WO2007141208A2 - Mikrobiologische herstellung von 3-hydroxyisobuttersäure - Google Patents

Mikrobiologische herstellung von 3-hydroxyisobuttersäure Download PDF

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    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01017—Enoyl-CoA hydratase (4.2.1.17), i.e. crotonase

Definitions

  • the present invention relates to their wild-type genetically modified cells, methods for producing a genetically modified cell, the genetically modified cells obtainable by these methods, a method for producing 3-hydroxyisobutyric acid or polyhydroxyalkanoates based on 3-hydroxyisobutyric acid , a process for producing methacrylic acid or methacrylic acid esters, and a process for producing polymethacrylic acid or polymethacrylic acid esters.
  • the present invention further relates to an isolated DNA, a vector, the use of this vector for the transformation of a cell, a transformed cell and a polypeptide.
  • Methacrylic acid is a significant intermediate which finds particular use in the form of its alkyl esters for the preparation of polymers.
  • a known methacrylic acid derivative is, for example, the methyl ester of methacrylic acid.
  • methyl methacrylate is about 1.5 million tonnes.
  • the polymethacrylic esters are versatile raw materials in the plastics sector.
  • methacrylic acid is usually carried out by heterogeneous, two-stage catalyzed gas phase oxidation of C 4 -carbon compounds such as butylene, isobutylene, butane, isobutane, t-butyl alcohol or methacrolein on solid multimetal oxide as a catalyst.
  • C 4 -carbon compounds such as butylene, isobutylene, butane, isobutane, t-butyl alcohol or methacrolein on solid multimetal oxide as a catalyst.
  • Methacrylic acid still contains numerous by-products, is then either subjected to a total condensation to obtain an aqueous methacrylic acid solution or absorbed in a suitable solvent mixture. After that usually follows a further purification of the thus obtained liquid phases by distillation, crystallization, extraction or by a combination of these measures.
  • methacrylic acid can also be formed by a catalytic, oxidative dehydrogenation of isobutyric acid, as described for example in EP-A-0 356 315.
  • ACH process Another possibility for the production of methacrylic acid is provided by the so-called "ACH process", in which acetone cyanohydrin and sulfuric acid are reacted to form methacrylamide as an intermediate, which then reacts further with water to give methacrylic acid. Subsequently, a distillative purification of the resulting methacrylic acid. This method is described for example in EP-AI 359 137.
  • the disadvantage of these conventional processes for the preparation of methacrylic acid is, inter alia, the formation of dimers or oligomers both during the preparation of the methacrylic acid itself and during the subsequent distillative purification steps owing to the high tendency of the methacrylic acid to polymerize due to the thermally stressing process steps , which in addition to the additional Aufthesesaufwand is also associated with a yield loss.
  • the object of the present invention was to overcome the disadvantages resulting from the prior art.
  • the present invention was based on the object of specifying a process for the preparation of methacrylic acid in which the methacrylic acid can be obtained with as few thermally stressing steps as possible.
  • this method should make it possible to produce the methacrylic acid from renewable resources, in particular from carbohydrates and / or from glycerol.
  • a contribution to achieving the abovementioned objects is made by a cell which has been genetically modified in comparison with its wild type in such a way that it is capable of producing more 3-hydroxyisobutyric acid or polyhydroxyalkanoates based on 3-hydroxyisobutyric acid, but preferably more 3-hydroxyisobutyric acid, this formation preferably takes place via methylmalonate-semialdehyde or via 3-hydroxyisobutyryl-coenzyme A as precursor.
  • 3-hydroxyisobutyric acid or of 3-hydroxyisobutyric acid-based polyhydroxyalkanoates via 3-hydroxyisobutyryl-coenzyme A is carried out as precursor, it is furthermore preferred that the formation via isobutyryl-coenzyme A or via 3-hydroxybutyryl-coenzyme A, preferably via 3-hydroxybutyryl-coenzyme A as a further intermediate.
  • precursor as used herein defines a chemical compound that can be enzymatically converted to 3-hydroxyisobutyric acid in a single reaction step, while the term “intermediate” defines a chemical compound that is not in the art only one reaction step can be reacted enzymatically to 3-hydroxyisobutyric acid.
  • 3-hydroxyisobutyric acid always describes the corresponding C 4 - carboxylic acid in the form in which it depends upon formation by the corresponding microorganisms of the pH value is present.
  • the term thus always includes the pure acid form (3-hydroxyisobutyric acid), the pure base form (3-hydroxyisobutyrate) and mixtures of protonated and deprotonated form of the acid.
  • the term "3-hydroxyisobutyric acid” basically includes both the (R) and the (S) stereoisomer, with the (S) stereoisomer being particularly preferred.
  • the phrase "that it is capable of producing more 3-hydroxyisobutyric acid or 3-hydroxyisobutyric acid-based polyhydroxyalkanoates” also relates to the case that the wild type of the genetically engineered cell does not produce any 3-hydroxyisobutyric acid or 3-hydroxyisobutyric acid-based polyhydroxyalkanoates However, at least no detectable amounts of these compounds can form and detectable amounts of these components can be formed only after the genetic modification.
  • a wild-type cell is preferably referred to as a cell whose genome is in a state as naturally produced by evolution, and is used for both the entire cell and for individual genes. fall therefore in particular not such cells or genes whose gene sequences have been at least partially modified by humans by recombinant methods.
  • 3-hydroxyisobutyric acid From the 3-hydroxyisobutyric acid can then be obtained by a gentle dehydration methacrylic acid.
  • the vesicles contained in the cells, which are filled with these polyhydroxyalkanoates can be isolated and subsequently the polymers can be cleaved to give 3-hydroxyisobutyric acid, which can then be dehydrated to give methacrylic acid.
  • the genetically modified cell prefferably to be genetically modified in such a way that it is particularly preferred within a defined time interval, preferably within 2 hours, more preferably within 8 hours, and most preferably within 24 hours, at least 2 times at least 100 times, moreover preferably at least 100 times, more preferably at least 100 times, and most preferably at least 10 000 times more 3-
  • Hydroxyisobutyric acid or 3-hydroxyisobutyric acid based polyhydroxyalkanoates forms as the wild type of the cell.
  • the increase in product formation can be determined, for example, by culturing the cell according to the invention and the wild-type cell separately under the same conditions (same cell density, same nutrient medium, same culture conditions) for a specific time interval in a suitable nutrient medium and then the amount Target product (3-hydroxyisobutyric acid or based on 3-hydroxyisobutyric acid polyhydroxyalkanoates) is determined in the nutrient medium.
  • the cells according to the invention can be prokaryotes or eukaryotes. These may be mammalian cells (such as human cells), plant cells, or microorganisms such as yeasts, fungi or bacteria, with microorganisms being most preferred and bacteria and yeasts being most preferred.
  • bacteria, yeasts or fungi are those bacteria, yeasts or fungi which are deposited as bacterial, yeast or fungal strains in the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ), Braunschweig, Germany.
  • Bacteria suitable according to the invention belong to the genera which can be found at http: // www. dsmz. de / species / bacteria.htm Yeasts which are suitable according to the invention belong to those genera which are listed under
  • Particularly preferred cells according to the invention are those of the genera Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Acinetobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Candida, Pichia, Kluveromyces, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Burkholderia and Clostridium, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Kluveromyces lactis, Candida blankii, Candida rugosa, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Zymonomas mobilis, Yarrowia lipolytica, Methylobacterium exporquens, Ralstonia eutropha, in particular Ralstonia eutropha H16, Rhodos
  • the formation of 3-hydroxyisobutyric acid or of polyhydroxyalkanoates based on 3-hydroxyisobutyric acid via methylmalonate-semialdehyde takes place as precursor.
  • this first variant of the cell according to the invention it is preferred that the formation of the 3-hydroxyisobutyric acid or of the 3- Hydroxyisobutyric acid-based polyhydroxyalkanoates preferably via succinyl-coenzyme A as an intermediate, wherein the cell preferably makes use of carbohydrates, glycerol or glutamate as carbon source.
  • the cell according to the invention may be advantageous for the cell according to the invention to have an increased activity of an enzyme Ei which catalyzes the conversion of succinyl-coenzyme A to methylmalonyl-coenzyme A in comparison to its wild type (see Figure 1).
  • the term "increased activity of an enzyme” as used above in connection with the enzyme Ei and in the following statements in connection with the enzymes E 2 , etc., is preferably to be understood as an increased intracellular activity.
  • an increase in the enzymatic activity can be achieved by increasing the copy number of the gene sequence or of the gene sequences which code for the enzyme, use a strong promoter or use a gene or allele which, for a corresponding enzyme, has an increased Activity encoded and, where appropriate, combined these measures.
  • Genetically engineered cells according to the invention are produced for example by transformation, transduction, conjugation or a combination of these methods with a vector which contains the desired gene, an allele of this gene or parts thereof and a vector which enables expression of the gene.
  • the heterologous expression is particularly due to integration of the Gene or allele into the chromosome of the cell or an extrachromosomally replicating vector.
  • the expression of the above and of all the enzymes and genes mentioned below can be detected in the gel with the aid of 1- and 2-dimensional protein gel separation and subsequent optical identification of the protein concentration with appropriate evaluation software. If the increase in enzyme activity is based solely on an increase in the expression of the corresponding gene, the quantification of the increase in enzyme activity can be determined in a simple manner by a comparison of the 1- or 2-dimensional protein separations between wild-type and genetically modified cell.
  • a common method for the preparation of the protein gels in co-ryneform bacteria and for the identification of the proteins is that of Hermann et al.
  • the protein concentration can also be determined by Western blot hybridization with an antibody specific for the protein to be detected (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY USA, 1989) and subsequent optical evaluation with appropriate concentration determination software (Lohaus and Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39;
  • DNA-binding proteins can be measured by DNA band shift assays (also called gel retardation) (Wilson et al., (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155).
  • DNA band shift assays also called gel retardation
  • the effect of DNA-binding proteins on the expression of other genes can by various well-described methods of reporter gene assays (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd ed. CoId Spring Harbor Laboratory Press, ColD Spring Harbor, NY USA, 1989).
  • the intracellular enzymatic activities can be determined by various methods described (Donahue et al., (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627; Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277-2284; berg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816-823). Unless specific methods for determining the activity of a particular enzyme are specified in the following, the determination of the increase in the enzyme activity and also the determination of the reduction of an enzyme activity are preferably carried out by means of the methods described in Hermann et al. , Electophoresis, 22: 1712-23 (2001), Lohaus et al.
  • mutations can be generated either undirected by conventional methods, for example by UV irradiation or by mutation-triggering chemicals, or specifically by means of genetic engineering methods such as deletion (s). Insertion (s) and / or nucleotide exchange (s). These mutations result in genetically engineered cells.
  • Particularly preferred mutants of enzymes are, in particular, also those enzymes which are no longer or at least reduced in their ability to be inhibited by jfeedfoacfc compared to the wild-type enzyme.
  • the increase in the enzyme activity is accomplished by increasing the expression of an enzyme, for example, the copy number of the corresponding genes is increased or the promoter and regulation region or the ribosome binding site located upstream of the structural gene is mutated.
  • expression cassettes which are installed upstream of the structural gene.
  • the enzyme gene can be assigned as regulatory sequences but also so-called “enhancers” which also cause an increased gene expression via an improved interaction between RNA polymerase and DNA. Measures to extend the lifetime of m-RNA also improve expression.
  • the enzymatic activity is also enhanced by preventing degradation of the enzyme protein.
  • genes or gene constructs are either present in plasmids with different copy numbers or are integrated and amplified in the chromosome. Alternatively, overexpression of the genes in question can be achieved by altering the composition of the medium and culture.
  • the skilled person will find, inter alia, in Martin et al. (Bio / Technology 5, 137-146 (1987)), Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya and Morinaga (Bio / Technology 6, 428-430 (1988)), in Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in EP-A-0 472 869, in US Pat. No.
  • episomal plasmids are used, for example. Suitable plasmids are in particular those which are replicated in coryneform bacteria.
  • Numerous known plasmid vectors such as pZI (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology 64: 549-554 (1989)), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 107: 69-74 (1991)) or pHS2-l (Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)) the cryptic plasmids pHM1519, pBLI or pGAl.
  • Other plasmid vectors such as those based on pCG4 (US 4,489,160) or pNG2
  • plasmid vectors by means of which one can apply the method of gene amplification by integration into the chromosome, as described for example by Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60: 126-132 (1994)) for duplication or amplification of the hom-thrB operon.
  • the complete gene is cloned into a plasmid vector which can be replicated in a host (typically Escherichia coli) but not in Corynebacterium glutamicum.
  • vectors used are pSUP301 (Simon et al., Bio / Technology 1: 784-791 (1983)), pK18mob or pK19mob (Schäfer et al., Gene 145: 69-
  • an activity of an enzyme E x which is increased with respect to its wild-type is preferably always an additional factor of at least 2, more preferably of at least 10, moreover of at least 100, moreover more preferably of at least 1,000 and most preferably at least 10,000 increased activity of the respective enzyme E x
  • the cell according to the invention comprising "an activity of an enzyme E x increased compared to its wild type” comprises in particular also a cell whose wild-type has no or at least no detectable activity of this enzyme E x and only after increasing the enzyme activity, for example by overexpression, a detectable activity of this enzyme E x shows.
  • the term "overexpression” or the expression “increase in expression” used in the following embodiments also encompasses the case in which a starting cell, for example a wild-type cell, has no or at least no detectable expression and only by recombinant methods a detectable Expression of the enzyme E x is induced.
  • reduced activity of an enzyme E x it is preferable to use a factor of at least 0.5, more preferably at least 0.1, more preferably at least 0.01, even more preferably at least
  • the reduction of the activity of a particular enzyme may be achieved, for example, by targeted mutation, by addition of competitive or non-competitive inhibitors, or by other methods known to those skilled in the art. man known measures to reduce the expression of a particular enzyme done.
  • the enzyme Ei which catalyzes the conversion of succinyl-coenzyme A to methylmalonyl-coenzyme A, is preferably a methylmalonyl-coenzyme A mutase (EC 5.4.99.2).
  • This enzyme is preferably encoded by the genes selected from the group consisting of mut, mutA, mutB, sbm, sbmA, sbmB, sbm5, bhbA, mcmA, mcmAl, mcmA2, mcmB, mcmI, mcm2, mcm3, icmA, meaAl and meaA2.
  • nucleotide sequences of these genes can be found, for example, in the "Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes” (KEGG database), the National Library for Biotechnology Information (NCBI) databases of the National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) or the nucleotide sequence. Database of European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Germany and Cambridge, UK).
  • the enzyme Ei is the methylmalonyl-coenzyme A mutase from Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, which is derived from a gene having the DNA sequence according to SEQ. ID No. 01 and the amino acid sequence according to SEQ. ID No. 02 has.
  • the cell in which succinyl-coenzyme A is formed as intermediate and methylmalonate-semialdehyde as precursor in the preparation of 3-hydroxyisobutyric acid or of polyhydroxyalkanoates based on 3-hydroxyisobutyric acid, it is preferred that the cell, optionally in addition to the increased activity of the enzyme egg, has an increased activity compared to its wild type at least one of the following enzymes E2 to E 4 (see Figure 2): an enzyme E2, which is the reaction of methylmalonyl coenzyme A to Catalyses methylmalonate; an enzyme E3, which catalyzes the conversion of methylmalonate to methylmalonate semialdehyde; an enzyme E 4 , which catalyzes the conversion of methylmalonate semialdehyde to 3-hydroxyisobutyric acid.
  • an enzyme E2 which is the reaction of methylmalonyl coenzyme A to Catalyses methylmalonate
  • an enzyme E3 which cataly
  • Particularly preferred cells according to the invention are those in which the activity of the following enzymes or enzyme combinations is increased: E 2 , E 3 , E 4 , E 2 E 3 , E 2 E 4 , EaE 4 , E 2 EaE 4 , where E 2 is EE 4 is most preferred. Furthermore, it is possible that an enzyme can also catalyze at least two of the reaction steps described above.
  • an enzyme can be used which has both the activity of the enzyme E 2 and that of the enzyme E 3 (and thus catalyzes the conversion of methylmalonyl coenzyme A directly to the methylmalonate semialdehyde), such as, for example, the malyonyl Co-enzyme A-reductase from Sulfolobus tokaii, which is derived from the DNA sequence with the Seq. ID. -No. 03 is coded and which the amino acid sequence according to Seq. ID. -No.
  • E 2 , E 3 and E 4 an enzyme which has all three enzyme activities E 2 , E 3 and E 4 , such as the malonyl-coenzyme A reductase from Chloroflexus aurantiacus (Hügler et al., Journal of Bacteriology 184, pages 2.404-2.410, 2002).
  • the enzyme E 2 is a methylmalonyl-coenzyme A-hydrolase (EC 3.1.2.17),
  • E3 an aldehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.3) or an aldehyde oxidase (EC 1.2.3.1) and
  • E 4 is a 3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase (EC 1.1.1.31) or a 3-hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase (EC 1.1.1.35)
  • the enzyme E2 is preferably encoded by the aox1 gene.
  • the rat liver methylmalonyl-coenzyme A-hydrolase is described, for example, in Kovachy et al., "Recognition, isolation, and characterization of rat liver D-methylmalonyl coenzyme A hydrolase", J. Biol. Chem. 258 (1983). , Pages 11,415-11,421.
  • the enzyme E3 is preferably selected from genes selected from the group consisting of aldh2, aldh3al, aldh3a2, aldhlbl, aldh9al, aldh7al, aldhla4, aldhlal, aldhla2, mgc80785, mgc83352, mgc89020, dmel-CG31075, cg3752, cg9629, alh-9, al -1, alh-2, f5O8.35, t7O23.15, fl5I1.19, tT17F15.130, aldl, ald2, ald4, ald5, ald ⁇ , aclO44Wp, adr417wp, msc7, tb06.5F5.780, aldH, puuC, putA aldA, badH, alkH, pcD, rspl591, rs01031, exaC, acoD, dhaL, pch
  • Suitable genes for the enzyme E 4 are selected from the group consisting of hibadh, cgl5093, cgl5093, cg4747, mwL2.23, tl3kl4.90, fl9bl5.150, hibA, ygbJ, mmsB, mmsB, garR, tsar, mmsB-1, mmsB-2, yfjR, ykwC, ywjF, hibD, glxR, SCMI.40c, hibD, ehhahd, hadh2, hadhsc, hsdl7B4, Ioc488110, had, mgC81885, hadh2-prov, cg3415, cg7113, ech-1, ech-8, ech-9, ard-1, yfcX, fadB, faoA, fadB2x, hbd-1, hbd-2, hb
  • 3-hydroxyisobutyrate dehydrogenases are described, for example, in Bannerjee et al. (1970), J. Biol. Chem, 245, pp. 1828-1835, Steele et al. (1992), J. Biol. Chem., 267, pages 13,585 to 13,592, Harris et al. (1988), J. Biol. Chem., 263, pages 327 to 331, Harris et al. , Biochim. Biophys. Acta,
  • nucleotide sequences of the abovementioned genes and of further genes for the enzymes E 2 to E 4 can be taken from among others the KEGG database, the NCBI database or the EMBL database.
  • succinyl coenzyme A is formed as an intermediate and methylmalonate semialdehyde as a precursor in the preparation of 3-hydroxyisobutyric acid or of 3-hydroxyisobutyric acid based polyhydroxyalkanoates
  • succinyl coenzyme A is formed as an intermediate and methylmalonate semialdehyde as a precursor in the preparation of 3-hydroxyisobutyric acid or of 3-hydroxyisobutyric acid based polyhydroxyalkanoates
  • the malonyl-coenzyme A-reductase from Sulfolobus tokodaii is used, which of DNA sequence with the Seq. ID. -No. 03 is coded and which the amino acid sequence according to Seq. ID No. 04 has.
  • the mono-a-coenzyme A reductase from Chloroflexus aurantiacus is used.
  • the cell in connection with this first alternative of the first particular embodiment of the cell according to the invention, it is preferable for the cell to have an activity of an enzyme E 5 which is reduced compared to its wild-type and which has the conversion of methylmalonate semialdehyde into propionyl-coenzyme A, this enzyme is preferably a methylmalonate semialdehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.27).
  • Hydroxyisobutyric acid-based polyhydroxyalkanoates are formed, it is preferred that the cell, optionally in addition to the increased activity of the enzyme egg, an increased compared to their wild-type activity of at least one of the following enzymes E 4 to E 7 (see Figure 3): one Enzyme E 6 , which catalyzes the conversion of (R) -methylmalonyl-coenzyme A to (S) -methylmalonyl-coenzyme A; an enzyme E 7 , which is the reaction of (S) -
  • Methylmalonyl coenzyme A catalyzed to propionyl-coenzyme A; an enzyme E 5 , which catalyzes the conversion of propionyl coenzyme A to methylmalonate semialdehyde; an enzyme E 4 which catalyzes the conversion of methylmalonate semialdehyde to 3-hydroxyisobutyric acid.
  • Particularly preferred cells according to the invention are those in which the activity of the following enzymes or enzymes Increased zymkombinationen: E 4 , E 5 , E 6 , E 7 , E 4 E 5 , E 4 E 6 , E 4 E 7 , E 5 E 6 , E 5 E 7 , E 6 E 7 , E 4 E 5 E 6 , E 4 E 5 E 7 , E 4 E 6 E 7 , E 5 E 6 E 7 and E 4 E 5 E 6 E 7 , wherein E 4 E 5 E 6 E 7 is most preferred.
  • E 6 is a methylmalonyl-coenzyme A-epimerase (EC 5.1.99.1)
  • E 7 is a methylmalonyl-coenzyme A decarboxylase (EC 4.1.1.41), E 5 is a methylmalonate semialdehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.27), and
  • E 4 is a 3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase (EC 1.1.1.31) or a 3-hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase (EC 1.1.1.35)
  • Preferred enzymes E 4 are those which have already been described above in connection with the first variant of the first preferred embodiment of the cell according to the invention.
  • the enzyme E 6 is preferably encoded by the mcee gene.
  • a suitable methylmalonyl-coenzyme A decarboxylase (enzyme E 7 ) is described, for example, in Biochemistry, Vol. 39 (2000), pages 4,630-4,639 by Benning et al. described.
  • Suitable genes for the enzyme E 5 are preferably selected from the group consisting of aldh ⁇ al, cgl7896, t22cl2.10, ald ⁇ , putAl, mmsA, mmsA-1, mmsA-2, mmsA-3, mmsA-4, msdA, iolA and iolAB ,
  • Suitable genes for the enzyme E 7 are preferably selected from the group consisting of mmdA, bcc, oadB, oadB2, oadB3, SC1C2.16, SC1G7.10, pccBl, accA2, mmdB, mmdC and ppcB.
  • the nucleotide sequences of the abovementioned genes for the enzymes E 5 , E 6 and E 7 can also be taken from the KEGG database, among others.
  • Hydroxyisobutyric acid-based polyhydroxyalkanoates are formed, it is preferred that the cell, optionally in addition to the increased activity of the enzyme egg, an increased compared to their wild-type activity of at least one of the following enzymes E 4 , E 5 and E 7 (see FIG. 4): an enzyme E 7 which catalyzes the conversion of methylmalonyl-coenzyme A to propionyl-coenzyme A; an enzyme E 5 , which catalyzes the conversion of propionyl coenzyme A to methylmalonate semialdehyde; an enzyme E 4 , which catalyzes the conversion of methylmalonate semialdehyde to 3-hydroxyisobutyric acid.
  • an enzyme E 7 which catalyzes the conversion of methylmalonyl-coenzyme A to propionyl-coenzyme A
  • an enzyme E 5 which catalyzes the conversion of propionyl coenzyme A to methylmalonate semial
  • This route essentially corresponds to the second variant of the first preferred embodiment of the cell according to the invention, but in contrast to the second variant, the preparation of propionyl-CoA is carried out directly from methyl-monyl-coenzyme A.
  • Preferred enzymes and genes for the enzymes E 4 , E 5 and E 7 are those genes or enzymes which have already been mentioned above in connection with the second variant.
  • the cell is capable of forming the cell formed Convert 3-hydroxyisobutyric acid into a polyhydroxyalkanoate.
  • polyhydroxyalkanoates are deposited intracellularly by many microorganisms in the form of highly refractive granules.
  • the cell according to the invention has an activity which is increased in comparison with its wild type of at least one of, preferably the two following enzymes Eg and Eio (see FIG. 5):
  • Hydroxyisobutyric acid catalyzed to 3-hydroxyisobutyryl-coenzyme A; of an enzyme Eg, which catalyzes the conversion of 3-hydroxyisobutyryl-coenzyme A into a 3-hydroxyisobutyric acid-based polyhydroxyalkanoate.
  • E 8 is a 3-hydroxyisobutyryl CoA hydrolase (EC 3.1.2.4) and Eg a polyhydroxyalkanoate synthase
  • Hydroxyisobutyric acid-based polyhydroxyalkanoates from succinyl-coenzyme A as intermediate and from methylmalonate-semidaldehyde as precursor. It may be useful in principle, in addition to influencing one or more of the above-mentioned enzyme activities Ei to E 9 to influence such enzyme activities, which an increase in the formation of succinyl coenzyme A in the cell.
  • the formation of 3-hydroxyisobutyric acid or polyhydroxyalkanoate based on 3-hydroxyisobutyric acid via succinyl-coenzyme A as intermediate and methylmalonate-semialdehyde as precursor of carbohydrates or glycerol it is according to a particular Embodiment of the above-described first, second or third alternative of the cell according to the invention, it is preferred for the cell to have an activity which is increased in comparison with its wild type of at least one, preferably the following two enzymes Ei 0 and En (see FIG. 6):
  • an enzyme Eio which catalyzes the conversion of phosphoenol pyruvate into oxaloacetate
  • an enzyme En which catalyzes the conversion of pyruvate to oxaloacetate.
  • the enzyme Ei 0 is preferably encoded by the genes selected from the group comprising fl2ml6.21, fl4n22.13, kl5m2.8, ppc, clpA, pepC, capP, cglI585, pepC, pck, ppc and pccA, the ppc gene is particularly preferred.
  • Phosphoenolpyruvate carboxylases which are preferred according to the invention are in particular also disclosed in US Pat. No. 4,757,009, US Pat. No. 4,980,285, US Pat. US 5,573,945, US 6,872,553 and US 6,599,732. The disclosure of these references for phosphoenolpyruvate carboxylases is hereby incorporated by reference and forms part of the disclosure of the present invention.
  • Enzyme En is preferably selected from the group consisting of pc, pcx, cgl516, cgl516, pyc-1, pyc-2, aarl62Cp, pyrl, accC-2, pycA, pycA2, pca, cglO689, pyc, pycB, accC , oadA, acc and accCl, the pyc gene being particularly preferred.
  • Pyruvate carboxylases preferred according to the invention are also described in particular in US Pat. Nos. 6,455,284, 6,171,833, 6,884,606, 6,403,351, 6,852,516 and 6,861,246.
  • Another pyruvate carboxylase which is particularly preferred according to the invention is that mutant which is described in "A novel methodology employing Corynebacterium glutamicum genome information to generate a novel L-lysine-producing mutant.”, Ohnishi J et al., Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 58 (2), pages 217-223 (2002)
  • the nucleotide sequences of suitable enzymes of enzymes En and E 12 can be found in the KEGG database, NCBI database or EMBL database.
  • the cell in which methylmalonate-semialdehyde is formed as precursor and succinyl-coenzyme A as intermediate, it is preferred that the cell, if appropriate in addition to an increased activity of the enzyme Ei 0 or En, one in comparison to their wild type increased activity of at least one of the following enzymes E 12 to Ei 5 has (see Figure 7): an enzyme E 12 , which catalyzes the conversion of oxaloacetate to malate; an enzyme Ei 3 , which catalyzes the conversion of malate to fumarate; an enzyme Ei 4 , which catalyzes the conversion of fumarate to succinate; of an enzyme Ei 5 , which catalyzes the conversion of succinate to succinyl coemzyme A.
  • Particularly preferred cells according to the invention are those in which the activity of the following enzymes or enzyme combinations is increased: E 12 , E 13 , Ei 4 , Ei 5 , Ei 2 Ei 3 , E 12 E 14 , Ei 2 Ei 5 , E 13 E 14 , Egg 3 egg 5 , egg 4 egg 5 , egg 2 egg 3 egg 4 , egg 2 egg 3 egg 5 , egg 2 egg 4 egg 5 , egg 3 egg 4 egg 5 , egg 2 egg 3 egg 4 egg 5 , taking egg 2 egg 3 egg 4 egg 5 is most preferred.
  • the enzyme E 12 is preferably selected from the group consisting of mdhl, mdh2, morl, cglO748, cglO749, cg5362, mdh-1, f46el0.10, fl9pl9.13, fl2ml6.14, t30120.4, kl5.n2.16, flp2.70, fl7il4.150, mnll2.18, mikl9.17, mdh3, adll64cp, adrl52cp, adr252wp, mdhA, mdhC, mdhB, ybiC, mdh, yiaK, ybiC, allD, citH, yjmC, citH, cgl2380, ldh, sqdB, mqo, yojH, mqoA, mqoB, mqol, m
  • the enzyme E13 is preferably selected from the group consisting of fh, fhl, sc4094, sc4095, t30b22.19, k3k7.11, acrO13Cp, fum1, fum2, fum3, fum4, fumH, fumA, fumB, fumC, fumCl, fumC2, fum, ttdA, ttdB, fumB-alpha, fumB-beta, citG, citB, fumX, fum-1 and fum-2, the fum gene being particularly preferred.
  • the enzyme Ei 4 is preferably selected from the group consisting of sdhl, sdh2, sdh3, sdh4, sdh5, sdh ⁇ , osml, osm2, sdhA, sdhB, sdhC, sdhD, frdA, frdB, frdC, frdD, ifcA-1, ifcA -2, sdhB-1, sdhB-2, frdC2, cgl0370, cglO371, cglO372, scmlO.lOc, scmlO.llc, scmlO.12c, sc5g8.25c, sc5g8.26c, scbac-31ell .02c, scbac31ell .02c, sc4bl0 .
  • the enzyme Ei 5 is preferably selected from genes from the group comprising suclgl, suclg2, Ioc434885, cgl0622, dmel-CG6255, flla3.3, f8115.30, mkd115.l, iscl, Isc2, ael211wp, afrl34cp, scsA, scsB, sucC and sucD encoded.
  • nucleotide sequences of suitable genes of the enzymes E12 to E 15 can in turn also be taken from the KEGG database, the NCBI database or EMBL database.
  • an enzyme E i6 which contains the Conversion of oxaloacetate to citrate catalyzed
  • an enzyme Ei 7 which catalyzes the conversion of malate to oxaloacetate
  • an enzyme Ei 8 which catalyzes the conversion of succinyl coenzyme A to succinate
  • an enzyme Ei 9 which catalyzes the conversion of oxaloacetate to phosphoenolpyruvate
  • an enzyme E 20 which catalyzes the conversion of oxaloacetate to pyruvate
  • an enzyme E21 which catalyzes the conversion of oxaloacetate to aspartate
  • an enzyme E 22 which catalyzes the conversion of malate to pyruvate
  • an enzyme E23 which catalyzes the conversion of
  • E19 is a phosphoenolpyruvate carboxykinase (EC 4.1.1.49 or 4.1.1.32),
  • E 2 O is an oxaloacetate decarboxylase (EC 4.1.1.3)
  • E 2 i is an aspartate transaminase (EC 2.6.1.1)
  • E 22 a malate dehydrogenase (EC 1.1.1.38, EC 1.1.1.39 or EC 1.1.1.40), E 23 a pyruvate dehydrogenase (EC 1.2.1.51), is.
  • the enzyme Ei6 is preferably selected from genes selected from the group comprising glt, csl, cg3861, cts-1, f7fl9.21, f4il.l6, t20nl0.90, t20nl0.100, t2O9.80, citl, cit2, cit3, aar004cp, agr002wp, cshA, gltA, citZ, cit, prpC, cisY, ice, mmgD, citA, gltAl, gltA2, gltA3, cglO829, prPCl, scdl0.20, citAl, citA2, citA3, acly, cg8322, f5e6.2, k7jJ8.14 and cite, with gltA being the most preferred.
  • the enzyme E19 is preferably encoded by genes selected from the group comprising pckA, pckI, pck2, cglO924, cgl7725, cgl7725, pckG, ppcK, cgl2863, pek and 2sck36.02.
  • the enzyme E 2 o is preferably encoded by genes selected from the group comprising oadA, oadB, oadC, oadG, oag3, eda, dcoA, oadAl, oadA2, pycB and mmdB.
  • the enzyme E21 is preferably selected from the group consisting of myn8.7, gltl, adr290wp, gltB, gltD, gltl, glsl, gltA, glt, glxD, gltDl, gltD2, gdh2, agl040Cp, gdhAl, gdhA, gdhA2, gluD, gluDl, gluD2, rocG, ypcA, gudB, tllil8.2, t2il.l50, mrg7.13, fl9c24.7, gdh, gdhl, gdh2, gdh3, gotl, got2, cg4233, cg8430, f23nl9.17, fl3jll.l6, t26cl9.9, f7fl.l8, F10N7.200
  • the enzyme E21 is preferably selected from the group consisting of myn8.7, gltl, adr290wp, gltB, gltD, gltl, glsl, gltA, glt, glxD, gltDl, gltD2, gdh2, agl040Cp, gdhAl, gdhA, gdhA2, gluD, gluDl, gluD2, rocG, ypcA,
  • the enzyme E22 is preferably selected from the group comprising me, mel, me2, me3, mae, mael, mae2, sfcA, sfcAl, maeA, maeB, tme, yqkJ, ywkA, yqkJ, malS, ytsJ, mleA, mleS, mez, sce59.10c, 2sc
  • the enzyme E23 is preferably selected from the group consisting of me, mel, me2, me3, mae, mael, mae2, sfcA, sfcAl, maeA, maeB, tme, yqkJ, ywkA, yqkJ, malS, ytsJ, mleA, mleS, mez, sce59.10c, 2sc7gll.23, malSl, malS2, dme, maeBl, maeB2, mdh, mdhl, mdh2, dmel cgi 0120, dmel cgi 0120, dmel_cg5889, fl9kl6.27, f6f22.7, t22p22.60, fl8al7.
  • glucose-6-phosphate dehydrogenase EC 1.1.1.49
  • 6-phosphogluconate dehydrogenase EC 1.1.1.44
  • Suitable genes for alcohol dehydrogenases and acetaldehyde dehydrogenases can in turn be taken from gene databases known to the person skilled in the art, such as the KEGG database, the NCBI database or EMBL database.
  • a second route from oxaloacetate to succinyl coenzyme A is via citrate as an intermediate.
  • the cell optionally in addition to an increased activity of the enzyme Eio or En, be compared to its wild type.
  • increased activity of at least one of the following enzymes E13 to Ei 6 and E 2 has 4 to E 26 (see Figure 8):
  • an enzyme Ei 6 which catalyzes the conversion of oxaloacetate to citrate; an enzyme E 24 which catalyzes the conversion of citrate to isocitrate; an enzyme E 25 which catalyzes the conversion of isocitrate to glyoxalate and succinate; an enzyme E 26 which catalyzes the conversion of glyoxalate to malate; an enzyme E13, which catalyzes the conversion of malate to fumarate; an enzyme Ei 4 , which catalyzes the conversion of fumarate to succinate; an enzyme Ei 5 , which catalyzes the conversion of succinate to succinyl coemzyme A.
  • Particularly preferred cells according to the invention are those in which the activity of the following enzymes or enzymes Egg 3 , Egg 4 , Egg 5 , E i6 , E 24 , E 25 , E 26 , Egg 3 Egg 4 , E 13 E 15 , E 13 E 16 , Egg 3 E 24 , Egg 3 E 25 , Egg 3 E 26 , egg 4 egg 5 , egg 4 egg 6 , egg 4 E 24 , egg 4 E 25 , egg 4 E 26 , egg 5 egg 6 , egg 5 E 24 , egg 5 E 25 , egg 5 E 26 and Egg 3 Egg 4 Egg 5 Egg 6 E 24 E 25 E 26 , where Egg 3 Egg 4 Egg 5 Egg 6 E 24 E 25 E 26 is most preferred.
  • the enzymes or enzymes Egg 3 , Egg 4 , Egg 5 , E i6 , E 24 , E 25 , E 26 , Egg 3 Egg 4 , E 13 E 15 , E 13 E 16 , Egg 3 E 24 , Egg 3 E 25 , Egg 3 E 26 , egg 4 egg 5
  • E 24 an aconitate hydratase (EC 4.2.1.3), E 25 an isococitrate lyase (EC 4.1.3.1) and
  • Preferred genes for the enzymes E i3 to E i6 are those which have already been described above in conjunction with the first route from oxaloacetate to succinyl-coenzyme A.
  • the enzyme E 24 is preferably selected from the group consisting of acol, aco2, ratireb, dmel-CG4706, dmel-CG4900, dmel-cg6342, cg9244, t3p4.5, fl0.n23.310, f4bl4.100, adl032Wp, afr629wp , acnA, acnB, acnC, acnD, rpfA, acnAl, acnA2, acnM, citB, leuC, cgll540, sacA, can, and aco, with acnA and acnB being particularly preferred.
  • the enzyme E 25 is preferably encoded by genes selected from the group comprising msd21.4, icll, icl2, ad106cp, agl057wp, aceA, ic1, aceAa, aceAb, cgl0097 and cgl2331, aceA being particularly preferred. According to a In a particular embodiment, those genes are preferred which code for a gene level or protein level deregulated isocitrate lyase.
  • the enzyme E 2 6 is preferably encoded by genes selected from the group comprising med24.5, mlsS1, acr268cp, masA, glcB, aceB, mls, glcB-1, glcB-2, cgl2329, masZ, aceBl, aceB2 and mas, wherein the aceB gene is particularly preferred.
  • nucleotide sequences of suitable genes of the enzymes E 2 4 to E 2 6 of the KEGG database, the NCBI database or EMBL database can be found.
  • the succinate formed in the cleavage of the isocitrate by the iscocitrate lyase next to glyoxalate can also be used for the formation of suc - Cinyl Coenzyme A can be used.
  • the isocitrate dehydrogenase is an enzyme which is selected from a gene selected from the group consisting of idhl, idh2, cg7176, cg7176, cg7176, f20d21.16, fl2pl9.10, tl5nl.8O, idpl, idp2, idp3, aalO22Wp, aerO ⁇ Icp, idhC, idhM, icdA, icd, idh, icdl, icd2, leuB, citC, citC, cglO664, leuB2, idh3A, idg3B, idh3G, cgl2233, dmel-CG5028, dmel-CG6439, f6p23.14, f23el2.
  • a third route from oxaloacetate to succinyl-coenzyme A is via 2-oxoglutarate as an intermediate.
  • the cell optionally, in addition to an increased activity of the enzyme Eio or En, an increased activity compared to its wild-type, at least one of the following enzymes Ei 6 , E 2 4, E 2 7 and E 28 has (see Figure 9): - an enzyme egg 6 , which catalyzes the conversion of oxaloacetate to citrate; an enzyme E 2 4, which catalyzes the conversion of citrate to isocitrate; an enzyme E 27 which catalyzes the conversion of isocitrate to 2-oxoglutarate; an enzyme E 28 , which catalyzes the conversion of 2-oxoglutarate to succinyl coemzyme A.
  • Particularly preferred cells according to the invention are those in which the activity of the following enzymes or enzyme combinations is increased: E i6 , E 24 , E 27 , E 28 , Ei 6 E 24 , Ei 6 E 27 , Ei 6 E 28 , E 24 E 27 , E 24 E 28 , E 27 E 28 , egg 6 E 24 E 27 , egg 6 E 24 E 28 , E 24 E 27 E 28 and egg 6 E 24 E 27 E 28 , egg 6 E 24 E 27 E 28 is the most preferred.
  • the enzyme Ei 6 is a citrate synthase (EC 2.3.3.1 or EC 2.3.3.8), E 24 is an aconitate hydratase (EC 4.2.1.3),
  • E 27 an isocitrate dehydrogenase (EC 1.1.1.41 or EC 1.1.1.42) and
  • Preferred genes for the enzymes E i6 , E 24 and E 27 are those which have already been described above in connection with the first and second route from oxaloacetate to succinyl coenzyme A.
  • the enzyme E 28 is preferably selected from the group consisting of korA, korB, kor D, korAl, korA2, corBl, corB2, oorA, oorB, oorC, oorD, oforA, oforB, porA, porB, porAl, porA2, porA3, porA4, porG, porGl, porG2, porBl, porB2, porB3, SCD20.12c, SCD20.13c, SCAHlO. 34c, SCAHIO.35c, korG, orA, orB, korGl and korG2.
  • E28 may also be a multi-subunit dehydrogenase complex having different enzymatic activities.
  • it may be a dehydrogenase complex comprising an oxoglutarate dehydrogenase (EC 1.2.4.2), a dihydro-lipoyl dehydrogenase (EC 1.8.1.4) and a dihydrolipoyl-lysine residual succinyl transferase (EC 2.3.1.61).
  • the oxoglutarate dehydrogenase (EC 1.2.4.2) is preferably selected from the group consisting of ogdh, ghdhl, Ioc239017, mgc68800, mgc80496, cgll ⁇ 1, t22el6.70, mpA24.10, kgdl, aer374cp, sucA, odhA, kgdA and cglII29, with sucA and odhA being particularly preferred.
  • the dihydrolipoyl dehydrogenase (EC 1.8.1.4) is preferably selected from genes from the group comprising dld, dld-prov, dldh, cg7430, t2jl5.6, kl4al7.6, at3gl7240, mgd8.71pdl, afr512wp, dldl, lpd, tb03 .26j7,650, tb04.3ml7.450, tb927.8.7380, tbO8.1OkIO .200, lpdA, lpdG, lpdV, lpd3, acoD, lpdAl, lpdA2, lpdA3, odhL, pdhD, pdhDl, pdhD2, pdhD3, pdhD42, lpdAchl, lpdAch2,
  • the diprolipoyllysine residual succinyl transferase (EC 2.3.1.61) is preferably selected from the group consisting of dlst, dlst-prov, mgc89125, dmel_CG5214, fl0m23.250, kl3p22.8, kgd2agl200wp, kgd2, odhB, sucB, aceF, kgdB, sucBl, sucB2, pdhC, dlaT, kgd, sc5F7.20 and sc4B10.24c, with sucB and odhB being particularly preferred.
  • nucleotide sequences of suitable genes of the enzyme E 2 s or of the abovementioned subunits of the enzyme E 2 s can in turn be taken from the KEGG database, the NCBI database or EMBL database.
