WO2008014861A1 - Verfahren und vorrichtung zur authentifizierung von mit einer markierung versehenen gegenständen - Google Patents

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WO2008014861A1
WO2008014861A1 PCT/EP2007/005884 EP2007005884W WO2008014861A1 WO 2008014861 A1 WO2008014861 A1 WO 2008014861A1 EP 2007005884 W EP2007005884 W EP 2007005884W WO 2008014861 A1 WO2008014861 A1 WO 2008014861A1
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fluorescence signal
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Christian Wolfrum
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for authentication of articles provided with a marking.
  • WO 01/51652 A2 discloses a method in which an object for authentication with a forgery-proof. Mark is provided.
  • the marker consists of a first nucleic acid, which is arranged in the form of firstinstitunelenente. To identify the marking, a partial pattern formed by the first surface elements is made visible.
  • the first nucleic acid is brought into contact with a complementary second nucleic acid.
  • fluorescence is observable.
  • additional second surface elements which contain a third nucleic acid can be provided in addition to the first surface elements.
  • the third nucleic acid is not complementary to the second nucleic acid. There is no hybridization between the second and third nucleic acids. A measurement of the fluorescence of the second surface elements makes it possible to determine the background fluorescence.
  • WO 02/072878 A1 describes a method in which an object for authentication is provided with a marking.
  • the marking comprises a first and a second area element.
  • the first surface element is impregnated with a predetermined first and the second surface element with a predetermined third nucleic acid.
  • the first and second surface elements are brought into contact with a detection solution.
  • the after- maschinel ⁇ sun ⁇ contains eir.e-complementary to the first nucleic acid ko m second nucleic acid which is a- Fiu ⁇ rophor rr.it rarkiert.
  • second nucleic acid is an increased fluorescence signal observable.
  • a contact of the second and the third nucleic acid in the second surface element leads to no hybridization. There is no increased fluorescence observable there.
  • the measurement of the fluorescence in the first and second surface element makes it possible to identify the marking.
  • the second nucleic acid used is usually a nucleic acid having a hairpin structure, at the first free end of which the fluorophore and at its opposite second free end a quencher are bound in a distance which deletes a fluorescence signal.
  • the hairpin structure opens because of the desired hybridization and the spatial relationship between the fluorophore and the quencher is dissolved. As a result, the fluorescence signal is observable.
  • the object of the invention is to eliminate the disadvantages of the prior art.
  • a method for the authentication of objects provided with a marking which method is as simple as possible, should be specified, which is distinguished by improved security against forgery and reliability.
  • a device suitable for carrying out the method should be specified.
  • a method of authenticating tagged articles, wherein the tag contains a tag nucleic acid comprising the steps of:
  • a detection compound which is separate from the reference solution and which contains an at least partially double-stranded detection nucleic acid in which one of the two detection nucleic acid strands is at least partially complementary to the marking nucleic acid, and wherein one detection nucleic acid strand is a second fluorophore and the other
  • the authenticity of the opponent star who.- (i) in the step ILz. c2), at least one expected first property of the first fluorescence signal is unobservable, and (ii) the second fluorescence signal observed in step d ⁇ ) corresponds to at least one expected, second property of the second fluorescence signal ,
  • the two reference nucleic acid strands of the reference nucleic acid are not complementary to the tag nucleic acid.
  • the double-stranded structure of the reference nucleic acid remains intact.
  • a first fluorescence signal is not observable or does not exceed a predetermined threshold.
  • substances such as acids, bases or the like., Contaminated or have been applied for the purpose of counterfeiting or contacting the detection solution with the label under conditions such as too high a temperature takes place.
  • the expected first property of the first fluorescence signal is observable. It is Z. 3. a fluorescence intensity observable, which exceeds the predetermined threshold. This indicates that there is a false positive measurement. It can thus be ensured in a simple, safe and reliable way a high reliability and security against forgery of the process.
  • the one detection nucleic acid strand is, at least to the extent that it is partially complementary to the marker nucleic acid, that when the marker nucleic acid is contacted with the one detection nucleic acid strand, hybridization takes place under predetermined conditions. None of the detection nucleic acid strands is complementary to the reference nucleic acid kleir.klarescrär.gen.
  • the hybridization of the proof-seric acid stratosphere with the carcinogenic acidic acid makes the spatial relationship between the. second. Quencher ur.d the sais ⁇ er. Repealed fluorophore. As a result, upon irradiation of light onto the second fluorochor, it will produce observable fluorescence.
  • the marker is conveniently fixedly attached to the surface of the article. To authenticate the counter, it is not necessary to remove the flag.
  • the marking may be in place, i. H. be identified in their attached to the surface of the article state. This makes the proposed method particularly easy to carry out.
  • the labeling nucleic acid is advantageously first brought into contact with the reference solution and the first fluorescence signal possibly emitted by the label is observed. If the first fluorescence signal exceeds a certain threshold value, this indicates that the marker is contaminated or there are inadmissible test conditions. In this case, it is no longer necessary to subsequently bring the marker nucleic acid into contact with the detection nucleic acid.
  • a particular advantage of the proposed method is that for observing the first and / or second fluorescence signal, a conventional fluorescence hand-held reader or a conventional fluorescence measuring device can be used, with which in particular the intensity of the observed fluorescence signal can be detected quantitatively.
  • the first fluorophore and the first quencher are in the region of one End of Referer.zr.ukleir.saure bound.
  • the second fluorophore and the second quencher may be i. ⁇ . Be bound to one end of the i- ⁇ chweisnuklein ⁇ äure.
  • This enables on-site authentication of the tag. Furthermore, it can be ensured in practice that substantially the same reaction conditions are present for carrying out the abovementioned steps.
  • the steps lit. cl) and lit. c2) and the steps lit. dl) and lit. d2) are conveniently carried out at ambient temperature. In particular, it is not necessary to set special temperatures which deviate from the ambient temperature.
  • the detection nucleic acid is present in a hairpin structure in which the detection nucleic acid has two mutually complementary branches.
  • the reference nucleic acid can also be present in a hairpin structure in which the reference nucleic acid strands have two mutually complementary branches.
  • the proposed self-complementary detection and / or reference nucleic acids are particularly suitable for detecting the label nucleic acid or optionally false positive signals generating substances or conditions.
  • the Welier.ianger.- range includes such wavelengths, rr.it which the first and / or second Flucrophcr for generating a first and / or a second fluorescence signal can be excited.
  • the intensities of the fluorescence signals can be clearly increased compared to the background and thus a particularly safe and reliable measurement can be ensured.
  • the mark can be applied to a light-reflecting surface.
  • both the detection and the reference solution are applied to a single detection field of the marking containing the marking nucleic acid.
  • the detection of the fluorescence can be simplified.
  • a predetermined volume of the detection and / or the reference solution is applied to the marking.
  • a given volume can be applied with suitable liquid application devices.
  • a pipette or a first pin containing the detection solution and a second pin containing the reference solution can be used for this purpose.
  • the use of such liquid application devices simplifies handling and enables rapid on-site detection.
  • At least one predetermined expected property of the first and second fluorescence signals is measured in each case.
  • the expected first property of the first fluorescence Signal eir.e given first maxia. ⁇ .alir.ter.sity in a-p. first. Weller.Iar.gen Colour ⁇ ⁇ r. ⁇ the expected second property a predetermined second Mir.destir.ter.stician m a second. Be Wellenlär.ger. Kunststoff.
  • the first and second fluorophores also differ with regard to the wavelength of the first and second fluorescence signals generated thereby.
  • the first and the second Fiuorophor are identical.
  • the first and the second quencher can be identical.
  • the excitation may occur both after the application of the reference solution and after the application of the detection solution with the same wavelength range, ie. H. done with the same excitation light source.
  • the observation of the emitted fluorescence can also be carried out with one and the same fluorescence detection device.
  • the technical complexity for the quantitative measurement or observation of the fluorescence can be reduced.
  • the first and second fluorescence signals can be detected, for example, with a fluorescence hand-held reader.
  • the fluorescence hand-held reader is placed on the marking, generates light for excitation of the first and / or second fluorophore and fluoresces emitted by the marking. res: he, 2 cesrirrinr. ⁇ s can ir to a given each. Weller.langer. Schl successively the intensities of the first and second. Fluceszenzsignale be detected * .
  • the external intensities may be compared to expected values and, if they agree with the expected values, be authenticated and, if they do not match the expected values, be evaluated as unauthenticated.
  • the expected value may be a ratio between an expected first and second intensity.
  • a ratio it is also possible to use a difference or another combination of expected values or properties with the measured properties for detecting the intensity of the marking.
  • the aforementioned expected values can be obtained by serial measurements on intact markings and on contaminated markings.
  • the method according to the invention it is advantageously only necessary that. observe fluorescence emitted by the single detection field.
  • the detection of the labeling can be carried out by applying the detection solution to the marking field as well as to the reference field and observing both the fluorescence emitted by the marking field and by the reference field.
  • the fluorescence emitted by the reference field reflects the background fluorescence. By doing this the background reszer.z reproducing signal r.it the. in front.
  • the Markersur.gsfeie m itt convinced Fluoreszer.zsigr.al is set, a particularly reliable authentication of the mark can be done.
  • the label contains at least one further nucleic acid, which is neither complementary to the detection nucleic acid strands nor to the reference nucleic acid strands.
  • the further nucleic acid may be present in excess in the marker relative to the labeling nucleic acid.
  • the further nucleic acid serves to hide the nucleic acid of the labeling or to make it impossible for it to be isolated from the label by unauthorized persons. This further increases the counterfeiting security of the marking.
  • the further nucleic acid it may be, for. B. order
  • Calf thymus DNA synthetic oligonucleotides with random sequences, tRNA, herring sperm DNA or plant DNA.
