WO2008001748A1 - Élément de détection pour mesure spr - Google Patents

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Michiko Seyama
Toru Miura
Tsutomu Horiuchi
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    • Y10T436/2575—Volumetric liquid transfer

Definitions

  • the present invention relates to a sensor element for SPR (surface plasmon resonance) measurement.
  • This sensor is used for biomedical diagnosis of humans and animals, environmental analysis, biomolecular mutual measurement sensor for biochemical research, etc. More specifically, an immunosensor for quantifying an antigen or antibody, DNA It is used as a sensor that identifies sequences, a sensor that quantifies substrates of enzymes, a sensor that identifies pathogenic bacteria, and so on.
  • a method using a molecular recognition material is known as one of methods for measuring a chemical substance in a liquid sample.
  • One of the methods using the molecular recognition material is an immunosensor utilizing an antigen-antibody reaction.
  • immunosensors using antibodies are useful for virus detection, disease markers, and environmental contamination.
  • Substance measurement ⁇ It is designed to be used for quick diagnosis.
  • the ELISA method has the problem that the operation which increases the cost of testing is also complicated.
  • the immunochromatography method is a measurement method for detecting the presence of an antigen by the following mechanism of action.
  • a sample such as urine, blood, or mucosal suspension containing the antigen to be measured, onto a sample dropping portion of a filter paper containing a gold colloid labeled antibody at a predetermined position, and spread it.
  • a sample containing an antigen develops, it contacts with a gold colloid labeled antibody, and the antigen and the gold colloid labeled antibody are bound by an antigen-antibody reaction.
  • the gold colloid labeled antibody bound to the antigen is further developed, it is bound to a second antibody fixed beforehand at a predetermined position on the filter paper, and the gold colloid accumulates on that part.
  • the SPR sensor is an immunosensor utilizing an antigen-antibody reaction, and comprises an antigen or an antibody immobilized on a metal thin film.
  • the antigen or antibody immobilized on the metal thin film binds to the antibody or antigen by antigen-antibody reaction.
  • refractive index change occurs. By detecting the change in refractive index, Or to detect an antigen.
  • the SPR sensor has been used as a means for detecting ecologically related substances because it is not necessary to label the molecule to be detected with a radioactive substance or fluorescent substance, and high concentration sensitivity can be obtained (see, for example, Patent Document 2) ).
  • the refractive index of the volume within the reach of the evanescent light of the reflection part of the light on the gold thin film is measured, so that the volume of the sample required for measurement can be reduced.
  • an optical system that measures the SPR phenomenon and a measurement element that performs an antigen-antibody reaction can be separated using a transparent substrate, and different molecules can be measured by replacing the measurement element. Also, it can prevent the contamination of measuring equipment due to sampling. In particular, in the case where the sample contains a toxin, the leakage of the toxin can be prevented.
  • SPR can measure multiple samples at the same time, which can increase the throughput of the measurement.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Publication No. 7-36017
  • Patent Document 2 Registered Patent 3294605
  • Non-Patent Document 1 Eight! 3 ⁇ 4 1.01 ⁇ 2 111. 2005, 77, 7901-7907
  • the object of the present invention is to provide an SPR measurement element that does not require a mechanical liquid transport mechanism in order to achieve both a simple measurement and a high sensitivity measurement.
  • the sensor element for SPR measurement of the present invention is a transparent substrate, a gold thin film formed on at least a part of the transparent substrate, and a transparent thin film formed on at least a part of the transparent thin film.
  • a sample affinity thin film provided on a substrate, and the transparent thin film on which the gold thin film and the sample affinity thin film are provided are interposed between a measurement area (area A) and the area A.
  • a sample affinity thin film is provided on at least a portion of the surface of each of the regions A, B, and C.
  • the sample affinity thin film of the region A is provided with a sample measurement section containing a molecular recognition film, and the introduction port is formed on the sample affinity film of the region B, and the sample affinity of the region C is formed.
  • An absorption pad is provided on the film so as to cover the entire area C, and a point in the area B, a point in the area A, and a point in the area C lie in a straight line on the sample affinity thin film. It is characterized by being present in
  • the gold film may be between the transparent substrate and the sample affinity film, or between the sample affinity film and the sample non-affinity film.
  • FIG. 1A is a schematic side view showing an embodiment of the sensor element of the present invention.
  • FIG. 1B is a schematic plan view showing an embodiment of the sensor element of the present invention.
  • FIG. 2 is an enlarged view showing a portion including the area A of the sensor element.
