WO2008122550A2 - Pulverisator und dazugehöriges verfahren für die vorbereitung zur prozessierung einer biologischen probe - Google Patents

Pulverisator und dazugehöriges verfahren für die vorbereitung zur prozessierung einer biologischen probe Download PDF

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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B02—CRUSHING, PULVERISING, OR DISINTEGRATING; PREPARATORY TREATMENT OF GRAIN FOR MILLING
    • B02C—CRUSHING, PULVERISING, OR DISINTEGRATING IN GENERAL; MILLING GRAIN
    • B02C17/00—Disintegrating by tumbling mills, i.e. mills having a container charged with the material to be disintegrated with or without special disintegrating members such as pebbles or balls
    • B02C17/14—Mills in which the charge to be ground is turned over by movements of the container other than by rotating, e.g. by swinging, vibrating, tilting

Definitions

  • the invention relates to a method for the preparation of a vegetable or animal sample for processing, ie, for example, for the isolation of nucleic acids or proteins from the sample and a pulverizer.
  • a method for the preparation of a vegetable or animal sample for processing ie, for example, for the isolation of nucleic acids or proteins from the sample and a pulverizer.
  • Such preparations and examinations are carried out in a laboratory by a laboratory assistant or a laboratory technician on the basis of standardized work instructions.
  • Such a manual includes a so-called protocol.
  • An example of such a protocol for the isolation of plasmid DNA from E. coli is apparent from the document DE 1 01 53 957 Al.
  • kits can be obtained commercially, for example the "UltraClean Tissue DNA Isolation Kit” of the company, depending on the sample and the desired result.
  • Qiagen www.Qiagen.com
  • a sample is processed using such a kit according to a given protocol, it must be suitably prepared.
  • an organ is taken from a test animal, such as a rat. It depends on the objective, which organ of an animal is selected.
  • the removed tissue of the animal is washed in a washing buffer solution, for example in PBS (Phosphate Buffered Saline with the following contents: Na 2 HPO 4 (dried), NaH 2 PO 4 (dried), NaCl and distilled water).
  • a washing buffer solution for example in PBS (Phosphate Buffered Saline with the following contents: Na 2 HPO 4 (dried), NaH 2 PO 4 (dried), NaCl and distilled water).
  • tissue with a body temperature of, for example, 37 ° C is immersed in liquid nitrogen. Bubbles develop. The tissue is only removed from the liquid nitrogen when bubbling stops. Subsequently, the tissue is stored at -80 0 C, for example, with the aid of dry ice.
  • RNAIater® is a viscous liquid developed by Ambion (www.ambion.com) for the preservation of fresh tissue.
  • the preservative effect is based primarily on the fact that all enzymes inactivated by dehydration in the tissue and cell activities are stopped.
  • the viscous fluid must quickly diffuse into all cells of the tissue.
  • the size of the fabric pieces is therefore limited to an edge length of a maximum of half a centimeter.
  • the tissue thus treated is also cooled at -80 ° to store it until processing.
  • tissue For processing typically 10 to 100 mg of tissue is needed to perform the desired assay, isolation or the like. It is now separated before starting the processing, the required amount of animal tissue, for example, with a scalpel.
  • the separated sample, ie the separated tissue is now digested, that is, the cell walls must be opened. This can be done mechanically, chemically or enzymatically. Mechanical disruption takes place, for example, with the aid of a "TissueRuptor" from Qiagen, which is known from the TissueRuptor Handbook, July 2006 by Qiagen, in which a rotating knife with 35,000 revolutions per minute shatters cell walls of the tissue.Mechanical digestions are regularly carried out in a buffer. to avoid damage to the ingredients such as nucleic acids.
  • a sample is first blocked in paraffin and then cut into thin tissue layers by means of a microtome. If vegetable samples are to be processed, scalping can only be done with soft materials such as leaves, soft beans, etc. For dried or frozen plant samples, they are cooled in liquid nitrogen and ground in a liquid nitrogen cooled mortar using a pestle.
  • German Patent 738,286 teaches to freeze and grind cells together with a dispersion liquid so as to comminute cells.
  • a solution to the problem comprises the features of claim 1.
  • Other solutions include the features of the dependent claims, which are also directed to a method.
  • An apparatus for carrying out the method comprises the features of the last subsidiary claim.
  • a sample is first washed as described above and treated, for example, with liquid nitrogen or stored in RNAIater.
  • a closable preferably made of metal vessel or plastic existing vessel, which is equipped with a metal inlay, and a container located in the body, movable body cooled to a temperature which is well below 0 0 C.
  • the plastic container is a shell for the inlay.
  • An inlay is a body made separately from the shell. To distinguish this is a double-walled vessel, as it is known for example from the document US 6,235,501 B l, Figure 1 0, which does not include inlay in the sense of the present invention, since the two known vessel walls are integrally connected to each other.
  • the temperature to which the vessel is cooled should be at least -50 0 C.
  • a temperature of approx. - 80 0 C for example, from -70 0 C to -90 0 C to choose, since this is significantly further away from 0 ° C.
  • Dry ice can be provided inexpensively. It has been shown that cooling to approx. -80 0 C for particularly good results. Lower temperatures than -80 0 C up to a certain extent possible. It should be noted, however, that the vessel must not be allowed to cool too much. Thus, a temperature of liquid nitrogen, ie of -1 96 0 C has been found to be too low to get good results.
  • the interior of the vessel is dimensioned and designed in addition to the movable body therein.
  • Particularly suitable is a cylindrical interior with hollow spherical ends.
  • the movable body is then preferably a ball or a bolt with spherical ends.
  • the diameter the ball or the bolt is smaller than the diameter of the interior, so as to ensure the mobility.
  • the movable body is made of a hard, preferably heavy material such as metal in order to be able to crush the sample.
  • the biological sample for example a cooled rat heart, is preferably placed completely in the vessel without first chopping the sample in order to obtain good results.
  • a least -50 0 C cold sample is placed into the vessel.
  • the vessel is shaken for 10 to 30 seconds, in particular by hand, so that the movable body is hurled back and forth.
  • the thus crushed sample is removed and the desired amount is processed using a kit according to a protocol.
  • Seeds of plants can be prepared in this way for further processing. For skin and bone and comparatively hard or viscous samples, however, this method is not suitable.
  • the sample is in powder form, it advantageously has a particularly large surface area, from which subsequently used chemicals can attack.
  • a desired amount of powder can be provided particularly easily for subsequent steps, for example by weighing or even by appropriately sized measuring vessels, such as a measuring spoon.
  • Figure 1 shows in section a vessel 1, on which a cover 2 can be screwed.
  • a ball 3 which has a smaller diameter compared to the diameter of the vessel 1.
  • the diameter of the vessel is in the range of a few centimeters.
  • the interior of the vessel 1 is cylindrical. When closed, the ends are 5 and 6 of the vessel spherically shaped. By appropriate shaking of the vessel 1, the ball 3 is moved back and forth in the interior and strikes the ends 5 and 6.
  • the vessel 1, the lid 2 and the ball 3 are made of metal and that made of stainless steel.
  • the vessel is cooled in dry ice at -80 0 C.
  • a sample 7 is taken from an animal.
  • the sample is washed and immersed in nitrogen until no more bubbles form or stored in RNAIater for 24 hours, for example. Following this, the sample may initially be stored in dry ice at -80 0 C.
  • dry ice In the case of a plant dried plant tissue such as seeds in the vessel 1 is cooled on dry ice. Fresh plant material like leaves are previously cooled to -80 0 C.
  • the vessel l has been cooled to the desired temperature, this is removed by hand.
  • the hand is expediently protected from the cold with a cotton glove and a glove made of latex.
  • the sample 7 is placed in the vessel 1, in which the ball 3 is located.
  • the lid 2 is screwed onto the vessel 1 and this closed so tightly.
  • the vessel 1 is shaken by hand back and forth, so that the ball 3 impinges alternately on the two ends 5 and 6.
  • the sample 7 is thereby smashed.
  • the result is a free-flowing powder that can be initially stored in the vessel 1 further. It is unscrewed immediately or following storage of the lid 2 and removed the crushed sample. A desired amount can now be provided by weighing, for example.