  • a marker containing the marker nucleic acid and / or the further nucleic acid is used as marker. It has surprisingly been found that a reliable proof of the authenticity of the article can also be achieved if the marker nucleic acid is contained in a printing ink. By printing the printing ink containing the marking nucleic acid, it is possible in a particularly simple and cost-effective manner to produce a marking which is initially unrecognizable to the layman, for example on documents, bills, tickets or the like.
  • the marking can be applied by a printing process to the object to be marked or to a, preferably self-adhesive, label.
  • the label is suitably It is not destructive before.
  • Object can be solved.
  • a mark can be produced inexpensively.
  • label nucleic acid 0.01 to 1.0 pmol of label nucleic acid is suitably used.
  • Such low levels of label nucleic acid are difficult to isolate, analyze, and mimic for counterfeiters. This applies in particular if the marker nucleic acid is present in a mixture with at least one further nucleic acid in the marker.
  • the detection solution To detect the marker nucleic acid, it is only necessary to apply a few microliters of the detection solution to the label.
  • defined predetermined volumes of the reference and detection solution are applied to the marking. This ensures that the expected first and second fluorescence signals are in a narrow intensity range.
  • a first fluid scavenger device containing the reference solution, wherein the referee contains at least partially double-stranded reference nucleic acid of which the reference radiofluoric acid has a predetermined polarity.
  • cation nucleic acid are not complementary, and wcbei a ReferenznukleinTalkrestrang a first fluorophore and the other Referenznukleinklarestrang a first quencher in a in a first fluorescence signal of the first fluorine lo- se- seen distance are-seeing distance, and a detection solution containing second liquid donating device, wherein the detection solution at least partially double-stranded Detection nucleic acid contains, in which one of the two Nachwiesnukleinklarfite at least partially complementary to the predetermined marker nucleic acid is complementary, and wherein on a detection nucleic acid strand, a second Fluoro phor and at the other detection nucleic acid strand a second quencher are bound in a second fluorescence signal of the second fluorophore quenching distance.
  • the first and second liquid dispensing devices are each a pen or pipette containing the detection or reference solution.
  • a liquid dispensing device with a first container for receiving the reference solution according to the invention and a second container for receiving the detection solution according to the invention and a device for temporally successive separate delivery of a predetermined volume of the reference and the detection solution.
  • the liquid dispensing device can be a double pipette, which is provided with a suitable mechanism, upon actuation of which a predetermined volume of reference rer.zl ⁇ sur.g and in whose err.eu ⁇ er operation below a predetermined volume of N'ach Stammown is delivered. This simplifies the handling of the proof. A confusion of the order of application of the reference and the proof solution is darr.it. excluded screened ⁇ ESEI ⁇ ig.
  • the marked item is preferably goods, goods, packaging and documents. In particular, these may be branded products, means of payment, chip cards or packaging for it.
  • the to be authenticated is preferably goods, goods, packaging and documents. In particular, these may be branded products, means of payment, chip cards or packaging for it.
  • the product is placed in the free movement of goods by manufacturers and is therefore subject to a potential risk of counterfeiting. If necessary, the authenticity of the object can be reliably and reliably determined using the method according to the invention. For this purpose, it is only necessary to apply the detection solution recorded, for example, in a felt-tip pen to the marking and then observe the fluorescence emitted by the marking with a fluorescence hand-held reader, analyze it or compare it with predefined expected values and, as a result of the comparison, verify the authenticity to determine the mark.
  • 1 shows schematically a labeling, detection and a reference nucleic acid
  • Fig. 1 shows scherr.atiser. a marker.gs- M, a proof N'cnc. a Referenznukiein Textre R.
  • the Xach Stammnuklemklare N and the Referenznukiein Textre R are each formed in the manner of a Molecular 3eacon.
  • the detection nucleic acid N comprises a Kaarnadel für, at the free ends of a first fluorophore Fl and a first quencher Ql are bound in a fluorescence of the first fluorophore Fl deleting distance.
  • the reference nucleic acid R comprises a hairpin structure at the free ends of which a second fluorophore F2 and a second quencher Q2 are bound in a distance which deletes the fluorescence of the second fluorophore F2.
  • the detection nucleic acid N is at least partially complementary to the marker nucleic acid M.
  • the hybridization occurs.
  • the fluorescence of the first fluorophore Fl deleting distance in the first quencher Ql - is canceled.
  • fluorescence is observable.
  • the reference nucleic acid R is not complementary to the marker nucleic acid M.
  • a marker 1 contains a marker nucleic acid M.
  • the mark is no Storstcffe er.rr.alt ji exposed to ur.z-lassig high temperatures, the original structure of a Referenznuklemsaure R is maintained. No or only a weak second fluorescence signal is observable.
  • a detection solution containing a detection nucleic acid N is subsequently applied to the marking 1.
  • the detection nucleic acid N hybridizes with the marker nucleic acid M.
  • the spatial relationship between the first fluorophore and the first quencher is abolished.
  • a first fluorescence signal can be observed, by means of which the authenticity of the label 1 can be recognized.
  • the label 1 contains no Mark istsnuklemsaure M. It is free of interferents and is at ambient temperature. In this case, due to a lack of hybridization with the detection nucleic acid N, the spatial structure of the detection nucleic acid N is not changed. In this case, only a weak fluorescence signal is observable. The mark is not considered authentic in this case.
  • Fig. 2c shows a third reaction variant.
  • the marker 1 here contains the marker nucleic acid M. Furthermore, the marker 1 contains interfering substances, for example NaOH.
  • the hairpin structure of the reference nucleic acid R is destroyed as a result of the prevailing pH. In this case, a clear fluorescence signal is observable.
  • Verées.sscr.rit ⁇ observable visualization signal indicates that the authenticity of the r.icht mark is verifiable. Scfern in a second process step the additional Nachweislcsung r.it the mark m is contacted hybridizes Nacr.weisr.
  • the fluorescence signal is composed both of the fluorescence signals generated by the reference nucleic acid R and by the detection nucleic acid N.
  • the intensity of the fluorescence signals is so strong that it exceeds a predefined limit value mark 1 is again considered non-authentic.
  • FIGS. 3a to 3e show the steps of the method according to the invention schematically in FIGS. 3a to 3e.
  • Fig. 3a shows the marker 1 of the invention with a single marker field.
  • the marker field consists essentially of a printed ink containing marker nucleic acid M.
  • a reference solution is applied to the marking field using a first pin 2.
  • the marking field is illuminated with an excitation light source 3 and the fluorescence possibly excited thereby by means of a
  • Fluorescence measuring device 4 observed. With the fluorescence measuring device 4, it is possible, in particular, to quantitatively determine an intensity of the fluorescence emitted by the marking surface.
  • 5 detection solution is then applied to the single marking field using a second pin.
  • the following will again be described using the Regur.gsiichtario 3 and the Flucreszer.z ⁇ .esse ⁇ r.richrur.g 4 voT. Markierur.gsfelc quantitatively detected fluorescence emitted.
  • the fluorescence measuring instruments are available from the Reich.richüur.g 4 kar.r. rp.it eir.er more suitable. Be provided evaluation in which thresholds and limits are stored. Thus, it can be determined automatically based on the measured fluorescence intensities, whether the tested mark is authentic or not.
  • nucleic acid In a conventional printing ink (UV ink from Wolke Inks and Printers GmbH, Hersbruck, Germany, Art. No. 690900), a nucleic acid according to Sequence Listing No. 1 (5 1 - AAGCCTGGAGGGATGATACTTTGCGCTTGG-3 ') in a concentration of 1 mg / ml.
  • the label nucleic acid was prepared by standard amidite solid phase synthesis.
  • the ink is z. B. in the inkjet printing process on a support, for. B white paper, a suitable plastic film or the like.
  • a printer for. Example, by means of the printer m600 the company Wolke Inks and Printers GmbH, Hersbruck, Germany, printed on an area of 4 mm x 3 mm. From a thus printed carrier, a, preferably self-adhesive, label can be produced.
  • Control labels without label nucleic acid were prepared by printing the ink without the addition of label nucleic acid. Proof of the label
  • the article was referenced to ten marks. The reference was to this. Purpose in one. first pin which transmits reference solution to the marking upon contact with the mark.
  • the reference solution is an aqueous liquid in which the reference nucleic acid is a nucleic acid according to Sequence Listing No. 3 (5'-FAM-CCG AGC CAC CAA AAA TGA TAT GCT CGG-3'-DABCYL) in a concentration of each 1 ⁇ Mol / i in TEN (10 mM TrisCl, pH 8, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.19% SDS (w / v)).
  • the detection solution was applied to the label.
  • the detection solution is an aqueous liquid in which the detection nucleic acid is a nucleic acid according to Sequence Listing No. 2,5-FAM-
  • CCAAGCGCAAAGTATCATCCCTCCAGGCTTGG-DABCYL- is included. This is partially complementary to the marker nucleic acid contained in the marker according to Sequence Listing No. 1.
  • the detection nucleic acid was also present in a concentration of 1 ⁇ mol / l in TEN (10 mM 2-amino-2- (hydroxylmethyl) -1,3 propanediol (TRIS), pH 8; 1mM EDTA, 100mM NaCl, 0.1% SDS (w / v)). After application of the detection solution, the second fluorescence signal possibly generated by the detection nucleic acid sequence has been measured or observed.
  • a second fluorophore / quencher pair is bound at a distance which quenches a fluorescence signal generated by the second fluorophore.
  • the second fluorophore may be, for example, a fluorescent group or a derivative thereof; the second quencher can be, for example, dabcyl or a blackhole quencher (Jena Bioscience GmbH, Loebstedter Strasse 80, D-07749 Jena, Germar.y).
  • Further suitable Kcrr.bir.aticr.en for fluorophore / Que ⁇ chercontract ⁇ are z. 3. ir.
  • the detection and reference nucleic acids were prepared by standard amidite solid-phase synthesis.
  • the labeling nucleic acid in the present example is terminally self-complexinear and is present in a hairpin structure.
