WO2009043471A1 - Anordnung zur optischen erfassung von in einer probe angeregter und/oder rückgestreuter lichtstrahlung - Google Patents

Anordnung zur optischen erfassung von in einer probe angeregter und/oder rückgestreuter lichtstrahlung Download PDF

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Carl Zeiss MicroImaging GmbH
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    • G02B5/18—Diffraction gratings
    • G02B5/1876—Diffractive Fresnel lenses; Zone plates; Kinoforms

Definitions

  • the invention relates to an achromatic main color splitter for laser scanning microscopy, which allows efficient excitation and detection in preferential confocal imaging and the integration thereof into a microscope, in particular a laser scanning microscope.
  • Such beam splitters are described for example in DE 19702753 A1. From the beach of technology, the use of the polarization state of the light is known for beam splitting (MDB). For this purpose, the excitation radiation is linearly polarized. However, the fluorescence is usually unpolarized. By forming the MDB as polarization splitter, however, only 50% of the fluorescence radiation can be separated from the excitation radiation achromatically.
  • MDB beam splitting
  • the object of the invention is to achieve an achromatic beam separation of the excitation light from the detection light with high efficiency both for the excitation light and for the detection light. This is realized by the arrangements explained below.
  • FIGS. 1-6 and 9-11 each describe arrangements for separating the common excitation and detection beam path.
  • the basic structure of the beam splitting is shown schematically in Fig. 1 based on the prior art.
  • the excitation beam path here comprises beam paths (3) from the direction of the light source (LQ), which are reflected by the beam splitter (MDB) in the direction of the sample (PR).
  • the beam path from the beam splitter (MDB) to the sample (PR) is referred to as a common excitation and detection beam path (1).
  • fluorescent light (FL) is excited in the sample.
  • the sample reflects a portion of the excitation light (AL).
  • the fluorescent light is preferably transmitted by the beam splitter (MDB) and enters the detection beam path (2), which includes the beam paths from MDB to the detector (DE).
  • Excitation light reflected by the sample (PR) predominantly passes through the MBD in the direction of the excitation beam path (3) and thus in the direction of the light source (LQ).
  • the detection light for example
  • Fluorescent light has a larger spectral bandwidth than the excitation light. This is because the excitation occurs in bands of approximately up to 20 nm spectral width. The spectral bandwidth influences the temporal coherence length of the light.
  • Fluorescent light thus has a shorter coherence length than that
  • the beam splitter according to the invention advantageously does not change the imaging properties as compared to the prior art, or only insignificantly.
  • Fig. 2a shows an optically transparent step element (PM).
  • This element is characterized in that it has along the optical axis (o.A.) steps with a width (B) and a height (A).
  • the steps can, for example, by successive set glass plates with a lateral offset, by etching processes
  • the height (A) is chosen so that it is greater than the temporal
  • Coherence length of the excitation light For example, light having a fluorescence in the range of 500 to 550 nm has a coherence length of 3.6 ⁇ m.
  • Laser light in contrast, has a narrow band depending on the laser medium
  • the step height could therefore preferably be greater than about 5-10 microns.
  • the width (B) of the step element (PM) is chosen so that it is greater than the spatial coherence length, so that the step element is not light-bending for the
  • Fig. 2b shows the behavior of the element explained in Fig. 2a) in the beam path.
  • Detection and excitation light (1) reach along the optical axis oA on the step element (PM), which is perpendicular (the end face SF of Figure 2a) is arranged to the optical axis in the beam path.
  • the light is split into sub-beams (TrT n ) at the stages, with adjacent sub-beams giving a discrete phase shift to the height of stage (A) to each other. Since the height (A) is greater than the coherence length of the detection light for the detection light, the partial beams generated at the stages can no longer interfere.
  • the partial beams of the detection light FL pass without angle change (2) through the step element.
  • the excitation light AL has a longer coherence length than the step height (A).
  • the partial beams can interfere with each other. This results in a deflection of the excitation light out of the optical axis according to the well-known Snell's law.
  • the first diffraction order is considered.
  • Fig. 3a shows a further behavior of the explained with reference to Fig. 2a) element in the beam path.
  • Detection and excitation light (1) illuminate the step element (PM) in a circular manner along the optical axis (O in FIG. 3b), wherein the step element is again arranged perpendicular to the optical axis in the beam path.
  • the light is decomposed at the stages into sub-beams (Ti-T n ) (FIG. 3 c), with adjacent sub-beams giving a discrete phase shift to the height of stage (A) relative to each other (pupil P).
  • Downstream of the step element is a lens (L).
  • each sub-beam is imaged individually and independently of the other sub-beams through the lens.
  • Decisive for the imaging by the lens is the extension of the partial beams, ie the width of the step (B) and the beam diameter. Since the beam diameter is larger than the width (B), a line-shaped distribution along the x-axis (a in FIG. 3d) arises in the focus of the lens (image) for the fluorescent light.
