WO2008012057A1 - Verfahren zur laser-scanning-mikroskopie und strahlvereiniger - Google Patents

Verfahren zur laser-scanning-mikroskopie und strahlvereiniger Download PDF

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    • G02B21/002—Scanning microscopes
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy

Definitions

  • a laser scanning system In a laser scanning system lasers of different power classes are used. Furthermore, a laser scanning system is characterized by a large number of variable modules that serve as a detector or for illumination. In Fig. 1, a beam path of a laser scanning microscope is shown schematically.
  • An LSM is essentially divided into 4 modules as shown in FIG. 1: light source, scanning module, detection unit and microscope. These modules are described in more detail below. Reference is additionally made to DE19702753A1.
  • lasers with different wavelengths are used in one LSM. The choice of the excitation wavelength depends on the absorption properties of the dyes to be investigated.
  • the excitation radiation is generated in the light source module. Various lasers are used here (argon, argon krypton, TiSa laser).
  • the selection of the wavelengths and the adjustment of the intensity of the required excitation wavelength e.g. through the use of an acousto-optic crystal.
  • the laser radiation passes through a fiber or a suitable mirror arrangement in the scan module.
  • the laser radiation generated in the light source is focused by means of the diffraction-limited diffraction lens via the scanner, the scanning optics and the tube lens into the specimen.
  • the focus scans the sample punctiformly in the x-y direction.
  • the pixel dwell times when scanning over the sample are usually in the range of less than one microsecond to several 100 microseconds.
  • a confocal detection (descanned detection) of the fluorescent light the light which is emitted from the focal plane (specimen) and from the planes above and below passes through the scanners to a dichroic beam splitter (MD). This separates the fluorescent light from the excitation light. Subsequently, the fluorescent light is focused on a diaphragm (confocal aperture / pinhole), which is located exactly in a plane conjugate to the focal plane. As a result, fluorescent light portions outside the focus are suppressed. By varying the aperture size, the optical resolution of the microscope can be adjusted. Behind the aperture is another dichroic block filter (EF) which again suppresses the excitation radiation.
  • EF dichroic block filter
  • the fluorescent light is measured by means of a point detector (PMT).
  • PMT point detector
  • the excitation of dye fluorescence occurs in a small volume where the excitation intensity is particularly high. This area is only marginally larger than the detected area using a confocal array. The use of a confocal aperture can thus be dispensed with and the detection can take place directly after the objective (non-descanned detection).
  • a descanned detection also takes place, but this time the pupil of the objective is imaged into the detection unit (nonconfocally descanned detection).
  • the plane (optical section) which is located in the focal plane of the objective is reproduced by both detection arrangements in conjunction with the corresponding one-photon absorption or multiphoton absorption.
  • a three-dimensional image of the sample can then be generated computer-aided.
  • the LSM is therefore suitable for the examination of thick specimens.
  • the excitation wavelengths are determined by the dye used with its specific absorption properties. Dichroic filters tuned to the emission characteristics of the dye ensure that only the fluorescent light emitted by the respective dye is measured by the point detector.
  • connection of the light source modules with the scan module is usually about
  • FIG. 1 The invention is shown schematically in FIG. 1
  • Tin encapsulated from telecommunication preferably in TTF
  • Thin-film technology is suitable for combining the light of, for example, eight light sources, which are brought in via fibers, and, advantageously via a polarization-maintaining glass fiber, for supplying the microscope (scan head) to an LSM.
  • Fig. 3 shows a possible embodiment is shown.
  • the solution is a compact, encapsulated, fully adjusted assembly that supports the
  • Beam combiner contains.
  • the laser sources are coupled via fibers and unified output via a fiber, the input and output fibers are fixed, so that no adjustment of a fiber to Strahlverlick as in the state of
  • the invention makes possible a compact construction of a beam combiner with the aid of, for example, one of the cubeo-fiber multiplexer or a comparable component.
  • the encapsulated assembly provides a rugged construction that is resistant to
  • Fiber connector realized, it is easily possible for the customer, a modular design

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Abstract

Verfahren zur Laser-Scanning-Mikroskopie, gekennzeichnet durch die Verwendung von gekapselten Fasermutiplexern der Telekommunikation bei der Strahlvereinigung von mehreren Lasern unterschiedlicher Wellenlängen und gemeinsamen Einkopplung in ein Laser-Scanning-Mikroskop und entsprechender Strahlvereiniger, wobei vorteilhaft aus einem gekapselten Bauteil Lichtleiterführungen herausführen, an die unterschiedliche Laser, vorzugsweise über Lichtleiter, ankoppelbar sind.