  • Wavelength at 492 nm a low fluorescence signal at 517 nm is observable, which is caused in particular by the intrinsic fluorescence of the labeling nucleic acid.
  • the measurement is preferably carried out a few seconds to minutes after contact with the reference solution.
  • the measurement can be carried out with the aid of a fluorescence handheld reader. This enables a proof on the marked object. Fluorescence handheld readers with the required properties can be purchased from identif GmbH, Er Siemens.
  • Table 1 shows the evaluation of ten marks after the application of the reference and detection nucleic acids.
  • the value for the fluorescence of the detection nucleic acid acid at 517 r.t. indicated.
  • labels ir.it and without marker acid were used.
  • labels were used for labeling nucleic acid which was not interfered with. (Labeling nucleic acid - NaOH) were added.
  • the value for the reference nucleic acid is in a narrow range around the mean value of 283.
  • This value corresponds to the closed structure of the reference nucleic acid, in which the first fluorophore and first quencher are closely adjacent through the hybridization with the detection nucleic acid (column left: signals + label nucleic acid)
  • the value for the detection nucleic acid is in a narrow range around the mean value of 548.
  • This value corresponds to the open structure of the detection nucleic acid, in which the second fluorophore and the second quencher are spatially separated by the hybridization with the complementary labeling nucleic acid.
  • the above value also contains the signal generated by the closed structure of the reference nucleic acid (right column: signals + label nucleic acid).
  • Labeling nucleic acid + NaOH columns used printed labels without label nucleic acid containing before contact with the reference and detection fluid.
  • C 5 ul of a 1 molar NaCH solution were added.
  • the feeder here is to simulate a possible disturbance of the mark.
  • the value for the referential nucleic acid lies in the range about the mean of 488. This value corresponds to the opened structure of the reference nucleic acid, in which the first fluorophore and the first quencher are spatially separated due to the denaturation due to the alkaline pH.
  • the value after application of the detection solution varies by a mean value of 710. This value corresponds to the sum of the signals from the opened structure of the reference nucleic acid and the detection nucleic acid. Due to the denaturing effect of the alkaline pH, the detection nucleic acid is also present in the opened structure.
  • the clear separation of the fluorescence values in the presence and absence of the label nucleic acid makes it possible to establish expected values for assessing the authenticity of the label. For example, for the evaluation of the label, an expected value of above 350 for the detection nucleic acid and an expected value below 350 for the reference nucleic acid can be determined. Both criteria must be considered authentic for a rating of the tag. According to these criteria, all markers containing tag nucleic acid (Table 1, signals + tag nucleic acid) are considered authentic, since all values for the detection nucleic acid are above 350 and all values for the reference nucleic acid are below 350.
  • the fluorescence value of the reference nucleic acid increases to values above the expected value for the reference nucleic acid (Table 1, column mark nucleic acid + NaOH). Exceeding the expected value for the reference nucleic acid also leads to a rating of the label as not authentic.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Authentifizierung von mit einer Markierung versehenen Gegenständen, wobei die Markierung eine Markierungsnukleinsäure enthält, mit folgenden Schritten: a) Bereitstellen einer Referenzlösung, welche eine zumindest abschnittsweise doppelsträngige Referenznukleinsäure enthält, deren Referenznukleinsäurestränge zur Markierungsnukleinsäure nicht komplementär sind, und wobei am einen Referenznukleinsäurestrang ein erster Fluorophor und am anderem Referenznukleinsäurestrang ein erster Quencher in einem ein erstes Fluoreszenzsignal des ersten Fluorophors löschenden Abstand gebunden sind; b) Bereitstellen einer von der Referenzlösung getrennten Nachweislösung, welche eine zumindest abschnittsweise doppelsträngige Nachweisnukleinsäure enthält, bei der einer der beiden Nachweisnukleinsäurestrange zur Markierungsnukleinsäure zumindest abschnittsweise komplementär ist, und wobei am einen Nachweisnukleinsäurestrang ein zweiter Fluorophor und am anderen Nachweisnukleinsäurestrang ein zweiter Quencher in einem ein zweites Fluoreszenzsignal des zweiten Fluorophors löschenden Abstand gebunden sind; c1) Inkontaktbringen der Referenzlösung mit der Markierung unter für eine Hybridisierung einer der beiden Nachweisnukleinsäurestrange mit der Markierungsnukleinsäure geeigneten Bedingungen; c2) Beobachten eines von der Markierung emittierten ersten Fluoreszenzsignals; d1) Inkontaktbringen der Nachweislösung mit der Markierung unter den Bedingungen wie im Schritt lit. c1); d2) Beobachter eines von der Markierung emittierten zweiter Fluoreszenzsignals und wobei die Schritte Iit. d1) und Iit. d2) entweder vor oder nach den Schritten Iit. c1) und Iit. c2) durchgeführt werden, und e) Feststellen der Authentizität des Gegenstands, wenn (i) bei dem im Schritt Iit. c2) beobachteten ersten Fluoreszenzsignal zumindest eine erwartete erste Eigenschaft des ersten Fluoreszenzsignals nicht beobachtbar ist und wenn (ii) das im Schritt Iit. d2) beobachtete zweite Fluoreszenzsignal zumindest einer erwarteten zweiten Eigenschaft des zweiten Fluoreszenzsignals entspricht.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Autheπtifizierur.g vor. mit einer Markierung versehener. Gegenständen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Verrichtung zur Authentifizierung von mit einer Markierung versehenen Gegenständen.
Die WO 01/51652 A2 offenbart ein Verfahren, bei dem ein Ge- genstand zur Authentifizierung mit einer fälschungssicherer. Markierung versehen wird. Die Markierung besteht aus einer ersten Nukleinsäure, welche in Form erster Flächenelenente angeordnet ist. Zur Identifizierung der Markierung wird ein durch die ersten Flächenelemente gebildetes Teilmuster sicht- bar gemacht. Dazu wird die erste Nukleinsäure mit einer dazu komplementären zweiten Nukleinsäure in Kontakt gebracht. Bei einer Hybridisierung der ersten und der zweiten Nukleinsäure ist eine Fluoreszenz beobachtbar. Zur Messung eines Hintergrundsignals können neben den ersten Flächenelementen zusätz- lieh zweite Flächenelemente vorgesehen sein, welche eine dritte Nukleinsäure enthalten. Die dritte Nukleinsäure ist nicht komplementär zur zweiten Nukleinsäure. Zwischen der zweiten und dritten Nukleinsäure tritt keine Hybridisierung auf. Eine Messung der Fluoreszenz der zweiten Flächenelemente ermöglicht eine Bestimmung der Hintergrundfluoreszenz.
Die WO 02/072878 Al beschreibt ein Verfahren, bei dem ein Gegenstand zur Authentifizierung mit einer Markierung versehen ist. Die Markierung umfasst ein erstes und ein zweites FlS- chenelement. Das erste Flächenelement ist mit einer vorgegebenen ersten und das zweite Flächenelement mit einer vorgegebenen dritten Nukleinsäure imprägniert. Zur Authentifizierung des Gegenstands werden das erste und das zweite Flächenelement mit einer Nachweislösung in Kontakt gebracht. Die Nach- weislσsunς enthalt eir.e zur ersten Nukleinsäure komplementäre zweite Nukleinsäure, welche rr.it eine- Fiuσrophor rarkiert ist. Infolge einer Hybridisierung der ersten und der dazu kor.piementärer. zweiten Nukleinsäure ist ein erhöhtes Fluores- zenzsignal beobachtbar. Dagegen fuhrt ein Kontakt der zweiten und der dritten Nukleinsäure im zweiten Flachenelement zu keiner Hybridisierung. Es ist dort keine erhöhte Fluoreszenz beobachtbar. Die Messung der Fluoreszenz im ersten und zweiten Flächenelement ermöglicht eine Identifizierung der Mar- kierung.
In der Praxis wird als zweite Nukleinsäure meist eine Nukleinsäure mit einer Haarnadelstruktur verwendet, an deren erstem freien Ende der Fluorophor und an deren gegenüberlie- gendem zweiten freien Ende in einem ein Fluoreszenzsignal löschenden Abstand ein Quencher gebunden sind. Beim Inkontakt- bringen der zweiten Nukleinsäure mit der ersten Nukleinsäure öffnet sich wegen der angestrebten Hybridisierung die Haarnadelstruktur und die räumliche Beziehung zwischen dem Fluoro- phor und dem Quencher wird aufgelöst. Infolgedessen ist das Fluoreszenzsignal beobachtbar.
Die nach dem Stand der Technik bekannten Verfahren sind in mehrfacher Hinsicht nachteilig. Zur Durchfuhrung einer exak- ten Messung sind stets mit unterschiedlichen Nukleinsäuren beladene Flächenelemente in der Markierung erforderlich. Die Herstellung der Markierung ist damit aufwändig. Abgesehen davon ist es zum Nachweis der Echtheit der Markierung erforderlich, sowohl die Fluoreszenz des ersten als auch des zweiten Flächenelements zu messen und auszuwerten. Schließlich kann es durch physikalische oder chemische Prozesse auch im ersten Flächenelement zu einer unspezifischen Fluoreszenz kommen, welche zu falsch positiven oder negativen Resultaten führen kann. Beispielsweise kann das Problem auftreten, dass die an- gesprochene Haarr.adeLscruktur nicht nur durch eine Hybridi- sieruπg ir.it der kcrr.plerr.er.cärer. erster. Nukleinsäure, sondern auch durch andere Einflüsse aufgehoben werden kann. Die Haarnadelstruktur kann durch eine Behandlung der zweiter. Nuklein- säure rr.it Säuren oder Basen oder bei Überschreiten einer bestimmten Temperatur zerstört werden. Es kann also beispielsweise durch eine Imprägnierung der Markierung mit einer Säure ein falsch positives Fluoreszenzsignal erzeugt und damit die Authentizität des Gegenstands vorgetäuscht werden.
Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es soll insbesondere ein möglichst einfach durchführbares Verfahren zur Authentifizierung von mit einer Markierung versehenen Gegenständen angegeben wer- den, welches sich durch eine verbesserte Fälschungssicherheit und Zuverlässigkeit auszeichnet. Ferner soll eine zur Durchführung des Verfahrens geeignete Vorrichtung angegeben werden.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 17 und 19 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 16 und 18.
Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Authentifi- " zierung von mit einer Markierung versehenen Gegenständen, wobei die Markierung eine Markierungsnukleinsäure enthält, mit folgenden Schritten vorgesehen:
a) Bereitstellen einer Referenzlösung, welche eine zumindest abschnittsweise doppelsträngige Referenznu- kleinsäure enthält, deren Referenznukleinsäurestränge zur Markierungsnukleinsäure nicht komplementär sind, und wobei am einen Referenznukleinsäurestrang ein erster Fluorophor und am anderem Referenznukleinsäurestrang ein erster Quencher in ei- nen ein erstes Fluoreszeπzsigr.al des erster. FIucrophcrs Ic- scher.den Abstand gebunden sind,
b) Bereitstellen einer vcn der Referenzlόsung getrennten Nachweislcsung, welche eine zumindest abschnittsweise doppelsträngige Nachweis- nukleinsäure enthält, bei der einer der beiden Nachweisnu- kleinsäurestränge zur Markierungsnukleinsäure zumindest abschnittsweise komplementär ist, und wobei am einen Nachweis- nukleinsäurestrang ein zweiter Fluorophor und am anderen
Nachweisnukleinsäurestrang ein zweiter Quencher in einem ein zweites Fluoreszenzsignal des zweiten Fluorophors löschenden Abstand gebunden sind,
cl) Inkontaktbringen der Referenzlösung mit der Markierung unter für eine Hybridisierung einer der beiden Nachweisnu- kleinsäurestränge mit der Markierungsnukleinsäure geeigneten Bedingungen,
c2) Beobachten eines von der Markierung emittierten ersten FluoreszenzSignals,
dl) Inkontaktbringen der Nachweislösung mit der Markierung unter den Bedingungen wie im Schritt lit. cl),
d2) Beobachten eines von der Markierung emittierten zweiten Fluoreszenzsignals und
wobei die Schritte lit. dl) und lit. d2) entweder vor oder nach den Schritten lit. cl) und lit. c2) durchgeführt werden,
und ei Feststeiler, der Authentizität des Geger.star.es, wer.- (i) bei den im Schritt ILz. c2) beobachteter, ersten Flucreszer.z- signal zumindest eine erwartete erste Eigenschaft άes ersten Fiucreszenzsignals nicht beobachtbar ist, und wenn (ii; das im Schritt lit. d∑) beobachtete zweite Fiuoreszenzsignal zumindest einer erwarteter, zweiten Eigenschaft des zweiten Fiuores∑enzsignals entspricht .
Die beiden Referenznukleinsäurestränge der Referenznuklein- säure sind zur Markierungsnukleinsäure nicht komplementär.
Bei Inkontaktbringen der Referenznukleinsäure mit der Markierungsnukleinsäure bleibt die doppelsträngige Struktur der Re- ferenznukleinsäure erhalten. Ein erstes Fluoreszenzsignal ist nicht beobachtbar bzw. übersteigt nicht einen vorgegebenen Schwellwert. Bei einer Störung der Markierung, wenn z. B. Stoffe, wie Säuren, Basen oder dgl., verunreinigt oder zum Zwecke der Fälschung aufgebracht worden sind oder das Inkontaktbringen der Nachweislösung mit der Markierung unter Bedingungen, beispielsweise einer zu hohen Temperatur, erfolgt,. unter denen eine doppelsträngige Struktur zweier Nukleinsäuren aufgelöst wird, ist die erwartete erste Eigenschaft des ersten ■ Fluoreszenzsignals beobachtbar. Es ist z. 3. eine Fluoreszenzintensität beobachtbar, welche den vorgegebenen Schwellwert übersteigt. Das zeigt an, dass eine falsch posi- tive Messung vorliegt. Es kann damit auf einfache, sichere und zuverlässige Weise eine hohe Zuverlässigkeit und Fälschungssicherheit des Verfahrens gewährleistet werden.
Der eine Nachweisnukleinsäurestrang ist zumindest soweit ab- schnittsweise komplementär mit der Markierungsnukleinsäure, dass bei einem Inkontaktbringen der Markierungsnukleinsäure mit dem einen Nachweisnukleinsäurestrang eine Hybridisierung unter vorgegebenen Bedingungen stattfindet. Keiner der Nach- weisnukleinsäurestränge ist komplementär zu den Referenznu- kleir.säurescrär.gen. Durch die Hybridisierur.g des Nachweisr.u- kieir.säurestrar.ςs .τ.it der Karkierungsr.ukleir.säure wird die räumliche Beziehung zwischen der. zweiter. Quencher ur.d dem zweiτer. Fluorophor aufgehoben . Infolgedessen komr.t es bei ei- ner Einstrahlung von Iiehr auf den zweiten Fluorcphor zu einer beobachtbaren Fluoreszenz.
Die Markierung ist zweckmäßigerweise fest an der Oberfläche des Gegenstands angebracht. Zur Authentifizierung des Gegen- Stands ist es nicht erforderlich, die Markierung zu entfernen. Vorteilhafterweise kann die Markierung an Ort und Stelle, d. h. in ihrem auf der Oberfläche des Gegenstands befestigten Zustand identifiziert werden. Das macht das vorgeschlagene Verfahren besonders einfach durchführbar.
Nach dem vorgeschlagenen Verfahren wird die Markierungsnu- kleinsäure vorteilhafterweise zunächst mit der Referenzlösung in Kontakt gebracht und es wird das von der Markierung ggf. emittierte erste Fluoreszenzsignal beobachtet. Sofern das er- ste Fluoreszenzsignal einen bestimmten Schwellwert übersteigt, zeigt das an, dass die Markierung mit Störstoffen versetzt ist oder unzulässige Prüfbedingungen vorliegen. In • diesem Fall ist es nicht mehr erforderlich, die Markierungs- nukleinsäure nachfolgend mit der Nachweisnukleinsäure in Kon- takt zu bringen. Ein besonderer Vorteil des vorgeschlagenen Verfahrens besteht darin, dass zur Beobachtung des ersten und/oder zweiten Fluoreszenzsignals ein herkömmliches Fluoreszenz-Handlesegerät bzw. eine herkömmliche Fluoreszenzmesseinrichtung verwendet werden kann, mit der insbesondere die Intensität des beobachteten Fluoreszenzsignals quantitativ erfassbar ist.
Nach einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung sind der erste Fluorophor und der erste Quencher im Bereich des einen Endes der Referer.zr.ukleir.saure gebunden. In ähnlicher Weise können der zweite Fluorophcr und der zweire Quencher i.τ. Bereich des einen Endes der i-≤chweisnuklein≤äure gebunden sein. Das Vorsehen der Fiucrophcr/Cuer.cherpaare im 3ereich des Zr.- des der Referenz- und/oder N'achweisnukieinsäure errr.cglicht eine besonders einfache Herstellung derselben. Die dcppel- strängige Struktur wird im Falle des vorgeschlagenen endständigen Vorsehens der Fluorophor/Quencherpaare wenig gestört.
Nach einer vorteilhaften Ausgestaltung werden die Schritte lit. cl) und lit. c2) sowie die Schritte lit. dl) und lit. d2) zeitlich aufeinanderfolgend innerhalb von 120 Sekunden, vorzugsweise 60 Sekunden, durchgeführt. Das ermöglicht eine Authentifizierung der Markierung vor Ort. Weiterhin kann in der Praxis sichergestellt werden, dass für die Durchführung der vorgenannten Schritte im Wesentlichen dieselben Reaktionsbedingungen vorliegen. Die Schritte lit. cl) und lit. c2) sowie die Schritte lit. dl) und lit. d2) werden zweckmäßigerweise bei Umgebungstemperatur durchgeführt. Es ist insbeson- dere nicht erforderlich, besondere von der Umgebungstemperatur abweichende Temperaturen einzustellen.
Nach einer zweckmäßigen Ausgestaltung liegt die Nachweisnu- kleinsäure in einer Haarnadelstruktur vor, bei welcher die Nachweisnukleinsäure zwei zueinander komplementäre Äste aufweist. In ähnlicher Weise kann auch die Referenznukleinsäure in einer Haarnadelstruktur vorliegen, bei welcher die Refe- renznukleinsäurestränge zwei zueinander komplementäre Äste aufweist. Die vorgeschlagenen selbst-komplementären Nachweis- und/oder Referenznukleinsäuren eignen sich in besonderer Weise zum Nachweis der Markierungsnukleinsäure oder ggf. falsch positiver Signale erzeugender Stoffe oder Bedingungen. Nach einer weiteren Ausgestaltung wird beim Schritt iit. c2) und/oder d2) die Markierung mit Licht eir.es vorgegebener. WeI- leπläncenbereichs bestrahle. Dabei umfasst der Welier.ianger.- bereich solche Wellenlängen, rr.it denen der erste und/oder zweite Flucrophcr zur Erzeugung eines ersten und/oder eines zweiten Fluoreszenzsignals anregbar ist. Damit können die Intensitäten der Fluoreszenzsignale klar gegenüber dem Hintergrund erhöht und somit eine besonders sichere und zuverlässige Messung gewährleistet werden. - Zur weiteren Verbesserung der Lichtausbeute kann die Markierung auf einer Licht reflektierenden Unterlage aufgebracht sein.
Nach einer weiteren Ausgestaltung werden sowohl die Nachweisais auch die Referenzlösung auf ein einziges, die Markie- rungsnukleinsäure enthaltendes Nachweisfeld der Markierung aufgebracht. Indem lediglich ein einziges Nachweisfeld vorgesehen ist, kann die Erfassung der Fluoreszenz vereinfacht werden .