  • a liver was taken from a rat and washed in PBS. Following this, the liver was stored in RNAIater® for 24 hours. Following this, the rat liver was stored at -80 ° C until further use. The liver was crushed in the cooled, closed vessel for 20 seconds as previously described. Using a funnel, the crushed sample was placed in a Falcon tube, and further stored in dry ice at -80 0 C initially.
  • the used DNeasy protocol from Qiagen includes the following steps.
  • the 1 0 mg tissue is incubated with 1 80 ⁇ l of BUFFER 1 + 20 ⁇ l proteinase K at 56 ° C for one hour in a rocking platform.
  • 4 ⁇ l RNase A are pipetted in and incubated for 2 minutes at room temperature.
  • 200 ul AL lysis buffer
  • 200 ⁇ l of ethanol (100%) are pipetted in and mixed by gentle inverting.
  • the column is washed as described in the protocol with 500 ⁇ l of buffer AW 2 for 3 minutes at 1 4000 revolutions per minute. The supernatant is again discarded.
  • the optional drying step described in the protocol is used for 1 minute at 1 4000 rpm.
  • 200 ⁇ l of RNase-free water is pipetted into the center of the column and incubated at room temperature for 1 minute, then centrifuged at 8000 rpm for 1 minute. This eluate is measured by means of a spectrometer. This serves to determine the concentration and to determine the degree of purity.
  • an agarose gel is made for qualitative and quantitative DNA determination. On this basis, the quality of the DNA, the degree of degradation, the size of the molecule and its amount can be determined.
  • the bright upper regions in FIG. 2 characterize the genomic DNA.
  • the bright area above TR is not as high as above TD +, TD- or TD / TR.
  • Figure 2 shows images of DNA agarose gels used as described above to determine the quantity and quality of the DNA.
  • a 1% gel is poured.
  • 1 g of agarose powder long-chain carbohydrate molecules that can polymerize
  • 1 00 ml (1 x) TAE buffer heated in the microwave.
  • the resulting solution is mixed with 5 .mu.l Ethid iumbromid and mixed by shaking the flask and poured into a mold.
  • the hot solution now combs are clamped, which leave as the solution cools, which polymerizes, prints in the gel, which later form the slots in which the sample mixed with 5 ⁇ l Lo ⁇ ding Dye is pipetted into it.
  • a marker is additionally added to the gel for later size comparison.
  • the DNA spreads after application of an electrical voltage due to its different weight and charge, d. H . Small degraded fragments move faster in the gel than high molecular weight DNA.
  • the DNA obtained by the method according to the invention can be seen in the form of a cloud with the naked eye.
  • Stabilization reagent has been treated, but was first frozen in liquid nitrogen. It was obtained with the aid of the method according to the invention, the double concentration of RNA compared to the known from the prior art, the method described above.
  • the supernatant was then pipetted into a new 2 ml reaction tube and 0.5X volume of 96-100% ethanol pipetted in and mixed through the pipette. Subsequently, first 700 ⁇ l of the solution were pipetted into the RNeasy column and centrifuged for 1 5 seconds at 10,000 revolutions per minute. Since the column has only 700 ⁇ l capacity, this step was repeated for the remaining solution so that the entire sample was passed over the column. The supernatant after centrifugation was discarded. Thereafter, the column was washed with 350 ul buffer RWl for 1 5 seconds at 8000 g and the supernatant discarded.
  • the column was then transferred once more to a new 2 ml reaction vessel and dried therein for 1 minute at maximum speed.
  • the column was transferred to a new 2 ml reaction vessel and filled with 30 ⁇ l of RNase-free water and centrifuged for 1 minute at 10,000 revolutions per minute to elute.
  • the eluate was then also measured by spectrometer and evaluated by RNA agarose gel.
  • FIG. 3 shows a particularly preferred embodiment of a closable vessel with which a sample is pulverized.
  • This vessel is called pulverizer below. It comprises an inlay 10, which preferably consists of metal for the reasons stated above.
  • the inlay 10 is comprised of a shell 11 preferably made of plastic.
  • the plastic shell serves primarily as an insulator to maintain the low temperature during Scblinins. Overall, the weight can be advantageously reduced in comparison to a completely made of metal pulverizer, which facilitates handling.
  • the double arrow below the pulverizer shown in FIG. 3 illustrates the preferred direction of movement in order to comminute the sample 7.
  • the buffers and reagents mentioned in the present application can be used in the Fa. Qiagen GmbH, Hilden, Germany, unless otherwise expressly stated.
  • FIG. 4 shows a section through a further improved embodiment of the invention.
  • the pulverizer comprises an inner sealable container 4 made of plastic.
  • the plastic inner container adjacent to so closely to the preferably made of metal inner walls of the pulverizer, so that the plastic inner container can not be destroyed by a ball 3 or a similar means during pulverization.
  • the plastic inner container 4 is removed after pulverization and can now serve as a storage vessel. Since the inner container is made of plastic, this can be made very inexpensive and therefore suitable for single use.
  • the lid of the inner container closes the remaining part of the container preferably by a positive connection, or it can be screwed onto the remaining part.
  • a positive connection is possible because plastic can be sufficiently elastic, so that, for example, an inwardly projecting bead of the lid snaps into a designated annular recess of the rest of the container body or vice versa, when the lid is pressed to the rest of the container body suitable.
  • Such a positive connection is particularly preferable because accidental release of the lid is particularly reliably avoided.
  • a container can be closed faster compared to a closure with a screw cap.
  • a set comprises, in addition to a pulverizer, a multiplicity of inner containers, which are preferably optically different, for example because of differently colored covers or different embossments.
  • the different optics can be used advantageously for the identification of a content.
  • a red-colored container lid can be used to mark a "heart" located therein and another lid, for example a green-colored lid, to identify another organ, such as a lung, for example no longer be labeled separately, which can be problematic due to the low temperatures.
  • the existing plastic plastic inner container can be made of PET, but also made of PP or PE, since such plastics are grown to the intended low temperatures in principle.
  • a kit in one embodiment, includes one or more measuring spoons besides a pulverizer so as to facilitate or accelerate the removal of the required amount of sample from the pulverizer or from an inner container.
  • a measuring spoon is so dimensioned and assigned to certain samples that the measuring spoon is capable of receiving a suitable amount of sample for further processing.
  • a separate weighing of a sample taken from the pulverizer can thus be accelerated or even completely eliminated.
  • a set comprises a plurality of optically labeled measuring spoons associated with different samples.
  • a red-colored measuring spoon can be provided for the removal of a heart sample.
  • the identifications of inner containers or parts of inner containers coincide with the identifications of measuring spoons.
  • Such a set then also includes a predetermined assignment of identifiers to samples, that is, for example, to organs. If, for example, a green-colored measuring spoon is provided for the organ lung, then an inner container is likewise completely or partially dyed green. The dimensioning of the measuring spoon is adapted to the sample "lung.”
  • the set then contains a corresponding assignment rule, which can be that a corresponding sample, for example a lung, is already displayed on the corresponding container and / or the measuring spoon.
  • a set comprises, in addition to a pulverizer, a shaking apparatus to facilitate the opening of an imprinter Automated Pulveris ⁇ tor sample to perform automated.
  • a shaking apparatus to facilitate the opening of an imprinter Automated Pulveris ⁇ tor sample to perform automated.
  • One or more Pulverisatoren can be used in the shaker or attached to this suitable.
  • the shaking apparatus comprises coolable receiving devices for receiving pulverizers.
  • the shaking apparatus does not need to be digested immediately after filling the sample in the pulverizer, if it can be sufficiently cooled. So it can be a variety of

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Vorbereitung einer pflanzlichen oder tierischen Probe für eine Prozessierung, also beispielsweise für die Isolierung von Nukleinsäuren oder Proteinen aus der Probe sowie einen Pulverisator.

