WO2008043459A2 - Anordnung zur aufteilung von detektionslicht - Google Patents

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    • G02B27/145—Beam splitting or combining systems operating by reflection only having sequential partially reflecting surfaces

Definitions

  • a confocal scanning microscope includes a light source module, which preferably consists of a plurality of laser beam sources that generate illumination light of different wavelengths.
  • a scanning device in which the illumination light is coupled as an illumination beam, has a main color splitter, an x-y scanner and a scanning objective to guide the illumination beam by beam deflection over a sample which is located on a microscope stage of a microscope unit.
  • a measurement light beam generated thereby from the sample is directed via a main color splitter and imaging optics to at least one confocal detection aperture (detection pinhole) of a detection channel.
  • FIG. 1 a beam path of a laser scanning microscope is shown schematically.
  • An LSM is essentially divided into 4 modules as shown in FIG. 1: light source, scanning module, detection unit and microscope. These modules are described in more detail below. Reference is additionally made to DE19702753A1.
  • Excitation wavelength depends on the absorption properties of the dyes to be investigated.
  • the excitation radiation is generated in the light source module.
  • Various lasers are used here (argon, argon krypton, TiSa laser).
  • the selection of the wavelengths and the adjustment of the intensity of the required excitation wavelength e.g. through the use of an acousto - optic crystal.
  • the laser radiation passes through a fiber or a suitable mirror arrangement in the scan module.
  • the laser radiation generated in the light source is focused by means of the diffraction-limited diffraction lens via the scanner, the scanning optics and the tube lens into the specimen.
  • the focus scans the sample punctiformly in the x-y direction.
  • the pixel dwell times when scanning over the sample are usually in the range of less than one microsecond to several 100 microseconds.
  • a confocal detection (descanned detection) of the fluorescent light the light passes from the focal plane (Specimen) and from the above and below Layers is emitted via the scanner to a dichroic beam splitter (MD). This separates the fluorescent light from the excitation light. Subsequently, the fluorescent light is focused on a diaphragm (confocal aperture / pinhole), which is located exactly in a plane conjugate to the focal plane. As a result, fluorescent light portions outside the focus are suppressed. By varying the aperture size, the optical depth resolution of the microscope can be adjusted. Behind the aperture is another dichroic block filter (EF) which again suppresses the excitation radiation.
  • EF dichroic block filter
  • the fluorescent light is measured by means of a point detector (PMT).
  • PMT point detector
  • the excitation of dye fluorescence occurs in a small volume where the excitation intensity is particularly high. This area is only marginally larger than the detected area using a confocal array. The use of a confocal aperture can thus be dispensed with and the detection can take place directly after the objective (non-descanned detection).
  • a descanned detection also takes place, but this time the pupil of the objective is imaged into the detection unit (nonconfocally descanned detection).
  • the LSM is therefore suitable for the examination of thick specimens.
  • the excitation wavelengths are determined by the dye used with its specific absorption properties. Dichroic filters tuned to the emission characteristics of the dye ensure that only the fluorescent light emitted by the respective dye is measured by the point detector.
  • connection of the light source modules with the scan module is usually about
  • Fig. 2 the area after the main color splitter in the direction of detection is shown.
  • the secondary color splitters designated as DBS in FIG. 1 are here NFT1 and NFT2, which are the
  • Wavelength-dependent detection radiation in the direction of detectorsDI-
  • Main selection of the wavelength are arranged upstream.
  • NFT1 and 2 and EF 1-3 can be designed as a motorized filter wheels to the flexibility in the setting of detected
  • the pinholes PH1-4 shown in FIG. 1 are not present for reasons of clarity in FIG. 2-5 n, since a pinhole for all beam paths .these vorby executable would be.
  • the emission filters suppress the light outside the selected spectral range
  • Dichroic beam splitters (with significantly lower suppression properties outside their transmissive range of action) for preselection of wavelength ranges, also, also changeable, non-perpendicular, typically less than 45 ° to the optical axis
  • 5 filter wheels are required to detect three spectral ranges, and 5 drives for changing the filters are required for a maximum of variable detection.
  • advantageously coated emission filters have virtually no absorption. These filters reflect all light with wavelengths outside the selected spectral range. It therefore seems possible to use this reflected light for other spectral channels. In order for the reflected light to be able to be separated from the incident light without further filters, the emission filters are easily tilted out of the vertical incidence. A small angle ( «20 °) was found to be particularly advantageous because the spectral properties of typical emission filters (high suppression, steep band edges) can be implemented particularly well for vertical incidence and small angles deviating from the normal incidence.
  • Emission filters NEF 1-3 arranged according to the invention, detectors D1-D3, jet trap S
  • the emission filters are designed such that they transmit a defined part of the light radiation and reflect the rest almost completely.
  • they are arranged at an angle other than 90 degrees in the beam path, which realizes an angle of incidence on the non-zero-degree filter
  • a downstream, preferably switchable, emission filter follows in front of the detector with the following advantages:
  • the reflected light from the downstream filter can also be used.
  • the unused portion of the spectrum may also be directed into a beam trap S. Detection of the light with another detector e.g. for control purposes is also conceivable.
  • Fig. 4 shows a simple structure without downstream filters:
  • the filters can also be switched interchangeable:
  • Fig. 5 shows fixed filters for main selection, additional switchable filters, preferably long and short passes, for narrowing the spectra of the fixed filters:
  • Fig. 6 shows an arrangement with arranged in the beam path "conventional" emission filter wheels NEF 1-3.
  • arrangements with 3 channels have always been shown here, but it is also possible for only two or any number of channels.