Vorteilhafterweise wird/werden jeweils ein vorgegebenes Volumen der Nachweis- und/oder der Referenzlösung auf die Markierung aufgetragen. Das ermöglicht eine besonders zuverlässige Authentifizierung der Markierung. Ein vorgegebenes Volumen kann mit geeigneten Flüssigkeitsapplikationensvorrichtungen aufgetragen werden. Beispielsweise können dazu eine Pipette oder ein die Nachweislösung enthaltender erster Stift sowie ein die Referenzlösung enthaltender zweiter Stift verwendet werden. Die Verwendung derartiger Flüssigkeitsapplikations- vorrichtungen vereinfacht das Handling und ermöglicht einen schnellen vor-Ort-Nachweis .
Gemessen wird jeweils zumindest eine vorgegebene erwartete Eigenschaft der ersten und zweiten Fluoreszenzsignale. Dabei kann die erwartete erste Eigenschaft der ersten Fluoreszenz- Signals eir.e vorgegebene erste Maxia.τ.alir.ter.sität in eine-p. erster. Weller.Iar.genbereich \^r.ά die erwartete zweite Eigenschaft eine vorgegebene zweite Mir.destir.ter.sität m einem zweiter. Wellenlär.ger.bereich sein. Zur Feststellung der Au- tr.entizität des Gegenstands kennen der erste und der zweite Fiuorophor sich auch hinsichtlich der Wellenlänge der damit erzeugten ersten und zweiten Fiuoreszenzsignale unterscheiden. Zum Feststellen der Authentizität des Gegenstands kann in diesem Fall in den Wellenlängenbereichen des ersten und des zweiten Fluoreszenzsignals gemessen werden. Sofern im ersten Wellenlängenbereich ein erstes Fluoreszenzsignal mit einer oberhalb einer vorgegebenen Maximalintensität beobachtet wird, oder ein Verhältnis zwischen dem ersten und zweiten Fluoreszenzsignal bestimmt wird, welches außerhalb eines Er- wartungswerts liegt, wird die Markierung als nicht authentifiziert bewertet.
Nach einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung sind der erste und der zweite Fiuorophor identisch. Auch der erste und der zweite Quencher können identisch sein. In diesem Fall kann die Anregung sowohl nach dem Auftragen der Referenzlösung als auch nach dem Auftragen der Nachweislösung mit demselben Wellenlängenbereich, d. h. mit derselben Anregungslichtquelle erfolgen. Abgesehen davon, kann auch die Beobach- tung der emittierten Fluoreszenz mit ein und derselben Fluoreszenzerfassungsvorrichtung durchgeführt werden. Damit kann der technische Aufwand zur quantitativen Messung bzw. Beobachtung der Fluoreszenz vermindert werden.
Die ersten und zweiten Fluoreszenzsignale können beispielsweise mit einem Fluoreszenz-Handlesegerät erfasst werden. Dazu wird das Fluoreszenz-Handlesegerät auf die Markierung aufgesetzt, Licht zur Anregung des ersten und/oder zweiten Fluo- rophors erzeugt und die von der Markierung emittierte Fluo- res:er,2 cesrirrinr. Ξs können dazu ir. einem jeweils vorgegebener. Weller.langer.bereich nacheinander die Intensitäten der ersten und zweiter. Flucreszenzsignale erfass* werden. Zur 3e- stirmung der Authentizität der Markierung können die ge-esse- r.en Intensitäter, mit Ξrwartungswerten verglichen und bei einer Übereinstimmung mit den Erwartungswerten als authentifiziert und bei einer fehlenden Übereinstimmung mit den Erwartungswerten als nicht authentifiziert bewertet werden. Vorteilhafterweise kann es sich bei dem Erwartungswert um ein Verhältnis zwischen einer erwarteten ersten und zweiten Intensität handeln. Anstelle eines Verhältnisses kann aber auch eine Differenz oder eine andere Verknüpfung erwarteter Werte bzw. Eigenschaften mit den gemessenen Eigenschaften zum Nachweis der Intensität der Markierung verwendet werden. Die vor- genannten Erwartungswerte können anhand von Serienmessungen an intakten Markierungen und an verunreinigten Markierungen gewonnen werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es vorteilhafterweise lediglich erforderlich, die . von dem einzigen Nachweisfeld emittierte Fluoreszenz zu beobachten. Es ist insbesondere nicht erforderlich-, das Fluoreszenz-Handlesegerät zur Erfassung beispielsweise einer von einer gesonderten Referenzfläche emittierten Fluoreszenz über die Markierung zu bewegen. Das vereinfacht das Verfahren. - Selbstverständlich ist es auch möglich, die Markierung auf einem ersten Markierungsfeld vorzusehen und ein zweites Referenzfeld vorzusehen, welches die Markierungsnukleinsäure nicht enthält. In diesem Fall kann der Nachweis der Markierung dadurch erfolgen, dass die Nachweislösung auf das Markierungsfeld sowie auf das Referenzfeld aufgebracht wird und sowohl die vom Markierungsfeld als auch vom Referenzfeld emittierte Fluoreszenz beobachtet wird. Die vom Referenzfeld emittierte Fluoreszenz gibt die Hintergrundfluoreszenz wieder. Indem das die Hintergrundfluo- reszer.z wiedergebende Signal r.it der. vor. dem Markierur.gsfeie emittierten Fluoreszer.zsigr.al ins Verhältnis gesetzt wird, kann eine besonders zuverlässige Authentifizierung der Markierung erfolgen.
Vorteilhafterweise enthält die Markierung zumindest eine weitere Nukleinsäure, welche weder zu den Nachweisnukleinsäure- strängen noch zu den Referenznukleinsäuresträngen komplementär ist. Die weitere Nukleinsäure kann relativ zur Markie- rungsnukleinsäure im Überschuss in der Markierung enthalten sein. Die weitere Nukleinsäure dient dazu, die Markierungsnu- kleinsäure zu verstecken bzw. deren Isolierung aus der Markierung durch nicht autorisierte Personen unmöglich zu machen. Das erhöht weiter die Fälschungssicherheit der Markie- rung. Bei der weiteren Nukleinsäure kann es sich z. B. um
Kalbsthymus-DNA, synthetische Oligonukleotide mit Zufallssequenzen, tRNA, Heringsperm-DNA oder Pflanzen-DNA handeln.
Nach einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist vorgese- hen, dass als Markierung eine die Markierungsnukleinsäure und/oder die weitere Nukleinsäure enthaltende Druckfarbe verwendet wird. Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass ein zuverlässiger Nachweis der Authentizität des Gegenstands auch dann erreicht werden kann, wenn die Markierungsnuklein- säure in einer Druckfarbe enthalten ist. Durch Drucken der die Markierungsnukleinsäure enthaltenden Druckfarbe kann auf besonders einfache und kostengünstige Weise eine für den Laien zunächst nicht erkennbare Markierung, beispielsweise auf Dokumenten, Geldscheinen, Tickets oder dgl., hergestellt wer- den.
Die Markierung kann mit einem Druckverfahren auf den zu markierenden Gegenstand oder auf ein, vorzugsweise selbstklebendes, Etikett aufgebracht werden. Das Etikett ist zweckmäßi- gerweise sc ausgeführt, dass es nicht zerstörungsfrei vor. Gegenstand gelöst werden kann.
Nach einer weiteren Ausgestaltung u.τ.fa≤sc die Markierung eine Markierungsfläche, welche lediglich wenige Quadr=tr.illi-.eτ:er, vorzugsweise 1 bis 20 mm2 groß ist. Eine solche Markierung kann kostengünstig hergestellt werden.
Zur Herstellung der Markierung werden zweckmäßigerweise 0,01 bis 1,0 pMol Markierungsnukleinsäure verwendet. Derart geringe Mengen an Markierungsnukleinsäure sind für Fälscher schwer zu isolieren, zu analysieren und nachzuahmen. Das gilt insbesondere dann, wenn die Markierungsnukleinsäure in einem Gemisch mit zumindest einer weiteren Nukleinsäure in der Mar- kierung vorliegt.
Zum Nachweis der Markierungsnukleinsäure ist es lediglich erforderlich, wenige Mikroliter der Nachweislösung auf die Markierung aufzubringen. Vorteilhafterweise werden definierte vorgegebene Volumina der Referenz- und Nachweislösung auf die Markierung aufgetragen. Dadurch wird gewährleistet, dass die erwarteten ersten und zweiten Fluoreszenzsignale sich in einem engen Intensitätsbereich befinden. Es ist insbesondere nicht erforderlich, die Markierung in der Nachweisflüssigkeit unterzutauchen oder die Markierung nach dem Aufbringen der Nachweisflüssigkeit zu waschen, um zum Feststellen der Authentizität eine geeignete Fluoreszenzemission zu beobachten. Damit ist es insbesondere möglich, den Gegenstand mit der darauf angebrachten Markierung zu authentifizieren. Durch das Aufbringen der geringen Mengen an Nachweisflüssigkeit wird der Gegenstand in keiner Weise beeinflusst. Die Authentizität des Gegenstands kann also schnell und einfach festgestellt werden. Nach weiterer Maßgabe der Erfindung ist ei.- Kiü πit einer die Referenzlösung enthaltenden ersten Fiüssigkeitsspencevorrich- tur.g vorgesehen, wcbei die Refere.nzicsur.g eine zumindest abschnittsweise doppelsträngige Referenznukleinsäure enthält, deren Referenzr.ukieir.säuresträr.ge zu einer vorgegebenen Kar- kierungsnukleinsäure nicht komplementär sind, und wcbei am einen Referenznukleinsäurestrang ein erster Fluorophor und am anderem Referenznukleinsäurestrang ein erster Quencher in einein ein erstes Fluoreszenzsignal des ersten Fluorophors lö- sehenden Abstand gebunden sind, und einer die Nachweislösung enthaltenden zweiten Flüssigkeitsspendeeinrichtung, wobei die Nachweislösung eine zumindest abschnittsweise doppelsträngige Nachweisnukleinsäure enthält, bei der einer der beiden Nach- weisnukleinsäurestränge zur vorgegebenen Markierungsnuklein- säure zumindest abschnittsweise komplementär ist, und wobei am einen Nachweisnukleinsäurestrang ein zweiter Fluorophor und am anderen Nachweisnukleinsäurestrang ein zweiter Quencher in einem ein zweites Fluoreszenzsignal des zweiten Fluorophors löschenden Abstand gebunden sind.