Description

Pulverisαtor und dazugehöriges Verfahren für die Vorbereitung zur
Prozessierung einer biologischen Probe
Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Vorbereitung einer pflanzlichen oder tierischen Probe für eine Prozessierung, also beispielsweise für d ie Isolierung von Nukleinsäuren oder Proteinen aus der Probe sowie einen Pulverisator. Solche Vorbereitungen und Untersuchungen werden in einem Labor von einer Laborantin oder von einem Laboranten anhand von standardisierten Arbeitsanleitungen durchgeführt. Zu einer solchen Arbeitsanleitung gehört ein sogenanntes Protokoll. Ein Beispiel für ein solches Protokoll zur Isolierung von Plasmid -DNA aus E . coli, geht aus der Druckschrift DE 1 01 53 957 Al hervor.
Um eine Probe in gewünschter Weise zu prozessieren, also beispielsweise die Nukleinsäuren oder Proteine zu isolieren, können in Abhängigkeit von der Probe und vom gewünschten Ergebnis sogenannte „Kits" kommerziell erhalten werden, so zum Beispiel das „UltraClean Tissue DNA Isolation Kit" der Fa . Qiagen (www.Qiagen.com) . Bevor eine Probe mit Hilfe eines solchen Kits gemäß einem vorgegebenen Protokoll prozessiert wird, muss diese geeignet vorbereitet werden .
Nachfolgend werden solche aus dem Stand der Technik bekannte typische Vorbereitungen beschrieben.
Einem Versuchstier, so zum Beispiel einer Ratte, wird beispielsweise ein Organ entnommen . Es hängt von der Zielsetzung ab, welches Organ eines Tieres ausgewählt wird .
Das entnommene Gewebe des Tieres wird in einer Waschpufferlösung gewaschen, so zum Beispiel in PBS (Phosphate Buffered Saline mit folgendem Inhalt: Na2HPO4 (getrocknet), NaH2PO4 (getrocknet), NaCI und destilliertes Wasser) . Durch die Waschung wird das Gewebe des entnommenen Teils blutfrei bereitgestellt und von unerwünschten Bestandteilen befreit.
Im Anschluss daran wird das entnommene Gewebe im flüssigen Stickstoff gekühlt und zwar u . a ., um Zellaktivitäten zu stoppen . Andernfalls würde nicht die gewünschte Information in der gewünschten Qualität im Anschluss an die Prozessierung erhalten . Typischerweise wird dabei Gewebe mit einer Körpertemperatur von beispielsweise 37°C in flüssigen Stickstoff eingetaucht. Es entwickeln sich Blasen . Das Gewebe wird erst wieder dem flüssigen Stickstoff entnommen, wenn die Blasenbildung stoppt. Im Anschluss daran wird das Gewebe bei -800C beispielsweise mit Hilfe von Trockeneis gelagert.
Soll der Kühlschritt in Flüssigstickstoff vermieden werden, so wird alternativ im Anschluss an die Waschung das entnommene Gewebe chemisch konserviert und zwar über Stabilisierungsreagenzien wie z. B. RNAIater®. RNAIater® ist eine viskose Flüssigkeit, die von der Firma Ambion (www.ambion.com) zur Konservierung von Frischgewebe entwickelt wurde. Die Konservierungswirkung beruht vor allem darauf, dass alle Enzyme durch Wasserentzug im Gewebe inaktiviert und Zellaktivitäten gestoppt werden . Die viskose Flüssigkeit muss schnell in alle Zellen des Gewebes hinein diffundieren. Die Größe der Gewebestücke ist daher auf eine Kantenlänge von maximal einem halben Zentimeter zu beschränken . Im Anschluss an die chemische Behandlung wird auch das so behandelte Gewebe bei -80° gekühlt, um es so bis zur Prozessierung zu lagern .
Für eine Prozessierung werden typischerweise 1 0 bis 1 00 mg an Gewebe benötigt, um die gewünschte Untersuchung, Isolierung oder dergleichen durchzuführen . Es wird nun vor Beginn der Prozessierung die benötigte Menge an tierischem Gewebe beispielsweise mit einem Skalpell abgetrennt. Die abgetrennte Probe, also das abgetrennte Gewebe wird nun aufgeschlossen, das heißt, die Zellwände müssen geöffnet werden. Dies kann mechanisch, chemisch oder enzymatisch erfolgen . Ein mechanischer Aufschluss erfolgt beispielsweise mit Hilfe eines „TissueRuptor" der Firma Qiagen, bekannt aus dem TissueRuptor Handbook, Juli 2006 der Firma Qiagen . Dabei zerschlägt ein drehendes Messer mit 35.000 Umdrehungen pro Minute Zellwände des Gewebes. Mechanische Aufschlüsse werden regelmäßig in einem Puffer durchgeführt, um Schädigungen der Inhaltsstoffe wie zum Beispiel Nukleinsäuren zu vermeiden.
Ein in einem Behälter unter Anwesenheit eines Puffers, also eines chemischen Stoffes durchgeführter mechanischer Aufschluss ist aus der Druckschrift EP 1 57701 1 A2 bekannt.
Es ist auch bekannt (siehe zum Beispiel http ://www. Ia borpraxis.de/fachartikel/lp_facha rtikel_nh_2384859. htm I,
Stand 1 2. März 2007), Proben in einer Kryomühle vorzubereiten . Bei dieser Mühle wird die Probe bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff gemahlen . Die Probe bleibt während des gesamten Mahlvorgangs tiefgekühlt, ohne mit dem Stickstoff in Kontakt zu kommen . Dieses technisch recht aufwendige Verfahren kann bei solchen Proben durchgeführt werden, bei denen das vorgenannte Verfahren versagt, so zum Beispiel bei sehr harten Materialien wie Knochen oder bei klollagenhaltigen Materialien wie Haut. Soll ein Knochen vorbereitet werden, so ist auch bekannt, diesen in ein mit flüssigem Stickstoff gefülltes Gefäß zu bringen und mit Hilfe eines Metallbolzens zu zerstoßen. Der Knochen liegt anschließend in Pulverform vor.
Sollen histologische Untersuchungen mittels eines Mikroskops durchgeführt werden, so wird eine Probe zunächst in Parafin eingeblockt und dann mittels Mikrotom in dünne Gewebeschichten geschnitten . Sollen pflanzliche Proben prozessiert werden, ist ein Zurechtschneiden mittels Skalpell nur bei weichen Materialien wie zum Beispiel Blättern, weichen Bohnen usw. möglich . Bei getrockneten oder gefrorenen Pflanzenproben werden diese in flüssigem Stickstoff gekühlt und in einem mit flüssigem Stickstoff gekühlten Mörser mit Hilfe eines Stößels zermahlen .
Die deutsche Patentschrift 738 286 lehrt, Zellen zusammen mit einer Dispersionsflüssigkeit einzufrieren und zu vermählen, um Zellen so zu zerkleinern .
Aus den Druckschriften DE 602005001 256 T2 sowie WO 2004/082837 Al gehen jeweils eine Zerstoß-/Mischvorrichtung für Nahrungsmittel wie Gewürze hervor. Die Vorrichtung umfasst einen Hohlkörper mit einer darin befindlichen Kugel, mit der Nahrungsmittel zerstoßen werden sollen . Die Druckschriften US 2004/01 44874 Al , JP 2006051 505 A, JP 2002-066 366 A sowie JP 03-186 360 A offenbaren weitere Beispiele für Ballmühlen und damit vergleichbare Vorrichtungen .
Mit einer Probenvorbereitung der vorgenannten Art wird das Ziel verfolgt, im Anschluss an die Prozessierung ein möglichst gutes gesuchtes Resultat zu erhalten. In Übereinstimmung hiermit ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Probenvorbereitung bereitzustellen, die verbesserte gesuchte Resultate im Anschluss an eine Prozessierung ermöglicht.
Eine Lösung der Aufgabe umfasst die Merkmale von Anspruch 1 . Weitere Lösungen umfassen die Merkmale der Nebenansprüche, die ebenfalls auf ein Verfahren gerichtet sind . Eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens umfasst die Merkmale des letzten Nebenanspruchs.
Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen .
