WO2009043986A1 - Reactif pseudo peptidique trifonctionnel, ses utilisations et applications - Google Patents
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- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
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Definitions
- the present invention relates to a trifunctional pseudopeptide reagent, for its various uses, in particular for the preparation of luminescent reagents or bioconjugates, optionally luminescent, the use of these reagents and bioconjugates for the functionalization of solid supports, as well as for the use of the solid supports thus functionalized for the detection of molecules of interest.
- bioconjugates derived from biopolymers involve being able to covalently (reversibly or non-reversibly) attaching these bioconjugates to a second molecular architecture (biopolymer, solid support,. ..) and to detect and / or quantify them accurately (optical detection, radioactive, ).
- a second molecular architecture biopolymer, solid support,. ..
- it is essential to have tools for effectively combining a biopolymer with other (macro) molecules without significantly altering the properties of each of the partners involved in the resulting and targeted molecular architecture.
- bifunctional cross-linking reagents For this purpose, many small bifunctional molecules (better known as "bifunctional cross-linking reagents") have been developed. A large number are marketed by Pierce. However, it is interesting to note that several academic groups continue to work on the development of new bifunctional reagents that are increasingly sophisticated and allow the development of ever more complex bioconjugates.
- the sulfo-SBED is not entirely satisfactory inasmuch as it is not possible to modulate the hydrophobic / hydrophilic nature and especially the third functional unit (ie biotin) allows only strong interaction (quasi -covalent) with partners previously conjugated to avidin (glycoprotein) or streptavidin, which greatly limits its use.
- trifunctional reagents for preparing bioconjugates consisting of a trifunctional central unit selected from triaminobenzene, tricarboxybenzene, dicarboxyaniline and diaminobenzoic acid, on which three affinity ligands, a biomolecule-reactive group and an effector agent are attached via three distinct linker arms.
- This reagent has the disadvantage of having a trifunctional central unit consisting of at least two identical chemical functions (ie, carboxylic acid or amine functions) which restricts the choice of the complementary functions carried by the connecting arms which may have a limiting effect.
- trifunctional reagents comprising three distinct functional poles, namely a luminescent group (L), a molecule (B) selected from the analyte to be detected, an analogue or a fragment thereof and finally a function ensuring the attachment of said trifunctional reagent to the surface of a solid support
- L luminescent group
- B molecule
- the present invention therefore firstly relates to a trifunctional pseudopeptide reagent, characterized in that it comprises at least the following three reactive structural units A, B and C:
- a unit A consisting of a hydrophilic chain of pseudopoly (ethylene glycol) (pseudo-PEG chain) interrupted by at least one amide function and having two ends E1 and E2, said E1 end being free and having a pattern terminal selected from amino group (-NH 2 ), activated carbamates and activated esters, and said E2 end having a terminal carbon atom carrying a carbonyl function, said carbon atom being engaged in an amide function (-C (O) -NH-) formed with the nitrogen atom of an ⁇ -amine function carried by the unit B;
- a unit B consisting of an amino acid chosen from ⁇ -amino acids of the L, D series and their racemic mixtures, said amino acid having on its side chain at least one oxyamine function protected by a protecting group or at least one minus a masked aldehyde function; and (c) a unit C consisting of an amino acid selected from ⁇ -amino acids of the L, D series and their racemic mixtures, said amino acid having on its side chain at least one thiol, maleimide, iodoacetyl, azide unit, true alkyne, phosphane or cyclooctyne; said units B and C being linked to one another via an amide function formed between the carbon atom carrying the carbonyl function of the ⁇ -amino acid constituting the unit B and the nitrogen atom of the ⁇ -amine function of the ⁇ -amino acid constituting the unit C.
- the main originality of these structures lies in the combination of amino acids (natural or modified) protected on their side chains by selected protective groups, and a functionalized pseudo-PEG chain whose length is easily adjustable. Even if the presence of several chemical functions (protected or not) necessarily entails problems during the preparation of these reagents (incompatibilities between functions, degradation and / or premature deprotection of certain protective groups, ...), the structure segmented into three Separate structural units (prepared independently of each other and then coupled together in the final steps of developing the trifunctional reagent) allows for a highly convergent synthesis strategy that minimizes the simultaneous presence of incompatible chemical motifs between them. Furthermore, a large structural diversity (modulation of geometry, length, physicochemical properties and solubility in particular, etc.) is accessible by modifying only one of the three structural units of the trifunctional reagent.
- the term "pseudo" -PEG string a string having great similarities of structure with the PEG chain: but which differs by the presence of one or more functional groups (ester, amide, carbamate, urea, ...) within it.
- the term "true” alkyne is understood to mean an alkyne whose triple bond is monosubstituted by a R: R 3 group.
- the three reactive structural units constituting the trifunctional reagents according to the present invention make it possible to carry out reactions totally chemo-selective under mild conditions (especially in aqueous media in which biopolymers are soluble).
- the activated carbamate or activated ester unit which may be present at the free E-terminus of the pseudo-PEG chain constituting unit A is reactive with respect to compounds having a complementary reactive unit such as an amine function (generally a primary amine aliphatic). Moreover, the primary amine function which may alternatively be present at the free E-terminus of the pseudo-PEG chain constituting unit A is reactive with respect to compounds having a complementary unit such as a carbamate or an activated ester .
- This end E1 allows in particular the fixation of biological macromolecules which comprise, naturally or not, said complementary reactive functions (antibodies, nucleic acids or analogs, polysaccharides, proteins, peptides, radionuclides, toxins, enzyme inhibitors, haptens, etc.). .).
- unit B after possible activation, that is to say after deprotection in the case of the oxyamine function or after unmasking in the case of the aldehyde function, under mild conditions compatible with the stability of the various partners involved, is reactive vis-à-vis compounds or materials having one or more carbonyl groups (aldehyde, ...) or alternatively amine.
- aldehyde Among such compounds, mention may in particular be made of macromolecules such as antibodies, nucleic acids or the like, liposomes, polysaccharides, proteins, peptides, active principles, radionuclides, toxins, fluorophores, enzyme inhibitors, haptens, etc.
- the thiol unit defined as a possible side substituent for the ⁇ -amino acid constituting the unit C is reactive with respect to the compounds or materials comprising a maleimide or iodoacetyl unit.
- the maleimide and iodoacetyl units, defined as possible side substituents of the ⁇ -amino acid constituting the unit C, are reactive with respect to the compounds or materials having a thiol function or a cysteine after their possible deprotection.
- the azide unit defined as possible lateral substituent of the ⁇ -amino acid constituting the unit C is reactive with respect to the compounds or materials having a true alkyne unit, phosphane or cyclooctyne and alternatively the true alkyne units, phosphane or cyclooctyne defined as possible side substituents of the ⁇ -amino acid constituting unit C are reactive with respect to compounds or materials having an azide pattern.
- This reaction site can in particular be used for the attachment of a fluorophore group carrying a complementary functional group reactive with the thiol, maleimide iodoacetyl, azide, true alkyne, phosphane or cyclooctyne units present on the C unit.
- the pseudo-PEG chain of unit A is chosen from the following chains of formula (A-I):
- Ri represents a primary amine, an activated carbamate unit or an activated ester unit
- n identical or different, are integers between 2 and 10 inclusive,
- p is an integer from 1 to 10 inclusive
- the arrow represents the covalent bond connecting the amide function of the E2 end of the pseudo-PEG chain to the unit B or C.
- activated carbamate groups that may be present at the E1 end of the pseudo-PEG chain of unit A, mention may in particular be made of N-hydroxysuccinimidyl carbamate, N-hydroxysuccinimidyl carbamate, N-carbamate and the like. hydroxyphthalimidyl, N-hydroxypiperidinyl carbamate, ⁇ -nitrophenyl carbamate and pentafluorophenyl carbamate; N-hydroxysuccinimidyl carbamate being very particularly preferred.
- the activated ester groups that may be present at the E1 end of the pseudo-PEG chain of unit A, there may be mentioned in particular the N-hydroxysuccinimidyl ester, the N-hydroxysuccinimidyl sulfo ester, the ester cyanomethyl, the N-hydroxyphthalimidyl ester, the N-hydroxypiperidinyl ester, the p-nitrophenyl ester, the pentafluorophenyl ester, the benzotriazole esters, the hydroxybenzotriazole esters and the hydroxyazabenzotriazole esters; the N-hydroxysuccinimidyl ester being particularly preferred.
- DABA 2,4-diaminobutanoic acid
- lysine is particularly preferred.
- ⁇ -amino acids which can be used for unit C, there may be mentioned in particular lysine, cysteine, homolysine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid (DABA), 2,3-diaminobutanoic acid (DABA), diaminopropanoic acid, aminomercaptoacetic acid, Thomocysteine, 5-mercapto-norvaline, 6-mercapto-norleucine, 2-amino-7-mercapto-heptanoic acid, and 2-amino-8-mercaptoacetic acid; octanoic.
- DABA 2,4-diaminobutanoic acid
- DABA 2,3-diaminobutanoic acid
- diaminopropanoic acid aminomercaptoacetic acid
- aminomercaptoacetic acid Thomocysteine, 5-mercapto-norvaline, 6-mercapto-norleucine, 2-amin
- lysine and cysteine are particularly preferred.
- the protective groups for the oxyamine function of the side chain of the ⁇ -amino acid constituting the unit B are preferably chosen from labile protective groups under mild conditions such as 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), benzyloxycarbonyl (Z ), allyloxycarbonyl (Alloc), trichloroethoxycarbonyl (Troc), trimethylsilylethoxycarbonyl (Teoc), pyridyldithioethoxycarbonyl (Pydec), 2- (2-nitrophenyl) -propyloxycarbonyl ( ⁇ PPOC), azomethyloxycarbonyl (Azoc), 2 - (trimethylsilyl) ethanesulfonyl (Ses) and phthalimide.
- labile protective groups under mild conditions such as 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), benzyloxycarbonyl (Z ), allyloxycarbonyl
- the groups Fmoc and phthalimide are particularly preferred.
- the term "masked aldehyde function" any aldehyde or ketone function included in a molecule organic compound selected from serine or any organic molecule containing the 1,2-diol (-CH (OH) -CH (OH) -), 1,2-amino-alcohol or 1,2-hydroxythiol moiety.
- organic molecules there may be mentioned tartaric acid, glyceric acid, 2,3-dihydroxypropanoic acid, 3,4-dihydroxybutanoic acid, 4,5-dihydroxypentanoic acid and the acid. 3-amino-2-hydroxypropanoic acid.
- the term "mild conditions" the use of oxyamine function deprotection reagents or unmasking function of the aldehyde function at room temperature and at neutral pH or in a pH range between about 5 and 9 inclusive.
- HIO 4 periodic acid
- NaIO 4 sodium metaperiodate
- KIO 4 potassium metaperiodate
- R 1, m, n and p have the same meanings as those indicated above for the unit of formula (A-I),
- Proc is a protecting group selected from 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), benzyloxycarbonyl (Z), allyloxycarbonyl (Alloc), trichloroethoxycarbonyl (Troc), trimethylsilylethoxycarbonyl (Teoc), pyridyldithioethoxycarbonyl (Pydec), 2- ( 2-nitrophenyl) -propyloxycarbonyle (NPPOC), azomethyloxycarbonyl (Azoc), 2- (trimethylsilyl) ethanesulfonyl (Ses) and phthalimide;
- - Func is a thiol, maleimide, iodoacetyl, azide, true alkyne, phosphane or cyclooctyne unit.
- Xi is an n-butyl chain.
- X 2 is an ethyl or n-butyl chain.
- the compounds of formula (I) above are chosen from the following compounds of formulas (I-1) to (1-6):
- the trifunctional reagents according to the invention can be prepared according to convergent synthesis methods according to which each of the units A, B and C is prepared individually, these being then assembled to lead to the expected trifunctional reagent.
- These convergent synthesis methods implement conventional reactions well known to those skilled in the art and the details of which are given in the synthesis examples illustrating the present application.
- the reagents according to the present invention and as described above can have multiple uses and applications.
- the trifunctional reagents according to the present invention can firstly be used for the preparation of bioconjugates.
- Another object of the present invention is the use of at least one trifunctional reagent as defined above for the preparation of a bioconjugate.
- bioconjugate means any trifunctional reagent as described above on which at least one biological molecule of interest is attached.
- the fixation of the molecule (s) of interest may be carried out at the level of the primary amine function or the activated carbamate or activated ester unit present at the free end of the pseudo-PEG chain constituting the unit A which is reactive vis-a-vis the with respect to biological molecules having an acid function (or carbamate) or a reactive amine function (generally an aliphatic primary amine).
- the binding of the biological molecule of interest can also be carried out at unit B, after deprotection of the oxyamine function or unmasking of the aldehyde function, which then become reactive with respect to the biological molecules having one or more carbonyl groups (aldehyde, etc.) respectively oxyaminated. It is thus possible to set one or two biological molecules, identical or different, trifunctional reagent according to the present invention.
- Another object of the invention is thus a bioconjugate characterized in that it consists of a trifunctional reagent as defined above in which the primary amine unit, activated carbamate or activated ester present at the free end of the pseudo-chain.
- PEG constituting the unit A and / or the oxyamine or aldehyde function carried by the unit B after deprotection or unmasking is (are) functionalized by a biological molecule of interest.
- bioconjugates it is therefore possible to have the following three types of bioconjugates: i) a bioconjugate constituted by a trifunctional reagent in which only the amine function or only the activated carbamate or activated ester unit present at the free end of the pseudo chain -PEG constituting the unit A is functionalized by a biological molecule, ii) a bioconjugate constituted by a trifunctional reagent in which only the deprotected oxyamine or aldehyde function unmasked from the unit B is functionalized by a biological molecule, and iii) a bioconjugate comprising two biological molecules, constituted by a trifunctional reagent in which the primary amine function or the activated carbamate or activated ester unit present at the free end of the pseudo-PEG chain constituting the unit A and the deprotected oxyamine or aldehyde function unmasked from unit B are each functionalized by a biological molecule; in the latter case the bioconjugate comprises two
- bioconjugates can be made conventionally by reacting a trifunctional reagent according to the invention with the biological molecule or molecules of interest to be fixed, while using the methods well known in the technical state for reacting by example:
- the tri functional reagents according to the present invention can also be used for the preparation of luminescent reagents, in particular fluorescent reagents.
- Another object of the present invention is therefore the use of at least one trifunctional reagent as defined above, for the preparation of a luminescent reagent, in particular fluorescent reagents.
- the grafting of a luminescent group (L) can be carried out: i) by reacting the thiol, maleimide, iodoacetyl, azide, true alkyne, phosphane or cyclooctyne unit carried by the unit C with a maleimide complementary function , iodoacetyl (if unit C has a thiol function), thiol (if unit C has a maleimide or iodoacetyl unit) or true alkyne, phosphane or cyclooctyne (if unit C has an azide function), or else azide (if the unit C comprises a true alkyne function, phosphane or cyclooctyne), said complementary function being carried, naturally or not, by said luminescent group, and / or ii) by reacting the deprotected oxyamine or aldehyde function unmasked from the unit B with
- luminescent reagents comprising: i) a single luminescent group attached to the unit B via the deprotected oxyamine function or the unmasked aldehyde function or on the unit C via the thiol function or maleimide, iodoacetyl, true alkyne, phosphane, cyclooctyne or even azide units; ii) two luminescent groups, one being attached to the unit B via the deprotected oxyamine function or the unmasked aldehyde function and the other being attached to the unit C via the thiol function or maleimide, iodoacetyl, true alkyne, phosphane, cyclooctyne or even azide units.
- the nature of the luminescent group or groups that can be used according to the invention is not critical from the moment when they naturally comprise or are functionalisable by a thiol or carbonyl function, or by a maleimide, iodoacetyl or alkyne unit. true, phosphane, cyclooctyne or even azide.
- the term luminescent group any substance which, when excited at a given wavelength or by a given chemical compound, is capable of emitting a photon, for example fluorophore or rare earth.
- luminescent groups including fluorophores
- fluorophores with polymethine chains (ie polyene chain); fluorescent cyanines such as those sold under the references Cy3, Cy3.5, Cy3B, Cy5, Cy5.5 and Cy7 by the company GE Healthcare; fluorescein (sodium fluorescein) and its derivatives such as fluorescein isothiocyanate (FITC) and 6-carboxyfluorescein (6-Fam); rhodamine and its derivatives such as tetramethyl rhodamine isothiocyanate (TRITC); water-soluble derivatives of rhodamine in the form of N-hydroxysuccinimide ester, such as the products sold under the trade name Alexa Fluor® by Invitrogen, for example Alexa Fluor® 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610-X, 633, 647, 660, 6
- the trifunctional reagents according to the present invention can also be used for the preparation of reagents luminescent, in particular fluorescent, also comprising an "acceptor compound" (Q) of the luminescence of the luminescent group
- reagents constitute what is known as an energy transfer cassette (or FRET cassette ) usable especially for the sequencing of DNA.
- Another object of the present invention is therefore the use of at least one trifunctional reagent as defined above for the preparation of a power transfer cassette.
- the grafting of the luminescent group will be carried out on the deprotected oxyamine or aldehyde function unmasked from the unit B or via the thiol function or the maleimide, iodoacetyl, true alkyne, phosphane, cyclooctyne or even azide units of the unit C, and the grafting of the acceptor compound (Q) will be carried out respectively via the thiol function or the maleimide, iodoacetyl, true alkyne, phosphane, cyclooctyne or even azide units of the unit C or on the deprotected or aldehyde oxyamine function unmasked from unit B.
- the invention therefore also relates to a transfer cassette of energy, characterized in that it consists of a trifunctional reagent as defined above, said reagent comprising a luminescent group (L) and an acceptor compound (Q ) of the luminescence of the luminescent group, L and Q being respectively and indifferently fixed on said trifunctional reagent via the deprotected oxyamine or aldehyde function unmasked from the unit B and the function thiol or the units maleimide, iodoacetyl, true alkyne, phosphane, cyclooctyne or even azide unit C.
- a transfer cassette of energy characterized in that it consists of a trifunctional reagent as defined above, said reagent comprising a luminescent group (L) and an acceptor compound (Q ) of the luminescence of the luminescent group, L and Q being respectively and indifferently fixed on said trifunctional reagent via the deprotected oxyamine or aldeh
- the luminescent group (L) that can be used in these energy transfer cassettes may in particular be chosen from the luminescent groups (L) mentioned above and that can be used for the preparation of the luminescent trifunctional reagents in accordance with the present invention.
- the term "acceptor compound" (Q) is understood to mean any molecule making it possible to reduce or disappear the luminescence of the luminescent group (L) under certain conditions.
- This compound of various natures, can in particular be a chemical compound (luminescent or not and such as for example fluorescent proteins), a heavy atom or a nanoparticle.
- acceptor compounds Q
- fluorescent compounds such as those mentioned above for L groups, in particular rhodamine and its derivatives such as tetramethyl rhodamine (TMR) and Rhodamine 6G (R6G).
- TMR tetramethyl rhodamine
- R6G Rhodamine 6G
- QSY® 7, QSY® 9 and QSY® 21 dyes (Molecular Probes); but also non-fluorescent molecules of the family of azo dyes, such as the compounds sold under the trade names Black HoIe Quencher® (BHQ), for instance BHQ-O, BHQ-I, BHQ-2 and BHQ-3 (Biosearch Technologies); gold particles such as those having a diameter of 1.5 nm sold under the trade name Nanogold Particles ® (Nanoprobes); disazo dyes such as the products sold under the trade names Eclipse Dark Quencher® (Epoch Bioscience) or QSY® 35 (Molecular Probes); the ElleQuencher ® commercial product (Eurogentec); malachite green and the acceptor compounds ("Quenchers") of the cyanine family, such as the compounds sold under the trade names Cy5Q or Cy7Q by the company GE Healthcare.