Vorteilhafterweise sind die erste und die zweite Flüssigkeitsspendeeinrichtung jeweils ein die Nachweis- oder Referenzlösung enthaltender Stift oder eine Pipette.
Nach einer weiteren Ausgestaltung kann anstelle des Kits auch eine Flüssigkeitsspendeeinrichtung mit einem ersten Behälter zur Aufnahme des erfindungsgemäßen Referenzlösung und einem zweiten Behälter zur Aufnahme der erfindungsgemäßen Nachweislösung und eine Einrichtung zur zeitlich aufeinanderfolgenden separaten Abgabe eines vorgegebenen Volumens der Referenz- und der Nachweislösung vorgesehen sein. Bei der Flüssigkeitsspendeeinrichtung kann es sich um eine Doppelpipette handeln, welche mit einem geeigneten Mechanismus versehen ist, bei dessen Betätigung zunächst ein vorgegebenes Volumen an Refe- rer.zlόsur.g und bei dessen err.euτer Betätigung nachfolgend ein vorgegebenes Volumen an N'achweislösung abgegeben wird. Das vereinfacht die Handhabung des Nachweises. Eine Verwechslung der Reihenfolge des Auftrageπ.s der Referenz- und der Nach- weislösung ist darr.it. gera~esei~ig ausgeschlossen.
3ei dem markierten Gegenstand handelt es sich bevorzugt um Güter, Waren, Verpackungen und Dokumente. Insbesondere kann es sich dabei um Markenprodukte, Zahlungsmittel, Chipkarten oder Verpackungen dafür handeln. Der zu authentifizierende
Gegenstand wird von Hersteller in den freien Warenverkehr gegeben und unterliegt damit einer potenziellen Fälschungsgefahr. Die Authentizität des Gegenstands kann bei Bedarf unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens sicher und zuver- lässig bestimmt werden. Dazu ist es lediglich erforderlich, die beispielsweise in einem Filzstift aufgenommene Nachweislösung auf die Markierung aufzutragen und anschließend mit einem Fluoreszenz-Handlesegerät die von der Markierung emittierte Fluoreszenz zu beobachten, zu analysieren bzw. mit vorgegebenen Erwartungswerten zu vergleichen und infolge des Ergebnisses des Vergleichs die Authentizität der Markierung festzustellen.
Nachfolgend werden Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 schematisch eine Markierungs-, Nachweis- und eine Referenznukleinsäure,
Fig. 2a bis 2c schematisch Reaktionsvarianten beim Kontakt einer Markierungsnukleinsäure mit einer Referenz- und Nachweisnukleinsäure und Fig. 3a bis 3e sc'r.err.atisch aufeinander folgende Verfahrensschrizze .
Fig. 1 zeigt scherr.atiser. eine Markierur.gs- M, eine Nachweis- N 'cnc. eine Referenznukieinsäure R. Die Xachweisnuklemsäure N und die Referenznukieinsäure R sind jeweils nach Art eines Molecular 3eacon ausgebildet. Die Nachweisnukleinsäure N um- fasst eine Kaarnadelstruktur, an deren freien Enden ein erstes Fluorophor Fl und ein erster Quencher Ql in einem die Fluoreszenz des ersten Fluorophors Fl löschenden Abstand gebunden sind. Desgleichen umfasst die Referenznukieinsäure R eine Haarnadelstruktur, an deren freien Enden ein zweiter Fluorophor F2 und ein zweiter Quencher Q2 in einem die Fluoreszenz des zweiten Fluorophors F2 löschenden Abstand gebun- den sind.
Die Nachweisnukleinsäure N ist zumindest abschnittsweise komplementär zur Markierungsnukleinsäure M. Beim Inkontaktbrin- gen der Nachweisnukleinsäure N mit der Markierungsnukleinsäu- re M kommt es zur Kybridisierung. Der die Fluoreszenz des ersten Fluorophors Fl löschende Abstand im ersten Quencher Ql - wird aufgehoben. 3ei einer Anregung des ersten Fluorophors Fl ist eine Fluoreszenz beobachtbar. Die Referenznukleinsäure R ist dagegen nicht komplementär zur Markierungsnukleinsäure M ausgebildet. Beim Inkontaktbringen der Referenznukleinsäure R mit der Markierungsnukleinsäure M kommt es nicht zu einer Hybridisierung. Infolgedessen bleibt die räumliche Beziehung zwischen dem zweiten Quencher Q2 und dem zweiten Fluorophor F2 erhalten. Bei einer Anregung des zweiten Fluorophors F2 kommt es nicht zur Ausbildung einer Fluoreszenz.
Die in Fig. 2a untereinander dargestellten Abbildungen zeigen schematisch eine erste Reaktionsvariante, bei welcher eine Markierung 1 eine Markierungsnukleinsäure M enthält. Die Mar- <ierur.g 1 is~ ir. cieser. Fall frei vc~. Szorstoffe~ . Sie oefir.- det sie.-. a_f Uxcecur.gs-emperatur, d. h. auf einer Terperatur vor. 2O0C = 50C. Die Mar.<ierungsr.J<leir.≤a_:re M wird ir. einen erster. Scnritt rrit cer Referer.zlosur.g m Kcr.zakt gecracht . 2a die Markierung keine Storstcffe er.rr.alt j.i- keine ur.z-lassig hohen Temperaturen ausgesetzt ist, bleibt die ursprüngliche Struktur einer Referenznuklemsaure R erhalten. Ξs ist kein oder nur ein schwaches zweites Fluoreszenzsignal beobachtbar. In einem zweiten Schritt wird nachfolgend eine eine Nachweis- nukleinsaure N enthaltende Nachweislosung auf die Markierung 1 aufgetragen. Die Nachweisnuklemsaure N hybridisiert mit der Markierungsnuklemsaure M. Die räumliche Beziehung zwischen dem ersten Fluorophor und dem ersten Quencher wird aufgehoben. Es ist ein erstes Fluoreszenzsignal beobachtbar, an- hand dessen die Authentizität der Markierung 1 erkannt werden kann.
Bei der in Fig. 2b gezeigten zweiten Reaktionsvariante enthalt die Markierung 1 keine Markierungsnuklemsaure M. Sie ist frei von Storstoffen und befindet sich auf Umgebungstemperatur. In diesem Fall wird infolge einer fehlenden Hybridisierung mit der Nachweisnuklemsaure N die räumliche Struktur der Nachweisnuklemsaure N nicht geändert. Es ist in diesem Fall lediglich ein schwaches Fluoreszenzsignal beobachtbar. Die Markierung wird in diesem Fall als nicht authentisch angesehen.
Fig. 2c zeigt eine dritte Reaktionsvariante. Dabei enthalt die Markierung 1 die Markierungsnuklemsaure M. Ferner ent- halt die Markierung 1 Storstoffe, beispielsweise NaOH. Beim Inkontaktbringen der Markierung 1 mit der Referenznuklemsaure R wird die Haarnadelstruktur der Referenznuklemsaure R infolge des herrschenden pH-Werts zerstört. Es ist in diesem Fall ein deutliches Fluoreszenzsignal beobachtbar. Dieses be- reit s irr, erster. Verfahrer.sscr.rit~ beobachtbare Fiucreszenzsi- gnal zeig:: an, dass die Authentizität der Markierung r.icht nachweisbar ist. Scfern in einem zweiten Verfahrensschritt zusätzlich die Nachweislcsung r.it der Markierung m Kontakt gebracht wird, hybridisiert die Nacr.weisr.-ikleir.säure N" r.it der Markierungsnukleinsäure M. Es wird eine weitere Erhöhung des Flucreszenzsigr.als beobachtet. Das beobachtbare Flucres- zenzsignal setzt sich in diesem Fall sowohl aus dem von der Referenznukleinsäure R als auch aus dem von der Nachweisnu- kleinsäure N erzeugten Fluoreszenzsignalen zusammen. Die Intensität der Fluoreszenzsignale ist in diesem Fall so stark, dass sie einen vorgegebenen Grenzwert überschreitet. In diesem Fall wird die Markierung 1 wiederum als nicht authentisch angesehen.
In den Fig. 3a bis 3e sind nochmals schematisch die Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens dargestellt. Fig. 3a zeigt die erfindungsgemäße Markierung 1 mit einem einzigen Markierungsfeld. Das Markierungsfeld besteht im Wesentlichen aus einer aufgedruckten Druckfarbe, welche Markierungsnukleinsäure M enthält. Bei dem in Fig. 3b gezeigten ersten Verfahrensschritt wird unter Verwendung eines ersten Stifts 2 Referenzlösung auf das Markierungsfeld aufgetragen. Anschließend wird mit einer Anregungslichtquelle 3 das Markierungsfeld beleuch- tet und die damit ggf. angeregte Fluoreszenz mittels einer
Fluoreszenzmesseinrichtung 4 beobachtet. Mit der Fluoreszenzmesseinrichtung 4 ist es insbesondere möglich, eine Intensität der von der Markierungsfläche abgestrahlten Fluoreszenz quantitativ zu bestimmen.