Die anspruchsgemäße Lehre funktioniert sowohl für pflanzliches als auch für tierisches oder menschliches Gewebe und zwar sowohl für stabilisierte als auch für frische Proben von Pflanzen oder Geweben . Zur Lösung der Aufgabe wird in einer Ausführungsform eine Probe zunächst wie eingangs geschildert gewaschen und beispielsweise mit flüssigem Stickstoff behandelt oder in RNAIater gelagert. Es werden ein verschließbares, vorzugsweise aus Metall bestehendes Gefäß oder aus Kunststoff bestehendes Gefäß, welches mit einem Metall-Inlay ausgestattet ist, und ein im Gefäß befindlicher, beweglicher Körper gekühlt und zwar auf eine Temperatur, die deutlich unterhalb von 00C liegt. Das aus Kunststoff bestehende Gefäß ist eine Hülle fü r das Inlay. Ein Inlay ist ein getrennt von der Hülle hergestellter Körper. Davon zu unterscheiden ist ein doppelwandiges Gefäß, wie es beispielsweise aus der Druckschrift US 6,235,501 B l , Figur 1 0, bekannt ist, welches kein Inlay im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst, da die hieraus bekannten beiden Gefäßwände einstückig miteinander verbunden sind .
Die Temperatur, auf die das Gefäß gekühlt wird, sollte wenigstens -500C betragen . Vorzugsweise ist eine Temperatur von ca . - 80 0C, so zum Beispiel von -700C bis -900C zu wählen, da diese deutlich weiter weg von 0°C liegt. Auch können -80°C bzw. -70°C bis -900C mit Hilfe von
Trockeneis preiswert bereitgestellt werden. Es hat sich gezeigt, dass sich durch eine Kühlung auf ca . -800C besonders gute Ergebnisse erzielen lassen . Tiefere Temperaturen als -800C sind bis zu einem gewissen Grad möglich. Zu beachten ist allerdings, dass das Gefäß nicht zu stark abgekühlt werden darf. So hat sich eine Temperatur von flüssigem Stickstoff, also von -1 96 0C als zu tief herausgestellt, um zu guten Resultaten zu gelangen .
Mit dem im Gefäß befindlichen Körper wird das Ziel verfolgt, durch Schüttelbewegung des Gefäßes eine darin befindliche tiefgekühlte Probe zu zerstoßen . Entsprechend diesem Ziel ist der Innenraum des Gefäßes nebst dem darin befindlichen beweglichen Körper dimensioniert und gestaltet. Besonders geeignet ist ein zylinderförmiger Innenraum mit hohlkugelförmigen Enden . Der bewegliche Körper ist dann bevorzugt eine Kugel oder aber ein Bolzen mit kugelförmigen Enden . Der Durchmesser der Kugel oder des Bolzens ist kleiner als der Durchmesser des Innenraums, um so die Beweglichkeit zu gewährleisten . Der bewegliche Körper besteht aus einem harten, vorzugsweise schweren Material wie Metall, um die Probe zerstoßen zu können .
Die biologische Probe, so zum Beispiel ein gekühltes Rattenherz wird vorzugsweise vollständig in das Gefäß gegeben, ohne die Probe zuvor zu zerkleinern, um so zu guten Resultaten zu gelangen . Insbesondere wird eine wenigstens -500C kalte Probe in das Gefäß gegeben . Anschließend wird das Gefäß insbesondere 1 0 bis 30 Sekunden insbesondere mit der Hand so geschüttelt, dass der bewegliche Körper hin und her geschleudert wird . Im Anschluss daran wird die so zerstoßene Probe entnommen und die gewünschte Menge mit Hilfe eines Kits gemäß einem Protokoll prozessiert. Grundsätzlich befinden sich in dem Gefäß außer der Probe und einem oder mehreren beweglichen Körper keine weiteren Substanzen und zwar insbesondere auch kein Kühlmittel wie flüssiger Stickstoff oder aber beispielsweise Pufferlösungen . Diese würden lediglich das gewünschte Ergebnis verschlechtern .
Es hat sich überraschend gezeigt, dass bei dieser Form der Probenvorbereitung bessere Ergebnisse erzielt werden im Vergleich zu den aus dem Stand der Technik bekannten Probenvorbereitungen, obwohl kein großer technischer Aufwand betrieben wird und die Handhabung einfach ist. Der technische Aufwand ist nicht groß, da das Gefäß mit dem darin befindlichen, beweglichen Körper lediglich in Trockeneis auf eine Temperatur von beispielsweise -800C gekühlt wird . Anschließend kann das gekühlte Gefäß von Hand, die mit Handschuhen leicht hinreichend vor der Kälte geschützt werden kann, entnommen, die Probe hineingegeben und das Gefäß verschlossen werden . Anschließend wird es noch nicht einmal eine Minute lang geschüttelt, und die Probe kann entnommen und beispielsweise erst einmal wieder beispielsweise gekühlt in einem weiteren Gefäß gelagert werden . Alternativ wird die Probe nicht entnommen und in einem weiteren Gefä ß gelagert, sondern sofort in dem Gefäß, welches den beweglichen Körper enthält. Es dient also dann zugleich als Aufschlussgefäß und Aufbewahrungsbehälter. Die gewünschte Probenmenge für die Prozessierung kann genau und einfach bereitgestellt werden. Auch wird dabei eine homogene Gewebeverteilung erreicht. Selbst stabilisiertes Gewebe, Blätter und
Samen von Pflanzen können in dieser Weise für die weitere Prozessierung vorbereitet werden . Für Haut und Knochen und vergleichbar harte bzw. viskose Proben ist a llerdings dieses Verfahren nicht geeignet.
Da die Bearbeitung im gekühlten, geschlossenen Gefäß nicht sehr viel Zeit in Anspruch nimmt, ist es nicht erforderlich, den Schüttelvorgang zu unterbrechen und das Gefäß zwischendurch wieder auf geeignete, tiefe Temperaturen abzukühlen. Dies gilt vor allem, wenn das Gefäß aus Metall besteht und hinreichend dicke Wandungen aufweist. Eine Wandung von wenigen Millimeter Dicke genügt bereits. Überraschend hat sich weiter herausgestellt, dass ein Aufschluss in beispielsweise einem TissueRupter entfallen kann . Die so vorbereitete Probe kann also sofort prozessiert werden und dies mit besonders guten Endergebnissen .
Da die Probe in Pulverform vorliegt, weist diese vorteilhaft eine besonders große Oberfläche auf, an der nachfolgend eingesetzte Chemikalien angreifen können . Eine gewünschte Menge an Pulver kann für nachfolgende Schritte besonders einfach bereitgestellt werden, so zum Beispiel durch Wiegen oder sogar durch entsprechend dimensionierte Messgefäße wie ein Messlöffel.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Figur 1 zeigt im Schnitt ein Gefäß 1 , auf welches ein Deckel 2 aufgeschraubt werden kann . Im Gefäß 1 befindet sich eine Kugel 3, die einen kleineren Durchmesser im Vergleich zum Durchmesser des Gefäßes 1 aufweist. Der Durchmesser des Gefäßes liegt im Bereich von wenigen Zentimetern. Der Innenraum des Gefäßes 1 ist zylinderförmig. Im geschlossenen Zustand sind die Enden 5 und 6 des Gefäßes hαlbkugelförmig geformt. Durch entsprechendes Schütteln des Gefäßes 1 wird die Kugel 3 im Inneren hin und her bewegt und schlägt auf die Enden 5 und 6 auf . Das Gefäß 1 , der Deckel 2 und die Kugel 3 bestehen aus Metall und zwar aus Edelstahl.
Zunächst wird das Gefäß in Trockeneis bei -800C gekühlt.
Eine Probe 7 wird einem Tier entnommen. Die Probe wird gewaschen und in Stickstoff getaucht, bis sich keine Blasen mehr bilden oder beispielsweise für 24 h in RNAIater gelagert. Im Anschluss daran kann die Probe zunächst in Trockeneis bei minus 800C gelagert werden . Im Fall einer Pflanze wird getrocknetes Pflanzengewebe wie zum Beispiel Samen im Gefäß 1 auf Trockeneis gekühlt. Frisches Pflanzenmaterial wie zum Beispiel Blätter werden zuvor auf -80 0C gekühlt.