  • FIG. 3A is an example in which the sample introduction membrane is dropped directly on the sample affinity membrane without providing anything on the sample affinity membrane in the sample introduction portion (in the embodiment of the region.
  • FIG. 3B is an example in which a cup or tube with a bottom in the embodiment of the sample introduction part (region B) is provided on a sample affinity membrane to make a sample introduction port.
  • FIG. 3C is an example in which a sample pad having a liquid holding function in the embodiment of the sample introduction unit (region B) is provided on a sample affinity film.
  • FIG. 4A is a simplified side schematic view showing another embodiment of the sensor element of the present invention.
  • FIG. 4B is a simplified plan view showing another embodiment of the sensor element of the present invention.
  • FIG. 5A shows a pattern of a sample affinity membrane.
  • FIG. 5B shows an antibody immobilization part.
  • FIG. 1A and 1B show simplified schematic views of the sensor element for SPR measurement of the present invention
  • FIG. 1A is a side view thereof
  • FIG. 1B is a plan view thereof
  • FIG. 2 is an enlarged view showing a portion including the area A.
  • a gold thin film 2 is formed on at least a part of the substrate 1.
  • the substrate transparent materials such as glass and transparent plastic can be used. In SPR measurement, light needs to be incident on the interface between the substrate and the gold thin film at an incident angle required for SPR measurement, and any transparent material that can enter light at such an angle can be used. If a prism based SPR measurement device is used with this sensor, the substrate preferably has the same refractive index as the prism.
  • the gold thin film 2 may cover the entire surface of the substrate 1, it is not necessary to cover the entire surface, but at least a portion thereof, ie, a portion including the area whose refractive index is to be measured 2 should be covered.
  • the gold thin film 2 can be formed by vapor deposition, sputtering or the like.
  • a sample affinity thin film 3 is provided on a substrate 1 on which a gold thin film 2 is formed on at least a part of the substrate 1.
  • the sample affinity membrane is a cellulose-based material such as cellulose, nitrocellulose, acetyl cellulose, chitosan, polycarbonate, polystyrene, protein, etc., if the sample is an aqueous solution.
  • a fibrous material or porous membrane made of a polymer can be used. Glass fibers and porous glass membranes can also be used. The membrane made of the polymer can be formed into a fibrous material or a porous membrane by appropriately selecting the solvent and the coating conditions.
  • the transparent substrate 1 on which the gold thin film 2 and the sample affinity thin film 3 are provided has regions A, B, and C which do not overlap each other in the plane. That is, the measurement area (area A) and the sample introduction portion (area and sample absorbing part (area C) provided so as to intervene between the area A.
  • the sample affinity thin film 3 is provided on at least a part of the surface of the sample, and the sample affinity membrane of the region A and the sample affinity membrane of the region B are connected at the boundary between the regions A and B. At the boundary, the sample affinity membrane of region A and the sample affinity membrane of region C are connected. Pull affinity thin film 3 covered with a layer, a portion has an affinity to the sample, a layer, a layer.
  • the exposed portion of the transparent substrate 1 or the gold thin film 2 has no affinity to the sample. Therefore, the sample introduced to the region A only enters the portion covered with the sample affinity thin film.
  • the surface of the sample affinity membrane in the region A may be covered with a non-affinitive membrane for the sample. Examples of membranes incompatible with this sample include metal membranes impermeable to liquids, solid polymer membranes, and membranes made of hydrophobic polymers when the sample is water-soluble.
  • the region A of the sample affinity membrane 3 has a sample measurement unit containing a molecular recognition membrane.
  • the molecular recognition membrane is one in which a molecular recognition material is immobilized on a sample affinity membrane.
  • a molecular recognition material one molecule of a pair of molecules forming a complex can be used.
  • Such complexes can include combinations of antigens and antibodies.
  • an antibody when used as a molecular recognition material, it is possible to measure an antigen contained in a sample.
  • the refractive index in a portion within 500 nm from the gold surface is measured, so the thickness of the sample affinity film 3 in the region A is preferably 10 ⁇ m or less. If the membrane is thicker than 10 ⁇ m, the unmeasured sample volume will be larger than necessary and the absolute sensitivity will be reduced.
  • a sample introduction port is formed in the region B of the sample affinity membrane 3.
  • the sample introduction port may be provided directly on the sample affinity membrane without providing anything on the sample affinity membrane as shown in FIG. 3A.
  • a cup or tube 6 with a bottom as shown in FIG. 3B may be provided on the sample affinity membrane to serve as a sample introduction port.
  • a sample pad 4 having a function of holding a liquid may be provided on the sample affinity membrane.