In einem nachfolgenden weiteren Verfahrensschritt wird sodann unter Verwendung eines zweiten Stifts 5 Nachweislösung auf das einzige Markierungsfeld aufgetragen. Wie in Fig. 3e gezeigt ist, wird nachfolgend wiederum unter Verwendung der An- regur.gsiichtquelle 3 sowie der Flucreszer.z^.esse^r.richrur.g 4 die voT. Markierur.gsfelc emittierte Fluoreszenz quantitativ erfasse.
Die Fluoreszenzrπesseir.richüur.g 4 kar.r. rp.it eir.er geeigneter. Auswertevorrichtung versehen sein, in der Schwellwerte und Grenzwerte hinterlegt sind. Damit kann automatisch anhand der gemessenen Fluoreszenzintensitäten ermittelt werden, ob die geprüfte Markierung authentisch ist oder nicht.
Beispiel 1:
Herstellung der Markierung
In einer herkömmlichen Druckerfarbe (UV-Tinte der Firma Wolke Inks und Printers GmbH, Hersbruck, Deutschland, Art. -Nr. 690900) ist als Markierungsnukleinsäure eine Nukleinsäure gemäß Sequenzprotokoll Nr. 1 (51- AAGCCTGGAGGGATGATACTTTGCGCTTGG-3' ) in einer Konzentration von 1 mg/ml aufgenommen. Die Markierungsnukleinsäure wurde mittels Standard-Amidit-Festphasensynthese hergestellt.
Die Druckfarbe ist z. B. im Inkjet-Druckverfahren auf einen Träger, z. B weißes Papier, eine geeignete Kunststofffolie oder dgl., mit einem Drucker, z. B. mittels des Druckers m600 der Firma Wolke Inks und Printers GmbH, Hersbruck, Deutschland, auf eine Fläche von 4 mm x 3 mm aufgedruckt. Aus einem solchermaßen bedruckten Träger kann ein, vorzugsweise selbstklebendes, Etikett hergestellt werden.
Es wurden Kontrollmarkierungen ohne Markierungsnukleinsäure durch Verdrucken der Druckerfarbe ohne Zusatz von Markierungsnukleinsäure hergestellt. Nachweis der Markierung
Zur Authentifi∑ierung des mit der Markierung markierter. Gegenstands wurde auf zehn Markierungen eine Referenzlcsung aufgetragen. Die Referenzlcsung war zu dieser. Zweck in einer. ersten Stift aufgenommen, der bei Kontakt mit der Markierung Referenzlösung auf die Markierung überträgt. Bei der Referenzlösung handelt es sich um eine wässrige Flüssigkeit, in der als Referenznukleinsäure eine Nukleinsäure gemäß Sequenz- Protokoll Nr. 3 (5'-FAM-CCG AGC CAC CAA AAA TGA TAT GCT CGG- 3'-DABCYL) in einer Konzentration von je 1 μMol/i in TEN (1OmM TrisCl, pH 8; 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0,19% SDS (w/v) ) enthalten ist. Nach Aufnahme eines ersten Fluoreszenzsignals erfolgte die Aufgabe der Nachweislösung auf die Markierung. Bei der Nachweislösung handelt es sich um eine wässrige Flüssigkeit, in der als Nachweisnukleinsäure eine Nukleinsäure gemäß Sequenzprotokoll Nr. 2,5-FAM-
CCAAGCGCAAAGTATCATCCCTCCAGGCTTGG-DABCYL- enthalten ist. Diese ist teilweise komplementär zu der in der Markierung enthalte- nen Markierungsnukleinsäure gemäß Sequenzprotokoll Nr. 1. Die Nachweisnukleinsäure lag ebenfalls in einer Konzentration von 1 μMol/1 in TEN (10 mM-2-Amino-2- (hydroxylmethyl) -1, 3- propanediol (TRIS) , pH 8; 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0,1% SDS (w/v)) vor. Nach dem Aufbringen der Nachweislösung ist das ggf. von der Nachweisnukleinsäuresequenz erzeugte zweite Fluoreszenzsignal gemessen bzw. beobachtet worden.
An den freien Enden der Nachweisnukleinsäure ist ein zweites Fluorophor/Quencherpaar in einem Abstand gebunden, welcher ein vom zweiten Fluorophor erzeugtes Fluoreszenzsignal löscht. Das zweite Fluorophor kann beispielsweise eine Fluoreszenzgruppe oder ein Derivat davon sein; der zweite Quen- cher kann beispielsweise Dabcyl oder ein Blackhole-Quencher (Jena Bioscience GmbH, Loebstedter Strasse 80, D-07749 Jena, Germar.y) sein. Weitere geeignete Kcrr.bir.aticr.en für Fluoro- phcr/Queπcherpaarε sind z. 3. ir. Tyagi S, 3ratu D?, ar.ά Krater FR (1993) "Multicolor molecuiar beacor.s for allele discriminaticr."; Na" Biotechr.ci 16, 43-53 offenbart. - Die Referer.znukleinsäure k≥r.r. mit der.selber. Fluoropr.or/Quer.cher- paar wie die Nachweisnukleir.säure versehen sein.
Die Nachweis- und Referenznukleinsäuren wurden mittels Stan- dard-Amidit-Festphasensynthese hergestellt. Die Markierungs- nukleinsäure ist im vorliegenden 3eispiel terminal selbst- kompleinentär ausgebildet und liegt in einer Haarnadelstruktur vor.
Beim Inkontaktbringen der Referenzlösung mit der Markierungs- nukleinsäure kommt es zu keiner Hybridisierung zwischen der
Referenznukleinsäure und der Markierungsnukleinsäure. Infolge dessen wird die doppelsträngige Struktur der Referenznukleinsäure nicht aufgelöst und damit die ursprüngliche räumliche Beziehung zwischen dem ersten Fluorophor und dem ersten Quen- eher nicht aufgehoben. Bei einer Anregung mit Licht einer
Wellenlänge mit 492 nm ist ein geringes Fluoreszenzsignal bei 517 nm beobachtbar, welches insbesondere durch die Eigenfluoreszenz der Markierungsnukleinsäure hervorgerufen wird. Die Messung erfolgt bevorzugt wenige Sekunden bis Minuten nach dem Kontakt mit der Referenzlösung. Die Messung kann mit Hilfe eines Fluoreszenz-Handlesegeräts durchgeführt werden. Das ermöglicht einen Nachweis auf dem markierten Objekt. Fluoreszenz-Handlesegerät mit den geforderten Eigenschaften können bei der identif GmbH, Erlangen erworben werden.
Beim Inkontaktbringen der Nachweislösung mit der Markierungsnukleinsäure kommt es zu einer Hybridisierung zwischen der Nachweisnukleinsäure und der Markierungsnukleinsäure. Infolgedessen wird die Struktur der Nachweisnukleinsäure verändert und damit die ursprüngliche räumliche Beziehung zwischen dem zweiter. Fluorcphor und derr. zweiter. Quer.c'r.er aufger.ocer.. Bei einer Anregung mit Licht εir.er Wellenlängen von 492 nn ist ein Fluoreszer.zsignal bei 517 n- beobachtbar, welches durch die Fluoreszenz der Markierungsnuklemsaure hervorgerufen wird. Die Messung erfolgt bevorzugt wenige Sekunden bis Xinu- ten nach dem Kontakt mit der Nachweislosung. Die Messung kann mit Hilfe eines Fluorεszer.z-Handlesegerats durchgeführt werden. Geeignete Fluoreszenz-Handlesegerät können bei der Firma identif GmbH, Erlangen erworben werden.
Tabelle: 1
Figure imgf000023_0001
Tabelle 1 zeigt die Auswertung von zehn Markierungen nach der Auftragung der Referenz- und Nachweisnukleinsäuren. In den Spalten ist der Wert für die Fluoreszenz der Nachweisnuklein- säure bei 517 r.τ. angegeben . is wurden Markierungen ir.it und ohne Markierur.gsr.ukleinsäure verwendet. Ferner wurden Markierungen chne Markierungsnukleir.säure verwenαet, weiche rr.it StörStoffer. (Markieruncsnukleinsaure - NaOH) versetzt waren.
Der Wert fϋr die Referenznukleinsäure liegt in einem engen Bereich um den Mittelwert von 283. Dieser Wert entspricht der geschlossenen Struktur der Referenznukleinsäure, in der erster Fluorophor und erster Quencher durch die Kybridisierung mit der Nachweisnukleinsäure räumlich eng benachbart vorliegen (Spalte links: Signale + Markierungsnukleinsäure) . - Der Wert für die Nachweisnukleinsäure liegt in einem engen Bereich um den Mittelwert von 548. Dieser Wert entspricht der offenen Struktur der Nachweisnukleinsäure, in der zweiter Fluorophor und zweiter Quencher durch die Hybridisierung mit der komplementären Markierungsnukleinsäure räumlich getrennt vorliegen. Der vorgenannte Wert enthält außerdem das durch die geschlossene Struktur der Referenznukleinsäure erzeugte Signal (Spalte rechts: Signale + Markierungsnukleinsäure) .
In den Spalten Signale + Markierungsnukleinsäure wurden ge- ■ druckte Markierungen ohne Markierungsnukleinsäure -verwendet . Der Wert nach Aufbringen der Referenzlösung liegt in einem Bereich um einen Mittelwert von 278. Dieser Wert entspricht der geschlossenen Struktur der Referenznukleinsäure, in der erster Fluorophor und erster Quencher bei Abwesenheit einer Markierungsnukleinsäure durch die Rückfaltung räumlich nah benachbart vorliegen. Nach dem Aufbringen der Nachweislösung liegt der Wert in einem engen Bereich um den Mittelwert von 312. Dieser Wert entspricht der geschlossenen Struktur sowohl der Referenz- als auch der Nachweisnukleinsäuren.