- BHQ Black HoIe Quencher®
- BHQ-O BHQ-O
- BHQ-I BHQ-2 and BHQ-3
- the luminescent group (L) and the acceptor compound (Q) are chosen from the following pairs (L / Q): Cy3 / Cy5, Cy5 / Cy7, Cy5 / Alexa Fluor ® 750, Cy3 / Cy5Q, Cy3 / QSY ® 7, Cy3 / QSY ® 9, Cy5 / Cy7Q, Cy5 / QSY ® 21, Cy5 / Cy5, Cy5.5 / Cy5.5, Cy7 / Cy7, R6 ) / Cy5, R6G / Alexa Fluor ® 647, R6G / QSY ® 21, Alexa Fluor ® 532 / Cy5, Alexa Fluor ® 532 / Alexa Fluor ® 647, Alexa Fluor ® 532 / QSY ® 21, Alexa Fluor ® 555 / Cy5, Alexa Fluor ® 555 / Alexa Fluor ® 647, Alexa Fluor ® 555 / Cy5, Alexa Fluor ® 555 /
- the trifunctional reagents can be used for the preparation of mixed bioconjugates comprising at least one biological molecule and at least one luminescent group.
- the present invention therefore also relates to a mixed bioconjugate, characterized in that it consists of a trifunctional reagent as defined above on which are fixed at least one biological molecule and at least one luminescent group.
- these mixed bioconjugates may also comprise an acceptor compound (Q) for the luminescence of the luminescent group (L).
- These mixed bioconjugates are therefore chosen from the trifunctional reagents on which are fixed: i) one or two biological molecules of interest and a luminescent group; or ii) a biological molecule of interest, and two luminescent groups; iii) a biological molecule of interest, a luminescent group, and an acceptor compound (Q) of the luminescence of the luminescent group; said biological molecules and said luminescent moieties and acceptor compound (Q) being attached to the functional reagent at the terminal ends of units A, B and C as described above.
- Trifunctional reagents and bioconjugates according to the present invention modified or not by a luminescent group at unit C, and in which the oxyamine or aldehyde function of unit B is free (ie non-functionalized by a biological molecule of interest, a fluorescent group or an acceptor compound) can be used for the functionalization of solid supports comprising at least one surface having one or more carbonyl groups, in particular one or more aldehyde or ketone functions or one or more oxyamine functions, respectively.
- the subject of the present invention is also a solid support, characterized in that it comprises at least one surface functionalized, covalently, with one or more trifunctional reagents, and / or with one or more bioconjugates, said reagents trifunctional and bioconjugated being optionally modified by a luminescent group at the level of the unit C and as defined above.
- the nature of the solid support is not critical from the moment when it comprises at least one surface having, naturally or after chemical modification, one or more carbonyl groups, in particular one or more aldehyde or ketone functions or respectively one or more primary amine functions, said groups or functions being able to react with the deprotected oxyamine function or respectively with the unmasked aldehyde function of the unit B of the tri functional reagent or the bioconjugate.
- Such supports there may be mentioned glass, plastic, and metals.
- the solid support comprises at least one surface functionalized with at least one bioconjugate and then constitutes a biochip such as for example a nucleic acid chip, a protein chip, a polysaccharide chip or a peptide chip, or a biosensor such as for example an immunosensor.
- a biochip such as for example a nucleic acid chip, a protein chip, a polysaccharide chip or a peptide chip, or a biosensor such as for example an immunosensor.
- Such supports can be prepared according to a process comprising the following steps: deprotection of the protected oxyamine function, or respectively the unmasking of the masked aldehyde function, present on unit B of at least one trifunctional reagent or from less a bioconjugate according to the invention to obtain a trifunctional reagent or a bioconjugate bearing a deprotected oxyamine function, respectively undefined aldehyde, - the formation of an oxyme bond by contacting said reagent or said bioconjugate carrying the oxyamine function deprotected or respectively aldehyde unmasked with a solid support of which at least one surface has a or more carbonyl groups, respectively primary amine, said oxyme bond ensuring the covalent attachment of said reagent or said bioconjugate to the surface of the support.
- Such supports may in particular be used for the detection of molecules of interest, in particular for the detection of analytes in a liquid medium.
- the invention also relates to the use of at least one trifunctional reagent as described above for the preparation of a probe for functional proteomics.
- Another object of the present invention is therefore a probe for functional proteomics, characterized in that it consists of a trifunctional reagent comprising:
- reporter tag a group allowing detection (or visualization) and / or purification of a target protein (reporter tag or "reporter tag”)
- the target protein is an enzyme
- the pattern recognized by the enzyme and the reactive group allowing a covalent link with the active site of this enzyme belong to the same entity.
- the other two units of said trifunctional reagent can be used to fix a group allowing detection (fluorophore for example) and a group facilitating purification (biotin, poly tag (histidine), ).
- the three entities can be fixed indifferently on any unit of the trifunctional pseudopeptide reagent according to the invention.
- the pattern recognized by the enzyme and the reactive group do not belong to the same entity and are therefore carried by two distinct units of the trifunctional pseudopeptide reagent according to the invention.
- the last unit of the trifunctional pseudopeptide reagent according to the invention will be used to fix the group allowing detection and / or purification.
- the unit A is a pseudo-PEG binding arm having an activated carbamate unit reactive with respect to the compounds having a primary amine function
- unit B is a lysine bearing on its side chain an oxyamine function protected by a Fmoc group, reactive with respect to surfaces having aldehyde functions
- - Unit C is a lysine having on its side chain a maleimide unit, reactive vis-à-vis the compounds having a thiol function.
- the strategy for synthesizing the compound (1-1) consists in separately preparing three correctly protected precursors (AI), (BI) and (CI) and then assembling them via coupling reactions to obtain the trifunctional reagent of formula (I-1 ) above according to the present invention.
- the precursor (AI) is a hydrophilic linker having four ethylene glycol units as well as a carboxylic acid function which will allow the subsequent coupling with the units (BI) and (CI) and a primary amino function that it It is essential to keep protected until the last conversion stage to "activated carbamate". It results from the combination of two molecules of 8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid, said molecules having been prepared according to the methods described by Rensen, PC N et al, J. Med. Chem., 2004, 47, 5798-5808; Dondoni, A. et al, J. Org. Chem., 2005, 70, 5508-5518 or Dhawan, R.
- the reaction mixture was then acidified by adding about 25 ml of a 1 M aqueous potassium hydrogen sulfate solution (KHSO 4 ). This solution was then extracted with 3 times 50 ml of ethyl acetate. The organic phase was dried over sodium sulphate (Na 2 SO 4 ) and then evaporated to dryness. The resulting oily residue was purified by column chromatography on silica gel (40 g) using a gradient of methanol (0 to 6%) in CH 2 Cl 2 as the mobile phase. Compound (7) (0.50 g, 1.87 mmol) was obtained as a colorless oil (50% yield).
- KHSO 4 a 1 M aqueous potassium hydrogen sulfate solution
- the precursor (BI) was synthesized in two steps from the protected N-Fmoc derivative of the aminooxyacetic acid (8) previously prepared by reaction between the commercial aminooxyacetic acid and the chloroformate of 9-fluorenylmethanol under Schotten-Baumann conditions (Cipolla L. et al, Bioorg Med Chem, 2002, 10, 1639-1646).
- the precursor (CI) was synthesized in four steps from ⁇ -Boc- ⁇ -ZL-lysine (11); in this compound Z represents the benzyloxycarbonyl group.
- the carboxylic acid function is converted to carboxamide (12) by reaction of ammonia with the mixed anhydride intermediately formed according to the method described, for example, by Hofmann, K. et al., J. Am. Chem. Soc., 1978, 100, 3585-3590.
- the ⁇ -NH 2 function protected by a Z group was released (13) by catalytic hydrogenation in order to be able to couple the maleimide derivative of glycine (14) previously prepared by reaction between glycine and N- (methyloxycarbonyl) maleimide according to the method described by Keller O. et al, HeIv. Chim. Acta, 1975, 58, 531-541.
- the maleimide derivative (15) was then isolated by chromatography on silica gel with a yield of 51%. Finally, the N-terminus was deprotected by treatment with trifluoroacetic acid to yield the precursor (CI).
- a voluminous white precipitate immediately formed; this was recovered by filtration and washed with 25 ml of distilled water and then with 25 ml of pentane. The residual water was removed by lyophilization to yield 0.705 g (1.86 mmol) of the compound (12).
- the filtrate was, moreover, taken up in 20 ml of ethyl acetate, washed with 20 ml of distilled water, dried over Na 2 SO 4 and evaporated to dryness.
- the white solid obtained was washed with twice 25 ml of pentane and dried under vacuum. An additional amount of compound (12) (0.25 g, 0.66 mmol) was thus obtained. The total yield was 95%.
- N-Maleoyl-L-Glycine (14) 0.5 g of glycine (6.7 mmol) was dissolved in aqueous NaHCO 3 (2.8 g in 32 ml) and the solution was then cooled to room temperature. 0 ° C (NaCl / ice bath).
- the TFA was then evaporated and the product was precipitated with ether, washed with ether and lyophilized.
- the crude TFA salt of precursor (CI) was purified by reversed-phase flash chromatography on a grafted silica column Ci 8 (20 g, elution with an aqueous solution of 0.1% TFA). Fractions containing the product were lyophilized to give 91 mg (0.22 mmol, 27% yield) of the expected precursor (Cl) as a white solid.
- the trifunctional compound (1-1) was synthesized in 5 steps from the precursors (AI), (BI) and (CI) prepared above in the previous steps.
- the synthesis protocol of the compound (1-1) is summarized (the three main steps only) in the following scheme 2:
- the coupling between the precursors (BI) and (CI) was carried out after pre-activation of the precursor (BI) in the form of hydroxysuccinimide ester according to the method described for example in the article by Knorr, R. et al. Tetrahedron Lett., 1989, 30, 1927-1930.
- the activated ester was then reacted with the precursor (CI) to yield a coupling product (16) which was isolated by silica gel chromatography in 32% yield.
- treatment with TFA made it possible to eliminate the Boc group and thus obtain the precursor (BlC-1).
- the final coupling between the precursor (AI) and the precursor (BlC-1) was carried out using the BOP as a coupling reagent.
- the expected product in still protected form, was purified by chromatography on silica gel. After deprotection, by treatment with trifluoroacetic acid, the N-terminus was converted to activated carbamate by treatment with TV, 4'-disuccinimidyl carbonate (DSC) in anhydrous DMF in the presence of triethylamine. Total conversion of the pseudo-peptide to the compound of formula (I-1) was observed after 30 minutes.
- the compound of formula (1-1) expected was then purified by flash reverse phase chromatography on a grafted silica column Ci 8 .
- 0.2 g (0.36 mmol) of the precursor (BI) obtained above in step 2) d) were dissolved in 2 ml of anhydrous acetonitrile. 67.4 ⁇ l (0.38 mmol) of DIEA and 1.16 mg (0.38 mmol) of O- (N-succinimidyl) -N, N, N ', N'-tetramethyl-uronium tetrafluoroborate were then added. (TSTU) and the reaction mixture was stirred at room temperature for 45 minutes under an argon atmosphere. The conversion of the precursor (BI) to its N-hydroxysuccinimide ester was monitored by TLC (CH 2 Cl 2 / MeOH, 85:15, v / v).
- Example 1 a convergent synthesis strategy, as in Example 1) of separately preparing the precursors (A), (B) and (C) and to assemble them.
- precursor (A) the precursor (AI) synthesized in Example 1) above was used.
- precursor (B) a precursor of formula (BI) was synthesized in a substantially different route and improved with respect to that used for the synthesis of the precursor (BI) of Example 1).
- the synthesis of the precursor (C-2) was carried out from the commercial Boc-Cys (SEt) -OH. 1) Synthesis of the Precursor (BI): ⁇ -Frn-butyloxyearbonyl-1-fluorenylmethyloxycarboxyl-aminooxy-acetyl-L-lysine
- the precursor (B-I) was synthesized from the protected N-Fmoc derivative of the aminooxyacetic acid (8) previously prepared as in Example 1), step 2) a).
- the precursor (C-2) was synthesized in two steps from 7V- (tert-butyloxycarbonyl) -S- (S-ethyl) -cysteine (19) according to scheme 3 below:
- the carboxylic acid function of the compound (19) is converted into carboxamide (20) by reaction of the ammonia with the mixed anhydride intermediately formed according to the method described for example by Hofmann, K. and al, J. Am. Chem. Soc., 1978, 100, 3585-3590.
- the N-terminus of the compound (20) is deprotected by treatment with trifluoroacetic acid to yield the precursor (C-2).
- the compound (20) obtained above in the preceding step was slowly dissolved in 14 ml of a mixture of TFA / H 2 O (95: 5 v / v) with stirring at a temperature of between 0 ° C. and room temperature for 1 hour.
- the reaction was checked by TLC (CH 2 Cl 2 / MeOH 90:10 v / v) and the reaction mixture was evaporated to dryness. A minimum amount of osmosis water was then added and the resulting aqueous solution was lyophilized to yield the precursor (C-2) as a yellowish powder with a yield of 89%.
- the reagent (1-2) was synthesized in three steps from the precursors (A-I), (B-I) and (C-2) previously synthesized according to scheme 4 below:
- the coupling between the precursors (BI) and (C-2) was carried out after pre-activation of the precursor (BI) in the form of hydroxybenzotriazole ester according to the method described for example in the article by Konig, W. and al, Chem. Ber., 1970, 103, 788-798.
- the activated ester was then reacted with the precursor (CI) to yield a coupling product (21).
- a base DIEA
- the intermediate (BlC-2) was purified by chromatography on silica gel with a yield of 61%.
- the expected compound (22) was purified by HPLC-PI (System C, i.e. using a Varian column Kromasil ® Ci 8 to 10 microns and of dimensions 21.2 x 250 mm eluting with a mixture of acetonitrile and water osmosis by passing 90% of RO water for 5 minutes, then a linear gradient ranging from 10 to 40% of CH 3 CN in 15 minutes, then from 40% to 70% of CH 3 CN, with a flow rate of 20.0 ml / min, a dual UV detection was made at 254 and 305 nm) .
- HPLC-PI System C, i.e. using a Varian column Kromasil ® Ci 8 to 10 microns and of dimensions 21.2 x 250 mm eluting with a mixture of acetonitrile and water osmosis by passing 90% of RO water for 5 minutes, then a linear gradient ranging from 10 to 40% of CH 3 CN in 15 minutes, then from 40% to 70% of CH 3 CN, with
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Abstract
La présente Invention est relative à un réactif trifonctionnel pseudopeptidique, à ses diverses utilisations, notamment pour la préparation de réactifs luminescents ou de bioconjugués éventuellement luminescents, à l'utilisation de ces réactifs et bioconjugués pour la fonctionnalisation de supports solides, ainsi qu'à l'utilisation des supports solides ainsi fonctionnalisés pour la détection de molécules d'intérêt.
Description
RÉACTIF PSEUDO PEPTIDIQUE TRIFONCTIONNEL, SES UTILISATIONS
ET APPLICATIONS
La présente Invention est relative à un réactif trifonctionnel pseudopeptidique, à ses diverses utilisations, notamment pour la préparation de réactifs luminescents ou de bioconjugués éventuellement luminescents, à l'utilisation de ces réactifs et bioconjugués pour la fonctionnalisation de supports solides, ainsi qu'à l'utilisation des supports solides ainsi fonctionnalisés pour la détection de molécules d'intérêt.
De nombreuses applications mettant en jeu des bioconjugués dérivés de biopolymères (acides nucléiques, protéines, polysaccharides, ...) impliquent de pouvoir fixer de façon covalente (fixation réversible ou non) ces bioconjugués à une seconde architecture moléculaire (biopolymère, support solide, ...) et de les détecter et/ou les quantifier avec précision (détection optique, radioactive, ...). Ainsi, il est indispensable de disposer d'outils permettant d'associer efficacement un biopolymère à d'autres (macro)molécules sans trop altérer les propriétés de chacun des partenaires impliqués dans l'architecture moléculaire résultante et ciblée.
Dans ce but, de nombreuses petites molécules bifonctionnelles (plus connues sous l'expression anglaise de "bifunctional cross-linking reagents") ont été développées. Un grand nombre est commercialisé par la société Pierce. Cependant, il est intéressant de noter que plusieurs groupes académiques continuent de travailler au développement de nouveaux réactifs bifonctionnels toujours plus sophistiqués et permettant l'élaboration de bioconjugués toujours plus complexes.
Comme mentionné précédemment, il est parfois indispensable de disposer non pas de deux mais de trois fonctions orthogonales (i.e., chaque fonction est capable de réagir sélectivement avec un partenaire ciblé). Ainsi, le développement de réactifs trifonctionnels s'impose.
C'est ainsi qu'il a déjà été décrit, par exemple dans les articles de Alley, S. C. et al, J. Am. Chem. Soc, 2000, 122, 6126-6127 et de Sinz, A. et al, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2005, 16, 1921-1931, l'utilisation de différents types de réactifs trifonctionnels parmi lesquels figure notamment le sulfo-SBED disponible auprès de la société Pierce (Rockford, IL, USA), c'est-à-dire le sulfosuccinimidyl-2- [6(biotinamido)-2-(p-azidobenzimidazo)-hexanoamido]éthyl- 1 ,3 '-dithiopropionate,
pour l'étude des interactions protéines/protéines. Ce réactif trifonctionnel est composé d'une aminé réactive et d'un site photoréactif. Le sulfo-SBED possède la structure suivante :
Site photoréactif Cependant, le sulfo-SBED ne donne pas entièrement satisfaction dans la mesure où il n'est pas possible d'en moduler le caractère hydrophobe/hydrophile et surtout le troisième motif fonctionnel (i.e. la biotine) permet uniquement une interaction forte (quasi-covalente) avec des partenaires préalablement conjugués à l'avidine (glycoprotéine) ou la streptavidine, ce qui en limite fortement l'utilisation.
Il a également déjà été décrit, notamment dans la demande internationale WO 00/02050, des réactifs trifonctionnels permettant de préparer des bioconjugués constitués d'un motif central trifonctionnel choisi parmi le triaminobenzène, le tricarboxybenzène, la dicarboxyaniline et l'acide diaminobenzoïque, sur lequel sont rattachées, par l'intermédiaire de trois bras de liaisons distincts, un ligand d'affinité, un groupement réactif vis-à-vis d'une biomolécule et un agent effecteur. Ce réactif présente cependant l'inconvénient de posséder un motif central trifonctionnel constitué d'au moins deux fonctions chimiques identiques (i.e., fonctions acide carboxylique ou aminé) ce qui restreint le choix des fonctions complémentaires portées par les bras de liaison ce qui peut avoir un effet limitant.
Dans d'autres applications, notamment pour la détection d'analytes par immunofluorescence en phase hétérogène, il a déjà été proposé d'utiliser des réactifs trifonctionnels (tripodes) comportant trois pôles fonctionnels distincts, à savoir un groupement luminescent (L), une molécule (B) choisie parmi l'analyte à détecter, un analogue ou un fragment de celui-ci et enfin une fonction assurant la fixation dudit réactif trifonctionnel sur la surface d'un support solide (voir notamment
la demande de brevet français publiée sous le n° FR 2 847 984 et l'article correspondant de Volland, H. et al, Anal. Chem., 2005, 77, 1986-1904). Ces réactifs ne sont cependant pas utilisables dans tout type d'application.
Le développement des nouvelles technologies toujours plus pointues nécessite la création et l'utilisation de bioconjugués toujours plus sophistiqués qu'il n'est pas facile (voir impossible) d'atteindre avec les réactifs bi fonctionnel s ou trifonctionnels actuellement disponibles sur le marché.
