WO2009057724A1 - 血管弛緩作用を有するモロヘイヤ合成樹脂吸着画分組成物、該吸着画分組成物を含む血管弛緩剤又は飲食物及び該吸着画分組成物の製造方法 - Google Patents

血管弛緩作用を有するモロヘイヤ合成樹脂吸着画分組成物、該吸着画分組成物を含む血管弛緩剤又は飲食物及び該吸着画分組成物の製造方法 Download PDF

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    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives

Definitions

  • TECHNICAL FIELD The technical field of Morohea synthetic resin adsorbing fraction composition having vasorelaxant action, vasorelaxant or food and drink containing the adsorbing fraction composition, and adsorbing fraction composition
  • the present invention relates to a moroheia synthetic resin adsorbed fraction composition having a blood vessel relaxing action that is recovered by adsorbing a moroheiya extract solution with a synthetic resin adsorbent and elution-treating the adsorbed fraction with an elution solvent.
  • the present invention relates to a blood vessel relaxant comprising a hayer synthetic resin adsorbed fraction composition as an active ingredient, a food and drink comprising the moroheya synthetic resin adsorbed fraction composition, and a method for producing the morohea synthetic resin adsorbed fraction composition .
  • the vascular endothelium produces vascular regulatory factors such as nitric oxide (NO), and maintains and regulates vascular function by controlling vasodilation, muscle relaxation, blood fibrinolysis, and blood flow. It is known to do.
  • nitric oxide (NO) not only has a strong vasodilatory action, but also has a function of suppressing the progression of arteriosclerosis and the formation of thrombus. Therefore, the decrease in vascular endothelial function is not only a decrease in the function of the entire blood vessel, May cause arteriosclerosis and other cardiovascular diseases.
  • vascular endothelium adversely affects the vascular endothelium and reduces vascular endothelial function.
  • a vasorelaxant and a blood pressure lowering agent that do not depend on vascular endothelial function are desired.
  • General therapy is a method of treatment by weight loss, alcohol saving, exercise therapy such as aerobic exercise, and dietary therapy such as salt reduction, which is the basis for treatment of essential hypertension.
  • general therapy does not use drugs, there are advantages in terms of side effects or economic burden, but depending on the individual's willingness and the cooperative system of the surroundings, it is not always possible to achieve a certain effect on improving hypertension. There are problems such as.
  • pharmacotherapy is a therapy used for blood pressure that does not normalize with general therapy, such as when the effects of dietary therapy or exercise therapy are insufficient, or for hypertension with severe symptoms, and reliable hypotension can be expected.
  • Drugs used in pharmacotherapy range from calcium antagonists, angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors, angiotensin II receptor antagonists, diuretics, and sympathomimetic drugs. .
  • ACE angiotensin converting enzyme
  • angiotensin II receptor antagonists angiotensin II receptor antagonists
  • diuretics and sympathomimetic drugs.
  • sympathomimetic drugs since these drugs used as antihypertensive agents require long-term use, they generally have side effects such as digestive symptoms, orthostatic hypotension, and changes in metabolic function.
  • ACE inhibitors are widely known as side effects such as dry cough, dizziness, dizziness on standing, nausea, roar, and excessive sedation, which lowers QOL and causes compliance.
  • Drugs aimed at relaxing blood vessels may have side effects such as reflex tachycardia, palpitation, dry cough, hot flushes, hot flashes, and headaches. These medications need to be continued once they have been taken, and they cannot be stopped or changed in quantity at the patient's discretion, increasing the economic and mental burden. Therefore, there has been a demand for an effective therapy that has no fear of side effects, has a low economic and mental burden, can be sustained safely for a long period of time, and is effective. 2. Health foods, functional foods, health supplements, etc.
  • the sesame protein degradation product (containing sesame peptide) L eu- V a 1- T yr (L VY), which is obtained by defatting sesame and then extracting the protein and reacting with the degrading enzyme, is used as the relevant component.
  • Some have ACE inhibitory action and blood pressure lowering action.
  • dairy lactic acid bacteria beverages with ⁇ -aminobutyric acid (GABA) added are on the market.
  • G A ⁇ is a kind of amino acid, a typical inhibitory neurotransmitter, and has long been known to have a blood pressure lowering effect.
  • Tea drinks for foods for specified health use containing geniposide acid as the active ingredient are also commercially available.
  • Gelposide acid acts on the parasympathetic nerve and lowers blood pressure by smoothing blood flow.
  • Naoyuki Yamamoto et al. Reported that Yodalt produced by fermentation of lactic acid bacteria using milk as a raw material has a blood pressure lowering action under the title of “lactic acid bacteria and fermented milk products” (see Patent Document 1). .
  • milk protein, soy protein, or fish protein contains various ACE inhibitory peptides.
  • These natural product-derived ACE inhibitors are low toxic and safe.
  • the blood pressure-lowering peptides contained in these peptide groups derived from natural products are very small, In many cases, the amount of food consumed is large and the effect cannot be expected, and the ACE inhibitory activity is strong but the blood pressure lowering action is not so strong.
  • the causative substances of vasorelaxant action are clear, industrially stable production is possible, and vascular relaxants derived from natural products that are more effective and safer than conventional products. Health foods and health drinks containing them are required.
  • Morohaya (scientific name: Corchorus oitorius L.) is a kind of jute that originates in the Mediterranean region centered on Egypt, and is one of the food materials that has attracted particular attention in recent years due to its high nutritional value. Moroheiya, when minced or boiled, produces a unique slime like okra potato, which contains plant gum and viscous polysaccharides (mucopolysaccharides). Nutritionally, it is rich in vitamins and minerals, and has particularly high total rotin and calcium content. Carotene is about 12 times broccoli, vitamin B 1 is about 3 times tomato, vitamin B 2 is about 14 times pepper, calcium is about 2.4 times milk, dietary fiber is about 20 times lettuce It is said. For this reason, it has recently been cultivated in Japan, and its dry powder along with fresh leaves is gaining attention as a food material.
  • Morohaya Morohaya extract, Morohaya powder obtained by dry powdering it, so-called Morohaya extract, foods and compositions containing them, or production thereof
  • Patent Document 2 Takashi Yamamoto and others have reported a manufacturing method for extracting Morohaya extract by adding an organic acid for the purpose of lowering the viscosity of Morohaya extract for use in beverages.
  • Satoshi Inami and others have reported a composition containing an ethanol precipitate as an active ingredient in the water-soluble fraction of Morohaya leaves (see Patent Document 3).
  • this active ingredient is dietary fiber.
  • Masayuki Yoshikawa et al. Under the title of “Composition containing an aqueous extract of moroheiya”, obtained by heating and extracting moroheiya with purified water, concentrating the extract, and freeze-drying. It has been reported with respect to a composition comprising an aqueous extract of Morohaya having an essential component (see Patent Document 4). Furthermore, Masayuki Yoshikawa et al. Relates to a novel fatty acid or a salt thereof, a fatty acid extract, an isolation method thereof, and a pharmaceutical composition having an inhibitory action on nitric oxide (NO) production containing the fatty acid as an active ingredient. (Patent Document 5 3 ⁇ 4). 4. Blood pressure lowering effect of Morohaya
  • nicotianamine has been isolated as an ACE inhibitory active ingredient of Morohea extract (see Non-Patent Documents 3, 4, and 5).
  • Norio Yamaguchi et al. Have proposed a method for efficiently producing nicotianamine from an aqueous soybean extract (see Patent Document 6).
  • nicotianamine is not contained in Morohaya in a very small amount, and is actually not practical because it requires a large amount of raw materials and a complicated purification process to be used as a vasorelaxant or antihypertensive agent. A point has been pointed out.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 7-1 2 3 9 7 7
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 10-1 9 1 9 2 2
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 7-6 9 9 1 0
  • Patent Document 4 JP 2000-26305 A
  • Patent Document 5 Japanese Patent Laid-Open No. 11-322667
  • Patent Document 6 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-231 675
  • Non-Patent Document 1 J. Dairy Sci. 78: p.777-783
  • Non-Patent Document 2 J. Dairy Sci. 78: 1253 ⁇ 257
  • Non-Patent Document 4 Bulletin of Tokyo Kasei University, Vol. 38 (2), 59— 63, 1 998 “Studies on ACE inhibitors in foods”, Koichi Kimoto, Emiko Shimizu, Yuko Kuroda
  • the object of the present invention is to provide blood vessels derived from safe foods that are effective for hypertensive patients, particularly essential hypertensive patients said to account for 90% of them, and have no side effects and are suitable for long-term use. It is intended to provide a relaxing agent (vasodilator), a food or drink comprising the composition, particularly a food such as a health food or a health supplement, or a beverage comprising the same. Furthermore, it is providing the manufacturing method of those compositions. Means for solving the problem ⁇ In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have focused on Morohya, which has been attracting attention as a food material with high nutritional value in recent years, and conducted extensive studies on its blood vessel relaxing action, particularly blood pressure lowering action.
  • a morohea extract solution more preferably a morohea enzyme-treated solution obtained by treating morohaya with protease is adsorbed with a synthetic resin adsorbent, and the adsorbed fraction is eluted with an elution solvent and recovered.
  • the inventors have found that it is possible to produce a morohay synthetic resin-adsorbed fraction composition having a more excellent vasodilation or vasorelaxant action, that is, a blood pressure lowering action, and completed the present invention.
  • a drug having a vasorelaxing action is effective as a therapeutic or preventive agent for hypertension, heart failure, angina pectoris, valvular heart disease, ischemic heart disease or myocardial infarction, and particularly an antihypertensive agent.
  • the present invention is as follows.
  • a morohea synthetic resin adsorbed fraction composition having a blood vessel relaxing action which is obtained by adsorbing a moroheiya extract solution with a synthetic resin adsorbent and elution-treating the adsorbed fraction with an elution solvent.
  • moroheia synthetic resin adsorbed fraction composition as described in 1 above, wherein the morohae extract solution is a morohae enzyme-treated extract solution obtained by subjecting morohae to protease.
  • composition according to 1 to 4 above, wherein the synthetic resin adsorbent is a synthetic resin adsorbent based on an aromatic polymer.