Ist das Gefäß l auf die gewünschte Temperatur gekühlt worden, so wird dieses von Hand entnommen . Die Hand ist dabei zweckmäßigerweise mit einem Baumwollhandschuh und einem aus Latex bestehenden Handschuh vor der Kälte geschützt. Mit einer Pinzette wird die Probe 7 in das Gefäß 1 hinein gegeben, in dem sich auch die Kugel 3 befindet. Im Anschluss daran wird der Deckel 2 auf das Gefäß 1 aufgeschraubt und dieses so fest verschlossen. Nun wird das Gefäß 1 von Hand hin und her geschüttelt, so dass die Kugel 3 auf die beiden Enden 5 und 6 abwechselnd auftrifft. Die Probe 7 wird dadurch zerschlagen . Dieser
Vorgang endet nach 20 bis 30 Sekunden. Es entsteht so ein rieselfähiges Pulver, das in dem Gefäß 1 zunächst weiter gelagert werden kann. Es wird unmittelbar oder im Anschluss an eine Lagerung der Deckel 2 abgeschraubt und die zerstoßene Probe entnommen . Eine gewünschte Menge kann nun beispielsweise durch Wiegen bereitgestellt werden .
Es wurde einer Ratte eine Leber entnommen und in PBS gewaschen . Im Anschluss daran wurde die Leber für 24 Stunden in RNAIater® gelagert. Im Anschluss daran wurde die Rattenleber bis zur weiteren Verwendung bei -80°C gelagert. Die Leber wurde wie zuvor beschrieben im gekühlten, geschlossenen Gefäß 20 Sekunden lang zerstoßen. Mit Hilfe eines Trichters wurde die zerstoßene Probe in ein Falcon Röhrchen eingefüllt und in Trockeneis bei -800C zunächst weiter gelagert.
1 0 mg der in dem Falcon Röhrchen befindlichen Probe wurde schließlich mit einer Waage abgewogen. Dabei wurde darauf geachtet, dass die Probe nicht auftaute.
1 80 μl einer wässrigen Lösung enthaltend 1 00 mM SDS, 1 0OmM EDTA; 5OmM Tris; 1 0OmM NaCI (PUFFER 1 ) und 20 μl ProtK wurden in ein 2 ml Reaktionsgefäß abgefüllt, und danach wurde die abgewogene Menge an Probe, also 1 0 mg unter Vortexen hinzugegeben. Dies verhindert eine Verklumpung der Probe, wodurch verhindert wird, dass sich DNeasy bzw. RNeasy Säulen zusetzen, die im Rahmen eines entsprechenden Protokolls bzw. Kits eingesetzt werden .
Das verwendete DNeasy Protokoll der Firma Qiagen beinhaltet folgende Schritte. Die 1 0 mg Gewebe werden mit 1 80 μl PUFFER 1 + 20 μl Proteinase K bei 56°C für eine Stunde in einer Rocking Plattform inkubiert. Im Anschluss werden 4 μl RNase A hinzu pipettiert und für 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach werden 200 μl AL (Lysispuffer) hinzu pipettiert und bei 70 0C für 1 0 Minuten in einer Rocking Plattform inkubiert. Im weiteren Verlauf werden 200 μl Ethanol ( 1 00 %) hinzu pipettiert und durch leichtes Invertieren gemischt. Hier ist der Punkt, wo die DNA als „Wolke" zu erkennen ist. Dies ist ein Zeichen für die Sensitivität der Methode, da es zeigt, dass das Molekül kaum beschädigt wird und hochmolekular vorliegt. Um die Säuleneffizienz zu steigern, wird die erhaltende Lösung 3 x mit der Pipette durch Aufziehen gemischt. Im Anschluss wird die gesamte Lösung in eine DNeasy Säule pipettiert und für 1 Minute bei 8000 rpm zentrifugiert. Die entsprechende Nukleinsäure ist nun an das Säulenmaterial gebunden. Der Überstand wird verworfen und die Säule nun mit 500 μl Waschbuffer AW 1 bei 8000 Umdrehungen pro Minute für 1 Minute gewaschen. Dieser Schritt wurde zusätzlich nochmals angewendet, auch wenn dieser durch das Protokoll nicht empfohlen wird . Im Anschluss wird die Säule wie im Protokoll beschrieben mit 500 μl Puffer AW 2 f ür 3 Minuten bei 1 4000 Umdrehungen pro Minute gewaschen . Der Überstand wird abermals verworfen . Zusätzlich findet der im Protokoll beschriebene optionale Schritt der Trocknung für 1 Minute bei 1 4000 Umdrehungen pro Minute Anwendung . Zuletzt werden 200 μl RNase freies Wasser in die Mitte der Säule pipettiert und bei Raumtemperatur für 1 Minute inkubiert, um dann bei 8000 Umdrehungen pro Minute (rpm) für 1 Minute zentrifugiert zu werden. Dieses Eluat wird mittels eines Spektrometers vermessen. Dieses dient zur Konzentrationsbestimmung und zur Bestimmung des Reinheitsgrades. Letztendlich wird zur qualitativen und quantitativen DNA Bestimmung ein Agarosegel angefertigt. Hierauf kann die Qualität der DNA, der Grad der Degradation, die Größe des Moleküls sowie dessen Menge bestimmt werden .
Die so erhaltenen Ergebnisse werden in der Figur 2 verdeutlicht und mit Vergleichsbeispielen verglichen . Oberhalb von „TR" wird das Ergebnis gezeigt, bei dem eine Rattenleber zunächst gemäß dem Stand der Technik in der eingangs genannten Art vorbehandelt wurde, also zunächst gewaschen und in RNAIater gelagert wurde. Anschließend wurde eine gewünschte Probenmenge von 1 0 mg abgetrennt und in einem TissueRupter® aufgeschlossen .
Rechts daneben oberhalb von „TR + " wird das Ergebnis gezeigt, welches nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurde. Damit die Säuleneffizienz der DNeasy Säule im Rahmen der Prozessierung besser ausgenutzt werden kann, wurde die nach DNeasy Protokoll verarbeitete Lösung nach Zugabe von 200 μl Ethanol ( 1 00%) mittels Pipette durch dreimaliges Aufziehen und anschließendes Abgeben gemischt. Hierdurch wird die hochmolekulare DNA so vorbereitet, dass sie an die DNeasy Säule binden kann . Rechts daneben oberhalb von „TD-,, wird das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Ergebnis gezeigt, bei dem keine Durchmischung mithilfe einer Pipette durchgeführt wurde, um so die Säuleneffizienz zu verbessern .
Rechts daneben oberhalb von „TD/TR" wird das Ergebnis gezeigt, bei dem die Probe zunächst einmal erfindungsgemäß vorbereitet wurde. Abschließend wurde die zerstoßene Probe jedoch in einem TissueRuptor® 3 Sekunden lang weiter aufgeschlossen . An den verschmierten Rändern ist deutlich zu sehen, dass schon nach 3 Sekunden eine Verstärkung der Degradierung stattfindet.
Die hellen oberen Bereiche in der Figur 2 charakterisieren die genomische DNA. Der helle Bereich oberhalb von TR reicht nicht so hoch wie oberhalb von TD + , TD- oder TD/TR . Je höher der helle Bereich reicht, desto hochmolekularer ist die erhaltene DNA und desto besser ist also das erhaltene Ergebnis.
Der helle Bereich oberhalb von TR, der nach dem Stand der Technik erhalten wurde, verschmiert und geht in einen hellgrauen Bereich über. Dies ist ein Zeichen, dass die DNA degradiert, also beschädigt worden ist. Eine solche Beschädigung konnte durch das erfindungsgemäße Verfahren gemäß TD + sowie gemäß TD- vermieden werden.