  • the excitation light AL Since the excitation light AL has a greater coherence length than the fluorescent light, it experiences a deflection in the x direction (FIG. 3).
  • the lens continues to focus in both axes, resulting in a point focus (b in Figure 3d). This in turn creates a spatial separation of the beam paths for the excitation and detection light due to the different coherence properties of the light.
  • a simplified spatial separation of excitation and detection light is made possible.
  • Fig. 4a shows a further arrangement with which the coherence properties of the excitation and detection light can be used for efficient beam separation.
  • the step element PM in this case has a rotationally symmetrical structure about the optical axis (o. A.) On.
  • the envelope of the step structure (a) preferably describes a convex lens shape.
  • the step height is again larger for the detection light and smaller for the excitation light than the coherence length of the radiation. Due to the structure, light is split into annular partial beams with the same phase. For the detection light, these partial beams do not interfere. Thereby, the beam shape and direction of the detection light FL is not affected. For the excitation light, the partial beams interfere and produce a focal point at the focal point of the phase element PM.
  • the focal point results from the convex shape of the envelope of the step element.
  • the figure shows a simplified representation of the lens with a straight end surface. This surface can be shaped accordingly.
  • a spatial separation of the excitation and detection light can take place with a small mirror R in the otherwise transmissive beam splitter (MDB), the excitation light AL being reflected in the direction of the output (3).
  • the shape of the MDB is illustrated in part 4b). It has a mirrored region (R) and a transparent region (T). This in turn creates a spatial separation of the beam paths for the excitation and detection light due to the different coherence properties of the light.
  • Fig. 5 shows an arrangement with which the detection light can be refocused after separation from the excitation light.
  • a compensation element cPM
  • the cPM is such that the modified phase front introduced by PM is compensated again.
  • the cPM must have exactly the inverted (mirror-inverted) form of the PM. Substituting both elements PM and cPM together, then results in a plane-parallel plate.
  • Fig. 6 shows an advantageous combination of the arrangements of Figs. 4 and 2b.
  • Fig. 4 uses a special mirror (MBD) for the spatial splitting of the excitation (3) and detection light (2), whereby the MDB shadows a part of the detection light so that efficiency losses occur.
  • MBD mirror
  • PM1 deflecting
  • PM2 focusing
  • the focusing of only the excitation light outside the detection beam path takes place on a reflector M, so that a particularly efficient beam separation is made possible.
  • compensation elements cPM1 and cPM2 are provided in the further beam path of the fluorescent light, cPM1 for compensation of PM2 is designed as hollow element HS with cavities H mirrored to PM2, otherwise all formed as a transmissive element, while cPM2 is mirror-inverted to PM1.
  • the phase offset of the elements PM1, PM2 is hereby canceled and at the output of cPM2 fully focusable detection light FL is present.
  • the step elements (PM) can also be designed to be reflective without restriction.
  • An example of a step element is shown in Fig. 7).
  • the common excitation and detection light is directed from direction (1) onto the step element.
  • partial beams of different phases are generated.
  • the step difference (h) is chosen so that the coherence length of the fluorescent light is smaller than the step difference.
  • the detection light (2) thereby experiences a classical reflection, the incidence (a1) and the angle of departure (a2) being equal, since the partial beams (determined by the width of the steps (b)) can not interfere.
  • the step difference (h) is smaller than the coherence length of the excitation light.
  • the sub-beams of the excitation light can not interfere.
  • lambda is the wavelength of the excitation light.
  • a spatial separation of the excitation from the detection light can be done by a suitable choice of the number of stripes (step width b) or the angle of incidence on (PM) (a1).
  • the use of reflective devices has the additional advantage of being achromatic, at least for the detection light.
  • Fig. 8 shows two exemplary schematic arrangements in a laser scanning microscope, wherein a spatial separation of the beam paths for the excitation and detection light due to the different coherence properties of the light is realized.
  • the excitation light of the light source is coupled in the same direction via the step element as it is decoupled after returning from the sample.
  • Partial image a) shows an arrangement according to the Fig. 1, wherein the beam splitter element (MDB) has been replaced by a beam splitter (S) according to the invention.
  • the beam splitter (S) is designed so that the phase front modified by the step element (PM) is again smoothed by the element cPM.
  • the light can be focused on the output side through the confocal diaphragm (PH).
  • Partial image b) shows a further arrangement, wherein the confocal diaphragm (PH) is arranged in the common excitation and detection beam path (1). Compensation of the phase front modified by the step element (PM) is not required in the detection beam path (2). This has the advantage that the adjustment is simplified because no compensating element (cPM) is used.
  • the compensation element CPM shown in partial image a) can also be dispensed with if a rectangular diaphragm is used as the confocal diaphragm PH.
  • a rectangular diaphragm is used as the confocal diaphragm PH.
  • the aspect ratio of the length to the width of the rectangle will be preferably chosen such that it corresponds to the ratio of the width of the steps of the step element (B) to the beam diameter at the entrance of the step element.
  • Fig. 9 shows an example of a detailed representation of the arrangement according to Fig. 8a) with the beam splitter element of Fig. 6).
