WO2008132247A2 - Behälter und verfahren zum nachweis von fluoreszenz - Google Patents

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Definitions

  • the present invention describes reaction vessels with integrated light harvesting optics that can be used for detection of surface bound fluorescent molecules.
  • bioanalysis solid-phase-based assays in which the substances to be detected are concentrated from the solution via immobilized receptors on the surface play a central role.
  • affinity-based reaction By means of the affinity-based reaction on the surface, biological substances can be detected very selectively, even from a mixture.
  • Typical receptors are antibodies and DNA molecules.
  • An example of particularly high relevance is antigen detection via high-affinity antibodies.
  • sandwich test is frequently used, with a capture antibody, the receptor, binding the antigen to be detected to the surface.
  • a second fluorescently labeled antibody also binds to the antigen and allows sensitive detection of the complexes.
  • the antigen concentration can be quantified by an intensity measurement of the bound fluorescence markers. Due to its high sensitivity, fluorescence detection is one of the most important detection techniques in biotechnology.
  • the signal-to-noise ratio is of central importance. This is especially true for fluorescence measurement, where a technological improvement in the ratio of fluorescence intensity and noise leads to low detection limits and / or material and time savings.
  • the signal-to-noise ratio is optimized by maximizing the fluorescence collection of surface-bound molecules while minimizing the light collection of all sources of oxygen.
  • the binding reaction is usually carried out at an interface between an aqueous solution and a transparent measuring substrate of glass or plastic material, which is coated with receptor molecules.
  • An important source of interference is the fluorescence signal of freely diffusing molecules in the sample solution, which can superimpose the fluorescence signal of the molecules bound to the surface, thus making it difficult to determine the concentration. This can be prevented by washing steps, but this is time consuming and expensive.
  • the surface-selective fluorescence detection is of decisive advantage.
  • the aim here is to limit the detection volume as far as possible to the surface and thus to exclude fluorescence from unbound molecules from the detection.
  • the emission of fluorescence requires the optical excitation with light of suitable wavelength.
  • the excitation light induces scattering and autofluorescence in the sample and substrate. Particularly problematic is that portion of the light which spectrally overlaps with the emission of the fluorescent dye to be detected and can not be blocked by wavelength filters. Since a significant portion of this light is generated in the measuring substrate, this contribution is suppressed by reducing the Detektionsvolumens in the substrate material. This can be achieved by spatial filtering of the fluorescence signal. This exploits the fact that fluorescence and scattered light arise spatially separated and thus can be separated from the optical system. Due to the different optical paths of fluorescence and scattering, the latter can be strongly suppressed by geometric means, eg with a pinhole.
  • the detection volume of the fluorescence measurement results in simple design goals. First, the fluorescence collection of the optical system at the interface should be as high as possible. Second, light collection should be as low as possible both within the aqueous sample and within the substrate.
  • ⁇ c aresine (nl / n 2).
  • a c is «61 °. Fluorescent molecules bound at the interface emit about 74% of the light into the glass. In this case, 34% of the total emission is above the critical angle ⁇ c .
  • the fluorescence emission above the critical angle (supercritical angle fluorescence) is of particular importance for binding assays. It takes place exclusively by molecules which are located directly in front of the interface, ie at a distance from the substrate much smaller than the emission wavelength. Consequently, a fluorescence collection that exclusively allows is limited to the region above the critical angle, a surface-selective detection. The contribution of unbound fluorescent dyes can thus be almost completely suppressed, which allows, for example, real-time measurements of binding reactions.
  • the conventional method of surface-selective fluorescence measurement is carried out via a so-called evanescent excitation of the interface.
  • the excitation light strikes the interface above the critical angle and is totally internally reflected in the measuring substrate.
  • a thin excitation layer is thus generated, with which surface-bound molecules can be selectively excited to fluoresce.
  • this method is technically complicated and makes miniaturization more difficult.
  • An optical waveguide made of glass or plastic, has a lateral surface, which is the
  • the use of a lateral surface of parabolic shape collimates the fluorescence into a parallel beam and makes further processing of the signal particularly easy.
  • the collimated fluorescence can be focused through a pinhole which serves as a spatial filter.
  • the diaphragm reduces the detection volume within the substrate and filters out the scattered light / autofluorescence induced there by the excitation light.
  • the collimator achieves a very high signal-to-noise ratio and even allows the detection of individual molecules. Even with exclusive fluorescence collection above the critical angle, the collection efficiency of the collimator is more than 30%, well above the levels of conventional detection systems. Fluorescence sensors based on fiber optics achieve collection efficiencies of 1%.
  • Refraction-based single lenses are up to a numerical aperture (N. A,) of about 0.6 and produce after all efficiencies by 5%.
  • N. A numerical aperture
  • conventional lenses or lens systems mainly collect fluorescence below the critical angle and thus do not allow surface-selective fluorescence collection.
  • reaction vessels In bioanalytics, small standardized reaction vessels are often used, such as test tubes or cuvettes for single measurements and microtiter plates for higher throughput measurements.
  • wells On microtiter plates, a large number of reaction vessels, so-called wells, are arranged in lattice-like fashion over an area of ⁇ 7 ⁇ 11 cm 2 , which allows standard 96, 384 or 1526 independent measurements. The wells are typically read out sequentially, which requires a fast shift of the plate between measurements.
  • the supercritical fluorescence collimator By incorporating the supercritical fluorescence collimator into microtiter plates, the signal yield can be significantly improved compared to conventional plates.
  • real-time measurements of high throughput binding reactions are made possible.
  • the collimator must be miniaturized to a few millimeters in diameter.
  • the excellent light collection property of the collimator is limited to a limited area around the optical axis. As the distance of the fluorescence emission from the optical axis decreases, the quality of the light condensing and the collection efficiency deteriorate. This is analogous to fluorescence microscopy, where high numerical aperture optics achieve high collection efficiency and sensitivity, but only within a relatively small area in the ocular space.