  • Increment of amino acid amount of amino acid after acid hydrolysis, amount of amino acid before monoacid hydrolysis
  • the increment of amino acid is the concentration of mochahae synthetic resin adsorption fraction composition solution 2
  • G 1 y is more than 3 times the weight of Va 1;
  • At least one amino acid selected from Ser, A 1 a and L eu is at least 2 times the weight of Va 1, and at least one amino acid selected from Ser, A 1 a and L eu is I 1 more than 2 times the weight of e;
  • a rg is 1 weight times or more of V a 1 and A rg is 1 weight weight or more of I 1 e; 7.
  • Morohaya extract solution is adsorbed with a synthetic resin adsorbent, and the adsorbed fraction is eluted into the elution solvent.
  • moroheia extract solution is a moroheia enzyme-treated extract solution obtained by treating moroheiya with protease.
  • a vasorelaxant comprising the Morohaya synthetic resin adsorption fraction composition according to any one of 1 to 6 above.
  • a food or drink comprising the morroheia synthetic resin adsorbed fraction composition according to any one of 1 to 6 above.
  • the invention's effect is not limited
  • morohea synthetic resin adsorbed fraction composition of the present invention is derived from morohaya, which has been confirmed to be safe as food, it is extremely safe without side effects and can be taken on a daily basis.
  • the production method is very easy because the morohea extract solution is adsorbed with a synthetic resin adsorbent and the adsorbed fraction is recovered by elution with an elution solvent.
  • morroheia itself as a vegetable, its vasorelaxant action, especially blood pressure lowering action, is far superior to conventional morroheia extract that is not treated with a synthetic resin adsorbent. Are better.
  • a synthetic resin-adsorbed fraction composition having a more excellent blood vessel relaxation action, particularly a blood pressure lowering action, can be obtained. .
  • composition of adsorbing fractions of the morohea synthetic resin of the present invention is not only superior in vasorelaxant action and superior in sustainability, but also in the vascular endothelium as compared with the conventional moroheia extract that is simply extracted. Since the blood vessels are relaxed without acting on the blood vessels, the blood vessels can be relaxed and the blood pressure can be lowered without depending on the vascular endothelial function reduced by arteriosclerosis or other cardiovascular diseases.
  • Morohaya is a plant rich in vitamins, minerals, and dietary fiber, and has a high nutritional value, so when compared with a conventional plant that isolates and purifies a single component that has vasorelaxant and blood pressure lowering effects, When the synthetic resin-adsorbed fraction composition of the invention is ingested, a plurality of components can be ingested simultaneously, and further effects can be expected.
  • Moroheiya because it is made from the natural plant Moroheiya, it is inexpensive and highly safe, so it can be used in medicines, foods, especially foods for specified health use, health foods, vegetable juices, etc. Is preferred. Brief Description of Drawings Little. Fig. 1 shows changes in systolic blood pressure due to administration of Morohaya extract (A, B, B '. No adsorption treatment). (Test Example 1)
  • Fig. 2 shows changes in diastolic blood pressure due to administration of Morohaya extract (A, B, B '. No adsorption treatment).
  • Fig. 3 is a graph showing heart rate variability after administration of Morohaya extract (A, B, B '. No adsorption treatment). (Test Example 1)
  • Fig. 4 is a graph showing the mean blood pressure change by administration of Morohaya extract (A, B, B '. No adsorption treatment). (Test Example 1)
  • FIG. 5 is a diagram showing diurnal variation in systolic blood pressure in SHR rats.
  • FIG. 6 is a graph showing the effect of an enzyme-treated moroheiya extract (C. no adsorption treatment) prepared from moroheiya puree on blood pressure fluctuations. (Test Example 1)
  • FIG. 9 is a graph showing the effect of Moroheiya protease-untreated extract on the blood pressure fluctuation of synthetic resin-adsorbed fraction extract Ae2. (Test Example 2)
  • FIG. 8 is a graph showing a comparison of the effects of synthetic resin adsorbed fraction extracts (through fraction Bel and adsorbed fraction Be2) on blood pressure fluctuations. (Test Example 3)
  • FIG. 9 is a graph showing the effect of the moroheia enzyme-treated extract (B) before purification with an adsorbent on blood pressure fluctuations. (Test Example 3)
  • FIG. 10 is a graph showing an increase in adsorbed fraction extract due to protease treatment of Morohaya leaves. (Test Example 4)
  • FIG. 11 is a graph showing blood pressure lowering action by single administration of Morohaya synthetic resin adsorption fraction extract B e 2. (Test Example 5)
  • FIG. 12 is a graph showing the suppression effect on blood pressure increase by long-term administration of Morohaya synthetic resin adsorbed fraction extract B e 2. (Test Example 6)
  • Fig. 13 is a diagram showing the results of measuring the ACE inhibitory activity of Morohella synthetic resin adsorbed fraction extract B e 2 (Test Example 7).
  • Fig. 14 is a diagram showing the vasorelaxant action of Morohella synthetic resin adsorbed fraction extract B e 2. (Test Example 7)
  • FIG. 15 is a diagram showing the vasorelaxant action of the purified morohaya synthetic resin adsorbed fraction extract. (Test Example 7)
  • FIG. 16 is a graph showing changes in heart rate after administration of the purified Morroheia synthetic resin adsorbed fraction extract. (Test Example 8)
  • FIG. 17 is a diagram showing the vasorelaxing action of each fraction of purified Morroheia synthetic resin adsorbed fraction extract Be 2.
  • FIG. 18 is a diagram showing the results of a confirmation test on the amino acid composition of the protein in the moroheiya synthetic resin adsorbed fraction composition. (Test 9)
  • FIG. 19 is a diagram showing that Morohaya synthetic resin adsorbed fraction extract B e 2 has an action of relaxing blood vessels without depending on vascular endothelium.
  • the morohaya synthetic resin adsorbed fraction composition of the present invention can be obtained by adsorbing a morohea extract solution with a synthetic resin adsorbent and then eluting the adsorbed fraction with an elution solvent.
  • the morohea extract solution as a raw material can be obtained, for example, by adding water or warm water to the morohaya leaf and extracting it. Specifically, water or warm water is added to the moro-hay leaves from which the hard stalks have been removed, and then steam heating is applied to break the frame, and then the crushed mogu-haha leaves are dried with hot air. Therefore, it can be obtained by adding 10 to 40 times, preferably about 20 to 30 times the weight of distilled hydrothermal water to the dried morohea leaves.
  • moroheiya any part of the above-ground part excluding seeds may be used, but a leaf part from which a hard stem part has been removed is particularly preferred. After steam heating, crush and dry with hot air , 0 is preferably used as a material, but the method for preparing the dried leaf is not particularly limited, and a commercially available product can be used if necessary.
  • undried materials such as fresh leaves of moroheiya and puree.
  • it can be conveniently obtained by dissolving a commercially available morohea extract powder in water or warm water, or it may be extracted from morohea puree.
  • the morohaya extract solution is an aqueous solution containing the morohea extract component, and the morohaya extract solution from the morohaya leaf solution obtained by mixing the morohaya water solution, that is, water or warm water with the morohaya leaf solution.
  • it means a morohea extract solution or morohea puree aqueous solution in which morohea extract powder is dissolved in water.
  • Preferred is a moroheia enzyme-treated extract solution that has been subjected to protease treatment.
  • Protease treatment can be obtained by allowing a proteolytic enzyme, ie, protease, to act on a morohea extract, morohaya extract solution or morohya puree solution in which morohea extract powder is dissolved in water.
  • a proteolytic enzyme ie, protease
  • the morohea extract solution or morohea enzyme-treated exhalation solution thus obtained is adsorbed with a synthetic resin adsorbent, passed through the synthetic resin adsorbent, pushed with water, and then passed, for example, 60% ethanol. By recovering and recovering it as a liquid, it can be recovered as a resin-adsorbed fraction, thereby obtaining the desired morohea synthetic resin-adsorbed fraction composition.
  • a synthetic resin adsorbent By elution treatment with a solvent, an elution solvent suitable for the synthetic adsorbent used can be selected.
  • an aromatic synthetic resin adsorbent when used, a large amount of water or warm water may be used, and 50 to 70%, preferably 55 to 65% for increasing efficiency. Ethanol diluted with water to a concentration can be used. More specifically, after passing the morohea extract solution or the morohea enzyme-treated extract solution through the synthetic resin adsorbent packed column, the column discharge liquid is Brix 1% or less, preferably Brix 0.5, as measured by Brix. The adsorbed fraction may be recovered by thoroughly washing with pure water or the like so as to be less than% and then eluting with an elution buffer such as ethanol of an appropriate concentration.
  • an elution buffer such as ethanol of an appropriate concentration.
  • the adsorbate can be efficiently recovered by passing the liquid in an amount of 1 to 10 times the volume, more preferably 1 to 5 times, and even more preferably 1 to 2.5 times.
  • the adsorbate can be recovered by washing with pure water and then passing 3 times the resin volume.
  • the filtration operation may be performed by suction filtration using ⁇ ⁇ 2 filter paper after filtration through a sieve with an opening of 850 ⁇ .
  • a further purified adsorption fraction or composition it can be further purified using cation exchange column chromatography or gel filtration chromatography.
  • the solution recovered from the fraction can be concentrated under reduced pressure to an appropriate concentration, or it can be lyophilized and stored as a powder.
  • the production method of the fraction treatment composition of the present invention is as shown in the following table.
  • Moroheiya Production Picking Cut'Trimming ⁇ Washing—Steam Branching ⁇ Dehydration—Hot Air Drying—Crushing—Hydrolysis—Heating ⁇ Microbial Protease Enzyme Treatment (—Enzyme Deactivation) ⁇ Solid-Liquid Separation—Filtration—Synthetic Adsorbent Column Flow-water push- 60% ethanol flow (at the same time recovering the discharged liquid as an adsorbed fraction) ⁇ vacuum concentration ⁇ lyophilization The moroheiya synthetic resin adsorbed fraction obtained in this way is used after removing the alcohol. It can be used as a beverage or in other fruit juices, vegetable juices, or mixed juices.