Description

Verfahren zur Laser- Scanning-Mikroskopie und Strahlvereiniger
Stand der Technik
In einem Laser-Scanning-System werden Laser unterschiedlicher Leistungsklassen verwendet. Weiterhin ist ein Laser-Scanning-System durch eine grosse Anzahl von variablen Modulen gekennzeichnet, die als Detektor oder zur Beleuchtung dienen. In Fig. 1 ist schematisch ein Strahlengang eines Laser-Scanning-Mikroskopes dargestellt.
Ein LSM gliedert sich im wesentlichen wie in Fig. 1 dargestellt in 4 Module: Lichtquelle, Scanmodul, Detektionseinheit und Mikroskop. Diese Module werden im folgenden näher beschrieben. Es wird zusätzlich auf DE19702753A1 verwiesen. Zur spezifischen Anregung der verschiedenen Farbstoffe in einem Präparat werden in einem LSM Laser mit verschiedenen Wellenlängen eingesetzt. Die Wahl der Anregungswellenlänge richtet sich nach den Absorptionseigenschaften der zu untersuchenden Farbstoffe. Der Anregungsstrahlung wird im Lichtquellenmodul erzeugt. Zum Einsatz kommen hierbei verschiedene Laser (Argon, Argon Krypton, TiSa-Laser). Weiterhin erfolgt im Lichtquellenmodul die Selektion der Wellenlängen und die Einstellung der Intensität der benötigten Anregungswellenlänge, z.B. durch den Einsatz eines akusto -optischen Kristalls. Anschließend gelangt die Laserstrahlung über eine Faser oder eine geeignete Spiegelanordnung in das Scanmodul. Die in der Lichtquelle erzeugte Laserstrahlung wird mit Hilfe des Objektivs beugungsbegrenzt über die Scanner, die Scanoptik und die Tubuslinse in das Präparat fokussiert. Der Fokus rastert punktförmig die Probe in x-y-Richtung ab. Die Pixelverweilzeiten beim Scannen über die Probe liegen meist im Bereich von weniger als einer Mikrosekunde bis zu einigen 100 Mikrosekunden.
Bei einer konfokalen Detektion (descanned Detection) des Fluoreszenzlichtes, gelangt das Licht das aus der Fokusebene (Specimen) und aus den darüber- und darunterliegenden Ebenen emittiert wird, über die Scanner auf einen dichroitischen Strahlteiler (MD). Dieser trennt das Fluoreszenzlicht vom Anregungslicht. Anschließend wird das Fluoreszenzlicht auf eine Blende (konfokale Blende / Pinhole) fokussiert, die sich genau in einer zur Fokusebene konjugierten Ebene befindet. Dadurch werden Fluoreszenzlichtanteile außerhalb des Fokus unterdrückt. Durch Variieren der Blendengröße kann die optische Auflösung des Mikroskops eingestellt werden. Hinter der Blende befindet sich ein weiterer dirchroitischer Blockfilter (EF) der nochmals die Anregungsstrahlung unterdrückt. Nach Passieren des Blockfilters wird das Fluoreszenzlicht mittels eines Punktdetektors (PMT) gemessen. Bei Verwendung einer Mehrphotonen-Absorption erfolgt die Anregung der Farbstofffluoreszenz in einem kleinen Volumen an dem die Anregungsintensität besonders hoch ist. Dieser Bereich ist nur unwesentlich größer als der detektierte Bereich bei Verwendung einer konfokalen Anordnung. Der Einsatz einer konfokalen Blende kann somit entfallen und die Detektion kann direkt nach dem Objektiv erfolgen (non descannte Detektion).
In einer weiteren Anordnung zur Detektion einer durch Mehrphotonenabsorption angeregten Farbstofffluoreszenz erfolgt weiterhin eine descannte Detektion, jedoch wird diesmal die Pupille des Objektives in die Detektionseinheit abgebildet (nichtkonfokal descannte Detektion).
Von einem dreidimensional ausgeleuchteten Bild wird durch beide Detektionsanordnungen in Verbindung mit der entsprechenden Einphotonen bzw. Mehrphotonen-Absorption nur die Ebene (optischer Schnitt) wiedergegeben, die sich in der Fokusebene des Objektivs befindet. Durch die Aufzeichnung mehrerer optische Schnitte in der x-y Ebene in verschiedenen Tiefen z der Probe kann anschließend rechnergestützt ein dreidimensionales Bild der Probe generiert werden. Das LSM ist somit zur Untersuchung von dicken Präparaten geeignet. Die Anregungswellenlängen werden durch den verwendeten Farbstoff mit seinen spezifischen Absorptionseigenschaften bestimmt. Auf die Emissionseigenschaften des Farbstoffes abgestimmte dichroitische Filter stellen sicher, dass nur das vom jeweiligen Farbstoff ausgesendete Fluoreszenzlicht vom Punktdetektor gemessen wird.
