下、「13C-PEG修飾ィ匕合物」と表記する）を使用することもできる。ここで、 13C-PEG修飾化合物とは、 13C-PEG力そのまま又はリンカ一となる基を介して化合物に結合しているものである。このような 13C-PEG修飾化合物において、 13C-P EGの標識 (結合)対象となる化合物としては、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等の抗体；前記抗体の Fabフラグメント；アルブミン、トランスフェリン等の血清タンパク質；インターフェロン、ェルスロポェチン、インターロイキン、 M— CSF、 G— CSF、インシュリン、アディポカイン等の薬理活性タンパク質； EP-1873 (Epix Pha rmaノ、エノくンスフノレ¹ ~~、 Congo red、 thioflavin— S、 (E,E)—l—bromo— 2,5— bis(3— hydroxy carbonyl-4-hydroxy)styrylbenzene (BSB)、 (E, E)— 1—fluoro— 2 , 5— bis(3— hydroxycarbony l-4-hydroxy)styrylbenzene (FSB)等の低分子化合物；内部に薬剤を封入できるようなリボソームを構成する化合物等が挙げられる。例えば、特定の病巣部位 (例えば、癌、動脈硬化、炎症等の部位、 )に対して特異的に結合可能な抗体が結合している 13 C-PEG修飾ィ匕合物によれば、当該特定病巣部位を可視化することが可能になる。また、例えば、薬理活性タンパク質が結合している 13C-PEG修飾ィ匕合物を使用すれば、治療目的部位への当該薬理活性タンパク質の集積度の判定が可能になる。

[0021] 上記 13C- PEG修飾ィ匕合物は、上記 13C- PEGと、標識対象となる化合物とを公知の方法で結合させることにより調製される。好適な例としては、標識対象となる化合物がアミノ基を有する場合 (具体的には、抗体や薬理活性タンパク質の場合)であれば、 N -ヒドロキシスクシンイミド (NHS)で上記ポリエチレングリコールを活性エステルイ匕し、標識対象となる化合物とアミド結合を形成させる方法が例示される。

[0022] 上記 13C-PEG修飾ィ匕合物において、標識対象となる化合物に対して結合する上記 13C-PEGの数としては、標識対象となる化合物の所望の活性が損なわれないことを限度として特に制限されない。例えば、上記 13C-PEG修飾ィ匕合物は、標識対象となる化合物に対して、 1つの 13C-PEGが結合していてもよぐまた 2つ以上の 13C-PE Gが結合していてもよい。

[0023] 本発明の造影剤は、上記 13C-PEG又は 13C-PEG修飾ィ匕合物を、薬学的又は化学的に許容される溶媒、例えば、生理食塩水、等張リン酸緩衝液等に溶解して調製される。本発明の造影剤において、上記ポリエチレングリコール、又は 13C-PEG修飾ィ匕合物の濃度は、画像形成方式、測定方式、測定部位等に応じて適宜設定することができる。一例として、本発明の造影剤の総量当たり、上記 13C- PEG又は 13C- PEG修飾化合物が、 0.0001〜100重量％、好ましくは 0.001〜50重量％、更に好ましくは 0.01 〜10重量％となる濃度が例示される。

[0024] 更に、本発明の造影剤は、上記成分の他に、可溶化剤、乳化剤、粘度調節剤、緩衝剤等の添加剤を適量含んで、てもよ、。

[0025] 本発明の造影剤は、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、経口投与、又はその他の方法によって被験者に投与される。本発明の造影剤の投与量は、上記 13C-PEG 又は 13C-PEG修飾ィ匕合物の 13Cの含有量、磁気共鳴画像の測定部位等に応じて適宜設定される。例えば、本発明の造影剤の投与量は、測定部位において、上記 13C- PEG又は 13C-PEG修飾化合物の 13C原子の数力 1cm³あたり、 1 X 10— ¹²mol以上、好ましくは 1 X 10— ⁸mol以上、更に好ましくは 1 X 10— ⁶mol以上となるように設定するとよい。