  • the synthetic resin adsorbent used may be either a hydrophilic synthetic resin adsorbent or a hydrophobic synthetic resin adsorbent. In order to recover a composition having an effective vasorelaxant action, particularly a blood pressure lowering action.
  • a preferable adsorbent is a hydrophobic synthetic resin adsorbent.
  • Examples of the resin matrix of the hydrophobic synthetic resin adsorbent include a styrene polymer, a styrene-divinylbenzene copolymer, a styrene-acrylic acid amide copolymer, and a phenol resin.
  • a preferred synthetic resin adsorbent is a porous adsorbent suitable for adsorbing water-soluble low-molecular substances, specifically, a porous modified polystyrene synthetic adsorbent, that is, an aromatic resin such as styrene.
  • porous modified polystyrene-based synthetic adsorbent obtained by chemically modifying and bonding a polar group such as bromine to the base.
  • porous synthetic adsorbents with a large surface area are preferred! /.
  • the specific surface area of the synthetic resin adsorbent is 100 to 1200 mg, preferably about 250 to 900 m 2 Zg.
  • the preferable pore volume, particle size distribution, and most frequent radius of the synthetic resin adsorbent are 0.9 to L: 6 mL / g, respectively, 250 m or more is 90% or more, and 30 to 260 angstroms.
  • Sepabeads registered trademark; Mitsubishi Chemical Corporation
  • These synthetic resin adsorbents may be pre-treated prior to the adsorption treatment.
  • the adsorbent can be washed with a solvent such as methanol to remove impurities, and further washed with water to remove the solvent such as methanol.
  • the treatment with these adsorbents can be carried out by either the batch method or the column method, but the column method that can efficiently treat with a relatively small amount of adsorbent is preferred.
  • the treatment with the adsorbent may be performed at least once.
  • the ratio between the adsorbent and the extract can be selected according to the type of adsorbent used.
  • the morohea extract solution as an object of the synthetic resin adsorption treatment is not particularly limited as long as it is a solution containing a morohea extract component, particularly an aqueous solution.
  • a morohaya enzyme-treated extract solution that has been subjected to a proteolytic enzyme, that is, a protease treatment, further excellent vasodilation or vascularization It is possible to bring about a relaxing action, that is, a blood pressure lowering action.
  • a morohea enzyme-treated extract solution subjected to such protease treatment can be obtained as follows.
  • Morohaya enzyme-treated extract solution is Morohaya water solution, that is, Morohaya extract from Morohaya leaf solution in which Morohaya leaves are mixed with water or warm water, Morohaya extract aqueous solution or Morohaya puree solution in which Morohaya extract powder is dissolved in water. It can be obtained by reacting a protease with a protease. For example, in the case of Morohaya leaves, water or warm water is added to Morohaya leaves from which the hard stem portion has been removed, and then steam heating is performed to crush the leaves.
  • hot water of about 10 to 40 times, preferably about 20 to 30 times the weight of distilled water is added to the dried mouth-leaved leaves obtained by drying the crushed morohaya leaves with hot air. To do. Then, after heat sterilization at a temperature of 95 ° C or higher, cool to an appropriate temperature and dry the raw material with an appropriate amount of protease dissolved in a small amount of water while keeping the liquid temperature in the water bath. Appropriate amount is added to the weight of leaf or dry leaf. After adding the protease, stir every 10 minutes, 30 minutes to 2 hours, preferably 45 minutes to 90 minutes after the addition of the protease, and after 5 minutes to 90 minutes at 95 ° C to boiling S.
  • Protease is inactivated by holding for 0 minutes, filtered through a sieve with an opening of 8500 ⁇ , and suction filtered using No. 2 filter paper to obtain a moroheia enzyme-treated extract solution. It can.
  • a solution after filtration preferably a solution from which at least solid-liquid separation is performed to remove Morohaya leaves or the like is used.
  • Treatment conditions such as solution temperature, enzyme concentration, and pH for protease treatment may be adjusted so that the protease to be used works optimally.
  • the enzyme used for preparing the morohea enzyme-treated solution there are no particular limitations on the enzyme used for preparing the morohea enzyme-treated solution, as long as it is a protease enzyme, but preferred is an endopeptidase or a complex enzyme mainly composed of an endopeptidase. A plurality of enzymes can also be used in combination.
  • the proteolytic enzyme or protease used in the present invention is a peptide bond hydrolysis product.
  • An enzyme that catalyzes a reaction is preferably an endo-type enzyme or an end-type complex enzyme.
  • proteolytic enzymes produced by the genus Bacillus are more preferable.
  • proteolytic enzymes produced by Bacillus subtilis and Bacillus thermoproteolyticus are more preferable.
  • a combination of multiple enzymes can also be used.
  • P H when the protease treatment, treatment temperature, treatment time, treatment concentration is not particularly limited, may be appropriately selected depending on the enzyme used.
  • treatment concentration is 0. 1 to 1.0 wt 0/0 are preferred.
  • treatment concentration is the dry weight of Morohaya. 0.1 to 1.0% by weight is preferred.
  • the enzyme is deactivated by heating, and solid-liquid separation is performed by any method such as filtration, and the extract is recovered.
  • the method for deactivating the enzyme is appropriately selected depending on the enzyme used, but can be performed by heating, for example, it can be left at 95 ° C to boiling for 5 to 10 minutes.
  • “Moguchiha synthetic resin adsorbed fraction composition” refers to a synthetic resin adsorbent obtained by treating a moroheiya extract solution, preferably a morohaea proteolytic enzyme-treated extract solution with a synthetic resin adsorbent, and separating the adsorbed fraction by solution separation. It means a fraction composition, specifically, a moorhae extract, which is obtained from a moorhaha leaf solution obtained by mixing mochahaha leaves with water or warm water.
  • Spilled solution a mohair hay extract aqueous solution in which morohea extract powder is dissolved in water or a morohea extract solution such as morohea puree solution, or a morohea enzyme-treated extract solution obtained by subjecting these to protease treatment is adsorbed with a synthetic resin adsorbent
  • a synthetic resin adsorbed fraction composition obtained by elution treatment by passing through a synthetic resin adsorbent and pushing it with water, and then recovering by passing, for example, 60% ethanol.
  • These synthetic resin adsorbed fraction compositions may be in liquid or solid form, and the synthetic resin adsorbed fraction liquid itself, a concentrated concentrate obtained by concentrating it, and a powder obtained by freeze-drying them, or A tablet formed by solidifying powder may be used.
  • a morohea extract solution or a morohea enzyme-treated extract solution obtained by subjecting these to a protease is adsorbed with a synthetic resin adsorbent, and the adsorbed fraction is eluted with an elution solvent.
  • the synthetic resin adsorbed fraction composition and the dried and powdered composition may be referred to as a moroheiya fractionation treatment kiss or fractionation treatment kiss, or an adsorption treatment exhalation or adsorption fraction extract.
  • an elution solvent suitable for the synthetic resin adsorbent to be used can be selected.
  • an aromatic synthetic resin adsorbent is used, a large amount of water may be used, and in order to increase efficiency, water is added to a concentration of 50 to 70%, preferably 55 to 65%. Diluted ethanol can be used.
  • morohaya fractionation treatment solution and the concentrated solution obtained by concentrating it can be used as beverages after being subjected to phenol recall, or mixed with other soft drinks such as fruit juice and vegetable diuse.
  • the Morohaya synthetic resin adsorbed fraction composition composed of a lyophilized powder or solid tablet can be used as a health food, a functional food, a health supplement, etc., as well as a soft drink or food. It can be used as a compounding agent.
  • the morohaya synthetic resin adsorbed fraction composition of the present invention can be effectively used as a food, a food additive, or a packaged beverage in addition to a pharmaceutical.
  • Preferred forms of foods and drinks containing the moroheiya synthetic lunar adsorbed fraction composition of the present invention include: koji, jelly, tablet confectionery, beverages, soup, koji containing the synthetic resin adsorbed fraction composition Foods and beverages such as rice crackers, Japanese confectionery, frozen confectionery, baked confectionery, etc., particularly preferably a fruit juice beverage comprising the synthetic resin-adsorbed fraction composition, It is a packaged beverage such as vegetable juice, fruit vegetable juice, tea beverage, coffee beverage, sports drink.
  • the moroheiya synthetic resin adsorbed fraction composition obtained in the present invention has little taste and odor specific taste, it can be ingested by oral administration in liquid or solid form.
  • it can be mixed with excipients and administered in the form of powder, granules, tablets, capsules and the like.
  • the intake varies depending on the age and blood pressure level, but is usually 10 mg to 2000 mg at a time in powder conversion, preferably 50 mg to 1 000 mg at a time, more preferably 100 mg to 50 Omg at a time.
  • the effect can be obtained with 1 to 3 intakes per day, but the number can be increased as needed.
  • it is 50 mg to 2500 mg, more preferably 100 mg to 80 Omg per 500 mL.
  • the mocha hae synthetic resin adsorbed fraction composition obtained by the present invention is administered in the form of powder, granules, tablets, capsules or the like as such or mixed with excipients or the like as appropriate for the convenience of formulation. be able to.
  • it can be added to various foods such as rice cakes, jelly, tablet confectionery, beverages, soup, rice cakes, rice crackers, Japanese confectionery, frozen confectionery, baked confectionery, and ingested.
  • it is used by blending an appropriate amount with other foods and beverages, particularly preferably vegetable juice, fruit juice, vegetable fruit juice mix juice, tea beverage, coffee beverage, sports drink and the like. In this way, not only can the nutrients contained in vegetable juice etc. be taken on a daily basis, but also hypertensive consumers can take blood pressure elevation suppressors very naturally.
  • the examination of the blood pressure lowering effect of the mocha haeha synthetic resin adsorbed fraction composition of the present invention is to orally administer the moroheia extract of the present invention to spontaneously hypertensive rats, and measure the blood pressure before and after administration. Went by.