  • the above-described routes from oxaloacetate to succinyl coenzyme A are based on phosphoenol pyruvate or on pyruvate as substrate precursors. In this context, it may furthermore be preferred to genetically modify the cells in such a way that they can provide particularly large amounts of pyruvate or phosphoenolpyruvate from carbohydrates and / or from glycerol.
  • the cell according to the invention has an increased activity of at least one, preferably all of the following enzymes E29 to E 42 in comparison to their wild type:
  • an enzyme E29 which facilitates the diffusion of glycerol into the cell
  • an enzyme E 30 which catalyzes the conversion of glycerol to glycerol-3-phosphate
  • an enzyme E31 which catalyzes the conversion of glycerol-3-phosphate to dihydroxyacetone phosphate
  • an enzyme E 32 which catalyzes the transfer of sulfur to the sulfur acceptor thioredoxin 1
  • an enzyme E 33 which catalyzes the hydrolysis of phospholipids to form alcohols and glycerol
  • an enzyme E 34 which inhibits the transport of glycerol 3- phosphate catalyzed into the cell in exchange for phosphate
  • an enzyme E 3 which catalyzes the conversion of dihydroxyacetone phosphate to glyceraldehyde-3-phosphate
  • an enzyme E 36 which catalyzes the conversion of glyceraldehyde-3-phosphate to 1,3-bisphosphoglycerate
  • an enzyme E37 which
  • particularly preferred cells are those in which the activity of the following enzymes or enzyme combinations is reduced: E29, E 3 o, E 3i, E 32, E 33, E 34, E 35, E 3 6, E 37, E 3 S , E 3 g, E 4 o, E 4i , E 42 , E 29 E 30 , E 29 E 3 I, E 29 E 32 , E 29 E 33 , E 29 E 34 , E 29 E 35 , E 29 E 3 6, E 29 E 37 , E 29 E 3 S, E 29 E 39 , E 29 E 4 Q, E 29 E 4 I,
  • E 29 E 42 E 30 E 31 , E 30 E 32 , E 30 E 33 , E 30 E 34 , E 30 E 35 , E 30 E 36 , E 30 E 37 , E 30 E 38 ,
  • E 29 an aquaglyceroporin (glycerol facilitator), which is preferably encoded by the glpF gene,
  • E 30 is a glycerol kinase (EC 2.7.1.30), which is preferably encoded by the glpK gene
  • E31 is a glycerol-3-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.99.5), preferably a FAD-dependent glycerol-3-phosphate dehydrogenase, wherein the glycerol-3-phosphate dehydrogenase is preferably derived from the glpA gene, the glpB gene, the glpC gene or the glpD gene, particularly preferably the glpD gene is encoded,
  • E 33 is a glycerol phosphodiesterase (EC 3.1.4.46), which is preferably encoded by the glpQ gene,
  • E34 is a glycerol-3-phosphate permease, which is preferably encoded by the glpT gene
  • E 36 is a glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase (EC 1.2.1.12),
  • E 40 a pyruvate kinase (EC 2.7.1.40), E41 a glycerol dehydrogenase (EC 1.1.1.6), which is preferably encoded by the gldA gene, and
  • E 4 2 a dihydroxyacetone kinase (EC 2.7.1.291 which is preferably encoded by the dhaK gene,
  • the gene sequences of the abovementioned enzymes can, in turn, be taken from the gene databases known to the person skilled in the art, in particular the KEGG database, the NCBI database or EMBL database. Furthermore, the gap gene coding for glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), the tpi gene coding for the trisphosphate isomerase (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086) and the pgk gene coding for the 3-phosphoglycerate kinase (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086) are also known from other sources.
  • the gap gene coding for glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086)
  • genes of the enzymes E 2 9 to E 42 can be genetically engineered cells in which at least one, more preferably at least two, more preferably at least three and most preferably all activities of the enzymes E 2 9 to E 42 by the above In connection with the enzyme egg described techniques (mutation of the enzyme or increase of the enzyme expression) has been increased.
  • These cells are capable of being cultured in the presence of glycerol as the sole carbon source (or together with carbohydrates as a further carbon source).
  • glycerol as the sole carbon source (or together with carbohydrates as a further carbon source).
  • the following genes are preferably heterologously expressed in the cells according to the invention:
  • the glpG gene or the 3925 gene the glpX gene, the dhaR gene, the ycgU gene or the bl201 gene the fsa gene, the mipB gene, the ybiZ gene or the B0825 gene the talC Gene, the fsaB gene, the yijG gene or the b3946 gene.
  • the nucleotide sequences of these genes can in turn be taken from the KEGG database, the NCBI database or EMBL database.
  • the cells can use carbohydrates as nutrient source, it is preferred that the inventive
  • Cell has a compared to their wild type increased activity of at least one, preferably all of the following enzymes E 43 to E 45 and E 36 to E 40 :
  • Glucose-6-phosphate catalyses ⁇ -D-fructose-6-phosphate
  • an enzyme E 44 which catalyzes the conversion of ⁇ -D-fructose-6-phosphate into ⁇ -D-fructose-1,6-biphosphate
  • an enzyme E 45 which catalyzes the conversion of ⁇ -D-fructose-1,6-bisphosphate into glyceraldehyde-3-phosphate and dihydroxyacetone phosphate
  • an enzyme E 36 which converts the glycerol-dehyd-3-phosphate into 1, 3-Biphosphoglycerat catalyzes
  • an enzyme E 37 which catalyzes the conversion of 1,3-biphosphoglycerate to 3-phosphoglycerate
  • an enzyme E 38 which catalyzes the conversion of 3-phosphoglycerate to 2-phosphoglycerate
  • - an enzyme E 39 which the implementation of 2-
  • Phosphoglycerate catalyzed to Phosphoenolpyruvat, and an enzyme E 4 o, which catalyzes the conversion of phosphoenolpyruvate to pyruvate.
  • Genetically modified cells particularly preferred according to the invention are those in which the activity of the following enzymes or enzyme combinations is increased: E 36 , E 37 , E 38 , E 39 , E 40 , E 43 , E 44 , E 45 , E 36 E 37 , E 36 E 38 , E 36 E 39 , E 36 E 4 Q, E 36 E 43 , E 36 E 44 , E 36 E 45 , E 37 E 38 , E 37 E 39 , E 37 E 4 Q, E37E43, E37E44, E37E45, E38E39, E38E40, E38E43, E38E44, E38E45, E39E40, E39E43, E39E44, E39E45, E40E43, E40E44, E40E45, E43E44, E43E45, E44E43E44, E43E45, E40E43, E40E44, E40E45, E43E44, E43E45, E44E45 and E36E37E38E39
  • E 43 is a glucose-6-phosphate isomerase (EC 5.3.1.9),
  • E 36 is a glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase (EC 1.2.1.12),
  • E 37 a phosphoglycerate kinase (EC 2.7.2.3), E 38 a phosphoglycerate mutase (EC 5.4.2.1), E 39 an enolase (EC 4.2.1.11) and E 40 a pyruvate kinase (EC 2.7.1.40),
  • the nucleotide sequences of these genes can in turn be taken from the KEGG database, the NCBI database or EMBL database. Furthermore, when the cell is capable of utilizing carbohydrates as a carbon source, it is preferable that, in addition to the above-mentioned enzymes E 43 to E 45 and E 36 to E 40 , the uptake of glucose into cells also be required, for example, by increasing the activity of enzymes of the phosphotransferase system, in particular of those enzymes which are encoded by ptsl, ptsH and ptsM genes, or by the enhancement of the glucokinase (EC 2.7.1.2), which is preferably encoded by the glk gene.
  • ptsl ptsH and ptsM genes
  • Phosphogluconate dehydrogenase (EC 1.1.1.44), which is preferably encoded by the gnd gene, and optionally at the same time to inhibit glycolysis, for example by weakening the activity of the glucose-6-phosphate isomerase, as described in WO-A-01 / 07626 is described.
  • the cells form 3-hydroxyisobutyric acid or polyhydroxyalkanoates based on 3-hydroxyisobutyric acid according to the particular embodiment of the cell according to the invention, in which methylmalonate-semialdehyde is formed as precursor and succinyl-coenzyme A as intermediate, via oxalacetate and pyruvate as intermediates, it may furthermore be preferred to reduce the activity of at least one, preferably all subsequent enzyme activities in the cell:
  • an enzyme which catalyzes the conversion of oxaloacetate into phosphoenolpyruvate such as, for example, the phosphoeylpyruvate carboxy kinase (EC 4.1.1.49) (see also DE-A-199 50 409), an enzyme which converts pyruvate to ace - catalyzed, such as the pyruvate oxidase (EC 1.2.2.2) (see also DE-A-199 51 975), an enzyme which the conversion of ⁇ -D-glucose-6-phosphate to ß-D-fructose 6-phosphate catalyzes (see also US 09 / 396,478), an enzyme which catalyzes the reaction of pyruvate to lactate, such as the 1-lactate dehydrogenase (EC 1.1.1.27) or the lactate-malate transhydrogenase (EC 1.1.99.7), an enzyme which catalyzes the conversion of pyruvate to acet
  • acetohydroxy acid synthase (EC 2.6.1.12) catalyzes, and / or - an enzyme which converts pyruvate to acetolactate, such as acetohydroxy acid synthase (EC 2.2.1.6).
  • Particularly preferred cells according to the invention which can form 3-hydroxyisobutyric acid or polyhydroxyalkanoates based on 3-hydroxyisobutyric acid via succinyl-coenzyme A as an intermediate of carbohydrates as carbon source and in which one or more of the abovementioned enzyme activities, in particular one of the enzyme activities Ei to E 45 in addition, the enzyme activities Ei, E x E 2 E 3 E 4 , EiE 4 E 5 E 6 E 7 or and EiE 4 E 5 E 7 can preferably be increased, are the microorganisms described by Bennett et al., Metab. Closely. (2005), 7 (3), pages 229 to 239, Bennett et al. , Biotechnol. Bioeng.
  • an enzyme E 46 which catalyzes the conversion of L-glutamate to 2-oxoglutarate
  • an enzyme E 28 which catalyzes the conversion of 2-oxoglutarate to succinyl coemzyme A.
  • E 46 a glutamate synthase (EC 1.4.1.13 or EC 1.4.1.14), a glutamate dehydrogenase (EC 1.4.1.2, EC 1.4.1.3 or EC 1.4.1.4) or an aspartate transaminase (EC 2.6.1.1 or EC 2.6.1.2) and
  • Preferred as enzyme E28 are those which have already been mentioned as the preferred enzyme E 2 s.
  • the enzyme E 4 6 is preferably selected from the genes selected from the group comprising myn8. , gltl, adr290wp, gltB, gltD, yeiT, aegA, ygfT, gltD-1, gltD-2, gltl, glt2, glsl, gltA, glt, glxD, gltA, yerD, cglO184, cglO185, sc3c9.12, gdhl, gdh2 , agl40cp, gdhA, gdhAl, gdhA2, gluD, rocG, ypcA, gudB, gluD, gdhA, gdhA2, gdh, gdhA-1, gdhA2-2, gdhA-3, gluDl,
  • KEGG database the NCBI database or EMBL database are taken.
  • the cell has an increased activity of at least one of the following enzymes E 4 , E 5 and E 47 to E 52 in comparison with their wild type (see FIG. 11):
  • an enzyme E 47 which catalyzes the conversion of acetyl coenzyme A to malonyl coenzyme A
  • an enzyme E 4s which catalyzes the conversion of malonyl coenzyme A into malonate semialdehyde
  • an enzyme E 4 g which catalyzes the conversion of malonate semialdehyde to 3-hydroxypropionate
  • an enzyme E 50 which catalyzes the conversion of 3-hydroxypropionate to 3-hydroxypropionyl-coenzyme A
  • an enzyme E 5i which catalyzes the conversion of 3-hydroxypropionyl-coenzyme A to acryloyl-coenzyme A
  • an enzyme E 52 which catalyzes the conversion of acryloyl-coenzyme A to propionyl-coenzyme A
  • an enzyme E 5 which catalyzes the conversion of propionyl coenzyme A to methylmalonate semialdehyde
  • an enzyme E 4 which cat
  • Genetically modified cells particularly preferred according to the invention are those in which the activity of the following enzymes or enzyme combinations is increased: E 47 , E 48 , E 49 , E 50 , E 51 , E 52 , E 4 , E 5 and E 47 E 48 E 49 E 50 E 51 E 52 E 4 E 5 .
  • E 4 is a 3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase (EC 1.1.1.31) or a 3-hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase (EC 1.1.1.35),
  • E 5 is a methylmalonate semialdehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.27),
  • E 47 a malonyl-coenzyme A decarboxylase (EC 4.1.1.9), a malonate-coenzyme A transferase (EC 2.8.3.3), a methylmalonyl-coenzyme A carboxytransferase (EC 2.1.3.1) or an acetyl-coenzyme A -Carboxylase (EC 6.4.1.2),
  • E 48 a malonate semialdehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.18), E 49 a 3-hydroxypropionate dehydrogenase (EC 1.1.1.59),
  • E 50 is a 3-hydroxyisobutyryl-coenzyme A hydrolase (EC 3.1.2.4), E 51 is an enoyl-coenzyme A hydratase (EC 4.2.1.17) and E 52 is an acyl-coenzyme A dehydrogenase (EC 1.3.99.3),
  • Preferred genes for the enzymes E 4 and E 5 are those which have already been mentioned above in connection with the first special embodiment of the cell according to the invention have been described.
  • the enzyme E 47 is preferably selected from the group consisting of mlycd, tl9bl7.4, tbO8.2904.110, matA, acac, acaca, acacb, f5j5.21, fl5c21.2, t8p21.5, accl, aarO71wp, accA, accB , accC, accD, accCI, accC2, mmdA, fabG, accDl, accD2, accD3, cglO831, accBC, dtsRl, accDA, scc24.16c and cglI327, with accA, accC and accD being most preferred.
  • the enzyme E 4s is preferably encoded by the iolD gene.
  • the enzyme E 5 i is preferably selected from the group comprising echSl, ehhadh, hadha, echsl-prov, cg4389, cg4389, cg6543, cg6984, cg8778, ech-1, ech-2, ech-3, ech-4, ech-5, ech-6, ech-7, FCAALL.314, fcaall.21, fox2, ecil, eci2, paaF, paaG, yfcX, fadB, faoA, rpfF, phaA, phaB, echAl, echA2, echA3, echA4, echA5, echA6, echA7, echA8, echA9, echA9, echAlO, echAl 1, echA12, echA13, echA14, echAl5, echAl 6, echAl7, echAl 8, echA
  • the enzyme E52 is preferably selected from the group consisting of acadl, acadm, acadlO, acadll, acadmpro, acadl-prov, mgc81873, cgl2262, cg4703, cg4860, f3e22.5, afl213wp, acdC, fadE13, acd-1, acd-2, acd-3, acd-4, acd-5, acd-6, acd-7, acd-8, acd-9, acd-10, acd-11, acd-12, acd, fadEl, fadE2, fadE3, fadE4, fadE5, fadE6, fadE7, fadE13, fadEl4, fadEl5, fadEl 6, f
  • nucleotide sequences of suitable genes for the enzymes E 47 to E52, in particular also the enzymes E49 and E50, can be found in the KEGG database, the NCBI database or EMBL database.
  • the formation of the intermediate propionyl-coenzyme A also takes place via acetyl-coenzyme A as a further intermediate, in which propionyl-coenzyme A according to this alternative is not directly but via methylmalonyl-coenzyme A is converted to methylmalonate semialdehyde.
  • the cell has an increased activity compared to its wild-type of at least one of the following enzymes E 2 to E 4 , E 6 , E 7 and E 47 to E 52 (see FIG. 12):
  • an enzyme E 47 which catalyzes the conversion of acetyl coenzyme A to malonyl coenzyme A
  • an enzyme E 4s which catalyzes the reaction of malonyl coenzyme A to malonate semialdehyde
  • an enzyme E 49 which catalyzes the conversion of malonate semialdehyde to 3-hydroxypropionate
  • an enzyme E 5 O which catalyzes the conversion of 3-hydroxypropionate to 3-hydroxypropionyl-coenzyme A
  • an enzyme E 5x which catalyzes the conversion of 3-hydroxypropionyl-coenzyme A to acryloyl-coenzyme A
  • an enzyme E 52 which catalyzes the conversion of acryloyl-coenzyme A to propionyl-coenzyme A
  • an enzyme E 7 which catalyzes the conversion of propionyl-coenzyme A to (S) -methylmalonyl-coenzyme A
  • Genetically modified cells particularly preferred according to the invention are those in which the activity of the following enzymes or enzyme combinations is increased: E 2 , E 3 , E 4 , E 6 , E 7 , E 47 , E 48 , E 49 , E 50 , E 51 , E 52 and E 2 E 3 E 4 EgE 7 E 47 E 48 E 49 E 5 oE 5 iE 52 .
  • Preferred enzymes and genes of these enzymes are those genes and enzymes which have already been mentioned above in connection with the enzymes E 2 to E 4 , Ee, E 7 and E 47 to E 52 .
  • the formation of the intermediate propionyl-coenzyme A is likewise carried out via acetyl-coenzyme A as a further intermediate, in which case the propionyl-coenzyme A according to this alternative likewise does not react directly but via (R) -methylmalonyl-coenzyme A (and is not converted to methylmalonate semialdehyde via (S) -methylmalonyl-coenzyme A.
  • the cell has an increased activity of at least one of the following enzymes E 2 to E 4 , E 7 and E compared to its wild-type 47 to E 52 (see Figure 13):
  • an enzyme E 47 which catalyzes the conversion of acetyl coenzyme A to malonyl coenzyme A; of an enzyme E 48, which catalyzes the conversion of malonyl-Coenzyme A into malonate semialdehyde; an enzyme E 49 which catalyzes the conversion of malonate semialdehyde to 3-hydroxypropionate; an enzyme E 5 O which catalyzes the conversion of 3-hydroxypropionate to 3-hydroxypropionyl-coenzyme A; an enzyme E 5 i which catalyzes the conversion of 3-hydroxypropionyl-coenzyme A to acryloyl-coenzyme A; an enzyme E 52 which catalyzes the conversion of acryloyl-coenzyme A to propionyl-coenzyme A; an enzyme E 7 which catalyzes the conversion of propionyl-coenzyme A to methylmalonyl-coenzyme A; an enzyme E 2 which catalyze
  • Genetically modified cells particularly preferred according to the invention are those in which the activity of the following enzymes or enzyme combinations is increased: E 2 , E 3 , E 4 , E 7 , E 47 , E 4S , E 49 , E 50 , E 51 , E 52 and E2E3E4E7E47E48E49E50E51E52.
  • Preferred enzymes and genes of these enzymes are again those genes and enzymes which have already been mentioned above in connection with the enzymes E 2 to E 4 , E 7 and E 47 to E 52 .
  • the formulation of the intermediate propionyl-coenzyme A is likewise carried out via acetyl-coenzyme A as a further intermediate, acetoacetyl-coenzyme A being formed as an intermediate according to this alternative.
  • the cell has an increased activity of at least one of the following enzymes E 8 and E 53 to E 6x compared to its wild type:
  • an enzyme E 53 which catalyzes the conversion of acetyl coenzyme A to acetoacetyl coenzyme A
  • an enzyme E 54 which catalyzes the conversion of acetoacetyl-coenzyme A to 3-hydroxybutanoyl-coenzyme A
  • an enzyme E 55 which catalyzes the conversion of 3-hydroxybutanoyl coenzyme A into crotonyl coenzyme A
  • an enzyme E 56 which catalyzes the conversion of crotonyl coenzyme A to butyryl coenzyme A
  • an enzyme E 57 which catalyzes the conversion of butyryl coenzyme A into ethylmalonyl-coenzyme A
  • an enzyme E 58 which catalyzes the conversion of ethylmalonyl-coenzyme A to methylsuccinyl-coenzyme A
  • an enzyme E 59 which catalyzes the reaction of
  • particularly preferred genetically modified cells are those in which the activity of the following enzymes or enzyme combinations is increased: E 8 , E 5 3, E 5 4, E 55 , E 5 6, E 57 , E 58 , E 59 , Eßo ⁇ Eßi and E 8 E 5 3E 5 4E 55 E 5 6E 5 7E 58 E 59 E6oE6i •
  • the formation of the intermediate propionyl-coenzyme A again via acetyl-coenzyme A as a further intermediate wherein according to this modification also acetoacetyl-coenzyme A is formed as a further intermediate, but in In this case, crotonyl-coenzyme A produces ethylmalonyl Coenzyme A is formed.
  • the cell has an increased activity compared to its wild type of at least one of the following enzymes E 8 and E 53 to E 56 and E 62 to E 65 (see FIG. 14):
  • an enzyme E 53 which catalyzes the conversion of two acetyl-coenzyme A units to acetoacetyl-coenzyme A; an enzyme E 54 which catalyzes the conversion of acetoacetyl-coenzyme A to 3-hydroxybutyryl-coenzyme A; an enzyme E 55 which catalyzes the conversion of 3-hydroxybutyryl-coenzyme A into crotonyl-coenzyme A; an enzyme E 56 which catalyzes the conversion of crotonyl coenzyme A to ethylmalonyl coenzyme A; an enzyme E 62 which catalyzes the conversion of ethylmalonyl-coenzyme A to methylsuccinyl-coenzyme A; an enzyme E 63 which catalyzes the conversion of methyl succinyl coenzyme A to mesaconyl coenzyme A; an enzyme E 64 which catalyzes the conversion of me
  • propionyl coenzyme A From the propionyl coenzyme A can then in the manner described above (increasing the activity of one or more of the enzymes E 7 , E 2 , E 3 and E 4 , increasing the activity of one or more of the enzymes E 7 , E 6 , E 2 , E 3 and E 4 or increase the activity of one or both enzymes E 4 and E 5 ).
  • the enzyme in this connection it is particularly preferred that the enzyme
  • E 53 is a ⁇ -ketothiolase (EC 2.3.1.9).
  • E 62 an ethylmalonyl-coenzyme A mutase (EC 5.4.99.2)
  • E 63 a methyl succinyl-coenzyme A dehydrogenase
  • E 64 is a mesaconyl-coenzyme A hydratase
  • E 65 is a ⁇ -methylmalyl / L-malyl-coenzyme A lyase
  • the enzyme E 53 is preferably selected from genes selected from the group consisting of acatl, acat2, Ioc484063, Ioc489421, mgc69098, mgc81403, mgc81256, mgc83664, cat-1, ergl0, ygeF, atoB, fadAx, phbA-1, phbA-2, atoB-2, pcaF, pcaF-2, phb-A, bktB, phaA, tioL, thlA, fadA, paaJ, phbAf, pimB, mmgA, yhfS, thI, vraB, thI, mvaC, thiL, paaJ, fadA3, fadA4, fadA5, fadA6, cgll2392, catF, sc8f4.03, thiLl, thiL2, acaB
  • the enzyme E 54 is preferably encoded by genes selected from the group consisting of phbB, fabG, phbNI, phbB2 or cglI2444, with phbB especially and the corresponding gene from Rhodobacter sphaeroides being particularly preferred.
  • the enzyme E 55 is preferably selected from the group consisting of echSl, ehhadh, hadha, echsl-prov, cg4389, cg4389, cg6543, cg6984, cg8778, ech-1, ech-2, ech-3, ech-4, ech-5, ech-6, ech-7, FCAALL.314, fcaall.21, fox2, ecil, eci2, paaF, paaG, yfcX, fadB, faoA, rpfF, phaA, phaB, echAl, echA2, echA3, echA4, echA5, echA6, echA7, echA8, echA9, echA9, echAlO, echAl 1, echA12, echA13, echA14, echAl5, echAl 6, echAl7, echAl 8, echAl
  • enzyme E 56 an enzyme from Rhodobacter sphaeroides is preferably used, which of DNA sequence with the Seq. ID. -No. 05 is coded and which the amino acid sequence according to Seq. ID. -No. 06 has.
  • Suitable genes for the enzyme E 62 are selected from the group consisting of mut, mutA, mutB, sbm, sbmA, sbmB, sbm5, bhbA, mcmA, mcmAl, mcmA2, mcmB, mcml, mcm2, mcm3, ic-mA, meaAl and meaA2, whereby here too the corresponding gene from Rhodobacter sphaeroides is particularly preferred.
  • Preferred genes for the enzymes E 63 , E 64 and E 65 are in particular the genes for these enzymes from Rhodobacter sphaeroides. Further examples of nucleotide sequences of the abovementioned genes can be found inter alia also of the KEGG database, the NCBI database or EMBL database.
  • the 3-hydroxyisobutyric acid or the 3-hydroxyisobutyric acid-based polyhydroxyalkanoates are produced via propionyl-coenzyme A and acetyl-coenzyme A as intermediates.
  • the cell has an increased activity of an enzyme E 66 which catalyzes the conversion of pyruvate to acetyl-coenzyme A.
  • This enzyme E 66 is preferably a pyruvate dehydrogenase (EC 1.2.1.51).
  • the 3-hydroxyisobutyric acid is formed from carbon-carbon sources such as methane or methanol, it may be preferable for the cell to have an activity of at least one of the enzymes E 67 to E 7 i which is increased in comparison with its wild type:
  • an enzyme E 67 which catalyzes the conversion of methane to methanol
  • an enzyme E 68 which catalyzes the conversion of methanol to formaldehyde
  • an enzyme E 69 which catalyzes the conversion of formaldehyde to 5, 10-Methylenetetrahydrofolat
  • an enzyme E 70 which is the reaction of 5,10-
  • Methylene-eta-tetrahydrofolate catalyzed to 5-methyltetrahydrofolate; an enzyme E 7i , which catalyzes the conversion of 5-methyltetrahydrofolate to acetyl-coenzyme A.
  • E 67 a methane monooxigenase (EC 1.14.13.25), E 68 a methanol dehydrogenase (EC 1.1.1.244),
  • E 70 a methylene tetrahydrofolate reductase (EC 1.5.1.20), E 7 i a carbon monoxide dehydrogenase (EC 1.2.99.2)
  • nucleotide sequences of suitable genes for the enzymes E 63 to E 67 can be found in the KEGG database, the NCBI database or the EMBL database.
  • Semialdehyde is carried out as a precursor, it is preferred that the formation of 3-hydroxyisobutyric acid or 3- Hydroxyisobutyric acid-based polyhydroxyalkanoates via acryloyl-coenzyme -A as an intermediate, whereby the cell is able to utilize carbohydrates, glycerol or glutamate as carbon source.
  • this cell has an increased activity compared to its wild type of at least one of the following enzymes Eio to Ei 2 , E 56 , E 72 and E 73 (see FIG ):
  • an enzyme E 72 which catalyzes the conversion of beta-alanine to beta-alanyl-coenzyme A
  • an enzyme E 73 which catalyzes the conversion of beta-alanyl-coenzyme A to acrylyl-coenzyme A
  • an enzyme E 56 which the Reaction of acrylyl coenzyme A to methylmalonyl coenzyme A
  • an enzyme Eio which catalyzes the conversion of methylmalonyl coenzyme A into methylmalonate
  • an enzyme En which catalyzes the conversion of methylmalonate to methylmalonate-semialdehyde
  • an enzyme E 12 which catalyzes the conversion of methylmalonate semialdehyde to 3-hydroxyisobutyric acid.
  • Particularly preferred cells according to the invention are those in which the activity of the following enzymes or enzyme combinations is increased: E 56 Ei 0 , E 56 En, E 56 Ei 2 , E 56 EioEn and E 72 E 73 E 56 E I0 E H E I2 .
  • an enzyme it may be advantageous for an enzyme to be overexpressed, which is able to catalyze at least two of the reaction steps described above.
  • an enzyme can also be used here, which has both the activity of the enzyme Ei 0 and that of the enzyme En, such as, for example, the malolyl-coenzyme A reductase from Sulfolobus tokaii, which is derived from the DNA sequence with the Seq.
  • ID. -No. 03 is coded and which the amino acid sequence according to Seq. ID. -No. 04 has. Furthermore, in connection with the fourth particular embodiment of the cell according to the invention, it is in principle also possible to use a cell which is already capable of producing particularly large amounts of acrylyl coenzyme A.
  • E72 a coenzyme A transferase (EC 2.8.3.1) or coenzyme A synthetase, preferably a coenzyme A transferase,
  • E 5 6 a crotonyl-coenzyme A-decarboxylase Eio a methylmalonyl-coenzyme A-hydrolase (EC 3.1.2.17),
  • E12 a 3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase (EC 1.1.1.31) or a 3-hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase (EC 1.1.1.35)
  • Preferred enzymes E 72 with a CoA transferase activity are those from Megasphaera elsdenii, Clostridium propionicum, Clostridium kluyveri and also from Escherichia coli.
  • SEQ ID NO: 24 sequence of Megasphaera elsdenii.
  • Further preferred enzymes are those variants of CoA transferase which are described in WO-A-03/062173.
  • Suitable enzymes E 73 having a beta-alanyl-coenzyme A ammonium-lyase activity are, for example, those from Clostridium propionicum.
  • DNA sequences encoding such an enzyme can be obtained, for example, from Clostridium propionicum as described in Example 10 of WO-A-03/062173.
  • the DNA sequence which codes for the Clostridium propionicum beta-alanyl-coenzyme A ammonium lyase is given in WO-A-03/062173 as SEQ ID NO: 22.
  • the enzyme E 56 is preferably again the Crotonyl- coenzyme A decarboxylase from Rhodobacter sphaeroides used, which of DNA sequence with the Seq. ID. -No. 05 is coded and which the amino acid sequence according to Seq. ID No. 06. This enzyme is not only able to
  • Suitable genes for the enzymes E10 to E12 have already been mentioned in connection with the first variant of the cell according to the invention, wherein it is also preferred in connection with the second variant, as gene for the enzyme En, the gene of Sulfolobus tokodaii described above is particularly preferred.
  • this has at least an increased activity of the enzyme E10 and E 56 or of the enzymes E10 compared to their wild type, En and E 56 on, wherein the egg 0 or the enzymes Ei 0 and En from a DNA sequence according to SEQ. ID No. 03 and the enzyme E 56 from a DNA sequence according to SEQ. ID No. 05 is coded.
  • the enhanced activity of these two enzymes is achieved by using the polypeptides of SEQ. ID No. 04 and SEQ. ID No.
  • amino acid sequences having an identity of at least 50%, preferably at least 55%, moreover preferably at least 60%, moreover preferably at least 65% and most preferably at least 70% to the amino acid sequence according to SEQ. ID No .: 04 or SEQ. ID No. 06 are overexpressed in the cell.
  • These two DNA sequences may be integrated into the genome of the cell or be present on a vector inside the cell.
  • the cell in addition to the increase of the activity of the enzyme E 56 and / or the activity of the enzyme Eio or the enzymes Eio and En at least one , preferably both of the following properties:
  • the enzyme En is preferably a carboxylase, more preferably a pyruvate carboxylase (EC No. 6.4.1.1), which catalyzes the conversion of pyruvate to oxaloacetate.
  • a particularly preferred pyruvate carboxylase in this context is that mutant which is described in "A novel methodology employing Corynebacterium glutamicum genome Information to generate a novel L-lysine-producing mutant.”, Ohnishi J et al., Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 58 (2), pp.
  • the enzyme E 75 is preferably a decarboxylase, more preferably a glutamate decarboxylase or an aspartate decarboxylase, with a 1-aspartate 1-decarboxylase (EC number 4.1.1.11) being most preferred, which is encoded by the panD gene.
  • Aspartate decarboxylase catalyzes the conversion of aspartate to beta-alanine.
  • Genes for the aspartate decarboxylase (panD genes), inter alia, from Escherichia coli (FEMS Microbiology Letters, 143, pages 247-252 (1996)), "Photorhabdus luminescens subsp. Laumondii, Mycobacterium bovis subsp.
  • panD genes of any conceivable origin, regardless of whether from bacteria, yeasts or fungi, and all the alleles of the panD gene can be used, in particular those resulting from the degeneracy of the genetic code or by function mutations (sense mutations)
  • Aspartate decarboxylase from Corynebacterium glutamicum Particularly preferred aspartate decarboxylase according to the invention is the Escherichia coli mutant DV9 (Vallari and Rock, Journal of Bacteriology, 164, pages 136-142 (1985)).
  • the formation of 3-hydroxyisobutyric acid or of polyhydroxyalkanoates based on 3-hydroxyisobutyric acid is carried out via 3-hydroxyisobutyryl-coenzyme A as precursor.
  • the formation of 3-hydroxyisobutyric acid or of 3-hydroxyisobutyric acid-based polyhydroxyalkanoates according to the second variant via 3-hydroxyisobutyryl-coenzyme A as a precursor it is preferred according to a first particular embodiment that the formation of the 3- Hydroxyisobutyric acid or based on 3-hydroxyisobutyric acid polyhydroxyalkanoates via isobutyryl-coenzyme A as an intermediate, wherein the cell is capable of utilizing preferably carbohydrates, glycerol or L-valine as a carbon source.
  • this cell has an increased activity compared to its wild-type at least one of the following enzymes E 76 to E 79 , E 60 , E 6x and E 8 has (see Figure 16):
  • an enzyme E 76 which catalyzes the conversion of pyruvate to 2-acetolactate
  • an enzyme E 77 which catalyzes the reaction of 2-acetolactate to 2, 3-dihydroxyisolvalerate
  • an enzyme E 78 which catalyzes the conversion of 2,3-dihydroxyisolvalerate to 2-oxoisovalerate
  • an enzyme E 79 which is the reaction of 2-
  • Genetically modified cells which are particularly preferred according to the invention are those in which the activity of the following enzymes or enzyme combinations is increased:
  • E 8 is a 3-hydroxyisobutyryl-coenzyme A-hydrolase (EC 3.1.2.4),
  • E 77 is a dihydroxyisovalerate dehydrogenase (EC 1.1.1.86), E 78 a 2, 3-dihydroxyisovalerate dehydratase (EC 4.2.1.9),
  • E 79 is a 2-oxoisovalerate dehydrogenase (EC 1.2.1.25 or EC 1.2.4.4),
  • E 60 an acyl-coenzyme A dehydrogenase (EC 1.3.99.3), a
  • Butyryl-coenzyme A dehydrogenase (EC 1.3.99.2) or a 2-methylacyl-coenzyme A dehydrogenase (EC 1.3.99.12), and
  • E 6 i an enoyl coenzyme A hydratase (EC 4.2.1.17)
  • Preferred enzymes E 8 , E 60 and E 6x are those already described above.
  • the enzyme E 76 is preferably selected from the group consisting of ilvbl, t8pl9.70, ilvl, ilv2, ilv ⁇ , aalO21wp, ael305cp, ilvl, ilvH, ilvN, ilvB, ilvM, ilvG, ilvN, budB, iIvN-I, ilvN -2, atrC, ilvX, iolD, budB, asS, ilvK, ilvBl, ilvB2, ilvB3, ilvNl, ilvN2, cglI271, cglI272, iolD and scc57A.40c.
  • the enzyme E 77 is preferably encoded by genes selected from the group comprising fl4p22.200, ilv5, acll98Wp, ilvC, ilVY, ilvC-1, ilvC-2, ilvC-3 and cgll273, the ilvC gene being most preferred is.
  • the enzyme E 78 is preferably encoded by genes selected from the group consisting of fl4ol3.18, ilv3, acIII7wp, ilvD, cgl168, ilvD1 and ilvD2, with ilvD being most preferred.
  • L-valine serves as a carbon source, it is according to a second modification of the first particular embodiment of the second alternative of the cell according to the invention, in which the formation of 3-hydroxyisobutyric acid or based on 3-hydroxyisobutyric polyhydroxyalkanoates via 3-hydroxyisobutyryl coenzyme A as precursor and isobutyryl-coenzyme A as an intermediate, it is preferred that this has an increased activity compared to its wild type of at least one of at least one of the following enzymes E 79 , E 8 O, E 60 , E 6 i and E 8 (see FIG ):
  • an enzyme E 8 o which catalyzes the conversion of L-valine to 2-oxoisovalerate; an enzyme E 79 which catalyzes the conversion of 2-oxoisovalerate to isobutyryl-coenzyme A; an enzyme E 60 which catalyzes the conversion of isobutyryl-coenzyme A to methacrylyl-coenzyme A; an enzyme E 6i which catalyzes the conversion of methacrylyl coenzyme A to 3-hydroxyisobutyryl coenzyme A; an enzyme E 8 , which catalyzes the conversion of 3-hydroxyisobutyryl-coenzyme A to 3-hydroxyisobutyrate.
  • Genetically modified cells which are particularly preferred according to the invention are those in which the activity of the following enzymes or enzyme combinations is increased:
  • the enzyme It is a 3-hydroxyisobutyryl-coenzyme A-hydrolase (EC 3.1.2.4),
  • E 60 an acyl-coenzyme A dehydrogenase (EC 1.3.99.3), a
  • Butyryl-coenzyme A dehydrogenase (EC 1.3.99.2) or a 2-methylacyl-coenzyme A dehydrogenase (EC 1.3.99.12),
  • E 79 is a 2-oxoisovalerate dehydrogenase (EC 1.2.1.25 or EC 1.2.4.4), and
  • E 8 O an amino acid transferase (EC 2.6.1.42)
  • Preferred Enzymes Es, E6o, E ⁇ i and E79 are those already described above.
  • the enzyme Eso is selected from genes selected from the group comprising bcatl, bcat2, t27I1.8, t27il.9, f2jl ⁇ .5, f2jl ⁇ .4, tl2hl.l6, mmbl2.20, t9c5.3, mpa24.13, batl, bat2A, ilvE, ilvEl, ilvE2, ilVE3, ywaA, ybgE, bcaT and cgl2204, with ilvE being particularly preferred.
  • nucleotide sequences of suitable genes, the enzyme Eso can be found in turn the KEGG database, the NCBI database or EMBL database.
  • an enzyme E 4 which catalyzes the reaction of methyl malonate semialdehyde to 3-hydroxyisobutyric acid, wherein this Enzyme E 4 preferably a 3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase (EC 1.1.1.31) or a 3-hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase (EC 1.1.1.35).
  • an enzyme E 53 which catalyzes the conversion of acetyl coenzyme A to acetoacetyl coenzyme A
  • an enzyme E 54 which catalyzes the conversion of acetoacetyl-coenzyme A into 3-hydroxybutyryl-coenzyme A
  • an enzyme E 8 i which catalyzes the conversion of 3-hydroxybutyryl-coenzyme A to 3-hydroxyisobutyryl-coenzyme A
  • an enzyme E 8 which catalyzes the conversion of 3-hydroxyisobutyryl-coenzyme A to 3-hydroxyisobutyrate.
  • Genetically modified cells which are particularly preferred according to the invention are those in which the activity of the following enzymes or enzyme combinations is increased: E 8 , E 53 , E 54 , E 8 i, and E 8 E 53 E 54 E 8I .
  • E 8 is a 3-hydroxyisobutyryl-coenzyme A-hydrolase (EC 3.1.2.4),
  • E 53 is a ⁇ -ketothiolase (EC 2.3.1.9).
  • E 8 I is an isobutyryl-coenzyme mutase (EC 5.4.99.13),
  • Preferred enzymes E 8 , E 53 and E 54 are those already described above.
  • a preferred enzyme E 8x is the ⁇ -proteobacterium isobutyryl-coenzyme M-mutase strain L108 described in Applied And Environmental Microbiology, Vol. 72 (6), 2006, pages 4128-4135.
  • this cell has an increased expression of the glbO gene compared to its wild type.
  • a contribution to the solution of the abovementioned objects is further provided by a process for the production of a genetically modified cell which is capable of reacting via methylmalonate-semialdehyde or isobutyryl-coenzyme A as precursors 3-hydroxyisobutyric acid or 3-
  • Hydroxyisobutyric acid based polyhydroxyalkanoates comprising the step of increasing the activity of at least one of the enzymes described above, preferably one or more of the enzymes
  • a further contribution to the solution of the abovementioned objects is provided by a process for preparing 3-hydroxyisobutyric acid or polyhydroxyalkanoates based on 3-hydroxyisobutyric acid, comprising the process step of bringing a cell according to the invention into contact with a nutrient medium comprising carbon hydrates, glycerol, carbon dioxide, methane as the carbon source , Methanol, L-valine or L-glutamate under conditions in which 3-hydroxyisobutergic acid or 3-hydroxyisobutyric acid-based polyhydroxyalkanoates are formed from the carbon source, and optionally purification of the 3-hydroxyisobutyric acid from the nutrient medium.
  • a nutrient medium comprising carbon hydrates, glycerol, carbon dioxide, methane as the carbon source , Methanol, L-valine or L-glutamate under conditions in which 3-hydroxyisobutergic acid or 3-hydroxyisobutyric acid-based polyhydroxyalkanoates are formed from the carbon source, and optional
  • the genetically modified cells according to the invention can be used continuously or discontinuously in the batch process (batch culturing) or in the fed-batch process (feed process) or repeated-fed-batch process (reactive feed process) for the purpose of producing 3-hydroxyisobutyrate or of 3-hydroxyisobutyrate based polyhydroxyalkanoates are contacted with the nutrient medium and thus cultured. Also conceivable is a semicontinuous process, as described in GB-A-1009370. A summary of known cultivation methods are in the textbook by Chmiel ("Bioprocess 1.
  • carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose, oils and fats such.
  • oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut oil, fatty acids such.
  • palmi- tine acid, stearic acid and linoleic acid alcohols such.
  • glycerol and methanol hydrocarbons such as methane, amino acids such as L-glutamate or L-valine or organic acids such.
  • acetic acid can be used.
  • These substances can be used individually or as a mixture. Particular preference is given to the use of carbohydrates, in particular monosaccharides, oligosaccharides or polysaccharides, as described in US Pat. Nos. 6,01,494 and 6,136,576, of C 5 sugars or of glycerol.
  • organic nitrogen-containing compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate may be used.
  • the nitrogen sources can be used singly or as a mixture.
  • Phosphoric acid, potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts can be used as the phosphorus source.
  • the culture medium must also contain salts of metals such as z. As magnesium sulfate or iron sulfate, which are necessary for growth. Finally, essential growth factors such as amino acids and vitamins can be used in addition to the above-mentioned substances.
  • suitable precursors may be added to the culture medium.
  • the said feedstocks may be added to the culture in the form of a one-time batch or fed in a suitable manner during the cultivation.
  • the temperature of the culture is normally from 20 0 C to 45 ° C and preferably 25 ° C to 40 0 C.
  • the cells which can convert glycerol as a substrate, it may be preferred to employ as the cells, those cells which are described in US 6,803,218.
  • the cells can be cultured at temperatures in the range of 40 to 100 0 C.
  • the purification of the 3-hydroxyisobutyric acid from the nutrient solution is preferably carried out continuously, it also being preferred in this context to carry out the preparation of the 3-hydroxyisobutyric acid by fermentation continuously, so that the entire process from the preparation of the 3-hydroxyisobutyric acid to the their purification from the fermentation broth continuously can be carried out.