[0026] 本発明の造影剤は、 60秒以下の繰り返し時間で励起磁場 (RF波）のノルスを印加することにより、磁気共鳴信号を連続的に取得するために使用される。ここで、繰り返し時間（time of repetition: TR)とは、ひとつのパルス系列に要する総時間のことをさす。すなわち、言い換えると、 TRは積算測定においてひとつのパルス系列の最初から次のパルス系列の最初までの時間間隔のことを意味する。本発明の造影剤で使用される上記 13C- PEG又は 13C- PEG修飾ィ匕合物は、 T1緩和時間が適度に短いという有利な点があるので、磁気共鳴画像の取得を、その繰り返し時間を上記のように短く設定して連続的に実施することができる。本発明の造影剤は、一層高速で連続的に磁気共鳴信号を取得するという観点から、繰り返し時間を好ましくは 1秒以下、更に好ましくは 250ミリ秒以下、特に好ましくは 60〜100ミリ秒に設定することが可能である。このように本発明の造影剤は、繰り返し時間を短く設定でき、連続的に磁気共鳴信号を取得することができるので、高速画像化のための使用に好適である。

[0027] 本発明の造影剤を使用して取得された磁気共鳴信号は、診断等にそのまま利用することができる。また、当該磁気共鳴信号を画像化して磁気共鳴画像を取得し、これを各種診断に利用することもできる。

[0028] 本発明の造影剤を使用して磁気共鳴信号を取得する際の他の条件、例えば、励起磁場のパルスの持続時間、磁気共鳴信号の測定方法等については、磁気共鳴信号の取得において一般的に採用されている条件力も適宜設定することができる。また、磁気共鳴信号の画像ィ匕方法については、磁気共鳴画像の取得において一般的に採用されている条件力適宜設定することができる。

[0029] 従って、本発明の造影剤は、公知の撮像方法、具体的には、ケミカルシフトイメージング法、プロトン検出 13Cケミカルシフトイメージング法、ファストスピンエコー法、ダラジェントエコー法等の撮像方法に適用することが可能である。実施例

[0030] 以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明する力本発明はこれらによって限定されるものではない。なお、以下、表記「13C-PEG」の前に付する割合（％)は、その 13C-PEGにおいて、全炭素原子当たりの 13Cの割合を意味する。また、表記「13 C-PEG」の後ろに付する数値は、その 13C- PEGの分子量を意味する。

[0031] ¾細

13C-PEGの NMR ^ベクトル特性を調べるために、以下の試験を行った。ほぼ全ての炭素原子が 13Cである 13C-PEG6000 [以下、 99%13C-PEG6000と表記する、 Cam bridge Isotope Laboratories, Inc (CIL社）より購入]を重水（D 0)に 2.2 mg/mlの濃度

2

に溶解し、これをサンプルとして NMR ^ベクトルを測定した。また、天然存在比（1%) の 13Cを有する 13C-PEG6000 (以下、 1%13C-PEG6000と表記する）を重水（D 0)に

2

22 mg/mlの濃度に溶解し、これをサンプルとして NMR ^ベクトルを測定した。

[0032] なお、 NMR ^ベクトルの装置及び測定条件は、以下の通りである：

S :高分解能 NMR装置

コンソ一ノレ： Varian Unity INOVA

磁石： Oxford 300 MHz

11^^:観測周波数 75 MHz,測定温度 23°C、 1パルス法 (プロトンデカップリング）

、待ち時間 1秒、 45° パルスで測定

[0033] 得られた結果を図 1に示す。 99% 13C-PEG6000は高分子であるにもかかわらず、非常にシャープな NMRシグナルを示した（図 la参照）。また、 99%13C-PEG6000では

、全炭素原子が同一の化学的環境にあるため、ケミカルシフトが一点に集中し、強いシグナル強度となっていた。一方、 99%13C-PEG6000の 10倍高い濃度に設定されている 1%13C-PEG6000は、 99%13C-PEG6000のほぼ 10分の 1のシグナル強度を示したことから、 13Cに基づくシグナル強度は、 13Cの数に対応しており、極めて定量性が高!、ものであることが確認された。