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Abstract

Anordnung zur Aufteilung von Detektionslicht in einem Laser-Scanning-Mikroskop, wobei eine spektrale Separierung unterschiedlicher Spektralanteile in transmittierte und ausgeblendete Anteile erfolgt, wobei die Aufteilung durch mindestens einen in einem Winkel ungleich 90 und Null Grad zur optischen Achse verkippten beschichteten Filter erfolgt, wobei der Winkel zur optischen Achse weniger als 20 Grad, vorteilhaft weniger als 10 Grad von der optischen Achse abweicht.

Description

Anordnung zur Aufteilung von Detektionslicht
In einem Laser-Scanning-System werden Laser unterschiedlicher Leistungsklassen verwendet. Weiterhin ist ein Laser-Scanning-System durch eine grosse Anzahl von variablen Modulen gekennzeichnet, die als Detektor oder zur Beleuchtung dienen. Ein konfokales Scanmikroskop enthält ein Lichtquellenmodul , das bevorzugt aus mehreren Laserstrahlquellen besteht, die Beleuchtungslicht unterschiedlicher Wellenlängen erzeugen. Eine Scaneinrichtung , in die das Beleuchtungslicht als Beleuchtungsstrahl eingekoppelt wird, weist einen Hauptfarbteiler , einen x-y-Scanner und ein Scanobjektiv auf, um den Beleuchtungsstrahl durch Strahlablenkung über eine Probe zu führen, die sich auf einem Mikroskoptisch einer Mikroskopeinheit befindet. Ein dadurch erzeugter von der Probe kommender Messlichtstrahl wird über einen Hauptfarbteiler und eine Abbildungsoptik auf mindestens eine konfokale Detektionsblende (Detektionspinhole) eines Detektionskanals gerichtet.
In Fig. 1 ist schematisch ein Strahlengang eines Laser-Scanning-Mikroskopes dargestellt. Ein LSM gliedert sich im wesentlichen wie in Fig. 1 dargestellt in 4 Module: Lichtquelle, Scanmodul, Detektionseinheit und Mikroskop. Diese Module werden im folgenden näher beschrieben. Es wird zusätzlich auf DE19702753A1 verwiesen.
Zur spezifischen Anregung der verschiedenen Farbstoffe in einem Präparat werden in einem LSM Laser mit verschiedenen Wellenlängen eingesetzt. Die Wahl der
Anregungswellenlänge richtet sich nach den Absorptionseigenschaften der zu untersuchenden Farbstoffe. Der Anregungsstrahlung wird im Lichtquellenmodul erzeugt. Zum Einsatz kommen hierbei verschiedene Laser (Argon, Argon Krypton, TiSa-Laser). Weiterhin erfolgt im Lichtquellenmodul die Selektion der Wellenlängen und die Einstellung der Intensität der benötigten Anregungswellenlänge, z.B. durch den Einsatz eines akusto - optischen Kristalls. Anschließend gelangt die Laserstrahlung über eine Faser oder eine geeignete Spiegelanordnung in das Scanmodul.
Die in der Lichtquelle erzeugte Laserstrahlung wird mit Hilfe des Objektivs beugungsbegrenzt über die Scanner, die Scanoptik und die Tubuslinse in das Präparat fokussiert. Der Fokus rastert punktförmig die Probe in x-y-Richtung ab. Die Pixelverweilzeiten beim Scannen über die Probe liegen meist im Bereich von weniger als einer Mikrosekunde bis zu einigen 100 Mikrosekunden.
Bei einer konfokalen Detektion (descanned Detection) des Fluoreszenzlichtes, gelangt das Licht das aus der Fokusebene (Specimen) und aus den darüber- und darunterliegenden Ebenen emittiert wird, über die Scanner auf einen dichroitischen Strahlteiler (MD). Dieser trennt das Fluoreszenzlicht vom Anregungslicht. Anschließend wird das Fluoreszenzlicht auf eine Blende (konfokale Blende / Pinhole) fokussiert, die sich genau in einer zur Fokusebene konjugierten Ebene befindet. Dadurch werden Fluoreszenzlichtanteile außerhalb des Fokus unterdrückt. Durch Variieren der Blendengröße kann die optische Tiefenauflösung des Mikroskops eingestellt werden. Hinter der Blende befindet sich ein weiterer dichroitischer Blockfilter (EF) der nochmals die Anregungsstrahlung unterdrückt. Nach Passieren des Blockfilters wird das Fluoreszenzlicht mittels eines Punktdetektors (PMT) gemessen. Bei Verwendung einer Mehrphotonen-Absorption erfolgt die Anregung der Farbstofffluoreszenz in einem kleinen Volumen an dem die Anregungsintensität besonders hoch ist. Dieser Bereich ist nur unwesentlich größer als der detektierte Bereich bei Verwendung einer konfokalen Anordnung. Der Einsatz einer konfokalen Blende kann somit entfallen und die Detektion kann direkt nach dem Objektiv erfolgen (non descannte Detektion).