  • this is continuously passed through a device for separating the microorganisms used in the fermentation, preferably via a filter having an exclusion size in a range of 20 to 200 kDa, in which a solid / liquid Separation takes place.
  • centrifuge a suitable sedimentation device or a combination of these devices, wherein it is particularly preferred first to separate off at least part of the microorganisms by sedimentation and then to supply the fermentation broth partially freed of the microorganisms to an ultrafiltration or centrifuging device ,
  • the enriched in its 3-Hydroxyisobutterklare-share fermentation product is supplied after the separation of the microorganisms of a preferably multi-stage separation plant.
  • a separation plant a plurality of separation stages connected in series are provided, from each of which recycle lines return, which are returned to the fermentation tank. Furthermore lead out of the respective separation stages derivatives.
  • the individual separation stages can operate on the principle of electrodialysis, reverse osmosis, ultrafiltration or nanofiltration. As a rule, these are membrane separation devices in the individual separation stages. The selection of the individual separation stages results from the nature and extent of the fermentation by-products and substrate residues.
  • the 3-hydroxyisobutyric acid can also be obtained by extraction processes be separated from the fermentation solution freed from microorganisms, in which case ultimately the pure 3-hydroxyisobutyric acid can be obtained.
  • the 3-hydroxyisobutyric acid by extraction for example, ammonium compounds or amines may be added to the fermentation solution to form an ammonium salt of 3-hydroxyisobutyric acid.
  • This ammonium salt can then be separated from the fermentation solution by adding an organic extractant and then heating the resulting mixture, whereby the ammonium salt accumulates in the organic phase. From this phase, the 3-hydroxyisobutyric acid can then be isolated to obtain the pure 3-hydroxyisobutyric acid, for example by further extraction steps. Further details regarding this separation process can be found in WO-A-02/090312, the disclosure content of which with regard to the separation of hydroxycarboxylic acids from fermentation solutions is hereby incorporated by reference and forms part of the disclosure of the present application.
  • Hydroxyisobutyric acid from the fermentation solution is either an aqueous 3-hydroxyisobutyric acid solution containing from 2 to 90% by weight, preferably from 7.5 to 50% by weight and more preferably from 10 to 25% by weight of 3-hydroxyisobutyric acid, or pure 3-hydroxyisobutyric acid.
  • the 3-hydroxyisobutyric acid prepared by the process according to the invention can be neutralized before, during or after the purification, it being possible to use bases such as calcium hydroxide or sodium hydroxide for this purpose.
  • a method for the production of methacrylic acid or methacrylic acid esters, comprising process steps IA) produces 3-hydroxyisobutyric acid by the process described above and, if appropriate, purification and / or neutralization of the 3-hydroxyisobutyric acid of 3-hydroxyisobutyric acid .
  • the 3-hydroxyisobutyric acid is dehydrated to form methacrylic acid, using either the pure 3-hydroxyisobutyric acid isolated from the fermentation solution or the aqueous 3-hydroxyisobutyric acid solution isolated during work-up of the fermentation solution if appropriate, this is concentrated before the dehydration, for example by distillation, if appropriate in the presence of a suitable entraining agent.
  • the dehydration can in principle be carried out in the liquid phase or in the gas phase. Furthermore, it is preferred according to the invention that the dehydration is carried out in the presence of a catalyst, wherein the type of catalyst used depends on whether a gas-phase or a liquid-phase reaction is carried out.
  • Suitable dehydration catalysts are both acidic and alkaline catalysts. Acid catalysts are particularly preferred because of the low tendency toward oligomer formation.
  • the dehydration catalyst can be used both as a homogeneous and as a heterogeneous catalyst. When the dehydration catalyst is present as a heterogeneous catalyst, it is preferred that the dehydration catalyst be in contact with a carrier x.
  • Suitable carriers x are all solids which appear suitable to the person skilled in the art. In this context, it is preferred that these solids have suitable pore volumes which are suitable for good binding and absorption of the dehydration catalyst.
  • total pore volumes according to DIN 66133 in a range from 0.01 to 3 ml / g are preferred and total pore volumes in a range from 0.1 to 1.5 ml / g are particularly preferred.
  • the solids suitable as carrier x have a surface area in the range from 0.001 to 1000 m / g, preferably in the range from 0.005 to 450 m / g and moreover preferably in the range from 0.01 to 300 m 2 / g according to BET test according to DIN 66131.
  • the carrier for the dehydration catalyst may on the one hand be a bulk material having an average particle diameter in the range from 0.1 to 40 mm, preferably in the range from 1 to 10 mm and more preferably in the range from 1.5 to 5 mm, be used.
  • the wall of the dehydration reactor may serve as a carrier.
  • the carrier per se may be acidic or basic, or an acidic or basic dehydration catalyst may be applied to an inert carrier. In particular, dipping or impregnating or incorporation into a carrier matrix may be mentioned as application techniques.
  • Suitable carriers x which may also have dehydrating catalyst properties, are, in particular, natural or synthetic silicatic substances, in particular mordenite, montmorillonite, acidic zeolites; excipients which are coated with mono-, di- or polybasic inorganic acids, in particular phosphoric acid, or acidic salts of inorganic acids, such as oxidic or siliceous substances, for example, Al 2 O 3, TiC ⁇ ; Oxides and mixed oxides, such as ⁇ -Al2 ⁇ 3 and ZnO-Al2 ⁇ 3 mixed oxides of heteropoly acids.
  • the carrier x consists at least partially of an oxidic compound.
  • oxidic compounds should have at least one of Si, Ti, Zr, Al, P or a combination of at least two of them.
  • Such carriers can themselves act as dehydration catalysts by their acidic or basic properties.
  • a preferred class of compound acting both as a carrier as x and as a dehydration catalyst include silicon / aluminum / phosphorus oxides.
  • Preferred basic substances which function both as dehydration catalyst and as support x include alkali, alkaline earth metal, lanthanum, lanthanides or a combination of at least two thereof in their oxidic form.
  • acidic or basic dehydration catalysts are commercially available both from Degussa AG and from Südchemie AG.
  • Another class are ion exchangers. These can also be present in both basic and acidic form.
  • Suitable homogeneous dehydration catalysts are, in particular, inorganic acids, preferably phosphorous-containing acids and, moreover, preferably phosphoric acid. These inorganic acids can be immobilized on the support x by immersion or impregnation.
  • the H 0 value corresponds to the acid function after Hämmert and can be determined by the so-called amine titration and use of indicators or by
  • an acidic solid catalyst having an inorganic acid, preferably with phosphoric acid or with superacids such as sulfated or phosphatized zirconia in contact brought pore-shaped carrier body, preferably at least 90 wt .-%, beyond preferably at least 95% by weight, and most preferably at least 99% by weight, based on a silica, preferably SiC> 2.
  • the contacting of the pore-shaped carrier body with the inorganic acid is preferably carried out by impregnating the carrier body with the acid, these preferably in an amount in a range from 10 to 70% by weight, particularly preferably in a range from 20 to 60 Wt .-% and moreover preferably in a range of 30 to 50
  • the support body is heated to fix the inorganic acid, preferably on a temperature in a range of 300 to 600 0 CC, moreover, preferably in a range of 400 to 500 0 C.
  • the dehydration is carried out in the gas phase.
  • customary apparatuses such as those known to those skilled in the gas phase reaction, for example tubular reactors, can be used.
  • Particularly preferred is the use of tube bundle heat exchangers and of reactors, which include thermoplates as heat exchangers.
  • pure 3-hydroxyisobutyric acid is introduced into a reactor comprising one of the aforementioned fixed bed catalysts.
  • the 3-hydroxyisobutyric acid in the form of an aqueous solution containing 2 to 80 wt .-%, particularly preferably 5 to 50 wt .-% and more preferably 10 to 25 wt .-% of 3-hydroxyisobutyric acid, respectively on the total weight of the aqueous solution introduced into the reactor.
  • the pressure and temperature conditions inside the reactor are chosen so that the 3-hydroxyisobutyric acid or the aqueous solution is in gaseous form when it enters the reactor.
  • the dehydration in the gas phase is preferably carried out in the temperature range between 200 and 400 ° C, more preferably between 250 and 350 0 C.
  • the pressure inside the reactor is in the gas phase dehydration preferably in a range of 0.1 to 50 bar, more preferably in a range of 0.2 to 10 bar, and most preferably in a range of 0.5 to 5 bar.
  • the amount of 3-hydroxyisobutyric acid introduced into the reactor is preferably in the range of 10 to 100% by volume, more preferably in a range of 20 to 100% by volume, in the gas phase dehydration. and most preferably in a range of 30 to 100% by volume.
  • the dehydration is carried out in the liquid phase.
  • the liquid phase dehydration may also be carried out in any apparatus known to those skilled in the art in which a fluid can be heated to a desired reaction temperature, the pressure being sufficient to maintain the reaction components liquid under the desired temperature conditions ,
  • the process of liquid phase dehydration comprises a first process step, in which pure 3-hydroxyisobutyric acid or an aqueous solution containing 5 to 100 wt .-%, particularly preferably 20 to 100 wt .-% and am most preferably 50 to 100% by weight of 3-hydroxyisobutyric acid, based on the total weight of the aqueous solution, is introduced into a reactor.
  • the pressure and temperature conditions inside the reactor are chosen so that the 3-hydroxyisobutyric acid or the aqueous solution is in liquid form when it enters the reactor.
  • the 3-hydroxyisobutyric acid or the aqueous solution in the interior of the dehydration reactor is passed over a fixed catalyst bed in such a way that the liquid phase trickles over the surface of the catalyst particles.
  • a procedure can be carried out, for example, in a trickle bed reactor.
  • the dehydration in the liquid phase is preferably carried out in the temperature range between 200 and 350 0 C, more preferably between 250 and 300 0 C.
  • the pressure inside in the case of the liquid phase dehydration the reactor is preferably in the range from 1 to 50 bar, particularly preferably in the range from 2 to 25 bar and most preferably in the range from 3 to 10 bar.
  • the catalysis of the dehydration can be homogeneous or heterogeneous both in the gas phase dehydration and in the liquid phase dehydration.
  • the catalyst which is then preferably an inorganic acid such as phosphoric acid or sulfuric acid, is first contacted with the pure 3-hydroxyisobutyric acid or with the aqueous solution containing the 3-hydroxyisobutyric acid. Subsequently, the composition thus obtained is introduced into the reactor and converted under the desired pressure and temperature conditions in methacrylic acid. It is also conceivable to introduce the inorganic acid into the reactor independently of the 3-hydroxyisobutyric acid or of the aqueous solution. In this case, the reactor has at least two supply lines, one for the 3
  • the catalyst is in the form of a solid substrate in the reaction space, for example in the form of a fixed bed, in the form of catalyst-coated plates, preferably thermoplates, which are arranged inside the reactor. but in the form of catalyst-coated reactor walls. Possible reactors are described, for example, in DE-A-198 48 208, DE-A-100 19 381 and EP-A-0 234 612.
  • preferably impregnated pore-shaped support bodies are used as catalysts which are brought into contact with inorganic acids. The 3-hydroxyisobutyric acid or the aqueous solution containing the 3-hydroxyisobutyric acid is then brought into contact in vapor or liquid form with the surface of the solid catalyst material.
  • the dehydration of the 3-hydroxyisobutyric acid in the liquid phase at a pressure in a range of 200 to 500 mbar, at a temperature in a range of 200 to 230 0 C and in the presence of alkali metal Ion carried out as a catalyst.
  • the reaction mixture which is obtained after the dehydrogenation is either an aqueous methacrylic acid solution which does not contain catalyst components (such is obtained in the case of a heterogeneously catalyzed dehydration) or else an aqueous methacrylic acid solution, which catalyst (obtained in the case of homogeneously catalyzed dehydration) is obtained.
  • the aqueous methacrylic acid solution can be present in liquid form (if the dehydration has taken place in the liquid phase) or in gaseous form (if the dehydration has taken place in the gas phase).
  • the methacrylic acid solution thus obtained may, according to a particular embodiment of the process according to the invention, be fed, if appropriate, to the esterification without further workup.
  • the methacrylic acid solution with corresponding alcohols such as methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol or 1-butanol and suitable, known in the art esterification catalysts, such as concentrated acids, brought under heating in contact and the methacrylic acid is converted in this way into the corresponding esters.
  • any purifying process known to those skilled in the art can be used, which is conventionally used to purify contaminated (meth) acrylic acid obtained by catalytic gas-phase oxidation of propylene.
  • the methacrylic acid is first condensed to obtain an aqueous methacrylic acid solution.
  • any condensation process known to the person skilled in the art can be used, for example a fractional condensation, as described in WO-A-2004/035514, WO-A-03/014172 or EP-A-EP 1 163 201, or by a total condensation , as described in EP-AO 695 736. It is also conceivable to add additional solvent, in particular water, in the condensation in order to absorb the methacrylic acid as completely as possible.
  • the aqueous methacrylic acid solution obtained after the condensation or else the aqueous methacrylic acid solution obtained in the case of liquid phase dehydration can then be freed of water and other impurities in further purification steps.
  • the water can first be removed in the presence of an entraining agent by azeotropic distillation, as described, for example, in DE-A-198 53 064. It is also conceivable to use high-boiling organic solvents for the removal of Sorption of methacrylic acid, as disclosed for example in EP-AO 974 574. In addition to these distillative processes, it is also possible to use membranes for dewatering, as proposed for example in DE-A-44 01 405. Also conceivable is a purification in the case of
  • the methacrylic acid obtained after dewatering can be further purified in further process steps. So still contained, high-boiling impurities can be removed by further distillation steps. However, it is particularly preferred if the methacrylic acid obtained after the dewatering is purified further by crystallization processes, as described for example in DE-A-101 49 353.
  • the purified methacrylic acid thus obtained may then optionally be subjected to esterification.
  • the carboxyl groups of methacrylic acid can be at least partially esterified before or after the radical polymerization.
  • (S) - or (R) -methylmalonatsemialdehyd and MaIo- natsemialdehyd are natural metabolic products which are formed for example in the degradation of valine, leucine or isoleucine, in the metabolism of propanoate or in the metabolism of pyruvate and because the semialdehyde formed in the course the aforementioned metabolic pathways to the corresponding 3-hydroxyalkanoates can be further reduced
  • the isolated DNA according to the invention can be used to produce recombinant bacteria, which are able to directly form large amounts of 3-hydroxyisobutyric acid (or 3-hydroxypropionic acid).
  • this DNA would also be useful to produce recombinant bacteria based on 3-hydroxyisobutyric acid (or 3-hydroxypropionic acid) ) can produce based polyhydroxyalkanoates.
  • nucleotide identity relative to SEQ ID No. 03, which is defined in alternative d), is determined here by means of known methods Computer programs using algorithms taking into account special needs.
  • Computer programs for determining identity include, but are not limited to, the GCG program package, including
  • BLAST program can be obtained from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and from other sources (BLAST Handbook, Altschul S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894, Altschul S. et al., Supra).
  • the well-known Smith-Waterman algorithm can also be used to determine the nucleotide identity.
  • Preferred parameters for nucleotide comparison include the following:
  • the GAP program is also suitable for use with the above parameters.
  • the above parameters are the default parameters in nucleotide sequence comparison.
  • An identity of 80% according to the above algorithm means 80% identity in the context of the present invention. The same applies to higher identities.
  • sequence which would hybridize with the opposite strand of a sequence according to one of groups a) to d), particularly preferably according to group a), or would hybridize in consideration of the degeneracy of the genetic code indicates a sequence, which hybridises under preferably stringent conditions with the complementary strand of a sequence according to one of the groups a) to d), particularly preferably according to group a), or would hybridise taking into account the degeneracy of the genetic code 2 x SSC or according to the protocol of the dioxygenin labeling kit from Boehringer (Mannheim)
  • Preferred hybridization conditions are eg incubation at 65 ° C. overnight in 7% SDS, 1% BSA, 1 mM EDTA, 250 mM sodium phosphate buffer (pH 7.2) and subsequent washing at 65 ° C with 2 X SSC; 0.1% SDS.
  • Derivatives of the isolated DNA according to the invention which are obtained according to alternative f) by substitution, addition, inversion and / or deletion of one or more bases of a sequence according to one of the groups a) to e)
  • those sequences which in the protein encoding them belong to conservative amino acid substitutes, such as e.g. B. the exchange of glycine for alanine or aspartic acid against glutamic acid drove.
  • Such functionally neutral mutations are referred to as sense mutations and do not lead to any fundamental change in the activity of the polypeptide.
  • an NADPH-dependent malonyl-coenzyme A reductase was first isolated from a cell extract from Metallosphaera sedula and purified. In the purified enzyme thus obtained, the first 20 amino acids of the N-terminal end of the polypeptide were sequenced.
  • a vector preferably an expression vector, comprising a DNA having a sequence according to one of the groups a) to f), as defined above.
  • Suitable vectors are all vectors known to those skilled in the art, which are usually used for introducing DNA into a host cell.
  • Preferred vectors are selected from the group comprising plasmids such as the E.
  • viruses such as bacteriophages, adenoviruses, vaccinia viruses, baculoviruses, measles viruses and retroviruses, cosmids or YACs, with plasmids as vectors most are preferred.
  • the DNA having a sequence according to one of the groups a) to f) is under the control of a regulatable promoter which is suitable for expression of the polypeptide encoded by these DNA sequences in the cell of a microorganism, preferably a Bacterial, yeast or pil cell, more preferably a bacterial cell, most preferably an E. coli cell.
  • a regulatable promoter which is suitable for expression of the polypeptide encoded by these DNA sequences in the cell of a microorganism, preferably a Bacterial, yeast or pil cell, more preferably a bacterial cell, most preferably an E. coli cell.
  • promoters are, for example, the trp promoter or the tac promoter.
  • the vector according to the invention should preferably comprise a ribosome binding site as well as a terminator. It is particularly preferred that the DNA according to the invention is incorporated into an expression cassette of the vector comprising the promoter, the ribosome binding site and the terminator.
  • the vector may further comprise selection genes known to those skilled in the art. The use of the above-described vector for the transformation of a cell as well as the cell obtained by transformation with this vector further contribute to the solution of the abovementioned objects.
  • the cells which can be transformed with the vector according to the invention can be prokaryotes or eukaryotes. These may be mammalian cells (such as human cells), plant cells or microorganisms such as yeasts, fungi or bacteria, with microorganisms being particularly preferred and bacteria and yeasts being most preferred.
  • polypeptide which comprises the amino acid sequence with SEQ. ID No. 04 or an amino acid sequence obtained when at most 40 amino acids, preferably at most 20 amino acids, moreover more preferably at most 10 amino acids, and most preferably at most 5 amino acids in SEQ. ID No. 04 is deleted, inserted, substituted or else attached to the C and / or N-terminal end of the amino acid sequence of SEQ. ID No. 04 are attached has.
  • the polypeptide is an enzyme which comprises both the conversion of (S) - or (R) -methylmalonyl-coenzyme A into (S) - or (R) -methylmalonate-semialdehyde and also the reaction of maleol-coenzyme A to catalyze malonate semialdehyde.
  • a polypeptide may be synthesized, for example, starting from the DNA sequence of SEQ. ID No. 03 or by transformation of a suitable cell with a suitable vector comprising these nucleic acid
  • Sequence expression of the protein encoded by this nucleic acid sequence in the cell, lysis of the cell to obtain a cell extract and subsequent purification of the enzyme by purification techniques known to those skilled in the art, for example by HPLC or other chromatographic methods.
  • a chroma- Tographic purification of the polypeptide from cell extracts can also take advantage of the fact that the polypeptide having the amino acid sequence SEQ. ID No. 04 is heat stable up to a temperature of at least 75 ° C. Therefore, one can heat the cell extract to a temperature of, for example, 75 ° C, which leads to coagulation and thus precipitation of the non-heat-stable polypeptides in the cell extract.
  • the polypeptide having the amino acid sequence SEQ. ID No. 04 remains in non-denatured form in the cell extract.
  • FIG. 1 shows the conversion of succinyl-coenzyme A into methylmalonyl-coenzyme A catalyzed by the enzyme Ei.
  • Hydroxyisobuttric acid according to the first alternative of the cell according to the invention, in which succinyl-coenzyme A is formed as an intermediate and methylmalonate-semialdehyde as a precursor in the preparation of 3-hydroxyisobutyric acid or 3-hydroxyisobutyric acid-based polyhydroxyalkanoates.
  • FIG. 3 shows the reaction of (R) -methylmalonyl-coenzyme A catalyzed by enzymes E 4 , E 6 and E 7 to form 3-hydroxyisobutergic acid according to the second alternative of the cell according to the invention, in which succinyl-coenzyme A as intermediate and methylmalonate -Semialdehyd as a precursor in the preparation of 3-hydroxyisobutyric acid or from 3-hydroxyisobutyric acid-based polyhydroxyalkanoates are formed.
  • FIG. 4 shows the reaction of methylmalonyl coenzyme A catalyzed by the enzymes E 4 , E 5 and E 7 to give 3
  • Hydroxyisobuttric acid according to the third alternative of the cell according to the invention, in which succinyl-coenzyme A is formed as an intermediate and methylmalonate-semialdehyde as precursor in the preparation of 3-hydroxyisobutyric acid or 3-hydroxyisobutyric acid-based polyhydroxyalkanoates.
  • FIG. 5 shows the reaction of 3-hydroxyisobutergic acid catalyzed by the enzymes E 8 and E 9 to give a polyhydroxyalkanoate.
  • FIG. 6 shows the reaction of phosphoenolpyruvate or pyruvate to oxalacetate catalyzed by the enzymes Ei 0 or En according to a particular embodiment of the first, second or third alternative of the cell according to the invention, in which succinyl-coenzyme A as intermediate and methylmalonate-semialdehyde as Precursor in the production of 3-hydroxyisobutyric acid or of polyhydroxyalkanoates based on 3-hydroxyisobutyric acid.
  • FIG. 8 shows the conversion of oxaloacetate into succinyl-coenzyme A catalyzed by the enzymes E13 to E16 and E24 to E 2 6 according to a second particular embodiment of the first, second or third alternative of the cell according to the invention, in the succinyl-coenzyme A as Intermediate and methylmalonate-semialdehyde as a precursor in the preparation of 3-hydroxyisobutyric acid or on 3-
  • Hydroxyisobutyric acid based polyhydroxyalkanoates are formed.
  • FIG. 9 shows the reaction of oxaloacetate to succinyl-coenzyme A catalyzed by the enzymes E16, E24, E27 and E 2 8 according to a third particular embodiment of the first, second or third alternative of the cell according to the invention, in the succinyl-coenzyme A as Intermediate and methylmalonate-semialdehyde as a precursor in the preparation of 3-hydroxyisobutyric acid or on 3-
  • Hydroxyisobutyric acid based polyhydroxyalkanoates are formed.
  • FIG. 10 shows the conversion of L-glutamate into succinyl-coenzyme A catalyzed by the enzymes E 4 6 and E28 according to a further particular embodiment of the first, second or third alternative of the cell according to the invention, in the succinyl-coenzyme A as Intermediate and methylmalonate-semialdehyde as a precursor in the preparation of 3-hydroxyisobutyric acid or on 3-
  • FIG. 11 shows the reaction of acetyl coenzyme A to 3-hydroxyisobutyric acid catalysed by the enzymes E 4 , E 5 and E 47 to E52 according to a first alternative of the second particular embodiment of the cell according to the invention of the cell according to the invention, in which propionyl coenzyme A as an intermediate and methylmalonate semialdehyde as a precursor in the preparation of 3-
  • FIG. 12 shows the reaction of propionyl-coenzyme A to 3-hydroxyisobutyric acid catalyzed by the enzymes E 2 to E 4 , E 6 , E 7 and E 47 to E 52 according to a second alternative of the second particular embodiment of the cell according to the invention in which propionyl-coenzyme A is formed as an intermediate and methylmalonate-semialdehyde as a precursor in the preparation of 3-hydroxyisobutyric acid or of 3-hydroxyisobutyric acid-based polyhydroxyalkanoates.
  • FIG. 13 shows the reaction of propionyl-coenzyme A to 3-hydroxyisobutyric acid catalyzed by the enzymes E 2 to E 4 , E 7 and E 47 to E 52 according to a third alternative of the second particular embodiment of the cell according to the invention
  • Propionyl-coenzyme A as an intermediate and methylmalonate-semialdehyde as a precursor in the preparation of 3-hydroxyisobutyric acid or of 3-hydroxyisobutyric acid based polyhydroxyalkanoates.
  • FIG. 14 shows the conversion of propionyl-coenzyme A to 3-hydroxyisobutyric acid catalyzed by the enzymes E 2 to E 4 , E 7 and E 47 to E 52 according to a fourth fifth alternative of the second particular embodiment of the cell according to the invention
  • propionyl coenzyme A as an intermediate and methylmalonate semialdehyde are formed as a precursor in the preparation of 3-hydroxyisobutyric acid or polyhydroxyalkanoates based on 3-hydroxyisobutyric acid.
  • FIG. 15 shows the conversion of beta-alanine to 3-hydroxyisobutyric acid catalysed by the enzymes Eio to E12, E 5 6, E72 and E73 according to a third particular embodiment of the cell according to the invention, in which acrylyl-coenzyme A as intermediate and methylmalonate Semialdehyde as a precursor in the production of 3-
  • FIG. 16 shows the reaction of pyruvate to 3-hydroxyisobutyric acid catalyzed by the enzymes E 76 to E 79 , E 60 , E 6 i and E 8 according to a first alternative of the first particular embodiment of the second variant of the cell according to the invention, in which isobutyryl Coenzyme A as an intermediate and 3-hydroxyisobutyryl coenzyme A as a precursor in the production of 3-Hydroxyisobutterklaklad or of 3-hydroxyisobutyric acid-based polyhydroxyalkanoates are formed.
  • FIG. 17 shows the conversion of L-valine into 3-hydroxyisobutyric acid catalyzed by the enzymes E 8 , E 60 , E 6x , E 79 and E 8 o according to a second alternative of the first particular embodiment of the second variant of the cell according to the invention the isobutyryl-coenzyme A as an intermediate and 3-hydroxyisobutyryl-coenzyme A as a precursor in the preparation of 3-hydroxyisobutyric acid or of 3-hydroxyisobutyric acid based polyhydroxyalkanoates are formed. Examples Example 1
  • Example 1 The present invention will now be illustrated in Example 1 with reference to a recombinant cell capable of producing 3-hydroxyisobutyric acid via 3-hydroxyisobutyryl-coenzyme A as a precursor and isobutyryl-coenzyme A as an intermediate starting from L-valine as a carbon source.
  • E. coli BL21 DE3
  • the enzymes EC 2.6.1.42 and EC 1.2.4.4 each from Pseudomonas aeruginosa
  • a cluster comprising the three enzymes EC 1.3.99.12, EC 4.2.1.17 and EC 3.1.2.4 (from Acinetobacter calcoaceticus) overexpressed.
  • the enzyme EC 1.2.4.4 is from a gene with the DNA sequence shown in SEQ. ID No. 07 and 08 (GC and ß subunit) encoded, while the enzyme EC 2.6.1.42 from a gene with the DNA sequence shown in SEQ. ID No. 09 is coded.
  • the enzyme EC 1.3.99.12 is from a gene with the DNA sequence with the SEQ. ID No. 10 encodes the enzyme EC 4.2.1.17 from a gene with the DNA sequence according to SEQ. ID No. 11 and the enzyme EC 3.1.2.4 from a gene with the DNA sequence according to SEQ. ID No. 12.
  • Pae 1244 fW (SEQ ID NO: 17) Pae 1244 re 5'-ATGGGTACCCATTCAGACCTCCATC-S ' v (SEQ ID NO: 18)
  • the vector pCDFDuet-1 (having a streptomycin / spectinomycin resistance) is, like the PCR fragment 2.6.1.42, cut by EcoRI / Sali and the restrictions thus obtained are transduced with T4 ligase
  • the fragments were each eluted from the gel and purified with the Qiagen kit QIAquick (according to instructions).
  • the vector pCDFDuet:: 2.6.1.42 and the vector pCR2.1-TOPO:: 1.2.4.4 are digested with BglII / Kpnl. Then the ligation of pCDFDuet:: 2.6.1.42 (BgI-11 / Kpnl) with pCR2.1-TOPO:: 1.2.4.4 to obtain the vector pCDFDuet:: 2.6.1.42-1.2.4.4.
  • E. coli DH5 ⁇ C cells were transformed. The plasmids were isolated.
  • the plasmid pCDFDuet:: 2.6.1.42-1.2.4.4 has the DNA sequence according to SEQ. ID No. 19 on.
  • V-ClusAca Cloning of the Valine Cluster from Acinetobacter calcoaceticus (V-ClusAca)
  • the strain ATCC 33304 Acinetobacter calcoaceticus was cultivated for isolation of total DNA (HH agar or medium).
  • the isolation of total DNA was carried out with the DNEasy kit from Qiagen (L1 and L2) and by a method comprising the method steps i) centrifugation of 1 ml culture, ii) addition of 200 ⁇ l H 2 O to
  • the PCR products were purified and ligated according to the instructions for the plasmid pET101 / D-TOPO and brought into E. coli DH50C.
  • the plasmid pET101 / D-TOPO :: V cluster Aca is obtained.
  • the plasmid pET101 / D-TOPO:: V cluster Aca has the DNA sequence according to SEQ. ID No. 20 on.
  • Hydroxyisobutyric acid from L-valine is able to form
  • E. coli BL21 (DE3) was transformed with plasmids pET101 / D-TOPO :: V-cluster Aca and pCDF-Duet :: 2.6.1.42-1.2.4.4 (plated on LB-Spec. / Amp-medium).
  • the cells thus obtained were capable of converting the L-valine into 3-hydroxyisobutyric acid in a nutrient medium containing L-valine.
  • the wild type of cells E. coli BL21 (DE3), however, could not form detectable levels of 3-hydroxyisobutyric acid in such a nutrient medium.
  • the DNA according to the invention is isolated and the gene is overexpressed in E. coli.
  • Sulfolobus tocodaii was grown in small culture volumes (40-200 ml) at 75 ° C and a pH of 3.0 with shaking (150 rpm). The growth was monitored photometrically by measuring the optical density at 578 nm (OD 578 nm).
  • a modified Sulfolochus medium was used (modified according to Brock et al., Archives of Microbiology 84, pages 54-68, 1972, Suzuki et al., Extremophiles, 6, pp. 39-44, 2002).
  • the source of energy and carbon was yeast extract, casamino acids and glucose.
  • the medium consisted of the following components: basal medium, glucose stock solution, iron stock solution and trace element stock solution.
  • Glucose stock solution (100 times). Glucose (100 g / l). The solution was sterile filtered.
  • Iron stock solution 1000 times. FeCl 3 X 6 H 2 O (20 g / L). The solution was sterile filtered.
  • Isolation of genomic DNA from S. tokodaii Isolation of genomic DNA was performed by the method of Murray and Thompson (Nucleic Acid Research, 8, pp. 4,321-4,325, 1980). For this purpose, 10-50 mg (wet weight) of freshly harvested cells were weighed into a 1.5 ml Eppendorf reaction vessel and in
  • PCR polymerase chain reaction
  • Pfu polymerase (Pfunds, Genaxxon) was used.
  • the Pfu polymerase contains a 3'-5 'exonuclease ("proofreading") function.
  • Table 1 used reaction mixture.
  • the PCR was performed as a hot-start PCR, i. the reaction mixture was incubated at 95 ° C. for 2 minutes before adding the Pfu polymerase. This was followed by 30 cycles of 1 minute each at 95 ° C, 1 minute at 45 ° C and
  • a gene fragment with a length of 1.1 kb was obtained.
  • Example 3 For cloning of the malonyl-coenzyme A reductase gene from Sulfolobus tocodaii, the gene amplified in Example 3 was nonspecific with the
  • the plasmid DNA was prepared using the "QIAprep Spin Plasmid Miniprep Kit” from Qiagen (Hilden) according to the manufacturer's instructions.
  • an expression vector comprising the malonyl-coenzyme A reductase gene
  • the isolated cloning vector obtained in Example 4 is subjected to restriction digestion with the restriction enzymes NcoI and BamRI.
  • 25-27 ⁇ l of plasmid DNA expression vector pTrc99A or pCR T7 / CT topo vector with the incorporated gene of malonyl-coenzyme A reductase
  • the reaction mixture was made up to 50 ⁇ l with H 2 Odest and incubated at the temperature indicated by the manufacturer for 5 h. Before further use, ethanol plating was performed. For this, the DNA was mixed with 3 volumes of 100% ethanol and 0.1 volume of 3 M sodium acetate buffer (pH 5.3) and incubated overnight at -80 or 0 C. 2 After a centrifugation step (20 min, 14,000 rpm, 4 0 C, Eppendorf bench centrifuge), the supernatant was carefully removed and the DNA with
  • alkaline phosphatase is used to remove the 5 'phosphate groups of the linearized double-stranded vector. In this way, the cloning efficiency is increased because religation of the vector is prevented.
  • Calf intestinal alkaline phosphatase was used to dephosphorylate the digested vector. Dephosphorylation was carried out in the same buffer as the restriction digest. 50 .mu.l of the restriction mixture were mixed with 1.5 .mu.l CIAP (CaIf intestine alkaline phosphatase) (lU / ul, Fermentas, St. Leon Red) and incubated at 37 0 C for 30 min. Prior to further use of the cut and dephosphorylated vector, ethanol precipitation was performed as described above.
  • Ligation of the insert DNA with the expression vector uses T4 DNA ligase using plasmid DNA and insert DNA in a molar ratio of 1: 3 - 1: 6.
  • the ligation mixtures had a volume of 50 ⁇ l. Plasmid DNA (2-10 ⁇ l), insert DNA (2-20 ⁇ l), 5 ⁇ l of ligation buffer with DTE (50 mM) and the appropriate amount of sterile H2O of t were pipetted together, vortexed, centrifuged briefly and then incubated at 45 ° C for 5 min. The batch was cooled on ice. 5 ⁇ l of 5 mM ATP and 1.5 ⁇ l of T4 DNA ligase (1 U / ⁇ l, Fermentas, St. Leon-Rot) were added and the batch was mixed. The ligation took place overnight at 16 ° C.
  • the ligation mixture was used directly for the transformation of chemically competent cells.
  • centrifugation was carried out for 1 min at 10,000 rpm, 750 ⁇ l were discarded from the supernatant and the cell precipitate resuspended.
  • 50 .mu.l, 100 .mu.l and 200 .mu.l were streaked on LB plates (Sambrook et al., 1989) with 100 ug / ml ampilcillin and incubated overnight at 37 0 C in an incubator.
  • the plates were rinsed with 1 ml of LB medium.
  • 150 ml LB medium (containing 100 ⁇ g / ml ampilcillin) were then inoculated into 500 ml Erlenmeyer baffled flasks with this cell suspension.
  • the cultures grew at 37 ° C. and 180 rpm. Overexpression was carried out by induction of the promoter in pTrc99A by addition of 0.5 M IPTG (isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside) at an OD 578n In of 0.6. The induced cultures were incubated for 3 h under the conditions mentioned and then in a 2.7 harvested.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • the E. coli strain obtained in Example 6 was digested by means of cell mills. The cell disruption was heated to 85 ° C for 15 min. Non-heat-stable enzymes coagulate and fall during this heat. Since the target protein is heat-stable, it remains contained in the supernatant. To measure the malonyl-coenzyme A reductase activity, the supernatant was diluted 1:50 in TM buffer (50 mM Tris / Cl, 1 mM MgCl 2 , pH 8.1).
  • HIPS buffer 100 mM HEPES / NaOH, 5 mM MgCl 2 , 1 mM dithioerythritol, the 0.5 mM NADPH, 30 ⁇ l of the diluted or undiluted supernatant (for evidence of methylmalonyl-coenzyme A reductase activity) were pipetted.
  • the reaction was started by adding malonyl coenzyme A, the final concentration being 0.5 mM.
  • the decrease in NADPH absorption at 365 nm was determined.
  • the determined enzyme activity was 15.5 ⁇ mol / min / mg protein (15.5 U / mg).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zelle, welche gegenüber ihrem Wildtyp derart gentechnisch verändert wurde, dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr 3-Hydroxyisobuttersäure oder auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierende Polyhydroxyalkanoate über Methylmalonat-Semialdehyd oder 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A als Vorprodukte zu bilden vermag. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle, die durch diese Verfahren erhältliche gentechnisch veränderte Zelle, ein Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten, ein Verfahren zur Herstellung von Methacrylsäure oder Methacrylsäureestern sowie ein Verfahren zur Herstellung von Polymethacrylsäure oder Polymethacrylsäureestern. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine isolierte DNA, einen Vektor, die Verwendung dieses Vektors zur Transformation einer Zelle, eine transformierte Zelle sowie ein Polypeptid.

Description

Mikrobiologische Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure
Die vorliegende Erfindung betrifft gegenüber ihrem Wildtyp gentechnisch veränderte Zellen, Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle, die durch diese Ver- 5 fahren erhältlichen, gentechnisch veränderten Zellen, ein Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyal- kanoaten, ein Verfahren zur Herstellung von Methacrylsäure oder Methacrylsäureestern sowie ein Verfahren zur Herstellt) lung von Polymethacrylsäure oder Polymethacrylsäureestern . Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine isolierte DNA, einen Vektor, die Verwendung dieses Vektors zur Transformation einer Zelle, eine transformierte Zelle sowie ein Polypeptid.
15
Methacrylsäure ist ein bedeutendes Zwischenprodukt, das insbesondere in Form seiner Alkylester zur Herstellung von Polymerisaten Verwendung findet. Ein bekanntes Methacryl- säurederivat ist zum Beispiel der Methylester der Methac- 20 rylsäure. Derzeit beträgt die Weltjahresproduktion an Me- thacrylsäuremethylester ca. 1,5 Millionen Tonnen. Die PoIy- methacrylsäureester sind vielfältig einsetzbare Grundstoffe auf dem Kunststoffsektor .
25 Die kommerzielle Produktion von Methacrylsäure erfolgt üblicherweise durch heterogene, zweistufig katalysierte Gas- phasenoxidation von C4-Kohlenstoff-verbindungen wie Buty- len, Isobutylen, Butan, iso-Butan, t-Butylalkohol oder Me- thacrolein an festen Multimetalloxidmassen als Katalysator.
30 Das dabei erhaltene Produktgasgemisch, welches neben der
Methacrylsäure noch zahlreiche Nebenprodukte enthält, wird anschließend entweder einer Totalkondensation unter Erhalt einer wässrigen Methacrylsäurelösung unterzogen oder in einem geeigneten Lösungsmittelgemisch absorbiert. Danach folgt üblicherweise eine weitere Aufreinigung der so erhaltenen flüssigen Phasen durch Destillation, Kristallisation, Extraktion oder durch eine Kombination dieser Maßnahmen. Neben der katalytischen Gasphasenoxidation von C4- Kohlenstoffverbindungen kann Methacrylsäure auch durch eine katalytische, oxidative Dehydrogenierung aus Isobuttersäure gebildet werden, wie dies beispielsweise in der EP-A- 0 356 315 beschrieben wird. Eine weitere Möglichkeit zur Herstellung von Methacrylsäure bietet der sogenannte "ACH- Prozess", bei dem Acetoncyanohydrin und Schwefelsäure unter Bildung von Methacrylamid als Zwischenprodukt umgesetzt werden, welches dann mit Wasser zur Methacrylsäure weiterreagiert. Anschließend erfolgt eine destillative Aufreini- gung der so erhaltenen Methacrylsäure. Dieses Verfahren ist beispielsweise in der EP-A-I 359 137 beschrieben.
Der Nachteil dieser herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von Methacrylsäure besteht unter anderem darin, dass es sowohl bei der Herstellung der Methacrylsäure selbst als auch bei den nachfolgenden, destillativen Aufreingungsschritten aufgrund der hohen Polymerisationsneigung der Methacrylsäure durch die thermisch belastenden Verfahrensschritte zu einer Bildung von Dimeren oder Oligomeren kommt, was neben dem zusätzlichen Aufreinigungsaufwand auch mit einem Ausbeuteverlust verbunden ist. Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die sich aus dem Stand der Technik ergebenden Nachteile zu ü- berwinden .
Insbesondere lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Methacrylsäure anzugeben, bei dem mit möglichst wenig thermisch belastenden Schritten die Methacrylsäure erhalten werden kann.
Auch sollte es dieses Verfahren ermöglichen, die Methacrylsäure aus nachwachsenden Rohstoffen, insbesondere aus Kohlehydraten und/oder aus Glycerin herzustellen. Einen Beitrag zur Lösung der vorstehend genannten Aufgaben leistet eine Zelle, welche gegenüber ihrem Wildtyp derart gentechnisch verändert wurde, dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr 3-Hydroxyisobuttersäure oder auf 3- Hydroxyisobuttersäure basierende Polyhydroxyalkanoate, vorzugsweise jedoch mehr 3-Hydroxyisobuttersäure zu bilden vermag, wobei diese Bildung vorzugsweise über Methylmalo- nat-Semialdehyd oder über 3-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A als Vorprodukt erfolgt. Sofern die Bildung von 3-Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten über Methylmalonat-Semialdehyd als Vorprodukt erfolgt, ist es weiterhin bevorzugt, dass die Bildung über Succinyl- Coenzym A, Propionyl-Coenzym A oder Acryloyl-Coenzym A, be- sonders bevorzugt über Succinyl-Coenzym A als weiteres Zwischenprodukt erfolgt. Sofern die Bildung von 3- Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten über 3-Hydroxyisobutyryl- Coenzym A als Vorprodukt erfolgt, ist es weiterhin bevor- zugt, dass die Bildung über Isobutyryl-Coenzym A oder über 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A, vorzugsweise über 3- Hydroxybutyryl-Coenzym A als weiteres Zwischenprodukt erfolgt.
Der Begriff „Vorprodukt", wie er hierin verwendet wird, de- finiert eine chemische Verbindung, die in nur einem einzigen Reaktionsschritt auf enzymatischem Weg zu 3- Hydroxyisobuttersäure umgesetzt werden kann, während der Begriff „Zwischenprodukt" eine chemische Verbindung definiert, die nicht in nur einem Reaktionsschritt auf enzyma- tischem Weg zu 3-Hydroxyisobuttersäure umgesetzt werden kann .
Der Begriff „3-Hydroxyisobuttersäure", wie er hierin verwendet wird, beschreibt stets die entsprechende C4- Carbonsäure in derjenigen Form, in der sie nach Bildung durch die entsprechenden Mikroorganismen in Abhängigkeit vom pH-Wert vorliegt. Der Begriff umfasst somit stets die reine Säureform (3-Hydroxyisobuttersäure) , die reine Basenform (3-Hydroxyisobutyrat) sowie Mischungen aus protonier- ter und deprotonierter Form der Säure. Weiterhin umfasst der Begriff „3-Hydroxyisobuttersäure" grundsätzlich sowohl das (R)- als auch das (S) -Stereoisomer, wobei das (S)- Stereoisomer besonders bevorzugt ist.