[0034] 実施例 2

99%13C-PEG6000を重水（D 0)溶媒に 2.5mg/mlの濃度に溶解し、これをサンプル

2

として、以下の測定条件下で、パルス (90° パルス）照射、 FID取得（1.3秒）に続く待ち時間（エコー収集終了後から次の励起までの時間；デットタイム； acquisition delay; dead time)の間隔を短縮したときのシグナル強度への影響を調べた。また、比較として、 13C-ピルビン酸 [sodium pyruvate (1- ¹³C,99%)、 CIL社]を重水に 25mg/mlの濃度に溶解したもの、及び 1位の炭素原子が 13Cであるグルコース [D- Glucose (1-¹³C,99% )、 CIL社製] (以下、 13C-グルコースと表記する）を重水に 2.2mg/mlの濃度に溶解したものを各々サンプルとして、同様に試験した。

高分解能 NMR装置

コンソ一ノレ： Varian Unity INOVA

磁石： Oxford 300 MHz

11^^:観測周波数 75 MHz,測定温度 23°C、 1パルス法 (プロトンデカップリング）、90。パルスで測定

[0035] 得られた結果を図 2及び 3に示す。図 2aに示すように、 13C-ピルビン酸では、待ち時間を 60秒以下にすると急激にシグナル強度が減少した。これは、 13C-ピルビン酸の T1緩和時間が非常に長!、ことに由来する（プロトンが直接結合して、な、炭素原子の T1緩和時間は長くなる）。それに対して、 99%13C-PEG6000に関しては、図 2b及び図 3bに示すように、待ち時間間隔を 20msec程度まで短くしても、シグナル強度の減少はほとんど観測されなかった。これは、 99%13C-PEG6000の T1緩和時間がある程度短いことに由来すると考えられる。

[0036] また、 13C-グルコースに関しては、グルコースの _α型、 j8型異性体の両炭素のシグナルが観測されている力これらはいずれもプロトンと直接共有結合しているので、ピルビン酸の場合よりもこれらの T1時間は短くなる。従って、待ち時間間隔を短縮しても、ピルビン酸で観測されたような 60秒以下での急激な減少はみられな力つた。しかしながら、それでもなお、 α型、 j8型の 1位の炭素ともに待ち時間間隔の短縮に伴うシグナル強度の減少が確認された（図 3a参照)。グルコースの _α型、型異性体の両炭素のシグナル強度の和は、待ち時間間隔 200秒力も 20ミリ秒になった時にはシグナル強度が 21%減少するのに対して、 99%13C-PEG6000の場合は、シグナル強度減少は僅力 3.9%であった。このことから、 99%13C-PEG6000において、 20ミリ秒まで待ち時間間隔を短縮してもシグナル強度が減じな、と、う現象は、 13C-PEG特有の T1緩和時間に由来するものと考えられる。

[0037] 実施例 3

2

として、磁場強度 7テスラの MRI装置を用い、以下の測定条件下で、繰り返し時間を 6 0〜200ミリ秒でパルスを印加したときのシグナル強度への影響を調べた。また、比較として、 13C-グルコースを重水に 2.2mg/mlの濃度に溶解したものをサンプルとして、同様に試験した。

装置: MRI装置 (磁場強度 7テスラ）

コンソ一ノレ： Varian Unity INOVA

磁石： JASTEC 7T

11^^:観測周波数 75 MHz,測定温度 23°C、 1パルス法 (プロトンデカップリング）、40° パルスで測定

[0038] 得られた結果を図 4に示す。図 4から明らかなように、 40° パルスで測定した場合は、グルコースのシグナルがパルス間隔 200ミリ秒から 100ミリ秒になると約 30%減少するのに対して、 99%13C-PEG6000の場合は 100ミリ秒に短縮してもシグナル強度の減少は 4%程度し力観測されなかった。以上の結果から、 MRI装置においても、 13C-PEG 6000は繰り返し時間を短縮できるという特徴を利用できることがわ力た。

[0039] 実施例 4

1%13C- PEGの一方の末端の水酸基に NHSを結合させた 1%13C- PEG5000NHS及び 1%13C-PEG20000NHS (日本油脂社製)を用いて、 IgGを標識した。標識反応後、ゲルろ過及び ProteinAカラムによる精製処理に供することにより、未反応の 1%13C-PEG を除去した（図 5a参照)。図 5aに示す SDS-PAGEの像から明らかなように、高分子側にバンドが数本確認でき、実際に 1%13C-PEGが共有結合で IgGに標識されていることが確認された。