C'est donc afin de remédier à l'ensemble de ces inconvénients et de pourvoir en particulier à une nouvelle famille de réactifs trifonctionnels dans lesquels il est possible de faire varier de façon très large la nature de chaque fonction pour pouvoir associer efficacement un biopolymère à d'autres (macro)molécules sans altérer trop les propriétés de chacun des partenaires impliqués dans l'architecture moléculaire résultante et ciblée, que les Inventeurs ont mis au point ce qui fait l'objet de la présente Invention. De façon plus précise, les Inventeurs se sont donnés pour but de pourvoir à un réactif trifonctionnel permettant de lier de façon covalente (fixation réversible ou non) un bioconjugué à une seconde architecture moléculaire telle qu'un biopolymère ou un support solide.
La présente Invention a donc pour premier objet un réactif trifonctionnel pseudopeptidique, caractérisé par le fait qu'il comprend au moins les trois unités structurales réactives A, B et C suivantes :
(a) une unité A constituée d'une chaîne hydrophile de pseudo- poly(éthylène glycol) (chaîne pseudo-PEG) interrompue par au moins une fonction amide et possédant deux extrémités El et E2, ladite extrémité El étant libre et comportant un motif terminal choisi parmi le groupement amino (-NH2), les carbamates activés et les esters activés, et ladite extrémité E2 comportant un atome de carbone terminal porteur d'une fonction carbonyle, ledit atome de carbone étant engagé dans une fonction amide (-C(O)-NH-) formée avec l'atome d'azote d'une fonction α-amine portée par l'unité B ;
(b) une unité B constituée d'un acide aminé choisi parmi les acides α-aminés de la série L, D et leurs mélanges racémiques, ledit acide aminé possédant sur sa chaîne latérale au moins une fonction oxyamine protégée par un groupement protecteur ou au moins une fonction aldéhydique masquée ; et
(c) une unité C constituée d'un acide aminé choisi parmi les acides α-aminés de la série L, D et leurs mélanges racémiques, ledit acide aminé possédant sur sa chaîne latérale au moins un motif thiol, maléimide, iodoacétyle, azoture, alcyne vrai, phosphane ou cyclooctyne ; lesdites unités B et C étant liées entre elles par l'intermédiaire d'une fonction amide formée entre l'atome de carbone porteur de la fonction carbonyle de l'acide α-aminé constituant l'unité B et l'atome d'azote de la fonction α-amine de l'acide α-aminé constituant l'unité C.
L'originalité principale de ces structures réside dans l'association d'acides aminés (naturels ou modifiés) protégés sur leurs chaînes latérales par des groupes protecteurs sélectionnés, et d'une chaîne pseudo-PEG fonctionnalisée dont la longueur est facilement modulable. Même si la présence de plusieurs fonctions chimiques (protégées ou non) entraîne nécessairement des problèmes lors de la préparation de ces réactifs (incompatibilités entre fonctions, dégradation et/ou déprotection prématurée de certains groupes protecteurs, ...), la structure segmentée en trois unités structurales distinctes (préparées indépendamment les unes des autres puis couplées entre elles lors des étapes finales d'élaboration du réactif trifonctionnel) permet une stratégie de synthèse hautement convergente qui limite au maximum la présence simultanée de motifs chimiques incompatibles entre eux. Par ailleurs, une grande diversité structurale (modulation de la géométrie, de la longueur, des propriétés de physicochimiques et la solubilité en particulier, ...) est accessible en modifiant uniquement l'une des trois unités structurale du réactif trifonctionnel.
Selon l'Invention, on entend par chaîne "pseudo"-PEG, une chaîne ayant de grandes similitudes de structure avec la chaîne PEG :
mais qui diffère par la présence de un ou plusieurs groupements fonctionnels (ester, amide, carbamate, urée, ...) en son sein.
Selon l'Invention, on entend par alcyne "vrai", un alcyne dont la triple liaison est monosubstituée par un groupement R : R ^ H Les trois unités structurales réactives constituants les réactifs trifonctionnels conformes à la présente Invention permettent de réaliser des réactions
totalement chimio sélectives dans des conditions douces (en particulier dans les milieux aqueux dans lesquels sont solubles les biopolymères).
Le motif carbamate activé ou ester activé pouvant être présent à l'extrémité El libre de la chaîne pseudo-PEG constituant l'unité A est réactif vis-à-vis des composés possédant un motif réactif complémentaire tel qu'une fonction aminé (généralement une aminé primaire aliphatique). Par ailleurs, la fonction aminé primaire pouvant alternativement être présente à l'extrémité El libre de la chaîne pseudo-PEG constituant l'unité A est réactive vis-à-vis des composés possédant un motif complémentaire tel qu'un carbamate ou un ester activé. Cette extrémité El permet notamment la fixation de macromolécules biologiques qui comportent, naturellement ou non, lesdites fonctions réactives complémentaires (anticorps, acides nucléiques ou analogues, polysaccharides, protéines, peptides, radionucléides, toxines, inhibiteurs d'enzymes, haptènes, ...etc.).
Le groupement de l'unité B, après activation éventuelle, c'est-à-dire après déprotection dans le cas de la fonction oxyamine ou après démasquage dans le cas de la fonction aldéhydique, dans des conditions douces compatibles avec la stabilité des différents partenaires impliqués, est réactif vis-à-vis des composés ou des matériaux possédant un ou plusieurs groupements carbonylés (aldéhyde, ...) ou alternativement aminés. Parmi de tels composés, on peut notamment citer les macromolécules telles qu'anticorps, acides nucléiques ou analogues, liposomes, polysaccharides, protéines, peptides, principes actifs, radionucléides, toxines, fluorophores, inhibiteurs d'enzymes, haptènes, ...etc.
Le motif thiol défini comme substituant latéral possible de l'acide α- aminé constituant l'unité C, est réactif vis-à-vis des composés ou des matériaux comportant un motif maléimide ou iodoacétyle. Les motifs maléimide et iodoacétyle, définis comme substituants latéraux possibles de l'acide α-aminé constituant l'unité C, sont réactifs vis-à-vis des composés ou des matériaux possédant une fonction thiol ou une cystéine après leur déprotection éventuelle. Enfin, le motif azoture défini comme substituant latéral possible de l'acide α-aminé constituant l'unité C est réactif vis-à-vis des composés ou des matériaux possédant un motif alcyne vrai, phosphane ou cyclooctyne et alternativement les motifs alcyne vrai, phosphane ou cyclooctyne définis comme substituants latéraux possibles de l'acide α-aminé constituant l'unité C
sont réactifs vis-à-vis des composés ou des matériaux possédant un motif azoture. Ce site réactionnel peut notamment être utilisé pour la fixation d'un groupement fluorophore porteur d'une fonction complémentaire réactive vis-à-vis des motifs thiol, maléimide iodoacétyle, azoture, alcyne vrai, phosphane ou cyclooctyne présents sur l'unité C.
Selon une forme de réalisation particulière de la présente Invention, la chaîne pseudo-PEG de l'unité A est choisie parmi les chaînes de formule (A-I) suivante :
- Ri représente une aminé primaire, un motif carbamate activé ou un motif ester activé,
- m et n, identiques ou différents, sont des nombres entiers compris entre 2 et 10 inclusivement,
- p est un nombre entier compris entre 1 et 10 inclusivement,
- la flèche représente la liaison covalente reliant la fonction amide de l'extrémité E2 de la chaîne pseudo-PEG à l'unité B ou C.
Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention, la chaîne pseudo-PEG est choisie parmi les chaînes pseudo-PEG de formule (A-I) ci-dessus dans lesquelles m = n = 2 et p = 1.
Parmi les groupements carbamates activés pouvant être présents à l'extrémité El de la chaîne pseudo-PEG de l'unité A, on peut en particulier citer le carbamate de N-hydroxysuccinimidyle, le carbamate de sulfo N-hydroxysuccinimidyle, le carbamate de N-hydroxyphtalimidyle, le carbamate de N-hydroxypipéridinyle, le carbamate de />-nitrophényle et le carbamate de pentafluorophényle ; le carbamate de N-hydroxysuccinimidyle étant tout particulièrement préféré.
Parmi les groupements esters activés pouvant être présents à l'extrémité El de la chaîne pseudo-PEG de l'unité A, on peut en particulier citer l'ester de N-hydroxysuccinimidyle, l'ester de sulfo N-hydroxysuccinimidyle, l'ester de cyanométhyle, l'ester de N-hydroxyphtalimidyle, l'ester de N-hydroxypipéridinyle, l'ester de p-nitrophényle, l'ester de pentafluorophényle, les esters de benzotriazole, les esters d'hydroxybenzotriazole et les esters d'hydroxyazabenzotriazole ; l'ester de N-hydroxysuccinimidyle étant particulièrement préféré.
Parmi les acides α-aminés utilisables pour l'unité B, on peut notamment citer la lysine, l'homolysine, l'ornithine, l'acide 2,4-diaminobutanoïque (DABA) et l'acide 2,3-diaminopropanoïque.
Parmi de tels acides α-aminés, la lysine est particulièrement préférée.
Parmi les acides α-aminés utilisables pour l'unité C, on peut notamment citer la lysine, la cystéine, l'homolysine, l'ornithine, l'acide 2,4-diaminobutanoïque (DABA), l'acide 2,3-diaminopropanoïque, l'acide aminomercapto-acétique, Thomocystéine, la 5-mercapto-norvaline, la 6-mercapto- norleucine, l'acide 2-amino-7-mercapto-heptanoïque, et l'acide 2-amino-8-mercapto- octanoïque.
Parmi de tels acides aminés, la lysine et la cystéine sont particulièrement préférées.
Les groupements protecteurs de la fonction oxyamine de la chaîne latérale de l'acide α-aminé constituant l'unité B, sont de préférence choisis parmi les groupements protecteurs labiles en conditions douces tels que le 9-fluorénylméthoxycarbonyle (Fmoc), le benzyloxycarbonyle (Z), l'allyloxycarbonyle (Alloc), le trichloroéthoxycarbonyle (Troc), le triméthylsilyléthoxycarbonyle (Teoc), le pyridyldithioéthoxycarbonyle (Pydec), le 2-(2-nitrophényl)-propyloxycarbonyle (ΝPPOC), l'azométhyloxycarbonyle (Azoc), le 2-(triméthylsilyl)éthanesulfonyle (Ses) et le phtalimide.
Parmi de tels groupements protecteurs, les groupements Fmoc et phtalimide sont particulièrement préférés.
Au sens de la présente Invention, on entend par "fonction aldéhydique masquée", toute fonction aldéhyde ou cétone incluse dans une molécule
organique choisie parmi la serine ou n'importe qu'elle molécule organique contenant le motif 1,2-diol (-CH(OH)-CH(OH)-), 1 ,2-amino-alcool ou 1,2-hydroxythiol. Parmi de telles molécules organiques, on peut notamment citer l'acide tartrique, l'acide glycérique, l'acide 2,3-dihydroxypropanoïque, l'acide 3,4-dihydroxybutanoïque, l'acide 4,5-dihydroxypentanoïque et l'acide 3-amino-2-hydroxypropanoïque.
Au sens de la présente Invention, on entend par "conditions douces", l'utilisation de réactifs de déprotection de la fonction oxyamine ou de démasquage de la fonction aldéhydique fonctionnant à température ambiante et à pH neutre ou dans une gamme de pH comprise entre environ 5 et 9 inclusivement.
A titre de réactif de déprotection ou de démasquage, on peut notamment citer l'acide périodique (HIO4), les métaperiodates tels que le métaperiodate de sodium (NaIO4) et le métaperiodate de potassium (KIO4), ainsi que les periodates de tétraalkylammonium.
Parmi les réactifs trifonctionnels conformes à l'Invention, on peut tout particulièrement citer ceux qui sont choisis parmi les composés de formule (I) suivante :
(I) dans laquelle :
- Ri, m, n et p ont les mêmes significations que celles indiquées ci- dessus pour l'unité de formule (A-I),
- Xi et X2, identiques ou différents et conjointement avec l'atome de carbone auxquels ils sont liés, représentent la chaîne hydrocarbonée d'un acide α-aminé,
Proc est un groupement protecteur choisi parmi le 9-fluorénylméthoxycarbonyle (Fmoc), le benzyloxycarbonyle (Z), l'allyloxycarbonyle (Alloc), le trichloroéthoxycarbonyle (Troc), le triméthylsilyléthoxycarbonyle (Teoc), le pyridyldithioéthoxycarbonyle (Pydec), le 2-(2-nitrophényl)-propyloxycarbonyle
(NPPOC), l'azométhyloxycarbonyle (Azoc), le 2-(triméthylsilyl)éthanesulfonyle (Ses) et le phtalimide;
- Fonc est un motif thiol, maléimide, iodoacétyle, azoture, alcyne vrai, phosphane ou cyclooctyne.
Selon une forme de réalisation particulièrement préférée de l'Invention Xi est une chaîne n-butyle.
Selon une autre forme de réalisation particulièrement préférée de l'Invention, X2 est une chaîne éthyle ou n-butyle.
Selon une forme de réalisation particulièrement préférée de l'Invention, les composés de formule (I) ci-dessus sont choisis parmi les composés de formules (I- 1) à (1-6) suivantes :
(M)
(1-2)
(1-5)
(1-6).
Les réactifs trifonctionnels conformes à l'Invention peuvent être préparés selon des méthodes de synthèse convergentes selon lesquelles chacune des unités A, B et C est préparée individuellement, celles-ci étant ensuite assemblées pour
conduire au réactif trifonctionnel attendu. Ces méthodes de synthèse convergentes mettent en œuvre des réactions classiques bien connues de l'homme du métier et dont le détail est donné dans les exemples de synthèse illustrant la présente demande.
Grâce à leur trifonctionnalité, les réactifs conformes à la présente Invention et tels que décrits ci-dessus peuvent avoir de multiples utilisations et applications.
Les réactifs trifonctionnels conformes à la présente Invention peuvent en premier lieu être utilisés pour la préparation de bioconjugués.
Un autre objet de la présente Invention est donc l'utilisation d'au moins un réactif trifonctionnel tel que défini précédemment pour la préparation d'un bioconjugué.
Au sens de la présente Invention, on entend par bioconjugué, tout réactif trifonctionnel tel que décrit précédemment sur lequel est fixée au moins une molécule biologique d'intérêt. La fixation de la ou des molécules d'intérêt peut être effectuée au niveau de la fonction aminé primaire ou du motif carbamate activé ou ester activé présent à l'extrémité libre de la chaîne pseudo-PEG constituant l'unité A qui est réactif vis-à-vis des molécules biologiques possédant une fonction acide (ou carbamate) ou une fonction aminé réactive (généralement une aminé primaire aliphatique). La fixation de la molécule biologique d'intérêt peut également être effectuée au niveau de l'unité B, après déprotection de la fonction oxyamine ou démasquage de la fonction aldéhydique, qui deviennent alors réactives vis-à-vis des molécules biologiques possédant un ou plusieurs groupements carbonylés (aldéhyde, ...) respectivement oxyaminés. II est ainsi possible de fixer une ou deux molécules biologiques, identiques ou différentes, par réactif trifonctionnel conforme à la présente Invention.
Parmi les molécules biologiques pouvant être fixées sur les réactifs trifonctionnels conformes à la présente Invention, on peut notamment citer les anticorps, les molécules d'acides nucléiques et leurs analogues, les polysaccharides, les protéines, les peptides, les radionucléides, les toxines, les inhibiteurs d'enzymes, les haptènes, ...etc.
Un autre objet de l'Invention est donc un bioconjugué caractérisé par le fait qu'il consiste en un réactif trifonctionnel tel que défini précédemment dans lequel le motif aminé primaire, carbamate activé ou ester activé présent à l'extrémité libre de la chaîne pseudo-PEG constituant l'unité A et/ou la fonction oxyamine ou aldéhydique portée par l'unité B après sa déprotection, respectivement son démasquage, est(sont) fonctionnalisé(s) par une molécule biologique d'intérêt.
Selon l'Invention, on peut donc avoir les trois types de bioconjugués suivants : i) un bioconjugué constitué par un réactif trifonctionnel dans lequel seule la fonction aminé ou seul le motif carbamate activé ou ester activé présent à l'extrémité libre de la chaîne pseudo-PEG constituant l'unité A est fonctionnalisé par une molécule biologique, ii) un bioconjugué constitué par un réactif trifonctionnel dans lequel seule la fonction oxyamine déprotégée ou aldéhydique démasquée de l'unité B est fonctionnalisée par une molécule biologique, et iii) un bioconjugué comportant deux molécules biologiques, constitué par un réactif trifonctionnel dans lequel la fonction aminé primaire ou le motif carbamate activé ou ester activé présent à l'extrémité libre de la chaîne pseudo- PEG constituant l'unité A et la fonction oxyamine déprotégée ou aldéhydique démasquée de l'unité B sont chacun fonctionnalisés par une molécule biologique ; dans ce dernier cas le bioconjugué comporte deux molécules biologiques qui peuvent être identiques ou différentes l'une de l'autre. Il peut en particulier s'agir de deux molécules biologiques identiques mais modifiées par deux marqueurs différents.
La préparation de ces bioconjugués peut être faite de façon classique en faisant réagir un réactif trifonctionnel conforme à l'Invention avec la ou les molécules biologiques d'intérêt à fixer, tout en utilisant les méthodes bien connues de l'état technique pour faire réagir par exemple :
- un carbamate activé ou ester activé avec une fonction aminé (Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, 1996, Académie Press, Inc.) ou - une fonction oxyamine avec un groupement carbonylé (Sing, Y. et al, Org. Biomol. Chem., 2006, 4, 1413-1419 ou Zatsepin, T. S. et al, Bioconjugate Chem., 2005, 16, 471-489.
Les réactifs tri fonctionnel s conformes à la présente Invention peuvent également être utilisés pour la préparation de réactifs luminescents, en particulier fluorescents.
Un autre objet de la présente Invention est donc l'utilisation d'au moins un réactif trifonctionnel tel que défini précédemment, pour la préparation d'un réactif luminescent, en particulier de réactifs fluorescents.
Dans ce cas, le greffage d'un groupement luminescent (L) peut être effectué : i) en faisant réagir le motif thiol, maléimide, iodoacétyle, azoture, alcyne vrai, phosphane ou cyclooctyne porté par l'unité C avec une fonction complémentaire maléimide, iodoacétyle (si l'unité C comporte une fonction thiol), thiol (si l'unité C comporte un motif maléimide ou iodoacétyle) ou alcyne vrai, phosphane ou cyclooctyne (si l'unité C comporte une fonction azoture), ou bien encore azoture (si l'unité C comporte une fonction alcyne vrai, phosphane ou cyclooctyne), ladite fonction complémentaire étant portée, naturellement ou non, par ledit groupement luminescent, et/ou ii) en faisant réagir la fonction oxyamine déprotégée ou aldéhydique démasquée de l'unité B avec un groupement luminescent porteur d'une fonction carbonylée telle qu'une fonction aldéhyde ou cétone ou respectivement avec une fonction oxyamine.
Dans ces deux cas, il peut être éventuellement nécessaire de fonctionnaliser préalablement le groupement luminescent à faire réagir par un motif complémentaire de la fonction avec laquelle on veut le faire réagir. La préparation de ces réactifs luminescents peut être faite de façon classique selon les réactions connues de l'homme de l'art.
Il est ainsi possible d'obtenir des réactifs luminescents comportant : i) un seul groupement luminescent fixé sur l'unité B par l'intermédiaire de la fonction oxyamine déprotégée ou de la fonction aldéhydique démasquée ou sur l'unité C par l'intermédiaire de la fonction thiol ou des motifs maléimide, iodoacétyle, alcyne vrai, phosphane, cyclooctyne ou bien encore azoture;
ii) deux groupements luminescents, l'un étant fixé sur l'unité B par l'intermédiaire de la fonction oxyamine déprotégée ou de la fonction aldéhydique démasquée et l'autre étant fixé sur l'unité C par l'intermédiaire de la fonction thiol ou des motifs maléimide, iodoacétyle, alcyne vrai, phosphane, cyclooctyne ou bien encore azoture.