  • the mechanism of the vasodilatory / relaxation action, that is, the blood pressure lowering action, of the composition of adsorbing fractions of the moroheia synthetic resin of the present invention is the nicotine included in the moroheia leaves that have been reported so far. It was also confirmed that it was not due to the ACE inhibitory activity that anamin had, but due to vasorelaxation and vasodilation. That is, it was confirmed that the blood pressure lowering action of the morohaya enzyme-treated kiss of the present invention is not due to nicotianamine contained in the morohaya leaf. The present invention has been completed based on these new findings.
  • the action and effect of the moroheiya synthetic resin adsorbed fraction composition of the present invention were examined in detail, it decreased well particularly for high blood pressure, and slightly decreased blood pressure for slightly higher blood pressure. It was found that the effect was effective according to the degree of hypertension. In addition, it was confirmed that long-term administration can suppress an increase in blood pressure, that blood pressure does not increase suddenly even when administration is stopped, and that there is no sudden rebound due to forgetting to take it. It was. Thus, the synthetic resin-adsorbed fraction composition of the present invention has extremely high safety as well as effectiveness.
  • the mocha hae synthetic resin adsorbed fraction composition of the present invention is obtained by treating a moro hae extract solution, preferably an moro haeya proteolytic enzyme treated extract solution with a synthetic resin adsorbent, and easily separating the adsorbed fraction containing the active ingredient by solution separation. It can be obtained after separation and purification, and its vasorelaxant action, especially blood pressure lowering action, is stronger compared to the conventional Morohaya extract, which has not been treated with Morohaya leaves themselves or a synthetic moonlight adsorbent.
  • the vasorelaxant of the present invention is useful as a therapeutic or preventive agent for hypertension, heart failure, angina pectoris, valvular heart disease, ischemic heart disease or myocardial infarction, particularly as a blood pressure lowering agent.
  • Morohaya is a plant rich in vitamins, minerals, dietary fiber and high nutritional value. Therefore, when compared with a single component that has a blood pressure lowering effect, it is Since the hayer synthetic resin adsorbed fraction composition contains a plurality of components, further effects can be expected.
  • morohea fractionated extract of the present invention is not only effective but also highly safe, so that it can be used for beverages such as pharmaceuticals, foods, especially foods for specified health use, health foods, vegetable juices, It is particularly suitable for packaged beverages and the like. ⁇
  • moroheiya synthetic resin adsorbed fraction composition of the present invention As a result of further detailed analysis of the moroheiya synthetic resin adsorbed fraction composition of the present invention, it was divided into four fractions depending on the molecular weight (R> S 1> S 2> T), of which the molecular weight was A small fraction (S 2 and T) was found to have a strong blood pressure lowering effect. The fraction was found to contain adenine. The same purine bases, guanosine and adenosine, are contained in trace amounts and are not contained in the morohaya fractionation treatment kiss of the present invention.
  • Morohaya leaves from which hard stems had been removed were steam-heated and then ruptured and dried with hot air to obtain dried morohair leaves.
  • Distilled hydrothermal water around 60 ° C with a weight of 20 times is added to 50 g of the dried morohea leaves, heated to 95 ° C or higher, sterilized, and then cooled to 60 ° C. Stirring was carried out every 10 minutes while the liquid temperature was kept at 60 ° C in a water pass. After 1 hour, hold at 95 ° C for 5 minutes, filter with a sieve with an opening of 8500 ⁇ , and then suction filter with No. 2 filter paper to obtain a moroheiya extract solution It was. This extract solution was concentrated under reduced pressure and then freeze-dried to obtain 6.8 g of a brown powder. It is a so-called conventional Moroheiya extract. Hereinafter, this powder is referred to as “A”.
  • Synthetic adsorbent wet with pure water S P 2 0 7 (Mitsubishi Chemical Co., Ltd.) 80 c c was packed into a glass column, and + min. Pure water was passed through to form a S P 2 0 7 packing power ram.
  • Morohaya leaves from which hard stems had been removed were steam-heated, crushed and dried with hot air to obtain dried Morrohair leaves.
  • Distilled hydrothermal water around 60 ° C, about 20 times the weight is added to 50 g of the dried leaves of this morohea, sterilized by heating to 95 ° C or higher, cooled to 60 ° C, and then liquidized in a water bath. While maintaining the temperature at 60 ° C., 0.7% by weight of Protease Namano G (manufactured by Amano Enzyme Co., Ltd.) was dissolved in a small amount of water and added to the raw dried Moroheiya leaves. Thereafter, stirring was carried out every 10 minutes while maintaining the liquid temperature at 60 ° C.
  • Morohaya adsorbed fraction extract _Be (with protease treatment, with SP 207 adsorption treatment)
  • 80 cc of synthetic adsorbent SP 207 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) in a wet state in pure water was packed into a glass column, and sufficient pure water was passed through to form a SP 207 packed column. 1
  • the treated extract solution 30 OmL (Brix 1.2, pH 6.0) was passed through the glass column at the rate of SV-4, and then the moroheiya extract was sufficiently washed out with 10 bed volumes of pure water.
  • the column effluent was collected immediately after the start of the passage of the morohaya enzyme-treated extract solution, and used as a passing-through fraction.
  • 5 bed volumes of ethanol adjusted to 60% concentration were passed through.
  • the 1Z2 bed volume of column effluent was discarded, and then collection of the column effluent was started and collected until the end of the flow of ethanol. This was taken as an adsorption fraction.
  • the flow-through fraction and the adsorbed fraction were each concentrated under reduced pressure and then lyophilized to obtain a powdery flow-through fraction extract (Bel) 2.1 g and an adsorbed fraction extract (Be 2) 0.8 g Got.
  • Synthetic adsorbent SP 70 wet from pure water (Mitsubishi Chemical Co., aromatic synthetic adsorbent) 80 cc is packed into a glass column, and enough pure water is passed through to form an SP 70 packed column.
  • Morohaya leaves from which hard stems had been removed were steam-heated, crushed and dried with hot air to obtain dried Morrohair leaves.
  • Distilled hydrothermal water around 60 ° C, about 20 times the weight is added to 50 g of the dried leaves of this morohea, sterilized by heating to 95 ° C or higher, cooled to 60 ° C, and then liquidized in a water bath. The temperature was kept at 60 ° C., and 0.7% by weight of Samoaise Y10 (manufactured by Yamato Kasei) was dissolved in a small amount of water and added to the raw dried Moroheiya leaves. Thereafter, stirring was performed every 10 minutes while maintaining the liquid temperature at 60 ° C.
  • Synthetic adsorbent wet in pure water SP 207 (Mitsubishi Chemical Co., Ltd.) 1 500 cc is filled into a glass power ram, and sufficient pure water is passed through to form an SP 207 filling power ram.
  • the moroha leaf stalk from which the stem was removed was steam-branched, crushed into a puree, and stored frozen.
  • This frozen puree was thawed in running water, and 1.5 times the weight of distilled water (1500 g) was added to 1000 g of puree, and mixed uniformly with a juicer mixer.
  • ethanol adjusted to 60% concentration After discarding the 1/2 bed capacity column effluent, start collecting the column effluent and collect it until the end of the ethanol flow. This is the adsorption fraction.
  • the flow-through fraction and the adsorbed fraction were each concentrated under reduced pressure and then lyophilized to obtain 2.1 g of a flow-through fraction extract (Cel) and 0.9 g of an adsorbed fraction extract (C e 2).
  • Morohaya adsorbed fraction extract De2 (with enzyme treatment, with SP 850 adsorption treatment); synthetic resin adsorbent wet with pure water SP 850 (Mitsubishi Chemical Corporation, aromatic synthetic adsorbent) 80 cc glass column And add enough pure water to make an SP 850 packed column.
  • Spontaneous hypertensive rats were used to examine the antihypertensive effect after a single administration.
  • 1 Omg / kg of powdered morohea extract A, enzyme-treated extract B, enzyme-treated extract B, and enzyme-treated extract C obtained in Examples 1, 2, 3 and 5 before the adsorption treatment.
  • SHR body weight In water for injection, powders A, B, B, 17-week-old (male) for powder A, 18-week-old (male) spontaneously hypertensive rat (SHR / Ho) s, SPF) was administered orally using a gastric tube. Blood pressure was measured noninvasively before administration, 4 hours after administration, 8 hours, and 24 hours after administration. The number of animals used in the study is shown in the table below. In addition, although 7 mice were used for each group, data on individuals that clearly showed abnormal blood pressure fluctuations were deleted.
  • Figure 1 shows the changes in systolic blood pressure up to 24 hours after administration.
  • Figure 2 shows changes in diastolic blood pressure up to 24 hours after administration.
  • Figure 3 shows heart rate fluctuations up to 24 hours after administration. Dosing 2
  • Figure 4 shows the change in mean blood pressure up to 4 hours later.
  • Figure 5 shows the diurnal variation in systolic blood pressure of SHR up to 24 hours after administration.
  • Example 2 (B) and Example 3 (B ′) above the enzyme-treated extract obtained by treating molhaea leaves with a proteolytic enzyme does not undergo enzyme treatment. It exhibited a stronger blood pressure lowering effect than conventional extracts obtained from leaves. In each figure, each value represents an average value.
  • Figure 6 shows the changes in systolic blood pressure and diastolic blood pressure up to 24 hours after administration.
  • FIG. 9 shows the change in mean blood pressure up to 4 hours after administration of the protease-treated powder B (with enzyme treatment, without resin adsorption treatment) obtained in Example 2. From FIG. 8, it was shown that the adsorbed fraction showed a stronger blood pressure lowering action than the pass-through fraction, and that the effect persisted until 24 hours later. Compared with the results in Fig. 9, the adsorbed fraction has a continuous blood pressure lowering action and is superior in the blood pressure lowering action.
  • the yield was 6.4 times higher than that of the example without enzyme treatment.
  • the ratio of the adsorbed fraction to the soluble solid content (solution volume XB rix measured value ⁇ 1 0 0) calculated from the Bri x measured value of the solution subjected to each adsorption treatment is calculated by the following equation. .
  • Adsorbed fraction / (Amount of soluble solid content calculated from Brix measurement value) X 1 0 0 (%)
  • the ratio of these adsorbed fractions in this example is obtained when the enzyme treatment is not performed as a result of measurement.