  • the excitation light must be focused on the surface about the optical axis of the collimator.
  • the size of the usable area and the accuracy with which the excitation light has to be centered on the optical axis depend on the size of the Collimator off. Miniaturization of the collimator reduces the usable area and thus increases the precision requirements. This increases the requirement and cost of the motorized shifting devices, adds more time and can also have a negative impact on the robustness and reproducibility of the measurements.
  • the present invention relates to methods of fluorescence collection above the critical angle in inexpensive liquid containers, such as test tubes and microtiter plates made of plastic. This is achieved by a novel collimator and the integration of the element into the bottom of the vessel. An improvement is in particular the integration of the focusing optics for the excitation light into the vessel bottom. With a convex surface arranged below the analyte-vessel bottom interface, excitation light near the optical axis of the collimator can be focused onto the interface. This leads to a significant increase in the allowed tolerances in the centering of the excitation light on the optical axis of the collimator.
  • FIG. 1 shows an embodiment of the invention.
  • the collimator 1 shown is part of a liquid container.
  • a convex-shaped surface 2 is integrated on the underside of the collimator 1.
  • the convex surface 2 is preferably arranged rotationally symmetrical about the optical axis of the collimator and focuses the light preferably close to the axis on the opposite Sensor surface 3, which is in contact with the liquid analyte.
  • the sensor surface 3 can be coated with receptor molecules.
  • the fluorescence emitted at large angles into the waveguide material is reflected by the lateral surface of the collimator 4 and leaves the collimator through the lower-side light exit surface 5.
  • the collimating of the lateral surface can be based on the total internal reflection, if it originates from a medium having a refractive index of less than 1.1 is surrounded, eg air with a refractive index of 1.0.
  • the lateral surface can also be metallically mirrored.
  • the lateral surface is preferably convex in such a way that the fluorescence after exiting the collimator is focused around the optical axis 9.
  • the use of a parabolic lateral surface is particularly advantageous because it allows the fluorescence to be collimated into an approximately parallel beam.
  • the lateral surface 4 can be directly adjacent to the light exit surface 5, but also to a further surface 6, which can be used for example for mounting purposes of the element.
  • the angular range of the fluorescence collection can be limited upwards by selecting the outer diameter of the diaphragm 7.
  • the angular range of the fluorescence light collection can be limited downwards, preferably above the critical angle ⁇ c .
  • the angular range of the light collection can, however, also be limited downwards without diaphragm 8, namely by suitable choice of the outer diameter of the lateral surface 4.
  • the area of the sensor surface 3 is at least in the region which is excited by the light source.
  • the planar region has a diameter of more than 100 microns.
  • the size of the collimator is preferably adapted to the respective size of the analyte container. Typically, a diameter between 2 and 15 millimeters. If a parabolic lateral surface 4 is selected, then it lies Focal length preferably in the range of 0.4 to 3 millimeters. The focal point of the parabolic lateral surface is then preferably on the sensor surface, so that the fluorescence striking the lateral surface is collimated to form an approximately parallel beam.
  • the distance of the convex light entry surface to the sensor surface is preferably 2 millimeters to 20 millimeters.
  • the diameter of the light entry surface 2 is generally smaller than the inner diameter of the lateral surface 4 and is preferably in the range of 0.5 to 6 millimeters.
  • injection-moldable optical plastics such as PMMA, PC, PS, Zeonor or Zeonex.
  • FIG. 2 shows a possible embodiment of the fluorescence measurement analyzer with the collimator 1 integrated in a vessel bottom.
  • a light source 10 emits light for fluorescence excitation of a suitable wavelength.
  • the light is sufficiently collimated by optical components 11 and brought to a suitable beam diameter. These components may include optical lenses, optical fibers, mirrors and apertures.
  • the light is spectrally cleaned by Weileninfilter 12.
  • the excitation light is irradiated in the direction of its optical axis in the collimator.
  • the fluorescence emitted above the critical angle emerges annularly as collimated radiation from the collimator.
  • the collimator also collects fluorescence with the convex surface 2.
  • the fluorescence in this angular range around the optical axis can also be emitted by molecules that are not bound to the interface 3.
  • fluorescence collected by the convex surface 2 must be completely blocked.
  • a reflector element 14 is arranged below the collimator which separates fluorescence emitted near the axis from the supercritical fluorescence. In the case shown, the reflector element 14 directs the excitation light 13 to the optical Axis of the collimator and reflects the fluorescence collected by the convex surface 2 at the same time completely from the detection beam path.
  • the reflector element may be such that the supercritical emitted fluorescence is mirrored, but excitation light and fluorescence collected near the axis are transmitted.
  • optical components 15 are arranged which focus the supercritical fluorescence through a pinhole 16 and project onto the light-sensitive surface of a detector 17.
  • the pinhole diaphragm serves for spatial filtering and is arranged in such a way that stray light or autofluorescence generated in the collimator is largely blocked and the fluorescence passes from the surface.
  • Wavelength filters 18 are preferably included in the detection beam path.
  • the convex surface 2 has an aspherical shape.
  • the curvature of the surface can be selected such that the excitation light is focused diffraction-limited in the waveguide material.
  • the focal length of the asphere can be chosen so that the focus is below or above the sensor surface 3. In this way, an excitation disc with a defined diameter can be produced on the interface, preferably with a diameter smaller than 300 micrometers.
  • the diameter of the convex surface 2 is chosen smaller than the cross section of the collimated excitation beam 13 ( Figure 4).
  • the part of the excitation beam which hits the collimator outside the convex surface is blocked by the opaque aperture 7 at the collimator. If the excitation beam has a homogeneous intensity profile, ie constant intensity over the entire cross section, then a certain lateral offset between the optical axis of the collimator and the excitation beam has no influence on the excitation profile of the collimator Sensor surface 3.