Ces réactifs trifonctionnels luminescents constituent un autre objet de l'Invention.
La nature du ou des groupements luminescents utilisables selon l'Invention n'est pas critique à partir du moment où ils comportent naturellement, ou qu'ils sont fonctionnalisables par, une fonction thiol ou carbonylée, ou bien par un motif maléimide, iodoacétyle, alcyne vrai, phosphane, cyclooctyne ou bien encore azoture.
Selon l'Invention, on entend par groupement luminescent toute substance qui, quand elle est excitée à une longueur d'onde donnée ou par un composé chimique donné, est capable d'émettre un photon, par exemple fluorophore ou terre rare.
Parmi les groupements luminescents (dont fluorophores) utilisables selon l'Invention, on peut en particulier citer les fluorophores à chaînes polyméthine (i.e. chaîne polyénique) ; les cyanines fluorescentes telles que celles commercialisées sous les références Cy3, Cy3.5, Cy3B, Cy5, Cy5.5 et Cy7 par la société GE Healthcare ; la fluorescéine (fluorescéinate de sodium) et ses dérivés tels que l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et la 6-carboxyfiuorescéine (6-Fam) ; la rhodamine et ses dérivés tels que la tetraméthyl rhodamine isothiocyanate (TRITC) ; les dérivés hydrosolubles de la rhodamine sous forme d'ester de N- hydroxysuccinimide tels que les produits vendus sous la dénomination commerciale Alexa Fluor ® par la société Invitrogen comme par exemple les Alexa Fluor ® 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610-X, 633, 647, 660, 680, 700, 750 et 790 ; les rhodols et leurs dérivés ; les dérivés de coumarine tels que la 7-amino-coumarine ; la 9-aminoacridine et l'acide 9-acridinecarboxylique ; les colorants fluorescents à aminés réactives tels que l'ester succinimidylique de l'acide 6-((7-amino-4-méthylcoumarin-3- acétyl)amino) hexanoïque (AMCA) ; les difluorures de bore de dipyrrométhène vendus sous les dénominations commerciales BODIPY ® tels que BODIPY® FR-Br2,
BODIPY ® R6G, BODIPY® TMR, BODIPY ® TR et les BODIPY ® 530/550 (longueur d'onde d'excitation/longueur d'onde d'émission, en nm), 558/567, 564/570, 576/589, 581/591, 630/650 et 650/665 vendus par la société Bio-Rad Inc. (USA) ; les fluorophores dérivés du pyrène tels que par exemple les colorants Cascade Blue (vendus par exemple par les sociétés Trilink BioTechnologies (USA) ou Invitrogen ; les dérivés diazoïques tels que le DABCYL® ; les dérivés du danzyle tels que l'EDANS® (Eurogentec, BE) ; l'éosine ; l'érythrosine et les dérivés de sulforhodamine tels que le chlorure/sulfonyl de sulforhodamine 101 également connu sous le nom de Texas Red. Les réactifs trifonctionnels conformes à la présente Invention peuvent également être utilisés pour la préparation de réactifs luminescents, en particulier fluorescents comportant également un "composé accepteur" (Q) de la luminescence du groupement luminescent. Dans ce cas, de tels réactifs constituent ce qu'il est convenu d'appeler une cassette de transfert d'énergie (ou cassette FRET) utilisables notamment pour le séquençage de l'ADN.
Un autre objet de la présente Invention est donc l'utilisation d'au moins un réactif trifonctionnel tel que défini précédemment pour la préparation d'une cassette de transfert d'énergie.
Dans ce cas, le greffage du groupement luminescent sera effectué sur la fonction oxyamine déprotégée ou aldéhydique démasquée de l'unité B ou bien via la fonction thiol ou les motifs maléimide, iodoacétyle, alcyne vrai, phosphane, cyclooctyne ou bien encore azoture de l'unité C, et le greffage du composé accepteur (Q) sera respectivement effectué via la fonction thiol ou les motifs maléimide, iodoacétyle, alcyne vrai, phosphane, cyclooctyne ou bien encore azoture de l'unité C ou bien sur la fonction oxyamine déprotégée ou aldéhydique démasquée de l'unité B.
L'Invention a donc également pour objet une cassette de transfert d'énergie, caractérisée par le fait qu'elle est constituée d'un réactif trifonctionnel tel que défini précédemment, ledit réactif comportant un groupement luminescent (L) et un composé accepteur (Q) de la luminescence du groupement luminescent, L et Q étant respectivement et indifféremment fixés sur ledit réactif trifonctionnel via la fonction oxyamine déprotégée ou aldéhydique démasquée de l'unité B et la fonction
thiol ou les motifs maléimide, iodoacétyle, alcyne vrai, phosphane, cyclooctyne ou bien encore azoture de l'unité C.
Dans ces deux cas, il peut être éventuellement nécessaire de fonctionnaliser préalablement le composé accepteur (Q) à faire réagir par un motif complémentaire de la fonction avec laquelle on veut le faire réagir.
Le groupement luminescent (L) utilisable dans ces cassettes de transfert d'énergie peut notamment être choisis parmi les groupements luminescents (L) cités précédemment et utilisables pour la préparation des réactifs trifonctionnels luminescents conformes à la présente Invention. Selon l'Invention, on entend par "composé accepteur" (Q), toute molécule permettant la diminution ou la disparition de la luminescence du groupement luminescent (L) dans certaines conditions. Ce composé, de natures diverses, peut notamment être un composé chimique (luminescent ou non et tel que par exemple les protéines fluorescentes), un atome lourd ou une nanoparticule. Parmi de tels composés accepteurs (Q), on peut en particulier citer les composés fluorescents tels que ceux cités ci-dessus pour les groupements L, en particulier la rhodamine et ses dérivés tels que la tetraméthyl rhodamine (TMR), la Rhodamine 6G (R6G) et les colorants QSY ® 7, QSY ® 9 et QSY ® 21 (Molecular Probes) ; mais également des molécules non-fluorescentes de la famille des colorants azoïques telles que les composés vendus sous les dénominations commerciales Black HoIe Quencher ® (BHQ) comme par exemple les BHQ-O, BHQ-I, BHQ-2 et BHQ-3 (Biosearch Technologies) ; les particules d'or telles que celles ayant un diamètre de 1,5 nm vendues sous la dénomination commerciale Nanogold Particules ® (Nanoprobes) ; les colorants diazoïques tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Eclipse Dark Quencher ® (Epoch Bioscience) ou QSY ® 35 (Molecular Probes) ; le produit commercial ElleQuencher ® (Eurogentec) ; le vert de malachite et les composés accepteurs ("Quenchers") de la famille des cyanines tels que le composés vendus sous les dénominations commerciales Cy5Q ou Cy7Q par la société GE Healthcare. Selon une forme de réalisation particulièrement avantageuse de ces cassettes de transfert d'énergie, le groupement luminescent (L) et le composé accepteur (Q) sont choisis parmi les couples suivants (L/Q) : Cy3/Cy5, Cy5/Cy7,
Cy5/Alexa Fluor® 750, Cy3/Cy5Q, Cy3/QSY® 7, Cy3/QSY® 9, Cy5/Cy7Q, Cy5/QSY® 21, Cy5/Cy5, Cy5.5/Cy5.5, Cy7/Cy7, R6)/Cy5, R6G/Alexa Fluor® 647, R6G/QSY® 21, Alexa Fluor® 532/Cy5, Alexa Fluor® 532/Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 532/QSY® 21, Alexa Fluor® 555/Cy5, Alexa Fluor® 555/Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 555/QSY® 21.
Selon une autre forme de réalisation particulière de l'Invention, les réactifs trifonctionnels peuvent être utilisés pour la préparation de bioconjugués mixtes comportant au moins une molécule biologique et au moins un groupement luminescent. La présente Invention a donc également pour objet un bioconjugué mixte, caractérisé par le fait qu'il consiste en un réactif trifonctionnel tel que défini précédemment sur lequel sont fixés au moins une molécule biologique et au moins un groupement luminescent. En outre, ces bioconjugués mixtes peuvent également comporter un composé accepteur (Q) de la luminescence du groupement luminescent (L).
Ces bioconjugués mixtes sont donc choisis parmi les réactifs trifonctionnels sur lesquels sont fixés : i) une ou deux molécules biologiques d'intérêt et un groupement luminescent ; ou ii) une molécule biologique d'intérêt, et deux groupements luminescents ; iii) une molécule biologique d'intérêt, un groupement luminescent, et un composé accepteur (Q) de la luminescence du groupement luminescent ; lesdites molécules biologiques et lesdits groupements luminescents et composé accepteurs (Q) étant fixés sur le réactif fonctionnel au niveau des extrémités terminales des unités A, B et C comme décrit ci-dessus.
Les réactifs trifonctionnels et les bioconjugués conformes à la présente Invention, modifiés ou non par un groupement luminescent au niveau de l'unité C, et dans lesquels la fonction oxyamine ou respectivement aldéhydique de l'unité B est libre (c'est-à-dire non fonctionnalisée par une molécule biologique d'intérêt, un groupement fluorescent ou un composé accepteur) peuvent être utilisés pour la fonctionnalisation de supports solides comportant au moins une surface
possédant un ou plusieurs groupements carbonylés, en particulier une ou plusieurs fonctions aldéhyde ou cétone ou respectivement une ou plusieurs fonctions oxyamine. Par conséquent, la présente Invention a également pour objet un support solide, caractérisé par le fait qu'il comporte au moins une surface fonctionnalisée, de façon covalente, par un ou plusieurs réactifs trifonctionnels, et/ou par un ou plusieurs bioconjugués, lesdits réactifs trifonctionnels et bioconjugués étant éventuellement modifiés par un groupement luminescent au niveau de l'unité C et tels que définis précédemment.
Selon l'Invention, la nature du support solide n'est pas critique à partir du moment où il comprend au moins une surface possédant, naturellement ou après modification chimique, un ou plusieurs groupements carbonylés, en particulier une ou plusieurs fonctions aldéhyde ou cétone ou respectivement une ou plusieurs fonctions aminé primaire, lesdits groupements ou fonctions étant aptes à réagir avec la fonction oxyamine déprotégée ou respectivement avec la fonction aldéhydique démasquée de l'unité B du réactif tri fonctionnel ou du bioconjugué.
Parmi de tels supports, on peut notamment citer le verre, le plastique, et les métaux.
Selon une forme de réalisation particulière de l'Invention, le support solide comprend au moins une surface fonctionnalisée par au moins un bioconjugué et constitue alors une biopuce telle que par exemple une puce à acide nucléique, une puce à protéine, une puce à polysaccharide ou une puce à peptide, ou bien un biocapteur tel que par exemple un immunosenseur.
De tels supports peuvent être préparés selon un procédé comprenant les étapes suivantes : - la déprotection de la fonction oxyamine protégée, ou respectivement le démasquage de la fonction aldéhydique masquée, présente sur l'unité B d'au moins un réactif trifonctionnel ou d'au moins un bioconjugué conforme à l'Invention pour obtenir un réactif trifonctionnel ou un bioconjugué porteur d'une fonction oxyamine déprotégée, respectivement aldéhydique démasquée, - la formation d'une liaison oxyme par mise en contact dudit réactif ou dudit bioconjugué porteur de la fonction oxyamine déprotégée ou respectivement aldéhydique démasquée avec un support solide dont au moins une surface possède un
ou plusieurs groupements carbonylés, respectivement aminé primaire, ladite liaison oxyme assurant la fixation covalente dudit réactif ou dudit bioconjugué à la surface du support.
De tels supports peuvent notamment être utilisés pour la détection de molécules d'intérêt, notamment pour la détection d'analytes en milieu liquide.
Selon une autre forme de réalisation, l'Invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un réactif trifonctionnel tel que décrit précédemment pour la préparation d'une sonde destinée à la protéomique fonctionnelle.
Un autre objet de la présente Invention est donc une sonde pour la protéomique fonctionnelle, caractérisée par le fait qu'elle constituée d'un réactif trifonctionnel comportant :
- un groupement permettant la détection (ou visualisation) et/ou la purification d'une protéine cible (étiquette rapporteuse ou "reporter tag"),
- un motif reconnu par ladite protéine cible (unité de reconnaissance ou "récognition unit"), et
- un groupe réactif permettant d'établir un lien de covalence avec le site actif de la protéine ciblée (groupe réactif).
Selon l'Invention, on entend par "motif reconnu par ladite protéine cible", tout ligand de la protéine ciblée ou tout substrat s'il s'agit d'une enzyme (séquence peptidique par exemple).
Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention la protéine cible est une enzyme.
Selon une première forme de réalisation de ces sondes pour la protéomique fonctionnelle et lorsque la protéine cible est une enzyme, le motif reconnu par l'enzyme et le groupe réactif permettant un lien de covalence avec le site actif de cette enzyme appartiennent à la même entité (c'est le cas par exemple des inhibiteurs irréversibles et/ou les substrats suicides utilisés en chimie médicinale) et sont donc portés par la même unité du réactif trifonctionnel pseudopeptidique conforme à l'Invention. Dans ce cas les deux autres unités dudit réactif trifonctionnel peuvent être utilisées pour fixer un groupement permettant la détection (fluorophore par exemple) et un groupement facilitant la purification (biotine, tag poly(histidine), ...). Selon cette forme de réalisation, les trois entités peuvent être fixées
indifféremment sur n'importe quelle unité du réactif trifonctionnel pseudopeptidique conforme à l'Invention.
Selon une seconde forme de réalisation de ces sondes pour la protéomique fonctionnelle et lorsque la protéine cible est une enzyme, le motif reconnu par l'enzyme et le groupe réactif n'appartiennent pas à la même entité et sont donc portés par deux unités distinctes du réactif trifonctionnel pseudopeptidique conforme à l'Invention. Dans ce cas, il est préférable de les fixer sur les deux unités les plus proches l'une de l'autre (B et C) afin que la réaction du groupe réactif ait bien lieu dans le site (actif) ciblé. Ainsi la dernière unité du réactif trifonctionnel pseudopeptidique conforme à l'Invention sera utilisée pour fixer le groupement permettant la détection et/ou la purification.
Outre les dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de synthèse de réactifs trifonctionnels conformes à l'Invention. EXEMPLE 1 : PRÉPARATION D'UN RÉACTIF TRIFONCTIONNEL CONFORME A L'INVENTION
Dans cet exemple est décrite la synthèse d'un réactif trifonctionnel (1-1) conforme à la présente Invention et répondant à la formule (1-1) suivante :
(M) dans lequel :
- l'unité A est un bras de liaison de type pseudo-PEG possédant un motif carbamate activé réactif vis-à-vis des composés possédant une fonction aminé primaire,
- l'unité B est une lysine portant sur sa chaîne latérale une fonction oxyamine protégée par un groupement Fmoc, réactive vis-à-vis des surfaces possédant des fonctions aldéhyde, et
- l'unité C est une lysine possédant sur sa chaîne latérale un motif maléimide, réactif vis-à-vis des composés possédant une fonction thiol.
La stratégie de synthèse du composé (1-1) consiste à préparer séparément trois précurseurs correctement protégés (A-I), (B-I) et (C-I) puis de les assembler via des réactions de couplage pour obtenir le réactif trifonctionnel de formule (I- 1) ci-dessus conforme à la présente Invention. 1) Synthèse du précurseur (A-I) : Bras du bras de liaison de type Boc-PEG
Précurseur (A-I) Le précurseur (A-I) est un bras de liaison hydrophile possédant quatre unités éthylèneglycol ainsi qu'une fonction acide carboxylique qui va permettre le couplage ultérieur avec les unités (B-I) et (C-I) et une fonction aminé primaire qu'il est indispensable de conserver protégée jusqu'à la dernière étape de conversion en "carbamate activé". Il résulte de l'association de deux molécules d'acide 8-amino-3,6- dioxaoctanoïque, lesdites molécules ayant été préparées selon les méthodes décrites par Rensen, P. C. N et al, J. Med. Chem., 2004, 47, 5798-5808 ; Dondoni, A. et al, J. Org. Chem., 2005, 70, 5508-5518 ou Dhawan, R. et al Bioconjugate Chem., 2000, 11, 14-21. Cet acide aminé a ensuite été converti en deux dérivés protégés (dérivé N- Boc (6) et ester méthylique (7)) selon les méthodes décrites par exemple par Nakatani, K. et al, Bioorg. Med. Chem. Lett, 2004, 14, 1 105-1108 ou Rachele, J., J. Org. Chem., 1963, 28, 2898, qui ont pu être couplés entre eux selon la méthode décrite par exemple par Han, S. -Y. et al, Tetrahedron, 2004, 60, 2447-2467 pour conduire, après saponification, au précurseur (A-I) recherché. a) Première étape : Synthèse du 2-(2-(2-azidoéthoxy)éthoxy)éthanol (3)
1,29 ml (8,9 mmol) de 2-(2-(2-chloroéthoxy)éthoxy)éthanol ont été ajoutés à une suspension d'azoture de sodium (0,7 g, 10,7 mmol) et d'iodure de sodium (0,14 g, 0,93 mmol) dans de l'éthanol anhydre. Le mélange jaune résultant a été chauffé au reflux pendant 5 jours sous atmosphère d'argon. On a contrôlé que la réaction était complète par chromatographie sur couche mince (CCM) vendues sous la
référence DC Kieselgel 60 F254 par la société Merck en utilisant un mélange solvant dichlorométhane/méthanol (9:1, v/v). Le mélange a ensuite été filtré sur Celite 545 afin d'éliminer les sels de sodium, puis évaporé. Le résidu huileux résultant a été dissous dans environ 10 ml de dichlorométhane puis stocké à une température de 4°C pendant 1 heure. Après filtration sur coton et concentration, le composé (3) attendu a été obtenu sous la forme d'une huile incolore (rendement quantitatif).
Analyse RMN 1H (300 MHz, CDCl3) : δ = 2,63 (t, J = 6,0 Hz, IH, OH), 3,43 (t, J = 4,9 Hz, 2H), 3,61-3,77 (m, 10H).
VV) Deuxième étape : Synthèse de l'acide 2-(2-(2-azidoéthoxy) éthoxy)acétique (4)
1,56 g (8,9 mmol) du composé (3) obtenu ci-dessus à l'étape précédente ont été dissous dans 90 ml d'acétone et la solution résultante a été refroidie jusqu'à une température de 4°C. 8,9 ml de réactif de Jones 3 M fraîchement préparé (par exemple par dissolution de 26,72 g de CrO3 dans 23 ml d'acide sulfurique concentré puis ajout d'eau jusqu'à un volume de 100 ml) ont ensuite été ajoutés goutte à goutte (un précipité vert a immédiatement été formé), puis le mélange réactionnel résultant a été agité à température ambiante pendant 1 heure. On a contrôlé que la réaction était complète par CCM comme à l'étape précédente et la réaction a été stoppée par ajout de d'environ 4 ml de propan-2-ol. Après 15 min, on a ajouté 100 ml d'acétone et le précipité vert de sels de Cr(III) a été éliminé par filtration sur Celite® 545. Le filtrat a ensuite été évaporé à sec. Le résidu huileux résultant a été purifié par chromatographie sur une colonne de gel de silice (50 g) en utilisant comme phase mobile un gradient de méthanol (0 à 5 %) dans le dichlorométhane. On a obtenu 1,53 g (8,1 mmol) du composé (4) sous la forme d'une huile jaune (rendement 91 %). Analyse RMN 1H (300 MHz, CDCl3) : δ = 3,43 (t, J = 4,9 Hz, 2H),
3,66-3,80 (m, 6H), 4,19 (s, 2H).