  • FIG. 3C shows an example in which a sample pad is provided as a sample introduction port. At the sample introduction port, the sample is dropped on the sample affinity membrane or in the cup or tube or on the sample pad.
  • an absorbent pad 5 for discharging the sample affinity membrane force of the sample is provided.
  • Absorbent pad 5 may be a sample affinity membrane having a large volume in a simplified configuration, or may be provided with a pad having a function of holding the liquid of the sample.
  • a pad having a function of holding a sample pad and sample liquid As the pad, for example, an absorbent pad made of Millipore AP22 material can be used.
  • the sample introduced from the introduction port flows in the sample affinity membrane and moves to the area C via the sample affinity membrane of the area A. Therefore, it is necessary that the points in the region B, the points in the region A, and the points in the region C exist on one straight line on the sample affinity thin film.
  • the sample liquid is dropped to a point of a certain area B on the straight line, the sample liquid spreads (flows) along the straight line, and the sample liquid is brought to the area C via the area A.
  • the sample liquid is absorbed by the absorbent pad 5 and discharged from the area on the straight line, so that the sample is continuously supplied from the area B to the area A, and in the area A.
  • the molecule to be measured can efficiently react with the molecule of the partner that forms a molecular complex with the molecule to be measured such as the immobilized antibody. This is particularly advantageous when the sample requires pretreatment and the amount of sample is reduced by the pretreatment and the amount of sample introduced from the introduction port into the sample affinity membrane is small.
  • a plurality of sampling measurement units may be provided in the region A.
  • detection of a plurality of antigens can be performed in a single SPR measurement.
  • the movement speed of the solute differs depending on the interaction between the material and the structure and the solute that make up the sample affinity membrane, and the order of reaching the region A is the solute for each solute. It will be different.
  • the molecules to be measured can be detected at different times rather than simultaneously, so that the molecular separation function by the immobilized molecules can be used more effectively, and highly sensitive detection can be achieved. It can be carried out.
  • the antigen flows close to the antibody near the gold thin film, the antigen can be efficiently captured.
  • the sensor element of the structure shown to FIG. 1A and FIG. IB was produced with the following procedures.
  • BK7 glass was used as a substrate 1
  • a titanium film having a thickness of 1 nm was formed on BK7 glass, and a thin film 2 consisting of a 45 nm-thick gold film was formed thereon by sputtering.
  • the titanium is used to improve the adhesion of the gold thin film to the substrate.
  • a gold thin film is formed on the area A of the sensor element.
  • a sample affinity membrane consisting of a 4 ⁇ m porous membrane was formed.
  • Anti-human IgG (manufactured by Sigma) was spot-fixed to the sample affinity membrane so that a gold thin film was present and the region A where SPR detection can be performed was included. Furthermore, blocking was performed on the area A using Superblock PBS (manufactured by PIAS).
  • the sample pad (Millipore AP22 material) was immobilized on the sample affinity membrane so as not to overlap with the portion on which the antibody was immobilized.
  • an absorbent pad (Millipore AP22 material) was placed in area C.
  • the glass surface of the sensor element thus obtained was brought into close contact with a prism of Handy SPR (manufactured by NTT-AT Co.), which is an SPR measurement device, using a refractive index matching oil.
  • a prism of Handy SPR manufactured by NTT-AT Co.
  • NTT-AT Co. an SPR measurement device
  • this sensor element can perform immunoassay without preparing a pump or a dedicated flow path. If the sensor element prepared as in the present embodiment is stored, the measurement of the antigen by the antigen-antibody reaction can be carried out simply by installing one sensor element in the SPR device every measurement and dropping the sample. It is possible and can detect an antigen simply and easily.
  • a sensor element as shown in FIGS. 4A and 4B was produced in the same production procedure as in Example 1.
  • a portion of the sample affinity membrane was removed as shown in FIG. 5A to limit the area through which the sample flows in the sample affinity membrane.
  • Two kinds of antibodies, anti-human IgG (manufactured by Sigma) and anti-jagged IgG (manufactured by Sigma) were immobilized at the two narrow spots.
  • This sensor element was adhered to a prism of DKK-20 (manufactured by DKK), which is an SPR measurement device, using a refractive index matching oil.
  • the present invention it is possible to easily perform high-sensitivity SPR measurement S without the need for a mechanical liquid transport mechanism.
  • concentration of specific molecules in liquid samples can be measured simply and quickly, which is useful for virus detection, disease markers, measurement of environmental contaminants, and rapid diagnosis.