[0040] 斯くして得られた 1%13C-PEG5000標識 IgGを重水に 14.1 mg/mlの濃度に溶解したもの、及び 1%13C-PEG20000標識 IgGを重水に 5.1 mg/mlの濃度に溶解したものを、各々サンプルとして、 NMR ^ベクトルの測定を行った。なお、 NMR ^ベクトルの装置及び測定条件は、以下の通りである：

S :高分解能 NMR装置

コンソ一ノレ： Varian Unity INOVA

磁石： Oxford 300 MHz

11^^:観測周波数 75 MHz,測定温度 23°C、 1パルス法 (プロトンデカップリング）、待ち時間 1秒、 45° パルスで測定

[0041] 得られた結果を図 5b及び図 6に示す。図 5bから明らかなうように、 1%13C-PEG5000 及び 1%13C-PEG20000は IgGに結合しても、 IgGに結合していない場合と同様、一点のケミカルシフトに集中した非常にシャープなシグナルを示すことが確認された。更に、図 6から分かるように、 1%13C-PEG5000において、シグナルの半値幅も、 IgGに結合した影響は殆ど認められな力つた。この結果から、 IgGのような高分子タンパク質に結合したことによる、 PEGのシグナル強度の減少やスペクトルのブロードユング等の不具合は起きないことが判明した。

[0042] 実飾 15

PEGの分子量が大きくなつた場合、 NMRシグナルの強度、半値幅がどのように変化するかを天然存在比 (1%)の 13Cを有する PEGを用いて検討した。用いた PEGの平均分子量は 35000、 500000、 2000000の 3種類である。 NMR ^ベクトルの測定は高分解能核磁気共鳴装置を用いて行った。なお、測定条件は以下の通りである。

装置:日本電子 JNM- ECA500

磁石： Oxford (11.7 Tesla, 500MHz)

沏 I ィ牛

観測周波数： 125 MHz

温度： 25°C 観測幅: 31 KHz

データポイント： 32 K

パルスシークェンス：シングルパルスデカップリング

フリップアングル： 45°

待ち時間： 2秒

データ取り込み時間： 1秒

結果を図 7に示す。いずれの分子量の PEGも濃度は 0.5 mg/ml (溶媒は D20)で、内部コントロールとして 0.5 mMの 13C-alanine (CIL社、カルボン酸の炭素が 13Cとなっている。）を各サンプルに添カ卩して測定を行った。 13C-alanineのカルボン酸の炭素のシグナルが 176.5 ppmの位置に観測され、 PEGのシグナルはいずれの分子量のものも 6 9.5 ppm近傍（分子量により 0.1 ppm程度のずれはある）に観測された。どの PEGのシグナルも非常にシャープなシグナルであり、それぞれの PEGの NMRシグナルの半値幅を測定した結果、 PEG35000、 PEG500000、 PEG2000000の半値幅はそれぞれ、 2.9 9、 3.03、 3.25Hzであり、分子量が大きくなつてもほとんど半値幅に変化は見られないという結果であった。また、各 PEGの NMRシグナルの信号強度をシグナルの高さで評価した場合、 13C- alanineのカルボン酸のシグナルを 1とすると、どの PEGにおいてもシグナルの強度（ピークの高さ）は 8〜10程度であり、同じ重量濃度の PEG溶液サンプルでは、分子量の違いでシグナル強度 (ピークの高さ）に大きな違いはみられなかつた（図 7a、 b、 c)。つまり、 PEG分子量が 2000000程度に大きくなつても、分子内の炭素の NMRシグナル強度が減弱するようなことは全くないということがこの実験力も判明した。各 PEGの濃度をモル濃度に換算すると、 PEG35000、 PEG500000、 PEG2000000 のサンプルは、 14.2 M、 1.0 M、 0.25 Mとなる。ここから PEG単一分子あたりのシグナルの高さを評価すると、 13C-alanineを 1とした場合、それぞれ、 283、 4000、 194 00という計算になり、 PEGの分子量にほぼ比例して信号強度 (ピークの高さ）が大きくなるという結果であった。以上の結果から、 PEGの NMRシグナルの信号強度（ピークの高さ）は、溶液の粘性が問題にならない場合、 PEGの分子量にほぼ比例して大きくなることが明らかになった。