A Analyse RMN 13C (75,5 MHz, CDCl3) : δ = 50,7 ; 68,6 ; 70,2 70,6 ; 71,4 ; 174,2.
c) Troisième étape : Synthèse de l'acide 2-(2-aminoéthoxy)éthoxy) acétique (5)
Un mélange de 1,53 g (8,2 mmol) du composé (4) obtenu ci-dessus à l'étape précédente et de 2,5 ml (65,5 mmol) d'acide formique a été dissous dans 150 ml d'éthanol, puis la solution obtenue a été refroidie jusqu'à une température de 4°C.
0,32 g de palladium/charbon (Pd/C) à 10% de Pd ont été ajoutés à cette solution et le mélange réactionnel résultant a été agité à température ambiante pendant 12 heures sous atmosphère d'hydrogène. On a ensuite contrôlé que la réaction était complète par
CCM comme à l'étape précédente mais en utilisant un mélange 8:2 (v/v) de dichlorométhane (CH2Cl2)/méthanol (MeOH), puis le mélange a été filtré sur Celite®
545 pour éliminer le Pd/C. Le filtrat a ensuite été évaporé à sec jusqu'à obtention d'un résidu huileux qui a été séché sous vide pour conduire au composé (5) attendu sous la forme d'une huile jaune (rendement quantitatif). d) Quatrième étape : Synthèse de l'ester méthylique de l'acide 2-(2-aminoéthoxy) éthoxy) acétique (6)
0,48 g (2,92 mmol) du composé (5) obtenu ci-dessus à l'étape précédente ont été mis en suspension dans 20 ml de 2,2-diméthoxypropane, puis on a ajouté 2,92 ml d'acide chlorhydrique concentré (HCl à 37 %)). Le mélange réactionnel résultant a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant 1 heure. On a ensuite contrôlé que la réaction était totale par CCM en utilisant un mélange CH2Cl2/Me0H/triéthylamine (TEA) 80:20:2 (v/v/v) puis le mélange a été évaporé à sec. Le résidu huileux résultant a ensuite subi 4 lyophilisations successives avec ajout de 10 ml d'eau osmosée à chaque fois pour finalement obtenir le produit attendu sous la forme d'une huile jaune (rendement quantitatif).
Analyse RMN 1H (300 MHz, CD3CN + 5% D2O) : δ = 3,08 (t, J = 5,3 Hz, 2H), 3,56-3,76 (m, 1 IH), 4,13 (s, 2H).
e) Cinquième étape : Synthèse de l'acide 2-(2-tert-butyloxycarbonyl)aminoéthoxy) éthoxy) acétique (7)
0,78 g (3,75 mmol) du composé (5) obtenu ci-dessus à l'étape c) ont été dissous dans 12 ml d'un mélange tetrahydrofurane (THF)/H2O (2:1, v/v). 5 ml d'une solution aqueuse de soude 2 M fraîchement préparée ont ensuite été ajoutés et la solution obtenue a été refroidie à 4°C. 0,89 g (4,12 mmol) de dicarbonate de di-t- butyle ont ensuite été ajoutés et le mélange réactionnel a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant 1 heure. On a ensuite contrôlé que la réaction était totale par CCM en utilisant un mélange CH2Cl2/Me0H (7:3, v/v). Le mélange réactionnel a ensuite été acidifié par ajout d'environ 25 ml d'une solution aqueuse d'hydrogénosulfate de potassium 1 M (KHSO4). Cette solution a ensuite été extraite avec 3 fois 50 ml d'acétate d'éthyle. La phase organique a été séchée sur sulfate de sodium (Na2SO4) puis évaporée à sec. Le résidu huileux résultant a été purifié par chromatographie sur une colonne de gel de silice (40 g) en utilisant comme phase mobile un gradient de méthanol (0 à 6 %) dans le CH2Cl2. On a obtenu 0,50 g (1,87 mmol) du composé (7) sous la forme d'une huile incolore (rendement 50 %).
Analyse RMN 1H (300 MHz, CDCl3) : δ - 1 ,44 (s, 9H), 3,34 (bm, 2H), 3,50-3,77 (m, 6H), 4,17 (s, 2H), 4,97 (bs, IH, NH). f) Cinquième étape : Synthèse du précurseur (A-I)
0,15 g (0,83 mmol) du composé (7) obtenu ci-dessus à l'étape précédente et 0,23 g (0,87 mmol) du composé (6) obtenu ci-dessus à l'étape d) ont été dissous dans 8 ml d'acétonitrile anhydre. On a ensuite ajouté 0,44 ml (2,5 mmol) de yV.Λf-diisopropyléthylamine (DIEA) et 0,37 g (0,83 mmol) d'hexafluorophosphate de benzotriazol-l-yl-Λf-oxytris(diméthyl-amino)-phosphonium (BOP) puis le mélange réactionnel a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant une nuit sous atmosphère d'argon. On a ensuite contrôlé que la réaction était totale par CCM en utilisant un mélange CH2Cl2/Me0H (8:2, v/v), puis le mélange réactionnel a été évaporé à sec. Le résidu résultant a ensuite été repris dans 75 ml d'acétate d'éthyle,
lavé successivement avec 50 ml d'une solution aqueuse d'acide citrique à 10 %, 50 ml d'une solution saturée de bicarbonate de sodium (NaHCO3) et 50 ml d'une solution aqueuse saturé de NaCl pour être ensuite séché sur Na2SO4 et évaporé à sec. Le résidu huileux orange a ensuite été dissous dans 5 ml de MeOH et la solution a été refroidie à 4 °C. 0,83 ml d'une solution aqueuse de soude 1 M ont alors été ajoutés et le mélange réactionnel a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant 30 min. On a ensuite contrôlé que la réaction était totale par CCM en utilisant un mélange CH2Cl2/Me0H (7:3, v/v). Le mélange réactionnel a ensuite été acidifié par ajout d'environ 1 ml d'une solution aqueuse de KHSO4 1 M. La solution a ensuite été évaporée à sec sans chauffage et le résidu résultant a été purifié par chromatographie sur une colonne de gel de silice (30 g) en utilisant comme phase mobile un gradient de méthanol (0-50 %) dans le CH2Cl2. On a ainsi obtenu 0,17 g (0,42 mmol) du précurseur du bras de liaison (A-I) sous la forme d'une huile incolore avec un rendement de 80 %. Analyse RMN 1H (300 MHz, CDCl3) : δ = 1,43 (s, 9 H), 3,30 (bm,
2H), 3,47-3,66 (m, 14H), 4,01 (s, 2H), 4,04 (s, 2H), 5,16 (bs, IH, NH), 7,34 (bs, IH, NH).
Analyse RMN 13C (75,5 MHz, CDCl3) : δ = 28,8 (3C) ; 38,9 ; 70,3 (3C) ; 70,5 (3C) ; 71,1 (3C) ; 79,8 ; 156,5 ; 171,6 ; 175,0. MS (ESI, mode positif) m/z : 431 ,27 (M+Na)+, 453,27 (M-H+2Na)+.
MS (ESI, mode négatif) m/z : 407,47 (M-H)" calculé pour C17H32N2O9 408,45. 2) Synthèse du précurseur (B-I)
Le précurseur (B-I) a été synthétisé en deux étapes à partir du dérivé protégé N-Fmoc de l'acide aminooxyacétique (8) préalablement préparé par réaction entre l'acide aminooxyacétique commercial et le chloroformiate de
9-fluorénylméthanol dans les conditions de Schotten-Baumann (Cipolla L. et al, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 1639-1646). a) Première étape préalable : Synthèse de l'acide 9-fluorénylméthoxycarbonyl- aminooxyacétique (8)
0,5 g (4,6 mmol) d'hémichlorhydrate de carboxyméthoxylamine ont été dissous dans 20 ml d'une solution aqueuse contenant 1,2 g de Na2CO3 puis la solution résultante a été refroidie à 4°C. 1,31 g (5,0 mmol) de chloroformiate de 9- fluorénylméthyle dans 10 ml de dioxane anhydre ont alors été ajoutés goutte à goutte au milieu réactionnel qui a ensuite été maintenu sous agitation à température ambiante pendant une nuit. Le mélange réactionnel a été concentré, acidifié jusqu'à pH 4-5 par ajout d'environ 5 ml d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique à 5 % et le produit a précipité dans la solution. Il a été récupéré par filtration et lavé 1 fois avec 20 ml d'eau distillée puis 1 fois avec 20 ml de pentane. L'eau résiduelle a été éliminée par lyophilisation pour conduire à 1,05 g (3,4 mmol) du composé (8) sous forme brute. Après purification par chromatographie sur une colonne de gel de silice (30 g) en utilisant comme phase mobile un gradient de méthanol (0-50 %) dans le dichlorométhane, on a obtenu 0,64 g (2,0 mmol) du composé (8) sous la forme d'une mousse blanche (rendement 43 %). Analyse RMN 1H (300 MHz, CD3OD) : δ = 4,22-4,27 (m, 3H), 4,44
(d, J = 6,8 Hz, 2H), 7,29-7,42 (m, 4H), 7,64 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,80 (d, J = 7,5 Hz, 2H). b) Deuxième étape préalable : Synthèse de la ^-(tert-butyloxycarbonyD-L-lysine (10)
(benzyloxycarbonyl)):Lτly_sine (produit commercial) a été dissous dans 50 ml
d'acétate d'éthyle puis la solution a été refroidie à 4°C. On a ensuite ajouté 0,1 g de Pd/C à 10 % de Pd puis le mélange réactionnel résultant a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant 21 heures sous atmosphère d'hydrogène. On a contrôlé que la réaction était complète par CCM (CH2Cl2/Me0H 85:15, v/v) puis le mélange réactionnel a été filtré sur Celite 545 pour éliminer le Pd/C. En raison de la faible solubilité du composé (10) dans l'acétate d'éthyle, on a réalisé des lavages de la Celite® 545 avec 2 fois 50 ml de méthanol pour récupérer le composé (10). Le filtrat a été évaporé à sec et le résidu huileux obtenu a été séché sous vide pour conduire à 0,41 g (1,67 mmol) du composé (10) sous la forme d'une mousse blanche avec un rendement de 64%. c) Première étape : Synthèse de l'ester succinimidylique de l'acide 9-fluorénylméthoxycarbonyl-aminooxyacétique (9)
0,560 g (1,80 mmol du composé (8) obtenu ci-dessus à l'étape a) ont été dissous dans 15 ml d'un mélange acétate d'éthyle/dioxane (2:1, v/v), puis la solution a été refroidie jusqu'à une température de 4°C. 0,225 g (1,95 mmol) de N-hydroxysuccinimide et 0,404 g de ΛζN'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) ont été ajoutés successivement à cette solution et le milieu réactionnel résultant a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant une nuit sous atmosphère d'argon. La conversion du composé (8) en ester N-hydroxysuccinimidylique correspondant (9) a été contrôlée par chromatographie liquide haute performance en phase inverse (HPLC-PI) sur une colonne Thermo Hypersil GOLD" Ci8 de 5 μm et de dimensions 4,6 x 150 mm, en utilisant de l'acétonitrile et une solution aqueuse d'acide trifluoroacétique (TFA) à 0,1 % (v/v, pH 2) comme éluants (80 % de solution aqueuse de TFA à 0,1 % avec un gradient linéaire de 20 à 90 % d'acétonitrile en 35 minute, à un débit de 1,0 ml/min. Une double détection UV a été effectuée à 210 et 254 nm. Le composé (9) (?R = 20,72 min) a ensuite été immédiatement utilisé dans la réaction suivante de couplage sans purification.
d) Deuxième étape : Synthèse de la Na-(tert-butyloxycarbonyl)- Nβ-^-fluorénylméthoxycarbonyl-aminooxyacétvQ-L-lysine (B- 1 )
A une suspension de Λ^-Boc-L-lysine (10) (0,41 g, 1,67 mmol) dans 6 ml d'un mélange de DMF/NMP (5:1, v/v) anhydre, on a successivement ajouté la DIEA (0,29 ml, 1,67 mmol) et la solution brute d'ester de N-hydroxysuccinimide (9) obtenu ci-dessus à l'étape précédente. Le milieμ réactionnel résultant a été agité à température ambiante pendant 30 minutes. Une solution aqueuse de DIEA (0,15 ml dans 5 ml) a été alors ajoutée et la solution résultante a été agitée à température ambiante pendant 90 minutes. La réaction a été suivie par HPLC-PI (système identique à celui utilisé ci-dessus à l'étape précédente pour l'analyse du composé (9)). Le mélange réactionnel a été acidifié jusqu'à pH 5-6 par ajout d'une solution aqueuse de HCl à 5% (~ 3 ml) puis évaporé à sec. Le résidu ainsi obtenu a été repris dans 50 ml d'acétate d'éthyle et le résidu solide insoluble (précipité de DCU) éliminé par filtration sur Celite® 545. Le filtrat a été lavé avec 30 ml d'une solution aqueuse d'acide citrique à 10 %, séché sur Na2SO4 puis évaporé à sec. Le résidu jaune huileux ainsi obtenu a été purifié par chromatographie sur une colonne de gel de silice (45 g) en utilisant comme phase mobile un gradient de MeOH (0-6%) dans le dichlorométhane. On a obtenu 310 mg (0,57 mmol) de composé (B-I) sous la forme d'une mousse blanche avec un rendement de 34%. Analyse RMN 1H (300 MHz, CD3CN) : δ = 1,37-1,83 (m, 15H),
3,18 (q, J = 6,4 Hz, J = 12,6 Hz, 2H), 4,00 (m, IH, α-CH), 4,04 (s, 2H), 4,26 (t, J = 6,8 Hz, IH), 4,49 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 5,61 (bd, J = 7,5 Hz, IH, NH), 7,31-7,44 (m, 4H), 7,51 (bs, IH, NH), 7,63 (d, J= 7,5 Hz, 2H), 7,83 (d, J= 7,5 Hz, 2H), 8,9 (bs, IH, NH). Analyse RMN 13C (75,5 MHz, CD3CN) : δ = 23,5 ; 28,5 (3C) ; 29,5
; 31,6 ; 38,9 ; 47,7 ; 54,2 ; 68,0 ; 76,3 ; 79,8 ; 120,9 (2C) ; 126,0 (2C) ; 128,1 (2C) ; 128,7 (2C), 142,1 (2C) ; 144,6 (2C) ; 156,7 ; 158,9 ; 169,3 ; 174,5.
MS (Maldi-TOF, mode positif) m/z : 564,5709 (M+Na)+, 580,5535 (M+K)+, calculé pour C28H35N3O8 541,61.
3) Synthèse du précurseur (C-I)
Cette synthèse est représentée sur le Schéma 1 ci-dessous :
SCHEMA 1 Ainsi que cela apparaît sur ce schéma 1, le précurseur (C-I) a été synthétisé en quatre étapes à partir la Λ^-Boc-Λ^-Z-L-lysine (11) ; dans ce composé Z représente le groupement benzyloxycarbonyl. Dans un premier temps, la fonction acide carboxylique est convertie en carboxamide (12) par réaction de l'ammoniaque sur l'anhydride mixte intermédiairement formé selon la méthode décrite par exemple par Hofmann, K. et al, J. Am. Chem. Soc, 1978, 100, 3585-3590. Ensuite, la fonction ε-NH2 protégée par un groupement Z a été libérée (13) par hydrogénation catalytique afin de pouvoir coupler le dérivé maléimide de la glycine (14) préalablement préparé par réaction entre la glycine et le N-(méthyloxycarbonyl)maléimide selon la méthode décrite par Keller O. et al, HeIv. Chim. Acta, 1975, 58, 531-541. Le dérivé maléimide (15) a ensuite été isolé par chromatographie sur gel de silice avec un rendement de 51%. Enfin, l'extrémité N-terminale a été déprotégée par traitement à l'acide trifluoroacétique pour conduire au précurseur (C-I). a) Première étape : Synthèse du /^-(tert-butyloxycarbonvD-Λ^- (benzyloxycarbonyl))7L:lysine-carbpxamideχi2J 1,0 g (2,63 mmol) de ^"-(tert-butyloxycarbonyl)-^-
(benzyloxycarbonyl)-L-lysine (11) a été dissous dans 18 ml d'acétate d'éthyle anhydre et la solution a été refroidie à -15°C dans un bain composé de carboglace (CO2 solide) et d'éthylèneglycol. 0,29 ml (2,63 mmol) de N-méthylmorpholine (NMM) et 0,34 ml
(2,63 mmol) de chloroformiate d'isobutyle ont ensuite été ajoutés et le milieu réactionnel résultant a été maintenu sous agitation à -15°C pendant 10 minutes sous atmosphère d'argon. On a ensuite ajouté à ce mélange 1 ,3 ml d'ammoniaque aqueux (50 % ; v/v) et le mélange réactionnel a été maintenu sous agitation à une température de 0°C pendant 1 heure. Un précipité blanc volumineux s'est immédiatement formé ; celui-ci a été récupéré par filtration et lavé avec 25 ml d'eau distillée puis avec 25 ml de pentane. L'eau résiduelle a été éliminée par lyophilisation pour conduire à 0,705 g (1,86 mmol) du composé (12). Le filtrat a par ailleurs été repris dans 20 ml d'acétate d'éthyle, lavé avec 20 ml d'eau distillée, séché sur Na2SO4 et évaporé à sec. Le solide blanc obtenu a été lavé avec 2 fois 25 ml de pentane et séché sous vide. Une quantité supplémentaire de composé (12) (0,25 g, 0,66 mmol) a ainsi été obtenue. Le rendement total était de 95 %.
Analyse RMN 1H (300 MHz, CD3CN) : δ = 1,31-7,78 (m, 15H), 3,10 (q, J = 6,4 Hz, J= 12,9 Hz, IH), 3,92 (m, IH, α-CH), 5,06 (s, 2H, CH2-Bn), 5,53 (bs, 1Η, NH), 5,66 (bs, IH, NH), 5,71 (bs, IH, NH), 6,31 (bs, IH, NH), 7,30-7,42 (m, 5H). b) Deuxième étape : Synthèse de la A^-(tert-butyloxycarbonyO-L-lysine-carboxamide (13)
0,95 g (2,5 mmol) du composé (12) obtenu ci-dessus à l'étape précédente ont été dissous dans 50 ml d'un mélange acétate d'éthyle/éthanol (4:1, v/v) et la solution a été refroidie à 4°C. 0,1 g de Pd/C à 10 % de Pd a été ajouté et le mélange réactionnel résultant a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant 3 heures sous atmosphère d'argon. On a contrôlé que la réaction était complète par CCM (CH2Cl2/Me0H 9:1, v/v) puis le mélange a été filtré sur Celite® 545 pour éliminer le Pd/C. Le filtrat a ensuite été évaporé à sec pour conduire à un résidu huileux qui a ensuite été évaporé sous vide pour conduire au composé (13) attendu sous la forme d'un solide blanc (rendement quantitatif).