  • the beam splitting i. the beam paths for the excitation and detection light are identical for the outward and return paths.
  • an irradiation of the light source LQ or a decoupling of the excitation light (which was reflected at the sample) takes place in the direction of the light source - see also explanation above, in particular to FIG. 8a.
  • Fig. 10 shows an example of a detailed representation of the arrangement of Fig. 8a) with the beam splitter element of Fig. 5).
  • Fig. 11 shows an example of a detailed representation of the arrangement for a light microscope with a CCD detector, wherein the beam splitter element of Fig. 5) is used for beam splitting. Plotted drawn is the pupil beam, pulled through the object beam path.
  • the detection light has a shorter coherence length than the excitation light. If excitation light with a shorter coherence length compared to the detection light is used (white light source), then the step element is designed so that the step height is smaller than the coherence length of the detection light but greater than that of the excitation light. This means that with respect to the arrangements described, the excitation light would pass through the step element and the detection light (fluorescence) would be interfered and diffracted out of the optical axis. In the described arrangements, only the excitation and detection beam path is then interchanged.

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Abstract

Anordnung zur optischen Erfassung von in einer Probe angeregter und/oder rückgestreuter Lichtstrahlung, wobei die Probenbeleuchtung eine größere zeitliche Kohärenzlänge als die Detektionsstrahlung aufweist und ein wobei ein im wesentlichen stufenförmiges Stufenelement mit Stufenhöhen größer als die Kohärenzlänge des Detektionslichts und kleiner als die des Anregungslichts vorgesehen ist, wobei an jeder Stufe ein Teilstrahl des Lichtes erzeugt wird und durch Interferenz der Teilstrahlen des Anregungslichtes eine Veränderung der Strahleigenschaften des Anregungslichtes erfolgt oder wobei die Probenbeleuchtung eine kleiner zeitliche Kohärenzlänge als die Detektionsstrahlung aufweist, und ein im wesentlichen stufenförmiges Stufenelement mit Stufenhöhen kleiner als die Kohärenzlänge des Detektionslichts und größer als die des Anregungslichts vorgesehen ist, wobei an jeder Stufe ein Teilstrahl des Lichtes erzeugt wird und durch Interferenz der Teilstrahlen des Detektionslichtes eine Veränderung der Strahleigenschaften des Detektionslichtes erfolgt.

Description

Titel:
Anordnung zur optischen Erfassung von in einer Probe angeregter und/oder rückgestreuter Lichtstrahlung
Die Erfindung betrifft einen achromatischen Hauptfarbteiler für die Laser-Scanning- Mikroskopie, der eine effiziente Anregung und Detektion in vorzugsweiser konfokaler Bildgebung erlaubt und die Integration desselben in ein Mikroskop, insbesondere Laser-Scanning-Mikroskop.
Stand der Technik
In einem Laser-Scanning-Mikroskop nach dem Stand der Technik (Fig. 1 ) gelangt Licht der Lichtquelle (LQ) über einen Strahlteiler (MDB), die Scanner (SC), die Scanoptik (SO), die Tubuslinse (TL) und das Objektiv (O) punktförmig auf die Probe (PR). In der Probe wird beispielsweise Fluoreszenzlicht angeregt, welches durch das Objektiv aufgesammelt wird und wiederum auf den Strahlteiler gelangt. Der Strahlteiler ist so ausgelegt, dass dieser das Fluoreszenzlicht aufgrund der gegenüber der Anregungswellenlänge veränderten Spektraleigenschaften transmittiert, so dass das Detektionslicht mit einer Pinholeoptik (PO) durch eine konfokale Blende (PH) fokussiert wird und im Anschluss auf einen Detektor (DE) gelangt. Vor dem Detektor ist in einem Fluoreszenzmikroskop ein Emissionsfilter (EF) zur Unterdrückung des Anregungslichtes vorgesehen. Mit Hilfe der Scanner wird der Beleuchtungsspot über die Probe gerastert. Die Probensignale werden in einem Rechner zu einem Bild zusammengesetzt.
Derartige Strahlteiler sind beispielsweise in DE 19702753 A1 beschrieben. Aus dem Strand der Technik ist weiterhin für die Strahlteilung (MDB) die Nutzung des Polarisationszustandes des Lichtes bekannt. Hierzu wird die Anregungsstrahlung linear polarisiert. Die Fluoreszenz ist jedoch normalerweise unpolarisiert. Durch die Ausbildung des MDB als Polarisationsteiler kann jedoch achromatisch nur 50% der Fluoreszenzstrahlung von der Anregungsstrahlung absepariert werden.
Weiterhin ist aus dem Strand der Technik eine Pupillenteilung zur Realisierung der Strahlteilung bekannt (DE 10257237 A1). Hierzu wird das Anregungslicht mit einer verkleinerten numerischen Apertur in die Probe abgebildet. Da die Fluoreszenz in alle Raumrichtungen abgestrahlt wird, erfolgt die Sammlung der Fluoreszenz hierbei in einer vergrößerten Apertur.