実施例 6 99%13C-PEG6000を 33mg/mlとなるように純水 (H 0)に溶解してサンプルとした。こ

2

のサンプル 0.1mlをラット（日本クレアより購入、雄の SDラット、 14週齢)側頭筋に注入投与し、以下の条件で MRI画像を取得した。

装置： MRコンソール Varian Unity INOVA、磁石 JASTEC 7T

パルス系列：プロトンデカップルド 13C 2D化学シフトイメージング（no slice selection) 位相エンコード： 8 X 8

撮影視野 (FOV) : 50 X 50 mm²

繰り返し時間： 1秒

マトリックス： 32 X 32

積算測定回数: 8回

全測定時間： 8分 32秒

[0044] 得られた結果を図 8に示す。この結果から、 99%13C-PEG6000によって、 1秒という短い繰り返し時間でも、ラットの側頭筋を鮮明に画像ィ匕して可視化することができることが確認された。

[0045] 実飾 17

99%13C-PEG6000を 0.05mg/ml、 0.5mg/ml又は 5mg/mlとなるように生理食塩水に溶解して、それぞれの lmlを lcm角のキュベットに添カ卩した。それぞれの 99%13C-PEG60 00を添カ卩したキュベットについて、以下の条件で MRI画像を取得した。また、比較として、 10重量％の 13C-glucoseを含む生理食塩水、又は生理食塩水単独を使用して、同様に MRI画像の取得を行った。

装置： MRコンソール Varian Unity INOVA、磁石 JASTEC 7T

パルス系列：プロトンデカップルド 13C 2D化学シフトイメージング（no slice slection) 位相エンコード： 8 X 8

撮影視野 (FOV) : 50 X 50 mm²

マトリックス： 32 X 32

繰り返し時間： 250ミリ秒

積算測定回数: 128回

全測定時間: 34分 [0046] 得られた結果を図 9に示す。図 9から分かるように、 1cm角のキュベットに入った 5mg /mlと 0.5mg/mlの 99%13C-PEG6000は、十分なコントラストで可視化できた。一方、 0.0 5 mg/mlの場合はかなり SN比 (信号雑音比）の低下がみられた力それでもなお、 99% 13C-PEG6000のキュベットの位置は十分に確認できる程度には可視化することができた。

[0047] 実施例 8

99%13C-PEG6000の水溶液を用いて、いくつかの撮像方法で MRI画像を取得し、それらを比較した。具体的には、 99%13C-PEG6000を 30 mg/ml又は 5 mg/mlとなるように純水（H 0)に溶解し、これらをそれぞれ lcm³のキュベットに充填して画像化を行つ

2

た。撮像方法としては、 13Cケミカルシフトイメージング（13C-CSI)、プロトン検出 13C ケミカルシフトイメージング（1H- detected 13C- CSI)、 13Cグラジェントエコー（13C- G RE)、 13Cファストスピンエコー（13C- FSE)の 4種類の撮像方法を用いた。それぞれの撮像は下記に示した条件で行った。

13C-CSI ;マトリックス： 8 x 8, FOV: 50 X 50 mm²,繰り返し時間： 1秒,測定時間： 128 秒

1H- detected 13C- CSI;マトリックス： 8 x 8, FOV: 50 X 50 mm²,繰り返し時間： 1秒，測定時間： 128秒

13C-GRE;マトリックス： 64 x 64, FOV: 50 X 50 mm²,繰り返し時間： 30ミリ秒，測定時間： 123秒，プロトンデカップリング

13C-FSE;マトリックス： 32 X 32, FOV: 50 X 50 mm²,繰り返し時間： 1秒， echo train: 8, echo space: 5ミリ秒、， centric acquisition,測定時間： 64秒、、プロトンデカップリング

[0048] 結果を図 10に示す。図 10中、 aには 13Cケミカルシフトイメージング法（13C- CSI)で撮像した画像、 bにはプロトン検出 13Cケミカルシフトイメージング法（lH-detected 13 C-CSI)で撮像した画像、 cには 13Cグラジェントエコー法（13C- GRE)で撮像した画像、及び dには 13Cファストスピンエコー法（13C- FSE)で撮像した画像を示す。図 10 の a〜dの画像には、上に 99%13C-PEG6000の 5 mg/ml溶液が充填されたキュベット、下に 99%13C-PEG6000の 30 mg/ml溶液が充填されたキュベットが配置されて!、る。