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Description

明 細 書
SPR測定用センサー素子
技術分野
[0001] 本発明は、 SPR (表面プラズモン共鳴)測定用センサー素子に関する。このセンサ 一は、人及び動物の生化学診断、環境分析、生化学研究用生体分子相互測定用セ ンサ一などに用いられ、より具体的には、抗原または抗体を定量する免疫センサー、 DNAの配列を同定するセンサー、酵素の基質を定量するセンサー、病原性菌同定 用センサーなどに用いられる。
背景技術
[0002] 液体試料中の化学物質を測定する方法のひとつとして、分子認識材料を用いる方 法が知られている。その分子認識材料を用いる方法のひとつとして抗原抗体反応を 利用した免疫センサーがある。
[0003] 抗体の分子認識特性が高いことと、被測定成分に特異的に結合する抗体を作製す る技術が進歩したことから、抗体を用いた免疫センサーはウィルス検出や疾病マーカ 一、環境汚染物質の測定 ·迅速診断に用レ、られるようになっている。
[0004] 例えば、免疫測定で一般的に用いられているサンドイッチ型 ELISA法 (酵素免疫 定量法）では、ひとつの抗原の異なる部位に結合しうる複数種の抗体を作成する必 要があり、し力もそれらの抗体のひとつには標識分子を結合する必要がある。
[0005] また、このサンドイッチ型 ELISA法は、 1)固相に目的の抗原に特異的に結合する 抗体を結合したものを準備し、 2)この固相に目的物質を含む溶液を加えて、抗原抗 体反応により抗原を固相に結合させ、 3)洗浄により余計な蛋白質や固相に結合しな 力、つた抗原を除去した後、 4)標識した抗体を加えて固相に結合している抗原と結合 させて、 5)固定された標識抗体により抗原を定量するものである。
[0006] このため、この作業手順分析を行うためには、液体の分注、洗浄、交換作業が必要 で、最終的な測定には吸収分光測定装置や蛍光分光測定装置が必要である。従つ て、 ELISA法は検査コストが高ぐ作業も複雑であるという問題を有している。
[0007] 一方、免疫測定分野では、簡便で安価な方法としてィムノクロマト法が開発されて レ、る (例えば、特許文献 1参照。）。
[0008] ィムノクロマト法は以下の作用機序で抗原の存在を検出する測定法である。 1)被測 定対象の抗原を含む尿、血液、粘膜懸濁液などのサンプルを、金コロイド標識抗体 を所定の位置に含有するろ紙の試料滴下部に滴下し、展開させる。 2)抗原を含有す る試料が展開する際に金コロイド標識抗体と接触し、抗原抗体反応により抗原と金コ ロイド標識抗体が結合する。 3)抗原と結合した金コロイド標識抗体をさらに展開させ ると、あらかじめろ紙の所定位置に固定しておいた第 2抗体と結合して、その部分に 金コロイドが集積する。 4)金コロイドが集積することによって赤紫色に着色する。金コ ロイドが集積することで、抗原の存在を検出する。
[0009] この方法ではろ紙を使ったクロマトグラフィーを利用しているので測定対象物と挟雑 物を分ける分離作用があり、挟雑物の多いサンプノレでも測定することができる。また、 特別な装置が不要で、 目視によって結果を判定できるので、簡便な抗原の測定法と して、インフルエンザウイルス検査や、妊娠検査などに使われている。
[0010] また、抗体に標識を導入することによって抗体の活性が失われたり、抗原の認識に 変化が生じたりした場合や、得られる抗体の量が少ない場合など、微量の測定を迫ら れる場合は特別な測定法が必要となる。
[0011] このような測定法のひとつとして、プラスチックの流路にろ紙を入れた測定チップが ある（例えば、非特許文献 1参照。）。この測定チップでは、ろ紙の平面内での展開に より検査対象成分を挟雑物から分離した後、これを透明なチャンバ一に導いて、その 透過光強度から対象成分を定量してレ、る。
[0012] 無標識の抗体または抗原を用いて抗原抗体反応や、 DNAのハイブリダィゼーショ ンなどの生体分子相互作用測定を行う方法としては、表面プラズモン共鳴 (Surface PI asmon Resonance)効果を利用した SPR測定法があり、この測定法においては、 SPR センサーが用いられる。