In den Spalten Markierungsnukleinsäure + NaOH wurden gedruckte Markierungen ohne Markierungsnukleinsäure verwendet, denen vor dem Kontakt -it der Referenz- und Nachweisflüssigkeit. C, 5 μl einer 1 molaren NaCH-Lösunς zugefügt wurden. Das Zufüger, soll hier eine mögliche Störung der Markierung simulieren. Der Wert für die Referentnukieinsäure liegt ix Bereich u~ ei- r.en Mittelwert von 488. Dieser Wert entspricht der geöffneten Struktur der Referenznukleinsäure, bei welcher der erste FIu- orophor und der erste Quencher durch die Denaturierung wegen des alkalischen pHs räumlich getrennt vorliegen. Der Wert nach dem Auftragen der Nachweislösung schwankt um einen MzLt- telwert von 710. Dieser Wert entspricht der Summe der Signale aus der geöffneten Struktur der Referenznukleinsäure sowie der Nachweisnukleinsäure . Durch die denaturierende Wirkung des alkalischen pH liegt auch die Nachweisnukleinsäure in der geöffneten Struktur vor.
Die deutliche Trennung der Fluoreszenz-Werte bei An- und Abwesenheit der Markierungsnukleinsäure ermöglicht eine Festlegung von Erwartungswerten zur Beurteilung der Authentizität der Markierung. Beispielsweise kann für die Bewertung der Markierung ein Erwartungswert von über 350 für die Nachweisnukleinsäure und ein Erwartungswert von unter 350 für die Referenznukleinsäure festgelegt werden. Beide Kriterien müssen für eine Bewertung der Markierung als authentisch erfüllt werden. Nach diesen Kriterien sind alle Markierungen, welche Markierungsnukleinsäure enthalten (Tabelle 1, Signale + Markierungsnukleinsäure) als authentisch bewertet, da sämtliche Werte für die Nachweisnukleinsäure oberhalb von 350 liegen und sämtliche Werte für die Referenznukleinsäure unterhalb von 350 liegen.
Ein Fehlen der Markierungsnukleinsäure (Tabelle 1, Spalten Signale - Markierungsnukleinsäure) führt zu Werten unterhalb von 350 für die Referenz- und Nachweisnukleinsäure. Damit liegt der Wert die Nachweisnukleinsäure unterhalb des Erwar- tur.gswertes . Die Kriterier, für die Authentizität der Markierung sind nicht erfüllt.
5ei Anwesenheit vcn Stcrstoffen m der Markierung erhöht sich der Wert der Fluoreszenz der Referenznukiemsäure auf Werte oberhalb des Erwartungswerts für die Referenznukleinsaure (Tabelle 1, Spalte - Markierungsnukleinsäure + NaOH) . Das Überschreiten des Erwartungswerts für die Referenznukleinsäu- re führt ebenfalls zu einer Bewertung der Markierung als nicht authentisch.

Claims

Pater.; ar.sorücr.e
1. Verfahrer, zur Authentifizierur.g vor. rr.it einer Markierung verseher.er. Gegenständen, wobei die .Markierung eir.e M≤rkie- rur.gsr.uklein≤äure enthält, r.it folgender. Schritten:
a) Bereitstellen einer Referenzlösuπg, welche eine zumindest abschnittsweise doppelsträngige Referenznu- kleinsäure enthält, derer. Referenzr.ukleinsäurestränge zur Markierungsnukleinsäure nicht komplementär sind, und wobei am einen Referenznukleinsäurestrang ein erster Fluorophor und am anderem Referenznukleinsäurestrang ein erster Quencher in einem ein erstes Fluoreszenzsignal des ersten Fluorophors löschenden Abstand gebunden sind,
b) Bereitstellen einer von der Referenzlösung getrennten Nachweislösung, welche eine zumindest abschnittsweise doppelsträngige Nachweis- nukleinsäure enthält, bei der einer der beiden Nachweisnu- kleinsäurestränge zur Markierungsnukleinsäure zumindest abschnittsweise komplementär ist, und wobei am einen Nachweis- nukleinsäurestrang ein zweiter Fluorophor und am anderen Nachweisnukleinsäurestrang ein zweiter Quencher in einem ein zweites Fluoreszenzsignal des zweiten Fluorophors löschenden Abstand gebunden sind,
cl) Inkontaktbringen der Referenzlösung mit der Markierung unter für eine Hybridisierung einer der beiden Nachweisnu- kleinsäurestränge mit der Markierungsnukleinsäure geeigneten Bedingungen,
c2) Beobachten eines von der Markierung emittierten ersten Fluoreszenzsignals,
26 dl) Ir.kcr.taktcrir.cer. der Nachweisicsur.ς mit der Markierung unter der. 3edir.gur.cer. wie ..r. Schritt lit. cl) ,
62) Beobachter, eir.es vcr. der Markierung emittierten zweiten Fiucreszer.zsignals und
wobei die Schritte lit. dl) und lit. d2) entweder vor oder nach den Schritten lit. cl) und lit. c2) durchgeführt werden,
und
e) Feststellen der Authentizität des Gegenstands, wenn (i) bei dem im Schritt iit. c2) beobachteten ersten Fluoreszenzsignal zuπindest eine erwartete erste Eigenschaft des ersten Fluoreszenzsignals nicht beobachtbar ist und wenn (ii) das im Schritt lit. d2) beobachtete zweite Fluoreszenzsignal zumindest einer erwarteten zweiten Eigenschaft des zweiten Fluoreszenzsignals entspricht.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der erste Fluorophor und der erste Quencher im Bereich des einen Endes der Refe- renznukleinsäure gebunden sind.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der zweite Fluorophor und der zweite Quencher im Bereich des einen Endes der Nachweisnukleinsäure gebunden sind.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Schritte lit. cl) und lit. c2) sowie die Schritte lit. dl) und lit. d2) zeitlich aufeinander folgend innerhalb von 120 Sekunden, vorzugsweise innerhalb von 60 Sekunden, durchgeführt werden.
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5. Verfahren r.ach eiπerr. der vcrherceher.der. Ar.scruche, wobei die Schritte li~. cl) ur.d Iit. c2 ) sowie die Schritte iit. dl) ur.d Iit. c2) bei ümgebur.gszerr.peratJr durchgeführt werden.
6. Verfahren nach einem der verhergehencen Ansprüche, wobei die Nachweisnukleinsäure in einer Haarnadelstruktur vorliegt, bei welcher die Nachweisnukleinsäure zwei zueinander komplementäre Äste aufweist.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Referenznukleinsäure in einer Haarnadelstruktur vorliegt, bei welcher die Referenznukleinsäurestränge zwei zueinander komplementäre Äste aufweist.
8. Verfahren nach einen der vorhergehenden Ansprüche, wobei beim Schritt Iit. c2) und/oder Iit. d2) die Markierung mit Licht eines vorgegeben Wellenlängenbereichs bestrahlt wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Markierung auf einer Licht reflektierenden Unterlage aufgebracht ist.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei sowohl die Nachweis- als auch die Referenzlösung auf ein ein- ziges, die Markierungsnukleinsäure enthaltendes Nachweisfeld der Markierung aufgebracht werden.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei jeweils ein vorgegebenes Volumen der Nachweis- und/oder die Referenzlösung auf die Markierung aufgetragen wird/werden.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erwartete erste Eigenschaft eine vorgegebene Maximalintensität in einem ersten Weilenlängenbereich und die erwarte-
28 te zweite Eigenschaft eine vorgegebene Mir.destir.ter.sit≤t xr. eir.e.T. zweiter. Weller.lär.ger.bereich ist.
13. Verfahren nach einer, der vorhergehenden Ansprüche, wobei der erste und zweite Fluorophor identisch sind.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Markierung außer der Markierungsnukleinsäure zumindest eine weitere Nukleinsäure enthält.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Markierung eine die Markierungsnukleinsäure und/oder die weitere Nukleinsäure enthaltende Druckfarbe verwendet wird.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Markierung mit einem Druckverfahren auf den zu markierenden Gegenstand oder auf ein, vorzugsweise selbstklebendes, Etikett aufgebracht wird.
17. Kit mit einer die Referenzlösung enthaltenden ersten FlüssigkeitsSpendeeinrichtung, wobei die Referenzlösung eine zumindest abschnittsweise doppelsträngige Referenznukleinsäure enthält, deren Referenz- nukleinsäurestränge zu einer vorgegebenen Markierungsnuklein- säure nicht komplementär sind, und wobei am einen Referenznu- kleinsäurestrang ein erster Fluorophor und am anderem Refe- renznukleinsäurestrang ein erster Quencher in einem ein erstes Fluoreszenzsignal des ersten Fluorophors löschenden Abstand gebunden sind, und einer die Nachweislösung enthaltenden zweiten Flüssigkeitsspendeeinrichtung, wobei die Nachweislösung eine zumindest abschnittsweise doppelsträngige Nachweisnukleinsäure enthält, bei der einer der beiden Nachweisnukleinsäurestränge zur vorgegebenen Markierungsnukleinsäure zumindest ab-
29 schr.it~sweise komplementär ist, und webe: a.τ. eir.er. Nacr.weis- r.ukleir.säurestrang ein zweiter Fiuorcphor und am anderer. Nachweisnukieinsäurestrar.g ein zweiter Quencher in einen ein zweites Fluoreszenzsicnal des zweiten Fiucrcphors löschenden Abstand gebunden sind.
18. Kit nach Anspruch 17, wobei die erste und zweite Flüssigkeitsspendeeinrichtung jeweils ein die Nachweis- oder Re- ferenzlόsung enthaltender Stift oder eine Pipette ist.
19. Flüssigkeitsspendeeinrichtung mit einem ersten Behälter zur Aufnahme der Referenzlösung nach Anspruch 17 und einem zweiten Behälter zur Aufnahme der Nachweislösung nach Anspruch 17, und einer Einrichtung zur zeitlich aufeinanderfol- genden separaten Abgabe eines vorgegebenen Volumens der Referenz- und der Nachweislösung.
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