  • Example 1 In Example 4, it was 10.7%, and in Example 4, it was 5.8%.
  • Example 2-3 On the other hand, when synthetic resin was adsorbed on the enzyme-treated ex, Example 2-3 was 19%, and Example 2-2 was 2 2.
  • Example 3_2 was 19.3%
  • Example 5 was 18.8%
  • Example 6 was 15.7%.
  • the solution filtered through No. 2 filter paper after solid-liquid separation was used to measure the adsorbed fraction obtained by this patented method by Brix measurement of the solution. It can be defined as a composition containing 15% or more of the soluble solid content calculated from the value (measured value of solution volume XB rix ⁇ 100).
  • the amount of the synthetic adsorbent to be used may be an amount that can sufficiently adsorb the adsorbing component in the solution to be passed, and preferably 1 Z 8 of the volume when the solution to be passed is Bri x 1%. Use more than double the amount of synthetic adsorbent.
  • the adsorbed fraction excellent in blood pressure lowering action was 0.29 g in the fraction extract A e of Example 1 that was not subjected to the protease treatment
  • the amount was 0.8 g, which was about 2.8 times higher in the case where the enzyme treatment was performed than in the case where the enzyme treatment was not performed.
  • the ratio of the adsorbed fraction to the total solid content (through fraction + adsorbed fraction) in each example was 10% with the fraction extract A e 2 of Example 1 and the fraction of Example 2 Minute extract B e 2 22.
  • the adsorbed fraction extract Be 2 of Example 2 was orally administered to 5-week-old male SHR / Hos once a day for 56 days for 90 mg mg Zkg (weight of SHR).
  • the control group was similarly given water for injection.
  • the results are shown in Figure 12. Each value represents an average value.
  • “*” indicates that there was a statistically significant difference at a risk rate of 5% or less compared to the control group.
  • “**” indicates that there was a statistically significant difference with a risk rate of 1% or less compared to the control group.
  • pentobarbital 50 mgZkg, ip
  • I I induction body surface electrocardiograms
  • angiotensin I changed to angiotensin I I by the action of angiotensin converting enzyme (ACE) in the living body, and increased blood pressure.
  • ACE angiotensin converting enzyme
  • Morohaya adsorbed fraction extract Be2 of Example 2 was further subjected to cation exchange treatment, and a further purified extract (see Example 7) obtained as the adsorbed fraction was administered into the duodenum (500 mgZkg).
  • Morohaya adsorbed fraction EX of the present invention has no conventionally reported ACE inhibitory activity. Therefore, further studies were conducted to elucidate the mechanism of blood pressure reduction.
  • a ring-like specimen was prepared using the thoracic aorta extracted from male SD rats, and the vascular tension was measured in oxygenated 37 ° C TVi'ode solution.
  • vasoconstriction Ph e O. 1 ⁇
  • phenylephrine a vasoconstrictor
  • Morohaya adsorbed fraction extract ⁇ e 2 of Example 2 100, 300, 1000, 3000 ⁇ g ZmL
  • the presence or absence of vasorelaxant action was observed.
  • the result is shown in FIG.
  • a similar experiment was also conducted on the extract used in 1 of Test Example 7 which was further purified. The results are shown in Fig. 15.
  • the tension when Phenylephrine was added was set to 100%, and the blood vessel was relaxed when the tension was lowered.
  • the moroheiya extract of the present invention showed a statistically significant relaxing action at 1000 g / mL or more. Therefore, it has been clarified that the action mechanism of the blood pressure lowering action of the moroheia adsorbed fraction extract of the present invention is based on the vasorelaxant action. This is new knowledge about moroha.
  • the moroheiya adsorbed fraction extract of the present invention showed a statistically significant relaxation effect from 1000 ⁇ gZ mL.
  • the further purified product showed a statistically significant relaxation effect from 500 ⁇ g / mL. Each value indicates the average soil standard error.
  • Extract R Extract S-1 Extract S-2 Extract T
  • Morohaya adsorbed fraction extract Be2 was prepared. After that, 28.4 g of the above adsorbent fraction was used to extract extract R (11.1) from the fraction with a large molecular weight by cation exchange column chromatography using PK 208 resin and gel filtration chromatography using HW40EC resin. 1 2 g), extract S-1 (3.48 g), extract S-2 (1.39 g), and extract T (1.36 g). When each of the fractions was compared for vasorelaxant action, S-2 and T were observed to have a strong vasorelaxant effect S. The results are shown in Fig. 17.
  • flavonoid derivatives such as isoquinolecitrin and hyalin perine peak. As detected. Adenine was detected in the S-2 fraction.
  • Drugs that dilate blood vessels such as hydralazine are known to have an increased reflex heart rate that accompanies a decrease in vascular resistance.
  • Increasing reflex heart rate leads to tachycardia, increased heart rate, intrathoracic distress, paradoxical blood pressure increase, palpitation, etc., leading to decreased patient quality of life and compliance with drug use.
  • Morohaya has the effect of relaxing excessively contracted blood vessels. Therefore, changes in the heart rate analogy at the time of administration of the further purified extract used in Test Example 7 were confirmed.
  • the heart rate at the time of administration of the further purified extract used in Test Example 7 was 426.33 B.
  • the amino acid increment that is, the amount of amino acids constituting the water-soluble protein can be confirmed, but it is higher in the adsorbed fraction. This means that most water-soluble proteins are separated into adsorbed fractions. I can say that.
  • the derived composition is a material that can be expected to have the functionality of these raw protein proteins.
  • the morohea synthetic resin adsorbed fraction composition of the present invention in particular, the morohea synthetic resin adsorbed fraction composition obtained by synthetic resin adsorbed fractionation of the morohea enzyme-treated extract solution is calculated by the following formula (A). It was revealed that each amino acid concentration satisfies all the requirements of the following formulas (1) to (3).
  • Amino acid increment Amino acid amount after acid hydrolysis Amino acid amount before monoacid hydrolysis
  • the amino acid increment is 0.5 mL of 6 N hydrochloric acid added to 2 mL of Moguchiha synthetic resin adsorbed fraction composition solution of any concentration, and autoclaved at 1 2 1 ° C for 3 hours. This means the increment of amino acid when the above treatment is performed.
  • G1y is 3 times or more of V a1 and G1y is 3 times or more of I1e;
  • Sej at least one amino acid selected from A1a and Leu Is V a 1
  • a test on vasorelaxant activity was conducted in item 2 of Test Example 7.
  • a ring-shaped specimen was prepared using the rat thoracic aorta and an oxygenated nutrient solution The following tests were conducted on the blood vessel relaxing action of the resin-adsorbed fraction extract of the present invention by measuring the blood vessel tension. ⁇
  • phenylephrine as a vasoconstrictor was added to a concentration of 0.1 ⁇ M to constrict the blood vessels, and then the Morohella adsorbed fraction extract B e obtained in Example 2 above was used. 2 was added to the nutrient solution at 0.5 mg / ml, 1.0 mg / ml, 2.5 mg / ml, and 5.0 mg / ml, and observed for vasodilatory effect. (N 2 6).
  • L-NAME means L-NAME + Phenerpheline + Morroheia Extract B e
  • domethacin means Indomethacin + Phenylephrine + Morroheia Extract B e 2.
  • Morohaya adsorbed fraction extract B e 2 exhibited a vasorelaxing effect in a statistically significant and concentration-dependent manner from 0.5 mg / ml.
  • Pretreatment with indomethacin (PGI 2 inhibitor) did not affect the vasorelaxation response of Morohaya adsorbed fraction extract B e 2.
  • PKI 2 inhibitor indomethacin
  • L-NAME depression of NO production
  • Morohaya adsorbed fraction extract B When the same operation was performed using a blood vessel from which the endothelium had been removed, Morohaya adsorbed fraction extract B The change in the concentration-response curve of vasorelaxation due to e 2 is the same as when L-NAME was pretreated.
  • the moroheia adsorbed fraction extract of the present invention exerts an effect even in a state where the vascular endothelium function is reduced and relaxes the blood vessel. It can be administered safely to hypertensive patients with cardiovascular diseases such as sclerosis. Industrial applicability
  • the morohea adsorbed fraction extract of the present invention i.e., morohea synthetic resin adsorbed fraction composition
  • morohea adsorbed fraction extract of the present invention does not contain nicotinamine having ACE inhibitory activity, which has been conventionally known to be contained in morohaya, as an active ingredient, and has a vasorelaxant action as an action mechanism. This is completely different from the conventional product, and its effect is expected.