  • the fluorescence bound to the surface of the collimator can be reproducibly read without a high-precision lateral adjustment of the collimator. This is particularly advantageous for the fast sequential reading of multiple collimators.
  • Sensor surface 3 is preferably excited in a region around the optical axis, preferably this region has a diameter smaller than 300 micrometers.
  • small collimators of a few millimeters in diameter require even more accurate centering of the excitation light on the optical axis.
  • the diameter of the convex surface 2 is larger than the cross section of the collimated excitation beam ( Figure 5). Even with a certain lateral offset of collimator and excitation beam, the light strikes the sensor surface 3 of the collimator very center-centered.
  • a transparent preferably planar substrate made of plastic or glass, for example a microscopy cover glass is integrated in the bottom of the vessel.
  • the substrate 19 may be connected by an optical adhesive 20 with the collimator.
  • the substrate, the optical adhesive and the collimator 1 preferably have similar refractive indices.
  • the arrangement is chosen so that the fluorescence is excited and collected at the top of the substrate, ie the sensor surface 3 lies on the substrate.
  • the use of a piano substrate has the following advantages: First, the microscope cover glass allows fluorescence measurements with very low background. Second, such glasses mass produced and are very cost effective. Third, the substrate prevents contact of the aqueous sample with the lateral surface 4. A gaseous environment 21 of the lateral surface allows loss-free collimation by total internal reflection. Fourth, glass is for the
  • the collimator is integrated in a test tube 22.
  • the liquid container consists only of two components, vessel wall and acting as a vessel bottom collimator.
  • the vessel wall is shaped such that it adjoins the sensor surface 3. In this way, contact of analyte fluid and lateral surface can be prevented.
  • the vessel wall may preferably surround the collimator laterally.
  • the optical lateral surface 4 is protected against contamination, e.g. in front of fingerprints of the user. It can also be prevented by using an opaque vessel wall that ambient light passes through the lateral surface in the collimator.
  • Advantages of this embodiment are in particular the reduced manufacturing costs and reduced number of adhesive surfaces, which can be causes of quality fluctuations.
  • the planar substrate is the bottom of a microtiter plate through which the fluorescence is detected ( Figure 8)
  • the collimators may be individually connected to the bottom of the microtiter plate or on one
  • the collimators can have the lattice spacing of the wells, but can also be arranged more densely, which allows multiple measurements at several points of a well. for example, by a displacement unit 24, which moves the microtiter plate with the collimators perpendicular to the optical axis.
  • the excitation beam can be translated.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen Flüssigkeitsbehälter, umfassend einen Boden und Seitenwände zum Halten einer Flüssigkeit, wobei der Boden umfasst: eine ebene Sensoroberfläche, die bei Befüllung mit der Flüssigkeit in Kontakt steht; eine Lichteintrittsfläche unterhalb der Sensoroberfläche, die geeignet ist, Licht auf die Sensoroberfläche zu fokussieren; eine Lichtaustrittsfläche; und eine Mantelfläche, die geeignet ist, Licht von der Sensoroberfläche zu reflektieren, so dass es durch die Lichtaustrittsfläche austreten kann. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Analytbestimmung in einem derartigen Flüssigkeitsbehälter wobei Anregungslicht über die Lichteintrittsfläche auf die Sensoroberfläche fokussiert wird, hierdurch ein den Analyten kennzeichnender Lumineszenzmarker angeregt wird, und dann die so entstehende Lumineszenz an der Manteloberfläche reflektiert und nach Austritt durch die Lichtaustrittsfläche detektiert wird. Die Erfindung betrifft auch eine Analysevorrichtung, umfassend eine Halterung für einen Flüssigkeitsbehälter; eine Lichtquelle, die derart angeordnet ist, dass ihr Licht über die Lichteintrittsfläche auf die Sensoroberfläche des Flüssigkeitsbehälters fokussiert werden kann; sowie einen Detektor, der derart angeordnet ist, dass er das aus der Lichtaustrittsfläche des Flüssigkeitsbehälters austretende Licht detektieren kann.

Description

BEHALTER UND VERFAHREN ZUM NACHWEIS VON FLUORESZENZ
Die vorliegende Erfindung beschreibt Reaktionsgefäße mit integrierten Lichtsammlungsoptiken, die für den Nachweis an Oberflächen gebundener fluoreszierender Moleküle eingesetzt werden können. In der Bioanalytik spielen festphasenbasierte Assays, bei denen die nachzuweisenden Substanzen aus der Lösung über immobilisierte Rezeptoren an der Oberfläche aufkonzentriert werden, eine zentrale Rolle. Über die affinitätsbasierte Reaktion an der Oberfläche können biologischer Substanzen sehr selektiv, auch aus einem Gemisch, nachgewiesen werden. Typische Rezeptoren sind Antikörper und DNA Moleküle. Ein Beispiel von besonders hoher Relevanz ist der Antigennachweis über hoch affine Antikörper. Für den fluoreszenzbasierten Nachweis wird häufig der so genannte Sandwichtest verwendet, wobei ein Fangantikörper, der Rezeptor, das nachzuweisende Antigen an die Oberfläche bindet. Ein zweiter fluoreszenzmarkierter Antikörper bindet ebenfalls an das Antigen und ermöglicht den empfindlichen Nachweis der Komplexe. Die Antigenkonzentration kann durch eine Intensitätsmessung der gebundenen Fluoreszenzmarker quantifiziert werden. Aufgrund der hohen erreichbaren Empfindlichkeit ist die Fluoreszenzdetektion eine der wichtigsten Nachweistechniken in der Biotechnologie.