RMN 1H (300 MHz, CD3OD) : δ = 1,40-1,80 (m, 15H), 2,70 (t, J =
6,8 Hz, 1 H), 4,03 (q, J = 4,9 Hz, J = 12, 1 Hz, 1 H, α-CH).
c) Etape annexe : Synthèse de la N-maléoyl-L-Glycine (14) i) étape préliminaire : Préparation de la N- (m4thyApΛycarpony.ljmaléimide
1 g (10,3 mmol) de maléimide a été dissous dans 20 ml d'acétate d'éthyle anhydre puis la solution a été refroidie à 4°C. 1,13 ml de NMM (10,3 mmol) et 0,80 ml (10,3 mmol) de chloroformiate de méthyle ont ensuite été ajoutés puis le mélange réactionnel résultant a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant 1 heure. Un précipité volumineux de couleur blanche de NMM.HC1 s'est immédiatement formé ; il a été éliminé par filtration et lavé avec environ 20 ml d'acétate d'éthyle. Le filtrat a été lavé par 30 ml de solution aqueuse saturée de NaCl, séché sur Na2SO4 et évaporé à sec. Le résidu huileux résultant a été séché sous vide pour conduire à la N-(méthyloxycarbonyl)maléimide sous la forme d'un solide brun pourpre (1,16 g, 7,5 mmol, rendement 73 %). ii) Préparation de la .N-maléoyl-L-Glyçine (14) 0,5 g de glycine (6,7 mmol), a été dissous dans une solution aqueuse de NaHCO3 (2,8 g dans 32 ml) et la solution a ensuite été refroidie à 0°C (NaCl/bain de glace). 1 ,04 g (6,7 mmol) de la W-(méthyloxycarbonyl)maléimide obtenue à l'étape i) ci-dessus ont été ajoutés et le mélange réactionnel résultant a été mélangé vigoureusement à une température de 0 °C pendant 20 minutes. Ensuite, 60 ml d'eau distillée ont été ajoutés et la solution aqueuse résultante a été laissée à température ambiante pendant une nuit. Le mélange réactionnel a alors été acidifié jusqu'à pH 6 par ajout d'H2SO4 puis partiellement évaporé. Une quantité supplémentaire de H2SO4 a ensuite été ajoutée pour atteindre un pH 1-2 puis la solution aqueuse a été extraite à l'acétate d'éthyle (2 x 50 ml). La phase organique a été lavée avec une solution aqueuse saturée de NaCl (50 ml), séchée sur Na2SO4 et évaporée à sec. Le résidu huileux résultant a été purifié par chromatographie sur une colonne de gel de silice (25 g) en utilisant comme phase mobile un mélange de CHCl3/AcOH (95:5, v/v). Finalement, les traces de AcOH ont été éliminées par lyophilisation. La N-maléoyl-L- glycine (14) a ensuite été obtenue sous la forme d'un solide incolore (0,61 g, 3,6 mmol, rendement 54 %). Ce composé (14) a ensuite été immédiatement utilisé dans la troisième étape qui est décrite ci-dessous.
Analyse RMN 1H (300 MHz, acétone-d6) : δ= 4,29 (s, 2H, CH2- GIy), 7,02 (s, 2H, CH-MaI).
Analyse RMN 13C (75,5 MHz, acétone-d6) : δ = 39,6, 136,3 (2C), 169,8 (2C), 171 ,7 (1C). d) Troisième étape : Synthèse du 7Vα-(tert-butyloxycarbonyl)-./V£-(N-maléoyl-L- glycyl)-L-lysine-carboxamide (15)
0,29 g (1,73 mmol) de N-maléoyl-L-glycine (14) obtenue précédemment a été dissous dans 5 ml de CH3CN anhydre. Une solution de Λ^-Boc-L- lysine-NH2 (11) (0,55 g, 2,24 mmol) dans 5 ml de DMF anhydre a été ajoutée et la solution résultante a été refroidie à 4°C. 0,23 g (1,73 mmol) d'hydroxybenzotriazole monohydraté (HOBt) et 0,39 g (1,90 mmol) de DCC ont été ajoutés. Le mélange réactionnel résultant a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant une nuit sous atmosphère d'argon. On a contrôlé que la réaction était complète par CCM (CH2Cl2/Me0H 8:2, v/v) et le mélange a été filtré sur Celite® 545 pour éliminer le précipité blanc de 7V,N'-dicyclohexylurée (DCU). Le filtrat a ensuite été évaporé à sec puis séché sous vide pour éliminer le DMF. Le résidu résultant a ensuite été repris dans 50 ml d'acétate d'éthyle, lavé avec 30 ml de NaHCO3 saturé, 30 ml d'une solution aqueuse saturée de NaCl, puis séché sur Na2SO4 et évaporé à sec. Le résidu résultant a été purifié par chromatographie sur une colonne de gel de silice (30 g) en utilisant comme phase mobile un gradient de méthanol (0-15%) dans le dichlorométhane, pour conduire à 0,35 g (0,88 mmol) du composé (15) attendu sous la forme d'une solide blanc avec un rendement de 51 %.
Analyse IR (KBr) vmax 835, 1063, 1166, 1256, 1432, 1525, 1555, 1665 (large), 1710 (large), 2926, 3218, 3342 (large), 3416 cm'1. Analyse RMN 1H (300 MHz, CD3CN) : δ = 1 ,29-1 ,78 (m, 15H),
3,15 (q, J= 6,4 Hz, J= 13,0 Hz, IH), 3,88-3,95 (m, IH, α-CH), 4,05 (s, 2H), 5,52 (bs, IH, NH), 5,72 (bs, IH, NH), 6,34 (bs, IH, NH), 6,62 (bs, IH, NH), 6,85 (s, 2H).
Analyse RMN 13C (75,5 MHz, CD3CN) : δ = 24,1, 29,0 (3C), 30,1 , 33,0, 40,1, 41,4, 55,7, 80,2, 136,1 (2C), 157,1, 167,8, 172,1, 176,0.
e) Quatrième étape : Synthèse du N£-(7V-maléoyl-L-glycyl)-L-lvsine-carboxamide
(Précurseur C-I)
0,33 g (0,83 mmol) de ^-(tert-butyloxycarbonyO-Λ^-OM-maléoyl-L- glycyl)-L-lysine-carboxamide (15) a été dissous dans 7 ml d'un mélange TFA/H2O (95:5, v/v) puis la solution a été laissée à température ambiante pendant 90 minutes.
Le TFA a ensuite été évaporé et le produit a été précipité à l'éther, lavé à l'éther et lyophilisé. Le sel de TFA brut du précurseur (C-I) a été purifié par flash chromatographie en phase inverse sur une colonne de silice greffée Ci8 (20 g, élution avec une solution aqueuse de TFA à 0,1 %). Les fractions contenant le produit ont été lyophilisées pour donner 91 mg (0,22 mmol, rendement 27 %) du précurseur (C-I) attendu sous la forme d'un solide blanc.
Analyse RMN 1H (300 MHz, D2O) : δ = 1,33-1,42 (m, 2H)5 1,49-
1 ,59 (m, 2H), 1,83-1,90 (m, 2H), 3,21 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 3,98 (t, J = 6,8 Hz, IH, α-
CH), 4,22 (s, 2H), 6.92 (s, 2H). 4) Synthèse du réactif fonctionnel (I- 1) conforme à l'Invention et non fluorescent:
Assemblage des précurseurs (A-I), (B-I) et (C-I)
Le composé trifonctionnel (1-1) a été synthétisé en 5 étapes à partir des précurseurs (A-I), (B-I) et (C-I) préparés ci-dessus au cours des étapes précédentes. Le protocole de synthèse du composé (1-1) est résumé (les trois étapes principales uniquement) sur le schéma 2 suivant :
Précurseur (B-1-C-1)
SCHÉMA 2
Le couplage entre les précurseurs (B-I) et (C-I) a été réalisé après pré-activation du précurseur (B-I) sous forme d'ester d'hydroxysuccinimide selon la méthode décrite par exemple dans l'article de Knorr, R. et al., Tetrahedron Lett., 1989, 30, 1927-1930. L'ester activé a ensuite été mis en réaction avec le précurseur (C-I) pour conduire à un produit de couplage (16) qui a été isolé par chromatographie sur gel de silice avec un rendement de 32%. Ensuite, un traitement avec du TFA a permis d'éliminer le groupement Boc et ainsi d'obtenir le précurseur (B-l-C-1). Le couplage final entre le précurseur (A-I) et le précurseur (B-l-C-1) a été réalisé en utilisant le BOP comme réactif de couplage. Le produit attendu, sous forme encore protégée, a été purifié par chromatographie sur gel de silice. Après déprotection, par traitement à l'acide trifluoroacétique, l'extrémité N-terminale a été convertie en carbamate activé par traitement avec le TV, TV'-disuccinimidyl carbonate (DSC) dans le DMF anhydre en présence de triéthylamine. Une conversion totale du pseudo-peptide en composé de formule (1-1) a été observée au bout de 30 minutes. Le composé de formule (1-1) attendu a ensuite été purifié par flash chromatographie en phase inverse sur une colonne de silice greffée Ci8.
a) Première étape : Synthèse du Λ^-(tert-butyloxycarbonylV7Vg-(9- fluorénylméthyloxycarbonyl-aminooxy-acétyl)-L-lvsine-Ng-maléoyl-L-lysine- carboxamide (16)
0,2 g (0,36 mmol) du précurseur (B-I) obtenu ci-dessus à l'étape 2) d) ont été dissous dans 2 ml d'acétonitrile anhydre. On a ensuite ajouté 67,4 μl (0,38 mmol) de DIEA et 1 16 mg (0,38 mmol) de tétrafluoroborate de O-(N-succinimidyl)- N,N,N',N'-tetraméthyl-uronium (TSTU) et le mélange réactionnel a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant 45 minutes sous atmosphère d'argon. La conversion du précurseur (B-I) en son ester de N-hydroxysuccinimide a été contrôlée par CCM (CH2Cl2/Me0H, 85:15, v/v). Une solution de 91 mg (0,23 mmol) de N°-(N- maléoyl-L-glycyl)-L-lysine-carboxamide (précurseur C-I) obtenu ci-dessus à l'étape 3 e) et de 40 μl (0,23 mmol) de DIEA dans 3 ml d'un mélange CH3CN/DMF anhydre (2:1, v/v) ont ensuite été ajoutés goutte à goutte et le mélange réactionnel résultant a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant 1 heure sous atmosphère d'argon. On a contrôlé que la réaction était complète par CCM (CH2Cl2/MeOH), 85:15, v/v/) puis le mélange a été évaporé sous vide pour éliminer le DMF. Le résidu huileux ainsi obtenu a été purifié par chromatographie sur une colonne de gel de silice (25 g) en utilisant comme phase mobile un gradient de MeOH (0-10%) dans le dichlorométhane. On a ainsi obtenu 60 mg (0,075 mmol) du composé (16) sous la forme d'une mousse blanche avec un rendement de 32 %.
Analyse RMN 1H (300 MHz, CDCl3) : δ ≈ 1,25-1,91 (m, 21H), 3,07-3,29 (m, 4H), 4,08-4,42 (m, 7H, 2 x α-CH, CH-Fmoc, 2 x CH2), 4,48 (d, J = 6,8 Hz, 2H5 CH2-Fm0C), 5,61 (bd, J = 6,4 Hz, IH, NH), 6,04 (bs, IH, NH), 6,74 (s, 2H), 6,81 (bs, IH, NH), 6,91 (bs, IH, NH), 7,27-7,42 (m, 4H), 7,57 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,75 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 9,2 (bs, 1 H, NH).
MS (MALDI-TOF, mode positif) m/z 706,6896 ((M-Boc)+H)+ 808,7330 (M+H)+, 828,7064 (M+Na)+, calculé pour C40H5IN7On 805,89. b) Deuxième étape : Synthèse du A^-(9-fluorénylméthyloxycarbonyl-aminooxy- acétyl)-L-lysine-./Vε-maléoyl-L-glycyl)-L-lysine-carboxamide (B-l-C-1) 60 mg (0,075 mmol) du composé (16) obtenu ci-dessus à l'étape précédente ont été dissous dans 2 ml de dichlorométhane et la solution a été refroidie jusqu'à 4°C. 306 μl (4,12 mmol) de TFA ont été ajoutés goutte à goutte et le mélange
réactionnel résultant a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant 90 min. On a contrôlé que la réaction était complète par CCM (CH2Cl2/Me0H, 85:15, v/v) puis le mélange a été évaporé à sec. Le résidu huileux ainsi obtenu a été dissous dans 5 ml d'un mélange CH3CN/H2O (1 :1, v/v) puis lyophilisé pour donner 58 mg (0,071 mmol) du composé (B-l-C-1) sous la forme d'une poudre blanche (rendement 94 %).
MS (MALDI-TOF, mode positif) m/z 706,6488 (M+H)+, calculé pour C35H43N7O9 707,77.
Ce composé a ensuite été utilisé dans l'étape suivante sans purification. c) Troisième étape : Synthèse du réactif trifonctionnel (1-1) sous forme totalement protégée
58 mg (0,071 mmol) du composé (B-l-C-1) obtenu ci-dessus à l'étape précédente et 32 mg (0,077 mmol) du précurseur (A-I) obtenu précédemment à l'étape 1) f) ont été dissous dans 2 ml de dichlorométhane anhydre. On a ensuite ajouté 25,9 μl (0,15 mmol) de DIEA et 34,4 mg (0,077 mmol) de BOP et le mélange réactionnel a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant 30 minutes sous atmosphère d'argon. On a contrôlé que la réaction était complète par HPLC-PI (Système B, c'est-à-dire en utilisant une colonne Thermo Hypersil GOLD® Ci8 de 5 μm et de dimensions 4,6 x 150 mm avec comme éluant de l'acétonitrile et une solution aqueuse de TFA à 0,1 % (v/v, pH 2) en faisant passer le mélange à 80 % de TFA pendant 5 minutes puis un gradient linéaire allant de 20 à 90 % de CH3CN en 35 minutes avec un débit de 1,0 ml/min ; une double détection UV a été faite à 210 et 254 nm), puis une quantité supplémentaire de précurseur (A-I) (14,4 mg, 0,035 mmol), de DIEA (18,5 μl, 0,10 mmol) et de BOP (15,6 mg, 0,077 mmol) a été ajoutée. Après mélange à température ambiante pendant 90 minutes, le mélange réactionnel a été dissous dans 25 ml de dichlorométhane. La phase organique résultante a été lavée successivement par 25 ml d'acide citrique à 10 % et 25 ml de saumure, puis séchée sur Na2SO4 et évaporée à sec. Le résidu huileux ainsi obtenu a été purifié par chromatographie sur une colonne de gel de silice (10 g) utilisant comme phase mobile un gradient de méthanol (0-15%) dans le dichlorométhane pour conduire à 24 mg
(0,022 mmol) du composé de formule (1-1) complètement protégé sous la forme d'une mousse jaune avec un rendement de 31 %. d) Quatrième étape : Synthèse du sel de TFA du composé de formule CI-I) totalement protégé 24 mg (0,022 mmol) du composé de formule (1-1) sous forme totalement protégée et tel qu'obtenu ci-dessus à l'étape précédente ont été dissous dans 1 ml de dichlorométhane. 81 μl (1,08 mmol) de TFA ont ensuite été ajoutés goutte à goutte puis le mélange réactionnel résultant a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant 1 heure. On a contrôlé que la réaction était complète par CCM (CH2Cl2/Me0H, 85:15, v/v) puis le mélange a été évaporé à sec. Le sel brut de TFA du composé de formule (1-1) sous forme totalement protégée a été purifié par flash chromatographie en phase inverse sur une colonne de silice greffée Ci8 (5 g) en utilisant comme phase mobile un gradient de CH3CN (0-23%) dans une solution aqueuse de TFA à 0,1 %. Les fractions contenant le produit ont été lyophilisées pour conduire à 12 mg (0,01 1 mmol du sel de TFA du réactif trifonctionnel de formule (1-1) totalement protégé sous la forme d'une mousse blanche. e) Cinquième étape : Synthèse du réactif trifonctionnel de formule (1-1)
12 mg (0,01 1 mmol) du sel de TFA du réactif trifonctionnel de formule (1-1) sous forme totalement protégée tel qu'obtenu ci-dessus à l'étape précédente ont été dissous dans 200 μl de DMF anhydre. On a ensuite ajouté 1,5 μl (0,011 mmol) de TEA et une solution du réactif DSC (4,15 mg, 0,016 mmol) dans 100 μl de DMF anhydre. Le mélange réactionnel a ensuite été maintenu sous agitation à température ambiante pendant 1 heure. On a contrôlé que la réaction était complète par HPLC-PI en utilisant le système B tel que décrit ci-dessus à l'étape 4) b). Le mélange a ensuite été repris dans 5 ml d'une solution aqueuse de TFA à 0,1 % et purifié par flash chromatographie en phase inverse sur une colonne de silice greffée Ci8 (5 g) en utilisant comme phase mobile un gradient de CH3CN (0-50%) dans une solution aqueuse de TFA à 0,1 %. Les fractions contenant le produit ont été lyophilisées pour conduire à 6,70 mg (0,0059 mmol) de réactif trifonctionnel de formule (1-1) attendu sous la forme d'une poudre blanche.
MS (MALDI-TOF, mode positif) m/z : 996,6590 ((M-NHS carbamate)+H)+, 1159,5921 (M+Na)+, 1175,5654 (M+K)+, calculé pour C52H68N10O19
1 137,18.
EXEMPLE 2 : SYNTHÈSE D'UN RÉACTIF TRIFONCTIONNEL
PSEUDOPEPTIDIQUE CONFORME A L'INVENTION (1-2)
Dans cet exemple est décrite la synthèse d'un réactif trifonctionnel pseudopeptidique (1-2) conforme à la présente Invention et répondant à la formule suivante :
Dans cet exemple, on illustre la synthèse d'un réactif trifonctionnel différent du réactif de formule (1-1) précédemment synthétisé ci-dessus à l'exemple 1) par la nature de l'acide aminé devant supporter la fixation d'un fluorophore (précurseur C). Cet exemple montre qu'il est également possible d'utiliser une cystéine dont la fonction thiol de la chaîne latérale a été protégée sous la forme de disulfure à l'aide du groupement S-éthyle (SEt), en vue de la faire réagir sur un fluorophore préalablement fonctionnalisé par un motif maléimide ou iodoacétyle.
Pour ce faire, il a été utilisé une stratégie de synthèse convergente, comme dans l'exemple 1) consistant à préparer séparément les précurseurs (A), (B) et (C) puis de les assembler. A titre de précurseur (A), on a utilisé le précurseur (A-I) synthétisé à l'exemple 1) ci-dessus. A titre de précurseur (B), on a synthétisé un précurseur de formule (B-I), selon une voie sensiblement différente et améliorée par rapport à celle utilisée pour la synthèse du précurseur (B-I) de l'exemple 1). Enfin la synthèse du précurseur (C-2) a été réalisée à partir de la Boc-Cys(SEt)-OH commerciale.
1) Synthèse du précurseur (B-I) : Λ^-ftert-butyloxyearbonvIHV*-^- fluorénylméthyloxycarboxyl-aminooxy-acétvD-L-lysine
Le précurseur (B-I) a été synthétisé à partir du dérivé protégé N-Fmoc de l'acide aminooxyacétique (8) préalablement préparé comme à l'exemple 1), étape 2) a).
0,230 g (0,73 mmol) du composé (8) a été dissous dans 9 ml d'un mélange CH3CN/DMF (1 :1, v/v). On a ensuite ajouté 1 19 mg (0,88 mmol) d'hydroxybenzotriazole monohydraté et 182 mg (0,88 mmol) de DCC puis le mélange réactionnel a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant 2 heures sous atmosphère d'argon. Une solution de 180 mg (0,731 mol) de Λ^-Boc-L-lysine
(10) telle qu'obtenue ci-dessus à l'étape 2), b) de l'exemple 1 dans 2 ml de DMF anhydre a ensuite été ajoutée et le mélange réactionnel a été maintenu sous agitation à température ambiante sous atmosphère d'argon. On a suivi la réaction par CCM
(CH2Cl2/Me0H, 80:20, v/v). Après 2 heures d'agitation, le mélange a été évaporé à sec. Le résidu ainsi obtenu a été repris dans 50 ml d'acétate d'éthyle, lavé avec 50 ml d'une solution aqueuse d'acide citrique à 10 %, 25 ml d'eau distillée, séché sur Na2SO4 et enfin purifié par chromatographie sur une colonne de gel de silice (20 g) en utilisant comme phase mobile un gradient d'acétate d'éthyle (0-80%) dans le dichlorométhane.