Die Formulierung „dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr 3-Hydroxyisobuttersäure oder auf 3- Hydroxyisobuttersäure basierende Polyhydroxyalkanoate zu bilden vermag" betrifft auch den Fall, dass der Wildtyp der gentechnisch veränderten Zelle überhaupt keine 3- Hydroxyisobuttersäure oder keine auf 3- Hydroxyisobuttersäure basierende Polyhydroxyalkanoate, zu- mindest aber keine nachweisbaren Mengen dieser Verbindungen zu bilden vermag und erst nach der gentechnischen Veränderung nachweisbare Mengen dieser Komponenten gebildet werden können .
Unter einem „Wildtyp" einer Zelle wird vorzugsweise eine Zelle bezeichnet, deren Genom in einem Zustand vorliegt, wie er natürlicherweise durch die Evolution entstanden ist. Der Begriff wird sowohl für die gesamte Zelle als auch für einzelne Gene verwendet. Unter den Begriff „Wildtyp" fallen daher insbesondere nicht solche Zellen bzw. solche Gene, deren Gensequenzen zumindest teilweise durch den Menschen mittels rekombinanter Verfahren verändert worden sind.
Aus der 3-Hydroxyisobuttersäure kann anschließend durch eine schonende Dehydratisierungsreaktion Methacrylsäure erhalten werden. Im Falle von auf 3-Hydroxyisobuttersäure ba- sierenden Polyhydroxyalkanoate können die in den Zellen enthaltenen Vesikel, welche mit diesen Polyhydroxyalkanoate gefüllt sind, isoliert und anschließend die Polymere unter Erhalt von 3-Hydroxyisobuttersäure gespalten werden, welches dann unter Erhalt von Methacrylsäure dehydratisiert werden kann. Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass die gentechnisch veränderte Zelle derart gentechnisch verändert ist, dass sie in einem definierten Zeitintervall, vorzugsweise innerhalb von 2 Stunden, noch mehr bevorzugt innerhalb von 8 Stunden und am meisten bevorzugt innerhalb von 24 Stunden, mindestens 2mal, besonders bevorzugt mindestens lOmal, darüber hinaus bevorzugt mindestens lOOmal, darüber hinaus noch mehr bevorzugt mindestens l.OOOmal und am meis- ten bevorzugt mindestens lO.OOOmal mehr 3-
Hydroxyisobuttersäure oder auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierende Polyhydroxyalkanoate bildet als der Wildtyp der Zelle. Die Zunahme der Produktbildung kann dabei beispielsweise dadurch bestimmt werden, dass die erfindungsgemäße Zelle und die Wildtyp-Zelle jeweils getrennt unter gleichen Bedingungen (gleiche Zelldichte, gleiches Nährmedium, gleiche Kulturbedingungen) für ein bestimmtes Zeitintervall in einem geeigneten Nährmedium kultiviert werden und anschließend die Menge an Zielprodukt (3-Hydroxyisobuttersäure oder auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierende Polyhydroxyalkanoate) im Nährmedium bestimmt wird.
Die erfindungsgemäßen Zellen können Prokaryonten oder Euka- ryonten sein. Dabei kann es sich um Säugetierzellen (wie etwa Zellen aus dem Menschen) , um pflanzliche Zellen oder um Mikroorganismen wie Hefen, Pilze oder Bakterien handeln, wobei Mikroorganismen besonders bevorzugt und Bakterien und Hefen am meisten bevorzugt sind.
Als Bakterien, Hefen oder Pilze sind insbesondere diejenigen Bakterien, Hefen oder Pilze geeignet, die bei der Deut- sehen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Deutschland, als Bakterien-, Hefeoder Pilz-Stämme hinterlegt sind. Erfindungsgemäß geeignete Bakterien gehören zu den Gattungen, die unter http : //www. dsmz . de/species/bacteria.htm aufgeführt sind, erfindungsgemäß geeignete Hefen gehören zu denjenigen Gattungen, die unter
http : //www. dsmz . de/species/yeasts .htm
aufgeführt sind und erfindungsgemäß geeignete Pilze sind diejenigen, die unter
http : //www. dsmz . de/species/fungi .htm
aufgeführt sind.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Zellen sind diejenigen der Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Acinetobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Candida, Pichia, Kluveromyces, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarro- wia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Burkholderia und Clostridium, wobei Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Escherichia coli, Saccharomyces cerevi- siae, Kluveromyces lactis, Candida blankii, Candida rugosa, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Zy- monomas mobilis, Yarrowia lipolytica, Methylobacterium ex- torquens, Ralstonia eutropha, insbesondere Ralstonia eutropha H16, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter sphaeroi- des, Paracoccus versutus, Pseudomonas aeruginosa, Acineto- bacter calcoaceticus und Pichia pastoris besonders bevorzugt sind.
Gemäß einer ersten Variante der erfindungsgemäßen Zelle erfolgt die Bildung von 3-Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten über Methylmalonat-Semialdehyd als Vorprodukt.
Gemäß einer ersten besonderen Ausführungsform dieser ersten Variante der erfindungsgemäßen Zelle ist es bevorzugt, dass die Bildung der 3-Hydroxyisobuttersäure oder des auf 3- Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoates vorzugsweise über Succinyl-Coenzym A als Zwischenprodukt erfolgt, wobei die Zelle vorzugsweise Kohlenhydrate, Glyce- rin oder Glutamat als Kohlenstoffquelle zu verwerten ver- mag .
Dabei kann es im Zusammenhang mit der ersten besonderen Ausführungsform der ersten Variante der erfindungsgemäßen Zelle vorteilhaft sein, dass die erfindungsgemäße Zelle im Vergleich zu ihrem Wildtyp eine gesteigerte Aktivität eines Enzyms Ei aufweist, welches die Umsetzung von Succinyl- Coenzym A zu Methylmalonyl-Coenzym A katalysiert (siehe die Figur 1) .
Der Begriff „gesteigerte Aktivität eines Enzyms", wie er vorstehend im Zusammenhang mit dem Enzym Ei und in den nachfolgenden Ausführungen im Zusammenhang mit den Enzymen E2 usw. verwendet wird, ist vorzugsweise als gesteigerte intrazelluläre Aktivität zu verstehen.
Die nun folgenden Ausführungen zur Erhöhung der Enzymaktivität in Zellen gelten sowohl für die Erhöhung der Aktivi- tat des Enzyms Ei als auch für alle nachfolgend genannten Enzyme, deren Aktivität gegebenenfalls erhöht werden kann.
Grundsätzlich lässt sich eine Steigerung der enzymatischen Aktivität dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der Gensequenz bzw. der Gensequenzen erhöht, welche für das En- zym kodieren, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen oder Allel nutzt, das für ein entsprechendes Enzym mit einer gesteigerten Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. Erfindungsgemäß gentechnisch veränderte Zellen werden beispielsweise durch Transformation, Transduktion, Konjugation oder einer Kombination dieser Methoden mit einem Vektor erzeugt, der das gewünschte Gen, ein Allel dieses Gens oder Teile davon und einen die Expression des Gens ermöglichenden Vektor enthält. Die hete- rologe Expression wird insbesondere durch Integration des Gens oder der Allele in das Chromosom der Zelle oder einem extrachromosomal replizierenden Vektor erzielt.
Einen Überblick über die Möglichkeiten zur Erhöhung der En- zym-Aktivitat in Zellen am Beispiel der Pyruvat-Carboxylase gibt DE-A-100 31 999, die hiermit als Referenz eingeführt wird und deren Offenbarungsgehalt hinsichtlich der Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzym-Aktivitat in Zellen einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung bildet.
Die Expression der vorstehend und aller nachfolgend genann- ten Enzyme bzw. Gene ist mit Hilfe von 1- und 2- dimensionaler Proteingelauftrennung und anschließender optischer Identifizierung der Proteinkonzentration mit entsprechender Auswertesoftware im Gel nachweisbar. Wenn die Erhöhung einer Enzymaktivitat ausschließlich auf einer Er- hohung der Expression des entsprechenden Gens basiert, so kann die Quantifizierung der Erhöhung der Enzymaktivitat in einfacher Weise durch einen Vergleich der 1- oder 2- dimensionalen Proteinauftrennungen zwischen Wildtyp und gentechnisch veränderter Zelle bestimmt werden. Eine ge- brauchliche Methode zur Praparation der Proteingele bei co- ryneformen Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al . (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001) beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot-Hybridisierung mit ei- nem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al . , Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, N. Y. USA, 1989) und anschließender optische Auswertung mit entsprechender Software zur Konzentrationsbestim- mung (Lohaus und Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39;
Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630-2647) analysiert werden. Die Aktivität von DNA-bindenden Proteinen kann mittels DNA-Band-Shift-Assays (auch als Gelretardation bezeichnet) gemessen werden (Wilson et al . (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155). Die Wirkung von DNA- bindenden Proteinen auf die Expression anderer Gene kann durch verschiedene gut beschriebene Methoden des Reporter- gen-Assays nachgewiesen werden (Sambrook et al . , Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, N. Y. USA, 1989) . Die intrazellulären enzymatischen Aktivitäten können nach verschiedenen beschriebenen Methoden (Donahue et al . (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627; Ray et al . (2000) Journal of Bacteriology 182 (8) : 2277-2284; Freed- berg et al . (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816- 823) bestimmt werden. Sofern in den nachfolgenden Ausführungen keine konkreten Methoden zur Bestimmung der Aktivität eines bestimmten Enzyms angegeben werden, erfolgt die Bestimmung der Steigerung der Enzymaktivität und auch die Bestimmung der Verminderung einer Enzymaktivität vorzugs- weise mittels der in Hermann et al . , Electophoresis, 22: 1712-23 (2001), Lohaus et al . , Biospektrum 5 32- 39 (1998), Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630- 2647 (1999) und Wilson et al . , Journal of Bacteriology 183: 2151-2155 (2001) beschriebenen Methoden. Wird die Erhöhung der Enzymaktivität durch Mutation des endogenen Gens bewerkstelligt, so können derartige Mutationen entweder nach klassischen Methoden ungerichtet erzeugt werden, wie etwa durch UV-Bestrahlung oder durch mutationsaus- lösende Chemikalien, oder gezielt mittels gentechnologi- scher Methoden wie Deletion (en) , Insertion (en) und/oder Nukleotidaustausch (e) . Durch diese Mutationen werden gentechnisch veränderte Zellen erhalten. Besonders bevorzugte Mutanten von Enzymen sind insbesondere auch solche Enzyme, die nicht mehr oder zumindest im Vergleich zum Wildtyp- Enzym vermindert jfeedfoacfc-inhibierbar sind.
Wird die Erhöhung der Enzymaktivität durch Erhöhung der Expression eines Enzyms bewerkstelligt, so erhöht man beispielsweise die Kopienzahl der entsprechenden Gene oder mutiert die Promotor- und Regulationsregion oder die Riboso- menbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusatzlich möglich, die Expression zu jedem beliebigen Zeitpunkt zu steigern. Des Weiteren können dem Enzym-Gen als regulatorische Sequenzen aber auch sogenannte "Enhancer" zugeordnet sein, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA ebenfalls eine erhöhte Genexpression bewirken. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die En- zymaktivitat verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte liegen dabei entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vor oder sind im Chromosom integriert und amplifi- ziert. Alternativ kann weiterhin eine Uberexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturfuhrung erreicht werden. Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al . (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al . (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns et al . (Gene 102, 93-98 (1991)), in EP-A-O 472 869, im US 4,601,893, bei Schwarzer und Puhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), bei Reinscheid et al . (Applied and Environ- mental Microbiology 60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al . (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), in WO-A- 96/15246, bei Malumbres et al . (Gene 134, 15-24 (1993), in JP-A-10-229891 , bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)) und in bekannten Lehrbuchern der Genetik und Molekularbiologie. Die vorstehend be- schriebenen Maßnahmen fuhren ebenso wie die Mutationen zu gentechnisch veränderten Zellen.
Zur Erhöhung der Expression der jeweiligen Gene werden zum Beispiel episomale Plasmide eingesetzt. Als Plasmide eignen sich insbesondere solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren, wie zum Beispiel pZl (Menkel et al . , Applied and Environmental Microbiology 64: 549-554 (1989)), pEKExl (Eikmanns et al., Gene 107: 69-74 (1991)) oder pHS2-l (Sonnen et al . , Gene 107: 69-74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBLl oder pGAl . Andere Plasmidvektoren, wie zum Beispiel solche, die auf pCG4 (US 4,489,160) oder pNG2
(Serwold-Davis et al . , FEMS Microbiology Letters 66: 119- 124 (1990)) oder pAGl (US 5,158,891) beruhen, können in gleicher Weise eingesetzt werden.
Weiterhin eignen sich auch solche Plasmidevektoren, mit Hilfe derer man das Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es beispielsweise von Reinscheid et al. (Applied and Environmen- tal Microbiology 60: 126-132 (1994)) zur Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige Gen in einen Plasmid- vektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise Escherichia coli) , nicht aber in Corynebacterium glutamicum repliziert werden kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al . , Bio/Technology 1: 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al . , Gene 145: 69-
73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, Wisconsin, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman, Journal of Biological Che- mistry 269: 32678-84 (1994)), pCR®Blunt (Invitrogen, Groningen, Niederlande), pEMl (Schrumpf et al . , Journal of Bacteriology 173: 4510-4516)) oder pBGSδ (Spratt et al . , Gene 41: 337-342 (1986)) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von Corynebacterium glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al . , Applied and Environmental Microbiology 60: 756-759 (1994) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al . , Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356-362 (1988), Dunican und Shivnan, Bio/Technology 7: 1067-1070 (1989) und Tauch et al., FEMS Microbiology Letters 123: 343-347 (1994) beschrieben. Nach homologer Rekom- bination mittels eines „cross-over"-Ereignisses enthalt der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens .
Unter der vorstehend und in den nachfolgenden Ausfuhrungen verwendeten Formulierung „eine gegenüber ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms Ex" ist vorzugsweise stets eine um ein en Faktor von mindestens 2, besonders bevorzugt von mindestens 10, darüber hinaus bevorzugt von mindestens 100, darüber hinaus noch mehr bevorzugt von mindestens 1.000 und am meisten bevorzugt von mindestens 10.000 gesteigerte Aktivität des jeweiligen Enzyms Ex zu verstehen. Weiterhin umfasst die erfindungsgemaße Zelle, welche „eine gegenüber ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms Ex" aufweist, insbesondere auch eine Zelle, deren Wildtyp keine oder zumindest keine nachweisbare Aktivität dieses Enzyms Ex aufweist und die erst nach Erhöhung der Enzymak- tivitat, beispielsweise durch Uberexpression, eine nachweisbare Aktivität dieses Enzyms Ex zeigt. In diesem Zusammenhang umfasst der Begriff „Uberexpression" oder die in den nachfolgenden Ausfuhrungen verwendete Formulierung „Erhöhung der Expression" auch den Fall, dass eine Ausgangszelle, beispielsweise eine Wildtyp-Zelle, keine oder zumindest keine nachweisbare Expression aufweist und erst durch rekombinante Verfahren eine nachweisbare Expression des En- zyms Ex induziert wird.
Unter der nachfolgend verwendeten Formulierung „verminderte Aktivität eines Enzyms Ex" wird dementsprechend vorzugsweise eine um einen Faktor von mindestens 0,5, besonders bevorzugt von mindestens 0,1, darüber hinaus bevorzugt von mindestens 0,01, darüber hinaus noch mehr bevorzugt von mindestens 0,001 und am meisten bevorzugt von mindestens 0,0001 verminderte Aktivität verstanden. Die Verminderung der Aktivität eines bestimmten Enzyms kann beispielsweise durch gezielte Mutation, durch Zugabe von kompetitven oder nicht kompetitiven Inhibitoren oder durch andere, dem Fach- mann bekannte Maßnahmen zur Verminderung der Expression eines bestimmten Enzyms erfolgen.
Bei dem Enzym Ei, welches die Umsetzung von Succinyl- Coenzym A zu Methylmalonyl-Coenzym A katalysiert, handelt es sich vorzugsweise um eine Methylmalonyl-Coenzym A-Mutase (EC 5.4.99.2) ist. Dieses Enzym wird vorzugsweise von den Genen kodiert ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus mut, mutA, mutB, sbm, sbmA, sbmB, sbm5, bhbA, mcmA, mcmAl, mcmA2, mcmB, mcml, mcm2, mcm3, icmA, meaAl und meaA2. Die Nukleotidsequenz dieser Gene können beispielsweise der „Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes" (KEGG-Datenbank) , den Datenbanken des National Center for Biotechnology Information (NCBI) der National Library of Medicine (Bethes- da, MD, USA) oder der Nukleotidsequenz-Datenbank der Euro- pean Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland bzw. Cambridge, UK) entnommen werden.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der ersten Variante der erfindungsgemäßen Zelle handelt es sich bei dem Enzym Ei um die Methylmalonyl-Coenzym A-Mutase aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, die von einem Gen mit der DNA-Sequenz gemäß SEQ. -ID-NR. 01 kodiert und die Aminosäuresequenz gemäß SEQ. -ID-Nr. 02 aufweist.
Weiterhin ist es gemäß einer ersten Alternative der erfindungsgemäßen Zelle, bei der Succinyl-Coenzym A als Zwi- schenprodukt und Methylmalonat-Semialdehyd als Vorprodukt bei der Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoa- ten gebildet werden, bevorzugt, dass die Zelle, gegebenenfalls zusätzlich zur gesteigerten Aktivität des Enzyms Ei, eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme E2 bis E4 aufweist (siehe die Figur 2) : eines Enzyms E2, welches die Umsetzung von Methylmalonyl-Coenzym A zu Methylmalonat katalysiert; eines Enzyms E3, welches die Umsetzung von Methylmalo- nat zu Methylmalonatsemialdehyd katalysiert; eines Enzyms E4, welches die Umsetzung von Methylmalonatsemialdehyd zu 3-Hydroxyisobuttersäure katalysiert. Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Zellen sind dabei diejenigen, bei denen die Aktivität folgender Enzyme oder Enzymkombinationen gesteigert ist: E2, E3, E4, E2E3, E2E4, EaE4, E2EaE4, wobei E2EsE4 am meisten bevorzugt ist. Weiterhin ist es möglich, dass ein Enzym auch mindestens zwei der vorste- hend beschriebenen Reaktionsschritte zu katalysieren vermag. So kann beispielsweise ein Enzym eingesetzt werden, welches sowohl die Aktivität des Enzyms E2 als auch die des Enzyms E3 aufweist (und somit die Umsetzung von Methylmalo- nyl-Coenzym A direkt zum Methylmalonat-Semialdehyd kataly- siert) , wie beispielsweise die Malyonyl-Coenzym A-Reduktase aus Sulfolobus tokodaii, welche von der DNA-Sequenz mit der Seq. -ID. -Nr. 03 kodiert wird und welche die Aminosäuresequenz gemäß Seq. -ID. -Nr. 04 aufweist, oder aber ein Enzym, welches alle drei Enzymaktivitäten E2, E3 und E4 aufweist, wie die Malonyl-Coenzym A-Reduktase aus Chloroflexus auran- tiacus (Hügler et al . , Journal of Bacteriology 184, Seiten 2.404-2.410, 2002) .
In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, dass das Enzym E2 eine Methylmalonyl-Coenzym A-Hydrolase (EC 3.1.2.17),
E3 eine Aldehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.3) oder eine Alde- hyd-Oxidase (EC 1.2.3.1) und
E4 eine 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.31) oder eine 3-Hydroxyacyl-Coenzym A-Dehydrogenase (EC 1.1.1.35)
ist. Das Enzym E2 wird vorzugsweise vom aoxl-Gen kodiert. Die Methylmalonyl-Coenzym A-Hydrolase aus der Leber der Ratte ist beispielsweise in Kovachy et al., „Recognition, isola- tion, and characterization of rat liver D-methylmalonyl coenzyme A hydrolase", J. Biol. Chem. 258 (1983), Seiten 11.415-11.421 beschrieben.
Das Enzym E3 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus aldh2, aldh3al, aldh3a2, aldhlbl, aldh9al, aldh7al, aldhla4, aldhlal, aldhla2, mgc80785, mgc83352, mgc89020, dmel-CG31075, cg3752, cg9629, alh-9, alh-1, alh-2, f5O8.35, t7O23.15, fl5I1.19, tT17F15.130, aldl, ald2, ald4, ald5, aldβ, aclO44Wp, adr417wp, msc7, tb06.5F5.780, aldH, puuC, putA, aldA, badH, alkH, pcD, rspl591, rs01031, exaC, acoD, dhaL, pchA, aldB, dhaS, betB, ywdH, ycbD, aldX, aldY, aldAl, aldA2, aldC, pcd, cglO546, cgl2668, cgl2796, scgllA.05, sci30A.27c, sce9.27c, sckl3.05c, sc5H4.03, thcA, gabD2, alkH, aldH, aldHl, aldYl, aldY2, aldY3, aldY4, aldY5, aldY6, aldY7 und aldhT kodiert.
Geeignete Gene für das Enzym E4 sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus hibadh, cgl5093, cgl5093, cg4747, mwL2.23, tl3kl4.90, fl9bl5.150, hibA, ygbJ, mmsB, mmsB, garR, tsar, mmsB-1, mmsB-2, yfjR, ykwC, ywjF, hibD, glxR, SCMl.40c, hibD, ehhahd, hadh2, hadhsc, hsdl7B4, Ioc488110, had, mgC81885, hadh2-prov, cg3415, cg7113, ech-1, ech-8, ech-9, ard-1, yfcX, fadB, faoA, fadB2x, hbd-1, hbd-2, hbd- 3, hbd-4, hbd-5, hbd-6, hbd-7, hbd-8, hbd-9, hbd-10, fadJ, rsO4421, rsO2946, rsO5766, bbsD, bbsC, fadBl, fadB2, fadB5, hbdA, pimF, fabJ-1, fabJ, scbacl9f3.11, sci35.13, scbacδdl.lOc, sc5f2a.l5, sc6a5.38, fadC2, fadC4, fadC5, fadC6, had und paaH. Weitere geeignete 3-Hydroxyisobutyrat- Dehydrogenasen sind beispielsweise in Bannerjee et al . (1970), J. Biol. Chem, 245, Seiten 1.828 bis 1.835, Steele et al. (1992), J. Biol. Chem., 267, Seiten 13.585 bis 13.592, Harris et al . (1988), J. Biol. Chem., 263, Seiten 327 bis 331, Harris et al . , Biochim. Biophys . Acta,
1645 (1), Seiten 89 bis 95, Hawes et al . (2000), Methods Enzymol., 324, Seiten 218 bis 228, Harris et al., J. Biol . Chem., 275 (49), Seiten 38.780 bis 38.786, Rougraff et al . (1988), J. Biol. Chem., 263(1), Seiten 327 bis 331, Robinson et al . , J. Biol. Chem., 225, Seiten 511 bis 521, Hawes et al. (1995), Biochemistry, 34, Seiten 4.231 bis 4.237, Hasegawa J. (1981), Agric . Biol. Chem., 45, Seiten 2.805 bis 2814, Hawes et al . (1996), FEBS Lett . , 389, Seiten 263 bis 267, Hawes et al . (1996), Enzymology and Molecular Bi- ology of Carbonyl Metabolism, Plenum Press, New York, Seiten 395 bis 402, Adams et al . (1994), Structure, 2, Seiten 651 bis 668, Zhang et al . (1999), Biochemistry, 38, Seiten 11.231 bis 11.238, Mirny et al . , (1999), J. Mol. Biol., 291, Seiten 177 bis 196 und Lokanath et al . (2005), J Mol Biol., beschrieben. Die Offenbarung dieser Druckschrif- ten wird hiermit als Referenz eingeführt und bildet einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung.
Die Nukleotidsequenzen der vorstehend genannten Gene sowie weiterer Gene für die Enzyme E2 bis E4 können unter anderem auch der KEGG-Datenbank, der NCBI-Datenbank oder EMBL- Datenbank entnommen werden.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform dieser Alternative der erfindungsgemäßen Zelle, bei der Succinyl- Coenzym A als Zwischenprodukt und Methylmalonat-Semialdehyd als Vorprodukt bei der Herstellung von 3- Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten gebildet werden, ist es bevorzugt, dass für die Umsetzung von Methylmalonyl- Coenzym A zum Methylmalonat-Semialdehyd die Malonyl- Coenzym A-Reduktase aus Sulfolobus tokodaii eingesetzt wird, welche von DNA-Sequenz mit der Seq. -ID. -Nr. 03 kodiert wird und welche die Aminosäuresequenz gemäß Seq. -ID.- Nr. 04 aufweist. Gemäß einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform dieser Variante wird für die Umsetzung von Methylmalonyl-Coenzym A zur 3-Hydroxyisobuttersäure die Ma- lonyl-Coenzym A-Reduktase aus Chloroflexus aurantiacus ein- gesetzt (Hügler et al . , Journal of Bacteriology 184, Seiten 2.404-2.410, 2002) .
Weiterhin ist es in Zusammenhang mit dieser ersten Alternative der ersten besonderen Ausführungsform der erfindungs- gemäßen Zelle bevorzugt, dass die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp verminderte Aktivität eines Enzyms E5 aufweist, welches die Umsetzung von Methylmalonatsemialdehyd zu Propionyl-Coenzym A aufweist, wobei es sich bei diesem Enzym vorzugsweise um eine Methylmalonatsemialdehyd- Dehydrogenase (EC 1.2.1.27) handelt.
Gemäß einer zweiten Alternative der erfindungsgemäßen Zelle, bei der Succinyl-Coenzym A als Zwischenprodukt und Me- thylmalonat-Semialdehyd als Vorprodukt bei der Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-
Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten gebildet werden, ist es bevorzugt, dass die Zelle, gegebenenfalls zusätzlich zur gesteigerten Aktivität des Enzyms Ei, eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme E4 bis E7 aufweist (siehe die Figur 3) : eines Enzyms E6, welches die Umsetzung von (R) - Methylmalonyl-Coenzym A zu (S) -Methylmalonyl-Coenzym A katalysiert; - eines Enzyms E7, welches die Umsetzung von (S)-
Methylmalonyl-Coenzym A zu Propionyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E5, welches die Umsetzung von Propionyl- Coenzym A zu Methylmalonatsemialdehyd katalysiert; - eines Enzyms E4, welches die Umsetzung von Methylmalonatsemialdehyd zu 3-Hydroxyisobuttersäure katalysiert.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Zellen sind dabei diejenigen, bei denen die Aktivität folgender Enzyme oder En- zymkombinationen gesteigert ist: E4, E5, E6, E7, E4E5, E4E6, E4E7, E5E6, E5E7, E6E7, E4E5E6, E4E5E7, E4E6E7, E5E6E7 und E4E5E6E7, wobei E4E5E6E7 am meisten bevorzugt ist.
In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, dass das Enzym
E6 eine Methylmalonyl-Coenzym A-Epimerase (EC 5.1.99.1),
E7 eine Methylmalonyl-Coenzym A-Decarboxylase (EC 4.1.1.41) , E5 eine Methylmalonatsemialdehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.27) , und
E4 eine 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.31) oder eine 3-Hydroxyacyl-Coenzym A-Dehydrogenase (EC 1.1.1.35)
ist.
Bevorzugt Enzyme E4 sind dabei diejenigen, die bereits vorstehend im Zusammenhang mit der ersten Variante der ersten bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zelle be- schrieben worden sind.
Das Enzym E6 wird vorzugsweise vom mcee-Gen kodiert. Eine geeignete Methylmalonyl-Coenzym A-Decarboxylase (Enzym E7) ist beispielsweise in Biochemistry, Vol. 39 (2000), Seiten 4.630-4.639 durch Benning et al . beschrieben. Geeignete Gene für das Enzym E5 sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus aldhβal, cgl7896, t22cl2.10, aldβ, putAl, mmsA, mmsA-1, mmsA-2, mmsA-3, mmsA- 4, msdA, iolA und iolAB.
Geeignete Gene für das Enzym E7 sind vorzugsweise ausge- wählt aus der Gruppe bestehend aus mmdA, bcc, oadB, oadB2, oadB3, SC1C2.16, SC1G7.10, pccBl, accA2, mmdB, mmdC und ppcB. Die Nukleotidsequenzen der vorstehend genannten Gene für die Enzyme E5, E6 und E7 können unter anderem auch der KEGG- Datenbank entnommen werden.
Gemäß einer dritten Alternative der erfindungsgemäßen Zelle, bei der Succinyl-Coenzym A als Zwischenprodukt und Me- thylmalonat-Semialdehyd als Vorprodukt bei der Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-
Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten ge- bildet werden, ist es bevorzugt, dass die Zelle, gegebenenfalls zusätzlich zur gesteigerten Aktivität des Enzyms Ei, eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme E4, E5 und E7 aufweist (siehe die Figur 4) : - eines Enzyms E7, welches die Umsetzung von Methylmalo- nyl-Coenzym A zu Propionyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E5, welches die Umsetzung von Propionyl- Coenzym A zu Methylmalonatsemialdehyd katalysiert; eines Enzyms E4, welches die Umsetzung von Methylmalo- natsemialdehyd zu 3-Hydroxyisobuttersäure katalysiert.
Dieser Weg entspricht im Wesentlichen der zweiten Variante der ersten bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zelle, wobei jedoch im Unterschied zur zweiten Variante die Herstellung von Propionyl-CoA unmittelbar aus Methylma- lonyl-Coenzym A erfolgt. Bevorzugte Enzyme und Gene für die Enzyme E4, E5 und E7 sind diejenigen Gene bzw. Enzyme, die bereits vorstehend im Zusammenhang mit der zweiten Variante genannt worden sind.
Weiterhin kann es gemäß der ersten besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zelle (und auch gemäß aller nachfolgend noch beschriebenen Ausführungsformen) auch bevorzugt sein, dass die Zelle in der Lage ist, die gebildete 3-Hydroxyisobuttersäure in ein Polyhydroxyalkanoat umzuwandeln. Solche Polyhydroxyalkanoate werden von vielen Mikroorganismen in Form von stark lichtbrechenden Granula intrazellulär abgelagert. In diesem Zusammenhang ist es insbe- sondere bevorzugt, dass die erfindungsgemäße Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der, vorzugsweise der beiden folgenden Enzyme Eg und Eio aufweist (siehe die Figur 5) :
- eines Enzyms E8, welches die Umsetzung von 3-
Hydroxyisobuttersäure zu 3-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms Eg, welches die Umsetzung von 3- Hydroxyisobutyryl-Coenzym A zu einem auf 3- Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoat katalysiert .
In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, dass das Enzym
E8 eine 3-Hydroxyisobutyryl-CoA-Hydrolase (EC 3.1.2.4) und Eg eine Polyhydroxyalkanoat-Synthase
ist. Wie bereits vorstehend erläutert, entsteht bei der ersten bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zelle die 3-Hydroxyisobuttersäure oder die auf 3-
Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoate aus Succinyl-Coenzym A als Zwischenprodukt und aus Methylmalo- nat-Semidaldehyd als Vorprodukt. Dabei kann es grundsätzlich sinnvoll sein, neben einer Beeinflussung einer oder mehrerer der vorstehend genannten Enzymaktivitäten Ei bis E9 auch solche Enzymaktivitäten zu beeinflussen, welche zu einer Erhöhung der Bildung von Succinyl-Coenzym A in der Zelle führen.
Sofern gemäß der ersten besonderen Ausführungsform der ersten Variante der erfindungsgemäßen Zelle die Bildung der 3- Hydroxyisobuttersäure oder des auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoates über Succinyl-Coenzym A als Zwischenprodukt und Methylmalonat-Semialdehyd als Vorprodukt aus Kohlenhydraten oder Glycerin erfolgt, ist es gemäß einer besonderen Ausgestaltung der vorstehend be- schriebenen ersten, zweiten oder dritten Alternative der erfindungsgemäßen Zelle bevorzugt, dass die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der, vorzugsweise der beiden folgenden Enzyme Ei0 und En aufweist (siehe die Figur 6) :
eines Enzyms Eio, welches die Umsetzung von Phosphoe- nolpyruvat zu Oxalacetat katalysiert; eines Enzyms En, welches die Umsetzung von Pyruvat zu Oxalacetat katalysiert. In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, dass das Enzym
Eio eine Phosphoenolpyruvat-Carboxylase (EC 4.1.1.31) und En eine Pyruvat-Carboxylase (EC 6.4.1.1)
ist.
Das Enzym Ei0 wird vorzugsweise von den Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend fl2ml6.21, fl4n22.13, kl5m2.8, ppc, clpA, pepC, capP, cgll585, pepC, pck, ppc und pccA kodiert, wobei das ppc-Gen besonders bevorzugt ist. Erfindungsgemäß bevorzugte Phosphoenolpyruvat-Carboxylasen sind insbesondere auch in US 4,757,009, US 4,980,285, US 5,573,945, US 6,872,553 und US 6,599,732 beschrieben. Der Offenbarungsgehalt dieser Druckschriften im Hinblick auf Phosphoenolpyruvat-Carboxylasen wird hiermit als Referenz eingeführt und bildet einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung.
Das Enzym En wird vorzugsweise von den Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend pc, pcx, cgl516, cgl516, pyc-1, pyc-2, aarl62Cp, pyrl, accC-2, pycA, pycA2, pca, cglO689, pyc, pycB, accC, oadA, acc und accCl kodiert, wobei das pyc-Gen besonders bevorzugt ist. Erfindungsgemäß bevorzugte Pyruvat-Carboxylasen sind insbesondere auch in US 6,455,284, US 6,171,833, US 6,884,606, US 6,403,351, US 6,852,516 und US 6,861,246 beschrieben. Eine weitere, erfindungsgemäß besonders bevorzugte Pyruvat-Carboxylase ist diejenige Mutante, die in „A novel methodology employ- ing Corynebacterium glutamicum genome Information to gene- rate a new L-lysine-producing mutant ." , Ohnishi J et al . , Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 58 (2), Seiten 217-223 (2002) beschrieben ist. Die Nukleotidsequenzen geeigneter Gene der Enzyme En und E12 können der KEGG-Datenbank, der NCBI-Datenbank oder EMBL-Datenbank entnommen werden.
Von der Oxalacetat-Zwischenstufe gibt es mehrere Möglichkeiten, um zum Succinyl-Coenzym A zu gelangen, welches dann über Methylmalonyl-Coenzym A mittel der drei eingangs genannten Varianten zu 3-Hydroxyisbuttersäure umgesetzt werden kann.
Ein erster Weg führt über Fumarat als Zwischenprodukt. In diesem Fall ist es gemäß einer ersten besonderen Ausgestal- tung der vorstehend beschriebenen ersten, zweiten oder dritten Alternative der erfindungsgemäßen Zelle, bei der Methylmalonat-Semialdehyd als Vorprodukt und Succinyl- Coenzym A als Zwischenprodukt gebildet werden bevorzugt, dass die Zelle, gegebenenfalls zusätzlich zu einer gestei- gerten Aktivität des Enzyms Ei0 oder En, eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme E12 bis Ei5 aufweist (siehe die Figur 7) : eines Enzyms E12, welches die Umsetzung von Oxalacetat zu Malat katalysiert; - eines Enzyms Ei3, welches die Umsetzung von Malat zu Fumarat katalysiert; eines Enzyms Ei4, welches die Umsetzung von Fumarat zu Succinat katalysiert; eines Enzyms Ei5, welches die Umsetzung von Succinat zu Succinyl-Coemzym A katalysiert.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Zellen sind dabei diejenigen, bei denen die Aktivität folgender Enzyme oder Enzymkombinationen gesteigert ist: E12, E13, Ei4, Ei5, Ei2Ei3, E12E14, Ei2Ei5, E13E14, Ei3Ei5, Ei4Ei5, Ei2Ei3Ei4, Ei2Ei3Ei5, Ei2Ei4Ei5, Ei3Ei4Ei5, Ei2Ei3Ei4Ei5, wobei Ei2Ei3Ei4Ei5 am meisten bevorzugt ist.
In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, dass das Enzym
Ei2 eine Malat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.37) oder eine Malat- Chinon-Oxidoreduktase (1.1.99.16),
Ei3 eine Fumarat-Hydratase (EC 4.2.1.2),
Ei4 eine Succinat-Dehydrogenase (EC 1.3.99.1 oder
EC 1.3.5.1) oder eine Succinat-Chinon-Oxidoreduktase (1.3.5.1), und
Ei5 eine Succinat-Coenzym A-Ligase (EC 6.2.1.4 oder EC 6.2.1.5)
ist. Das Enzym E12 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend mdhl, mdh2, morl, cglO748, cglO749, cg5362, mdh-1, f46el0.10, fl9pl9.13, fl2ml6.14, t30120.4, kl5.n2.16, flp2.70, fl7il4.150, mnll2.18, mikl9.17, mdh3, adll64cp, adrl52cp, adr252wp, mdhA, mdhC, mdhB, ybiC, mdh, yiaK, ybiC, allD, citH, yjmC, citH, cgl2380, ldh, sqdB, mqo, yojH, mqoA, mqoB, mqol, mqo2, mqo3, mqo4 und cgl2001 kodiert, wobei das mqo-Gen und das mdh-Gen besonders bevorzugt sind.
Das Enzym E13 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend fh, fhl, sc4094, sc4095, t30b22.19, k3k7.11, acrO13Cp, fuml, fum2, fum3, fum4, fumH, fumA, fumB, fumC, fumCl, fumC2, fum, ttdA, ttdB, fumB-alpha, fumB-beta, citG, citB, fumX, fum-1 und fum-2 kodiert, wobei das fum-Gen besonders bevorzugt ist.
Das Enzym Ei4 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend sdhl, sdh2, sdh3, sdh4, sdh5, sdhβ, osml, osm2, sdhA, sdhB, sdhC, sdhD, frdA, frdB, frdC, frdD, ifcA-1, ifcA-2, sdhB-1, sdhB-2, frdC2, cgl0370, cglO371, cglO372, scmlO.lOc, scmlO.llc, scmlO.12c, sc5g8.25c, sc5g8.26c, scbac-31ell .02c, scbac31ell .02c, sc4bl0.10c, sdhA2, sdhB2, sdhAl, sdhBl, qcrB2, sdhA3, sdhB3, frdBl und frdB2 kodiert, wobei die Gene sdhA, sdhB und sdhC besonders bevorzugt sind.
Das Enzym Ei5 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend suclgl, suclg2, Ioc434885, cgl0622, dmel-CG6255, flla3.3, f8115.30, mkdl5.ll, lscl, Isc2, ael211wp, afrl34cp, scsA, scsB, sucC und sucD kodiert.
Die Nukleotidsequenzen geeigneter Gene der Enzyme E12 bis E15 können wiederum auch der KEGG-Datenbank, der NCBI- Datenbank oder EMBL-Datenbank entnommen werden.
Sofern die Aktivität eines oder mehrerer der Enzyme E12 bis E15 erhöht ist, kann es sich auch als vorteilhaft erweisen, dass die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp verminderte Aktivität eines der folgenden Enzyme E16 bis E23 aufweist : eines Enzyms Ei6, welches die Umsetzung von Oxalacetat zu Citrat katalysiert; eines Enzyms Ei7, welches die Umsetzung von Malat zu Oxalacetat katalysiert; eines Enzyms Ei8, welches die Umsetzung von Succinyl- Coenzym A zu Succinat katalysiert, - eines Enzyms Ei9, welches die Umsetzung von Oxalacetat zu Phosphoenolpyruvat katalysiert, eines Enzyms E20, welches die Umsetzung von Oxalacetat zu Pyruvat katalysiert, eines Enzyms E21, welches die Umsetzung von Oxalacetat zu Aspartat katalysiert, eines Enzyms E22, welches die Umsetzung von Malat zu Pyruvat katalysiert, eines Enzyms E23, welches die Umsetzung von Pyruvat zu Acetat katalysiert, Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Zellen sind dabei diejenigen, bei denen die Aktivität folgender Enzyme oder Enzymkombinationen vermindert ist: Ei6, Ei7, Ei8, Ei9, E20, E2i, und Ei6Ei7Ei8Ei9E2oE2iE22E23 •
In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, dass das Enzym
Ei6 eine Citrat-Synthase (EC 2.3.3.1 oder EC 2.3.3.8),
Ei7 eine Malat-Oxidase (EC 1.1.3.3),
Ei8 eine Succinyl-CoA-Hydrolase (EC 3.1.2.3),
E19 eine Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (EC 4.1.1.49 oder 4.1.1.32),
E2O eine Oxalacetat-Decarboxylase (EC 4.1.1.3), E2i eine Aspartat-Transaminase (EC 2.6.1.1),
E22 eine Malat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.38, EC 1.1.1.39 oder EC 1.1.1.40) , E23 eine Pyruvat-Dehydrogenase (EC 1.2.1.51), ist .
Das Enzym Ei6 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend glt, es, csl, cg3861, cts-1, f7fl9.21, f4il.l6, t20nl0.90, t20nl0.100, t2O9.80, citl, cit2, cit3, aar004cp, agr002wp, cshA, gltA, citZ, cit, prpC, cisY, eis, mmgD, citA, gltAl, gltA2, gltA3, cglO829, prpCl, scdl0.20, citAl, citA2, citA3, acly, cg8322, f5e6.2, k7jJ8.14 und ci- tE kodiert, wobei gltA am meisten bevorzugt ist.
Das Enzym E19 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend pckA, pckl, pck2, cglO924, cgl7725, cgl7725, pckG, ppcK, cgl2863, pek und 2sck36.02 kodiert.
Das Enzym E2o wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend oadA, oadB, oadC, oadG, oag3, eda, dcoA, oadAl, oadA2, pycB und mmdB kodiert. Das Enzym E21 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend myn8.7, gltl, adr290wp, gltB, gltD, gltl, glsl, gltA, glt, glxD, gltDl, gltD2, gdh2, agl040Cp, gdhAl, gdhA, gdhA2, gluD, gluDl, gluD2, rocG, ypcA, gudB, tllil8.2, t2il.l50, mrg7.13, fl9c24.7, gdh, gdhl, gdh2, gdh3, gotl, got2, cg4233, cg8430, f23nl9.17, fl3jll.l6, t26cl9.9, f7fl.l8, F10N7.200, tl611.170, fl5nl8.H0, t20dl.70, aatl, aat2, ablO38wp, afr211cp, agxl, bna4, aatA, aatB, ybdL, aspC, yfbQ, aat, avtAl, avtA2, tyrB, avtA, avtB, argDl, argD2, aspBl, aspB2, aspB3, aspB, aspCl, aspC2, aspC3, aspC4, RS05143, aspAT, ywfG, yhdR, argD, mtnV, alaT, hisC, avtAl, avtA2, avtA3, cgl0240, cglll03, cgl2599, cgl2844, 2sck36.07c, sc9el2.21, sc2h4.04c, tyrB, gtp, gtpl, gtp2, cgl640, f20d23.34, f26f24.16, f24jl3.15, tlθdlθ.20 und agrO85wp kodiert, wobei aspC, aatA, gdh, gudB, gdhA, gltB und gltD besonders bevorzugt sind.