In einer weiteren Anordnung zur Detektion einer durch Mehrphotonenabsorption angeregten Farbstofffluoreszenz erfolgt weiterhin eine descannte Detektion, jedoch wird diesmal die Pupille des Objektives in die Detektionseinheit abgebildet (nichtkonfokal descannte Detektion).
Von einem dreidimensional ausgeleuchteten Bild wird durch beide Detektionsanordnungen in Verbindung mit der entsprechenden Einphotonen bzw. Mehrphotonen-Absorption nur die Ebene (optischer Schnitt) wiedergegeben, die sich in der Fokusebene des Objektivs befindet. Durch die Aufzeichnung mehrerer optische Schnitte in der x-y Ebene in verschiedenen Tiefen z der Probe kann anschließend rechnergestützt ein dreidimensionales Bild der Probe generiert werden.
Das LSM ist somit zur Untersuchung von dicken Präparaten geeignet. Die Anregungswellenlängen werden durch den verwendeten Farbstoff mit seinen spezifischen Absorptionseigenschaften bestimmt. Auf die Emissionseigenschaften des Farbstoffes abgestimmte dichroitische Filter stellen sicher, dass nur das vom jeweiligen Farbstoff ausgesendete Fluoreszenzlicht vom Punktdetektor gemessen wird.
In biomedizinischen Applikationen werden zur Zeit mehrere verschiedene Zellregionen mit verschiedenen Farbstoffe gleichzeitig markiert (Multifluoreszenz). Die einzelnen Farbstoffe können mit den Stand der Technik entweder aufgrund verschiedener Absorptionseigenschaften oder Emissionseigenschaften (Spektren) getrennt nachgewiesen werden. Dazu erfolgt eine zusätzliche Aufspaltung des Fluoreszenzlichts von mehreren Farbstoffen mit den Nebenstrahlteilem (DBS) und eine getrennte Detektion der einzelnen
Farbstoffemissionen in getrennten Punktdetektoren (PMT x).
Das LSM LIVE der Carl Zeiss Micolmaging GmbH realisiert einen sehr schnellen
Linienscanner mit einer Bilderzeugung um 120 Bildern pro Sekunde
(http://www.zeiss.de/c12567be00459794/Contents-
Frame/fd9fa0090eee01a641256a550036267b).
Die Verbindung der Lichtquellenmodule mit dem Scanmodul erfolgt in der Regel über
Lichtleitfasern.
Das Einkoppeln mehrerer unabhängiger Laser in eine Faser zur Übertragung zum Scankopf wurde beispielsweise in Pawley : „ Handbook of Confocal Microskopy „ , Plenum Press,
1994, Seite 151 sowie in DE19633185 A1 beschrieben.
In Fig. 2 ist der Bereich nach dem Hauptfarbteiler in Richtung der Detektion dargestellt.
Die in Fig.1 als DBS bezeichneten Nebenfarbteiler sind hier NFT1 und NFT2, die die
Detektionsstrahlung wellenlängenabhängig ( Vorselektion) in Richtung von DetektorenDI-
D3, denen noch vorzugsweise motorisch wechselbare Emissionsfilter EF1-EF3 (
Hauptselektion der Wellenlänge) vorgeordnet sind.
In Fig. 3 ist dargestellt, dass NFT1 und 2 sowie EF 1-3 als motorisch betriebene Filterräder ausgebildet sein können, um die Flexibilität bei der Einstellung von detektierten
Wellenlängenbereichen zu optimieren.
Die in Fig. 1 dargestellten Pinholes PH1-4 sind aus Gründen der Anschaulichkeit in Fig. 2-5 n nicht vorhanden, da auch ein Pinhole für alle Teilstrahlengänge .diesen vorangesetzt ausführbar wäre.
Emissionsfilter und dichroitische Strahlteiler wurden nach dem Stand der Technik bisher unterschiedlich eingesetzt:
• Emissionsfilter im Strahlengang vor dem Detektor zur Auswahl der detektierten Wellenlängen, senkrecht zur optischen Achse angeordnet.
Gleichzeitig unterdrücken die Emissionsfilter das Licht außerhalb des gewählten Spektralbereiches