Die Fig. 2 zeigt Aufnahmen von DNA Agarosegelen, die wie oben beschrieben eingesetzt werden um die Quantität und Qualität der DNA zu bestimmen . Hierzu wird ein 1 % Gel gegossen. Hierfür wird 1 g Agarosepulver (langkettige Kohlenhydratmoleküle die Polymerisieren können) abgewogen und in 1 00 ml ( 1 x) TAE Puffer gelöst und in der Mikrowelle erhitzt. Die erhaltene Lösung wird mit 5 μl Ethid iumbromid versetzt und durch Schütteln der Kolbenflasche vermischt und in eine Form gegossen . In die heiße Lösung werden nun Kämme eingespannt, die beim Abkühlen der Lösung, wobei diese polymerisiert, Abdrücke im Gel hinterlassen, die später die Slots bilden, in denen die Probe vermischt mit 5 μl Loαding Dye hinein pipettiert wird . Um später unter UV- Licht eine Aussage treffen zu können, wird zum späteren Größenvergleich ein Marker zusätzlich auf das Gel gegeben . Die DNA verteilt sich nach Anlegung einer elektrischen Spannung aufgrund Ihres unterschiedlichen Gewichtes und der Ladung, d . h . kleine degradierte Fragmente bewegen sich schneller im Gel als hochmolekulare DNA.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene DNA kann in Form einer Wolke mit bloßem Auge gesehen werden .
Im Rahmen eines weiteren Versuchs wurde 25 mg „frisches" Rattenherz untersucht. „Frisch" bedeutet, dass es nicht mit dem
Stabilisierungsreagenz behandelt worden ist, sondern zunächst in flüssigem Stickstoff tiefgekühlt wurde. Es wurde mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens die doppelte Konzentration an RNA erhalten im Vergleich zur aus dem Stand der Technik bekannten , eingangs beschriebenen Methode.
In diesem Versuch wurde dasselbe Verfahren zur Pulverisierung angewendet wie bei dem zuvor beschriebenen Versuch . Das Herz der Ratte wurde entnommen und mittels Flüssigstickstoff gekühlt, bis keine Blasen mehr entstanden sind . Im Anschluss wurde das Herz auf Trockeneis (-80 0C) gelagert. Kurz vor der Prozessierung wurde das Gefäß 1 auf Trockeneis gekühlt und mit dem gefrorenen ganzen Herzen gefüllt und für 20 Sekunde mit der Hand geschüttelt. Im Anschluss wurde das Pulver im Gefäß gelagert, um Zeit zu haben, die Materialien für das RNeasy Fibrous Tissue Mini Protokoll zu besorgen . Dieses stellt kein Problem dar, denn das Gefäß war Aufschluss- und Aufbewahrungsgefäß in einem . Zur weiteren Bearbeitung nach dem genannten Protokoll wurden unter einem Abzug 300 μl einer wässrigen Lösung enthaltend 3,5 M GTC; 28 mM Na3 -Citrate x 2 H2O (RLT Puffer, Lysispuffer) mit 3 μl ß-Mercaptoethanol in einem 2 ml Reaktionsgefäß vermischt und 25 mg des gelagerten Herz- Gewebepulvers in das Reaktionsgefäß eingewogen und im Anschluss gevortext. Hinzu kamen 590 μl RNase-freies-Wasser und 1 0 μl ProtK (Enzym), welches mittels Pipette gemischt wurde, bevor es für 1 0 Minuten bei 55 0C auf einer Rocking Plattform inkubiert wurde, um danach für 3 Minuten bei Raumtemperatur bei 1 0000 x g zentrifugiert zu werden. Der Überstand wurde dann in ein neues 2 ml Reaktionsgefäß pipettiert und das 0,5fache Volumen an 96 - 1 00% Ethanol hinzu pipettiert und durch die Pipette vermischt. Im Anschluss wurden zunächst 700 μl der Lösung in die RNeasy Säule pipettiert und für 1 5 Sekunden bei 1 0000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Da die Säule nur 700 μl Fassungsvermögen hat, wurde dieser Schritt für die verbleibende Lösung wiederholt, so dass die gesamte Probe über die Säule gegeben worden ist. Der Überstand nach dem Zentrifugieren wurde verworfen . Danach wurde die Säule mit 350 μl Puffer RWl für 1 5 Sekunden bei 8000 g gewaschen und der Überstand verworfen . Nun wurden je Probe 1 0 μl DNase I Stock Solution mit 70 μl RDD Puffer vermischt und durch invertieren gemischt. Von dieser Lösung wurden 80 μl genau in die Mitte der Säule gegeben und für 1 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss wurden 350 μl Puffer RWl auf die Säule gegeben, um diese für 1 5 Sekunden bei 8000 g zu waschen . Die RNeasy Säule wurde hiernach in ein neues 2 ml Collection Tube überführt und mit 500 μl RPE Puffer befüllt, um diese wieder für 1 5 Sekunden bei 8000 g zu waschen . Der Überstand wurde wieder verworfen . Der letzte Schritt wurde wiederholt, nur mit dem Unterschied, dass nun für 2 Minuten bei 8000 g zentrifugiert wurde. Die Säule wurde nun ein weiteres mal in ein neues 2 ml Reaktionsgefäß überführt und darin für 1 Minute bei maximaler Geschwindigkeit getrocknet. Für den abschließenden Schritt wurde die Säule in ein neues 2 ml Reaktionsgefäß überführt und mit 30 μl RNase-freiem-Wasser befüllt und zum Eluieren für 1 Minute bei 1 0000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Das Eluat wurde dann ebenfalls mittels Spektrometers vermessen und mittels RNA Agarosegel ausgewertet.
Es wurden ergänzend diverse Zerkleinerungsversuche unter anderem in einem Mörser bei -1 96°C durchgeführt. Letzten Endes haben diese Versuche ergeben, dass eine Kühlung auf -1 96°C, aber auch die Verwendung eines Mörsers nicht geeignet sind, um zu den gewünschten Ergebnissen zu gelangen.
Figur 3 zeigt eine besonders bevorzugte Ausführungsform eines verschließbaren Gefäßes, mit dem eine Probe pulverisiert wird . Dieses Gefäß wird nachfolgend Pulverisator genannt. Es umfasst ein Inlay 1 0, welches vorzugsweise aus Metall aus oben genannten Gründen besteht. Das Inlay 1 0 wird von einer vorzugsweise aus Kunststoff bestehenden Hülle 1 1 umfasst. Die Kunststoffhülle dient vor allem als Isolator, um die tiefe Temperatur während des Schütteins aufrechtzuerhalten . Insgesamt kann so das Gewicht im Vergleich zu einem ganz aus Metall bestehenden Pulverisator vorteilhaft reduziert werden, was die Handhabung erleichtert. Der Doppelpfeil unterhalb des in Figur 3 gezeigten Pulverisators verdeutlicht die bevorzugte Bewegungsrichtung, um die Probe 7 zu zerkleinern .
Die in der vorliegenden Anmeldung erwähnten Puffer und Reagenzien können bei der Fa . Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland kommerziell erworben werden, falls etwas anderes nicht ausdrücklich ausgesagt wurde.
Figur 4 zeigt einen Schnitt durch eine weiter verbesserte Ausführungsform der Erfindung . Der Pulverisator umfasst einen inneren verschließbaren Behälter 4, der aus Kunststoff besteht. Der aus Kunststoff bestehende innere Behälter grenzt derart eng an die vorzugsweise aus Metall bestehenden Innenwände des Pulverisators an, so dass der aus Kunststoff bestehende innere Behälter durch eine Kugel 3 oder ein vergleichbares Mittel während des Pulverisierens nicht zerstört werden kann. Der aus Kunststoff bestehende innere Behälter 4 wird nach der Pulverisierung entnommen und kann nun als Aufbewahrungsgefäß dienen. Da der innere Behälter aus Kunststoff besteht, kann dieser sehr preiswert gefertigt werden und daher für den einmaligen Gebrauch geeignet ist. Diese Ausführungsform der Erfindung vereinfacht dann die Handhabung, da der innere Behälter ersetzt werden kann, in diesem Fall keine Reinigung des Innenraums des Pulverisators erforderlich ist und Kreuzkontaminationen besonders zuverlässig vermieden werden .