On a obtenu 296 mg (0,36 mmol) de composé (B-I) sous la forme d'une mousse blanche avec un rendement de 50 %.
Analyse RMN 1H (300 MHz, CD3CN) : δ = 1 ,37-1,83 (m, 15H),
3,18 (q, J = 6,4 Hz, J = 12,6 Hz, 2H), 4,00 (m, IH, α-CH), 4,04 (s, 2H), 4,26 (t, J =
6,8 Hz, IH), 4,49 (d, J = 6,8 Hz, 2H), 5,61 (bd, J = 7,5 Hz, IH, NH), 7,31-7,44 (m,
4H), 7,51 (bs, IH, NH), 7,63 (d, J= 7,5 Hz, 2H), 7,83 (d, J= 7,5 Hz, 2H), 8,9 (bs, IH, NH).
Analyse RMN 13C (75,5 MHz, CD3CN) : δ = 23,5 ; 28,5 (3C) ; 29,5 ; 31 ,6 ; 38,9 ; 47,7 ; 54,2 ; 68,0 ; 76,3 ; 79,8 ; 120,9 (2C) ; 126,0 (2C) ; 128,1 (2C) ; 128,7 (2C), 142,1 (2C) ; 144,6 (2C) ; 156,7 ; 158,9 ; 169,3 ; 174,5.
MS (MALDI-TOF, mode positif) m/z : 564,5709 (M+Na)+, 580,5535 (M+K)+, calculé pour C28H35N3O8 541,61.
2) Synthèse du précurseur (C-2)
Le précurseur (C-2) a été synthétisé en deux étapes à partir de la 7V-(tert-butyloxycarbonyl)-S-(S-éthyl)-cystéine (19) selon le schéma 3 ci-dessous :
SCHEMA 3
Selon ce schéma et dans un premier temps, la fonction acide carboxylique du composé (19) est convertie en carboxamide (20) par réaction de l'ammoniaque sur l'anhydride mixte intermédiairement formé selon la méthode décrite par exemple par Hofmann, K. et al, J. Am. Chem. Soc, 1978, 100, 3585-3590 Ensuite, l'extrémité N-terminale du composé (20) est déprotégée par traitement à l'acide trifluoroacétique pour conduire au précurseur (C-2). a) Première étape : Synthèse du N-(tert-butyloxycarbonyl)-5'-(S-éthyiycvstéine- carboxamide (6) 500 mg (1,08 mmol) de N-(tert-butyloxycarbonyl)-S-(S-éthyl)- cystéine (19) ont été dissous dans 15 ml d'acétate d'éthyle et la solution a été refroidie jusqu'à -150C dans un bain de carboglace et d'éthylèneglycol. 0,119 ml (1,08 mmol) de NMM et 0,140 mg (1,08 mmol) de chloroformiate d'isobutyle ont ensuite été ajoutés et le mélange réactionnel a été maintenu sous agitation à -15°C pendant 10 minutes sous atmosphère d'argon. On a ensuite ajouté à cette solution anhydre une solution aqueuse à 15 % d'ammoniaque (0,38 ml, 3,24 mmol) puis le mélange
réactionnel a été maintenu sous agitation pendant 30 minutes à une température de 4°C. Le mélange a ensuite été évaporé à sec et le résidu a été repris dans 30 ml d'acétate d'éthyle puis lavé avec 20 ml d'eau. Les phases organiques ont été séchées sur Na2SO4 puis évaporées à sec. On a obtenu le composé (20) avec un rendement quantitatif, sous la forme d'un solide blanc.
Analyse RMN 1H (300 MHz, CDCl3) : δ = 1 ,24-1.29 (t, J = 6,8 Hz, 3H, CH3(SEt)), 1,39 (s, 9H, tBu), 2,63-2,70 (q, J = 7,1 Hz, 2H, CH2(SEt)), 2,99-3,01 (d, J= 6,0 Hz, 2H, CH2 β), 4,36-4,39 (m, IH, CH α), 5,25-5,28 (d, J = 9,0 Hz, IH, NH), 5,63 (bs, IH, NH), 6,31 (bs, IH, NH). Analyse RMN 13C (75,5 MHz, CDCl3) : δ = 13,8 (CH3(SEt)), 27,8
(tBu), 32,0 (CH2(SEt)), 39,9 (CH2 β), 53,0 (CH α), 80,1 (Cq tBu), 155,1 (Cq), 172,6 (Cq).
MS (MALDI-TOF, mode positif) m/z = 303,13 (M+Na)+, calculé pour Ci0H20N2O3S2-Na 303,41. b) Deuxième étape : Synthèse du précurseur (C-2) : ^(S-éthvD-cystéine-carboxamide
Le composé (20) obtenu ci-dessus à l'étape précédente a été lentement dissous dans 14 ml d'un mélange TFA/H2O (95:5 v/v) sous agitation à une température comprise entre 0°C et la température ambiante pendant 1 heure. On a contrôlé que la réaction était complète par CCM (CH2Cl2/Me0H 90:10 v/v) puis le mélange réactionnel a été évaporé à sec. Une quantité minimale d'eau osmosée a alors été ajoutée et la solution aqueuse résultante a été lyophilisées pour conduire au précurseur (C-2) sous la forme d'une poudre jaunâtre avec un rendement de 89 %.
Analyse RMN 1H (300 MHz, D2O) : δ = 1,26-1,31 (t, J = 7,1 Hz, 3H, CH3(SEt)), 1,39 (s, 9H), 2,72-2,80 (q, J = 7,1 Hz, 2H, CH2(SEt)), 3,25-3,26 (d, J = 6,0 Hz, 2H, CH2 β), 4,30-4,35 (m, IH, CH α).
Analyse RMN 13C (75,5 MHz, D2O) : δ = 13,8 (CH3(SEt)), 30,1 (CH2(SEt)), 38,3 (CH2 β), 52,2 (CH α), 170,8 (Cq).
MS (MALDI-TOF, mode positif) m/z = 180,00 (M+Na)+, calculé pour C5H12N2OS2-Na 180,29.
3) Synthèse du réactif trifonctionnel de formule (1-2)
Le réactif (1-2) a été synthétisé en trois étapes à partir des précurseurs (A-I), (B-I) et (C-2) précédemment synthétisés selon le schéma 4 ci-après :
Réactif trifonctionnel (1-2)
SCHEMA 4
Le couplage entre les précurseurs (B-I) et (C-2) a été réalisé après pré-activation du précurseur (B-I) sous forme d'ester d'hydroxybenzotriazole selon la méthode décrite par exemple dans l'article de Kônig, W. et al, Chem. Ber., 1970, 103, 788-798. L'ester activé a ensuite été mis en réaction avec le précurseur (C-I) pour conduire à un produit de couplage (21). Les aminés engagées étant sous la forme de sel de TFA, il a été nécessaire d'ajouter une base (DIEA). Le composé intermédiaire (B-l-C-2) a été purifié par chromato graphie sur gel de silice avec un rendement de 61 %. L'extrémité N-terminale du réactif trifonctionnel N-Boc (22) a été déprotégée au TFA puis convertie en carbamate activé par traitement au DSC dans le DMF anhydre en présence de TEA.
a) Première étape : Synthèse du TV-Ctert-butyloxycarbonvD-Λ^-CÇ- fluorénylméthyloxycarbonyl-aminooxy-acétyπ-L-lvsine-θ'-fS-éthvD-L-cystéine- carboxamide (21)
0,196 g (0,36 mmol) du compose (B-I) obtenu ci-dessus à l'issue de l'étape 1) a été dissous dans 3 ml d'un mélange CH3CN/DMF anhydre (2:1, v/v). 58,4 mg (0,43 mmol) d'hydroxybenzotriazole monohydraté et 89,1 mg (0,43 mmol) de DCC ont ensuite été ajoutés et le mélange réactionnel résultant a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant 2 heures sous atmosphère d'argon. Ensuite, 1 ml d'une solution de DMF contenant 106 mg (0,36 mmol) du composé (C-2) a été ajouté et le mélange réactionnel a été maintenu sous agitation à température ambiante sous atmosphère d'argon. Au bout de 2 heures, 31 μl (0,18 mmol) de DIEA ont été ajoutés. Au bout de 2 heures supplémentaires, on a à nouveau ajouté 31 μl (0,18 mmol) de DIEA. A nouveau après 2 heures supplémentaires, on a encore ajouté 31 μl (0,18 mol) de DIEA et 44,9 mg (0,18 mmol) de DCC. Le flacon contenant le milieu réactionnel a été stocké à une température de -20°C pendant une nuit. Le lendemain, une quantité supplémentaire de DIEA (31 μl, 0,18 mmol) et de DCC (44,9 mg, 0,18 mmol) a été ajoutée. Après 2 heures, on a jugé que la réaction était complète et le mélange réactionnel a été évaporé à sec. Le résidu résultant a été repris avec 25 ml d'acétate d'éthyle, lavé avec 25 ml d'une solution aqueuse d'acide citrique à 10 %, 25 ml de NaHCO3 saturé, 25 ml d'eau distillée, séché sur Na2SO4 et purifié par chromatographie sur une colonne de gel de silice (20 g) en utilisant comme phase mobile un gradient de MeOH (0-10%) dans le dichlorométhane. On a obtenu 222 mg (0,31 mmol) du composé (21) sous la forme d'une mousse blanche avec un rendement de 88 %). Analyse RMN 1H (300 MHz, CDCl3) : δ = 1,26-1,31 (t, 3H, J = 7,1
Hz, CH3(SEt) Cys), 1,42 (s, 9H, tBu), 1,51-1,92 (m, 6H, CH2 β, δ, γ Lys), 2,65-2,72 (q, 2H, J = 7,5 Hz, CH2(SEt) Cys), 3,08-3,10 (d, 2H, J= 6 Hz, CH2 β Cys), 3,26-3,33 (m, 2H, CH2 ε Lys), 4,04-4,06 (t, J = 6.0 Hz, IH, CH α Lys), 4,20-4.25 (t, J= 7,2 Hz, IH, CH Fmoc), 4,33 (s, 2H), 4,49-4,51 (d, IH, J = 6.4 Hz, CH2 Fmoc), 4,71-4,78 (q, J = 6,4 Hz, 1 H, CHa Cys), 7,26-7,78 (m, 8H, CH Fmoc).
Analyse RMN 13C (75,5 MHz, CDCl3) : δ = 14,2 (CH3(SEt) Cys), 22,3 (CH2 γ, Lys), 28,6 (CH2 δ Lys), 30,1 (CH2 (SEt) Cys), 32,4 (CH2 β Lys), 38,0
(CH2 β Cys), 39,3 (CH2 ε Lys), 46,7 (CH Fmoc), 52,3 (CH α Cys), 52,2 (CH α Lys), 68,0 (CH2 Fmoc), 76,1 (CH2), 80,8 (Cq tBu), 120,3 (Cq Fmoc), 125,1 (Cq Fmoc), 127,4 (Cq Fmoc), 128,1 (Cq Fmoc), 141,4 (Cq), 143,3 (Cq), 156,4 (Cq), 158,6 (Cq), 169,0 (Cq),172,6 (Cq), 172,8 (Cq). HPLC-PI (système B) : tR ≈ 22,3 min, pureté 84%
Analyse MS (MALDI-TOF, mode positif) m/z = 726,77 (M+Na)+, 742,74 (M+K)+ calculé pour C33H45N5O8S2-Na 726,88. b) Deuxième étape : Synthèse du produit de couplage (B-l-C-2) : l^-Q- fluorénylméthyloxycarbonyl-aminooxy-acétyl)-L-lysine-.S-(S-éthyl)-L-cvstéine- carboxamide
191 mg (0,27 mmol) du composé (21) obtenu ci-dessus à l'étape précédente ont été dissous dans 7 ml de dichlorométhane et la solution a été refroidie à 4°C. 1,2 ml (16,6 mmol) de TFA ont alors été ajoutés goutte à goutte et le mélange réactionnel résultant a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant 90 min. On a contrôlé que la réaction était complète par CCM (CH2Cl2/Me0H, 80:20, v/v) puis le mélange réactionnel a été évaporé à sec. Le résidu huileux ainsi obtenu a été dissous dans l'eau distillée et lyophilisé. On a obtenu 199 mg (0,27 mmol) du produit de couplage (B-l-C-2) sous la forme d'une poudre blanche avec un rendement quantitatif. Ce composé a ensuite été utilisé dans l'étape suivante sans purification supplémentaire.
Analyse RMN 1H (300 MHz, CD3OD) : δ = 1,26-1,28 (t, 3H, J= 3,8 Hz, CH3(SEt) Cys), 1,40-1 ,56 (m, 4H, CH2 β, γ Lys), 1,83-1,90 (m, 2H, CH2 δ Lys), 2,67-2,7 '4 (q, 2H, J = 7,2 Hz, CH2(SEt) Cys), 2,93-2,96 (d, 2H, J = 9,4 Hz, CH2 β Cys), 3,20-3,28 (m, 2H, CH2 ε Lys), 3,84-3,88 (t, J = 6,0 Hz, IH, CH α Lys), 4,23 (s, 3H, CH Fmoc, CH2), 4,46-4,48 (d, 2H, J = 6,4 Hz, CH2 Fmoc), 4,63-4,68 (q, J = 4,9 Hz, IH, CH α Cys), 7,26-7,78 (m, 8H, CH Fmoc), 8,32 (bs, IH, NH).
Analyse RMN 13C (75,5 MHz, CD3OD) : δ = 14,7 (CH3(SEt) Cys), 22,3 (CH2 γ, Lys), 30,7 (CH2 δ Lys), 32,2 (CH2 (SEt) Cys), 33,2 (CH2 β Lys), 39,5 (CH2 β Cys), 41,0 (CH2 ε Lys), 48,2 (CH Fmoc), 53,9 (CH α Cys), 54,2 (CH α Lys), 68,6 (CH2 Fmoc), 76,5 (CH2), 121,0 (CH Fmoc), 126,0 (CH Fmoc), 128,2 (CH Fmoc), 129,0 (CH Fmoc), 142,7-174,3 (Cq).
HPLC-PI (système B) : /R = 16.5 min, pureté 74%. MS (MALDI-TOF, mode positif) m/z = 604,70 (M+H)+, 626,68 (M+Na)+, 642,66 (M+K)+, calculé pour C28H37N5O6S2 603,76. c) Troisième étape : Synthèse du réactif trifonctionnel protégé Boc (22") 78 mg (0,19 mmol) du précurseur (A-I) tel que préparé précédemment à l'exemple 1 ont été dissous dans 2 ml de CH3CN anhydre. 31 mg (0,23 mmol) d'hydroxybenzotriazole monohydraté et 47,3 mg (0,23 mmol) de DCC ont ensuite été ajoutés et le mélange réactionnel résultant a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant 2 heures sous atmosphère d'argon. On a ensuite ajouté 136,4 mg (0,19 mmol) du composé (B-l-C-2) obtenu ci-dessus à l'étape précédente puis le mélange réactionnel a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant 2 heures sous atmosphère d'argon. Le ballon contenant le mélange réactionnel a été stocké à une température de -20°C pendant une nuit. Le lendemain, 32 μl (0,19 mmol) de DIEA ont été ajoutés. La réaction a été suivie par HPLC-PI (système B). Au bout de 3 heures, une quantité supplémentaire de DCC (12 mg, 58 μmol) et de DIEA (16 μl, 95 μmol) a été ajoutée. Au bout de 90 min, 16 μl (95 μmol) de DIEA ont encore été ajoutés. 2 heures plus tard, 16 μl (95 μmol) de DIEA ont été ajoutés encore une fois. La réaction a été stoppée par addition de 21 μl (360 μmol) d'acide acétique et le ballon contenant le milieu réactionnel a été stocké à une température de -2O0C pendant une nuit. Après dilution avec 2 ml d'un mélange CH3CN/H2O (2: 1, v:v), le composé (22) attendu a été purifié par HPLC-PI (système C, c'est-à-dire en utilisant une colonne Varian Kromasil® Ci8 de 10 μm et de dimensions 21,2 x 250 mm avec comme éluant un mélange d'acétonitrile et d'eau osmosée en faisant passer 90 % d'eau osmosée pendant 5 minutes puis un gradient linéaire allant de 10 à 40 % de CH3CN en 15 minutes, puis de 40 % à 70 % de CH3CN, avec un débit de 20,0 ml/min ; une double détection UV a été faite à 254 et 305 nm). Deux produits ont été obtenus et lyophilisés pour conduire respectivement à 38 mg and 66 mg de deux réactifs trifonctionnels différents (22-1) (22-2) sous la forme d'une poudre blanche avec un rendement global de 61%. Composé (22-1) = composé (22) attendu : HPLC-PI (système B): tR
= 20.8 min, pureté 86%, 66 mg.
Analyse RMN 1H (300 MHz, CDCl3) : δ = 1,25-1,30 (t, 3H, J = 7,1 Hz, CH3(SEt) Cys), 1 ,43 (s, 9H, tBu), 1,52-1,90 (m, 4H, CH2 γ, δ Lys), 2,32 (bs, 2H, CH2 β Lys), 2,64-2,69 (q, 2H, J = 7,2 Hz, CH2(SEt) Cys), 2,97-3,16 (m, 2H, CH2 β Cys), 3,30 (s, 2H, CH2 unité (A-I)), 3,45-3,65 (m, HH, CH2 ε Lys + 4 x CH2 unité (A-I)), 4,0 (s, 3H, CH2 unité (A-I) + CH Fmoc), 4,21-4,25 (q, J = 6,8 Hz, IH, CH α Lys), 4,34 (s, 2H, CH2), 4,44-4,50 (d, 2H, J = 10,0 Hz, CH2 Fmoc), 4,70-4,72 (q, IH, J = 2,3 Hz CH α Cys), 5,23 (bs, IH, NH), 6,08 (bs, IH, NH), 6,9 (bs, IH, NH), 7,26- 7,77 (m, 8H, CH Fmoc).
Analyse RMN 13C (75,5 MHz, CDCl3),: δ = 14,4 (CH3(SEt) Cys), 22,6 (CH2 γ, Lys), 27,6 (CH2 unité (A-I)), 28,5 (tBu), 28,7 (CH2 δ Lys), 31,7 (CH2 (SEt) Cys), 32,5 (CH2 β Lys), 38,6 (CH2 unité (A-I)), 38,8 (CH2 unité (A-I)), 39,6 (CH2 ε Lys), 40,4 (CH2 β Cys), 47,0 (CH2 unité (A-I)), 53,6 (CH α Lys), 68,0 (CH2 Fmoc), 70,0-71,2 (5 x CH2 unité (A-I)), 77,5 (CH2 unité (A-I)), 77,8 (CH Fmoc), 79,5 (Cq tBu), 120,2 (CH Fmoc), 125,1 (CH Fmoc), 127,3 (CH Fmoc), 128,1 (CH Fmoc), 141 ,4-173,0 (Cq).
MS (MALDI-TOF, mode positif) m/z = 1016,66 (M+Na)+, calculé pour C45H67N7Oi4S2.Na 1017,20.
Composé (22-2) (non attendu) : HPLC-PI (système B): /R = 21,6 min, pureté 79 %, 38 mg. MS (MALDI-TOF, mode positif) m/z = 871,47 (M+Na)+, calculé pour C39H56N6OnS2-Na 871,04. d) Quatrième étape : Déprotection du composé (22-1) et synthèse du réactif trifonctionnel de formule (1-2)
62 mg (0,062 mmol) du composé (22-1) obtenu ci-dessus à l'étape précédente ont été dissous dans 3 ml de dichlorométhane. La solution a été refroidie à 4°C et 368 μl, (4,96 mmol) de TFA ont ensuite été ajoutés goutte à goutte. Le mélange réactionnel résultant a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant 1 heure. On a contrôlé que la réaction était complète par HPLC-PI (système B) puis le mélange a été évaporé à sec. Une quantité minimale d'eau osmosée a ensuite été ajoutée et la solution résultante a été lyophilisée pour conduire à 83 mg (0,082 mmol) du composé (22-1) (sel de TFA) sous forme déprotégée (poudre blanche).