[0013] SPRセンサーは抗原抗体反応を利用した免疫センサーであり、抗原または抗体を 金属薄膜に固定してなる。金属薄膜に固定された抗原または抗体は抗原抗体反応 により抗体または抗原と結合する。抗原抗体反応により抗原または抗体が抗体または 抗原と結合すると屈折率変化が生じる。その屈折率変化を検出することにより抗体ま たは抗原を検出するものである。 SPRセンサーは、検出したい分子に放射性物質や 蛍光物質で標識をつける必要がなぐかつ、高い濃度感度が得られるため、生態関 連物質の検出手段として用いられてきている (例えば、特許文献 2参照。）。
[0014] SPR測定では、金薄膜上の光の反射部分のエバネッセント光の届く範囲の体積の 屈折率が測定されるために、測定に必要なサンプノレの体積が少なくて済むという特 徴がある。さらに SPR測定では、 SPR現象の計測を行う光学系と、抗原抗体反応を 行う測定素子を透明な基板を用いて分離することができ、測定素子を取り替えること により異なる分子の測定を行うこともでき、サンプノレによる測定装置の汚染を防ぐこと もできる。特にサンプルが毒素を含む場合では毒素の漏洩を防ぐことができる。また、 SPRでは同時に複数のサンプルの測定を行うことができ、測定のスループットを高め ること力 Sできる。
[0015] 特許文献 1 :特公平 7— 36017号公報
特許文献 2：登録特許 3294605号公報
非特許文献1 :八!¾1.0½111.2005，77，7901-7907
発明の開示
[0016] ィムノクロマト法では、二つの抗体が同時に抗原に結合できるように、抗体を作製す る必要がある。しかも、その一つには抗体の活性が落ちないように金コロイドを結合さ せる必要があり、抗体の作製にコストと時間力 Sかかる。
[0017] 一方、従来の SPR測定では抗体を 1種類用いるだけで済み、感度も高いが、流路 構造と、その流路構造にサンプル液を液送する液送装置とが必要であった。さらに、 SPRで屈折率を測定できる領域が非常に狭ぐ既存の液送装置を用いてこの領域に だけ液送しょうとすると、液送に非常に高い圧力が必要であった。このため、 SPR測 定に際しては、本来測定に必要な量以上の量が必要となる問題があり、絶対量感度 (所要サンプノレ量あたりの感度）を高くすることが困難であった。
[0018] 簡便な測定と高感度測定を両立させるために、本発明は、機械的な液送機構の必 要のない、 SPR測定素子を提供することを目的とする。
[0019] 即ち、本発明の SPR測定用センサー素子は、透明基板と、該透明基板上の少なく とも一部に形成された金薄膜と、その少なくとも一部の上に金薄膜が形成された透明 基板上に設けられたサンプル親和性薄膜とを有し、前記金薄膜と前記サンプル親和 性薄膜がその上に設けられた透明基板は測定領域 (領域 A)と、該領域 Aを間に介 するように設けられた試料導入部 (領域 B)と試料吸収部 (領域 C)を有し、前記領域 A, B, Cのいずれにもそれらの少なくとも一部表面にサンプル親和性薄膜が設けら れており、前記領域 Aのサンプル親和性薄膜には分子認識膜を含有するサンプノレ 測定部が設けられており、領域 Bのサンプル親和性膜上には導入ポートが形成され 、領域 Cのサンプル親和性膜上には該領域 C全体を覆うように吸収パッドが設けられ 、サンプル親和性薄膜上で、領域 B内の点と領域 A内の点と領域 C内の点が 1つの 直線にのるように存在することを特徴とする。金薄膜は、透明基板とサンプル親和性 膜の間にあっても、またはサンプル親和性膜とサンプノレ非親和性膜の間にあってもよ レ、。
図面の簡単な説明
[図 1A]図 1 Aは本発明のセンサー素子の 1実施態様を示す側面模式図である。
[図 1B]図 1 Bは本発明のセンサー素子の 1実施態様を示す平面模式図である。
[図 2]図 2はセンサー素子の領域 Aを含む部分を示す拡大図である。
[図 3A]図 3Aは試料導入部 (領域 の実施態様におけるサンプル親和性膜上に何 も設けず、サンプル親和性膜に直接サンプノレを滴下する例である。
[図 3B]図 3Bは試料導入部（領域 B)の実施態様における底があいたカップまたはチ ユーブをサンプル親和性膜上に設けてサンプノレ導入ポートとした例である。
[図 3C]図 3Cは試料導入部 (領域 B)の実施態様における液体を保持する機能を有 するサンプルパッドをサンプル親和性膜上に設けた例である。
[図 4A]図 4Aは本発明のセンサー素子の他の実施態様を示す簡略化された側面模 式図である。