Das Enzym E21 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend myn8.7, gltl, adr290wp, gltB, gltD, gltl, glsl, gltA, glt, glxD, gltDl, gltD2, gdh2, agl040Cp, gdhAl, gdhA, gdhA2, gluD, gluDl, gluD2, rocG, ypcA, Das Enzym E22 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend me, mel, me2, me3, mae, mael, mae2, sfcA, sfcAl, maeA, maeB, tme, yqkJ, ywkA, yqkJ, malS, ytsJ, mleA, mleS, mez, sce59.10c, 2sc7gll.23, malSl, malS2, dme, maeBl, maeB2, mdh, mdhl, mdh2, dmel cgi 0120, dmel cgi 0120, dmel-cg5889, fl9kl6.27, f6f22.7, t22p22.60, fl8al7.1, modl, tme, mao, cgl3007, malS und malE kodiert.
Das Enzym E23 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend me, mel, me2, me3, mae, mael, mae2, sfcA, sfcAl, maeA, maeB, tme, yqkJ, ywkA, yqkJ, malS, ytsJ, mleA, mleS, mez, sce59.10c, 2sc7gll.23, malSl, malS2, dme, maeBl, maeB2, mdh, mdhl, mdh2, dmel cgi 0120, dmel cgi 0120, dmel_cg5889, fl9kl6.27, f6f22.7, t22p22.60, fl8al7.1, modl, tme, mao, cgl3007, malS und malE kodiert. Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass in dem Fall, in dem die gesteigerte Bereitstellung von Succinyl- Coenzym A in der Zelle mittels des vorstehend beschriebenen Weges (Oxalacetat —> Malat —> Fumarat —> Succinyl-Coenzym A) erfolgt, in der Zelle auch die Bereitstellung von Redukti- onsäquivalenten gezielt zu steigern.
Eine Möglichkeit der Steigerung von Reduktionsäquivalenten besteht darin, den oxidativen Pentosephosphat weg zu steigern. In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, dass die Aktivität der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.49) und/oder der 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.44), welche vorzugsweise vom gnd-Gen kodiert wird, erhöht werden und gegebenenfalls gleichzeitig die Glykolyse gehemmt wird, beispielsweise durch Abschwächung der Aktivität der Glucose-6-Phosphat-Isomerase, wie dieses in WO-A-01/07626 beschrieben ist. Neben oder anstelle der gezielten Förderung des Pentosephosphatweges kann es weiterhin bevorzugt sein, Reduktionsäquivalente dadurch bereitzustellen, dass den Zellen Ethanol als Kohlenstoffquelle angeboten wird und in den Zellen die Umsetzung des Etha- nols zu Acetaldehyd mittels Alkohol-Dehydrogenasen (EC 1.1.1.1, EC 1.1.1.2, EC 1.1.1.71 oder EC 1.1.99.8) und die weitere Umsetzung des Acetaldehyds zu Acetyl-Coenzym A mittels Acetaladehyd-Dehydrogenasen (EC 1.2.1.10) zu fördern. Geeignete Gene für Alkohol-Dehydrogenasen und Acetal- dehyd-Dehydrogenasen können wiederum aus dem Fachmann bekannten Gen-Datenbanken, wie etwa der KEGG-Datenbank, der NCBI-Datenbank oder EMBL-Datenbank, entnommen werden.
Ein zweiter Weg vom Oxalacetat zum Succinyl-Coenzym A führt über Citrat als Zwischenprodukt. In diesem Fall ist es ge- maß einer zweiten besonderen Ausgestaltung der vorstehend beschriebenen ersten, zweiten oder dritten Alternative der erfindungsgemäßen Zelle bevorzugt, dass die Zelle, gegebenenfalls zusätzlich zu einer gesteigerten Aktivität des Enzyms Eio oder En, eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp ge- steigerte Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme E13 bis Ei6 und E24 bis E26 aufweist (siehe die Figur 8) :
eines Enzyms Ei6, welches die Umsetzung von Oxalacetat zu Citrat katalysiert; - eines Enzyms E24, welches die Umsetzung von Citrat zu Isocitrat katalysiert; eines Enzyms E25, welches die Umsetzung von Isocitrat zu Glyoxalat und Succinat katalysiert; eines Enzyms E26, welches die Umsetzung von Glyoxalat zu Malat katalysiert; eines Enzyms E13, welches die Umsetzung von Malat zu Fumarat katalysiert; eines Enzyms Ei4, welches die Umsetzung von Fumarat zu Succinat katalysiert; - eines Enzyms Ei5, welches die Umsetzung von Succinat zu Succinyl-Coemzym A katalysiert.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Zellen sind dabei diejenigen, bei denen die Aktivität folgender Enzyme oder En- zymkombinationen erhöht ist: Ei3, Ei4, Ei5, Ei6, E24, E25, E26, Ei3Ei4, E13E15, E13E16, Ei3E24, Ei3E25, Ei3E26, Ei4Ei5, Ei4Ei6, Ei4E24, Ei4E25, Ei4E26, Ei5Ei6, Ei5E24, Ei5E25, Ei5E26 und Ei3Ei4Ei5Ei6 E24E25E26, wobei Ei3Ei4Ei5Ei6E24E25E26 am meistern bevorzugt ist. In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, dass das Enzym
Ei3 eine Fumarat-Hydratase (EC 4.2.1.2),
Ei4 eine Succinat-Dehydrogenase (EC 1.3.99.1 oder
EC 1.3.5.1) oder eine Succinat-Chinon-Oxidoreduktase (1.3.5.1),
Ei5 eine Succinat-Coenzym A-Ligase (EC 6.2.1.4 oder EC 6.2.1.5) ,
Ei6 eine Citrat-Synthase (EC 2.3.3.1 oder EC 2.3.3.8),
E24 eine Aconitat-Hydratase (EC 4.2.1.3), E25 eine Iscocitrat-Lyase (EC 4.1.3.1) und
E26 eine Malat-Synthase (EC 2.3.3.9),
ist.
Bevorzugt Gene für die Enzyme Ei3 bis Ei6 sind diejenigen, die bereits vorstehend im Zusammenweg mit dem ersten Weg vom Oxalacetat zum Succinyl-Coenzym A beschrieben worden sind.
Das Enzym E24 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend acol, aco2, ratireb, dmel-CG4706, dmel-CG4900, dmel-cg6342, cg9244, t3p4.5, fl0.n23.310, f4bl4.100, adl032Wp, afr629wp, acnA, acnB, acnC, acnD, rpfA, acnAl, acnA2, acnM, citB, leuC, cgll540, sacA, can, und aco kodiert, wobei acnA und acnB besonders bevorzugt sind. Das Enzym E25 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend msd21.4, icll, icl2, adlO66cp, aglO57wp, aceA, icl, aceAa, aceAb, cgl0097 und cgl2331 kodiert, wobei aceA besonders bevorzugt ist. Gemäß einer be- sonderen Ausführungsform sind solche Gene bevorzugt, welche für eine auf der Gen-Ebene oder Protein-Ebene deregulierte Isocitrat-Lyase kodieren.
Das Enzym E26 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend med24.5, mlsSl, acr268cp, masA, glcB, aceB, mls, glcB-1, glcB-2, cgl2329, masZ, aceBl, aceB2 und mas kodiert, wobei das aceB-Gen besonders bevorzugt ist.
Auch hier können die Nukleotidsequenzen geeigneter Gene der Enzyme E24 bis E26 der KEGG-Datenbank, der NCBI-Datenbank oder EMBL-Datenbank entnommen werden.
Wenn die Bereitstellung von Oxalacetat aus Phosphoenolpyru- vat oder aus Pyruvat durch die Steigerung der Aktivität des Enzyms Ei0 oder En gefördert wird, kann das bei der Spaltung des Isocitrats durch die Iscocitrat-Lyase neben Glyo- xalat gebildete Succinat ebenfalls für die Bildung von Suc- cinyl-Coenzym A genutzt werden. Weiterhin kann es bei diesem zweiten Weg vom Oxalacetat zum Succinat vorteilhaft sein, die Aktivität eines Enzyms E27, welches die Umsetzung von Isocitrat zu 2-Oxoglutarat katalysiert und bei dem es sich vorzugsweise um eine Isocitrat-Dehydrogenase
(EC 1.1.1.41 oder EC 1.1.1.42) handelt, zu vermindern. Vorzugsweise handelt es sich bei der Isocitrat-Dehydrogenase um ein Enzym, welches von einem Gen ausgewählt aus der Gruppe umfassend idhl, idh2, cg7176, cg7176, cg7176, f20d21.16, fl2pl9.10, tl5nl.8O, idpl, idp2, idp3, aalO22Wp, aerOβlCp, idhC, idhM, icdA, icd, idh, icdl, icd2, leuB, citC, citC, cglO664, leuB2, idh3A, idg3B, idh3G, cgl2233, dmel-CG5028, dmel-CG6439, f6p23.14, f23el2.180, f8d20.160, fl2e4.20, adl223wp und afrl37cp kodiert wird, wobei icdA und citC besonders bevorzugt sind.
Ein dritter Weg vom Oxalacetat zum Succinyl-Coenzym A führt über 2-Oxoglutarat als Zwischenprodukt. In diesem Fall ist es gemäß einer dritten besonderen Ausgestaltung der vorstehend beschriebenen ersten, zweiten oder dritten Alternative der erfindungsgemäßen Zelle bevorzugt, dass die Zelle, ge- gebenenfalls zusätzlich zu einer gesteigerten Aktivität des Enzyms Eio oder En, eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme Ei6, E24, E27 und E28 aufweist (siehe die Figur 9) : - eines Enzyms Ei6, welches die Umsetzung von Oxalacetat zu Citrat katalysiert; eines Enzyms E24, welches die Umsetzung von Citrat zu Isocitrat katalysiert; eines Enzyms E27, welches die Umsetzung von Isocitrat zu 2-Oxoglutarat katalysiert; eines Enzyms E28, welches die Umsetzung von 2- Oxoglutarat zu Succinyl-Coemzym A katalysiert.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Zellen sind dabei diejenigen, bei denen die Aktivität folgender Enzyme oder En- zymkombinationen erhöht ist: Ei6, E24, E27, E28, Ei6E24, Ei6E27, Ei6E28, E24E27, E24E28, E27E28, Ei6E24E27, Ei6E24E28, E24E27E28 und Ei6E24E27E28, wobei Ei6E24E27E28 am meistern bevorzugt ist.
In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, dass das Enzym Ei6 eine Citrat-Synthase (EC 2.3.3.1 oder EC 2.3.3.8), E24 eine Aconitat-Hydratase (EC 4.2.1.3),
E27 eine Isocitrat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.41 oder EC 1.1.1.42) und
E28 eine 2-Oxoglutarat-Synthase (EC 1.2.7.3)
ist.
Bevorzugt Gene für die Enzyme Ei6, E24 und E27 sind diejenigen, die bereits vorstehend im Zusammenhang mit dem ersten und zweiten Weg vom Oxalacetat zum Succinyl-Coenzym A be- schrieben worden sind beschrieben worden sind.
Das Enzym E28 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend korA, korB, kor D, korAl, korA2, korBl, korB2, oorA, oorB, oorC, oorD, oforA, oforB, porA, porB, porAl, porA2, porA3, porA4, porG, porGl, porG2, porBl, porB2, porB3, SCD20.12c, SCD20.13c, SCAHlO.34c, SCAHlO.35c, korG, orA, orB, korGl und korG2 kodiert. Wei- terhin kann es sich bei E28 auch um einen Dehydrogenase- Komplex aus mehreren Untereinheiten handeln, die unterschiedliche enzymatische Aktivitäten aufweisen. Insbesondere kann es sich um einen Dehydrogenase-Komplex umfassend eine Oxoglutarat-Dehydrogenase (EC 1.2.4.2), eine Dihydro- lipoyl-Dehydrogenase (EC 1.8.1.4) und eine Dihydrolipoylly- sin-Rest-Succinyl-Transferase (EC 2.3.1.61). Die Oxoglutarat-Dehydrogenase (EC 1.2.4.2) wird dabei vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend ogdh, ghdhl, Ioc239017, mgc68800, mgc80496, cgllββl, t22el6.70, mpA24.10, kgdl, aer374cp, sucA, odhA, kgdA und cglll29 kodiert, wobei sucA und odhA besonders bevorzugt sind. Die Dihydrolipoyl-Dehydrogenase (EC 1.8.1.4) wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend dld, dld- prov, dldh, cg7430, t2jl5.6, kl4al7.6, at3gl7240, mgd8.71pdl, afr512wp, dldl, lpd, tb03.26j 7.650, tb04.3ml7.450, tb927.8.7380, tbO8.1OkIO .200, lpdA, lpdG, lpdV, Ipd3, acoD, lpdAl, lpdA2, lpdA3, odhL, pdhD, pdhDl, pdhD2, pdhD3, pdhD42, lpdAchl, lpdAch2, lpdAc, acoL, bfmbC, bkdD, cglO366, cglO688, scml.l7c, pdhL, sckl3.11, lpdB2 und dldl kodiert, wobei lpd besonders bevorzugt ist. Die Di- hydrolipoyllysin-Rest-Succinyl-Transferase (EC 2.3.1.61) wird dabei vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend dlst, dlst-prov, mgc89125, dmel_CG5214, fl0m23.250, kl3p22.8, kgd2agl200wp, kgd2, odhB, sucB, aceF, kgdB, sucBl, sucB2, pdhC, dlaT, kgd, sc5F7.20 und sc4B10.24c kodiert, wobei sucB und odhB besonders bevorzugt sind.
Die Nukleotidsequenzen geeigneter Gene des Enzyms E2s bzw. der vorstehend genannten Untereinheiten des Enzyms E2s kön- nen wiederum der KEGG-Datenbank, der NCBI-Datenbank oder EMBL-Datenbank entnommen werden. Die vorstehend beschriebenen Wege vom Oxalacetat zum Succi- nyl-Coenzym A gehen von Phosphoenolypyruvat oder von Pyru- vat als Substratvorstufen aus. In diesem Zusammenhang kann es weiterhin bevorzugt sein, die Zellen gentechnisch derart zu verandern, dass sie aus Kohlehydraten und/oder aus GIy- cerin besonders große Mengen an Pyruvat oder Phosphoenolpy- ruvat bereitstellen können.
Sofern die Zellen Glycerin als Nährstoffquelle verwerten können, ist es bevorzugt, dass die erfindungsgemaße Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines, vorzugsweise aller folgenden Enzyme E29 bis E42 aufweist:
eines Enzyms E29, welches die Diffusion von Glycerin in die Zelle hinein erleichtert, eines Enzyms E30, welches die Umsetzung von Glycerin zu Glycerin-3-Phosphat katalysiert, eines Enzyms E31, welches die Umsetzung von Glycerin-3- Phosphat zu Dihydroxyacetonphosphat katalysiert, - eines Enzyms E32, welches die Übertragung von Schwefel auf den Schwefelsakzeptor Thioredoxin 1 katalysiert, eines Enzyms E33, welches die Hydrolyse von Phospholi- piden unter Bildung von Alkoholen und Glycerin katalysiert, - eines Enzyms E34, welches den Transport von Glycerin-3- Phosphat in die Zelle hinein im Austausch gegen Phosphat katalysiert; eines Enzyms E3s, welches die Umsetzung von Dihydroxyacetonphosphat zu Glycerinaldehyd-3-Phosphat kataly- siert, eines Enzyms E36, welches die Umsetzung von Glycerinal- dehyd-3-Phosphat zu 1, 3-Biphosphoglycerat katalysiert, eines Enzyms E37, welches die Umsetzung von 1,3- Biphosphoglycerat zu 3-Phosphoglycerat katalysiert, eines Enzyms E38, welches die Umsetzung von 3- Phosphoglycerat zu 2-Phosphoglycerat katalysiert, eines Enzyms E39, welches die Umsetzung von 2- Phosphoglycerat zu Phosphoenolpyruvat katalysiert, eines Enzyms E40 welches die Umsetzung von Phosphoenolpyruvat zu Pyruvat katalysiert, eines Enzyms E4i, welches die Umsetzung von Glycerin zu Dihydroxyaceton katalysiert, eines Enzyms E42, welches die Umsetzung von Dihydroxyaceton zu Dihydroxyacetonphosphat katalysiert.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Zellen sind dabei diejenigen, bei denen die Aktivität folgender Enzyme oder Enzymkombinationen vermindert ist: E29, E3o, E3i, E32, E33, E34, E35, E36, E37, E3S, E3g, E4o, E4i, E42, E29E30, E29E3I, E29E32, E29E33, E29E34, E29E35, E29E36, E29E37, E29E3S, E29E39, E29E4Q, E29E4I,
E29E42, E30E31, E30E32, E30E33, E30E34, E30E35, E30E36, E30E37, E30E38,
E3oE39, E3oE4o, E30E41, E30E42, E3iE32, E3iE33, E3iE34, E3iE35, E3iE36,
E3xE37, E3iE38, E3iE39, E3iE40, E31E41, E3iE42, E32E33, E32E34, E32E35,
E32E36, E32E37, E32E38, E32E39, E32E40, E32E4I, E32E42, E33E34, E33E35,
E33E36, E33E37, E33E38, E33E39, E33E40, E34E4I, E33E42, E34E35, E34E36,
E34E47, E34E38, E34E39, E34E40, E34E4I, E34E42 , E35E36, E35E37, E35E38,
E35E39, E35E4O, E35E4I, E35E42, E36E37, E36E38, E36E39, E36E40, E36E4I,
E36E42, E37E38, E37E39, E37E40, E37E4I, E37E42, E38E39, E39E40, E39E4I,
E39E42, E40E4I, E40E42, E4iE42 und E29E30E3IE32 E33E34E35E36E37E38E39-
E4QE4IE4
In diesem Zusammenhang ist es insbesondere bevorzugt, dass das Enzym
E29 ein Aquaglyceroporin (Glycerol-Facilitator) , der vorzugsweise vom glpF-Gen kodiert wird,
E30 eine Glycerin-Kinase (EC 2.7.1.30), die vorzugsweise vom glpK-Gen kodiert wird, E31 eine Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase (EC 1.1.99.5), vorzugsweise eine FAD-abhängige Glycerin-3-Phosphat- Dehydrogenase, wobei die Glycerin-3-Phosphat- Dehydrogenase vorzugsweise von dem glpA-Gen, dem glpB- Gen, dem glpC-Gen oder dem glpD-Gen, besonders bevorzugt dem glpD-Gen kodiert wird,
E32 eine Schwefeltransferase, welche von dem glpE-Gen kodiert wird,
E33 eine Glycerinphosphodiesterase (EC 3.1.4.46), welche vorzugsweise vom glpQ-Gen kodiert wird,
E34 eine Glycerin-3-Phosphat-Permease, welche vorzugsweise vom glpT-Gen kodiert wird
E35 eine Triosephosphat-Isomerase (EC 5.3.1.1),
E36 eine Glyceraldehyd-3-Phosphat-Deydrogenase (EC 1.2.1.12) ,
E37 eine Phosphoglycerat-Kinase (EC 2.7.2.3),
E38 eine Phosphoglycerat-Mutase (EC 5.4.2.1),
E39 eine Enolase (EC 4.2.1.11),
E40 eine Pyruvat-Kinase (EC 2.7.1.40), E41 eine Glycerin-Dehydrogenase (EC 1.1.1.6), die vorzugs- weise vom gldA-Gen kodiert wird, und
E42 eine Dihydroxyaceton-Kinase (EC 2.7.1.291 die Vorzugs- weise vom dhaK-Gen kodiert wird,
ist.
Die Gensequenzen der vorstehend genannten Enzyme können wiederum aus den dem Fachmann bekannten Gen-Datenbanken, insbesondere der KEGG-Datenbank, der NCBI-Datenbank oder EMBL-Datenbank, entnommen werden. Des Weiteren sind das Glyceraldehyd-3-Phosphat- Dehydrogenase kodierende gap-Gen (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), das für die Trio- sephosphat-Isomerase codierende tpi-Gen (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086) und das für die 3- Phosphoglycerat-Kinase codierende pgk-Gen (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086) auch aus anderen Quellen bekannt.
Mit den bekannten Genen der Enzyme E29 bis E42 lassen sich gentechnisch veränderte Zellen, in denen mindestens eine, besonders bevorzugt mindestens zwei, darüber hinaus bevorzugt mindestens drei und am meisten bevorzugt alle Aktivitäten der Enzyme E29 bis E42 durch die eingangs im Zusammenhang mit dem Enzym Ei beschriebenen Techniken (Mutation des Enzyms oder Steigerung der Enzymexpression) erhöht worden ist, herstellen. Diese Zellen sind in der Lage, dass sie in Gegenwart von Glycerin als einziger Kohlenstoffquelle (oder aber zusammen mit Kohlehydraten als weitere Kohlenstoffquelle) kultiviert werden können. Neben der Erhöhung einer oder mehrerer der Enzymaktivitäten E2g bis E42 kann es, wenn die Zelle Glycerin als Kohlenstoffquelle zu verwerten vermag, auch vorteilhaft sein, wenn in den erfindungsgemäßen Zellen folgende Gene vorzugsweise heterolog exprimiert werden:
das glpG-Gen oder das 3925-Gen, das glpX-Gen, das dhaR-Gen, das ycgU-Gen oder das bl201-Gen das fsa-Gen, das mipB-Gen, das ybiZ-Gen oder das B0825- Gen das talC-Gen, das fsaB-Gen, das yijG-Gen oder das b3946-Gen. Die Nukleotidsequenzen dieser Gene können wiederum der KEGG-Datenbank, der NCBI-Datenbank oder EMBL-Datenbank entnommen werden entnommen werden.
Sofern die Zellen Kohlenhydrate als Nährstoffquelle verwer- ten können, ist es bevorzugt, dass die erfindungsgemäße
Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines, vorzugsweise aller folgenden Enzyme E43 bis E45 und E36 bis E40 aufweist:
- eines Enzyms E43, welches die Umsetzung von α-D-
Glukose-6-Phosphat zu ß-D-Fruktose-6-Phosphat katalysiert, eines Enzyms E44, welches die Umsetzung von ß-D- Fruktose-6-Phosphat zu ß-D-Fruktose-1, 6-Biphosphat ka- talysiert, eines Enzyms E45, welches die Umsetzung von ß-D- Fruktose-1, 6-Biphosphat zu Glycerinaldehyd-3-Phosphat und Dihydroxyacetonphosphat katalysiert, eines Enzyms E36, welches die Umsetzung von Glycerinal- dehyd-3-Phosphat zu 1, 3-Biphosphoglycerat katalysiert, eines Enzyms E37, welches die Umsetzung von 1,3- Biphosphoglycerat zu 3-Phosphoglycerat katalysiert, eines Enzyms E38, welches die Umsetzung von 3- Phosphoglycerat zu 2-Phosphoglycerat katalysiert, - eines Enzyms E39, welches die Umsetzung von 2-
Phosphoglycerat zu Phosphoenolpyruvat katalysiert, und eines Enzyms E4o, welches die Umsetzung von Phosphoenolpyruvat zu Pyruvat katalysiert.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte gentechnisch veränderte Zellen sind dabei diejenigen, bei denen die Aktivität folgender Enzyme oder Enzymkombinationen gesteigert ist: E36, E37, E38, E39, E40, E43, E44, E45, E36E37, E36E38, E36E39, E36E4Q, E36E43, E36E44, E36E45, E37E38, E37E39, E37E4Q, E37E43 , E37E44 , E37E45 , E38E39 , E38E40 , E38E43 , E38E44 , E38E45 , E39E40 , E39E43 , E39E44 , E39E45 , E40E43 , E40E44 , E40E45 , E43E44 , E43E45 , E44E45 und E36E37E38E39-E40E43E44E45 .
In diesem Zusammenhang ist es insbesondere bevorzugt, dass das Enzym
E43 eine Glucose-6-Phosphat-Isomerase (EC 5.3.1.9),
E44 eine 6-Phosphofrukto-Kinase (EC 2.7.1.11),
E45 eine Fruktose-Bisphosphat-Aldolase (EC 4.1.2.13),
E36 eine Glyceraldehyd-3-Phosphat-Deydrogenase (EC 1.2.1.12) ,
E37 eine Phosphoglycerat-Kinase (EC 2.7.2.3), E38 eine Phosphoglycerat-Mutase (EC 5.4.2.1), E39 eine Enolase (EC 4.2.1.11) und E40 eine Pyruvat-Kinase (EC 2.7.1.40),
ist.
Die Nukleotidsequenzen dieser Gene können wiederum der KEGG-Datenbank, der NCBI-Datenbank oder EMBL-Datenbank entnommen werden entnommen werden. Weiterhin ist es, wenn die Zelle Kohlenhydrate als Kohlenstoffquelle zu verwerten vermag, bevorzugt, dass neben den vorstehend genannten Enzymen E43 bis E45 und E36 bis E40 auch die Aufnahme von Glukose in die Zellen zu fordern, beispielsweise durch die Erhöhung der Aktivität von Enzymen des Phosphotransferase-Systems, insbesondere derjenigen Enzyme, die von ptsl-, ptsH- und ptsM-Genen kodiert werden, oder durch die Verstärkung der Glukokinase (EC 2.7.1.2), welche vorzugsweise durch das glk-Gen kodiert wird. In diesem Zusammenhang wird insbesondere auf US 6,680,187, US 6,818,432, US 6,913,910 und US 6,884,614 verwiesen, deren Offenbarungsgehalt hinsichtlich der Möglichkeiten zur Uberexprimierung der ptsl-, ptsH-, ptsM- und glk-Gene hiermit als Referenz eingeführt wird und einen Teil der Offen- barung der vorliegenden Erfindung bildet. Auch kann es im Falle von Kohlenhydraten als Kohlenstoffquelle vorteilhaft sein, gezielt den Pentosephosphat-Weg zu fördern, beispielsweise durch Erhöhen der Aktivität der Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.49) und der 6-
Phosphogluconat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.44), welche vorzugsweise vom gnd-Gen kodiert wird, und gegebenenfalls gleichzeitig die Glykolyse zu hemmen, beispielsweise durch Abschwächung der Aktivität der Glucose-6-Phosphat- Isomerase, wie dieses in WO-A-01/07626 beschrieben ist.
Sofern die Zellen 3-Hydroxyisobuttersäure oder auf 3- Hydroxyisobuttersäure basierende Polyhydroxyalkanoate gemäß der besonderen Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Zelle, bei der Methylmalonat-Semialdehyd als Vorprodukt und Succi- nyl-Coenzym A als Zwischenprodukt gebildet werden, über O- xalacetat und Pyruvat als Zwischenprodukte bilden, kann es weiterhin bevorzugt sein, die Aktivität mindestens eines, vorzugsweise alle nachfolgenden Enzymaktivitäten in der Zelle zu vermindern:
eines Enzyms, welches die Umsetzung von Oxaloacetat zu Phosphoenolpyruvat katalysiert, wie etwa die Phosphoe- nylpyruvat-Carboxy-Kinase (EC 4.1.1.49) (siehe auch DE- A-199 50 409), eines Enzyms, welches die Umsetzung von Pyruvat zu Ace- tat katalysiert, wie etwa die Pyruvat-Oxidase (EC 1.2.2.2) (siehe auch DE-A-199 51 975), eines Enzyms, welches die Umsetzung von α-D-Glukose-6- Phosphat zu ß-D-Fruktose-6-Phosphat katalysiert (siehe auch US 09/396,478) , eines Enzyms, welches die Umsetzung von Pyruvat zu Lac- tat katalysiert, wie etwa die 1-Lactat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.27) oder die Lactat-Malat-Transhydrogenase (EC 1.1.99.7) , eines Enzyms, welches die Umsetzung von Pyruvat zu Ace- tyl-Coenzym A katalysiert, wie etwa die Pyruvat- Dehydrogenase (EC 1.2.1.51), eines Enzyms, welches die Umsetzung von Pyruvat zu Ace- tylphosphat katalysiert, wie etwa die Pyruvat-Oxidase (EC 1.2.3.3) , eines Enzyms, welches die Umsetzung von Pyruvat zu Ace- tat katalysiert, wie etwa die Pyruvat-Dehydrogenase (EC 1.2.2.2) , eines Enzyms, welches die Umsetzung von Pyruvat zu Phosphoenol-Pyruvat katalysiert, wie etwa die Phosphoe- nolpyruvat-Synthase (EC 2.7.9.2) oder die Pyruvat- Phosphat-Dikinase (EC 2.7.9.1), eines Enzyms, welches die Umsetzung von Pyruvat zu Alanin katalysieren, wie etwa die Alanin-Transaminase
(2.6.1.2) oder die Alanin-Oxosäure-Transaminase
(EC 2.6.1.12) katalysiert, und/oder - eines Enzyms, welches Pyruvat zu Acetolactat umsetzt, wie etwa die Acetohydroxysäure-Synthase (EC 2.2.1.6).
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Zellen, welche 3- Hydroxyisobuttersäure oder auf 3-Hydroxyisobuttersäure ba- sierende Polyhydroxyalkanoate über Succinyl-Coenzym A als Zwischenprodukt aus Kohlenhydraten als Kohlenstoffquelle bilden können und in denen eine oder mehrere der vorstehend genannten Enzymaktivitäten, insbesondere eine der Enzymaktivitäten Ei bis E45, darüber hinaus bevorzugt die Enzymak- tivitäten Ei, ExE2E3E4, EiE4E5E6E7 oder und EiE4E5E7 erhöht werden können, sind diejenigen Mikroorganismen, die durch Bennett et al., Metab. Eng. (2005), 7 (3), Seiten 229 bis 239, Bennett et al . , Biotechnol . Bioeng. (2005), 90 (6), Seiten 775 bis 779, Bennett et al . , Biotechnol. Prog. (2005), 21 (2), Seiten 358 bis 365, Bennett et al . (2005), Appl. Microbiol. Biotechnol. , 67 (4), Seiten 515 bis 523, Vemuri et al . (2002), Applied and Environmental Microbiolo- gy 68 (4), Seiten 1.715 bis 1.727 und in US 6,455,284 be- schrieben sind.
Erfolgt gemäß der ersten besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zelle die Bildung der 3- Hydroxyisobuttersäure oder des auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoates über Succinyl-Coenzym A als Zwischenprodukt aus L-Glutamat als Kohlenstoffquelle, ist es einer weiteren besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zelle, bei der Methylmalonat-Semialdehyd als Vorprodukt und Succinyl-Coenzym A als Zwischenprodukt ge- bildet werden, erfindungsgemäß weiterhin bevorzugt, dass die eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der, vorzugsweise der beiden folgenden Enzyme E28 und E46 aufweist (siehe die Figur 10) :
- eines Enzyms E46, welches die Umsetzung von L-Glutamat zu 2-Oxoglutarat katalysiert; eines Enzyms E28, welches die Umsetzung von 2- Oxoglutarat zu Succinyl-Coemzym A katalysiert.
In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, dass das Enzym
E46 eine Glutamat-Synthase (EC 1.4.1.13 oder EC 1.4.1.14), eine Glutamat-Dehydrogenase (EC 1.4.1.2, EC 1.4.1.3 o- der EC 1.4.1.4) oder eine Aspartat-Transaminase (EC 2.6.1.1 oder EC 2.6.1.2) und
E28 eine 2-Oxoglutarat-Synthase (EC 1.2.7.3) ist .
Als Enzym E28 sind diejenigen bevorzugt, die bereits Eingangs als bevorzugte Enzyme E2s genannt worden sind.
Das Enzym E46 wird vorzugsweise von den Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend myn8. , gltl, adr290wp, gltB, gltD, yeiT, aegA, ygfT, gltD-1, gltD-2, gltl, glt2, glsl, gltA, glt, glxD, gltA, yerD, cglO184, cglO185, sc3c9.12, gdhl, gdh2, agl40cp, gdhA, gdhAl, gdhA2, gluD, rocG, ypcA, gudB, gluD, gdhA, gdhA2, gdh, gdhA-1, gdhA2-2, gdhA-3, gluDl, gluD2, gludl-prov, gludla, tllI18.2, t2I1.150, mrg7.13, gotl, got2, caspat, got2-prov, xr406-prov, 406-prov, cg4233, cg4233, cg8430, cg8430, f23nl9.17, fl3jll.l6, t26cl9.9, f7fl.l8, fl0n7.200, tl611.170, fl5nl8.H0, t20dl.70, aat, aatl, aat2, ablO38wp, afr211cp, agxl, bnA4, aatA, aatB, ybdL, aspC, yfbQ, ydcR, avtA2, aspC-1, aspC-2, aspC-3, aspC-4, aspB, aspB-1, aspB-2, aspB-3, aspB-4, argDl, argD2, aatAc, ywfG, mtnV, alaT, avtAl, avtA2, avtA3, cgl0240, cglllO3,cgl2599, cgl2844, dapC, 2sck36.07c, sc9el2.21, sc2h4.04c, aspBl, aspB2, aspB3, tyrB, gpt, gptl, gpt2, mgc82097, cgl640, c32flθ.8, f20d23.34, f26f24.16, f24jl3.15, tlθdlθ.20 oder agrwp .
Die Nukleotidsequenzen dieser Gene können wiederum der
KEGG-Datenbank, der NCBI-Datenbank oder EMBL-Datenbank entnommen werden entnommen werden.
Gemäß einer zweiten besonderen Ausführungsform der erfin- dungsgemäßen Zelle, bei der die Bildung von 3-
Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten über Methylmalonat- Semialdehyd als Vorprodukt erfolgt, ist es bevorzugt, dass die Bildung der 3-Hydroxyisobuttersäure oder des auf 3- Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoates ü- ber Propionyl-Coenzym A als Zwischenprodukt erfolgt, wobei die Zelle vorzugsweise Kohlenhydrate, Glycerin, Methan oder Methanol als Kohlenstoffquelle zu verwerten vermag. Dabei gibt es verschiedene Wege, um vom Propionyl-Coenzym A zur 3-Hydroxyisobuttersäure bzw. zu auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten zu gelangen.
Gemäß einer ersten Alternative dieser zweiten besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zelle erfolgt die
Bildung des Zwischenproduktes Propionyl-Coenzym A über Ace- tyl-Coenzym A als weiteres Zwischenprodukt. In diesem Zusammenhang ist es insbesondere bevorzugt, dass die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme E4, E5 und E47 bis E52 aufweist (siehe die Figur 11) :
eines Enzyms E47, welches die Umsetzung von Acetyl- Coenzym A zu Malonyl-Coenzym A katalysiert; - eines Enzyms E4s, welches die Umsetzung von Malonyl- Coenzym A zu Malonatsemialdehyd katalysiert; eines Enzyms E4g, welches die Umsetzung von Malonatsemialdehyd zu 3-Hydroxypropionat katalysiert; eines Enzyms E50, welches die Umsetzung von 3- Hydroxypropionat zu 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E5i, welches die Umsetzung von 3- Hydroxypropionyl-Coenzym A zu Acryloyl-Coenzym A katalysiert; - eines Enzyms E52, welches die Umsetzung von Acryloyl- Coenzym A zu Propionyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E5, welches die Umsetzung von Propionyl- Coenzym A zu Methylmalonatsemialdehyd katalysiert; eines Enzyms E4, welches die Umsetzung von Methylmalo- natsemialdehyd zu 3-Hydroxyisobutyrat katalysiert.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte gentechnisch veränder- te Zellen sind dabei diejenigen, bei denen die Aktivität folgender Enzyme oder Enzymkombinationen gesteigert ist: E47, E48, E49, E50, E51, E52, E4, E5 und E47E48E49E50E51E52E4E5.
Weiterhin ist es in diesem Zusammenhang insbesondere bevor- zugt, dass das Enzym
E4 eine 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.31) oder eine 3-Hydroxyacyl-Coenzym A-Dehydrogenase (EC 1.1.1.35) , E5 eine Methylmalonatsemialdehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.27) ,
E47 eine Malonyl-CoenzymA-Decarboxylase (EC 4.1.1.9), eine Malonat-Coenzym A-Transferase (EC 2.8.3.3), eine Me- thylmalonyl-Coenzym A-Carboxytransferase (EC 2.1.3.1) oder eine Acetyl-Coenzym A-Carboxylase (EC 6.4.1.2),
E48 eine Malonatsemialdehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.18), E49 eine 3-Hydroxypropionat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.59),
E50 eine 3-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A Hydrolase (EC 3.1.2.4) , E51 eine Enoyl-Coenzym A-Hydratase (EC 4.2.1.17) und E52 eine Acyl-Coenzym A-Dehydrogenase (EC 1.3.99.3),
ist.
Bevorzugt Gene für die Enzyme E4 und E5 sind diejenigen, die bereits vorstehend im Zusammenhang mit der ersten be- sonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zelle beschrieben worden sind.
Das Enzym E47 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend mlycd, tl9bl7.4, tbO8.2904.110, matA, acac, acaca, acacb, f5j5.21, fl5c21.2, t8p21.5, accl, aarO71wp, accA, accB, accC, accD, accCl, accC2, mmdA, fabG, accDl, accD2, accD3, cglO831, accBC, dtsRl, accDA, scc24.16c und cgll327 kodiert, wobei accA, accC und accD am meisten bevorzugt sind.
Das Enzym E4s wird vorzugsweise vom iolD-Gen kodiert.
Das Enzym E5i wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend echSl, ehhadh, hadha, echsl-prov, cg4389, cg4389, cg6543, cg6984, cg8778, ech-1, ech-2, ech- 3, ech-4, ech-5, ech-6, ech-7, FCAALL.314, fcaall.21, fox2, ecil, eci2, paaF, paaG, yfcX, fadB, faoA, rpfF, phaA, phaB, echAl, echA2, echA3, echA4, echA5, echA6, echA7, echA8, e- chA9, echA9, echAlO, echAl 1, echA12, echA13, echA14, e- chAl5, echAl 6, echAl7, echAl 8, echAl 9, echA20, echA21, fad- 1, fad-2, fad-3, dcaE, hcaA, fadJ, rspO671, rsp0035, rspO648, rspO647, rsO3234, rsO3271, rsO4421, rsO4419, rs02820, rsO2946, paaGl, paaG2, paaG3, ech, pksH, ydbS, eccHl, eccH2, pimF, fabJl, fabJ2, caiD2, ysiB, yngF, yusL, fucA, cglO919, scf41.23, scdlθ.16, sckl3.22, scp8.07c, stbacl6h6.14, sc5f2a.l5, sc6a5.38, hbd-1, hbd-2, hdb-3, hdb-4, hdb-5, hdb-6, hdb-7, hdb-8, hdb-9, hdb-10, fad-1, fad-2, fad-3, fad-4, fad-5, paaF-1, paaF-2, paaF-3, paaF-4, paaF-5, paaF-6, paaF-7 und crt kodiert.
Das Enzym E52 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend acadl, acadm, acadlO, acadll, acadm- prov, acadl-prov, mgc81873, cgl2262, cg4703, cg4860, f3e22.5, afl213wp, acdC, fadE13, acd-1, acd-2, acd-3, acd- 4, acd-5, acd-6, acd-7, acd-8, acd-9, acd-10, acd-11, acd- 12, acd, fadEl, fadE2, fadE3, fadE4, fadE5, fadE6, fadE7, fadE13, fadEl4, fadEl5, fadEl 6, fadE17, fadEl 8, fadEl 9, fa- dE20, fadE21, fadE22, fadE23, fadE26, fadE27, fadE30, fa- dE31, fadE33, fadE35, fadE38, fadE45, fadE, caiA, aidB, RSp0036, RS03588, mmgC, acdA-3, bcd, acdA, acdHl, acdH2, acdH3, aidB, acdl und acdH kodiert.
Die Nukleotidsequenzen geeigneter Gene für die Enzyme E47 bis E52, insbesondere auch der Enzyme E49 und E50, können der KEGG-Datenbank, der NCBI-Datenbank oder EMBL-Datenbank entnommen werden.
Gemäß einer zweiten Alternative dieser zweiten besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zelle erfolgt die Bildung des Zwischenproduktes Propionyl-Coenzym A ebenfalls über Acetyl-Coenzym A als weiteres Zwischenprodukt, wobei gemäß dieser Alternative das Propionyl-Coenzym A nicht di- rekt, sondern über Methylmalonyl-Coenzym A zum Methylmalo- natsemialdehyd umgesetzt wird. In diesem Zusammenhang ist es insbesondere bevorzugt, dass die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme E2 bis E4, E6, E7 und E47 bis E52 aufweist (siehe die Figur 12) :
eines Enzyms E47, welches die Umsetzung von Acetyl- Coenzym A zu Malonyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E4s, welches die Umsetzung von Malonyl- Coenzym A zu Malonatsemialdehyd katalysiert; eines Enzyms E49, welches die Umsetzung von Malonatsemialdehyd zu 3-Hydroxypropionat katalysiert; eines Enzyms E5o, welches die Umsetzung von 3- Hydroxypropionat zu 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E5x, welches die Umsetzung von 3- Hydroxypropionyl-Coenzym A zu Acryloyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E52, welches die Umsetzung von Acryloyl- Coenzym A zu Propionyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E7, welches die Umsetzung von Propionyl- Coenzym A zu (S) -Methylmalonyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E6, welches die Umsetzung von (S)- Methylmalonyl-Coenzym A zu (R) -Methylmalonyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E2, welches die Umsetzung von (R) - Methylmalonyl-Coenzym A zu Methylmalonat katalysiert; eines Enzyms E3, welches die Umsetzung von Methylmalonat zu Methylmalonatsemialdehyd katalysiert; eines Enzyms E4, welches die Umsetzung von Methylmalonatsemialdehyd zu 3-Hydroxyisobutyrat katalysiert.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte gentechnisch veränderte Zellen sind dabei diejenigen, bei denen die Aktivität folgender Enzyme oder Enzymkombinationen gesteigert ist: E2, E3, E4, E6, E7, E47, E48, E49, E50, E51, E52 und E2E3E4EgE7E47E48E49E5oE5iE52.
Bevorzugte Enzyme und Gene dieser Enzyme sind diejenigen Gene und Enzyme, die bereits vorstehend im Zusammenhang mit den Enzymen E2 bis E4, Ee, E7 und E47 bis E52 genannt worden sind.