Die Quantifizierung geringer Mengen von Biomaterialien stellt an die Nachweistechnik hohe Anforderungen hinsichtlich der Empfindlichkeit, der Sicherheit und der Kosten. Für den Nachweis von Biomarkern, welche z.B. im Zusammenhang mit Krebs- oder Herzkreislauferkrankungen entstehen, werden immer geringere Nachweisgrenzen angestrebt. Für medizinische Anwendungen sind gleichzeitig Robustheit und
Reproduzierbarkeit der Analyse von großer Bedeutung. Außerdem erfordert die ständig wachsende Zahl an solchen Tests Messungen mit möglichst geringem Material- und Zeitaufwand. Für die Leistungsfähigkeit einer empfindlichen Messmethode ist das Signal-Rausch Verhältnis von zentraler Bedeutung. Dies gilt im Besonderen für die Fluoreszenzmessung, wo eine technologische Verbesserung des Verhältnisses von Fluoreszenzintensität und Rauschen zu niedrigen Nachweisgrenzen und/oder zu Einsparungen an Material und Zeitaufwand führt. Bei der Detektion von Bindungsassays mittels Fluoreszenzmethoden erfolgt die Optimierung des Signal-Rausch-Verhältnisses über die Maximierung der Fluoreszenzsammlung von oberflächengebundenen Molekülen bei gleichzeitiger Minimierung der Lichtsammlung sämtlicher Ξtörquellen.
Die Bindurtgsreaktion wird in der Regel an einer Grenzfläche zwischen einer wassrigen Lösung und einem transparenten Messsubstrat aus Glas oder Kunststoffmaterial durchgeführt, welches mit Rezeptormolekülen beschichtet ist. Eine wichtige Störquelle ist das Fluoreszenzsignal frei diffundierender Moleküle in der Probenlösung, welches das Fluoreszenzsignal der an die Oberfläche gebundenen Moleküle überlagern kann und somit die Konzentrationsbestimmung erschwert. Dies kann durch Waschschritte verhindert werden, was aber zeit- und kostenaufwendig ist. Um Echtzeitmessung der
Bindungsreaktionen zu ermöglichen und aufwendige Spülschritte zu umgehen, ist die oberflächenselektive Fluoreszenzdetektion von entscheidendem Vorteil. Hierbei gilt es, das Detektionsvolumen so weit wie möglich auf die Oberfläche einzuschränken und so von ungebundenen Molekülen herrührende Fluoreszenz von der Detektion auszuschließen.
Die Emission von Fluoreszenz erfordert die optische Anregung mit Licht geeigneter Wellenlänge. Das Anregungslicht induziert Streuung und Autofluoreszenz in Probe und Substrat. Problematisch ist besonders jener Anteil des Lichts, welcher spektral mit der Emission des nachzuweisenden Fluoreszenzfarbstoffs überlappt und nicht durch Wellenlängenfilter geblockt werden kann. Da ein erheblicher Teil dieses Lichts im Messsubstrat entsteht, erfolgt Unterdrückung dieses Beitrags durch die Reduzierung des Detektionsvolumens im Substratmaterial. Dies kann durch räumliche Filterung des Fluoreszenzsignals erreicht werden. Hierbei wird ausgenutzt, dass Fluoreszenz und Streulicht raumlich getrennt entstehen und somit vom optischen System separiert werden können. Durch die verschiedenen optischen Pfade von Fluoreszenz und Streuung kann letztere auf geometrischem Wege, z.B. mit einer Lochblende, stark unterdruckt werden. Zusammengefasst ergeben sich für das Detektionsvolumen der Fluoreszenzmessung einfache Designziele: Erstens sollte die Fluoreszenzsammlung des optischen Systems an der Grenzfläche möglichst hoch sein. Zweitens sollte die LichtSammlung sowohl innerhalb der wassrigen Probe als auch innerhalb des Substrats möglichst gering sein.
Die Nahe der Grenzfläche zweier dielektrischer Materialien, wie z.B. zwischen Wasser (Brechungsindex nl » 1.33} und Glas (n2 « 1.52) hat erheblichen Einfluss auf die Eigenschaften der Fluoreszenzemission. Im Gegensatz zur Fluoreszenzabstrahlung innerhalb eines homogenen Mediums ist die Emission von der Oberfläche nicht isotrop, sondern weist ein starkes Maximum in Richtung des kritischen Winkels der Totalreflexion αc auf, wobei
αc = aresin (nl/n2) .
Für die Wasser/Glas-Grenzfläche ist ac « 61°. Fluoreszierende Moleküle, die an der Grenzfläche gebunden sind, strahlen etwa 74% des Lichts ins Glas ab. Dabei erfolgt 34% der Gesamtemission oberhalb des kritischen Winkels αc. Die Fluoreszenzemission oberhalb des kritischen Winkels (englisch: supercritical angle fluorescence) ist für Bindungsassays von ganz besonderer Bedeutung. Sie erfolgt ausschließlich von Molekülen, welche sich direkt vor der Grenzflache befinden, d.h. in einem Abstand zum Substrat deutlich kleiner als die Emissionswellenlange . Folglich ermöglicht eine Fluoreszenzsammlung, welche ausschließlich auf den Bereich oberhalb des kritischen Winkels beschränkt ist, eine oberflächenselektive Detektion. Der Beitrag ungebundener Fluoreszenzfarbstoffe kann also fast vollständig unterdrückt werden, was z.B. Echtzeitmessungen von Bindungsreaktionen ermöglicht .
Die herkömmliche Methode der oberflächenselektiven Fluoreszenzmessung erfolgt über eine so genannte evaneszente Anregung der Grenzfläche. Dabei trifft das Anregungslicht oberhalb des kritischen Winkels auf die Grenzfläche und wird im Messsubstrat intern total reflektiert. Auf der Probenseite der Grenzfläche wird so eine dünne Anregungsschicht generiert, mit der oberflächengebundene Moleküle selektiv zur Fluoreszenz angeregt werden können. Diese Methode ist aber technisch aufwendig und erschwert die Miniaturisierung.