Ce composé a ensuite été utilisé dans les réactions suivantes sans purification supplémentaire.
HPLC-PI (système B): tR = 16,5 min, pureté 88 %. MS (MALDI-TOF, mode positif) m/z = 894,64 (M+H)+, calculé pour C40H59N7Oi2S2 894,08.
36 mg (36,7 μmol du sel de TFA du composé (22-1) déprotégé obtenu ci-dessus ont été dissous dans 500 μl de DMF anhydre. 5 μl (36,7 μmol) de TEA et une solution de DSC (24 mg, 91 ,75 μmol) dans 250 μL de DMF anhydre ont ensuite été ajoutés goutte à goutte et le mélange réactionnel à été maintenu sous agitation à température ambiante pendant 90 minutes. On a contrôlé que la réaction était complète par HPLC-PI (système B). Le mélange a ensuite été repris par environ 4 ml d'une solution aqueuse de TFA à 0,1% et purifié par HPLC-PI (système D, c'est- à-dire en utilisant une colonne Thermo Hypersil GOLD® C]8 de 5 μm et de dimensions 10 x 250 mm avec comme éluant un mélange acétonitrile/solution aqueuse de TFA à 0,1 % (v/v, pH 2) en faisant passer le mélange à 90 % de TFA à 0,1 % pendant 5 minutes puis un gradient linéaire allant de 10 à 40 % en CH3CN en 15 minutes, puis de 40 % à 70 % en CH3CN, avec un débit de 5,0 ml/min ; une double détection UV a été faite à 254 et 305 nm). Les fractions contenant le produit ont été lyophilisées pour conduire à 25 mg (24,2 μmol) du réactif trifonctionnel de formule (1-2) sous la forme d'une poudre amorphe blanche, avec un rendement de 74 %.
HPLC-PI (system B): tR = 18,5 min, pureté 97 %. Analyse RMN 1H (300 MHz, CDCl3) : δ = 1,24-1,27 (t, 3H, J = 7,1 Hz, CH3(SEt) Cys), 1,32-1,90 (m, 6H, CH2 β, γ, δ Lys), 2,63-2,69 (q, 2H, J = 7,1 Hz, CH2(SEt) Cys), 2,81 (s, 4H, 2 x CH2 succinimidyl), 2,24-3,28 (m, 2H, CH2 β Cys), 3,24-3.69 (m, HH, 5 x CH2 unité (A-I) + CH2 ε Lys), 4,22-4,27 (t, IH, CH Fmoc), 4,32 (s, 2H, CH2), 4,51-4,53 (d, 2H, J = 6,4 Hz, CH2 Fmoc), 4,58-4,66 (q, J = 7,5 Hz, IH, CH α Lys), 4,70-4,76 (q, IH, J = 6,0 Hz CH α Cys), 6,17 (bs, IH, NH), 6,83 (s, IH, NH), 7,27-7,83 (m, 8H, CH Fmoc), 9,2 (bs, IH, NH).
MS (MALDI-TOF, mode positif) m/z 1035,17 (M+H)+, 1057,71 (M+Na)+, 1073,68 (M+K)+, calculé pour C45H62N8Oi6S2 1035,69 (M+H)+
Le réactif trifonctionnel de formule (1-2) peut ensuite être fonctionnalisé par tout ligand fluorescent pour conduire au réactif trifonctionnel fluorescent correspondant.
Claims
1. Réactif trifonctionnel pseudopeptidique, caractérisé par le fait qu'il comprend au moins les trois unités structurales réactives A, B et C suivantes : (a) une unité A constituée d'une chaîne hydrophile de pseudo- poly(éthylène glycol) interrompue par au moins une fonction amide et possédant deux extrémités El et E2, ladite extrémité El étant libre et comportant un motif terminal choisi parmi le groupement amino, les carbamates activés et les esters activés, et ladite extrémité E2 comportant un atome de carbone terminal porteur d'une fonction carbonyle, ledit atome de carbone étant engagé dans une fonction amide (-C(O)-NH-) formée avec l'atome d'azote d'une fonction α-amine portée par l'unité B ;
(b) une unité B constituée d'un acide aminé choisi parmi les acides α-aminés de la série L, D et leurs mélanges racémiques, ledit acide aminé possédant sur sa chaîne latérale au moins une fonction oxyamine protégée par un groupement protecteur ou au moins une fonction aldéhydique masquée ; et
(c) une unité C constituée d'un acide aminé choisi parmi les acides α-aminés de la série L, D et leurs mélanges racémiques, ledit acide aminé possédant sur sa chaîne latérale au moins un motif thiol, maléimide, iodoacétyle, azoture, alcyne vrai, phosphane ou cyclooctyne ; lesdites unités B et C étant liées entre elles par l'intermédiaire d'une fonction amide formée entre l'atome de carbone porteur de la fonction carbonyle de l'acide α-aminé constituant l'unité B et l'atome d'azote de la fonction α-amine de l'acide α-aminé constituant l'unité C.
2. Réactif trifonctionnel selon la revendication 1 , caractérisé par le fait que la chaîne pseudo-poly(éthylène glycol) de l'unité A est choisie parmi les chaînes de formule (A-I) suivante :
(A-I) dans laquelle :
- R] représente une aminé primaire, un motif carbamate activé ou un motif ester activé,
- m et n, identiques ou différents, sont des nombres entiers compris entre 2 et 10 inclusivement,
- p est un nombre entier compris entre 1 et 10 inclusivement,
- la flèche représente la liaison covalente reliant la fonction amide de l'extrémité E2 de la chaîne pseudo-poly(éthylène glycol) à l'unité B ou C.
3. Réactif trifonctionnel selon la revendication 2, caractérisé par le fait que la chaîne pseudo-poly(éthylène glycol) est choisie parmi les chaînes pseudo- poly(éthylène glycol) de formule (A-I) dans lesquelles m = n = 2 et p = 1.
4. Réactif trifonctionnel selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que les groupements carbamates activés sont choisis parmi le carbamate de N-hydroxysuccinimidyle, le carbamate de sulfo N- hydroxysuccinimidyle, le carbamate de N-hydroxyphtalimidyle, le carbamate de N- hydroxypipéridinyle, le carbamate de jP-nitrophényle et le carbamate de pentafluorophényle.
5. Réactif trifonctionnel selon la revendication 4, caractérisé par le fait que le groupement carbamate activé est le carbamate de N-hydroxysuccinimidyle.
6. Réactif trifonctionnel selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que les groupements esters activés sont choisis parmi l'ester de TV-hydroxysuccinimidyle, l'ester de sulfo N-hydroxysuccinimidyle, l'ester de cyanométhyle, l'ester de N-hydroxyphtalimidyle, l'ester de N-hydroxypipéridinyle, l'ester de p-nitrophényle, l'ester de pentafluorophényle, les esters de benzotriazole, les esters d'hydroxybenzotriazole et les esters d'hydroxyazabenzotriazole.
7. Réactif trifonctionnel selon la revendication 6, caractérisé par le fait que le groupement ester activé est l'ester de 7V-hydroxysuccinimidyle.
8. Réactif trifonctionnel selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que les acides α-aminés utilisables pour l'unité B sont choisis parmi la lysine, l'homolysine, l'ornithine, l'acide 2,4-diaminobutanoïque et l'acide 2,3-diaminopropanoïque.
9. Réactif trifonctionnel selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'acide α-aminé de l'unité B est la lysine.
10. Réactif trifonctionnel selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que les acides α-aminés utilisables pour l'unité C, sont choisis parmi la lysine, la cystéine, l'homolysine, l'ornithine, l'acide 2,4- diaminobutanoïque, l'acide 2,3-diaminopropanoïque, l'acide aminomercapto-acétique, l'homocystéine, la 5-mercapto-norvaline, la 6-mercapto-norleucine, l'acide 2-amino-7- mercapto-heptanoïque, et l'acide 2-amino-8-mercapto-octanoïque.
11. Réactif trifonctionnel selon la revendication 10, caractérisé par le fait que l'acide α-aminé de l'unité C est la lysine ou la cystéine.
12. Réactif trifonctionnel selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que les groupements protecteurs de la fonction oxyamine de la chaîne latérale de l'acide α-aminé constituant l'unité B, sont choisis parmi les groupements 9-fluorénylméthoxycarbonyle, le benzyloxycarbonyle, l'allyloxycarbonyle, le trichloroéthoxycarbonyle, le triméthylsilyléthoxycarbonyle, le pyridyldithioéthoxycarbonyle, le 2-(2-nitrophényl)-propyloxycarbonyle, l'azométhyloxycarbonyle, le 2-(triméthylsilyl)éthanesulfonyle et le phtalimide.
13. Réactif trifonctionnel selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il est choisi parmi les composés de formule (I) suivante :
(I) dans laquelle :
- Ri, m, n et p ont les mêmes significations que celles définies à la revendication 2 ou 3 pour l'unité de formule (A-I),
- Xi et X2, identiques ou différents et conjointement avec l'atome de carbone auxquels ils sont liés, représentent la chaîne hydrocarbonée d'un acide α-amine, Proc est un groupement protecteur choisi parmi le 9-fluorénylméthoxycarbonyle, le benzyloxycarbonyle, l'allyloxycarbonyle, le trichloroéthoxycarbonyle, le triméthylsilyléthoxycarbonyle, le pyridyldithioéthoxycarbonyle, le 2-(2-nitrophényl)-propyloxycarbonyle, 1 'azométhyloxycarbonyle, le 2-(triméthylsilyl)éthanesulfonyle et le phtalimide;
- Fonc est un motif thiol, maléimide, iodoacétyle, azoture, alcyne vrai, phosphane ou cyclooctyne.
14. Réactif trifonctionnel selon la revendication 13, caractérisé par le fait que Xi est une chaîne n-butyle.
15. Réactif trifonctionnel selon la revendication 13 ou 14, caractérisé par le fait que X2 est une chaîne éthyle ou n-butyle.
16. Réactif selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisé par le fait que les composés de formule (I) sont choisis parmi les composés de formule (I- 1) et (1-6) suivantes :
(M) 
(1-2)
(1-5)
17. Utilisation d'au moins un réactif trifonctionnel tel que défini à l'une quelconque des revendications précédentes, pour la préparation d'un bioconjugué.
18. Bioconjugué, caractérisé par le fait qu'il consiste en un réactif trifonctionnel tel que défini à l'une quelconque des revendication 1 à 16, dans lequel le motif aminé primaire, carbamate activé ou ester activé présent à l'extrémité libre de la chaîne pseudo-poly(éthylène glycol) constituant l'unité A et/ou la fonction oxyamine ou aldéhydique portée par l'unité B après sa déprotection, respectivement son démasquage, est(sont) fonctionnalisé(s) par une molécule biologique d'intérêt.
19. Bioconjugué selon la revendication 18, caractérisé par le fait que la molécule biologique d'intérêt est choisie parmi les anticorps, les molécules d'acides nucléiques et leurs analogues, les polysaccharides, les protéines, les peptides, les radionucléides, les toxines, les inhibiteurs d'enzymes et les haptènes.
20. Bioconjugué selon la revendication 18 ou 19, caractérisé par le fait qu'il est choisi parmi : i) un bioconjugué constitué par un réactif trifonctionnel dans lequel seul la fonction aminé primaire ou seul le motif carbamate activé ou ester activé présent à l'extrémité libre de la chaîne pseudo-poly(éthylène glycol) constituant l'unité A est fonctionnalisé par une molécule biologique, ii) un bioconjugué constitué par un réactif trifonctionnel dans lequel seule la fonction oxyamine déprotégée ou aldéhydique démasquée de l'unité B est fonctionnalisée par une molécule biologique, et iii) un bioconjugué comportant deux molécules biologiques, constitué par un réactif trifonctionnel dans lequel le la fonction aminé primaire ou motif carbamate activé ou ester activé présent à l'extrémité libre de la chaîne pseudo- poly(éthylène glycol) constituant l'unité A et la fonction oxyamine déprotégée ou aldéhydique démasquée de l'unité B sont chacun fonctionnalisés par une molécule biologique, lesdites molécules étant identiques ou différentes l'une de l'autre.
21. Utilisation d'au moins un réactif trifonctionnel tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 16, pour la préparation d'un réactif luminescent.
22. Réactif trifonctionnel luminescent, caractérisé par le fait qu'il consiste en un réactif trifonctionnel tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 16, et qu'il comporte un seul groupement luminescent (L) fixé sur l'unité B par l'intermédiaire de la fonction oxyamine déprotégée ou de la fonction aldéhydique démasquée ou sur l'unité C par l'intermédiaire de la fonction thiol ou des motifs maléimide, iodoacétyle, alcyne vrai, phosphane, cyclooctyne ou bien encore azoture.
23. Réactif trifonctionnel luminescent, caractérisé par le fait qu'il consiste en un réactif trifonctionnel tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 16, et qu'il comporte deux groupements luminescents, l'un étant fixé sur l'unité B par l'intermédiaire de la fonction oxyamine déprotégée ou de la fonction aldéhydique démasquée et l'autre étant fixé sur l'unité C par l'intermédiaire de la fonction thiol ou des motifs maléimide, iodoacétyle, alcyne vrai, phosphane, cyclooctyne ou bien encore azoture.
24. Réactif trifonctionnel luminescent selon la revendication 22 ou 23, caractérisé par le fait que le ou les groupements luminescents sont choisis parmi les fluorophores à chaînes polyméthine ; les cyanines fluorescentes ; la fluorescéine et ses dérivés ; la rhodamine et ses dérivés ; les dérivés hydrosolubles de la rhodamine sous forme d'ester de TV-hydroxysuccinimide ; les rhodols et leurs dérivés ; les dérivés de coumarine ; les colorants fluorescents à aminés réactives ; les difluorures de bore de dipyrrométhène ; les fluorophores dérivés du pyrène ; les dérivés diazoïques ; les dérivés du danzyle ; l'éosine ; l'érythrosine et les dérivés de sulforhodamine.
25. Utilisation d'au moins un réactif trifonctionnel tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 16, pour la préparation d'une cassette de transfert d'énergie.
26. Cassette de transfert d'énergie, caractérisée par le fait qu'elle est constituée d'un réactif trifonctionnel tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 16, ledit réactif comportant un groupement luminescent (L) et un composé accepteur (Q) de la luminescence du groupement luminescent, L et Q étant respectivement et indifféremment fixés sur ledit réactif trifonctionnel via la fonction oxyamine déprotégée ou aldéhydique démasquée de l'unité B et la fonction thiol ou les motifs maléimide, iodoacétyle, alcyne vrai, phosphane, cyclooctyne ou bien encore azoture de l'unité C.
27. Cassette selon la revendication 26, caractérisée par le fait que le groupement luminescent (L) est choisi parmi les fluorophores à chaînes polyméthine ; les cyanines fluorescentes ; la fluorescéine et ses dérivés ; la rhodamine et ses dérivés ; les dérivés hydrosolubles de la rhodamine sous forme d'ester de N-hydroxysuccinimide ; les rhodols et leurs dérivés ; les dérivés de coumarine ; les colorants fluorescents à aminés réactives ; les difluorures de bore de dipyrrométhène ; les fluorophores dérivés du pyrène ; les dérivés diazoïques ; les dérivés du danzyle ; l'éosine ; l'érythrosine et les dérivés de sulforhodamine.
28. Cassette selon la revendication 25 ou 26, caractérisée par le fait que le composé accepteur (Q) est choisi parmi les groupements luminescents (L) listés à la revendication 27, les molécules non-fluorescentes de la famille des colorants azoïques, les particules d'or, les colorants diazoïques, le vert de malachite et les composés accepteurs de la famille des cyanines.
29. Cassette selon l'une quelconque des revendications 25 à 28, caractérisée par le fait que le groupement luminescent (L) et le composé accepteur (Q) sont choisis parmi les couples suivants (L/Q) : Cy3/Cy5, Cy5/Cy7, Cy5/Alexa Fluor® 750, Cy3/Cy5Q, Cy3/QSY® 7, Cy3/QSY® 9, Cy5/Cy7Q, Cy5/QSY® 21, Cy5/Cy5, Cy5.5/Cy5.5, Cy7/Cy7, R6)/Cy5, R6G/Alexa Fluor® 647, R6G/QSY® 21, Alexa Fluor® 532/Cy5, Alexa Fluor® 532/Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 532/QSY® 21, Alexa Fluor® 555/Cy5, Alexa Fluor® 555/Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 555/QSY® 21.
30. Utilisation d'un réactif trifonctionnel tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 16, pour la préparation d'un bioconjugué mixte comportant au moins une molécule biologique et au moins un groupement luminescent.
31. Bioconjugué mixte, caractérisé par le fait qu'il consiste en un réactif trifonctionnel tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 16 sur lequel sont fixés au moins une molécule biologique et au moins un groupement luminescent.
32. Bioconjugué mixte selon la revendication 31 , caractérisé par le fait qu'il comporte en outre un composé accepteur (Q) de la luminescence du groupement luminescent.
33. Bioconjugué mixte selon la revendication 31 ou 32, caractérisé par le fait qu'il est choisi parmi les réactifs trifonctionnels sur lesquels sont fixés : i) une ou deux molécules biologiques d'intérêt et un groupement luminescent ; ou ii) une molécule biologique d'intérêt, et deux groupements luminescents ; iii) une molécule biologique d'intérêt, un groupement luminescent, et un composé accepteur (Q) de la luminescence du groupement luminescent ; lesdites molécules biologiques, lesdits groupements luminescents et ledit composé accepteurs (Q) étant fixés sur le réactif fonctionnel au niveau des extrémités terminales des unités A, B et C.
34. Utilisation d'un réactif trifonctionnel ou d'un bioconjugué, modifiés ou non par un groupement luminescent au niveau de l'unité C, tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 16, 18 à 20, 22, 24, 31 et 33, et dans lesquels la fonction oxyamine ou respectivement aldéhydique de l'unité B est libre, pour la fonctionnalisation de supports solides comportant au moins une surface possédant un ou plusieurs groupements carbonylés ou respectivement une ou plusieurs fonctions oxyamine.
35. Support solide, caractérisé par le fait qu'il comporte au moins une surface fonctionnalisée, de façon covalente, par un ou plusieurs réactifs trifonctionnels, et/ou par un ou plusieurs bioconjugués tels que définis à l'une quelconque des revendications 1 à 16, 18 à 20, 22, 24, 31 et 33, lesdits réactifs trifonctionnels et bioconjugués étant éventuellement modifiés par un groupement luminescent au niveau de l'unité C.
36. Support solide selon la revendication 35, caractérisé par le fait qu'il comprend au moins une surface fonctionnalisée par au moins un bioconjugué et qu'il constitue alors une biopuce ou un biocapteur.
37. Utilisation d'un support tel que défini à la revendication 35 ou 36, pour la détection de molécules d'intérêt.
38. Utilisation d'au moins un réactif trifonctionnel tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 16, pour la préparation d'une sonde destinée à la protéomique fonctionnelle.
39. Sonde pour la protéomique fonctionnelle, caractérisée par le fait qu'elle est constituée d'un réactif trifonctionnel tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 16, ledit réactif comportant :
- un groupement permettant la détection (ou visualisation) et/ou la purification d'une protéine cible (étiquette rapporteuse ou "reporter tag"),
- un motif reconnu par ladite protéine cible (unité de reconnaissance ou "récognition unit"), et
- un groupe réactif permettant d'établir un lien de covalence avec le site actif de la protéine ciblée (groupe réactif).
40. Sonde selon la revendication 39, caractérisée par le fait que la protéine cible est une enzyme.
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