Gemäß einer dritten Alternative dieser ersten Alternative der zweiten besonderen Ausführungsform der erfindungsgemä- ßen Zelle erfolgt die Bildung des Zwischenproduktes Propio- nyl-Coenzym A ebenfalls über Acetyl-Coenzym A als weiteres Zwischenprodukt, wobei gemäß dieser Alternative das Propio- nyl-Coenzym A ebenfalls nicht direkt, sondern über (R) - Methylmalonyl-Coenzym A (und nicht über (S) -Methylmalonyl- Coenzym A, zum Methylmalonatsemialdehyd umgesetzt wird. In diesem Zusammenhang ist es insbesondere bevorzugt, dass die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme E2 bis E4, E7 und E47 bis E52 aufweist (siehe die Figur 13) :
eines Enzyms E47, welches die Umsetzung von Acetyl- Coenzym A zu Malonyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E48, welches die Umsetzung von Malonyl- Coenzym A zu Malonatsemialdehyd katalysiert; eines Enzyms E49, welches die Umsetzung von Malonatsemialdehyd zu 3-Hydroxypropionat katalysiert; eines Enzyms E5o, welches die Umsetzung von 3- Hydroxypropionat zu 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A kata- lysiert; eines Enzyms E5i, welches die Umsetzung von 3- Hydroxypropionyl-Coenzym A zu Acryloyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E52, welches die Umsetzung von Acryloyl- Coenzym A zu Propionyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E7, welches die Umsetzung von Propionyl- Coenzym A zu Methylmalonyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E2, welches die Umsetzung von Methylmalonyl-Coenzym A zu Methylmalonat katalysiert; - eines Enzyms E3, welches die Umsetzung von Methylmalonat zu Methylmalonatsemialdehyd katalysiert; eines Enzyms E4, welches die Umsetzung von Methylmalonatsemialdehyd zu 3-Hydroxyisobutyrat katalysiert. Erfindungsgemäß besonders bevorzugte gentechnisch veränderte Zellen sind dabei diejenigen, bei denen die Aktivität folgender Enzyme oder Enzymkombinationen gesteigert ist: E2, E3, E4, E7, E47, E4S, E49, E50, E51, E52 und E2E3E4E7E47E48E49E50E51E52.
Bevorzugte Enzyme und Gene auch dieser Enzyme sind wiederum diejenigen Gene und Enzyme, die bereits vorstehend im Zu- sammenhang mit den Enzymen E2 bis E4, E7 und E47 bis E52 genannt worden sind.
Gemäß einer vierten Alternative der zweiten besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zelle erfolgt die BiI- düng des Zwischenproduktes Propionyl-Coenzym A ebenfalls über Acetyl-Coenzym A als weiteres Zwischenprodukt, wobei gemäß dieser Alternative Acetoacetyl-Coenzym A als Zwischenprodukt gebildet wird. In diesem Zusammenhang kann es bevorzugt sein, dass die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme E8 und E53 bis E6x aufweist:
eines Enzyms E53, welches die Umsetzung von Acetyl- Coenzym A zu Acetoacetyl-Coenzym A katalysiert; - eines Enzyms E54, welches die Umsetzung von Acetoacetyl-Coenzym A zu 3-Hydroxybutanoyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E55, welches die Umsetzung von 3- Hydroxybutanoyl-Coenzym A zu Crotonyl-Coenzym A kataly- siert; eines Enzyms E56, welches die Umsetzung von Crotonyl- Coenzym A zu Butyryl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E57, welches die Umsetzung von Butyryl- Coenzym A zu Ethylmalonyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E58, welches die Umsetzung von Ethylmalonyl-Coenzym A zu Methylsuccinyl-Coenzym A katalysiert; - eines Enzyms E59, welches die Umsetzung von Methylsuccinyl-Coenzym A Isobutyryl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E60, welches die Umsetzung von Isobutyryl- Coenzym A zu Methacrylyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms Eβi, welches die Umsetzung von Methacry- lyl-Coenzym A zu 3-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E8, welches die Umsetzung von 3- Hydroxyisobutyryl-Coenzym A zu 3-Hydroxyisobutyrat katalysiert .
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte gentechnisch veränderte Zellen sind dabei diejenigen, bei denen die Aktivität folgender Enzyme oder Enzymkombinationen gesteigert ist: E8, E53, E54, E55, E56, E57, E58, E59, Eßo^ Eßi und E8E53E54E55E56E57E58E59E6oE6i •
Dieser Stoffwechselweg und die an diesem Stoffwechselweg beteiligten Enzyme sind beispielsweise in Korotkova et al . , Journal of Bacteriology (2002), Seiten 1.750 bis 1.758 be- schrieben.
Gemäß einer fünften Alternative der zweiten besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zelle erfolgt die Bildung des Zwischenproduktes Propionyl-Coenzym A wiederum ü- ber Acetyl-Coenzym A als weiteres Zwischenprodukt, wobei gemäß dieser Abwandlung ebenfalls Acetoacetyl-Coenzym A als weiteres Zwischenprodukt gebildet wird, wobei jedoch in diesem Fall aus Crotonyl-Coenzym A direkt Ethylmalonyl- Coenzym A gebildet wird. In diesem Zusammenhang kann es bevorzugt sein, dass die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme E8 und E53 bis E56 und E62 bis E65aufweist (siehe die Figur 14) :
eines Enzyms E53, welches die Umsetzung von zwei Ace- tyl-Coenzym A-Einheiten zu Acetoacetyl-Coenzym A katalysiert; - eines Enzyms E54, welches die Umsetzung von Acetoacetyl-Coenzym A zu 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E55, welches die Umsetzung von 3- Hydroxybutyryl-Coenzym A zu Crotonyl-Coenzym A kataly- siert; eines Enzyms E56, welches die Umsetzung von Crotonyl- Coenzym A zu Ethylmalonyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E62, welches die Umsetzung von Ethylmalonyl-Coenzym A zu Methylsuccinyl-Coenzym A katalysiert; - eines Enzyms E63, welches die Umsetzung von Methylsuccinyl-Coenzym A zu Mesaconyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E64, welches die Umsetzung von Mesaconyl- Coenzym A zu ß-Methylmalyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E65, welches die Umsetzung von ß- Methylmalyl-Coenzym A zu Glyoxylat und Propionyl- Coenzym A katalysiert.
Aus dem Propionyl-Coenzym A kann dann auf die vorstehend beschriebenen Art und Weisen (Erhöhung der Aktivität eines oder mehrerer der Enzyme E7, E2, E3 und E4, Erhöhung der Aktivität eines oder mehrerer der Enzyme E7, E6, E2, E3 und E4 oder Erhöhung der Aktivität eines der oder beider Enzyme E4 und E5) . In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, dass das Enzym
E53 eine ß-Kethothiolase (EC 2.3.1.9),
E54 Acetoacetyl-Coenzym A-Reduktase (eine EC 1.1.1.36),
E55 eine Enoyl-Coenzym A-Hydratase (EC 4.2.1.17),
E56 eine Crotonyl-Coenzym A-Decarboylase,
E62 eine Ethylmalonyl-Coenzym A-Mutase (EC 5.4.99.2), E63 eine Methylsuccinyl-Coenzym A-Dehydrogenase,
E64 eine Mesaconyl-Coenzym A-Hydratase, und
E65 eine ß-Methylmalyl/L-Malyl-Coenzym A-Lyase
ist.
Das Enzym E53 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus acatl, acat2, Ioc484063, Ioc489421, mgc69098, mgc81403, mgc81256, mgc83664, kat-1, erglO, ygeF, atoB, fadAx, phbA-1, phbA-2, atoB-2, pcaF, pcaF-2, phb-A, bktB, phaA, tioL, thlA, fadA, paaJ, phbAf, pimB, mmgA, yhfS, thl, vraB, thl, mvaC, thiL, paaJ, fadA3, fadA4, fadA5, fadA6, cgll2392, catF, sc8f4.03, thiLl, thiL2, acaBl, acaB2, acaB3, acaB4 oder kodiert, wobei a- catl, acat2, atoB und phbA sowie das entsprechende Gen aus Rhodobacter sphaeroides besonders bevorzugt sind.
Das Enzym E54 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus phbB, fabG, phbNl, phbB2 oder cgll2444 kodiert, wobei phbB besonders sowie das entspre- chende Gen aus Rhodobacter sphaeroides besonders bevorzugt sind. Das Enzym E55 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus echSl, ehhadh, hadha, echsl-prov, cg4389, cg4389, cg6543, cg6984, cg8778, ech-1, ech-2, ech- 3, ech-4, ech-5, ech-6, ech-7, FCAALL.314, fcaall.21, fox2, ecil, eci2, paaF, paaG, yfcX, fadB, faoA, rpfF, phaA, phaB, echAl, echA2, echA3, echA4, echA5, echA6, echA7, echA8, e- chA9, echA9, echAlO, echAl 1, echA12, echA13, echA14, e- chAl5, echAl 6, echAl7, echAl 8, echAl 9, echA20, echA21, fad- 1, fad-2, fad-3, dcaE, hcaA, fadJ, rspO671, rsp0035, rspO648, rspO647, rsO3234, rsO3271, rsO4421, rsO4419, rs02820, rsO2946, paaGl, paaG2, paaG3, ech, pksH, ydbS, eccHl, eccH2, pimF, fabJl, fabJ2, caiD2, ysiB, yngF, yusL, fucA, cglO919, scf41.23, scdlθ.16, sckl3.22, scp8.07c, stbacl6h6.14, sc5f2a.l5, sc6a5.38, hbd-1, hbd-2, hdb-3, hdb-4, hdb-5, hdb-6, hdb-7, hdb-8, hdb-9, hdb-10, fad-1, fad-2, fad-3, fad-4, fad-5, paaF-1, paaF-2, paaF-3, paaF-4, paaF-5, paaF-6, paaF-7 und crt kodiert, wobei das entsprechende Gen aus Rhodobacter sphaeroides besonders bevorzugt ist.
Als Enzym E56 wird vorzugsweise ein Enzym aus Rhodobacter sphaeroides eingesetzt, welches von DNA-Sequenz mit der Seq. -ID. -Nr. 05 kodiert wird und welches die Aminosäuresequenz gemäß Seq. -ID. -Nr. 06 aufweist.
Geeignete Gene für das Enzym E62 sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus mut, mutA, mutB, sbm, sbmA, sbmB, sbm5, bhbA, mcmA, mcmAl, mcmA2, mcmB, mcml, mcm2, mcm3, ic- mA, meaAl und meaA2, wobei auch hier das entsprechende Gen aus Rhodobacter sphaeroides besonders bevorzugt ist.
Bevorzugte Gene für die Enzyme E63, E64 und E65 sind insbesondere die Gene für diese Enzyme aus Rhodobacter sphaeroides . Weitere Beispiele für Nukleotidsequenzen der vorstehend genannten Gene können unter anderem auch der KEGG-Datenbank, der NCBI-Datenbank oder EMBL-Datenbank entnommen werden.
Wie bereits vorstehend erläutert, entsteht bei der ersten Alternative der zweiten bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßen Zelle die 3-Hydroxyisobuttersäure oder die auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoate über Propionyl-Coenzym A und Acetyl-Coenzym A als Zwischenprodukte. Dabei kann es grundsätzlich sinnvoll sein, neben einer Beeinflussung einer oder mehrerer der vorstehend genannten Enzymaktivitäten E2 bis E8 und E47 bis E65 auch solche Enzymaktivitäten zu beeinflussen, welche zu einer Erhö- hung der Bildung von Acetyl-Coenzym A in der Zelle führen.
Wenn die 3-Hydroxyisobuttersäure aus Kohlehydraten oder aus Glycerin als Kohlenstoffquelle gebildet wird, so kann es bevorzugt sein, dass die Zelle eine gesteigerte Aktivität eines Enzyms E66 aufweist, welches die Umsetzung von Pyru- vat zu Acetyl-Coenzym A katalysiert. Bei diesem Enzym E66 handelt es sich vorzugsweise um eine Pyruvat-Dehydrogenase (EC 1.2.1.51) .
Wenn die 3-Hydroxyisobuttersäure aus Ci-Kohlenstoffquellen wie etwa Methan oder Methanol gebildet wird, so kann es bevorzugt sein, dass die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der Enzyme E67 bis E7i aufweist:
eines Enzyms E67, welches die Umsetzung von Methan zu Methanol katalysiert; eines Enzyms E68, welches die Umsetzung von Methanol zu Formaldehyd katalysiert; eines Enzyms E69, welches die Umsetzung von Formaldehyd zu 5, 10-Methylenetetrahydrofolat katalysiert; - eines Enzyms E70, welches die Umsetzung von 5,10-
Methylen-etetrahydrofolate zu 5-Methyltetrahydrofolat katalysiert; eines Enzyms E7i, welches die Umsetzung von 5- Methyltetrahydrofolat zu Acetyl-Coenzym A katalysiert.
In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, dass das Enzym
E67 eine Methan-Monooxigenase (EC 1.14.13.25), E68 eine Methanol-Dehydrogenase (EC 1.1.1.244),
E69 eine Methylmalonatsemialdehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.27) ,
E70 eine Methylenetetrahydrofolat-Reductase (EC 1.5.1.20), E7i eine Kohlenmonoxid-Dehydrogenase (EC 1.2.99.2)
ist.
Die Nukleotidsequenzen geeigneter Gene für die Enzyme E63 bis E67 können der KEGG-Datenbank, der NCBI-Datenbank oder EMBL-Datenbank entnommen werden.
Gemäß einer dritten besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zelle, bei der die Bildung von 3- Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten über Methylmalonat-
Semialdehyd als Vorprodukt erfolgt, ist es bevorzugt, dass die Bildung der 3-Hydroxyisobuttersäure oder des auf 3- Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoates ü- ber Acryloyl-Coenzym -A als Zwischenprodukt erfolgt, wobei die Zelle vorzugsweise Kohlenhydrate, Glycerin oder Glutamat als Kohlenstoffquelle zu verwerten vermag.
Im Zusammenhang mit der dritten besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zelle ist es insbesondere bevorzugt, wenn diese Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der nachfolgenden Enzyme Eio bis Ei2, E56, E72 und E73 aufweist (siehe die Figur 15) :
eines Enzyms E72, welches die Umsetzung von Beta-Alanin zu Beta-Alanyl-Coenzym A katalysiert, eines Enzyms E73, welches die Umsetzung von Beta- Alanyl-Coenzym A zu Acrylyl-Coenzym A katalysiert, eines Enzyms E56, welches die Umsetzung von Acrylyl- Coenzym A zu Methylmalonyl-Coenzym A katalysiert, eines Enzyms Eio, welches die Umsetzung von Methylmalonyl-Coenzym A zu Methylmalonat katalysiert; - eines Enzyms En, welches die Umsetzung von Methylmalonat zu Methylmalonat-Semialdehyd katalysiert; eines Enzyms E12, welches die Umsetzung von Methylmalonat-Semialdehyd zu 3-Hydroxyisobuttersäure katalysiert.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Zellen sind dabei diejenigen, bei denen die Aktivität folgender Enzyme oder Enzymkombinationen gesteigert ist: E56Ei0, E56En, E56Ei2, E56EioEn und E72E73E56EI0EHEI2. Auch im Zusammenhang mit der vierten besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zelle kann es vorteilhaft sein, dass ein Enzym überexpri- miert wird, welches mindestens zwei der vorstehend beschriebenen Reaktionsschritte zu katalysieren vermag. So kann auch hier beispielsweise ein Enzym eingesetzt werden, welches sowohl die Aktivität des Enzyms Ei0 als auch die des Enzyms En aufweist, wie beispielsweise die Malonyl- Coenzym A-Reduktase aus Sulfolobus tokodaii, welche von der DNA-Sequenz mit der Seq. -ID. -Nr. 03 kodiert wird und welche die Aminosäuresequenz gemäß Seq. -ID. -Nr. 04 aufweist. Weiterhin ist es im Zusammenhang mit der vierten besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zelle grundsätzlich auch möglich, eine Zelle einzusetzen, die bereits in der Lage ist, besonders große Mengen an Acrylyl-Coenzym A zu bilden, einzusetzen.
In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, dass das Enzym
E72 eine Coenzym A-Transferase (EC 2.8.3.1) oder Coenzym A- Synthetase, vorzugsweise eine Coenzym A-Transferase,
E73 eine Beta-Alanyl-Coenzym A-Ammonium-Lysase (EC 4.3.1.6) ,
E56 eine Crotonyl-Coenzym A-Decarboxylase Eio eine Methylmalonyl-Coenzym A-Hydrolase (EC 3.1.2.17),
En eine Aldehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.3) oder eine Aldehyd-Oxidase (EC 1.2.3.1) und
E12 eine 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.31) oder eine 3-Hydroxyacyl-Coenzym A-Dehydrogenase (EC 1.1.1.35)
ist.
Bevorzugte Enzyme E72 mit einer CoA-Transferaseaktivität sind diejenigen aus Megasphaera elsdenii, Clostridium pro- pionicum, Clostridium kluyveri und auch aus Escherichia Coli. Als Beispiele für eine eine CoA-Transferase codierende DNA-Sequenz sei an dieser Stelle die in der WO-A-03/062173 mit der SEQ ID NO: 24 bezeichnete Sequenz aus Megasphaera elsdenii genannt. Des Weiteren bevorzugte Enzyme sind diejenigen Varianten der CoA-Transferase, die in der WO-A- 03/062173 beschrieben werden.
Geeignete Enzyme E73 mit einer Beta-Alanyl-Coenzym A- Ammonium-Lyase-Aktivität sind beispielsweise diejenigen aus Clostridium propionicum. DNA-Sequenzen, welche für ein solches Enzym kodieren, können beispielsweise aus Clostridium propionicum, wie im Beispiel 10 der WO-A-03/062173 beschrieben, erhalten werden. Die DNA-Sequenz, welche für die Beta-Alanyl-Coenzym A-Ammonium-Lyase aus Clostridium propionicum kodiert, ist in der WO-A-03/062173 als SEQ ID NO: 22 angegeben .
Als Enzym E56 wird vorzugsweise wiederum die Crotonyl- Coenzym A-Decarboxylase aus Rhodobacter sphaeroides eingesetzt, welche von DNA-Sequenz mit der Seq. -ID. -Nr. 05 kodiert wird und welche die Aminosäuresequenz gemäß Seq. -ID.- Nr. 06 aufweist. Dieses Enzym ist nicht nur in der Lage,
Crotonyl-Coenzym A zu Ethylmalonyl-Coenzym A, sondern auch Acrylyl-Coenzym A zu Methylmalonyl-Coenzym A umzusetzen
Geeignete Gene für die Enzyme E10 bis E12 wurden bereits im Zusammenhang mit der ersten Variante der erfindungsgemäßen Zelle genannt, wobei es auch im Zusammenhang mit der zweiten Variante bevorzugt ist, als Gen für das Enzym En das vorstehend beschriebene Gen aus Sulfolobus tokodaii besonders bevorzugt ist.
Gemäß einer besonders bevorzugten Variante der dritten besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zelle weist diese im Vergleich zu ihrem Wildtyp zumindest eine gesteigerte Aktivität der Enzyms E10 und E56 bzw. der Enzyme E10, En und E56 auf, wobei das Ei0 bzw. die Enzyme Ei0 und En von einer DNA-Sequenz gemäß SEQ. -ID-Nr. 03 und das Enzym E56 von einer DNA-Sequenz gemäß SEQ. -ID-Nr. 05 kodiert wird. In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, wenn die gesteigerte Aktivität dieser beiden Enzyme dadurch erzielt wird, dass die Polypeptide mit SEQ. -ID-Nr. 04 und der SEQ. -ID-Nr. 06 oder aber dass Aminosäure-Sequenzen, die eine Identität von mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 55 %, darüber hinaus bevorzugt mindestens 60 %, darüber hinaus bevorzugt mindestens 65 % und am meisten bevorzugt mindestens 70 % zu den Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ. -ID-Nr.: 04 bzw. SEQ. -ID- Nr. 06 aufweisen, in der Zelle überexpremiert werden. Dabei können diese beiden DNA-Sequenzen in das Genom der Zelle integriert sein oder auf einem Vektor im Inneren der Zelle vorliegen.
Im Zusammenhang mit der vorstehend beschriebenen, dritten besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zelle kann es weiterhin vorteilhaft sein, wenn die Zelle neben der Er- höhung der Aktivität des Enzyms E56 und/oder der Aktivität des Enzyms Eio bzw. der Enzyme Eio und En mindestens eine, vorzugsweise beide der folgenden Eigenschaften aufweist:
eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivi- tat eines Enzyms En, welches die Umsetzung von Pyruvat zu Oxalacetat katalysiert oder eines Enzyms E74, welches die Umsetzung von Phosphoenolpyruvat zu Oxalacetat katalysiert, vorzugsweise jedoch eines Enzyms En, welches die Umsetzung von Pyruvat zu Oxalacetat kataly- siert, sowie
eine gesteigerte Aktivität eines Enzyms E75, welches die Umsetzung von Aspartat zu Beta-Alanin katalysiert, Bei dem Enzym En handelt es sich vorzugsweise um eine Car- boxylase, besonders bevorzugt um eine Pyruvat-Carboxylase (EC-Nummer 6.4.1.1), welche die Umsetzung von Pyruvat zu Oxalacetat katalysiert. Eine in diesem Zusammenhang beson- ders bevorzugte Pyruvat-Carboxylase ist diejenige Mutante, die in „A novel methodology employing Corynebacterium glu- tamicum genome Information to generate a new L-lysine- producing mutant ." , Ohnishi J et al., Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 58 (2), Seiten 217-223 (2002) be- schrieben ist. Bei dieser Mutation wurde die Aminosäure Prolin an Position 458 durch Serin ersetzt. Der Offenbarungsgehalt dieser Veröffentlichung hinsichtlich der Möglichkeiten zur Herstellung von Pyruvat-Carboxylase-Mutanten wird hiermit als Referent eingeführt und bildet einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung.
Bei dem Enzym E75 handelt es sich vorzugsweise um eine De- carboxylase, besonders bevorzugt um eine Glutamat- Decarboxylase oder eine Aspartat-Decarboxylase, wobei eine 1-Aspartat-l-Decarboxylase (EC-Nummer 4.1.1.11) am meisten bevorzugt ist, welche von dem panD-Gen kodiert wird. Die Aspartat-Decarboxylase katalysiert die Umsetzung von Aspartat zu Beta-Alanin. Gene für die Aspartat-Decarboxylase (panD-Gene) unter anderem aus Escherichia coli (FEMS Micro- biology Letters, 143, Seiten 247-252 (1996)), „Photorhabdus luminescens subsp. Laumondii, Mycobacterium bovis subsp. Bovis") sowie aus zahlreichen anderen Mikroorganismen wurden bereits kloniert und sequenziert. Insbesondere die Nukleotidsequenz des panD-Gens aus Corynebacterium glutami- cum ist in der DE-A-198 55 313 beschrieben. Grundsätzlich können panD-Gene jeder nur denkbaren Herkunft, gleichgültig ob aus Bakterien, Hefen oder Pilzen, verwendet werden. Weiterhin können alle Allele des panD-Gens verwendet werden, insbesondere auch diejenigen, die sich aus der Degeneriert- heit des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale Sinnmutationen (sense mutations) ergeben. Eine neben der Aspartat-Decarboxylase aus Corynebacterium glutamicum erfindungsgemäß besonders bevorzugte Aspartat-Decarboxylase ist die Escherichia coli-Mutante DV9 (Vallari und Rock, Journal of Bacteriology, 164, Seiten 136-142 (1985)). Der Offenbarungsgehalt dieser Veröffentlichung hinsichtlich der vorstehend genannten Mutante wird hiermit als Referenz eingeführt und bildet einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung. Die Herstellung rekombinanter Zellen, in denen sowohl die Aktivität der Pyruvat-Carboxylase als auch die Aktivität der Aspartat-Decarboxylase erhöht ist, ist in DE-A-IO 2005 048 818 beschrieben.
Gemäß einer zweiten Variante der erfindungsgemäßen Zelle erfolgt die Bildung von 3-Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoa- ten über 3-Hyroxyisobutyryl-Coenzym A als Vorprodukt.
Wenn bei der erfindungsgemäßen Zelle die Bildung von 3- Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten gemäß der zweiten Variante über 3-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A als Vorprodukt erfolgt, so ist es gemäß einer ersten besonderen Ausführungsform bevorzugt, dass die Bildung der 3- Hydroxyisobuttersäure oder des auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoates über Isobutyryl-Coenzym A als Zwischenprodukt erfolgt, wobei die Zelle vorzugsweise Kohlenhydrate, Glycerin oder L-Valin als Kohlenstoffquelle zu verwerten vermag.
Sofern Kohlenhydrate oder Glycerin als Kohlenstoffquelle dienen, ist es gemäß einer ersten Alternative dieser ersten besonderen Ausführungsform der zweiten Variante der erfindungsgemäßen Zelle bevorzugt, dass diese Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme E76 bis E79, E60, E6x und E8 aufweist (siehe Figur 16) :
eines Enzyms E76, welches die Umsetzung von Pyruvat zu 2-Acetolactat katalysiert; eines Enzyms E77, welches die Umsetzung von 2- Acetolactat zu 2, 3-Dihydroxyisolvalerat katalysiert; eines Enzyms E78, welches die Umsetzung von 2,3- Dihydroxyisolvalerat zu 2-Oxoisovalerat katalysiert; - eines Enzyms E79, welches die Umsetzung von 2-
Oxoisovalerat zu Isobutyryl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E60, welches die Umsetzung von Isobutyryl- Coenzym A zu Methacrylyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E6x, welches die Umsetzung von Methacry- lyl-Coenzym A zu 3-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E8, welches die Umsetzung von 3- Hydroxyisobutyryl-Coenzym A zu 3-Hydroxyisobutyrat katalysiert .
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte gentechnisch veränderte Zellen sind dabei diejenigen, bei denen die Aktivität folgender Enzyme oder Enzymkombinationen gesteigert ist:
E8 , E6 O / Eßi , E76 , E77 , E78 , E79 und E8E6oE6iE76E77E78E79 .
In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, dass das Enzym
E8 eine 3-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A-Hydrolase (EC 3.1.2.4) ,
E76 eine Acetolactat-Synthase (EC 2.2.1.6),
E77 eine Dihydroxyisovalerat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.86), E78 eine 2, 3-Dihydroxyisovalerat-Dehydratase (EC 4.2.1.9),
E79 eine 2-Oxoisovalerat-Dehydrogenase (EC 1.2.1.25 oder EC 1.2.4.4) ,
E60 eine Acyl-Coenzym A-Dehydrogenase (EC 1.3.99.3), eine
Butyryl-Coenzym A-Dehydrogenase (EC 1.3.99.2) oder eine 2-Methylacyl-Coenzym A-Dehydrogenase (EC 1.3.99.12), und
E6i eine Enoyl-Coenzym A-Hydratase (EC 4.2.1.17)
ist.
Bevorzugt Enzyme E8, E60 und E6x sind diejenigen, die bereits vorstehend beschrieben worden sind.
Das Enzym E76 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend ilvbl, t8pl9.70, ilvl, ilv2, ilvβ, aalO21wp, ael305cp, ilvl, ilvH, ilvN, ilvB, ilvM, ilvG, ilvN, budB, iIvN-I, ilvN-2, atrC, ilvX, iolD, budB, alsS, ilvK, ilvBl, ilvB2, ilvB3, ilvNl, ilvN2, cgll271, cgll272, iolD und scc57A.40c kodiert.
Das Enzym E77 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend fl4p22.200, ilv5, acll98Wp, ilvC, il- vY, ilvC-1, ilvC-2, ilvC-3 und cgll273 kodiert, wobei das ilvC-Gen am meisten bevorzugt ist.
Das Enzym E78 wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend fl4ol3.18, ilv3, aclll7wp, ilvD, cgll268, ilvDl und ilvD2 kodiert, wobei ilvD am meisten be- vorzugt ist. Sofern L-Valin als Kohlenstoffquelle dient, ist es gemäß einer zweiten Abwandlung der ersten besonderen Ausführungsform der zweiten Alternative der erfindungsgemäßen Zelle, bei der die Bildung von 3-Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoa- ten über 3-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A als Vorprodukt und Isobutyryl-Coenzym A als Zwischenprodukt erfolgt, bevorzugt, dass diese eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme E79, E8O, E60, E6i und E8 aufweist (siehe die Figur 17) :
eines Enzyms E8o, welches die Umsetzung von L-Valin zu 2-Oxoisovalerat katalysiert; eines Enzyms E79, welches die Umsetzung von 2- Oxoisovalerat zu Isobutyryl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E60, welches die Umsetzung von Isobutyryl- Coenzym A zu Methacrylyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E6i, welches die Umsetzung von Methacrylyl-Coenzym A zu 3-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A kataly- siert; eines Enzyms E8, welches die Umsetzung von 3- Hydroxyisobutyryl-Coenzym A zu 3-Hydroxyisobutyrat katalysiert .
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte gentechnisch veränderte Zellen sind dabei diejenigen, bei denen die Aktivität folgender Enzyme oder Enzymkombinationen gesteigert ist:
E8 , E60 , E6i , E79 , E80 und E8E60E6IE79E80 .
In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, dass das Enzym Es eine 3-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A-Hydrolase (EC 3.1.2.4) ,
E60 eine Acyl-Coenzym A-Dehydrogenase (EC 1.3.99.3), eine
Butyryl-Coenzym A-Dehydrogenase (EC 1.3.99.2) oder eine 2-Methylacyl-Coenzym A-Dehydrogenase (EC 1.3.99.12),
Eδi eine Enoyl-Coenzym A-Hydratase (EC 4.2.1.17),
E79 eine 2-Oxoisovalerat-Dehydrogenase (EC 1.2.1.25 oder EC 1.2.4.4) , und
E8O eine Aminosäure-Transferase (EC 2.6.1.42)
ist.
Bevorzugte Enzyme Es, E6o, Eεi und E79 sind diejenigen, die bereits vorstehend beschrieben worden sind.
Das Enzym Eso wird vorzugsweise von Genen ausgewählt aus der Gruppe umfassend bcatl, bcat2, t27I1.8, t27il.9, f2jlθ.5, f2jlθ.4, tl2hl.l6, mmbl2.20, t9c5.3, mpa24.13, batl, bat2, adl384wp, eca39, bcaA, ilvE, ilvEl, ilvE2, il- vE3, ywaA, ybgE, bcaT und cgl2204 kodiert, wobei ilvE besonders bevorzugt ist.
Die Nukleotidsequenzen geeigneter Gene das Enzym Eso können im wiederum der KEGG-Datenbank, der NCBI-Datenbank oder EMBL-Datenbank entnommen werden.
Im Zusammenhang mit dieser zweiten Alternative der ersten besonderen Ausführungsform der zweiten Variante der erfindungsgemäßen Zelle kann es weiterhin vorteilhaft sein, die Aktivität eines Enzyms E4, welches die Umsetzung von Me- thylmalonatsemialdehyd zu 3-Hydroxyisobuttersäure katalysiert, zu vermindern, wobei es sich bei diesem Enzym E4 vorzugsweise um eine 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.31) oder um eine 3-Hydroxyacyl-Coenzym A- Dehydrogenase (EC 1.1.1.35) handelt.
Weiterhin kann es gemäß der zweiten Abwandlung der ersten besonderen Ausführungsform der zweiten Variante der erfindungsgemäßen Zelle, bei der die Bildung von 3- Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten über 3-Hydroxyisobutyryl- Coenzym A als Vorprodukt und Isobutyryl-Coenzym A als Zwischenprodukt und ausgehend von L-Valin als Kohlenstoffquelle erfolgt, bevorzugt sein, solche Zellen einzusetzen, die bereits große Mengen an L-Valin bilden können. In Betracht kommen hier insbesondere diejenigen Zellen, die in Applied Environmental Microbiology, Vol. 73 (7) (2007), Seiten 2.079-2.084 von Blombach et al . beschrieben wurden.
Sofern Ci-Verbindungen wie beispielsweise Methan oder Methanol als Kohlenstoffquelle dienen, ist es bei einer zwei- ten besonderen Ausführungsform der zweiten Variante der erfindungsgemäßen Zelle, bei der die Bildung von 3- Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten über 3-Hydroxyisobutyryl- Coenzym A als Vorprodukt erfolgt bevorzugt, dass die BiI- düng über 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A als Zwischenprodukt erfolgt. In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, dass die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme Es, E53, E54 und
eines Enzyms E53, welches die Umsetzung von Acetyl- Coenzym A zu Acetoacetyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E54, welches die Umsetzung von Acetoace- tyl-Coenzym A zu 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E8i, welches die Umsetzung von 3- Hydroxybutyryl-Coenzym A zu 3-Hydroxyisobutyryl- Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E8, welches die Umsetzung von 3- Hydroxyisobutyryl-Coenzym A zu 3-Hydroxyisobutyrat katalysiert .
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte gentechnisch veränderte Zellen sind dabei diejenigen, bei denen die Aktivität folgender Enzyme oder Enzymkombinationen gesteigert ist: E8, E53, E54, E8i, und E8E53E54E8I.
In diesem Zusammenhang ist es besonders bevorzugt, dass das Enzym
E8 eine 3-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A-Hydrolase (EC 3.1.2.4) ,
E53 eine ß-Kethothiolase (EC 2.3.1.9),
E54 Acetoacetyl-Coenzym A-Reduktase (eine EC 1.1.1.36), und
E8I eine Isobutyryl-Coenzym -Mutase (EC 5.4.99.13),
ist.
Bevorzugte Enzyme E8, E53 und E54 sind diejenigen, die bereits vorstehend beschrieben worden sind. Ein bevorzugtes Enzym E8x ist die Isobutyryl-Coenzym -Mutase aus ß- Proteobakterium des Stammes L108, die in Applied And Envi- ronmental Microbiology, Vol. 72 (6), 2006, Seiten 4.128- 4.135 beschrieben ist. Gemäß einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zelle ist es weiterhin bevorzugt, dass diese Zelle eine gegenüber ihrem Wildtyp gesteigerte Expression des glbO- Gens aufweist. Weiterhin kann es unter Umständen bevorzugt sein, dass die erfindungsgemäße Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp verminderte Aktivität des Citrat- Transportproteins, welches durch das dctA-Gen oder das citP-Gen kodiert wird, aufweist.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle, welche in der Lage ist, über Methylmalonat-Semialdehyd oder Isobutyryl-Coenzym A als Vorprodukte 3-Hydroxyisobuttersäure oder auf 3-
Hydroxyisobuttersäure basierende Polyhydroxyalkanoate zu bilden, umfassend den Verfahrensschritt der Erhöhung der Aktivität mindestens eines der vorstehend beschriebenen Enzyme, vorzugsweise eines oder mehrer der Enzyme
Ei bis E4,
Ei, E4, E5, E6 und E7,
Ei, E4, E5 und E7,
E4, E5 und E47 bis E52, - E2 bis E4, E6, E7 und E47 bis E52,
E2 bis E4, E7 und E47 bis E52,
E8 und E53 bis E6x,
E8, E60, E6i und E76 bis E79,
E8, E60, E6i, E79 und E80, oder - E8, E53, E54 und E82 in der Zelle, wobei das Erhöhen der Enzymaktivität vorzugsweise durch die eingangs beschriebenen Verfahren erfolgt.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leisten auch die durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhältlichen Zellen.
Einen weiteren Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet ein Verfahren zur Herstellung von 3- Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten, umfassend den Verfahrensschritt des in Kontakt bringens einer erfindungsgemäßen Zelle mit einem Nährmedium beinhaltend als Kohlenstoffquelle Kohlenhydrate, Glycerin, Kohlendioxid, Methan, Methanol, L-Valin oder L-Glutamat unter Bedingungen, unter denen aus der Kohlenstoffquelle 3-Hydroxyisobuttrsäure oder von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierende Polyhydroxyalkanoate gebildet werden, sowie gegebenenfalls Aufreinigung der 3- Hydroxyisobuttersäure aus dem Nährmedium.
Die erfindungsgemäßen, gentechnisch veränderten Zellen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch- Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch-Verfahren (Zulaufverfahren) oder repeated-fed-batch-Verfahren (repe- titives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von 3- Hydroxyisobutyrat oder von auf 3-Hydroxyisobutyrat basierenden Polyhydroxyalkanoaten mit dem Nährmedium in Kontakt und somit kultiviert werden. Denkbar ist auch ein semikontinuierliches Verfahren, wie es in der GB-A-1009370 be- schrieben wird. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel ( „Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik" (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas ( „Bioreaktoren und periphere Einrichtungen" , Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) beschrieben. Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stamme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981) enthalten.
Als Kohlenstoffquelle können Kohlehydrate wie z. B. Gluco- se, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Starke und Cellulose, Ole und Fette wie z. B. Sojaol, Sonnenblumenöl, Erdnussol und Kokosfett, Fettsauren wie z. B. Palmi- tinsaure, Stearinsaure und Linolsaure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Methanol, Kohlenwasserstoffe wie Methan, Ami- nosauren wie L-Glutamat oder L-Valin oder organische Sauren wie z. B. Essigsaure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Besonders bevorzugt ist der Einsatz von Kohlehydraten, insbesondere Monosaccharide, Oligosaccharide oder Polysaccharide, wie dies in US 6,01,494 und US 6,136,576 beschrieben ist, von C5- Zuckern oder von Glycerin.
Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsaure, Kaliumdihydro- genphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium kön- nen überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie z. B. Luft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 200C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 400C. Insbesondere bei der Verwendung von Zellen, welche Glycerin als Substrat umwandeln können, kann es bevorzugt sein, als Zellen solche Zellen einzusetzen, die in der US 6,803,218 beschrieben werden. In diesem Fall können die Zellen bei Temperaturen im Bereich von 40 bis 1000C kultiviert werden.
Die Aufreinigung der 3-Hydroxyisobuttersäure aus der Nähr- lösung erfolgt vorzugsweise kontinuierlich, wobei es in diesem Zusammenhang weiterhin bevorzugt ist, auch die Herstellung der 3-Hydroxyisobuttersäure durch Fermentation kontinuierlich durchzuführen, so dass der gesamte Prozess von der Herstellung der 3-Hydroxyisobuttersäure bis zur de- ren Aufreinigung aus der Fermentationsbrühe kontinuierlich durchgeführt werden kann. Zur kontinuierlichen Aufreinigung der Herstellung der 3-Hydroxyisobuttersäure aus der Fermentationsbrühe wird diese kontinuierlich über eine Vorrichtung zur Abtrennung der bei der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen, vorzugsweise über einen Filter mit einer Ausschlußgröße in einem Bereich von 20 bis 200 kDa geführt, in dem eine Fest/Flüssig-Trennung stattfindet. Denkbar ist auch der Einsatz einer Zentrifuge, einer geeigneten Sedimentationsvorrichtung oder eine Kombination dieser Vorrich- tungen, wobei es besonders bevorzugt ist, zumindest einen Teil der Mikroorganismen zunächst durch Sedimentation abzutrennen und anschließend die von den Mikroorganismen teilweise befreite Fermentationsbrühe einer Ultrafiltration o- der Zentrifugationsvorrichtung zuzuführen.
Das hinsichtlich seines 3-Hydroxyisobuttersäure-Anteils angereicherte Fermentationserzeugnis wird nach der Abtrennung der Mikroorganismen einer vorzugsweise mehrstufigen Trennanlage zugeführt. In dieser Trennanlage sind mehrere hin- tereinander geschaltete Trennstufen vorgesehen, aus denen jeweils Rückführleitungen ausmünden, die zum Fermentationstank zurückgeführt sind. Weiterhin führen aus den jeweiligen Trennstufen Ableitungen heraus. Die einzelnen Trennstufen können nach dem Prinzip der Elektrodialyse, der Umkehr- osmose, der Ultrafiltration oder der Nanofiltration arbeiten. In der Regel handelt es sich um Membran- Trenneinrichtungen in den einzelnen Trennstufen. Die Auswahl der einzelnen Trennstufen ergibt sich aus Art und Umfang der Gärungsnebenprodukte und Substratreste.
Neben der Abtrennung der 3-Hydroxyisobuttersäure mittels Elektrodialyse, Umkehrosmose, Ultrafiltration oder Nano- filtration, in deren Verlauf als Endprodukt eine wässrige 3-Hydroxyisobuttersäure-Lösung erhalten wird, kann die 3- Hydroxyisobuttersäure auch durch Extraktionsverfahren aus der von Mikroorganismen befreiten Fermentationslösung abgetrennt werden, wobei in diesem Fall letztendlich die reine 3-Hydroxyisobuttersäure erhalten werden kann. Zur Abtrennung der 3-Hydroxyisobuttersäure durch Extraktion können der Fermentationslösung beispielsweise Ammoniumverbindungen oder Amine zugesetzt werden, um ein Ammoniumsalz der 3- Hydroxyisobuttersäure zu bilden. Dieses Ammoniumsalz kann dann aus der Fermentationslösung abgetrennt werden, in dem ein organisches Extraktionsmittel zugesetzt und die so er- haltene Mischung anschließend erhitzt wird, wodurch das Ammoniumsalz sich in der organischen Phase anreichert. Aus dieser Phase kann die 3-Hydroxyisobuttersäure dann unter Erhalt der reinen 3-Hydroxyisobuttersäure beispielsweise durch weitere Extraktionsschritte isoliert werden. Genauere Einzelheiten bezüglich dieses Trennverfahrens sind der WO- A-02/090312 zu entnehmen, deren Offenbarungsgehalt hinsichtlich der Abtrennung von Hydroxycarbonsäuren aus Fermentationslösungen hiermit als Referenz eingeführt wird und einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Anmeldung bil- det.
Je nach Art und Weise der Abtrennung der 3-
Hydroxyisobuttersäure aus der Fermentationslösung wird entweder eine wässrige 3-Hydroxyisobuttersäure-Lösung, bein- haltend 2 bis 90 Gew.-%, vorzugsweise 7,5 bis 50 Gew.-% und besonders bevorzugt 10 bis 25 Gew.-% an 3- Hydroxyisobuttersäure, oder aber reine 3- Hydroxyisobuttersäure erhalten.
Des Weiteren kann die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte 3-Hydroxyisobuttersäure vor, während oder nach der Aufreinigung noch neutralisiert werden, wobei hierzu Basen wie etwa Kalziumhydroxid oder Natriumhydroxid eingesetzt werden können. Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet insbesondere auch ein Verfahren zur Herstellung von Methacrylsäure oder Methacrylsäureestern, umfassend die Verfahrensschritte IA) Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure durch das vorstehend beschriebene Verfahren sowie gegebenenfalls Aufreinigung und/oder Neutralisation der 3- Hydroxyisobuttersäure der 3-Hydroxyisobuttersäure,
IB) Dehydratisierung der 3-Hydroxyisobuttersäure unter BiI- düng von Methacrylsäure sowie gegebenenfalls Veresterung des Methacrylates bzw. der Methacrylsäure.