Ruckstuhl und Seeger beschreiben eine Methode, die Fluoreszenzemission über dem kritischen Winkel sehr effizient zu sammeln (PCT/EP099/1548 ) . Ein optischer Wellenleiter, aus Glas oder Kunststoff, besitzt eine Mantelfläche, welche das
Licht durch eine interne Reflexion kollimiert . Die Verwendung einer Mantelfläche parabolischer Form kollimiert die Fluoreszenz zu einem parallelen Strahlenbündel und macht die weitere Verarbeitung des Signals besonders einfach. Die kollimierte Fluoreszenz kann durch eine Lochblende fokussiert werden, welche als räumlicher Filter dient. Die Blende reduziert das Detektionsvolumen innerhalb des Substrats und filtert das dort vom Anregungslicht induzierte Streulicht/Autofluoreszenz aus. Somit erzielt der Kollimator ein sehr hohes Signal-Rausch-Verhältnis und erlaubt sogar den Nachweis einzelner Moleküle. Selbst bei ausschließlicher Sammlung der Fluoreszenz oberhalb des kritischen Winkels beträgt die Sammlungseffizienz des Kollimators mehr als 30%, was deutlich über den Werten herkömmlicher Detektionssysteme liegt. Fluoreszenzsensoren, die auf Faseroptiken basieren, erreichen Sammlungseffizienzen um 1%. Auf Lichtbrechung basierende Einzellinsen sind bis zu einer numerischen Apertur (N. A,) von etwa 0.6 herstellbar und erzielen immerhin Effizienzen um 5%. Konventionelle Linsen oder Linsensysteme sammeln jedoch vornehmlich Fluoreszenz unterhalb des kritischen Winkels und ermöglichen somit keine oberflächenselektive Fluoreszenzsammlung.
In der Bioanalytik werden oft kleine standardisierte Reaktionsgefäße verwendet, wie z.B. Testtubes oder Küvetten für Einzelmessungen und Mikrotiterplatten für Messungen mit höherem Durchsatz. Auf Mikrotiterplatten sind eine Vielzahl von Reaktionsgefäßen, so genannte Wells, auf einer Fläche von ~7χll cm2 gitterförmig angeordnet, was standardmäßig 96, 384 oder 1526 unabhängige Messungen erlaubt. Die Wells werden in der Regel sequentiell ausgelesen, was ein schnelles Verschieben der Platte zwischen den Messungen erfordert. Durch Integration des Kollimators für superkritische Fluoreszenz in Mikrotiterplatten lässt sich die Signalausbeute im Vergleich zu herkömmlichen Platten erheblich verbessern. Zudem werden Echtzeitmessungen von Bindungsreaktionen mit hohem Durchsatz ermöglicht. Allerdings muss der Kollimator dazu auf wenige Millimeter Durchmesser miniaturisiert werden.
Die hervorragende Lichtsammlungseigenschaft des Kollimators ist auf einen begrenzten Bereich um die optische Achse beschränkt. Mit wachsendem Abstand der Fluoreszenzemission von der optischen Achse verschlechtern sich die Qualität der Lichtbündelung und die Sammelungseffizienz . Dies ist analog zur Fluoreszenzmikroskopie, wo Optiken mit hoher numerischer Apertur zwar hohe Sammlungseffizienz und Sensitivität erreichen, dies jedoch nur innerhalb eines relativ kleinen Bereichs im Öbjektraum. Um die Leistungsfähigkeit des Kollimators voll auszuschöpfen, irtuss das Anregungslicht an der Oberfläche um die optische Achse des Kollimators gebündelt werden. Die Größe der nutzbaren Fläche und die Genauigkeit, mit der das Anregungslicht auf die optische Achse zentriert werden muss, hängen dabei von der Größe des Kollimators ab. Eine Miniaturisierung des Kollimators führt zur Verkleinerung der nutzbaren Fläche und erhöht somit die Präzisionsanforderungen. Dies erhöht die Anforderung und Kosten der motorisierten Verschiebevorrichtungen, führt zu mehr Zeitbedarf und kann auch negativen Einfluss auf die Robustheit und Reproduzierbarkeit der Messungen haben.
Die vorliegende Erfindung betrifft Methoden der Fluoreszenzsammlung oberhalb des kritischen Winkels in kostengünstigen Flüssigkeitsbehältern., wie beispielsweise Testtubes und Mikrotiterplatten aus Kunststoff. Dies wird durch einen neuartigen Kollimator und die Integration des Elements in den Gefäßboden erreicht. Eine Verbesserung stellt im Besonderen die Integration der Fokussierungsoptik für das Anregungslicht in den Gefäßboden dar. Mit einer unterhalb der Grenzfläche zwischen Analyt und Gefäßboden angeordneten konvexen Fläche kann Anregungslicht nahe der optischen Achse des Kollimators auf die Grenzfläche fokussiert werden. Dies führt zu einer deutlichen Vergrößerung der erlaubten Toleranzen bei der Zentrierung des Anregungslichts auf die optische Achse des Kollimators. Daraus ergibt sich unter anderem der Vorteil, dass bei sequentieller Auslesung mehrerer Reaktionen die Verschiebung der Gefäße über dem Detektionssystem weniger mit geringerer Präzision erfolgen kann, ohne negative Auswirkung auf die Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit der Messungen. Der manuelle oder automatisierte Wechsel der Behälter zwischen zwei Messungen kann damit schneller erfolgen und/oder mit kostengünstigeren Komponenten realisiert werden.