[図 4B]図 4Bは本発明のセンサー素子の他の実施態様を示す簡略化された平面模 式図である。
[図 5A]図 5Aはサンプル親和性膜のパターンを示す。
[図 5B]図 5Bは抗体固定化部分を示す。
発明を実施するための最良の形態 [0021] 以下に、本発明につき、図面を参照しつつ説明する。
[0022] 図 1 Aおよび図 1Bは本発明の SPR測定用センサー素子の簡略化された模式図を 示し、図 1Aはその側面図、図 1Bはその平面図である。図 2はその領域 Aを含む部分 を示す拡大図である。基板 1の少なくとも一部の上に、金薄膜 2が形成されている。基 板 1としては、ガラス、透明プラスチックなどの透明な材料を用いることができる。 SPR 測定においては、基板と金薄膜の界面に SPR測定に必要な入射角度で光を入射さ せる必要があり、このような角度で光を入射できる透明材料であればいずれも用いる ことができる力 プリズムを用いた SPR測定装置をこのセンサーとともに用いる場合は 、基板はこのプリズムと同じ屈折率を有していることが好ましい。
[0023] 金薄膜 2は基板 1の全面を覆っていてもょレ、が、必ずしも全面を覆っている必要は なぐ少なくともその一部、即ち、屈折率を測定される領域を含む部分を金薄膜 2が 覆っていればよい。この金薄膜 2は蒸着法、スパッタ法などにより形成することができ る。
[0024] その少なくとも一部の上に金薄膜 2が形成された基板 1上にサンプル親和性薄膜 3 が設けられてレ、る。サンプル親和性膜はサンプルが膜内に含浸できる材料からなるも のであればよぐサンプルが水溶液の場合、セルロース、ニトロセルロース、ァセチル セルロースなどのセルロース系材料、キトサン、ポリカーボネート、ポリスチレン、蛋白 質などの高分子からなる繊維状物または多孔性膜を用いることができる。またガラス 繊維やガラス多孔質膜を用いることもできる。前記高分子からなる膜は、溶媒、塗布 条件を適切に選択することにより、繊維状物を形成することも、多孔質膜とすることも できる。
[0025] 金薄膜 2と前記サンプル親和性薄膜 3がその上に設けられた透明基板 1はその面 内において互いに重ならない領域 A, B, Cを有する。即ち、測定領域 (領域 A)と、該 領域 Aを間に介するように設けられた試料導入部 (領域 と試料吸収部 (領域 C)で ある。前記領域 A, B, Cのいずれにもそれらの少なくとも一部表面にサンプル親和性 薄膜 3が設けられており、領域 A, Bの境界において領域 Aのサンプル親和性膜と領 域 Bのサンプル親和性膜はつながっており、領域 A, Cの境界において領域 Aのサン プル親和性膜と領域 Cのサンプル親和性膜はつながっている。また、領域 Aのサン プル親和性薄膜 3で覆われてレ、なレ、部分はサンプノレに対して親和性を有してレ、なレヽ 。即ち、透明基板 1や金薄膜 2が露出した部分はサンプルに対して親和性がない。し たがって、領域 Aに導入されたサンプルはサンプル親和性薄膜に覆われた部分にの み進入する。また、領域 Aのサンプル親和性膜の表面はサンプノレに非親和性の膜で 覆われていてもよい。このサンプルに非親和性の膜としては、液体の浸透できない金 属膜、固体の高分子膜、またサンプルが水溶性の場合には疎水性の高分子からなる ものを例示できる。
[0026] サンプル親和性膜 3の領域 Aは分子認識膜を含有するサンプル測定部を有する。
分子認識膜はサンプル親和性膜に分子認識材料が固定されたものである。分子認 識材料としては複合体を形成する分子対の一方の分子を用いることができる。このよ うな複合体としては抗原と抗体の組み合わせを挙げることができる。特に抗体を分子 認識材料として用いると、サンプル中に含まれる抗原の測定ができる。
[0027] SPR法では、金表面から 500nm以内の部分における屈折率が測定されるため、 領域 Aでのサンプル親和性膜 3の厚さは 10 μ m以下であることが好ましい。膜が 10 μ mより厚くなると測定されないサンプル体積が必要以上に大きくなり、絶対量感度 が低下する。