Gemäß Verfahrensschritt IB) wird die 3- Hydroxyisobuttersäure unter Bildung von Methacrylsäure de- hydratisiert, wobei hierzu entweder die aus der Fermenati- onslösung isolierte, reine 3-Hydroxyisobuttersäure oder a- ber die bei der Aufarbeitung der Fermenationslösung isolierte wässrige 3-Hydroxyisobuttersäure-Lösung eingesetzt werden kann, wobei diese gegebenenfalls noch vor der De- hydratisierung beispielsweise durch Destillation, gegebenenfalls in Gegenwart eines geeigneten Schleppmittels, aufkonzentriert wird.
Die Dehydratisierung kann grundsätzlich in flüssiger Phase oder in der Gasphase durchgeführt werden. Weiterhin ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass die Dehydratisierung in Gegenwart eines Katalysators erfolgt, wobei die Art des eingesetzten Katalysators davon abhängig ist, ob eine Gasphasen- oder eine Flüssigphasenreaktion durchgeführt wird.
Als Dehydratisierungskatalysatoren kommen sowohl saure als auch alkalische Katalysatoren in Betracht. Saure Katalysatoren sind insbesondere wegen der geringen Neigung zur Oli- gomerenbildung bevorzugt. Der Dehydratisierungskatalysator kann sowohl als homogener als auch als heterogener Katalysator eingesetzt werden. Wenn der Dehydratisierungskataly- sator als heterogener Katalysator vorliegt, ist es bevorzugt, dass der Dehydratisierungskatalysator mit einem Trä- ger x in Kontakt steht. Als Träger x kommen alle dem Fachmann als geeignet erscheinenden Feststoffe in Betracht. In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, dass diese Feststoffe geeignete Porenvolumina aufweisen, die zur guten Anbindung und Aufnahme des Dehydratisierungskatalysators geeignet sind. Außerdem sind Gesamtporenvolumen nach DIN 66133 in einem Bereich von 0,01 bis 3 ml/g bevorzugt und Gesamtporenvolumen in einem Bereich von 0,1 bis 1,5 ml/g besonders bevorzugt. Zudem ist es bevorzugt, dass die als Träger x geeigneten Feststoffe eine Oberfläche im Bereich von 0,001 bis 1000 m /g, vorzugsweise im Bereich von 0,005 bis 450 m /g und darüber hinaus bevorzugt im Bereich von 0,01 bis 300 m2/g nach BET-Test gemäß DIN 66131 aufweisen. Als Träger für den Dehydratisierungskatalysator kann zum einen ein Schüttgut, das einen mittleren Teilchendurchmesser im Be- reich von 0,1 bis 40 mm, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 10 mm und darüber hinaus bevorzugt im Bereich von 1,5 bis 5 mm aufweist, eingesetzt werden. Ferner kann die Wand des Dehydratisierungsreaktors als Träger dienen. Weiterhin kann der Träger an sich sauer oder basisch sein oder ein saurer oder basischer Dehydratisierungskatalysator auf einen inerten Träger aufgebracht werden. Als Aufbringtechniken sind insbesondere Eintauchen bzw. Imprägnieren oder das Einarbeiten in eine Trägermatrix zu nennen.
Als Träger x, die auch Dehydratisierungskatalysatoreigen- schaften aufweisen können, eignen sich insbesondere natürliche oder synthetische silikatische Stoffe, wie insbesondere Mordenit, Montmorillonit, saure Zeolithe; mit ein-, zwei oder mehrbasigen anorganischen Säuren, insbesondere Phosphorsäure, oder saure Salze anorganischer Säuren belegte Trägerstoffe, wie oxidische oder silikatische Stoffe, beispielsweise AI2O3, TiC^; Oxide und Mischoxide, wie beispielsweise γ-Al2θ3 und ZnO-Al2θ3-Mischoxide der Heteropoly- säuren .
Es entspricht einer erfindungsgemäßen Ausführungsform, dass der Träger x mindestens teilweise aus einer oxidischen Verbindung besteht. Derartige oxidische Verbindungen sollten mindestens eines der Elemente aus Si, Ti, Zr, Al, P oder eine Kombination von mindestens zwei davon aufweisen. Der- artige Träger können auch selber durch ihre sauren bzw. basischen Eigenschaften als Dehydratisierungskatalysator wirken. Eine bevorzugte sowohl als Träger als x als auch als Dehydratisierungskatalysator wirkende Verbindungsklasse beinhalten Silizium/Aluminium/Phosphoroxide. Bevorzugte ba- sische sowohl als Dehydratisierungskatalysator als auch als Träger x fungierende Stoffe beinhalten Alkali, Erd-alkali, Lanthan, Lanthanoide oder eine Kombination von mindestens zwei davon in ihrer oxidischen Form. Derartige saure oder basische Dehydratisierungskatalysatoren sind sowohl bei der Degussa AG als auch bei der Südchemie AG kommerziell erhältlich. Eine weitere Klasse stellen Ionenaustauscher dar. Auch diese können sowohl in basischer als auch in saurer Form vorliegen.
Als homogene Dehydratisierungskatalysatoren kommen insbesondere anorganische Säuren, vorzugsweise Phosphor beinhaltende Säuren und darüber hinaus bevorzugt Phosphorsäure in Betracht. Diese anorganischen Säuren können auf dem Träger x durch Eintauchen bzw. Imprägnieren immobilisiert werden.
Insbesondere bei der Gasphasendehydratisierung hat sich der Einsatz von heterogenen Katalysatoren besonders bewährt. Bei der Flüssigphasendehydratisierung werden jedoch sowohl homogene als auch heterogene Dehydratisierungskatalysatoren eingesetzt. Zudem ist es bevorzugt, dass in dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Dehydratisierungskatalysator mit einem Ho-Wert im Bereich von +1 bis -10, vorzugsweise in einem Bereich von +2 bis -8,2 und darüber hinaus bevorzugt bei der Flüs- sigphasendehydratisierung in einem Bereich von +2 bis -3 und in der Gasphasendehydratisierung in einem Bereich von - 3 bis -8,2 eingesetzt wird. Der H0-Wert entspricht der Säurefunktion nach Hämmert und lässt sich durch die sogenannte Amin-Titration und Verwendung von Indikatoren oder durch
Absorption einer gasförmigen Base ermitteln (siehe „Studies in Surface Science and Catalytics" , Vol. 51, 1989: „New solid Acids and Bases, their catalytic Properties" , K. Tanna- be et al .
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als saurer Feststoffkatalysator ein mit einer anorganischen Säure, vorzugsweise mit Phosphorsäure oder mit Supersäuren wie etwa sulfatisiertem oder phospha- tisiertem Zirkoniumoxid in Kontakt gebrachter porenförmiger Trägerkörper eingesetzt, der vorzugsweise zu mindestens 90 Gew.-%, darüber hinaus bevorzugt zu mindestens 95 Gew.-% und am meisten bevorzugt zu mindestens 99 Gew.-% auf einem Siliziumoxid, vorzugsweise auf SiC>2, basiert. Das in Kon- takt bringen des porenförmigen Trägerkörpers mit der anorganischen Säure erfolgt vorzugsweise durch das Imprägnieren des Trägerkörpers mit der Säure, wobei diese vorzugsweise in einer Menge in einem Bereich von 10 bis 70 Gew.-%, besonders bevorzugt in einem Bereich 20 bis 60 Gew.-% und darüber hinaus bevorzugt in einem Bereich von 30 bis 50
Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Trägerkörpers, mit diesem in Kontakt gebracht und anschließend getrocknet wird. Im Anschluss an die Trocknung wird der Trägerkörper zur Fixierung der anorganischen Säure erhitzt, vorzugsweise auf eine Temperatur in einem Bereich von 300 bis 6000CC, darüber hinaus bevorzugt in einem Bereich von 400 bis 5000C.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemä- ßen Verfahrens wird die Dehydratisierung in der Gasphase durchgeführt. Dabei können übliche Apparaturen, wie sie dem Fachmann für Gasphasenreaktion bekannt sind, beispielsweise Röhrenreaktoren, eingesetzt werden. Besonders bevorzugt ist der Einsatz von Rohrbündelwärmeaustauschern sowie von Reak- toren, welche Thermobleche als Wärmeaustauscher beinhalten.
Gemäß einer Ausführungsform der Gasphasendehydratisierung wird reine 3-Hydroxyisobuttersäure in einen Reaktor umfassend einen der vorstehend genannten Festbettkatalysatoren eingebracht. Gemäß einer anderen Ausführungsform wird die 3-Hydroxyisobuttersäure in Form einer wässrigen Lösung beinhaltend 2 bis 80 Gew.-%, besonders bevorzugt 5 bis 50 Gew.-% und darüber hinaus bevorzugt 10 bis 25 Gew.-% an 3- Hydroxyisobuttersäure, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der wässrigen Lösung, in den Reaktor eingebracht. Die Druck- und Temperaturbedingungen im Inneren des Reaktors werden so gewählt, dass die 3-Hydroxyisobuttersäure bzw. die wässrigen Lösung bei ihrem Eintritt in den Reaktor in gasförmiger Form vorliegt. Die Dehydratisierung in der Gasphase erfolgt vorzugsweise im Temperaturbereich zwischen 200 und 400°C, besonders bevorzugt zwischen 250 und 3500C. Der Druck im Inneren des Reaktors liegt bei der Gasphasendehydratisierung vorzugsweise in einem Bereich von 0,1 bis 50 bar, besonders bevorzugt in einem Bereich von 0,2 bis 10 bar und am meisten bevorzugt in einem Bereich von 0,5 bis 5 bar.
Die Menge an in den Reaktor eingebrachter 3- Hydroxyisobuttersäure liegt bei der Gasphasendehydratisierung vorzugsweise in einem Bereich von 10 bis 100 Vol-%, besonders bevorzugt in einem Bereich von 20 bis 100 Vol-% und am meisten bevorzugt in einem Bereich von 30 bis 100 Vol-%.
Gemäß einer anderen besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Dehydratisierung in der Flüssigphase durchgeführt. Die Flüssigphasendehydratisie- rung kann ebenfalls in allen dem Fachmann bekannten Apparaturen durchgeführt werden, in denen ein Fluid auf eine gewünschte Reaktionstemperatur erhitzt werden kann, wobei die Apparatur mit einem Druck beaufschlagt werden kann, der ausreicht, um die Reaktionskomponenten unter den gewünschten Temperaturbedingungen flüssig zu halten.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Verfahren der Flüssigphasende- hydratisierung einen ersten Verfahrensschritt, bei dem rei- ne 3-Hydroxyisobuttersäure oder eine wässrige Lösung beinhaltend 5 bis 100 Gew.-%, besonders bevorzugt 20 bis 100 Gew.-% und am meisten bevorzugt 50 bis 100 Gew.-% an 3- Hydroxyisobuttersäure, bezogen auf das Gesamtgewicht der wässrigen Lösung, in einen Reaktor eingebracht wird. Die Druck- und Temperaturbedingungen im Inneren des Reaktors werden so gewählt, dass die 3-Hydroxyisobuttersäure bzw. die wässrigen Lösung bei ihrem Eintritt in den Reaktor in flüssiger Form vorliegt. Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem eine Dehydratisierung in der Flüssigphase durchgeführt wird, wird die 3-Hydroxyisobuttersäure bzw. die wässrige Lösung im Inneren des Dehydratisierungsreaktors derart über ein Katalysatorfestbett geführt, dass die flüssige Phase über die Oberfläche der Katalysatorpartikel rieselt. Eine derar- tige Vorgehensweise kann beispielsweise in einem Riesel- bettreaktor durchgeführt werden.
Die Dehydratisierung in der Flüssigphase erfolgt vorzugsweise im Temperaturbereich zwischen 200 und 3500C, beson- ders bevorzugt zwischen 250 und 3000C. Der Druck im Inneren des Reaktors liegt bei der Flüssigphasendehydratisierung vorzugsweise in einem Bereich von 1 bis 50 bar, besonders bevorzugt in einem Bereich von 2 bis 25 bar und am meisten bevorzugt in einem Bereich von 3 bis 10 bar.
Die Katalyse der Dehydratisierung kann sowohl bei der Gasphasendehydratisierung als auch bei der Flüssigphasendehydratisierung homogen oder heterogen erfolgen.
Bei der homogenen Katalyse wird der Katalysator, bei dem es sich dann vorzugsweise um eine anorganische Säure wie etwa Phosphorsäure oder Schwefelsäure handelt, zunächst mit der reinen 3-Hydroxyisobuttersäure oder mit der wässrigen Lösung beinhaltend die 3-Hydroxyisobuttersäure in Kontakt ge- bracht. Anschließend wird die so erhaltene Zusammensetzung in den Reaktor eingebracht und unter den gewünschten Druck- und Temperaturbedingungen in Methacrylsäure überführt. Denkbar ist auch, die anorganische Säure unabhängig von der 3-Hydroxyisobuttersäure bzw. der wässrigen Lösung in den Reaktor einzubringen. In diesem Fall weist der Reaktor mindestens zwei Zuleitungen, eine für die 3-
Hydroxyisobuttersäure bzw. die wässrigen Lösung beinhaltend die 3-Hydroxyisobuttersäure und eine für den Katalysator, auf. Wird die Dehydratisierung in flüssiger Phase in einem Rieselbettreaktor durchgeführt, so ist es bevorzugt, dass der Katalysator zusammen mit der 3-Hydroxyisobuttersäure bzw. der wässrigen Lösung beinhaltend die 3- Hydroxyisobuttersäure im Kopfbereich des Reaktors eingebracht wird.
Bei der heterogenen Katalyse befindet sich der Katalysator in Form eines festen Substrates im Reaktionsraum, beispielsweise in Form einer Festbettschüttung, in Form von mit Katalysator beschichteten Platten, vorzugsweise Thermo- blechen, welche im Inneren des Reaktors angeordnet sind o- der aber in Form von mit Katalysator beschichteten Reaktorwänden. Mögliche Reaktoren sind beispielsweise in der DE-A- 198 48 208, DE-A-100 19 381 und EP-A-I 234 612 beschrieben. Im Falle der heterogenen Katalyse sind als Katalysatoren mit anorganischen Säuren in Kontakt gebrachte, vorzugsweise imprägnierte porenförmiger Trägerkörper bevorzugt. Die 3- Hydroxyisobuttersäure bzw. die wässrige Lösung beinhaltend die 3-Hydroxyisobuttersäure wird dann in dampfförmiger oder flüssiger Form mit der Oberfläche des festen Katalysatorma- terials in Kontakt gebracht.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Dehydratisierung der 3- Hydroxyisobuttersäure in flüssiger Phase bei einem Druck in einem Bereich von 200 bis 500 mbar, bei einer Temperatur in einem Bereich von 200 bis 2300C und in Gegenwart von Alka- limetall-Ionen als Katalysator durchgeführt.
Als Reaktionsgemisch, welches im Anschluss an die Dehydra- tisierung erhalten wird, wird entweder eine wässrige Me- thacrylsäure-Lösung, die keine Katalysatorbestandteile enthält (eine solche wird im Falle einer heterogen katalysierten Dehydratisierung erhalten) oder aber eine wässrige Me- thacrylsäure-Lösung, welche Katalysatoren beinhaltet (eine solche wird im Falle einer homogen katalysierten Dehydratisierung erhalten) erhalten. Weiterhin kann die wässrige Me- thacrylsäure-Lösung in flüssiger Form (sofern die Dehydratisierung in der Flüssigphase erfolgt ist) oder gasförmig (sofern die Dehydratisierung in der Gasphase erfolgt ist) vorliegen.
Die so erhaltene Methacrylsäure-Lösung kann gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ohne weitere Aufarbeitung gegebenenfalls der Veresterung zugeführt werden. Dabei wird die Methacrylsäure-Lösung mit entsprechenden Alkoholen, wie etwa Methanol, Ethanol, 1- Propanol, 2-Propanol oder 1-Butanol sowie geeigneten, dem Fachmann bekannten Veresterungkatalysatoren, wie etwa konzentrierten Säuren, unter Erhitzen in Kontakt gebracht und die Methacrylsäure auf diese Weise in die entsprechenden Ester überführt. Vorteilhaft kann es jedoch sein, die Methacrylsäure vor der Veresterung noch aufzureinigen, wobei zur Aufreinigung grundsätzlich jedes dem Fachmann bekanntes Aufreinigungsverfahren angewendet werden kann, welches her- kömmlicherweise zur Aufreinigung verunreinigter, durch ka- talytische Gasphasenoxidation von Propylen erhaltener (Meth) Acrylsäure Anwendung findet.
Wurde die Dehydratisierung in der Gasphase durchgeführt, so ist es bevorzugt, dass die Methacrylsäure zunächst unter Erhalt einer wässrigen Methacrylsäure-Lösung kondensiert wird. Dabei kann grundsätzlich jedes dem Fachmann bekannte Kondensationsverfahren eingesetzt werden, beispielsweise eine fraktionierte Kondensation, wie sie in WO-A- 2004/035514, WO-A-03/014172 oder EP-A-EP 1 163 201 beschrieben ist, oder durch eine Totalkondensation, wie sie in der EP-A-O 695 736 beschrieben ist. Denkbar ist auch, bei der Kondensation zusätzliches Lösungsmittel, insbesondere Wasser, zuzusetzen, um die Methacrylsäure möglichst vollständig zu absorbieren.
Die nach der Kondensation erhaltene, wässrige Methacrylsäure-Lösung oder aber die im Falle der Flüssigphasendehydra- tisierung erhaltene wässrige Methacrylsäure-Lösung kann dann in weiteren Aufreinigungsschritten von Wasser und anderen Verunreinigungen befreit werden. Dabei kann zunächst das Wasser in Gegenwart eines Schleppmittels durch Aze- otropdestillation entfernt werden, wie dies beispielsweise in der DE-A-198 53 064 beschrieben ist. Denkbar ist auch der Einsatz hochsiedender organischer Lösungsmittel zur Ab- Sorption der Methacrylsäure, wie dies beispielsweise in der EP-A-O 974 574 offenbart ist. Neben diesen destillativen Verfahren können auch Membranen zur Entwässerung eingesetzt werden, wie dies etwa in DE-A-44 01 405 vorgeschlagen wird. Denkbar ist weiterhin eine Aufreinigung der im Falle der
Flüssigphasendehydratisierung gewonnen oder durch Kondensation erhaltenen wässrigen Methacrylsäure-Lösung durch Kristallisationsverfahren .
Die nach dem Entwässern erhaltene Methacrylsäure kann in weiteren Verfahrensschritten noch weiter aufgereinigt werden. So können noch enthaltene, hochsiedende Verunreinigungen durch weitere Destillationsschritte entfernt werden. Besonders bevorzugt ist es jedoch, wenn die nach dem Ent- wässern erhaltene Methacrylsäure durch Kristallisationsverfahren weiter aufgereinigt wird, wie dies etwa in DE-A- 101 49 353 beschrieben ist.
Die so erhaltene, aufgereinigte Methacrylsäure kann dann gegebenenfalls der Veresterung unterzogen werden.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Methacrylsäure oder Methacrylsäureestern, umfassend die Verfah- rensschritte
IIA) Herstellung von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten durch das vorstehend beschriebene Verfahren,
IIB) Spaltung der auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoate unter Bildung von 3- Hydroxyisobuttersäure sowie gegebenenfalls Neutralisa- tion der 3-Hydroxyisobuttersäure und/oder Aufreinigung der 3-Hydroxyisobuttersäure,
HC) Dehydratisierung der 3-Hydroxyisobuttersäure unter BiI- düng von Methacrylsäure sowie gegebenenfalls Veresterung des Methacrylates bzw. der Methacrylsäure.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch ein Verfahren zur Herstellung von Polymethac- rylsäure oder Polymethacrylsäureestern, umfassend die Verfahrensschritte
IHA) Herstellung von Methacrylsäure durch das vorstehend beschriebene Verfahren,
HIB) radikalische Polymerisation der Methacrylsäure,
wobei gegebenenfalls die Carboxylgruppen der Methacrylsäure vor oder nach der radikalischen Polymerisation zumindest teilweise verestert werden können.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgabe leistet weiterhin eine isolierte DNA, welche ausgewählt ist aus den folgenden Sequenzen:
a) eine Sequenz gemäß SEQ. -ID-Nr. 03, b) eine intronfreie Sequenz, die von einer Sequenz nach a) abgeleitet ist und die das gleiche Protein oder Peptid kodiert wie die Sequenz nach SEQ. -ID-Nr. 03, c) eine Sequenz, die ein Protein oder Peptid kodiert, das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ. -ID-Nr. 04 umfasst, d) eine Sequenz, die mit einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis c) , besonders bevorzugt nach Gruppe a) , zu mindestens 80 %, besonders bevorzugt zu mindestens 90 %, darüber hinaus bevorzugt zu mindestens 95 % und am meisten bevorzugt zu mindestens 99 % identisch ist, wobei diese Sequenz vorzugsweise für ein Protein oder Peptid kodiert, welches in der Lage ist, sowohl S- oder R-Methylmalonyl-Coenzym A als auch Malonyl-Coenzym A zu den entsprechenden Semialdehyden ((S)- oder (R)- Methylmalonatsemialdehyd bzw. Malonatsemialdehyd) umzusetzen, e) eine Sequenz, die mit dem Gegenstrang einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis d) , besonders bevorzugt nach Gruppe a) , hybridisiert oder unter Berücksichti- gung der Degeneration des genetischen Codes hybridisieren würde, wobei diese Sequenz vorzugsweise für ein Protein oder Peptid kodiert, welches in der Lage ist, sowohl S- oder R-Methylmalonyl-Coenzym A als auch Malonyl-Coenzym A zu den entsprechenden Semialdehyden ((S)- oder (R) -Methylmalonatsemialdehyd bzw. Malonatsemialdehyd) umzusetzen, f) ein durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion mindestens einer Base, vorzugsweise von mindestens 2 Basen, darüber hinaus bevorzugt von mindes- tens 5 Basen und am meisten bevorzugt mindestens 10 Basen, jedoch vorzugsweise von nicht mehr als 100 Basen, besonders bevorzugt von nicht mehr als 50 Basen und am meisten bevorzugt von nicht mehr als 25 Basen erhaltenes Derivat einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis e) , besonders bevorzugt nach Gruppe a) , wobei dieses Derivat vorzugsweise für ein Protein oder Peptid kodiert, welches in der Lage ist, sowohl S- oder R- Methylmalonyl-Coenzym A als auch Malonyl-Coenzym A zu den entsprechenden Semialdehyden ((S)- oder (R)- Methylmalonatsemialdehyd bzw. Malonatsemialdehyd) umzusetzen, g) eine komplementäre Sequenz zu einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis f) , besonders bevorzugt nach Gruppe
Überraschend wurde festgestellt, dass eine aus Bakterien des Stammes Sulfolobus tokodaii (bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungsnummer DSM 16993) isolierte DNA mit einer DNA-Sequenz gemäß SEQ.- ID. -Nr. 03 ein Polypeptid kodiert (SEQ. -ID-Nr. 04), welches auch bei Temperaturen von bis zu 75°C in der Lage ist, sowohl S- oder R-Methylmalonyl-Coenzym A als auch Malonyl- Coenzym A zu den entsprechenden Semialdehyden ((S)- oder (R) -Methylmalonatsemialdehyd bzw. Malonatsemialdehyd) umzusetzen. Da (S)- oder (R) -Methylmalonatsemialdehyd und MaIo- natsemialdehyd naturliche Stoffwechselprodukte sind, welche beispielsweise beim Abbau des Valins, des Leucins oder des Isoleucins, beim Metabolismus des Propanoates oder beim Metabolismus des Pyruvates gebildet werden und weil die gebildeten Semialdehyde im Verlaufe der vorstehend genannte Stoffwechselwege zu den entsprechenden 3-Hydroxyalkanoaten weiterreduziert werden können, kann die erfindungsgemaße isolierte DNA genutzt werden, um rekombinante Bakterien herzustellen, welche in der Lage sind, direkt große Mengen an 3-Hydroxyisobuttersaure (bzw. 3-Hydroxypropionsaure) zu bilden. Wenn die Zellen darüber hinaus in der Lage sind, die gebildeten 3-Hydroxyalkanoate unter Bildung von PoIy- hydroxyalkanoaten zu polymerisieren, so wurde sich diese DNA darüber hinaus eignen, um rekombinante Bakterien herzustellen, die auf 3-Hydroxyisobuttersaure (bzw. auf 3- Hydroxypropionsaure) basierende Polyhydroxyalkanoate herstellen können.
Die „Nukleotid-Identitat" relativ zur SEQ. -ID-Nr. 03, welche in Alternative d) definiert ist, wird hierbei mit Hilfe bekannter Verfahren bestimmt. Generell werden besondere Computerprogramme mit Algorithmen unter Berücksichtigung spezieller Erfordernisse verwendet.
Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Identität erzeugen zunächst die größte Übereinstimmung zwischen den zu vergleichenden Sequenzen. Computer-Programme zur Bestimmung der Identität umfassen, sind jedoch nicht beschrankt auf, das GCG- Programmpaket, einschließlich
- GAP (Deveroy, J. et al . , Nucleic Acid Research 12
(1984), Seite 387, Genetics Computer Group University of Wisconsin, Medicine (Wi), und
BLASTP, BLASTN und FASTA (Altschul, S. et al., Journal of Molecular Biology 215 (1990), Seiten 403-410. Das
BLAST-Programm kann erhalten werden vom National Center For Biotechnology Information (NCBI) und aus weiteren Quellen (BLAST Handbuch, Altschul S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894; Altschul S. et al . , vorstehend).
Der bekannte Smith-Waterman Algorithmus kann ebenso zur Bestimmung der Nukleotid-Identitat verwendet werden.
Bevorzugte Parameter zum Nukleotidvergleich umfassen die nachfolgenden:
Algorithmus Needleman und Wunsch, Journal of Molecular Biology 48 (1970), Seiten 443-453
- Vergleichsmatrix
Matches = + 10 Mismatches = 0
Gap penalty = 50
Gap length penalty = 3
Das GAP-Programm ist ebenso zur Verwendung mit den vorstehenden Parametern geeignet. Die vorstehenden Parameter sind die default-Parameter im Nukleotidsequenzvergleich.
Eine Identität von 80 % gemäß dem vorstehenden Algorithmus bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung 80 % Identität. Das gleiche gilt für höhere Identitäten.
Das Merkmal „Sequenz, die mit dem Gegenstrang einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis d) , besonders bevorzugt nach Gruppe a) , hybridisiert oder unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Codes hybridisieren würde" gemäß Alternative e) weist auf eine Sequenz hin, die unter vorzugsweise stringenten Bedingungen mit dem Gegenstrang einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis d) , besonders bevor- zugt nach Gruppe a) , hybridisiert oder unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Codes hybridisieren würde. Beispielsweise können die Hybridisierungen bei 68°C in 2 x SSC oder nach dem Protokoll des Dioxygenin- Labelling-Kits der Firma Boehringer (Mannheim) durchgeführt werden. Bevorzugte Hybridisierungsbedingungen sind z. B. Inkubation bei 65°C über Nacht in 7 % SDS, 1 % BSA, 1 mM EDTA, 250 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,2) und nachfolgendes Waschen bei 65°C mit 2 X SSC; 0,1 % SDS.
Zu den Derivaten der erfindungsgemäßen isolierten DNA, welche gemäß Alternative f) durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrere Basen einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis e) erhalten werden können, gehören insbesondere solche Sequenzen, welche in dem Protein, welches sie kodieren, zu konservativen Amino- saureaustauschen, wie z. B. dem Austausch von Glycin gegen Alanin oder von Asparaginsaure gegen Glutaminsäure fuhren. Solche funktionsneutralen Mutationen werden als Sinnmutationen (sense mutations) bezeichnet und fuhren zu keiner grundsatzlichen Veränderung der Aktivität des Polypeptids. Weiterhin ist bekannt, dass Änderungen am N- und/oder C- Terminus eines Polypeptids dessen Funktion nicht wesentlich beeinträchtigen oder dieses sogar stabilisieren können, so dass dementsprechend auch DNA-Sequenzen, bei denen am 3'- Ende oder am 5' -Ende der Sequenz mit der SEQ. -ID-Nr. 03 Basen angefugt sind, von der vorliegenden Erfindung umfasst sind. Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Ben-Bassat et al . (Journal of Bacteriology 169:751-757
(1987)), bei O'Regan et al . (Gene 77:237-251 (1989)), bei Sahin-Toth et al . (Protein Sciences 3:240-247 (1994)), bei Hochuli et al . (Bio/Technology 6:1321-1325 (1988)) und in bekannten Lehrbuchern der Genetik und Molekularbiologie.
Zur Isolierung der erfindungsgemaßen DNA wurde zunächst aus einem Zellextrakt aus Metallosphaera sedula eine NADPH- anhangige Malonyl-Coenzym A-Reduktase isoliert und aufgereinigt. Bei dem so erhaltenen, aufgereinigten Enzym wurden die ersten 20 Aminosäuren des N-terminalen Endes des Polypeptides sequenziert. Im Genom von Sulfolobus tokodaii, welches bereits vollständig sequenziert worden ist (Kawara- bayasi et al . , „Complete genome sequence of an aerobic thermoacidophilic crenarchaeon, Sulfolobus tokodaii strainl." , DNA Research 8:123-40), wurde anschließend das Gen für die Malonyl-Coenzym A-Reduktase ermittelt, in dem diejenige abgeleitete Proteinsequenz identifiziert wurde, welche mit den ersten 20 Aminosäuren des aus Metallosphaera sedula isolierten Polypeptids identisch ist. Mittels geeig- neter Primer wurde dann die erfindungsgemaße DNA-Sequenz mittels PCR amplifiziert (siehe Beispiel 2). Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet weiterhin ein Vektor, vorzugsweise ein Expressionsvektor, umfassend eine DNA mit einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis f) , wie vorstehend definiert. Als Vektoren kommen alle dem Fachmann bekannten Vektoren in Betracht, die üblicherweise zum Einschleusen von DNA in eine Wirtzelle eingesetzt werden. Bevorzugte Vektoren sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Plasmide, wie etwa die E. coli- Plasmide pTrc99A, pBR345 und pBR322, Viren, wie etwa Bakteriophagen, Adenoviren, Vacciniaviren, Baculoviren, Masernviren und Retroviren, Cosmide oder YACs, wobei Plasmide als Vektoren am meisten bevorzugt sind.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Vektors liegt die DNA mit einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis f) unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors, welcher zur Expression des von diesen DNA- Sequenzen kodierten Polypeptids in der Zelle eines Mikroor- ganismus, vorzugsweise einer Bakterien-, Hefe- oder Pilzelle, besonders bevorzugt einer Bakterienzelle, am meisten bevorzugt einer E. Coli-Zelle, geeignet ist. Beispiele für solche Promotoren sind etwa der trp-Promotor oder der tac- Promotor .
Der erfindungsgemäße Vektor sollte neben einem Promotor vorzugsweise eine Ribosomenbindungsstelle sowie einen Terminator umfassen. Dabei ist es besonders bevorzugt, dass die erfindungsgemäße DNA in eine Expressionskassette des Vektors umfassend den Promotor, die Ribosomenbindungsstelle und den Terminator eingebaut ist. Neben den vorstehend genannten strukturellen Elementen kann der Vektor des Weiteren dem Fachmann bekannte Selektionsgene umfassen. Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leisten weiterhin die Verwendung des vorstehend beschriebenen Vektors zur Transformation einer Zelle sowie die durch Transformation mit diesem Vektor erhaltene Zelle. Die ZeI- len, welche mit dem erfindungsgemäßen Vektor transformiert werden können, können Prokaryonten oder Eukaryonten sein. Dabei kann es sich um Säugetierzellen (wie etwa Zellen aus dem Menschen) , um pflanzliche Zellen oder um Mikroorganismen wie Hefen, Pilze oder Bakterien handeln, wobei Mikroor- ganismen besonders bevorzugt und Bakterien und Hefen am meisten bevorzugt sind.
Einen Beitrag zur Lösung der eingangs genannten Aufgaben leistet auch ein Polypeptid, welches die Aminosäure-Sequenz mit der SEQ. -ID-Nr. 04 oder eine Aminosäuresequenz, die erhalten wird, wenn höchstens 40 Aminosäuren, vorzugsweise höchstens 20 Aminosäuren, darüber hinaus noch mehr bevorzugt höchstens 10 Aminosäuren und am meisten bevorzugt höchstens 5 Aminosäuren in der SEQ. -ID-Nr. 04 deletiert, insertiert, substituiert oder aber an das C- und/oder N- terminale Ende der Aminosäure-Sequenz mit der SEQ. -ID- Nr. 04 angefügt sind, aufweist. Bei dem Polypeptid handelt es sich um ein Enzym, welches sowohl die Umsetzung von (S) - oder (R) -Methylmalonyl-Coenzym A zur (S)- oder (R)- Methylmalonatsemialdehyd als auch die Umsetzung von MaIo- nyl-Coenzym A zu Malonatsemialdehyd zu katalysieren vermag. Ein solches Polypeptid kann beispielsweise auf synthetischem Weg, ausgehend von der DNA-Sequenz mit der SEQ. -ID- Nr. 03 oder durch Transformation einer geeigneten Zelle mit einem geeigneten Vektor umfassend diese Nukleinsäure-
Sequenz, Expression des von dieser Nukleinsäure-Sequenz kodierten Proteins in der Zelle, Lyse der Zelle unter Erhalt eines Zellextrakts und anschließende Aufreinigung des Enzyms mittels dem Fachmann bekannten Aufreinigungstechniken, beispielsweise mittels HPLC oder anderen chromatographischen Verfahren, erhalten werden. Neben einer chroma- tographischen Aufreinigung des Polypeptids aus Zellextrakten kann man sich auch den Vorteil zu Nutze machen, dass das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ. -ID-Nr. 04 bis zu einer Temperatur von mindestens 75°C hitzestabil ist. Daher kann man den Zellextrakt auf eine Temperatur von beispielsweise 75°C erhitzen, wodurch es zur Koagulation und somit zum Ausfällen der nicht-hitzestabilen Polypeptide im Zellextrakt kommt. Das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ. -ID-Nr. 04 verbleibt in nicht-denaturierter Form im Zellextrakt.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand nicht limitierender Figuren und Beispiele näher erläutert.
Es zeigt die Figur 1 die durch das Enzym Ei katalysierte Umsetzung von Succinyl-Coenzym A zu Methylmalonyl- Coenzym A.
Es zeigt die Figur 2 die durch die Enzyme E2 bis E4 kataly- sierte Umsetzung von Methylmalonyl-Coenzym A zu 3-
Hydroxyisobuttrsäure gemäß der ersten Alternative der erfindungsgemäßen Zelle, bei der Succinyl-Coenzym A als Zwischenprodukt und Methylmalonat-Semialdehyd als Vorprodukt bei der Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoa- ten gebildet werden.
Es zeigt die Figur 3 die durch die Enzyme E4, E6 und E7 katalysierte Umsetzung von (R) -Methylmalonyl-Coenzym A zu 3- Hydroxyisobuttrsäure gemäß der zweiten Alternative der erfindungsgemäßen Zelle, bei der Succinyl-Coenzym A als Zwischenprodukt und Methylmalonat-Semialdehyd als Vorprodukt bei der Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoa- ten gebildet werden.
Es zeigt die Figur 4 die durch die Enzyme E4, E5 und E7 ka- talysierte Umsetzung von Methylmalonyl-Coenzym A zu 3-
Hydroxyisobuttrsäure gemäß der dritten Alternative der erfindungsgemäßen Zelle, bei der Succinyl-Coenzym A als Zwischenprodukt und Methylmalonat-Semialdehyd als Vorprodukt bei der Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoa- ten gebildet werden.
Es zeigt die Figur 5 die durch die Enzyme E8 und E9 katalysierte Umsetzung von 3-Hydroxyisobuttrsäure zu einem PoIy- hydroxyalkanoat .
Es zeigt die Figur 6 die durch die Enzyme Ei0 oder En katalysierte Umsetzung von Phosphoenolpyruvat bzw. Pyruvat zu Oxalacetat gemäß einer besonderen Ausgestaltung der ersten, zweiten oder dritten Alternative der erfindungsgemäßen Zelle, bei der Succinyl-Coenzym A als Zwischenprodukt und Methylmalonat-Semialdehyd als Vorprodukt bei der Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3- Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten ge- bildet werden.
Es zeigt die Figur 7 die durch die Enzyme E12 bis Ei5 katalysierte Umsetzung von Oxalacetat zu Succinyl-Coenzym A gemäß einer ersten besonderen Ausgestaltung der ersten, zwei- ten oder dritten Alternative der erfindungsgemäßen Zelle, bei der Succinyl-Coenzym A als Zwischenprodukt und Methylmalonat-Semialdehyd als Vorprodukt bei der Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3- Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten gebildet werden.
Es zeigt die Figur 8 die durch die Enzyme E13 bis E16 und E24 bis E26 katalysierte Umsetzung von Oxalacetat zu Succinyl- Coenzym A gemäß einer zweiten besonderen Ausgestaltung der ersten, zweiten oder dritten Alternative der erfindungsgemäßen Zelle, bei der Succinyl-Coenzym A als Zwischenprodukt und Methylmalonat-Semialdehyd als Vorprodukt bei der Her- Stellung von 3-Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-
Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten gebildet werden.
Es zeigt die Figur 9 die durch die Enzyme E16, E24, E27 und E28 katalysierte Umsetzung von Oxalacetat zu Succinyl- Coenzym A gemäß einer dritten besonderen Ausgestaltung der ersten, zweiten oder dritten Alternative der erfindungsgemäßen Zelle, bei der Succinyl-Coenzym A als Zwischenprodukt und Methylmalonat-Semialdehyd als Vorprodukt bei der Her- Stellung von 3-Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-
Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten gebildet werden.
Es zeigt die Figur 10 die durch die Enzyme E46 und E28 kata- lysierte Umsetzung von L-Glutamat zu Succinyl-Coenzym A gemäß einer weiteren besonderen Ausgestaltung der ersten, zweiten oder dritten Alternative der erfindungsgemäßen Zelle, bei der Succinyl-Coenzym A als Zwischenprodukt und Methylmalonat-Semialdehyd als Vorprodukt bei der Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-
Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten gebildet werden. Es zeigt die Figur 11 die durch die Enzyme E4, E5 und E47 bis E52 katalysierte Umsetzung von Acetyl-Coenzym A zu 3- Hydroxyisobuttersäure gemäß einer ersten Alternative der zweiten besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zelle der erfindungsgemäßen Zelle, bei der Propionyl- Coenzym A als Zwischenprodukt und Methylmalonat-Semialdehyd als Vorprodukt bei der Herstellung von 3-
Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten gebildet werden.
Es zeigt die Figur 12 die durch die Enzyme E2 bis E4, E6, E7 und E47 bis E52 katalysierte Umsetzung von Propionyl- Coenzym A zu 3-Hydroxyisobuttersäure gemäß einer zweiten Alternative der zweiten besonderen Ausführungsform der er- findungsgemäßen Zelle, bei der Propionyl-Coenzym A als Zwischenprodukt und Methylmalonat-Semialdehyd als Vorprodukt bei der Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten gebildet werden.
Es zeigt die Figur 13 die durch die Enzyme E2 bis E4, E7 und E47 bis E52 katalysierte Umsetzung von Propionyl-Coenzym A zu 3-Hydroxyisobuttersäure gemäß einer dritten Alternative der zweiten besonderen Ausführungsform der erfindungsgemä- ßen Zelle, bei der Propionyl-Coenzym A als Zwischenprodukt und Methylmalonat-Semialdehyd als Vorprodukt bei der Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3- Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten gebildet werden.
Es zeigt die Figur 14 die durch die Enzyme E2 bis E4, E7 und E47 bis E52 katalysierte Umsetzung von Propionyl-Coenzym A zu 3-Hydroxyisobuttersäure gemäß einer vierten fünften Alternative der zweiten besonderen Ausführungsform der erfin- dungsgemäßen Zelle, bei der Propionyl-Coenzym A als Zwi- schenprodukt und Methylmalonat-Semialdehyd als Vorprodukt bei der Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoa- ten gebildet werden.
Es zeigt die Figur 15 die durch die Enzyme Eio bis E12, E56, E72 und E73 katalysierte Umsetzung von Beta-Alanin zu 3- Hydroxyisobuttersäure gemäß einer dritten besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zelle, bei der Acrylyl- Coenzym A als Zwischenprodukt und Methylmalonat-Semialdehyd als Vorprodukt bei der Herstellung von 3-
Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten gebildet werden.
Es zeigt die Figur 16 die durch die Enzyme E76 bis E79, E60, E6i und E8 katalysierte Umsetzung von Pyruvat zu 3- Hydroxyisobuttersäure gemäß einer ersten Alternative der ersten besonderen Ausführungsform der zweiten Variante der erfindungsgemäßen Zelle, bei der Isobutyryl-Coenzym A als Zwischenprodukt und 3-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A als Vorprodukt bei der Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure o- der von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten gebildet werden.
Es zeigt die Figur 17 die durch die Enzyme E8, E60, E6x, E79 und E8o katalysierte Umsetzung von L-Valin zu 3- Hydroxyisobuttersäure gemäß einer zweiten Alternative der ersten besonderen Ausführungsform der zweiten Variante der erfindungsgemäßen Zelle, bei der Isobutyryl-Coenzym A als Zwischenprodukt und 3-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A als Vorprodukt bei der Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure o- der von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten gebildet werden. Beispiele Beispiel 1
Die vorliegende Erfindung wird nun im Beispiel 1 anhand einer rekombinanten Zelle veranschaulicht, die 3- Hydroxyisobuttersäure über 3-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A als Vorprodukt und Isobutyryl-Coenzym A als Zwischenprodukt ausgehend von L-Valin als Kohlenstoffquelle herzustellen vermag. Dazu wurden in E. coli BL21 (DE3) die Enzyme EC 2.6.1.42 und EC 1.2.4.4 (jeweils aus Pseudomonas aeruginosa) sowie ein Cluster umfassend die drei Enzyme EC 1.3.99.12, EC 4.2.1.17 und EC 3.1.2.4 (aus Acinetobacter calcoaceticus) überexprimiert .
Das Enzym EC 1.2.4.4 wird dabei von einem Gen mit der DNA- Sequenz gemäß SEQ. -ID-Nr. 07 und 08 (GC- und ß-Untereinheit) kodiert, während das Enzym EC 2.6.1.42 von einem Gen mit der DNA-Sequenz gemäß SEQ. -ID-Nr. 09 kodiert wird. Das Enzym EC 1.3.99.12 wird von einem Gen mit der DNA-Sequenz mit der SEQ. -ID-Nr. 10 kodiert, das Enzym EC 4.2.1.17 von einem Gen mit der DNA-Sequenz gemäß SEQ. -ID-Nr. 11 und das Enzym EC 3.1.2.4 von einem Gen mit der DNA-Sequenz gemäß SEQ. -ID- Nr. 12.