Zur Fluoreszenzanregung werden verschiedenste Farbstoffe eingesetzt. Dies bedeutet, dass für verschiedene Anregungs- und Detektionswellenlängen verschiedene Farbteiler benötigt werden, die normalerweise auf einem Filterrad in den Strahlengang ein- und ausgeschwenkt werden können. Zusätzlich werden Präparate mit mehreren Farbstoffen gleichzeitig versehen. Die Aufnahme der Probensignale, so genannte Mehrfachfluoreszenzsignale, erfolgt dann mit mehreren Detektoren.
Nähere Details zum Stand der Technik zu Strahlteilern in Laser-Scanning- Mikroskopen sind weiterhin in „Handbook of biological confocal microscopy", Kapitel 9, Editor J. P. Pawley, Plenum Press, 1995 zu finden.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine achromatische Strahltrennung des Anregungs- vom Detektionslicht mit hoher Effizienz sowohl für das Anregungslicht als auch für das Detektionslicht zu erreichen. Dies wird durch die im Folgenden erläuterten Anordnungen realisiert.
Beschreibung der Erfindung
Die Abb. 1 - 6 und 9 - 11 beschreiben jeweils Anordnungen zur Trennung des gemeinsamen Anregungs- und Detektionstrahlenganges. Der prinzipielle Aufbau der Strahlteilung ist in Abb. 1 anhand des Standes der Technik schematisch dargestellt. Der Anregungsstrahlengang umfasst hierbei Strahlwege (3) aus Richtung Lichtquelle (LQ), die über den Strahlteiler (MDB) in Richtung der Probe (PR) reflektiert werden. Der Strahlweg vom Strahlteiler (MDB) bis zur Probe (PR) wird als gemeinsamer Anregungs- und Detektionsstrahlengang (1 ) bezeichnet. In der Probe wird beispielsweise Fluoreszenzlicht (FL) angeregt. Zusätzlich reflektiert die Probe einen Anteil des Anregungslichts (AL). Das Fluoreszenzlicht wird vorzugsweise vom Strahlteiler (MDB) transmittiert und gelangt in den Detektionsstrahlengang (2), der die Strahlwege von MDB bis zum Detektor (DE) umfasst. Von der Probe (PR) reflektiertes Anregungslicht gelangt über den MBD überwiegend in Richtung des Anregungsstrahlenganges (3) und damit in Richtung der Lichtquelle (LQ). In einem Laser Scanning Mikroskop hat das Detektionslicht (beispielsweise
Fluoreszenzlicht) eine größere spektrale Bandbreite als das Anregungslicht. Dies liegt daran, dass die Anregung in Bändern von ca. bis zu 20 nm spektraler Breite erfolgt. Die spektrale Bandbreite beeinflusst die zeitliche Kohärenzlänge des Lichtes.
Je breiter das Spektrum des Lichtes ist, desto kürzer ist die zeitliche Kohärenzlänge des Lichtes. Fluoreszenzlicht hat somit eine kürzere Kohärenzlänge als das
Anregungslicht.
Erfindungsgemäß wurde erkannt, dass sich durch Ausnutzung dieser Eigenschaft eine besonders effiziente und achromatische Strahlteilung realisieren lässt.
Der erfindungsgemäße Strahlteiler verändert vorteilhaft die Abbildungseigenschaften im Vergleich zum Stand der Technik nicht oder nur unwesentlich .
Abb. 2a) zeigt ein optisch transparentes Stufenelement (PM). Dieses Element zeichnet sich dadurch aus, dass es entlang der optischen Achse (o.A.) Stufen mit einer Breite (B) und einer Höhe (A) aufweist. Die Stufen können beispielsweise durch aufeinander gesetzte Glasplatten mit einem seitlichen Versatz, durch Ätzprozesse
(diffraktive Optik) oder durch Mikromaterialbearbeitung realisiert werden.
Die Höhe (A) ist dabei so gewählt, dass diese größer ist als die zeitliche
Kohärenzlänge des zu detektierenden Lichtes. Jedoch ist die Höhe (A) kleiner als die
Kohärenzlänge des Anregungslichtes. Beispielsweise hat Licht mit einer Fluoreszenz im Bereich von 500 bis 550 nm eine Kohärenzlänge von 3.6μm. Das anregende
Laserlicht besitzt dagegen aufgrund der Schmalbandigkeit je nach Lasermedium eine
Kohärenzlänge im cm-Bereich. Die Stufenhöhe könnte daher vorzugsweise größer etwa 5-10 μm betragen.
Die Breite (B) des Stufenelements (PM) ist so gewählt, dass sie größer als die räumliche Kohärenzlänge ist, so dass das Stufenelement nicht lichtbeugend für das
Anregungs- und Fluoreszenzlicht wirkt.