Abbildung 1 zeigt eine Ausführung der Erfindung. Der gezeigte Kollimator 1 ist Teil eines Flüssigkeitsbehälters. Für die Fokussierung des Anregungslichts ist an der Unterseite des Kollimators 1 eine konvex geformte Fläche 2 integriert. Die konvexe Fläche 2 ist vorzugsweise rotationssymmetrisch um die optische Achse des Kollimators angeordnet und fokussiert das Licht vorzugsweise achsennah auf die gegenüberliegende Sensoroberfläche 3, welche mit dem flüssigen Analyten in Kontakt steht. Für Bindungsassays kann die Sensoroberfläche 3 mit Rezeptormolekülen beschichtet werden. Die unter großen Winkeln in das Wellenleitermaterial emittierte Fluoreszenz wird von der Mantelfläche des Kollimators 4 reflektiert und verlässt den Kollimator durch die unterseitige Lichtaustrittsfläche 5. Die Kollimierung der Mantelfläche kann auf der totalen internen Reflektion beruhen, wenn sie von einem Medium mit einem Brechungsindex kleiner als 1.1 umgeben ist, also z.B. Luft mit einem Brechungsindex von 1.0. Die Mantelfläche kann aber auch metallisch verspiegelt sein. Die Mantelfläche ist vorzugsweise derart konvex geformt, dass die Fluoreszenz nach Austritt aus dem Kollimator gebündelt um die optische Achse verläuft 9. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung einer parabolischen Mantelfläche weil dadurch die Fluoreszenz zu einem annähernd, parallelen Strahlenbündel kollimiert werden kann. Die Mantelfläche 4 kann direkt an die Lichtaustrittsfläche 5 angrenzen, aber auch an eine weitere Fläche 6, welche z.B. zu Halterungszwecken des Elements verwendet werden kann. Mit der lichtundurchlässigen Blende 7 kann verhindert werden, dass Anregungslicht außerhalb der Lichteintrittsfläche 2 in den Kollimator 1 eindringt. Zudem kann über Wahl des Λußendurchmessers der Blende 7 der Winkelbereich der Fluoreszenzsammlung nach oben begrenzt werden. Mit einer lichtundurchlässigen Blende 8 kann der Winkelbereich der Fluoreszenzlichtsammlung nach unten begrenzt werden, vorzugsweise oberhalb des kritischen Winkels αc. Der Winkelbereich der Lichtsammlung kann aber auch ohne Blende 8 nach unten beschränkt werden, nämlich durch geeignete Wahl des Außendurchmessers der Mantelfläche 4. Der Bereich der Sensoroberfläche 3 ist zumindest in dem Bereich, der von der Lichtquelle angeregt wird eben. Vorzugsweise hat der ebene Bereich einen Durchmesser von mehr als 100 Mikrometer. Der Größe des Kollimators ist vorzugsweise auf die jeweilige Größe der Analytbehälter angepasst. Typisch ist ein Durchmesser zwischen 2 und 15 Millimeter. Wird eine parabolische Mantelfläche 4 gewählt, so liegt deren Brennweite vorzugsweise im Bereich von 0.4 bis 3 Millimeter. Der Brennpunkt der parabolischen Mantelfläche befindet sich dann vorzugsweise auf der Sensoroberfläche, so dass die auf die Mantelfläche treffende Fluoreszenz zu einem annähernd parallelen Strahlenbündel kollimiert wird.
Der Abstand der konvexen Lichteintrittsfläche zur Sensoroberfläche beträgt vorzugsweise 2 Millimeter bis 20 Millimeter. Der Durchmesser der Lichteintrittsfläche 2 ist in der Regel kleiner als der innere Durchmesser der Mantelfläche 4 und liegt vorzugsweise im Bereich von 0.5 bis 6 Millimeter. Für die kostengünstige Massenfertigung des Kollimators eignen sich- besonders spritzgießbare optische Kunststoffe, wie beispielsweise PMMA, PC, PS, Zeonor oder Zeonex.
Abbildung 2 zeigt eine mögliche Ausführung des Analysegeräts zur Fluoreszenzmessung mit dem in einem Gefäßboden integrierten Kollimator 1. Eine Lichtquelle 10 emittiert Licht zur Fluoreszenzanregung geeigneter Wellenlänge. Das Licht wird durch optische Komponenten 11 ausreichend kolliraiert and auf einen geeigneten Strahldurchmesser gebracht. Diese Komponenten können optische Linsen, optische Fasern, Spiegel und Blenden beinhalten. Das Licht wird durch Weilenlängenfilter 12 spektral aufgereinigt . Das Anregungslicht wird in Richtung seiner optischen Achse in den Kollimator eingestrahlt. Die über dem kritischen Winkel emittierte Fluoreszenz tritt ringförmig als gebündelte Strahlung aus dem Kollimator. Der Kollimator sammelt aber auch Fluoreszenz mit der konvexen Fläche 2. Die Fluoreszenz in diesem Winkelbereich um die optische Achse kann auch von Molekülen abgestrahlt werden, die nicht an der Grenzfläche 3 gebunden sind. Für eine oberflächenselektive Messung muss daher Fluoreszenz, welche von der konvexen Fläche 2 gesammelt wird, vollständig blockiert werden. Zu diesem Zweck ist unterhalb des Kollimators ein Reflektorelement 14 angeordnet, welche achsennah emittierte Fluoreszenz von der überkritschen Fluoreszenz trennt. Im gezeigten Fall lenkt das Reflektorelement 14 das Anregungslicht 13 auf die optische Achse des Kollimators und spiegelt die durch die konvexen Fläche 2 gesammelte Fluoreszenz gleichzeitig vollständig aus dem Detektionsstrahlengang. In einer weiteren Ausführung kann das Reflektorelement derart beschaffen sein, dass die überkritische emitterte Fluoreszenz gespiegelt, aber Anregungslicht und achsennah gesammelte Fluoreszenz durchgelassen werden. Im Detektionsstrahlengang sind optische Komponenten 15 angeordnet, welche die überkritische Fluoreszenz durch eine Lochblende 16 fokussieren und auf die lichtsensitive Fläche eines Detektors 17 projizieren. Die Lochblende dient dabei zur räumlichen Filterung und ist derart angeordnet, dass im Kollimator erzeugtes Streulicht bzw. Autofluoreszenz weitgehend geblockt wird die Fluoreszenz von der Oberfläche passiert. Im Detektionsstrahlengang sind vorzugsweise Wellenlängenfilter 18 enthalten.