1. Organismen, Plasmide und Oligonucleotide
Zur Herstellung dieser rekombinanten Zelle wurden folgende Bakterienstämme, Vektoren, genomische DNA und O- ligonucleotide verwendet:
Tab. 1: Verwendete Bakterienstämme
Referenz (Her¬
Stamm steller)
E. coli DH5 NEB E. coli BL21 Invitrogen
Figure imgf000100_0001
Tab. 2: Verwendete Vektoren
Referenz (Her¬
Vektor steller) pCDFDuet-1 Novagen pET101/D-TOPO Invitrogen pCR2.1-TOPO Invitrogen
Tab. 3: Verwendete genomische DNA
Stamm
Pseudomonas aeruginosa PAOl
Acinetobacter calcoaceticus ADPl
Tab. 4: Verwendete Oligonucleotide
Name Sequenz
A- 5 ' -ATGCAATTTAATGAAGAACAGCTATTAATTC-3 ' ca VClus fW (SEQ. -ID-Nr. 13)
A-
5' -CAGTCTGAAATGACTAACCTAATTGGC-3' ca VClus_re (SEQ. -ID-Nr. 14)
V
Pae 26142 f 5 ' -ACGGAATTCTGAAGGAGCTGGCAACTATG-3 '
W (SEQ. -ID-Nr. 15)
Pae 26142 r 5' -TTGTCGACTTACTTGACCAGGGTACGCC-3' ev (SEQ. -ID-Nr. 16)
5 ' -ACAGATCTGGAGGCCTGTCATGAGTGATTAC-3 '
Pae 1244 fW (SEQ. -ID-Nr. 17) Pae 1244 re 5'-ATGGGTACCCATTCAGACCTCCATC-S' v (SEQ. -ID-Nr. 18)
2. Amplifikation der PCR-Fragmente 1.2.4.4 (2.313 kb) und 2.6.1.42 (958 bp)
Zunächst wurden die Fragmente der 1.2.4.4 und 2.6.1.42 mittels der in der Tabelle 4 angegebenen Primern gemäß SEQ. -ID-Nr. 15 bis SEQ. -ID-Nr. 18 ausgehend von der Ge- samt-DNA aus Pseudomonas aeruginosa mittels PCR ampli- fiziert .
3. Verdau des Vektors pCDF-Duet-1 und des PCR-Fragmentes 2.6.1.42 (958 bp)
Der Vektor pCDFDuet-1 (aufweisend eine Streptomy- cin/Spectinomycin-Resistenz) wird, ebenso wie das PCR- Fragment 2.6.1.42, mittels EcoRI/Sali geschnitten und die so erhaltenen Restriktionen mit T4-Ligase über
Nacht ligiert. Es wird der Vektor pCDFDuet : : 2.6.1.42 erhalten .
4. Klonierung der PCR-Fragmente in den Vektor pCR2.1-TOPO
Die Herstellung eines Klonierungsvektors umfassend das Fragment 2.6.1.42 bzw. das Fragment 1.2.4.4 unter Einsatz der Vektors pCR2.1-TOPO erfolgte gemäß den Angaben des Herstellers. Mit den auf diese Weise erhaltenen Klonierungsvektoren pCR2.1-TOPO: : 1.2.4.4 und pCR2.1- TOPO: :2.6.1.42 wurden E. coli DH5α-Zellen transfor- miert. Da die Vektoren pCR2.1-TOPO eine Kanamycin- und eine Ampicillin-Resistenz aufweisen, wurde auf 2 AXI- und KXI-Platten ausplattiert (20 und 40 μl) . Die Plasmide der erhaltenen Klone wurden isoliert und verdaut:
pCR2.1-TOPO: : 1.2.4.4 BgIII + Kpnl Fragmentgröße 2313 bp pCR2.1-TOPO: :2.6.1.42 EcoRI + Sali Fragmentgroße 958 bp
Die Fragmente wurden jeweils aus dem Gel eluiert und mit dem Qiagen-Kit QIAquick (nach Anleitung) aufgereinigt .
5. Herstellung des Vektors pCDFDuet : 2.6.1.42-1.2.4.4
Der Vektor pCDFDuet : : 2.6.1.42 sowie der Vektor pCR2.1- TOPO: : 1.2.4.4 werden mit BgIII/Kpnl verdaut. Anschließend erfolgt die Ligation von pCDFDuet : : 2.6.1.42 (BgI- 11/Kpnl) mit pCR2.1-TOPO: : 1.2.4.4 unter Erhalt des Vektors pCDFDuet : :2.6.1.42-1.2.4.4. Mittels dieses Klonie- rungsvektors wurden wiederum E. coli DH5θC-Zellen trans- formiert. Die Plasmide wurden isoliert. Das Plasmid pCDFDuet : :2.6.1.42-1.2.4.4 weist die DNA-Sequenz gemäß SEQ. -ID-Nr. 19 auf.
6. Klonierung des Valin-Clusters aus Acinetobacter calcoa- ceticus (V-ClusAca) Der Stamm ATCC 33304 Acinetobacter calcoaceticus wurde für eine Isolierung von Gesamt-DNA kultiviert (HH Agar bzw. Medium). Die Isolierung von Gesamt-DNA erfolgte mit dem Kit DNEasy von Qiagen (Ll und L2) und durch ein Verfahren umfassend die Verfahrensschritte i) Zentrifu- gation von 1 mL Kultur, ii) Zugabe von 200 μL H2O zum
Pellet, iii) Erhitzen für 10 min auf 95 0C, iv) Zentri- fugation (10 min, 13.000 rpm) sowie v) Abnehmen des U- berstandes für eine PCR.
Zur Amplifikation des Valin-Clusters aus A. calcoaceti- cus wurde eine PCR unter Verwendung der in der Tabelle 4 angegebenen Primer gemäß SEQ. -ID-Nr. 13 und SEQ. -ID- Nr. 14 durchgeführt (nach Anleitung des Herstellers mit den Polymerasen Pfu bzw. Tag) . Die PCR-Produkte wurden aufgereinigt und nach Anleitung zum Plasmid pET101/D-TOPO ligiert sowie in E. coli DH50C gebracht. Es wird das Plasmid pET101/D-TOPO: :V- ClusterAca erhalten. Das Plasmid pET101/D-TOPO: :V- ClusterAca weist die DNA-Sequenz gemäß SEQ. -ID-Nr. 20 auf .
7. Herstellung einer rekombinanten Zelle, die 3-
Hydroxyisobuttersäure aus L-Valin zu bilden vermag
E. coli BL21 (DE3) wurde mit den Plasmiden pET101/D- TOPO: :V-ClusterAca und pCDF-Duet : : 2.6.1.42-1.2.4.4 transformiert (ausplattiert auf LB-Spec. /Amp-Medium) . Die so erhaltenen Zellen waren in der Lage, in einem Nährmedium beinhaltend L-Valin das L-Valin zu 3- Hydroxyisobuttersäure umzusetzen. Der Wildtyp der Zellen (E. coli BL21 (DE3) ) konnte hingegen in einem derartigen Nährmedium keine nachweisbaren Mengen an 3- Hydroxyisobuttersäure bilden.
Beispiel 2
In diesem Beispiel wird die erfindungsgemäße DNA isoliert und das Gen in E. coli überexprimiert .
1. Züchtung und Ernte von Sulfolobus tokodaii
Sulfolobus tokodaii wurde in kleinen Kulturvolumen (40- 200 ml) bei 75°C und einem pH-Wert von 3,0 unter Schütteln (150 rpm) angezogen. Das Wachstum wurde photomet- risch über die Messung der optischen Dichte bei 578 nm (OD578 nm) verfolgt. Es wurde ein modifiziertes Sulfolo- jbus-Medium verwendet (modifiziert nach Brock et al., Archives of Microbiology 84, Seiten 54-68, 1972; Suzuki et al., Extremophiles, 6, Seiten 39-44, 2002). Als E- nergie- und Kohlenstoffquelle dienten Hefeextrakt, Ca- saminosäuren und Glucose. Das Medium bestand aus folgenden Komponenten: Grundmedium, Glucosestammlösung, Eisenstammlösung und Spurenelementestammlösung. Bei einer OD578nm von 0,3-0,5 (exponentie1Ie Phase) wurden die Zellen geerntet. Die Zentrifugation erfolgte in einer Sorvall-Zentrifuge (SS34-Rotor) für 15 min bei 9.000 rpm. Der Zellniederschlag wurde direkt für die DNA-Extraktion eingesetzt.
Grundmedium. KH2PO4 (0,28 g/l), (NH4) 2SO4 (1,3 g/l), MgSO4 x 7 H2O (0,25 g/l), CaCl2 X 6 H2O (0,07 g/l), Hefeextrakt (1 g/l) und Casaminosäuren (1 g/l). Der pH-Wert wurde mit H2SO4 vor dem Autoklavieren auf
3, 0 eingestellt .
Glucosestammlösung (lOOfach). Glucose (100 g/l). Die Lösung wurde sterilfiltriert.
Eisenstammlösung (1000fach) . FeCl3 X 6 H2O (20 g/l). Die Lösung wurde sterilfiltriert.
Spurenelementestammlösung (1000fach) . MnCl2 X 4 H2O (1,8 g/l), Na2B4O7 X 10 H2O (4,5 g/l), ZnSO4 X 7 H2O
(220 mg/1), CuCl2 X 2 H2O (50 mg/1), Na2MoO4 X 2 H2O (30 mg/1), VOSO4 X 5 H2O (30 mg/1), CoCl2 X 6 H2O (8,4 mg/1) . Die einzelnen Komponenten wurden nacheinander in H2Odest gelöst, der pH-Wert mit HCl auf 3,0 eingestellt und die Lösung sterilfiltriert.
2. Isolierung von genomischer DNA aus S. tokodaii Die Isolierung von genomischer DNA wurde nach der Methode von Murray und Thompson (Nucleic Acid Research, 8, Seiten 4.321-4.325, 1980) durchgeführt. Hierzu wurden 10-50 mg (Feuchtgewicht) frisch geerntete Zellen in ein 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefaß eingewogen und in
570 ml TE-Puffer (10 mM Tris/HCl (pH 8,0), 1 mM NaEDTA) resuspendiert. Es wurden 30 μl einer 10% (w/v) SDS- Losung (Natriumdodecylsulfat-Losung) und 3 μl Proteinase K (20 μg/μl) zugesetzt und 1 h bei 52°C inkubiert. Danach wurden 100 μl 5 M NaCl-Losung und 80 μl vorgewärmte 10% (w/v) Cetyltrimethyl-ammoniumbromid (CTAB)- Losung (10% (w/v) CTAB in 0,7 M NaCl) zugegeben. Nach 10 min Inkubation bei 65°C wurden die Komplexe aus CTAB, Zellwandfragmenten und Proteinen mit 780 μl ChIo- roform/iso-Amylalkohol (24 : 1 (v/v) ) extrahiert und
15 min bei 14.000 rpm abzentrifugiert . Die obere wass- rige Phase wurde in ein neues Eppendorf-Reaktionsgefaß überfuhrt und die Extraktion wiederholt. Nachdem die wassrige Phase frei war von Pigmenten, wurde sie mit 400 μl 100 % Isopropanol uberschichtet . Durch vorsichtiges Mischen beider Phasen präzipitierte die chromosomale DNA an der Grenzschicht. Die DNA konnte mit einer ausgezogenen Pasteurpipette geangelt und in 200 μl 70 % Ethanol gewaschen werden. Nach erneuter Zentrifugation (5 min, 14.000 rpm) wurde der Überstand abgezogen, die DNA 2 h bei Raumtemperatur getrocknet und schließlich in 100 μl TE-Puffer gelost.
3. Amplifizierung des Gens für die Malonyl-Coenzym A- Reduktase
Die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) (Mullis et al., CoId Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51, Seiten 263- 273, 1986) wurde eingesetzt, um ausgehend von der im Beispiel 2 erhaltenen genomischen DNA von Sulfolobus tokodaii das Gen für die Malonyl-CoA-Reduktase gezielt zu amplifizieren . Sie wurde in einem Thermocycler (Biometra, Göttingen) durchgeführt.
Zur Anwendung gelangte eine präparative PCR, bei der
Pfu-Polymerase (Pfunds, Genaxxon) verwendet wurde. Die Pfu-Polymerase enthält eine 3 '-5' Exonuklease („proofreading") Funktion.
Folgende Primer wurden verwendet:
5' -ATTATCCCATGGGGAGAACATTAAAAGC-S' („forward primer"; Λfcol-Schnittstelle ist unterstrichen; Seq. -ID-Nr. 21) und
5' -CGGGATCCTTACTTTTCAATATATCC-S' („reverse primer"; BamHI-Schnittstelle ist unterstrichen; Seq. -ID-Nr. 22)
Für die PCR-Reaktionen wurde der in der nachfolgenden
Tabelle 1 angegebene Reaktionsansatz verwendet. Die PCR wurde als Hot-Start-PCR durchgeführt, d.h. der Reaktionsansatz wurde vor der Zugabe der Pfu-Polymerase 2 min bei 95°C inkubiert. Anschließend folgten 30 Zyklen mit jeweils 1 Minute bei 95°C, 1 Minute bei 45°C und
5 Minuten bei 72°C, gefolgt von einem letzten Schritt mit 30 Sekunden bei 45°C, 15 Minuten bei 72°C und schließlich einer Pause bei 6°C.
Tabelle 1 : Standardreaktionsansatz (50 μl) für
Proofreading-PCR mit Pfu-Polymerase
Zusammensetzung μl/50 μl-Ansatz
Figure imgf000107_0001
Es wurde ein Gen-Fragment mit einer Lange von 1,1 kb erhalten .
Klonierung des Gens für die Malonyl-Coenzym A-Reduktase
Zur Klonierung des Malonyl-Coenzym A-Reduktase-Gens aus Sulfolobus tokodaii wurde das im Beispiel 3 amplifi- zierte Gen unspezifisch mit dem
„pCR T7 Topo TA Expression Kit" (Invitrogen, Karlsruhe) in den Vektor pCR T7/CT-Topo (Invitrogen, Karlsruhe) kloniert. Die Durchfuhrung erfolgte laut den Angaben des Herstellers.
Zur Isolierung der Plasmid-DNA wurde aus 5 ml Uber- nacht-Kulturen von transformierten E. coli TOP10FS- Zellen die Plasmid-DNA mit dem „QIAprep Spin Plasmid Miniprep Kit" von Qiagen (Hilden) nach Anleitung des Herstellers präpariert.
Herstellung eines Expressionsvektors Zur Herstellung eines Expressionsvektors umfassend das Malonyl-Coenzym A-Reduktase-Gen wird der im Beispiel 4 erhaltene, isolierte Klonierungsvektor einem Restrikti- onsverdau mit den Restriktionsenzymen NcoI und BamRI unterzogen. Dazu werden 25-27 μl Plasmid-DNA (Expressionsvektor pTrc99A bzw. pCR T7/CT-Topo Vektor mit dem eingebauten Gen der Malonyl-Coenzym A-Reduktase) mit 5 μl lOfach konzentriertem Reaktionspuffer und 2-3 μl Restriktionsenzym (10 U/μl; Fermentas, St. Leon-Rot) gut gemischt. Der Reaktionsansatz wurde mit H2θdest auf 50 μl aufgefüllt und bei der vom Hersteller angegebenen Temperatur für 5 h inkubiert. Vor der weiteren Verwendung wurde eine Ethanolfallung durchgeführt. Dazu wurde die DNA mit 3 Volumeneinheiten 100% Ethanol und 0,1 Volumeneinheiten 3 M Natrium-Acetat-Puffer (pH 5,3) gemischt und 2 h oder über Nacht bei -800C inkubiert. Nach einem Zentrifugationsschritt (20 min, 14.000 rpm, 40C, Eppendorf Tischzentrifuge) wurde der Überstand vorsichtig abgenommen und die DNA mit
3 Volumeneinheiten 70% (v/v) Ethanol gewaschen. Nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur wurde erneut zentrifugiert (10 min, 14.000 rpm, 4°C, Eppendorf Tischzentrifuge) und der Überstand verworfen. Die DNA wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur getrocknet und anschließend im gewünschten Volumen H2O oder TE-Puffer (10 mM Tris/HCl (pH 8,0), 1 mM NaEDTA) aufgenommen.
Anschließend wird alkalische Phosphatase verwendet, um die 5 ' -Phosphatgruppen des linearisierten doppelstran- gigen Vektors zu entfernen. Auf diese Weise wird die Klonierungseffizienz gesteigert, da eine Religation des Vektors verhindert wird. Es wurde alkalische Phosphatase aus Kalberdarm zur Dephosphorylierung des verdauten Vektors verwendet. Die Dephosphorylierung wurde im gleichen Puffer wie der Restriktionsverdau durchgeführt. 50 μl Restriktionsansatz wurden mit 1,5 μl CIAP (CaIf Intestine Alkaline Phosphatase) (lU/μl; Fermentas, St. Leon-Rot) gemischt und 30 min bei 370C inkubiert. Vor der weiteren Verwendung des geschnittenen und dephosphorylierten Vektors wurde eine Ethanolfällung, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt .
Die Ligation der Insert-DNA mit dem Expressionsvektor wird die T4 DNA-Ligase verwendet, wobei Plasmid-DNA und Insert-DNA in einem molaren Verhältnis von 1:3 - 1:6 eingesetzt wurden.
Stammlösungen :
Ligationspuffer (lOfach): 0,5 M Tris/HCl, pH 7,6
100 mM MgCl2 0,5 mg/ml BSA sterilfiltrieren, Lagerung bei Raumtemperatur.
5 mM ATP (Adenosintriphosphat) immer frisch ansetzten in sterilem H2θdest
50 mM DTE (Dithioerythritol) immer frisch ansetzten in Ligationspuffer
Die Ligationsansätze hatten ein Volumen von 50 μl . Plasmid-DNA (2-10 μl), Insert-DNA (2-20μl), 5 μl Ligationspuffer mit DTE (50 mM) und die entsprechende Menge steriles H2θdest wurden zusammenpipettiert, gevortext, kurz abzentrifugiert und anschließend 5 min bei 45°C inkubiert. Der Ansatz wurde auf Eis abgekühlt. Es wurden 5 μl 5 mM ATP und 1,5 μl T4 DNA-Ligase (1 U/μl; Fermentas; St. Leon-Rot) hinzugegeben und der Ansatz gemischt. Die Ligation erfolgte über Nacht bei 16°C.
Der Ligationsansatz wurde direkt zur Transformation chemisch-kompetenter Zellen eingesetzt.
Transformation von E. Coli-Zellen mit dem Expressions- vektor
Ausgehend von einer Einzelkolonie von E. coli Rosetta 2-Zellen wurde eine 5 ml Ubernachtkultur angezogen. Mit 0,5-1,0 ml dieser Kultur wurden am nächsten Morgen
50 ml LB-Medium (Sambrook et al . , „Molecular Cloning: A Laboratory Manual" , CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, New York, 1989) beimpft. Nach 1,5-2 h Inkubation (37°C, Schuttein (180 UpM)) wurde eine OD578nIn von 0,6 erreicht. Die Zellen wurden 10 min auf Eis abgekühlt und anschließend 5 min bei 5000 UpM und 4°C (GSA-Rotor, Sorvall-Zentrifuge) abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und der Zellniederschlag in 2,7 ml kalter 0,1 M CaCl2-Losung resuspendiert. Nach Zugabe von 2,3 ml sterilem 50%
(v/v) Glycerin wurde die Zellsuspension in Portionen (je 300 μl) in 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefaße verteilt. Die kompetenten Zellen wurden sofort in flussigem Stickstoff eingefroren und anschließend bei -800C gelagert.
Zur Transformation der Zellen wurde ein Aliquot der chemisch-kompetenten Zellen (300 μl) auf Eis aufgetaut und mit 25 μl eines Ligationsansatzes versetzt. Der An- satz wurde vorsichtig gemischt und für 30 min auf Eis inkubiert. Nach einem Hitzeschock (42°C, 1 min) wurde nochmals 5 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden 800 μl LB-Medium (Sambrook et al . , 1989) zugegeben und die Zellen 1 h bei 37°C geschüttelt (Thermomixer, Ep- pendorf 5436) . Vor dem Ausstreichen des Ansatzes auf LB-Medium wurde der Ansatz noch aufkonzentriert . Dazu wurde 1 min bei 10.000 rpm abzentrifugiert, vom Überstand 750 μl verworfen und der Zellniederschlag re- suspendiert. Von diesem konzentrierten Ansatz wurden 50 μl, 100 μl und 200 μl auf LB-Platten (Sambrook et al . , 1989) mit 100 μg/ml Ampilcillin ausgestrichen und über Nacht bei 370C im Brutschrank inkubiert. Die Platten wurden mit 1 ml LB-Medium abgespult. Mit dieser Zellsuspension wurden anschließend 150 ml LB-Medium (mit 100 μg/ml Ampilcillin) in 500 ml Erlenmeyer- Schikanekolben beimpft. Die Kulturen wuchsen bei 370C und 180 UpM. Die Uberexpression erfolgte durch Induktion des Promotors in pTrc99A durch Zugabe von 0,5 M IPTG (Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) bei einer OD578nIn von 0,6. Die induzierten Kulturen wurden 3 h unter den genannten Bedingungen inkubiert und anschließend bei einer
Figure imgf000111_0001
2,7 geerntet.
Nachweis der Enzymaktivitat
Der im Beispiel 6 erhaltene E. coli-Stamm wurde mittels Zellmuhle aufgeschlossen. Der ZellaufSchluss wurde 15 min lang auf 85°C erhitzt. Bei dieser Hitzefallung koagulieren nicht-hitzestabile Enzyme und werden ge- fallt. Da das Zielprotein hitze-stabil ist, bleibt es im Überstand enthalten. Zur Messung der Malonyl- Coenzym A-Reduktaseaktivitat wurde der Überstand im Verhältnis 1 : 50 in TM-Puffer (50 mM Tris/Cl, 1 mM MgCl2, pH 8,1) verdünnt. Zu 500 μl HIPS-Puffer (100 mM HEPES/NaOH, 5 mM MgCl2, 1 mM Dithioerythritol, der 0.5 mM NADPH enthielt, wurden 30 μl des verdünnten bzw. unverdünnten (für Nachweise der Methylmalonyl- Coenzym A-Reduktaseaktivitat) Uberstands pipetiert.
In einem ersten Ansatz wurde die Reaktion durch Zugabe von Malonyl-Coenzym A gestartet, wobei die Endkonzentration 0.5 mM betrug. Die Abnahme der NADPH-Absorption bei 365 nm wurde ermittelt. Die ermittelte Enzymaktivi- tat betrug 15,5 μmol/min/mg Protein (15,5 U/mg).
In einem zweiten Ansatz wurde die Reaktion durch Zugabe von Methylmalonyl-Coenzym A gestartet (Firma Fluka,
Art. -Nr.: 67767), wobei die Endkonzentration 2.0 mM betrug. Die Abnahme der NADPH-Absorption wurde ermittelt. Die ermittelte Enzymaktivitat betrug 0,24 μmol/min/mg Protein (0,24 U/mg) . Diesen Ergebnissen ist zu entnehmen, dass das Polypeptid, für welches die DNA-Sequenz mit der SEQ. -ID-Nr. 03 kodiert, sowohl die Umsetzung von Malonyl-CoA als auch Methylmalonyl-Coenzym A katalysiert.
Pro eingesetztes Mol Malonyl-CoA bzw. Methylmalonyl-CoA wurde 1 Mol NADPH oxidiert. Daraus lasst sich schließen, dass die Enzymreaktion zum entsprechenden Semial- dehyd fuhrt .

Claims

Patentansprüche
1. Eine Zelle, welche gegenüber ihrem Wildtyp derart gentechnisch verändert wurde, dass sie im Vergleich zu ih- rem Wildtyp mehr 3-Hydroxyisobuttersäure oder auf 3- Hydroxyisobuttersäure basierende Polyhydroxyalkanoate zu bilden vermag.
2. Die Zelle nach Anspruch 1, wobei die Bildung von 3- Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-
Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten über Methylmalonat-Semialdehyd als Vorprodukt erfolgt.
3. Die Zelle nach Anspruch 2, wobei die Zelle 3- Hydroxyisobuttersäure oder auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierende Polyhydroxyalkanoate über Succinyl-Coenzym A als Zwischenprodukt zu bilden vermag.
4. Die Zelle nach Anspruch 3, wobei die Zelle eine im Ver- gleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität eines Enzyms Ei aufweist, welches die Umsetzung von Succinyl- Coenzym A zu Methylmalonyl-Coenzym A katalysiert.
5. Die Zelle nach Anspruch 4, wobei das Enzym Ei eine Me- thylmalonyl-Coenzym A-Mutase (EC 5.4.99.2) ist.
6. Die Zelle nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme E2 bis E4 aufweist: eines Enzyms E2, welches die Umsetzung von Methylmalonyl-Coenzym A zu Methylmalonat katalysiert; eines Enzyms E3, welches die Umsetzung von Methyl- malonat zu Methylmalonatsemialdehyd katalysiert; eines Enzyms E4, welches die Umsetzung von Methyl- malonat-semialdehyd zu 3-Hydroxyisobutyrat kataly- siert.
7. Die Zelle nach Anspruch 6, wobei das Enzym
E2 eine Methylmalonyl-Coenzym A-Hydrolase (EC 3.2.1.17) , E3 eine Aldehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.3) oder eine Aldehyd-Oxidase (EC 1.2.3.1) und
E4 eine 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase
(EC 1.1.1.31) oder eine 3-Hydroxyacyl-Coenzym A- Dehydrogenase (EC 1.1.1.35) ist.
8. Die Zelle nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme E4, E5, E4 und E7 aufweist: eines Enzyms E6, welches die Umsetzung von (R) - Methylmalonyl-Coenzym A zu (S) -Methylmalonyl- Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E7, welches die Umsetzung von (S)- Methylmalonyl-Coenzym A zu Propionyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E5, welches die Umsetzung von Propionyl-Coenzym A zu Methylmalonatsemialdehyd katalysiert; - eines Enzyms E4, welches die Umsetzung von Methylmalonatsemialdehyd zu 3-Hydroxyisobuttersäure katalysiert .
9. Die Zelle nach Anspruch 8, wobei das Enzym
E6 eine Methylmalonyl-Coenzym A-Epimerase (EC 5.1.99.1) , E7 eine Methylmalonyl-Coenzym A-Decarboxylase (EC 4.1.1.41) ,
E5 eine Methylmalonatsemialdehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.27) , und
E4 eine 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.31) oder eine 3-Hydroxyacyl-Coenzym A-
Dehydrogenase (EC 1.1.1.35) ist .
10. Die Zelle nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte
Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme E4, E5 und E7 aufweist: eines Enzyms E7, welches die Umsetzung von Methylmalonyl-Coenzym A zu Propionyl-Coenzym A kataly- siert; eines Enzyms E5, welches die Umsetzung von Propionyl-Coenzym A zu Methylmalonatsemialdehyd katalysiert; eines Enzyms E4, welches die Umsetzung von Methyl- malonatsemialdehyd zu 3-Hydroxyisobuttersäure katalysiert .
11. Die Zelle nach Anspruch 10, wobei das Enzym
E7 eine Methylmalonyl-Coenzym A-Decarboxylase (EC 4.1.1.41) ,
E5 eine Methylmalonatsemialdehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.27) , und E4 eine 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase
(EC 1.1.1.31) oder eine 3-Hydroxyacyl-Coenzym A- Dehydrogenase (EC 1.1.1.35) ist .
12. Die Zelle nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme E28 und E46 aufweist: - eines Enzyms E46, welches die Umsetzung von L- Glutamat zu 2-Oxoglutarat katalysiert; eines Enzyms E2S, welches die Umsetzung von 2- Oxoglutarat zu Succinyl-Coenzym A katalysiert.
13. Die Zelle nach Anspruch 12, wobei das Enzym
E46 eine Glutamat-Synthase (EC 1.4.1.13 oder EC 1.4.1.14), eine Glutamat-Dehydrogenase (EC 1.4.1.2, EC 1.4.1.3 oder EC 1.4.1.4) oder eine Aspartat-Transaminase (EC 2.6.1.1 oder EC 2.6.1.2) und
E28 eine 2-Oxoglutarat-Synthase (EC 1.2.7.3) ist .
14. Die Zelle nach Anspruch 2, wobei die Zelle 3- Hydroxyisobuttersäure oder auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierende Polyhydroxyalkanoate über Propionyl- Coenzym A als Zwischenprodukt zu bilden vermag.
15. Die Zelle nach Anspruch 14, wobei die die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme E4, E5 und E47 bis E52 aufweist : eines Enzyms E47, welches die Umsetzung von Acetyl- Coenzym A zu Malonyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E48, welches die Umsetzung von Malonyl-Coenzym A zu Malonatsemialdehyd katalysiert; - eines Enzyms E49, welches die Umsetzung von Malonatsemialdehyd zu 3-Hydroxypropionat katalysiert; eines Enzyms E50, welches die Umsetzung von 3- Hydroxypropionat zu 3-Hydroxypropionyl-Coenzym A katalysiert; - eines Enzyms E5x, welches die Umsetzung von 3-
Hydroxypropionyl-Coenzym A zu Acryloyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E52, welches die Umsetzung von Acryloyl-Coenzym A zu Propionyl-Coenzym A katalysiert; - eines Enzyms E5, welches die Umsetzung von Propionyl-Coenzym A zu Methylmalonatsemialdehyd katalysiert; eines Enzyms E4, welches die Umsetzung von Methylmalonatsemialdehyd zu 3-Hydroxyisobutyrat kataly- siert.
16. Die Zelle nach Anspruch 15, wobei das Enzym
E4 eine 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase
(EC 1.1.1.31) oder eine 3-Hydroxyacyl-Coenzym A- Dehydrogenase (EC 1.1.1.35),
E5 eine Methylmalonatsemialdehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.27) ,
E47 eine Malonyl-CoenzymA-Decarboxylase (EC 4.1.1.9), eine Malonat-CoenzymA-Transferase (EC 2.8.3.3), eine Methylmalonyl-Coenzym A-Carboxytransferase
(EC 2.1.3.1) oder eine Acetyl-Coenzym A-Carboxylase (EC 6.4.1.2) , E4S eine Malonatsemialdehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.18) ,
E49 eine 3-Hydroxypropionat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.59) , E50 eine 3-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A Hydrolase (EC 3.1.2.4) ,
E5I eine Enoyl-Coenzym A-Hydratase (EC 4.2.1.17) und E52 eine Acyl-Coenzym A-Dehydrogenase (EC 1.3.99.3), ist .
17. Die Zelle nach Anspruch 2, wobei die Zelle 3- Hydroxyisobuttersäure oder auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierende Polyhydroxyalkanoate über Acryloyl-Coenzym A als Zwischenprodukt zu bilden vermag.
18. Die Zelle nach Anspruch 17, wobei die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der nachfolgenden Enzyme Ei0 bis E12, E56, E72 und E73 aufweist: - eines Enzyms E72, welches die Umsetzung von Beta- Alanin zu Beta-Alanyl-Coenzym A katalysiert, eines Enzyms E73, welches die Umsetzung von Beta- Alanyl-Coenzym A zu Acrylyl-Coenzym A katalysiert, eines Enzyms E56, welches die Umsetzung von Acry- lyl-Coenzym A zu Methylmalonyl-Coenzym A katalysiert, eines Enzyms Ei0, welches die Umsetzung von Methylmalonyl-Coenzym A zu Methylmalonat katalysiert; eines Enzyms En, welches die Umsetzung von Methyl- malonat zu Methylmalonat-Semialdehyd katalysiert; eines Enzyms E12, welches die Umsetzung von Methyl- malonat-Semialdehyd zu 3-Hydroxyisobuttersäure katalysiert .
19. Die Zelle nach Anspruch 18, wobei das Enzym
E72 eine Coenzym A-Transferase (EC 2.8.3.1) oder Coen- zym A-Synthetase, vorzugsweise eine Coenzym A- Transferase,
E73 eine Beta-Alanyl-Coenzym A-Ammonium-Lysase (EC 4.3.1.6) ,
E56 eine Crotonyl-Coenzym A-Decarboxylase
Eio eine Methylmalonyl-Coenzym A-Hydrolase (EC 3.1.2.17) ,
En eine Aldehyd-Dehydrogenase (EC 1.2.1.3) oder eine Aldehyd-Oxidase (EC 1.2.3.1) und
E12 eine 3-Hydroxyisobutyrat-Dehydrogenase
(EC 1.1.1.31) oder eine 3-Hydroxyacyl-Coenzym A- Dehydrogenase (EC 1.1.1.35) ist .
20. Die Zelle nach Anspruch 1, wobei die Bildung von 3- Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3-
Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten über 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A als Vorprodukt erfolgt.
21. Die Zelle nach Anspruch 20, wobei die Zelle 3- Hydroxyisobuttersäure oder auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierende Polyhydroxyalkanoate über Isobutyryl- Coenzym A als Zwischenprodukt zu bilden vermag.
22. Die Zelle nach Anspruch 21, wobei die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität min- destens eines der folgenden Enzyme E76 bis E79, E60, E6x und E8 aufweist: eines Enzyms E76, welches die Umsetzung von Pyruvat zu 2-Acetolactat katalysiert; - eines Enzyms E77, welches die Umsetzung von 2-
Acetolactat zu 2, 3-Dihydroxyisolvalerat katalysiert; eines Enzyms E78, welches die Umsetzung von 2,3- Dihydroxyisolvalerat zu 2-Oxoisovalerat kataly- siert; eines Enzyms E79, welches die Umsetzung von 2- Oxoisovalerat zu Isobutyryl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E60, welches die Umsetzung von Isobutyryl-Coenzym A zu Methacrylyl-Coenzym A kataly- siert; eines Enzyms E6i, welches die Umsetzung von Methacrylyl-Coenzym A zu 3-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E8, welches die Umsetzung von 3- Hydroxyisobutyryl-Coenzym A zu 3-Hydroxyisobutyrat katalysiert .
23. Die Zelle nach Anspruch 22, wobei das Enzym
E8 eine 3-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A-Hydrolase (EC 3.1.2.4) ,
E76 eine Acetolactat-Synthase (EC 2.2.1.6),
E77 eine Dihydroxyisovalerat-Dehydrogenase (EC 1.1.1.86) ,
E78 eine 2, 3-Dihydroxyisovalerat-Dehydratase (EC 4.2.1.9) ,
E79 eine 2-Oxoisovalerat-Dehydrogenase (EC 1.2.1.25 oder EC 1.2.4.4) , E60 eine Acyl-Coenzym A-Dehydrogenase (EC 1.3.99.3), eine Butyryl-CoenzymA-Dehydrogenase (EC 1.3.99.2) oder eine 2-Methylacyl-Coenzym A-Dehydrogenase (EC 1.3.99.12) , und E6i eine Enoyl-Coenzym A-Hydratase (EC 4.2.1.17) ist .
24. Die Zelle nach Anspruch 21 oder 22, wobei die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität mindestens eines der folgenden Enzyme E8, E60 bis E6x und E79 bis E8o aufweist: eines Enzyms E8O, welches die Umsetzung von L-Valin zu 2-Oxoisovalerat katalysiert; eines Enzyms E79, welches die Umsetzung von 2- Oxoisovalerat zu Isobutyryl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E60, welches die Umsetzung von Isobutyryl-Coenzym A zu Methacrylyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E6i, welches die Umsetzung von Methac- rylyl-Coenzym A zu 3-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E8, welches die Umsetzung von 3- Hydroxyisobutyryl-Coenzym A zu 3-Hydroxyisobutyrat katalysiert .
25. Die Zelle nach Anspruch 24, wobei das Enzym
E8 eine 3-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A-Hydrolase (EC 3.1.2.4) ,
E60 eine Enoyl-Coenzym A-Hydratase (EC 4.2.1.17), E6i eine Acyl-Coenzym A-Dehydrogenase (EC 1.3.99.3), eine Butyryl-CoenzymA-Dehydrogenase (EC 1.3.99.2) oder eine 2-Methylacyl-Coenzym A-Dehydrogenase (EC 1.3.99.12) ,
E79 eine 2-Oxoisovalerat-Dehydrogenase (EC 1.2.1.25 oder EC 1.2.4.4), und E8O eine Aminosäure-Transferase (EC 2.6.1.42), ist .
26. Die Zelle nach Anspruch 20, wobei die Zelle 3- Hydroxyisobuttersäure oder auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierende Polyhydroxyalkanoate über 3-Hydroxybutyryl- Coenzym A als Zwischenprodukt zu bilden vermag.
27. Die Zelle nach Anspruch 26, wobei die Zelle eine im Vergleich zu ihrem Wildtyp gesteigerte Aktivität min- destens eines der folgenden Enzyme E8, E53, E54 und E82: eines Enzyms E53, welches die Umsetzung von Acetyl- Coenzym A zu Acetoacetyl-Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E54, welches die Umsetzung von Acetoacetyl-Coenzym A zu 3-Hydroxybutyryl-Coenzym A kata- lysiert; eines Enzyms E82, welches die Umsetzung von 3- Hydroxybutyryl-Coenzym A zu 3-Hydroxyisobutyryl- Coenzym A katalysiert; eines Enzyms E8, welches die Umsetzung von 3- Hydroxyisobutyryl-Coenzym A zu 3-Hydroxyisobutyrat katalysiert .
28. Die Zelle nach Anspruch 27, wobei das Enzym
E8 eine 3-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A-Hydrolase (EC 3.1.2.4) ,
E53 eine ß-Kethothiolase (EC 2.3.1.9), E54 Acetoacetyl-Coenzym A-Reduktase (eine EC 1.1.1.36), und
E82 eine Isobutyryl-Coenzym -Mutase (EC 5.4.99.13), ist .
29. Ein Verfahren zur Herstellung einer gentechnisch veränderten Zelle, welche in der Lage ist, über das Vorprodukt Methylmalonat-Semialdehyd oder 3-Hydroxybutyryl- Coenzym A 3-Hydroxyisobuttersäure oder auf 3- Hydroxyisobuttersäure basierende Polyhydroxyalkanoate zu bilden, umfassend den Verfahrensschritt der Erhöhung der Aktivität mindestens eines der in den Ansprüchen 2 bis 28 genannten Enzyme in der Zelle.
30. Eine Zelle, erhältlich durch ein Verfahren nach 29.
31. Ein Verfahren zur Herstellung von 3- Hydroxyisobuttersäure oder von auf 3- Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoa- ten, umfassend den Verfahrensschritt des in Kontakt bringens einer Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 28 oder 30 mit einem Nährmedium beinhaltend als Kohlenstoffquelle Kohlenhydrate, Glycerin, Kohlendioxid, Methanol, L-Valin oder L-Glutamat unter Bedingungen, un- ter denen aus der Kohlenstoffquelle 3-
Hydroxyisobuttersäure oder auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierende Polyhydroxyalkanoate gebildet werden, sowie gegebenenfalls Aufreinigung der 3-Hydroxyisobuttersäure aus dem Nährmedium.
32. Ein Verfahren zur Herstellung von Methacrylsäure oder Methacrylsäureestern, umfassend die Verfahrensschritte IA) Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure durch ein Verfahren nach Anspruch 31 sowie gegebenenfalls Neutralisation der 3-Hydroxyisobuttersäure,
IB) Dehydratisierung des 3-Hydroxyisobuttersäure un- ter Bildung von Methacrylsäure sowie gegebenenfalls Veresterung Methacrylsäure.
33. Ein Verfahren zur Herstellung von Methacrylsäure oder Methacrylsäureestern, umfassend die Verfahrensschritte IIA) Herstellung von auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoaten durch ein Verfahren nach Anspruch 31,
IIB) Spaltung der auf 3-Hydroxyisobuttersäure basierenden Polyhydroxyalkanoate unter Bildung von 3- Hydroxyisobuttersäure sowie gegebenenfalls Neutralisation der 3-Hydroxyisobuttersäure,
HC) Dehydratisierung der 3-Hydroxyisobuttersäure unter Bildung von Methacrylsäure sowie gegebenenfalls Veresterung der Methacrylsäure.
34. Ein Verfahren zur Herstellung von Polymethacrylsäure oder Polymethacrylsäureestern, umfassend die Verfahrensschritte
IHA) Herstellung von Methacrylsäure durch ein Verfah- ren nach Anspruch 32 oder 33,
HIB) Radikalische Polymerisation der Methacrylsäure, wobei gegebenenfalls die Carboxylgruppen der Methacrylsäure bzw. die Carboxylatgruppe des Methacrylates vor oder nach der radikalischen Polymerisation zumindest teilweise verestert werden können.
35. Eine isolierte DNA, welche ausgewählt ist aus den folgenden Sequenzen: a) eine Sequenz nach SEQ. -ID-Nr. 03, b) eine intronfreie Sequenz, die von einer Sequenz nach a) abgeleitet ist und das gleiche Protein oder Peptid kodiert wie die Sequenz nach SEQ. -ID-Nr. 03, c) eine Sequenz, die ein Protein oder Peptid kodiert, das die Aminosäuresequenz nach SEQ. -ID-Nr. 04 um- fasst, d) eine Sequenz, die mit einer Sequenz nach a) bis c) zu mindestens 80% identisch ist, e) eine Sequenz, die mit dem Gegenstrang einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis d) hybridisiert oder unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Codes hybridisieren würde, f) ein durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen erhaltenes Derivat einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis e) , sowie g) eine komplementäre Sequenz zu einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis f) .
36. Ein Vektor, umfassend eine DNA-Sequenz nach einer der Gruppen a) bis f) , wie im Anspruch 35 definiert.
37. Die Verwendung des Vektors nach Anspruch 36 zur Trans- formation einer Zelle.
38. Eine transformierte Zelle, erhältlich durch Transformation mit einem Vektor nach Anspruch 36.
39. Ein isoliertes Polypeptid, welches die Aminosäure- Sequenz mit der SEQ. -ID-Nr. 04 oder eine Aminosäuresequenz, die erhalten wird, wenn höchstens 10 Aminosäuren in der SEQ. -ID-Nr. 04 deletiert, insertiert, substituiert oder aber an das C- und/oder N-terminale Ende der Aminosäure-Sequenz mit der SEQ. -ID-Nr. 04 angefügt sind, aufweist.
PCT/EP2007/055394 2006-06-02 2007-06-01 Mikrobiologische herstellung von 3-hydroxyisobuttersäure Ceased WO2007141208A2 (de)

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