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Abstract

　モロヘイヤエキス溶液を合成樹脂吸着剤で吸着処理し、その吸着画分を溶出溶媒により溶出処理して回収することにより、優れた血管弛緩作用、特に血圧降下作用を有するモロヘイヤ合成樹脂吸着画分組成物を得ることができる。本発明のモロヘイヤ合成樹脂吸着画分組成物は、高血圧患者に対して効果的で、副作用が無く、安全性の高い血管弛緩剤、それら組成物を含んでなる健康食品、健康補助食品、特定保健用食品等の食品類、あるいはそれらを含んでなる飲料を提供することができる。

Description

明細書
血管弛緩作用を有するモロヘイャ合成樹脂吸着画分組成物、 該吸着画分組成物を含 む血管弛緩剤又は飲食物及び該吸着画分組成物の製造方法 技術分野
本発明は、 モロヘイヤエキス溶液を合成樹脂吸着剤で吸着処理してその吸着画分を 溶出溶媒により溶出処理することによって回収される血管弛緩作用を有するモロヘイヤ 合成樹脂吸着画分組成物、 該モ口ヘイャ合成樹脂吸着画分組成物を有効成分として含有 する血管弛緩剤、 該モロヘイヤ合成樹脂吸着画分組成物を含有してなる飲食物、 及ぴ該 モロヘイャ合成樹脂吸着画分組成物の製造方法に関する。 背景技術
1 . 高血圧症について
現在日本では、 約 3 5 0 0万人の人が高血圧症にかかっていると言われている。 わ が国の死亡原因の 2位は心疾患、 3位は脳血管疾患であるが、 これらの疾患の原因には 高血圧症が深く関わっている。高血圧症には自覚症状がないため、気がつかないうちに、 動脈硬化を促し、 この動脈硬化によって、 心疾患、 狭心症、 脳出血、 脳梗塞、 腎臓病そ の他の様々な合併症を引き起こす。 特に、 血管収縮が継続すると血管の機能が低下し、 動脈硬化の発生 '進展につながる。 また、 血管機能の低下は、 高血圧などのリスクを高 め、 脳卒中発症などの確率を高める。
ところで、 血管内皮は、 一酸化窒素 (NO) などの血管調節因子を産出して、 血管の 拡張や筋肉の弛緩、 血液の線溶、 血流のコントロールをすることで血管機能を維持し調 節することが知られている。血管内皮細胞の出す各種血管調節因子のうち一酸化窒素（N O) は、 強い血管拡張作用を有するのみならず、 動脈硬化の進行や血栓の形成を抑制す る働きもある。 したがって、 血管内皮機能の低下は、 血管全体の機能低下のみならず、 動脈硬化やその他循環器系疾患を招く恐れがある。 し力 し、 高血圧は血管内皮に悪影響 を及ぼし、 血管内皮機能を低下させる。 この様な観点から、 血管内皮機能に依存しない 血管弛緩剤や血圧降下剤が望まれる。
従来、 高血圧症の予防及び治療方法としては、 一般療法と薬物療法が用いられてい る。
一般療法は減量、 節酒、 好気的運動等の運動療法、 減塩等の食事療法を行うことに より治療する方法であって、 本態性高血圧症の治療の基本である。 一般療法は、 薬物を 使用しないため、 副作用の懸念あるいは経済的負担という点では利点があるものの、 個 人の意欲と周囲の協力態勢に依存し、 必ずしも一定の高血圧改善効果を得られなレ、等の 問題点がある。
—方、 薬物療法は、 食事療法や運動療法の効果が不充分な場合等、 一般療法で血圧 が正常化しない場合や、 症状が重い高血圧に対し用いる療法であり、 確実な降圧が期待 できる。 薬物療法において使用される薬物は、 カルシウム拮抗薬、 アンジォテンシン転 換酵素 （Angiotensin l Converting Enzyme;以下 A C E) 阻害薬、 アンジォテンシン I I受容体拮抗薬、 利尿薬、 交感神経抑制薬等多岐にわたる。 しかしこれらの血圧降下剤 として用いられる薬物は、 長期的な服用を必要とするため、 一般的に消化器症状、 起立 性低血圧、 代謝機能の変化等の副作用を伴う。 特に A C E阻害薬は副作用として空咳、 めまい、 立ちくらみ、 悪心、 ロ渴、 過度の鎮静等が広く知られており、 Q O Lを低下さ せ、 コンプライアンスの低下にもつながる要因となっている。 また、 血管弛緩を目的と した医薬品には反射性頻脈、 動悸、 空咳、 顔面紅潮、 ほてり、 頭痛などの副作用が発生 する可能性がある。 これら薬物は、 一度服薬を開始した場合には継続する必要があり、 患者の判断によって途中で服薬を中止したり量を変えたりすることができない為、 経済 的及び精神的な負担も多くなる。 その為、 副作用の恐れがなく、 経済的精神的負担も軽 く、 安全で長期間継続することが可能であり、 かつ効果的な療法が望まれてきた。 2 . 健康食品、 機能性食品、 健康補助食品等
そこで、 上記課題を解決するために注目されるものが、 血圧降下剤による薬物療法 と一般療法の中間に位置するともいえる食品による治療又は予防方法である。 このよう な食品は、 健康食品、 機能性食品、 健康補助食品、 特定保健用食品と呼ばれることもあ り、 日常的に摂取する食品中に、 血圧降下作用を有する物質を添カ卩したもの等がある。 例えば、 血圧が高めの人に適した飲料として、 植物由来のペプチドを含む茶飲料が販売 されている。 一例としては、 ゴマを脱脂した後、 蛋白質を抽出し分解酵素を作用させて 得られるゴマ蛋白質分解物 （ゴマペプチド含有） の L e u— V a 1— T y r ( L VY) を関与成分とするものがあり、 A C E阻害作用を有し、 血圧降下作用を示す。 また、 乳 製品乳酸菌飲料中に γ—ァミノ酪酸 （G A B A) を添加したものが販売されている。 G A Β Αはァミノ酸の一種で、 代表的な抑制系の神経伝達物質であり、 血圧降下作用を有 することが古くから知られているものである。 杜仲茶葉に含まれる杜仲葉配糖体の主成 分ゲニポシド酸を有効成分として含んだ特定保健用食品の茶飲料も市販されている。 ゲ 二ポシド酸は、 副交感神経に作用し、 血流をスムーズにすることにより血圧を下げるも のである。 また、 山本直之等は、 「乳酸菌及び発酵乳製品」 の表題の下に、 乳を原料とし て乳酸菌発酵により製造されたョーダルトが血圧降下作用を有することを報告している (特許文献 1参照)。
しかし、 その血圧降下作用の原因物質に関しては、 明らかではない。 その他にも、 血圧降下作用を謳った多くの健康食品、 飲料等が販売されているが、 さらに効き目のあ る商品、 安心して長期に渡って服用できる商品、 経済的負担がより少ない商品が、 常に 求められている。
その他、 天然物成分としては、 乳蛋白質、 大豆蛋白質あるいは魚肉蛋白質に、 様々 な A C E阻害ぺプチドが含まれていることが報告されており、 これら天然物由来の A C E阻害物質は低毒性で安全性の高い降圧剤として実用化が検討されている。 しかし、 こ れらの天然物由来べプチド群に含まれる血圧降下ぺプチドは微量であり、 現実的な経口 での摂食量では大き 、効果が期待出来ないものや、 A C E阻害活性は強いが血圧降下作 用はあまり強くないものが多い。
また、 近年、 乳酸菌発酵乳から強い A C E阻害活性を有する 2種のトリぺプチド、 即ち V a 1— P r o— P r oと I 1 e— P r o—P r oとが報告されている （例えば、 非特許文献 1参照)。 更に、 これらのトリぺプチドの強レ、血圧降下作用が自然発症高血圧 ラット （S HR) にて確認された報告がある （例えば、 非特許文献 2参照)。 しかしなが ら、 乳酸菌発酵乳中に産生されるトリペプチドは、 乳酸発酵の進行と共に乳酸菌が産生 する蛋白質分解酵素により生じるために、 発酵条件により トリペプチド量は変動しやす く、 一定の含有量で得ることが困難である。
以上のように、 血管弛緩作用、 特に血圧降下作用の原因物質が明らかで、 工業的に 安定した生産が可能であり、 従来品以上に有効性、 安全性の高い天然物由来の血管弛緩 物質およびそれらを含有した健康食品、 健康飲料等が求められている。
3 . モロヘイヤ
モロヘイヤ （学名 ： Corchorus oitorius L.) はェジプトを中心とした地中海地方を 原産地とする黄麻の一種であり、 その栄養価の高さから、 近年特に注目されてきた食品 素材のひとつである。 モロヘイヤは、 細かく刻んだり茹でたりすると、 オクラゃャマイ モの様に独特のヌメリを生じ、 このヌメリは植物ゴム （Plant gum) 及び粘質多糖 （ム コ多糖） を含んでいる。 また栄養学的にはビタミン類やミネラル類が豊富で、 特に総力 ロチン及びカルシウム含量が多い等の特徴を有する。 カロチンはブロッコリ一の約 1 2 倍、 ビタミン B 1はトマトの約 3倍、 ビタミン B 2はピーマンの約 14倍、 カルシゥム は牛乳の約 2 . 4倍、 食物繊維はレタスの約 2 0倍と言われている。 そのため、 最近、 我が国でも栽培され、 生葉と共にその乾燥粉末が食品素材として注目を集めつつある。
現在までに、 モロヘイヤに関してはモロヘイャ抽出物やそれを乾燥粉末化したモロ ヘイャ粉末、 所謂モロヘイヤエキス、 それらを含有する食品や組成物、 或いはその製造 5
方法が多数提案されている。
例えば、 山本隆士等は、 モロヘイヤエキスを飲料に使用するためにその粘性を低下 させることを目的として、 有機酸を添加してモロヘイヤエキスを抽出する製造方法につ いて報告している （特許文献 2参照)。 また、 印南敏等は、 モロヘイヤ葉の水溶性画分の エタノール析出物を有効性成分として含有する組成物について報告している （特許文献 3参照)。 し力 しながら、 この有効性成分は食物繊維である。