Der Deckel des inneren Behälters verschließt den übrigen Teil des Behälters vorzugsweise durch eine formschlüssige Verbindung, oder aber er kann auf den übrigen Teil aufgeschraubt werden . Ein formschlüssige Verbindung ist möglich, da Kunststoff hinreichend elastisch sein kann, so dass beispielsweise ein nach innen vorstehender Wulst des Deckels in eine dafür vorgesehene ringförmige Vertiefung des übrigen Behälterkörpers einrastet oder umgekehrt, wenn der Deckel auf den übrigen Behälterkörper geeignet gedrückt wird . Eine solche formschlüssige Verbindung ist besonders zu bevorzugen, da ein versehentliches Lösen des Deckels besonders zuverlässig vermieden wird . Auch kann ein Behälter schneller verschlossen werden im Vergleich zu einem Verschließen mit einem Schraubverschluss.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst ein Set neben einem Pulverisator eine Vielzahl von inneren Behältern, die vorzugsweise optisch unterschiedlich sind, beispielsweise aufgrund von unterschiedlich gefärbten Deckeln oder unterschiedlichen Prägungen . Die unterschiedliche Optik kann vorteilhaft für die Kennzeichnung eines Inhalts genutzt werden . So kann ein beispielsweise rot gefärbter Behälterdeckel dazu genutzt werden, um ein darin befindliches „Herz" zu kennzeichnen und ein anders, beispielsweise grün gefärbter Deckel ein anderes Organ, wie zum Beispiel eine Lunge. Ein innerer, der Aufbewahrung einer pulverisierten Probe dienender Behälter muss dann nicht mehr separat gekennzeichnet werden, was aufgrund der tiefen Temperaturen problematisch sein kann .
Es ist zu bevorzugen, dass lediglich die Behälterdeckel optisch unterschiedlich gekennzeichnet sind, um so Lagerkosten klein zu halten . Der aus Kunststoff bestehende innere Behälter kann aus PET, aber auch aus PP oder PE bestehen, da solche Kunststoffe den vorgesehenen tiefen Temperaturen grundsätzlich gewachsen sind .
In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst ein Set neben einem Pulverisator ein oder meh rere Messlöffel, um so die Entnahme der erforderlichen Probenmenge aus dem Pulverisator oder aus einem inneren Behälter zu erleichtern oder zu beschleunigen . Ein Messlöffel ist also so dimensioniert und bestimmten Proben zugeordnet, dass der Messlöffel eine geeignete Menge an Probe für die weitere Bearbeitung aufzunehmen vermag. Ein separates Wiegen einer aus dem Pulverisator entnommenen Probe kann so beschleunigt werden oder sogar vollständig entfallen .
In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst ein Set eine Mehrzahl optisch gekennzeichneter Messlöffel, die unterschiedlichen Proben zugeordnet sind . So kann ein rot gefärbter Messlöffel für die Entnahme einer Herzprobe vorgesehen sein . Insbesondere stimmen in einer Ausführungsform der Erfindung die Kennzeichnungen von inneren Behältern oder Teilen von inneren Behältern mit den Kennzeichnungen von Messlöffeln überein . Ein solches Set umfasst dann auch eine vorgegebene Zuordnung von Kennzeichnungen zu Proben, also beispielsweise zu Organen . Wird also beispielsweise ein grün gefärbter Messlöffel für das Organ Lunge vorgesehen, so ist ein innere Behälter ebenfalls ganz oder teilweise grün gefärbt. Die Dimensionierung des Messlöffels ist auf die Probe „Lunge" abgestimmt. Das Set enthält dann eine entsprechende Zuordnungsvorschrift. Diese kann darin bestehen, dass bereits eine entsprechende Probe, also zum Beispiel eine Lunge auf dem entsprechenden Behälter und/ oder dem Messlöffel abgebildet ist.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst ein Set neben einem Pulverisator eine Schüttelapparatur, um das Aufschließen einer im Pulverisαtor befindlichen Probe automatisiert durchführen zu können . Ein oder mehrere Pulverisatoren können in die Schüttelapparatur eingesetzt oder an dieser geeignet befestigt werden .
Die Schüttelapparatur umfasst in einer Ausführungsform der Erfindung kühlbare Aufnahmeeinrichtungen für die Aufnahme von Pulverisatoren . Insbesondere bei dieser Ausführungsform muss nicht sofort nach dem Einfüllen der Probe in den Pulverisator aufgeschlossen werden, wenn hinreichend gekühlt werden kann. Es können also eine Vielzahl von
Pulverisatoren vorbereitet und eingesetzt werden, bevor dann zeitgleich eine Vielzahl von Proben automatisiert aufgeschlossen werden .

Claims

Ansprüche
1 . Verfahren zum Aufschluss einer biologischen Probe, in dem eine feste biologische Probe mit einer Temperatur unter -50 0C in einen auf unter -50 0C gekühlten Pulverisator umfassend eine H ülle, welche geöffnet und verschlossen werden kann, ein I nlay und einen beweglichen Körper (3) eingebracht wird, in welchem sich ein auf unter -50 0C gekühlter beweglicher Körper befindet, welcher nach Verschluss des Gefäßes in Bewegung versetzt wird und die biologische Probe zerkleinert, dadurch gekennzeichnet, dass das Gefäß während der Zerkleinerung nicht gekühlt wird und auch keine Kühlmedien oder chemische Stoffe in das Gefäß während oder vor dem Aufschluss eingebracht werden, welche während des Aufschlusses noch i m Gefäß vorhanden sind .
2. Verfahren zum Aufschluss einer biologischen Probe, indem eine feste biologische Probe mit einer Temperatur unter -50 0C in ein auf unter -50 0C gekühltes, verschließbares Gefäß eingebracht wird, in welchem sich ein auf unter -50 0C gekühlter beweglicher Körper befindet, welcher nach Verschluss des Gefäßes in Bewegung versetzt wird und die biologische Probe zerkleinert, dadurch gekennzeichnet, dass das Gefäß während der Zerkleinerung nicht gekühlt wird und auch keine Kühlmedien ode r chemische Stoffe in das Gefäß während oder vor dem Aufschluss eingebracht werden, welche während des Aufschlusses noch im Gefäß vorhanden sind .
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe mit einer Temperatur i m Bereich von - 70 bis -90 0C in ein auf eine Temperatur im Bereich von - 70 bis -90 0C gekühltes, verschließbares Gefäß eingebracht wird .
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der biologischen Probe um eine pflanzliche Probe handelt.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der biologischen Probe um tierisches oder menschliches Gewebe handelt.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der bewegliche Körper durch manuelles Schütteln in Bewegung gebracht wird .
7. Verfahren zur Analyse einer biologischen Probe umfassend die Schritte Aufschluss der Probe gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, teilweise oder vollständige E ntnahme der aufgeschlossenen Probe und Isolierung von Nukleinsäuren und/oder Proteinen aus der aufgeschlossenen Probe.
8. Verfahren für die Vorbereitung der Prozessierung einer pflanzlichen oder tierischen Probe, bei dem die Probe zunächst gewaschen und anschließend stabilisiert wird, bei dem d ie Probe im Anschluss an die Stabilisierung tiefgekühlt wird und zwar vorzugsweise auf - 50 bis - 1 1 00C, bei dem ein verschließbares Gefäß ( 1 , 2) mit einem darin befindlichen beweglichen Körper (3) tiefgekühlt wird und zwar vorzugsweise auf -50 bis - 1 1 00C, bei dem die tiefgekühlte Probe in das tiefgekühlte Gefäß mit dem darin befindlichen beweglichen Körper gegeben wird, das tiefgekühlte Gefäß im Anschluss daran verschlossen wird und das tiefgekühlte Gefäß hin - und her geschüttelt wird und im Anschluss dara n eine dadurch zerstoßene Probe entnommen wird .
9. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, bei dem die Probe im Anschluss an die Stabilisierung in Trockeneis und/ oder das verschließbares Gefäß ( 1 , 2) mit einem darin befindlichen beweglichen Körper (3) in Trockeneis tiefgekühlt wird und zwar vorzugsweise auf -800C. 0. Verfahren nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche , bei dem das verschlossene, tiefgekühlte Gefäß mit der darin befindlichen Probe (7) und dem darin befindlichen beweglichen Körper 1 0 bis 40 Sekunden lang hin und her geschüttelt wird .