Abb. 2b) zeigt das Verhalten des anhand von Abb. 2a) erläuterten Elements im Strahlengang. Detektions- und Anregungslicht (1 ) gelangen entlang der optischen Achse o.A. auf das Stufenelement (PM), welches senkrecht ( die Stirnfläche SF aus Fig.2a) zur optischen Achse im Strahlengang angeordnet ist. Das Licht wird an den Stufen in Teilstrahlen (TrTn) zerlegt, wobei benachbarte Teilstrahlen eine diskrete Phasenverschiebung, um die Höhe der Stufe (A) zueinander erhalten. Da für das Detektionslicht die Höhe (A) größer als die Kohärenzlänge des Detektionslichts ist, können die an den Stufen generierten Teilstrahlen nicht mehr interferieren. Somit treten die Teilstrahlen des Detektionslichts FL ohne Winkeländerung (2) durch das Stufenelement hindurch.
Das Anregungslicht AL weist jedoch eine größere Kohärenzlänge als die Stufenhöhe (A) auf. Somit können die Teilstrahlen miteinander interferieren. Hierdurch ergibt sich eine Ablenkung des Anregungslichtes aus der optischen Achse heraus entsprechend des bekannten Snellschen Gesetzes. Hier wird vor allem die erste Beugungsordnung betrachtet. Durch entsprechendes Design des Stufenelementes , zum Beispiel über die Dimensionierung der Stufenbreite (B) oder eine leichte Verdrehung des Stufenelements zur optischen Achse können die nullte Ordnung bzw. höhere Ordnungen weitgehend vermieden werden.
Es entsteht somit eine räumliche Separierung der Strahlwege für das Anregungsund Detektionslicht aufgrund der unterschiedlichen Kohärenzeigenschaften des Lichts.
Abb. 3a) zeigt ein weiteres Verhalten des anhand von Abb. 2a) erläuterten Elements im Strahlengang. Detektions- und Anregungslicht (1 ) leuchten das Stufenelement (PM) entlang der optischen Achse kreisförmig aus (O in 3b), wobei das Stufenelement wiederum senkrecht zur optischen Achse im Strahlengang angeordnet ist. Das Licht wird an den Stufen in Teilstrahlen (Ti-Tn) ( Fig.3c) zerlegt, wobei benachbarte Teilstrahlen eine diskrete Phasenverschiebung, um die Höhe der Stufe (A) zueinander erhalten (Pupille P). Dem Stufenelement nachgeordnet ist eine Linse (L).
Da für das Fluoreszenzlicht die Höhe (A) größer als die Kohärenzlänge des Fluoreszenzlichts ist, können die an den Stufen generierten Teilstrahlen nicht mehr interferieren. Somit treten die Teilstrahlen des Fluoreszenzlichts FL ohne Winkeländerung (3) durch das Stufenelement hindurch. Außerdem wird jeder Teilstrahl für sich einzeln und unabhängig von den anderen Teilstrahlen durch die Linse abgebildet. Maßgeblich für die Abbildung durch die Linse ist die Ausdehnung der Teilstrahlen, d.h. die Breite der Stufe (B) und der Strahldurchmesser. Da der Strahldurchmesser größer als die Breite (B) ist, entsteht im Fokus der Linse (Bild) für das Fluoreszenzlicht eine linienförmige Verteilung entlang der x-Achse (a in Fig. 3d). Da das Anregungslicht AL eine größere Kohärenzlänge als das Fluoreszenzlicht besitzt erfährt es eine Ablenkung in x-Richtung (3). Die Linse fokussiert weiterhin in beiden Achsen, so dass ein Punktfokus (b in Fig.3d) entsteht. Es entsteht somit wiederum eine räumliche Separierung der Strahlwege für das Anregungs- und Detektionslicht aufgrund der unterschiedlichen Kohärenzeigenschaften des Lichts. Durch den Einsatz der Linse und damit durch die Fokussierung des Anregungslichtes wird eine vereinfachte räumliche Trennung von Anregungs- und Detektionslicht ermöglicht.
Abb. 4a) zeigt eine weitere Anordnung mit der sich die Kohärenzeigenschaften des Anregungs- und Detektionslichtes für eine effiziente Strahltrennung nutzen lassen. Das Stufenelement PM weist hierbei eine rotationssymetrische Struktur um die optische Achse (o. A.) auf. Zusätzlich beschreibt die Einhüllende der Stufenstruktur (a) vorzugsweise eine konvexe Linsenform. Die Stufenhöhe sei wiederum für das Detektionslicht größer und für das Anregungslicht kleiner als die Kohärenzlänge der Strahlung. Durch die Struktur wird Licht in ringförmige Teilstrahlen mit gleicher Phase zerlegt. Für das Detektionslicht interferieren diese Teilstrahlen nicht. Dadurch wird die Strahlform und -richtung des Detektionslichts FL nicht beeinflusst. Für das Anregungslicht interferieren die Teilstrahlen und erzeugen einen Fokuspunkt im Brennpunkt des Phasenelements PM. Der Brennpunkt ergibt sich aus der konvexen Form der Einhüllenden des Stufenelements. Die Abb. zeigt eine vereinfachte Darstellung der Linse mit einer geraden Endfläche. Auch diese Fläche kann entsprechend geformt sein. Im Brennpunkt kann mit einem kleinen Spiegel R im ansonsten transmittiven Strahlteiler (MDB) eine räumliche Trennung des Anregungsund Detektionslichtes erfolgen, wobei das Anregungslicht AL in Richtung Ausgang (3) reflektiert wird. Die Form des MDB ist im Teilbild 4b) verdeutlicht. Er besitzt eine verspiegelte Region (R) und eine transparente Region (T). Es entsteht somit wiederum eine räumliche Separierung der Strahlwege für das Anregungs- und Detektionslicht aufgrund der unterschiedlichen Kohärenzeigenschaften des Lichts.