[0049] 99%13C-PEG6000の 5 mg/ml又は 30 mg/ml溶液が充填されたキュベットの!/、ずれでも可視化されたが、今回のような短時間の撮像条件下では、 30 mg/mlの方が明確に可視化できることが確認された。また、 13C- CSI (図 10 a)と lH-detected 13C-CSI( 図 10 b)を比較すると、どちらも SN比や解像度などに関しては大差はみられな力つた。一方、 13C- GRE及び 13C-FSEで撮像した画像は、キュベットの正方形の形が明瞭に認識できた。また、本結果から、 13C- GRE及び 13C-FSEで測定することにより、 13C- CSIや lH-detected 13C-CSIに比較して、同程度の積算時間又はより短時間の積算時間で、高解像度の画像が取得できることが確認された。以上のことより、 13C-PEG を造影剤とした場合でも、 13C-GREや 13C-FSEなどを適切に応用すれば、より短時間で高解像度の画像が取得できる可能性があること示された。

図面の簡単な説明

[図 1]実施例 1において測定した 99%13C- PEG6000 (2.2 mg/ml)と 1%13C- PEG6000(2 2 mg/ml)の 13C- NMR ^ベクトルを示す図である。

[図 2]実施例 2にお!/、て測定した結果、即ち、 13C-ピルビン酸及び 99%13C-PEG6000 の 13C- NMRシグナル強度と待ち時間（Acquisition delay)の関係を示す図である。

[図 3]実施例 2において測定した結果、即ち、 13C-グルコース及び 99%13C-PEG6000 の 13C- NMRシグナル強度と待ち時間（Acquisition delay)の関係を示す図である。

[図 4]実施例 3において測定した結果、即ち、 40° のパルスで、繰り返し時間を 60〜9 60ミリ秒にした場合の 13C-グルコース及び 99%13C-PEG6000の 13C- NMRシグナル強度を示す図である。

[図 5]図 5中、 aは、各精製工程で得られた 1%13C-PEG20000標識 IgGの SDSポリアタリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE)の写真である。 aにおいて、レーン左から、分子量マーカー、標識前 IgG (図中、 IgGと表記）、標識反応後ゲルろ過（Sephacryl S-200 、 Pharmacia)した 1%13C- PEG20000標識 IgG (図中、 gelfiltと表記）、ゲルろ過したものを ProteinAカラムでァフィユティー精製した 1%13C-PEG20000標識 IgG (図中、 ProAと表記）を示す。また、図 5中、 bは、実施例 4において、 1%13C-PEG5000標識 IgG及び 1%13C-PEG20000標識 IgGの 13C- NMR ^ベクトルを測定した結果である。

[図 6]99%13C-PEG6000と、 1%13C-PEG5000標識 IgGのシグナル半値幅の比較を示す図である。 [図 7]実施例 5で得られた NMR ^ベクトルを示す図である。 aは 1%13C- PEG35000 0.5 mg/ml (14.2 M)の NMR ^ベクトルである。 bは 1%13C- PEG500000 0.5 mg/ml (1.0 μ M)の NMR ^ベクトルである。 cは 1%13C- PEG2000000 0.5 mg/ml (0.25 μ M)の NM Rスペクトルである。

[図 8]実施例 6で得られた MRI画像を示す図である。図 8中、 aはプロトン画像; bは 99% 13C-PEG6000の 13C-ィ匕学シフト画像、青で表示する； cは、ラットの側頭筋に内在する脂肪の 13C-化学シフト画像、赤で表示する； dはプロトン画像の上に 99%13C-PEG6 000の 13C-ィ匕学シフト画像、及び内在脂肪の 13C-ィ匕学シフト画像を重ねて表示したもの； eはプロトン画像の上に 99%13C-PEG6000の 13C-化学シフト画像を重ねて表示したもの; fは、プロトン画像の上に内在脂肪の 13C-ィ匕学シフト画像を重ねて表示したものを、それぞれ示す。