また、 吉川雅之等は、 「モロヘイヤの水性エキスを含有する組成物」 の表題の下、 モ ロヘイヤを精製水で加熱抽出し、 抽出物を濃縮後、 凍結乾燥させることにより得る、 胃 粘膜保護作用を有するモロヘイヤの水性エキスを必須成分として含有することからなる 組成物に関して報告している （特許文献 4参照)。 さらに、 吉川雅之等は、 モロヘイヤに 含まれる新規な脂肪酸又はその塩、 脂肪酸抽出物、 その単離法及び該脂肪酸を有効成分 として含有する一酸化窒素 （N O) 産生抑制作用を有する医薬組成物に関して報告して いる （特許文献 5参 ¾)。 4 . モロヘイヤの血圧降下作用
モ口ヘイャの血圧降下作用についてはそのエキスに試験管レベルの A C E阻害活性 が確認されている。 更に、 モロヘイヤエキスの A C E阻害活性成分としてニコチアナミ ンが単離されている （非特許文献 3 , 4 , 5参照)。 また、 山口典男らは、 大豆の水抽出 液から効率よくニコチアナミンを製造する方法を提案している （特許文献 6参照)。 しか し、 ニコチアナミンはモロヘイヤに極微量し力含まれておらず、 実際に血管弛緩剤乃至 血圧降下剤として利用するには大量の原料と複雑な精製工程が必要であり現実的ではな いという問題点が指摘されている。
[特許文献 1 ] 特開平 7— 1 2 3 9 7 7号公報
[特許文献 2 ] 特開平 1 0— 1 9 1 9 2 2号公報
[特許文献 3 ] 特開平 7— 6 9 9 1 0公報 [特許文献 4 ] 特開 2000— 26305号公報
[特許文献 5 ] 特開平 1 1一 322667号公報
[特許文献 6 ] 特開 2003— 231 675号公報
[非特許文献 1 ] J. Dairy Sci.78： p.777-783
[非特許文献 2 ] J. Dairy Sci.78： 1253Ί257
[非特許文献 3] 食品の試験と研究， 31号, 78— 79,1996 「モロヘイヤの栄養成 分とアンジォテンシン I変換酵素阻害活性」、 荒川彰彦
[非特許文献 4] 東京家政大学研究紀要， 第 38集 （2) , 59— 63, 1 998 「食 品中の ACE阻害物質に関する研究」、 木元幸一、 清水恵美子、 黒田裕子
[非特許文献 5] 日本食生活学会誌， 10卷， 3号， 20— 25, 1999 「食品中の高 血圧抑制物質につ！/ヽて」、 木元幸一 発明の開示
発明が解決しようとする課題
上記のように、 高血圧症の改善のために、 副作用の恐れがなく、 経済的精神的負担 も軽く、 安全でかつ効果的な療法が望まれてきた。 特に薬物療法と一般療法の中間に位 置するような、 健康食品、 機能性食品、 健康補助食品等として、 血管弛緩作用、 特に血 圧降下作用を有するものが強く求められていた。
従って、 本発明の目的は、 高血圧患者、 特に、 その 90%を占めるといわれている 本態性高血圧患者に対して効果的で、 副作用の無い、 長期間服用に適した安全な食物由 来の血管弛緩剤 （血管拡張剤）、 それら組成物を含んでなる飲食品、 特に健康食品、 健康 補助食品等の食品類、あるいはそれらを含んでなる飲料を提供することである。更には、 それら組成物の製造方法を提供することである。 課題を解決するための手段 η 本発明者等は、 上記課題を解決するべく、 近年栄養価の高い食品素材として注目さ れてきているモロへィャに着目し、 その血管弛緩作用、 特に血圧降下作用について鋭意 検討を重ねた結果、 モロヘイヤエキス溶液、 より好ましくはモロヘイヤをプロテアーゼ 処理して得られるモロヘイャ酵素処理ェキス溶液を合成樹脂吸着剤で吸着処理し、 その 吸着画分を溶出溶媒により溶出処理して回収することにより、 より優れた血管拡張乃至 血管弛緩作用、 即ち血圧降下作用を有するモロヘイャ合成樹脂吸着画分組成物を製造す ることが可能であることを見出し、 本発明を完成した。
血管弛緩作用を有する薬剤は、 高血圧症、 心不全症、 狭心症、 心臓弁膜症、 虚血性心 疾患若しくは心筋梗塞症の治療剤又は予防剤、 特に血圧降下剤として有効である。 本発明は、 具体的には以下のとおりである。
1 . モロヘイヤエキス溶液を合成樹脂吸着剤で吸着処理し、 その吸着画分を溶出溶媒に より溶出処理して回収される血管弛緩作用を有するモロヘイャ合成樹脂吸着画分組成 物。
2 . モロヘイヤエキス溶液がモロヘイヤをプロテアーゼ処理して得られるモロヘイヤ酵 素処理エキス溶液である上記 1に記載のモロヘイヤ合成樹脂吸着画分組成物。
3 . プロテアーゼが、 ェンドぺプチダーゼである上記 2に記載のモロヘイャ合成樹脂吸 着画分組成物。
4 . エンドぺプチダーゼが、 Bacillus 由来のエンドぺプチダーゼである上記 3に記載の モロヘイャ合成樹脂吸着画分組成物。
5 . 合成樹脂吸着剤が芳香族重合体を母体とする合成樹脂吸着剤である上記 1乃至 4の レ、ずれか 1項に記載のモロヘイャ合成樹脂吸着画分組成物。
6 . 下記式 （A) で算出されるアミノ酸を含有し、 かつ各アミノ酸濃度が下記式 （1 ) から （ 3 ) の要件を全て満たすことを特徴とする上記 1乃至 5のいずれか 1項に記载 のモ口ヘイャ合成樹脂吸着画分組成物。 0
O
(A) ァミノ酸増分 =酸加水分解後のァ，ミノ酸量一酸加水分解前のァミノ酸量 ここで、 ァミノ酸増分は、 任意の濃度のモ口ヘイャ合成樹脂吸着画分組成物溶液 2 mLに対し、 0. 5mLの 6 N塩酸を添加してオートクレーブにて 121°Cで 3時 間の処理を行った場合のァミノ酸増分を意味する。
(1) G 1 yが Va 1の 3重量倍以上、 力つ G 1 y力 S I 1 eの 3重量倍以上；
(2) S e r、 A 1 a及び L e uから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸が Va 1の 2重量倍以上、 かつ S e r、 A 1 a及び L e uから選ばれる少なくとも 1つのアミ ノ酸が I 1 eの 2重量倍以上；
(3) A r gが V a 1の 1重量倍以上、 かつ A r gが I 1 eの 1重量倍以上； 7. モロヘイヤエキス溶液を合成樹脂吸着剤で吸着処理し、 その吸着画分を溶出溶媒に より溶出処理して回収することを特徴とする血管弛緩作用を有するモロヘイャ合成樹 脂吸着画分組成物の製造方法。
8. モロヘイヤエキス溶液がモロヘイヤをプロテアーゼ処理して得られるモロヘイヤ酵 素処理エキス溶液である上記 7に記載のモ口ヘイャ合成樹脂吸着画分組成物の製造方 法。
9. プロテアーゼが、 エンドぺプチダーゼである上記 8に記載のモロヘイヤ合成樹脂吸 着画分組成物の製造方法。
10. ェンドぺプチダーゼが Bacillus由来のェンドぺプチダーゼである上記 9に記載の モロヘイャ合成樹脂吸着画分組成物の製造方法。
11. 合成樹脂吸着剤が芳香族重合体を母体とする合成樹脂吸着剤である上記 7に記載 のモロヘイャ合成樹脂吸着画分組成物の製造方法。
12. 上記 1乃至 6のいずれか 1項に記載のモロヘイヤ合成樹脂吸着画分組成物を含ん でなる血管弛緩剤。
13. 上記 1乃至 6のいずれか 1項に記載のモロヘイヤ合成樹脂吸着画分組成物を含ん でなる飲食物。 発明の効果
本発明のモロヘイヤ合成樹脂吸着画分組成物は、 食物として安全性が確認されてい るモロヘイヤ由来であるので、 副作用もなく極めて安全な上、 日常的に摂取することが 可能である。 また、 その製造方法も、 モロヘイヤエキス溶液を合成樹脂吸着剤で吸着処 理し、 その吸着画分を溶出溶媒により溶出処理して回収するだけであるので、 極めて容 易である。
また、 野菜としてのモロヘイヤそれ自体は勿論のこと、 合成樹脂吸着剤処理してい ない従来のモロヘイヤエキスと比較して、 その血管弛緩作用、 特に血圧降下作用は格段 に優れており、 かつ持続性に優れている。 特に、 モロヘイヤをプロテアーゼ処理して得 られるモロヘイヤ酵素処理エキス溶液を使用して吸着処理した場合には、 より優れた血 管弛緩作用、 特に血圧降下作用を有する合成樹脂吸着画分組成物が得られる。
そして、 本発明のモロヘイヤ合成樹脂吸着画分組成物は、 従来の単に抽出したモロ ヘイヤエキスと比較して、 その血管弛緩作用が優れており、 かつ持続性に優れているだ けでなく、 血管内皮に作用することなく血管を弛緩するので、 動脈硬化やその他循環器 系疾患により低下した血管内皮機能に依存せず、 血管を弛緩し、 血圧を降下させること ができる。
更に、 モロヘイヤはビタミン類やミネラル類、 食物繊維が豊富で栄養価が高い植物 であるため、 血管弛緩作用や血圧降下作用のある単一の成分を分離精製した従来のもの と比較した場合、 本発明の合成樹脂吸着画分組成物を摂取した場合には、 複数の成分を 同時に摂取することが可能であり、 さらなる効果が期待できる。 加えて、 天然の植物で あるモロヘイヤを原料としているので、 安価で、 安全性も高いため、 医薬品、 食品、 特 に特定保健用食品、健康食品、野菜ジュース等の飲料、特に容器詰飲料等に好適である。 図面の簡単な説明 ェ。 図 1は、 モロヘイヤエキス （A、 B、 B '。 吸着処理なし） 投与による収縮期血圧変 動を示した図である。 （試験例 1 )
図 2は、 モロヘイヤエキス （A、 B、 B '。 吸着処理なし） 投与による拡張期血圧変 動を示した図である。 （試験例 1 )
図 3は、 モロヘイヤエキス （A、 B、 B '。 吸着処理なし） 投与による心拍数変動を 示した図である。 （試験例 1 )
図 4は、 モロヘイヤエキス （A、 B、 B ' 。 吸着処理なし） 投与による平均血圧変 動を示した図である。 （試験例 1 )
図 5は、 S H Rラットの収縮期血圧の日内変動を示した図である。 （試験例 1 ) 図 6は、 モロヘイヤピューレより調製した酵素処理モロヘイヤエキス （C。 吸着処 理なし） の血圧変動に対する効果を示した図である。 （試験例 1 )