Abb. 5) zeigt eine Anordnung mit der sich das Detektionslicht nach der Trennung vom Anregungslicht wieder fokussieren lässt. Hierzu wird ein Kompensationselement (cPM) nach dem Stufenelement (PM) angeordnet. Das cPM ist so beschaffen, dass die durch PM eingeführte modifizierte Phasenfront wieder kompensiert wird. Dazu muss das cPM genau die invertierte (spiegelverkehrte) Form des PM aufweisen. Setzt man beide Elemente PM und cPM zusammen, dann ergibt sich eine planparallele Platte.
Abb. 6) zeigt eine vorteilhafte Kombination der Anordnungen aus den Abb. 4 und 2b. Abb. 4 verwendet einen speziellen Spiegel (MBD) zur räumlichen Aufspaltung der Anregungs- (3) und Detektionslichts (2), wobei der MDB einen Teil des Detektionslichts abschattet, so dass es zu Effizienzverlusten kommt. Durch die Kombination des ablenkenden (PM1 ) und eines fokussierenden (PM2) Stufenelements erfolgt die Fokussierung nur des Anregungslichts außerhalb des Detektionsstrahlenganges auf einen Reflektor M, so dass eine besonders effiziente Strahltrennung ermöglicht wird.
Analog zu Fig.5 sind Kompensationselemente cPM1 und cPM2 im weiteren Strahlengang des Fluoreszenzlichtes vorgesehen, cPM1 zur Kompensation von PM2 ist als Hohlelement HS mit zu PM2 spiegelverkehrten Hohlräumen H ausgebildet, ansonsten aller als transmissives Element ausgebildet, während cPM2 zu PM1 spiegelverkehrt aufgebaut ist. Der Phasenversatz der Elemente PM1 , PM2 wird hierdurch wieder aufgehoben und am Ausgang von cPM2 liegt voll fokussierfähiges Detektionslicht FL vor.
Die Stufenelemente (PM) können ohne Einschränkung auch reflektierend ausgebildet werden. Ein Beispiel für ein Stufenelement ist in Abb. 7) dargestellt.
Das gemeinsame Anregungs- und Detektionslicht wird aus Richtung (1 ) auf das Stufenelement geleitet. Am Stufenelement werden Teilstrahlen unterschiedlicher Phase erzeugt. Die Stufendifferenz (h) wird hierbei so gewählt, dass die Kohärenzlänge des Fluoreszenzlichts kleiner als die Stufendifferenz ist. Das Detektionslicht (2) erfährt hierdurch eine klassische Reflexion, wobei der Einfalls- (a1 ) und Ausfallswinkel (a2) gleich sind, da die Teilstrahlen (die durch die Breite der Stufen (b) bestimmt sind) nicht interferieren können. Die Stufendifferenz (h) ist jedoch kleiner als die Kohärenzlänge des Anregungslichts. Somit können die Teilstrahlen des Anregungslichtes nicht interferieren. Durch Interferieren der Teilstrahlen des Anregungslichts (2) erfährt dieses jedoch eine Beugung am einem Gitter, wobei der Ausfallswinkel (a3), dann durch die Anzahl der Streifen (Stufenbreite b) entsprechend der aus dem Stand der Technik bekannten Gitterformel
a3 = a1 + lambda / b
gegeben ist, wobei lambda die Wellenlänge des Anregungslichts ist. Eine räumliche Trennung des Anregungs- vom Detektionslichts (Winkel zwischen den Strahlengängen (2) und (3) = a3-a2) kann durch geeignete Wahl der Streifenzahl (Stufenbreite b) bzw. des Einfallswinkels auf (PM) (a1 ) erfolgen. Die Verwendung von reflektierenden Anordnungen hat den zusätzlichen Vorteil, dass sie zumindest für das Detektionslicht achromatisch sind.