In einer Ausführung der Erfindung weist die konvexe Fläche 2 eine asphärische Form auf. Die Krümmung der Fläche kann dabei so gewählt sein, dass das Anregungslicht beugungsbegrenzt im Wellenleitermaterial fokussiert wird. Wie in Abbildung 3 dargestellt, kann die Brennweite der Asphäre dabei so gewählt sein, dass der Fokus unterhalb oder oberhalb der Sensoroberfläche 3 liegt. Auf diese Weise kann auf der Grenzfläche eine Anregungsscheibe mit definiertem Durchmesser produziert werden, vorzugsweise mit einem Durchmesser kleiner als 300 Mikrometer.
In einer Ausführung der Erfindung ist der Durchmesser der konvexen Fläche 2 kleiner gewählt als der Querschnitt des kollimierten Anregungsstrahls 13 (Abbildung 4) . Der Teil des Anregungsstrahls der außerhalb der konvexen Fläche auf den Kollimator trifft, wird durch die lichtundurchlässige Blende 7 am Kollimator geblockt. Besitzt der Anregungsstrahl ein homogenes Intensitätsprofil, d.h. gleichbleibende Intensität über den gesamten Querschnitt, so hat ein gewisser lateraler Versatz zwischen der optischen Achse des Kollimators und dem Anregungsstrahl keinen Einfluss auf das Anregungsprofil der Sensoroberfläche 3. Dadurch kann die an der Oberfläche des Kollimators gebundene Fluoreszenz reproduzierbar ausgelesen werden, ohne eine hochpräzise laterale Justierung des Kollimators. Dies ist besonders von Vorteil für die schnelle sequentielle Auslesung mehrerer Kollimatoren. Die
Sensoroberfläche 3 wird vorzugsweise in einem Bereich um die optische Achse angeregt, vorzugsweise hat dieser Bereich einen Durchmesser kleiner als 300 Mikrometer. Kleine Kollimatoren von wenigen Millimetern Durchmesser erfordern allerdings eine noch genauere Zentrierung des Anregungslichts auf die optische Achse . Durch die Integration der konvexen Fläche 2 in den Gefäßboden kann das auf die Sensoroberfläche treffende Anregungslicht präzise auf die optische Achse zentriert werden, selbst bei einem lateralen Versatz des kollimierten Anregungsstrahls 13 zur optischen Achse des Kollimators von mehreren hundert Mikrometern.
In einer Ausführung der Erfindung ist der Durchmesser der konvexen Fläche 2 größer als der Querschnitt des kollimierten Anregungsstrahls (Abbildung 5) . Selbst bei einem gewissen lateralen Versatz von Kollimator und Anregungsstrahl trifft das Licht sehr achsenzentriert auf die Sensoroberfläche 3 des Kollimators .
In einer Ausführung der Erfindung ist ein transparentes vorzugsweise planares Substrat aus Kunststoff oder Glas, z.B. ein Mikroskopie-Deckglas, im Gefäßboden integriert. Dies ist in Abbildung 6 gezeigt. Das Substrat 19 kann dabei durch einem optischen Klebstoff 20 mit dem Kollimator verbunden sein. Das Substrat, der optische Klebstoff und der Kollimator 1 besitzen vorzugsweise ähnliche Brechungsindizes. Die Anordnung ist dabei so gewählt, dass die Fluoreszenz an der Oberseite des Substrats angeregt und gesammelt wird, d.h. die Sensoroberfläche 3 liegt auf dem Substrat. Die Verwendung eines pianaren Substrats hat folgende Vorteile: Erstens ermöglicht das Mikroskopie-Deckglas Fluoreszenzmessungen mit sehr geringem Untergrund. Zweitens werden solche Gläser massengefertigt und sind sehr kostengünstig. Drittens verhindert das Substrat den Kontakt der wässrigen Probe mit der Mantelfläche 4. Eine gasförmige Umgebung 21 der Mantelfläche erlaubt eine verlustfreie Kollimierung durch totale interne Reflexion. Viertens ist Glas für die
Immobilisierung von Rezeptormolekülen besonders gut geeignet. Im gezeigten Beispiel ist der Kollimator in einem Testtube 22 integriert .
Eine weitere Ausführung der Erfindung ist in Abbildung 7 gezeigt. Hier besteht das Flüssigkeitsbehältnis lediglich aus zwei Komponenten, aus Gefäßwand und aus als Gefäßboden fungierendem Kollimator. Die Gefäßwand ist dabei derart geformt, dass sie an die Sensoroberfläche 3 angrenzt. Auf diese Weise kann ein Kontakt von Analytflüssigkeit und Mantelfläche verhindert werden. Die Gefäßwand kann vorzugsweise den Kollimator seitlich umschließen. Dadurch ist die optische Mantelfläche 4 vor Verunreinigungen geschützt, z.B. vor Fingerabdrücken des Anwenders. Auch kann durch Verwendung einer lichtundurchlässigen Gefäßwand verhindert werden, dass Umgebungslicht durch die Mantelfläche in den Kollimator gelangt. Vorteile dieser Ausführung sind insbesondere die verringerten Herstellkosten und verringerte Zahl an Klebeflächen, die Ursachen für Qualitätsschwankungen sein können.