[0028] さらに、サンプル親和性膜 3の領域 Bにはサンプル導入ポートが形成される。サンプ ル導入ポートは、図 3Aのようにサンプル親和性膜上に何も設けず、サンプル親和性 膜に直接サンプルを滴下するようにしてもよい。また、図 3Bのように底があいたカップ またはチューブ 6をサンプル親和性膜上に設けてサンプノレ導入ポートとしてもよい。 また、図 3Cのように、液体を保持する機能を有するサンプルパッド 4をサンプル親和 性膜上に設けてもよい。図 3Cでは、サンプノレ導入ポートとしてサンプルパッドを設け た例を示している。サンプル導入ポートにおいては、サンプルがサンプル親和性膜 上あるいはカップまたはチューブ内あるいはサンプルパッド上に滴下される。
[0029] さらに、サンプル親和性膜の領域 Cにはサンプノレをサンプル親和性膜力 排出さ せるための吸収パッド 5が設けられる。吸収パッド 5は簡素化された構成では体積の 大きなサンプル親和性膜を用レ、てもよぐサンプルの液体を保持する機能を有するパ ッドを設けてもょレ、。サンプルパッド及びサンプルの液体を保持する機能を有するパ ッドとしては、例えば、ミリポア社製 AP22素材の吸収パッドを用いることができる。
[0030] 本発明のセンサー素子では、導入ポートから導入したサンプルがサンプル親和性 膜内を流れ、領域 Aのサンプル親和性膜を経由して領域 Cに移動する。したがって、 サンプル親和性薄膜上で、領域 B内の点と領域 A内の点と領域 C内の点が 1つの直 線上に存在することが必要である。この直線上のある領域 Bの点にサンプノレ液を滴下 すると、この直線に沿ってサンプル液が展開（流動）し、領域 Aを経由して領域 Cにい たる。
[0031] 領域 Cでは吸収パッド 5によりサンプノレ液が吸収されてこの直線上にある領域から 排出されてレ、くため、領域 Bから領域 Aに継続的にサンプルが供給され、領域 Aにお いて固定された抗体等の被測定分子と分子複合体を形成する相手の分子と、被測 定分子が効率的に反応できる。このことは、特にサンプノレが前処理を必要とするもの であって、前処理によりサンプノレ量が減少し、導入ポートからサンプル親和性膜内に 入り込むサンプノレ量が少なくなつた場合に有利である。
[0032] このセンサー素子による測定に当たっては、このセンサー素子の基板側から光を入 射し、基板と金薄膜の界面での金薄膜力 の反射光を測定することにより、 SPR測定 を行う。
[0033] さらに、領域 Aに複数のサンプノレ測定部が設けられていてもよい。この複数のサン プノレ測定部に互いに異なる抗体を固定すると複数の抗原の検出を 1回の SPR測定 で行うことができる。
[0034] 一般に、サンプル親和性膜内部をサンプルが流れる場合、サンプル親和性膜を構 成する材料及び構造と溶質の相互作用によって溶質の移動速度が異なり、領域 Aに 到達する順番が溶質ごとに異なってくる。この効果を利用すると、それぞれの測定対 象分子が同時に検出されるのではなく時間をずらして検出されるので固定化された 分子による分子分別機能をより効果的に利用でき、感度の高い検出を行うことができ る。また、 SPR測定では金薄膜近傍の抗体に抗原が接近して流れると、抗原を効率 的に捕捉できる。サンプノレ非親和性膜を設けることにより、サンプル親和性膜内での 膜に垂直な方向の流速分布が金薄膜の反対側に偏るのを防ぐことができる利点があ る。 [0035] 以下に図面を参照しつつ、本発明を実施例により詳細に説明する。なお、本発明 は以下の実施例のみに限定されるものではない。
実施例 1
[0036] (4 μ mセルロース膜を貼った金チップ）
以下の手順により、図 1A、図 IBに示す構造のセンサー素子を作製した。
1. まず、基板 1として BK7ガラスを用レ、、 BK7ガラス上に厚さ lnmのチタン膜、 その上に厚さ 45nmの金膜からなる薄膜 2を基板中心部にスパッタ法で形成した。チ タンは金薄膜の基板への接着性を向上させるために使用したものである。これにより 、センサー素子の領域 Aに金薄膜が形成されたことになる。
2. アセトンを主成分とし、アルコール類を含む混合溶媒に混合ニトロセルロース (アドバンテック社製）を溶解した溶液を用いスピンコート法で、金薄膜つきガラス基 板の全面に、中心部の厚さが 4 μ mの多孔質膜からなるサンプル親和性膜を形成し た。
3. 金薄膜が存在し、 SPR検出が行える領域 Aを含むように、サンプル親和性膜 に抗ヒト IgG (Sigma社製）をスポット法で固定した。さらに、スーパーブロック PBS (ピ ァス社製）を用いて領域 Aの部分にブロッキングを施した。