• Dichroitische Strahlteiler ( mit deutlich schwächeren Unterdrückungseigenschaften ausserhalb ihres transmissiven Wirkungsbereiches) zur Vorselektion von Wellenlängenbereichen, ebenfalls , auch wechselbar, nicht senkrecht, typisch unter 45° zur optischen Achse angeordnet Zum Erreichen der in Fig. 2 nach dem Stand der Technik dargestellten Flexibilität sind zur Detektion von drei Spektralbereichen 5 Filterräder und bei maximal variabler Detektion auch 5 Antriebe zum Wechseln der Filter erforderlich. Daneben gibt es einen hohen Platzbedarf für die benötigten Elemente.
Dieser hohe Aufwand soll durch die Erfindung reduziert werden.
Erfindungsgemäss wurde erkannt, dass vorteilhaft beschichtete Emissionsfilter praktisch keine Absorption aufweisen. Diese Filter reflektieren alles Licht mit Wellenlängen außerhalb des selektierten Spektralbereiches. Es scheint daher möglich, dieses reflektierte Licht für weitere spektrale Kanäle zu nutzen Damit das reflektierte Licht vom einfallenden Licht ohne weitere Filter getrennt werden kann, werden die Emissionsfilter leicht aus dem senkrechten Einfall heraus gekippt. Ein kleiner Winkel (« 20°) wurde dabei als besonders vorteilhaft erkannt, weil die spektralen Eigenschaften typischer Emissionsfilter (hohe Unterdrückung, steile Bandkanten) sich für senkrechten Einfall und kleine vom senkrechten Einfall abweichende Winkel sich besonders gut realisieren lassen.
Weiterhin erfolgt mit den Filtern eine Transmission des nicht reflektierten Strahlanteils mit hoher Unterdrückung der nicht erwünschten Strahlung (vorteilhaft grösser 10"3) in diesem
Bereich.
Durch diese Anordnung ergibt sich vorteilhaft die Möglichkeit einer einfacheren, kompakteren und kostenreduzierten „Kaskadierung" der Detektionskanäle in einer oder mehreren Ebenen.
Die Erfindung wird nachstehend anhand der Fig.4, 5 und 6 näher beschrieben.
Es zeigen:
Fig. 4:
Erfindungsgemäss angeordnete Emissionsfilter NEF 1-3, Detektoren D1-D3, Strahlfalle S
Fig.5:
Die NEF 1-3 jeweils auf Filterrädern zur Auswechslung
Fig. 6:
Zusätzliche schaltbare Filter F1-3 im Strahlengang von Fig. 4.
Erfindungsgemäss sind die Emissionsfilter so ausgebildet, dass sie einen definierten Teil der Lichtstrahlung transmittieren und den Rest nahezu vollständig reflektieren. Zu diesem Zweck sind sie in einem Winkel ungleich 90 Grad im Strahlengang angeordnet, der einen Einfallswinkel auf dem Filter von ungleich null Grad realisiert
Es erfolgt also eine Gestaltung der Emissionsfilter so, dass reflektiertes Spektrum noch genutzt werden kann:
- Reflektion des noch gewünschten Restspektrums
Nicht gewünschtes Restspektrum kann absorbiert werden
Einfallswinkel abweichend von 0°, aber noch klein (typischerweise 10°, auf jeden Fall deutlich kleiner 45°) kleiner Einfallswinkel garantiert nahezu gleiche Eigenschaften für s- und p- polarisiertes Licht sowie hocheffiziente Unterdrückung der nicht gewünschten
Spektralbereiche in Transmission.
In einem weiteren Schritt erfolgt ein Nachschalten eines zweiten vorzugsweise schaltbaren Emissionsfilters vor dem Detektor mit folgenden Vorteilen :
- Erhöhung der Flexibilität, mit dem Filter kann Spektralbereich weiter eingeschränkt werden
- Zur einseitigen Einengung des Spektrums reicht ein zusätzlicher Kurz- bzw. Langpaß, das ergibt zusammen mit dem vorgeschalteten Filter ein Bandpaß und ist kostengünstiger als zwei schaltbare Bandpässe
Das reflektiertes Licht vom nachgeschalteten Filter kann ebenfalls genutzt werden.
Der ungenutzte Teil des Spektrums kann auch in eine Strahlfalle S geleitet werden. Eine Detektion des Lichts mit einem weiteren Detektor z.B. für Kontrollzwecke ist ebenfalls denkbar.
Abb. 4 zeigt einen einfachen Aufbau ohne nachgeschaltete Filter: Die Filter können auch wechselbar geschaltet werden:
Abb. 5 zeigt feste Filter zur Hauptselektion, zusätzlich schaltbare Filter, vorzugsweise Lang- und Kurzpässe, zur Einengung der Spektren der festen Filter:
Abb. 6 zeigt eine Anordnung mit im Strahlengang angeordneten „ üblichen „ Emissionsfilterrädern NEF 1-3. Beispielhaft wurden hier immer Anordnungen mit 3 Kanälen gezeigt, es können aber auch nur zwei oder beliebig viele Kanäle sein.