[図 9]実施例 7で得られた MRI画像を示す図である。 aは 5 mg/mlの 99%13C-PEG6000 の画像 [上の写真：プロトン画像。左上のキュベットは 10重量％ 13C- glucose、右上のキュベットは 5mg/mlの 13C- PEG6000、下のキュベットは生理食塩水が入っている。下の写真： 13C- PEG6000の CSI画像]である。 bは 0.5 mg/mlの 99%13C- PEG6000の画像 [上の写真：プロトン画像。左のキュベットは生理食塩水、右のキュベットは 0.5 mg/ mlの 13C- PEG6000が入っている。下の写真： 13C- PEG6000の CSI画像]である。 cは 0 .05 mg/mlの 99%13C- PEG6000の画像 [上の写真：プロトン画像。左のキュベットは生理食塩水、右のキュベットは 0.05 mg/mlの 99%13C- PEG6000が入っている。中段の写真： 99%13C-PEG6000の CSI画像。下の写真：画像処理により中段の画像のノイズレベルをカットしたもの。 0.05 mg/mlの 99%13C- PEG6000の存在が明確に認識できる。 ] である。

[図 10]実施例 8で得られた MRI画像を示す図である。図 10中、 aは 13Cケミカルシフトイメージング法（13C-CSI)で撮像した画像; bはプロトン検出 13Cケミカルシフトィメージング法（1H- detected 13C- CSI)で撮像した画像； cは 13Cグラジェントエコー法（13 C- GRE)で撮像した画像;及び dは 13Cファストスピンエコー法（13C- FSE)で撮像した画像を示す。なお、 a- dの画像中、上には 5 mg/mlの 99%13C- PEG6000のキュベット、及び下には 30 mg/mlの 99%13C-PEG6000のキュベットが置かれ、 2つのキュベットが縦に配置されている。

Claims

請求の範囲

[1] 60秒以下の繰り返し時間で励起磁場のパルスを印加して磁気共鳴信号を連続的に取得するために使用される、

磁気共鳴造影剤。

[2] 前記ポリエチレングリコールの 13Cの割合力全炭素原子の 20〜100%である、請求項 1に記載の磁気共鳴造影剤。

[3] 前記ポリエチレングリコールの重量平均分子量が 470〜10000000である、請求項 1 に記載の磁気共鳴造影剤。

[4] 前記化合物が、天然存在比以上の割合で 13Cを含むポリエチレングリコールで標識された抗体である、請求項 1に記載の磁気共鳴造影剤。

[5] 天然存在比以上の割合で 13Cを含むポリエチレングリコール、又は該ポリエチレングリコールで標識された化合物を含有する磁気共鳴造影剤が投与された被験体に対して、 60秒以下の繰り返し時間で励起磁場のノルスを印加することにより磁気共鳴信号を連続的に取得して画像化することを特徴とする、磁気共鳴撮像方法。

[6] 前記ポリエチレングリコールの 13Cの割合力全炭素原子の 20〜100%である、請求項 5に記載の磁気共鳴撮像方法。

[7] 前記ポリエチレングリコールの重量平均分子量が 470〜10000000である、請求項 5 に記載の磁気共鳴撮像方法。

[8] 前記化合物が、天然存在比以上の割合で 13Cを含むポリエチレングリコールで標識された抗体である、請求項 5に記載の磁気共鳴撮像方法。

[9] 天然存在比以上の割合で 13Cを含むポリエチレングリコール、又は該ポリエチレングリコールで標識された化合物を含有する磁気共鳴造影剤が投与された被験体に対して、 60秒以下の繰り返し時間で励起磁場のノルスを印加することにより磁気共鳴信号を連続的に取得することを特徴とする、磁気共鳴信号の取得方法。

[10] 天然存在比以上の割合で 13Cを含むポリエチレングリコール、又は該ポリエチレングリコールで標識されたィ匕合物の、 60秒以下の繰り返し時間で励起磁場のパルスを印加して磁気共鳴信号を連続的に取得するために用いられる磁気共鳴造影剤の製造のための使用。

天然存在比以上の割合で 13Cを含むポリエチレングリコール、又は該ポリエチレングリコールで標識されたィ匕合物の、

60秒以下の繰り返し時間で励起磁場のパルスを印加して磁気共鳴信号を連続的に取得するための使用。