In biomedizinischen Applikationen werden zur Zeit mehrere verschiedene Zellregionen mit verschiedenen Farbstoffe gleichzeitig markiert (Multifluoreszenz). Die einzelnen Farbstoffe können mit den Stand der Technik entweder aufgrund verschiedener Absorptionseigenschaften oder Emissionseigenschaften (Spektren) getrennt nachgewiesen werden. Dazu erfolgt eine zusätzliche Aufspaltung des Fluoreszenzlichts von mehreren Farbstoffen mit den Nebenstrahlteilern (DBS) und eine getrennte Detektion der einzelnen Farbstoffemissionen in getrennten Punktdetektoren (PMT x). Das LSM LIVE der Carl Zeiss Micolmaging GmbH realisiert einen sehr schnellen Linienscanner mit einer Bilderzeugung um 120 Bildern pro Sekunde. (http://www.zeiss.de/c12567be00459794/Contents- Frame/fd9fa0090eee01 a641256a550036267b).
Die Verbindung der Lichtquellenmodule mit dem Scanmodul erfolgt in der Regel über
Lichtleitfasern.
Das Einkoppeln mehrerer unabhängiger Laser in eine Faser zur Übertragung zum
Scankopf wurde beispielsweise in Pawley : „ Handbook of Confocal Microskopy „,
Plenum Press, 1994 , Seite 151 sowie in DE19633185 A1 beschrieben.
Bei der Messung von fluoreszierenden Proben mit einem Laser Scanning Mikroskop müssen diese mit geeigneten Laserquellen mit hoher Strahlqualität beleuchtet werden, um optimale Auflösungen zu erzielen. Dabei werden zweckmäßigerweise mehrere Laser mit verschiedener Wellenlänge eingesetzt, deren Laserstrahlen räumlich überlagert werden. Wenn gleichzeitig eine kompakte Bauform mit in den Scankopf integrierten Laserquellen angestrebt wird, dann sollten geeigneterweise kompakte Strahlvereiniger zur Überlagerung der Laserstrahlen Anwendung finden. Der Stand der Technik ist die Verwendung von Justierspiegeln, Spiegeltreppen und Strahlvereinigern als diskrete, einzeln verstellbare und justierbare Bauteile. Die Montage und Justage dieser Bauteile ist aufwändig und empfindlich. Die Umwelteinflüsse (Temperatur, Staub, Erschütterungen), denen diese Baugruppen ausgesetzt sind, wirken sich nachteilig auf Performance, Herstellkosten, Servicebarkeit, Zuverlässigkeit und Kundenfreundlichkeit aus. Aufwändig ist hier auch die Realisierung der gesetzlich geforderten Lasersicherheit. Aufgrund des komplexen Aufbaus sind erforderliche Serviceeinsätze zudem aufwändig und teuer. Erfindung:
Die Erfindung ist in Fig.2 schematisch dargestellt.
Tin gekapseltes Beuteil aus dfer Telekommunikation , vorzugsweise in TTF
Dünnschichttechnologie ist geeignet, das Licht von beispielsweise acht Lichtquellen, die über Fasern herangeführt werden , zu vereinigen und , vorteilhaft über eine polarisationserhaltende Glasfaser, dem Mikroskop ( Scankopf ) eines LSM zuzuführen.
In Fig. 3 ist eine mögliche Ausführungsform dargestellt.
Die Lösung stellt eine kompakte, gekapselte, fertig justierte Baugruppe dar, die die
Strahlvereiniger enthält. Die Laserquellen werden über Fasern eingekoppelt und vereinigt über eine Faser ausgegeben, wobei die Ein- und ausgabefasern fest justiert sind, so dass keine Justierung einer Faser zum Strahlvereiniger wie beim Stand der
Technik erfolgen muss.
Die Erfindung ermöglicht einen kompakten Aufbau eines Strahlvereinigers mit Hilfe beispielsweise eines des Cubeo-Fasermulitplexers oder eines vergleichbaren Bauteils.
Es entfallen die Montage- und Justierarbeiten an den Spiegeln und Teilern. Die gekapselte Baugruppe sorgt für einen robusten Aufbau, der resistent gegenüber den
Umwelteinflüssen Temperatur, Staub und Erschütterungen ist und damit deutliche zuverlässiger arbeitet. Von Vorteil ist auch die erhebliche Gewichtsersparnis. Der in sich geschlossene Strahlvereiniger ist technologisch bedingt lasersicher.
Die ursprüngliche Anwendung des Bauteiles der Fa. Cubo in der
Telekommunikationsbranche ermöglicht geringe Herstellkosten.
Werden die Faserkoppelstellen zu den Quellen (Laser) mittels hocheffizienter
Faserstecker realisiert, ist es für den Kunden leicht möglich, eine modular aufgebaute
Quelle ohne Justageaufwand entsprechend gewünschter Applikation eigenständig ohne zusätzliche Hilfestellung eines Servicetechnikers zu tauschen.
Es wird erfindungsgemäß auf die überraschende Verwendung eines (oder mehrerer) kompakter gekapselter Strahlvereiniger in Glasfasertechnik (z.B. der Fa. Cubθhttp://www.cubeoptics.com/impressum.php) in der Laser Scanning Mikroscopy hingewiesen. Derartige Technologien sind auch aus http://www.auxora.com/application.asp bekannt, ihr besonderer Vorteil , der hier beschrieben wird, bei Laser- Scanning- Mikroskopen wurde aber nicht erkannt:
Statt einzelne optischer Elemente jeweils gegeneinander zu justieren wird eine geeignete Halterung mit präzise geführten Anschlägen benutzt, so dass alle Justagen rein passiv erfolgen können (z.B. Multiplexer der Fa. Cubo)
Diese bereits vorhandene Lösung aus der Telekommunikationsindustrie wird explizit für die Laser Scanning Mikroskopie verwendet.