Claims

Patentansprüche
1. Anordnung zur Aufteilung von Detektionslicht in einem Laser-Scanning-Mikroskop, wobei eine spektrale Separierung unterschiedlicher Spektralanteile in transmittierte und ausgeblendete Anteile erfolgt, dadurch gekennzeichnet dass die Aufteilung durch mindestens einen in einem Winkel ungleich 90 und Null Grad zur optischen Achse verkippten beschichteten ersten Filter erfolgt.
2. Anordnung nach Anspruch 1, wobei der Winkel zur optischen Achse weniger als 20 Grad, vorteilhaft weniger als 10 Grad von der optischen Achse abweicht.
3. Anordnung nach Anspruch 1 oder 2,
Wobei der Filter zur Aufteilung eine für Emissionsfilter typische Unterdrückung der ausgeblendeten Spektralanteile von > 10'3 aufweist.
4. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei dem ersten Filter mindestens in der Richtung der ausgeblendeten Strahlung mindestens ein zweiter Filter nachgeordnet ist.
5. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine kaskadenförmige Aufspaltung des Detektionslichtes mindestens in einer Ebene erfolgt, durch die die optische Achse führt.
6. Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei dem ersten oder zweiten Filter nachgeordnete Emissionsfilter zur Einengung des transmittierten Spektrums vorgesehen sind.
7. Anordnung nach Anspruch 6, wobei der nachgeordnete Emissionsfilter ist Lang- oder Kurzpaß ist und mit dem vorgeschalteten Filter einen Bandpaß bildet.
8. Laser-Scanning-Mikroskop mit mindestens einer Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche.
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