Abb. 8) zeigt zwei beispielhafte schematische Anordnungen in einem Laser- Scanning-Mikroskop, wobei eine räumliche Separierung der Strahlwege für das Anregungs- und Detektionslicht aufgrund der unterschiedlichen Kohärenzeigenschaften des Lichts realisiert wird. Hier wird das Anregungslicht der Lichtquelle in derselben Richtung über das Stufenelement eingekoppelt wie es nach Rückkehr von der Probe wieder ausgekoppelt wird. Teilbild a) zeigt eine Anordnung entsprechend der Abb. 1 , wobei das Strahlteilerelement (MDB) durch einen erfindungsgemäßen Strahlteiler (S) ersetzt wurde. Im Detektionsstrahlengang (2) ist der Strahlteiler (S) so ausgelegt, dass die durch das Stufenelement (PM) modifizierte Phasenfront wieder durch das Element cPM geglättet wird. Hierdurch kann das Licht ausgangsseitig durch die konfokale Blende (PH) fokussiert werden.
Teilbild b) zeigt eine weitere Anordnung, wobei die konfokale Blende (PH) im gemeinsamen Anregungs- und Detektionsstrahlengang (1 ) angeordnet ist. Eine Kompensation der durch das Stufenelement (PM) modifizierten Phasenfront ist im Detektionsstrahlengang (2) nicht erforderlich. Dies hat den Vorteil, dass sich die Justage vereinfacht, da kein kompensierendes Element (cPM) verwendet wird.
Auf das in Teilbild a) gezeigte Kompensationselement CPM kann auch verzichtet werden, wenn als konfokale Blende PH eine Rechteckblende zum Einsatz kommt. Für den Strahlteiler kommt vorzugsweise eine Anordnung nach Abb. 2b) zum Einsatz. Das Seitenverhältnis der Länge zur Breite der Rechteckblende wird vorzugsweise so gewählt, dass es dem Verhältnis der Breite der Stufen des Stufenelements (B) zum Strahldurchmesser am Eingang des Stufenelements entspricht.
Abb. 9) zeigt beispielhaft eine detaillierte Darstellung der Anordnung nach Abb. 8a) mit dem Strahlteilerelement aus Abb. 6).
Die Strahlteilung, d.h. die Strahlwege für das Anregungs- und Detektionslicht sind für die Hin- und Rückwege identisch. Somit ist es beispielsweise für das Anregungslicht egal, ob eine Einstrahlung der Lichtquelle LQ oder eine Auskopplung des Anregungslichtes (das an der Probe reflektiert wurde) in Richtung der Lichtquelle erfolgt - siehe auch Erläuterung weiter oben, insbesondere zu 8a.
Abb. 10) zeigt beispielhaft eine detaillierte Darstellung der Anordnung nach Abb. 8a) mit dem Strahlteilerelement aus Abb. 5).
Abb. 11 ) zeigt beispielhaft eine detaillierte Darstellung der Anordnung für ein Lichtmikroskop mit einem CCD Detektor, wobei zur Strahlteilung das Strahlteilerelement aus Abb. 5) zum Einsatz kommt. Gestrichelt eingezeichnet ist der Pupillenstrahlengang, durchgezogen der Objektstrahlengang.
Bei der Beschreibung der Anordnungen wurde davon ausgegangen, dass das Detektionslicht eine geringere Kohärenzlänge als das Anregungslicht besitzt. Wird Anregungslicht mit einer geringeren Kohärenzlänge im Vergleich zum Detektionslicht eingesetzt (Weißlichtquelle), dann wird das Stufenelement so ausgelegt, dass die Stufenhöhe kleiner als die Kohärenzlänge des Detektionslichts aber größer als die des Anregungslichts ist. Das bedeutet dass bezüglich der beschriebenen Anordnungen das Anregungslicht durch das Stufenelement hindurchgehen würde und das Detektionslicht (Fluoreszenz) interferiert und aus der optischen Achse heraus gebeugt wird. In den beschriebenen Anordnungen wird dann lediglich der Anregungs- und Detektionsstrahlengang vertauscht.

Claims

Patentansprüche
1.
Anordnung zur optischen Erfassung von in einer Probe angeregter und/ oder rückgestreuter Lichtstrahlung, wobei die Probenbeleuchtung eine größere zeitliche
Kohärenzlänge als die Detektionsstrahlung aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass ein im wesentlichen stufenförmiges Stufenelement mit Stufenhöhen größer als die
Kohärenzlänge des Detektionslichts und kleiner als die des Anregungslichts vorgesehen ist, wobei an jeder Stufe ein Teilstrahl des Lichtes erzeugt wird und durch Interferenz der Teilstrahlen des Anregungslichtes eine Veränderung der
Strahleigenschaften des Anregungslichtes erfolgt.
2.
Anordnung zur optischen Erfassung von in einer Probe angeregter und/ oder rϋckgestreuter Lichtstrahlung, wobei die Probenbeleuchtung eine kleiner zeitliche
Kohärenzlänge als die Detektionsstrahlung aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass ein im wesentlichen stufenförmiges Stufenelement mit Stufenhöhen kleiner als die
Kohärenzlänge des Detektionslichts und größer als die des Anregungslichts vorgesehen ist, wobei an jeder Stufe ein Teilstrahl des Lichtes erzeugt wird und durch Interferenz der Teilstrahlen des Detektionslichtes eine Veränderung der
Strahleigenschaften des Detektionslichtes erfolgt.