In einer Ausführung der Erfindung ist das planare Substrat der Boden einer Mikrotiterplatte, durch welche die Fluoreszenz detektiert wird (Abbildung 8} . Die Wells sind an der Unterseite mit Kollimatoren versehen. Die Kollimatoren können dabei einzeln mit dem Boden der Mikrotiterplatte verbunden sein oder auf einem optischen Element integriert sein, welches mehrere in einer Ebene angeordnete Kollimatoren enthält. Die Kollimatoren können den Gitterabstand der Wells besitzen, aber auch dichter angeordnet sein, was mehrere Messungen an mehreren Stellen eines Wells ermöglicht. Die Auslesung der Kollimatoren erfolgt sequentiell, beispielsweise durch eine Verschiebeeinheit 24, welche die Mikrotiterplatte mit den Kollimatoren senkrecht zur optischen Achse bewegt. Alternativ dazu kann der Anregungsstrahl translatorisch bewegt werden.

Claims

Patentansprüche
1 . Flüssigkeitsbehälter , umfas send einen Boden und Seitenwände zum Halten einer Flüssigkeit ,
wobei der Boden umfasst:
a) eine ebene Sensoroberfläche, die bei Befüllung mit der Flüssigkeit in Kontakt steht;
b) eine Lichteintrittsfläche unterhalb der Sensoroberfläche, die geeignet ist, Licht auf die Sensoroberfläche zu fokussieren;
c) eine Lichtaustrittsflache;
d) eine Mantelfläche, die geeignet ist, Licht von der Sensoroberfläche zu reflektieren, so dass es durch die Lichtaustrittsfläche austreten kann.
2. Verfahren zur qualitativen oder quantitativen Analytbestimmung in einem Flüssigkeitsbehälter nach Anspruch 1, wobei Anregungslicht über die Lichteintrittsfläche auf die Sensoroberfläche fokussiert wird, hierdurch ein den Analyten kennzeichnender Lumineszenzmarker angeregt wird, und dann die so entstehende Lumineszenz an der Manteloberflache reflektiert und nach Austritt durch die Lichtaustrittsfläche detektiert wird.
3. Analysevorrichtung, umfassend
a) eine Halterung für einen Flüssigkeitsbehälter nach Anspruch 1;
b) eine Lichtquelle, die derart angeordnet ist, dass ihr Licht über die Lichteintrittsfläche auf die Sensoroberflache des Flussigkeitsbehalters fokussiert werden kann; sowie
c) einen Detektor, der derart angeordnet ist, dass er das aus der Lichtaustrittsflache des
Flussigkeitsbehalters austretende Licht detektieren kann .
4. Verwendung eines Flussigkeitsbehalters nach Anspruch 1 für Bindungsassays .
5. Flussigkeitsbehalter nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichteintrittsflache konvex geformt ist.
6. Flussigkeitsbehaiter nach Anspruch 1 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichteintrittsflache aspharisch geformt ist.
7. Flussigkeitsbehalter nach Anspruch 1 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichteintrittsflache sphärisch geformt ist,
8. Flussigkeitsbehalter nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichteintrittsflache zylindrisch geformt ist.
9. Flussigkeitsbehalter nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichteintrittsflache eine Fresnelsche Linse ist.
10. Flussigkeitsbehalter nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine diffraktive Struktur auf der Lichteintrittsflache geeignet ist, Licht auf die Sensoroberflache zu fokussieren.
11. Flüssigkeitsbehälter nach Anspruch 1, 4-10, dadurch gekennzeichnet , dass eine lichtundurchlässige Blende im Boden integriert ist, mit welcher der Lichteintritt um die Lichteintrittsfläche lateral begrenzt werden kann.
12. Flüssigkeitsbehälter nach Anspruch 1, 4-11, der an der Außenseite Vertiefungen enthält, die geeignet sind, den Flüssigkeitsbehälter in der Analysevorrichtung zu fixieren .
13. Flüssigkeitsbehälter nach Anspruch 1, 4-11, der an der Außenseite hervorstehende Strukturen enthält, die geeignet sind, den Flüssigkeitsbehälter in der Analysevorrichtung zu fixieren.
14. Flüssigkeitsbehälter nach Anspruch 1, wobei der Boden in den Behälter geklebt ist .
15. Flüssigkeitsbehälter nach Anspruch 1, wobei der Boden in den Behälter ohne Klebstoff gesteckt wird.
16. Flüssigkeitsbehälter nach Anspruch 1, wobei ein transparentes pianares Substrat im Boden integriert ist.
17. Flüssigkeitsbehälter nach Anspruch 1, der als Testtube verwendet wird.
18. Flüssigkeitsbehälter nach Anspruch 1, der als ein Mikrofluidic-Chip verwendet wird,
19. Mehrere Flüssigkeitsbehälter nach Anspruch 1, 4-18, welche in einer Ebene angeordnet sind.
20. Anordnung von Flüssigkeitsbehältern nach Anspruch 1, 4- 16, 19, welche die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte sind.
21. Verfahren zur Analytbestimmung nach Anspruch 2 in einem Flüssigkeitsbehälter nach Ansprüchen 1, 4-20, wobei das Anregungslicht die Lichteintrittsfläche vollständig ausleuchtet und der Lichteintritt lateral von der lichtundurchlässigen Blende begrenzt wird.
22. Verfahren zur AnalytbeStimmung nach Anspruch 2 in einem Flüssigkeitsbehälter nach Ansprüchen 1, 4-20, wobei das Anregungslicht in vollem Umfang auf die Lichteintrittsfläche geführt wird.
23. Verfahren zur AnalytbeStimmung nach Anspruch 2 in einem Flüssigkeitsbehälter nach Ansprüchen 1, 4-20, wobei ausschließlich oberhalb des kritischen Winkels von der Sensoroberfläche emittiertes Licht durch die Lichtaustrittsfläche tritt.
24. Analyseeinrichtung nach Anspruch 3, wobei eine Rastereinrichtung das Verschieben des Flüssigkeitsbehälters ermöglicht.
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