4. 図 1 Aに示すように、抗体を固定した部分と重ならないように、サンプルパッド (ミリポア社製 AP22素材)をサンプル親和性膜に固定した。
5. 図 1 Aに示すように、吸収パッド (ミリポア社製 AP22素材）を領域 Cに設置し た。
[0037] こうして得られたセンサー素子のガラス面を、 SPR測定装置であるハンディー SPR ( NTT— AT社製）のプリズムに屈折率マツティングオイルを用いて密着させた。次に、 サンプルパッドに、ャギ IgGを 10 x g/mL含む牛乳を滴下したところ、液体が領域 A に到達した時点で屈折率の増大が見られたが、抗原と抗体の吸着反応による屈折率 の増加は見られな力 た。一方、同様にして用意したセンサー素子にヒト IgGを 10 /i g/mL含む牛乳を滴下したところ、ヒト IgGの特異吸着による SPR信号の変化が見ら れた。このセンサー素子によって、ポンプや専用の流路を準備することなく免疫測定 ができることがわ力つた。 [0038] 本実施例のようにして作成したセンサー素子を保存しておけば、測定の度にセンサ 一素子を SPR装置に設置し、サンプルを滴下するだけで、抗原抗体反応による抗原 の測定が可能であり、簡便に抗原の検出を行うことができる。
実施例 2
[0039] (マルチ抗体）
実施例 1と同様の作製手順で図 4A、図 4Bに示すようなセンサー素子を作製した。 この素子ではサンプル親和性膜の一部を図 5Aに示すように除去し、サンプル親和 性膜の、サンプルが流れる領域を制限した。この狭くなつた 2箇所に 2種類の抗体、 抗ヒト IgG (Sigma社製）と抗ャギ IgG (Sigma社製）をそれぞれ固定化した。
[0040] このセンサー素子を、 SPR測定装置である DKK— 20 (DKK社製）のプリズムに屈 折率マツティングオイルを用いて密着させた。
[0041] サンプルパッドにヒト IgGとャギ IgGを含む牛乳を滴下し、それぞれの領域 Aの SPR 信号を記録した。このセンサー素子を一回の測定ごとに取り替え、異なる濃度のヒト I gGとャギ IgGを含む牛乳からなるサンプノレで測定を繰り返したところ、それぞれの領 域 Aで、固定した抗体に特異的な抗原に対応する SPR信号が得られ、複数種の抗 原を同時に、その濃度情報も含め検出できることがわかった。
産業上の利用可能性
[0042] 本発明によれば、機械的な液送機構の必要がなぐ簡便に高感度の SPR測定を行う こと力 Sできる。また、液体試料中の特定の分子の濃度を簡便かつ迅速に測定すること ができ、ウィルス検出や疾病マーカー、環境汚染物質の測定 ·迅速診断に有用であ る。

Claims

請求の範囲
[1] 透明基板と、該透明基板上の少なくとも一部に形成された金薄膜と、その少なくとも 一部の上に金薄膜が形成された透明基板上に設けられたサンプル親和性薄膜とを 有し、前記金薄膜と前記サンプル親和性薄膜がその上に設けられた透明基板は測 定領域 (領域 A)と、該領域 Aを間に介するように設けられた試料導入部 (領域 B)と試 料吸収部 (領域 C)を有し、前記領域 A, B, Cのいずれにもそれらの少なくとも一部表 面にサンプル親和性薄膜が設けられており、前記領域 Aのサンプル親和性薄膜には 分子認識膜を含有するサンプル測定部が設けられており、領域 Bのサンプル親和性 膜上には導入ポートが形成され、領域 Cのサンプル親和性膜上には該領域 C全体を 覆うように吸収パッドが設けられ、サンプル親和性薄膜上で、領域 B内の点と領域 A 内の点と領域 C内の点が 1つの直線にのるように存在することを特徴とする表面ブラ ズモン共鳴（SPR)効果を利用する SPR測定用センサー素子。
[2] 前記領域 Aに複数のサンプノレ測定部が設けられていることを特徴とする請求項 1記 載の SPR測定用センサー素子。
[3] 前記分子認識膜が、複合体を形成する分子対の一方の分子を固定してなるもので あることを特徴とする請求項 1または 2記載の SPR測定用センサー素子。
[4] 前記複合体を形成する分子対の一方の分子が抗体であることを特徴とする請求項 3記載の SPR測定用センサー素子。
[5] 前記領域 Aのサンプル親和性薄膜の表面がサンプルに対して非親和性の膜で覆 われていることを特徴とする請求項 1から 4のいずれ力、 1項に記載の SPR測定用セン サー素子。
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