3.
Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Stufenhöhe die Differenz der optisch wirksamen Länge im Stufenelement zwischen zwei benachbarten Stufen ist.
4.
Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Veränderung der Strahleigenschaften in einer Richtungsänderung von
Interferenzlicht in Bezug auf die Richtung von nicht interferierendem Lichtes besteht.
5.
Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Stufenelement in Richtung der optischen Achse des Anregungs- und/oder Detektionslichtes in seinem Querschnitt eine stufenartig abnehmende Dicke aufweist.
6.
Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein Stufenelement, welches das Anregungslicht relativ zum Detektionslicht ablenkt, vorgesehen ist.
7.
Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein Stufenelement, welches das Anregungslicht relativ zum Detektionslicht in mindestens einer Achse fokussiert, vorgesehen ist.
8.
Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein zusätzliches Element zur räumlichen Trennung des Anregungs- und Detektionsstrahlenganges vorgesehen ist.
9.
Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Stufenelement reflektierend und/oder transparent ausgebildet ist.
10.
Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine konfokale Rechteckblende am Eingang des Stufenelements vorgesehen ist.
11.
Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein zweites Stufenelement zur Kompensation der Phasenfront im Detektionsstrahlengang vorgesehen ist.
12.
Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
Die Ausbildung des zweiten Stufenelementes bezüglich der Einstrahlrichtung zur
Ausbildung des ersten Stufenelementes im Wesentlichen spiegelverkehrt ist.
13.
Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Optik zur separaten Fokussierung des Anregungs- und des Fluoreszenzlichtes vorgesehen ist.
14.
Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Stufenelement eine rotationssymetrische Struktur um die optische Achse aufweist und eine Einhüllende der Stufenstruktur vorzugsweise eine konvexe
Linsenform hat.
15.
Anordnung nach Anspruch 14, wobei ein zweites Stufenelement vorgesehen ist das einen Hohlraum aufweist, der der
Form des rotationssymmetrischen Stufenelementes im Wesentlichen entspricht.
16.
Anordnung nach einem der Ansprüche 14,15 , wobei das zweite Stufenelement spiegelverkehrt zum ersten Stufenelement angeordnet ist.
17.
Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Anregungslicht außerhalb des Detektionsstrahlenganges auf einen Spiegel fokussiert ist.
18.
Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei über einen das Anregungslicht über einen Spiegel in den Beleuchtungsstrahlengang ein und/ oder ausgekoppelt wird.
19.
Anwendung einer Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche in einem Mikroskop.
20.
Anwendung einer Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, in einem
Laser-Scanning-Mikroskop.
21.
Mikroskop, insbesondere Laser-Scanning-Mikroskop nach einem der vorangehenden
Ansprüche.
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4281896A (en) * 1978-08-02 1981-08-04 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Shared aperture separator for reciprocal path optical beams
WO1999042884A1 (de) * 1998-02-19 1999-08-26 Leica Microsystems Heidelberg Gmbh Optische anordnung mit spektral selektivem element
US6310733B1 (en) * 1996-08-16 2001-10-30 Eugene Dolgoff Optical elements and methods for their manufacture
US20020027716A1 (en) * 2000-09-01 2002-03-07 Koichiro Tanaka Method of processing beam, laser irradiation apparatus, and method of manufacturing semiconductor device
EP1420281A2 (de) * 2002-11-15 2004-05-19 CARL ZEISS JENA GmbH Verfahren und Anordnung zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19758744C2 (de) 1997-01-27 2003-08-07 Zeiss Carl Jena Gmbh Laser-Scanning-Mikroskop
US6888148B2 (en) 2001-12-10 2005-05-03 Carl Zeiss Jena Gmbh Arrangement for the optical capture of excited and /or back scattered light beam in a sample

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4281896A (en) * 1978-08-02 1981-08-04 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Shared aperture separator for reciprocal path optical beams
US6310733B1 (en) * 1996-08-16 2001-10-30 Eugene Dolgoff Optical elements and methods for their manufacture
WO1999042884A1 (de) * 1998-02-19 1999-08-26 Leica Microsystems Heidelberg Gmbh Optische anordnung mit spektral selektivem element
US20020027716A1 (en) * 2000-09-01 2002-03-07 Koichiro Tanaka Method of processing beam, laser irradiation apparatus, and method of manufacturing semiconductor device
EP1420281A2 (de) * 2002-11-15 2004-05-19 CARL ZEISS JENA GmbH Verfahren und Anordnung zur tiefenaufgelösten optischen Erfassung einer Probe

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
POPOV E K ET AL: "TRANSMISSION GRATINGS FOR BEAM SAMPLING AND BEAM SPLITTING", APPLIED OPTICS, OSA, OPTICAL SOCIETY OF AMERICA, WASHINGTON, DC, vol. 35, no. 16, 1 June 1996 (1996-06-01), pages 3072 - 3075, XP000594924, ISSN: 0003-6935 *

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