Claims

Patentansprüche
1.
Verfahren zur Laser- Scanning-Mikroskopie, gekennzeichnet durch die Verwendung der Dünnschichttechnologie aus der Telekommunikation bei der Strahlvereinigung von mehreren Lasern unterschiedlicher Wellenlängen und gemeinsamen Einkopplung in ein Laser- Scanning-Mikroskop.
2.
Gekapselter Strahlvereiniger für ein Laser-Scanning-Mikroskop, bestehehend aus Dünnschichtfiltern ( TTF) zur Vereinigung mehrerer Wellenlängen.
3.
Verfahren zur Laser- Scanning-Mikroskopie, gekennzeichnet durch die Verwendung von gekapselten Fasermutiplexern der Telekommunikation bei der Strahlvereinigung von mehreren Lasern unterschiedlicher Wellenlängen und gemeinsamen Einkopplung in ein Laser- Scanning-Mikroskop.
4.
Strahlvereiniger, nach einem der Ansprüche 1-3, wobei aus einem gekapselten Bauteil Lichtleiterführungen herausführen, an die unterschiedliche Laser, vorzugsweise über Lichtleiter, ankoppelbar sind.
5.
Strahlvereiniger nach einem der Ansprüche 1-4, wobei
Eine Vereinigung mindestens der Wellenlängen 405nm, 488nm, 555nm und 635nm und eine Zuführung zu einer polarisationserhaltenden Glasfaser erfolgt.
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