1 . Verfahren nach einem der drei vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Gefäß keine flüssigen Bestandteile wie flüssiger Stickstoff oder eine Pufferlösung enthält und zwar insbesondere nicht während sich die Probe (7) im Gefäß ( 1 , 2) befindet und/ oder die Probe kein Knochen und keine Haut ist. 2. Verfahren nach einem der vier vorhergehenden Ansprüche, bei dem eine Leber, ein Herz, Blätter oder pflanzlicher Samen als Probe verwendet wird . 3. Verfahren nach einem der fünf vorhergehenden Ansprüche, bei dem der bewegliche Körper (3) eine Kugel ist und der Innenraum des verschließbaren Gefäßes zylinderförmig mit hohlkugelförmigen Enden (5, 6) ist. 4. Verfahren nach einem der sechs vorhergehenden Ansprüche, bei dem im Anschluss an die Entnahme der tiefgekühlten, zerstoßenen Probe (7) aus dem verschließbaren Gefäß die zerstoßene Probe (7) prozessiert wird . 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Probe in einen inneren, aus Kunststoff bestehendem Behälter zusammen mit einem beweglichen Körper (3) gebracht wird und der innere Behälter (4) in das verschließbare Gefäß eingesetzt wird .
1 6. Pulverisαtor für biologische Proben zur Durchführung eines
Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüc he umfassend eine Hülle ( 1 1 ), welche geöffnet und verschlossen werden kann, ein Inlay ( 1 0) und einen beweglichen Körper (3) .
1 7. Pulverisator gemäß Anspruch 1 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Hülle ( 1 1 ) aus Kunststoff gefertigt ist.
1 8. Pulverisator gemäß Ans pruch 1 6 oder 1 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Inlay ( 1 0) aus Metall gefertigt ist.
1 9. Pulverisator gemäß einem der Ansprüche 1 6 bis 1 8, dadurch gekennzeichnet, dass der bewegliche Körper (3) aus Metall oder einem Mineral gefertigt ist.
20. Pulverisator gemäß einem der Ansprüche 1 6 bis 1 9, dadurch gekennzeichnet, dass der bewegliche Körper (3) kugelförmig ist und der Pulverisator einen ovalen Innenraum besitzt.
21 . Pulverisator insbesondere gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche 1 6 bis 20 mit einem inneren, aus Kunststoff bestehenden Behälter (4) .
22. Set umfassend einen Pulverisator mit einem Gefäß, welches geöffnet und verschlossen werden kann, und einem darin beweglichen Körper (3) insbesondere nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 6 bis 2 1 mit einer Mehrzahl von inneren, aus Kunststoff bestehenden Behältern (4) und/ oder einer
Mehrzahl von Messlöffeln .
23. Set nach dem vorhergehenden Anspruch, bei dem d ie inneren Behälter (4) und/ oder die Messlöffel unterschiedlich optisch gekennzeichnet sind .
24. Set nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche mit einer vorgegebenen Zuordnung zwischen optischen Kennzeichnungen von inneren Behältern und/ oder Messlöffeln und Proben .
25. Set insbesondere nach einem der vorhergehenden Ansprüche 20 bis 23 umfassend einen Pulverisator und eine Rüttelapparatur für das Aufschließen einer im Pulverisator befindlichen Probe.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2791334A4 (de) * 2011-11-28 2016-02-24 Syngenta Participations Ag Dna-extraktion aus samen unter verwendung von osmoticum

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2503316A1 (de) * 2008-09-18 2012-09-26 Qiagen GmbH Verfahren und Vorrichtung für das zeitgleiche, automatisierte Aufschließen von mehreren biologischen Proben
US8523092B2 (en) * 2009-09-14 2013-09-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. System and method for creating a test sample from individual seeds or tissue structures
TWM417958U (en) * 2011-07-07 2011-12-11 Rega Biotechnology Inc Portable grinder
FR2991305B1 (fr) * 2012-06-01 2015-05-01 Assist Publ Hopitaux De Paris Dispositif pour le recueil, le traitement preanalytique, le transport et le broyage d'echantillons solides.
FR3091987B1 (fr) * 2019-01-29 2021-12-03 Peugeot Saveurs moulin a produits condimentaires
US11774328B2 (en) * 2019-02-26 2023-10-03 SPEX SamplePrep, LLC Homogenizer and method of grinding large sample quantities
JP7416496B1 (ja) * 2023-03-03 2024-01-17 株式会社小泉製作所 粉砕器具
JP2024180257A (ja) * 2023-06-16 2024-12-26 株式会社小泉製作所 粉砕器具
CN117511740B (zh) * 2024-01-08 2024-05-10 山东伯桢生物科技有限公司 组织解离装置及用于组织解离装置的控制方法

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE738286C (de) * 1940-11-16 1943-08-10 Walter Guenther Dipl Ing Verfahren zur Feinstzerkleinerung
US3172546A (en) * 1961-05-19 1965-03-09 Union Carbide Corp Size reduction of biological substances
DE2057428A1 (de) * 1970-11-21 1972-06-08 Kloeckner Humboldt Deutz Ag Schwingmuehle fuer die Zerkleinerung fester Stoffe unter Zugabe von Kaeltemitteln in den Mahlraum
EP0014179B1 (de) * 1979-01-18 1982-05-12 Ciba-Geigy Ag Vorrichtung zum Extrahieren von Konstituenten aus festen und halbfesten Stoffen
US4509695A (en) * 1983-07-18 1985-04-09 Spectrum Medical Industries, Inc. Tissue pulverizer
JPH03186360A (ja) * 1989-12-15 1991-08-14 Sumitomo Electric Ind Ltd ダイヤモンドまたは立方晶窒化硼素の破砕方法
US6235501B1 (en) * 1995-02-14 2001-05-22 Bio101, Inc. Method for isolation DNA
JPH11148890A (ja) * 1997-11-17 1999-06-02 Takahisa Matsue 凍結試料破砕用容器
JP2001178444A (ja) * 1999-10-13 2001-07-03 Yasui Kikai Kk 破砕方法及び装置
JP4373391B2 (ja) * 1999-10-13 2009-11-25 安井器械株式会社 試料破砕用具
JP2002066366A (ja) * 2000-08-25 2002-03-05 Japan Nuclear Cycle Development Inst States Of Projects ボールミルポット内壁への粉末付着防止方法
US6553190B1 (en) 2001-10-16 2003-04-22 Hewlett-Packard Development Co., L.P. Correction of pulse width accumulator based on the temperature and relative humidity
JP4029998B2 (ja) * 2001-10-17 2008-01-09 独立行政法人理化学研究所 サンプル保存ケースおよびサンプル保存ケースの収容ラック
DE10153957A1 (de) 2001-11-06 2003-05-22 Quiagen Gmbh Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren
JP3793472B2 (ja) * 2002-03-05 2006-07-05 安井器械株式会社 破砕装置
EP1546383A4 (de) * 2002-09-17 2006-08-30 Pharmacia Corp Isolierung genetischer moleküle aus einem komplexen biologischen konstrukt zur verwendung bei der genetischen expressionsanalyse
EP1558765A4 (de) 2002-11-08 2005-11-30 Pharmacia Corp Automatische nukleinsäureisolierungs-und quantifizierungsverfahren mit hohem durchsatz
US20040144874A1 (en) * 2003-01-24 2004-07-29 Moskowitz Joel P. Method and apparatus for making high purity silica powder by ball milling
GB2399518B (en) * 2003-03-17 2005-04-13 Freshcrush Ltd Crushing apparatus
US20050178726A1 (en) 2004-02-18 2005-08-18 Robert Belly Disruption of cells and tissues
GB2421448A (en) * 2004-12-24 2006-06-28 Levene Ltd William Foodstuff crushing and blending apparatus
JP4903419B2 (ja) * 2005-04-20 2012-03-28 安井器械株式会社 破砕方法とそれを用いた破砕装置及び破砕処理装置

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2791334A4 (de) * 2011-11-28 2016-02-24 Syngenta Participations Ag Dna-extraktion aus samen unter verwendung von osmoticum
AU2012346112B2 (en) * 2011-11-28 2017-03-02 Syngenta Participations Ag DNA extraction from seeds using osmoticum

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