図 Ίは、 モロヘイヤのプロテアーゼ未処理抽出物の合成樹脂吸着画分エキス Ae2の 血圧変動に対する効果を示した図である。 （試験例 2 )
図 8は、 合成樹脂吸着画分エキス （素通り画分 B el及び吸着画分 B e2) の血圧変動 に対する効果の比較を示した図である。 （試験例 3 )
図 9は、 吸着剤による精製前のモロヘイヤ酵素処理エキス （B ) の血圧変動に対す る効果を示した図である。 （試験例 3 )
図 1 0は、 モロヘイヤ葉のプロテアーゼ処理による吸着画分エキスの増加を示した 図である。 （試験例 4 )
図 1 1は、 モロヘイヤ合成樹脂吸着画分エキス B e 2の単回投与による血圧降下作 用を示した図である。 （試験例 5 )
図 1 2は、 モロヘイヤ合成樹脂吸着画分エキス B e 2の長期投与による血圧上昇抑 制効果を示した図である。 （試験例 6 )
図 1 3は、 モロヘイャ合成樹脂吸着画分エキス B e 2の A C E阻害活"生を測定した 結果を示した図である。 （試験例 7 ) ェェ 図 1 4は、 モロヘイャ合成樹脂吸着画分エキス B e 2の血管弛緩作用を示した図で ある。 （試験例 7 )
図 1 5は、 精製モロヘイヤ合成樹脂吸着画分エキスの血管弛緩作用を示した図であ る。 （試験例 7 )
図 1 6は、 精製モロヘイヤ合成樹脂吸着画分エキス投与後の心拍数の変化を示した 図である。 （試験例 8 )
図 1 7は、 精製モロヘイヤ合成樹脂吸着画分エキス B e 2の各画分の血管弛緩作用 を示した図である。
図 1 8は、 モロヘイヤ合成樹脂吸着画分組成物中の蛋白質のアミノ酸構成について 確認試験結果を示す図である。 （試験 9 )
図 1 9は、 モロヘイヤ合成樹脂吸着画分エキス B e 2が血管内皮に依存することな く血管を弛緩する作用を有することを示した図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明のモロヘイヤ合成樹脂吸着画分組成物は、 モロヘイヤエキス溶液を合成樹脂 吸着剤で吸着処理し、 その吸着画分を溶出溶媒により溶出処理することによって得るこ とができる。
原材料としてのモロヘイヤエキス溶液は、 例えば、 モロヘイヤ葉に水又は温水を加 えて抽出することによって得ることができる。 具体的には、 硬い茎の部分を除去したモ ロヘイヤ葉に水又は温水を加水した後、 スチーム加熱し、 これを破枠処理し、 次いで、 破砕処理したモ口ヘイャ葉を熱風乾燥することによつて得られたモロヘイャ乾燥葉に 1 0乃至 4 0倍重量、 好ましくは 2 0乃至 3 0倍重量程度の蒸留水熱水を加水して抽出す ることによって得ることができる。
モロヘイヤとしては、 種子を除く地上部のどの部分を用いてもよいが、 硬い茎の部 分を除去した葉の部分が特に好ましい。 これらをスチーム加熱後、 破砕し、 熱風乾燥を , 0 行う等して得られる乾燥葉を材料とするのが好ましいが、 乾燥葉の調製方法は特に限定 されるものではなく、 必要に応じて、 市販品を用いることもできる。 また、 乾燥葉以外 でも、 例えば、 モロヘイヤの生葉やピューレ等の未乾燥物も用いることも可能である。 また、 簡便には市販のモロヘイヤエキス粉末を水乃至温水に溶解させることによって得 ることもできるし、 モロヘイヤピューレからエキス抽出してもよい。
ここで、 モロヘイヤエキス溶液とは、 モロヘイヤの抽出成分を含有する水溶液のこ とであり、 モロヘイャ加水液即ち水又は温水にモ口ヘイャ葉を混合したモ口ヘイャ葉溶 液からのモロヘイヤ抽出液それ自体、 モロヘイヤエキス粉末を水に溶解させたモロヘイ ヤエキス溶液又はモロヘイヤピューレ水溶液を意味する。 好適にはプロテァーゼ処理を 施したモロヘイヤ酵素処理エキス溶液である。 プロテアーゼ処理は、 前記のごときモロ ヘイャ抽出液、 モロヘイヤエキス粉末を水に溶解させたモロヘイヤエキス溶液又はモロ ヘイャピューレ溶液に蛋白質分解酵素即ちプロテアーゼを作用させることによって得る ことができる。
次いで、 このようにして得られたモロヘイヤエキス溶液又はモロヘイヤ酵素処理ェ キス溶液を合成樹脂吸着剤で吸着処理し、 合成樹脂吸着剤へ通液し水押し後、 例えば 6 0 %エタノ一ルを通液して回収することにより樹脂吸着画分として回収することによつ て目的とするモロヘイャ合成樹脂吸着画分組成物を得ることができる。 溶媒による溶出 処理は、 使用する合成樹月旨吸着剤に適した溶出溶媒を選定することができる。
例えば、 芳香族系の合成樹脂吸着剤を用いた場合には、 多量の水や温水を用いても 良いし、 より効率を上げるために 5 0〜 7 0 %、 好ましくは 5 5〜 6 5 %濃度に水で希 釈したエタノールを用いることができる。 より具体的には、 モロヘイヤエキス溶液又は モロヘイヤ酵素処理エキス溶液を、 合成樹脂吸着剤充填カラムに通液後、 カラム排出液 が Brix測定値で B r i X 1 %以下、好ましくは B r i x 0 . 5 %以下になるように純水 等にて十分に洗浄し、 適当な濃度のエタノール等の溶出バッファ一にて溶出して吸着画 分を回収すればよい。 吸着画分の回収は、 例えば 6 0 %エタノール溶液であれば、 樹脂 容量の 1〜1 0倍量、 より好ましくは 1〜5倍量、 さらに好ましくは 1〜2 . 5倍量を 通液することにより効率よく吸着物を回収できる。 また水を用いる場合は純水による洗 浄後、 樹脂容量の 3倍量以上を通液することにより吸着物を回収することができる。 必要に応じて、 ろ過操作は、 目の開き 850 μ πιのふるいでろ過後、 Νο·2のろ紙を用 いて吸引ろ過を行えばよい。 また、 更に精製された吸着画分,組成物を望む場合は、 陽ィ オン交換カラムクロマトグラフィー、 ゲルろ過クロマトグラフィーを用いて更に精製し てもよレ、。 画分から回収された溶液は、 適当な濃度まで減圧濃縮し、 あるいは、 これを 凍結乾燥し粉末として保存することもできる。
限定されるものではないが、 本発明の画分処理組成物の製造方法は下記表のとおり である。
表 1
モロヘイヤ生業摘採—カット'トリミング→水洗い—スチームブランチング→脱水—熱風乾燥—粉砕—加水 —加熱→必要により微生物由来プロテアーゼ酵素処理 (—酵素失活)→固液分離—ろ過—合成吸着剤カラ ム通液—水押し— 60%エタノール通液（同時に排出液を吸着画分として回収)→減圧濃縮→凍結乾燥 このようにして得られたモロヘイヤ合成樹脂吸着画分は、 アルコール分を除去して そのまま飲料として、 あるいは他の果汁や野菜ジュース、 ミックスジュースに配合して 利用することが可能である。 また、 適当な濃度まで減圧濃縮することによって濃厚な液 状組成物とすることも可能であり、 目的に応じて凍結乾燥して粉末状とすることも可能 である'。 これら濃厚な液状組成物及び粉末状の合成樹脂吸着画分組成物は、 食品、 飲料 等に添加して用いることが可能である。 使用する合成樹脂吸着剤は、 親水性合成樹脂吸着剤、 疎水性合成樹脂吸着剤の何れ であってもよいが、 効果的な血管弛緩作用、 特に血圧降下作用を有する組成物を回収す るために好ましい吸着剤は、 疎水性合成樹脂吸着剤である。 疎水性合成樹脂吸着剤の樹 脂母体として、 例えば、 スチレン重合体、 スチレンージビニルベンゼン共重合体、 スチ レン一アクリル酸アミドの共重合体、 フエノール樹脂等が挙げられる。 本発明において 好ましい合成樹脂吸着剤は、 水溶性低分子物質を吸着するのに適した多孔性の吸着剤、 具体的には、 多孔性修飾ポリスチレン系合成吸着剤、 即ち、 スチレン等の芳香族系の樹 脂母体に臭素等の極性基を化学的に修飾結合させてなる多孔性修飾ポリスチレン系合成 吸着剤である。 これら吸着剤としては、 表面積の大きい多孔性の合成樹月旨吸着剤が好ま し！/、。 合成樹脂吸着剤の比表面積としては、 100〜： 1200 m g、 好ましくは 25 0〜900m2Zg程度である。 また、 合成樹脂吸着剤の好ましい細孔容積、 粒度分布、 最頻度半径は、それぞれ 0. 9〜： L. 6mL/gであり、 250 m以上が 90 %以上、 30〜260オングストロームである。 より具体的には、 セパビーズ （登録商標；三菱 化学株式会社）、 特にセパビーズ SP 70、 SP 700、 SP850、 SP 207、 さら に好ましくは SP 207 (比表面積、 細孔容積、 粒度分布、 最頻度半径は、 それぞれ 5 90 m2Z g、 1. 1 mL/g, 250 m以上が 90 %以上、 120オングストローム) を挙げることができる。
これら合成樹脂吸着剤は、 吸着処理に先立って予め前処理しておいてもよレ、。 例え ば、 吸着剤をメタノールなどの溶媒で洗浄して不純物を除去した後、 さらに水で洗浄し てメタノールなどの溶媒を除去することにより行うことができる。
また、 これら吸着剤による処理は、 バッチ法、 カラム法の何れで行ってもよいが、 比較的少量の吸着剤により効率よく処理できるカラム法が好ましレ、。 吸着剤による処理 は、 少なくとも一回行えばよい。 吸着剤と抽出液の割合は、 使用する吸着剤の種類など に応じて選択できる。
合成樹脂吸着処理の対象としてのモロヘイヤエキス溶液は、 モロヘイヤ抽出成分を 含有する溶液、 特に水溶液であればよく、 特に限定されるものではない。 例えば、 モロ ヘイャ葉を温水に浸し、 またはモロヘイヤピューレに温水を加えて、 その含有成分を浸 出させることにより、 あるいは、 市販のモロヘイヤエキス粉末を水に溶解させることに よって得ることができる。 好ましくは、 蛋白質分解酵素即ちプロテアーゼ処理を施した モロヘイヤ酵素処理エキス溶液を用いることにより、 より一層優れた血管拡張乃至血管 弛緩作用、 即ち血圧降下作用をもたらすことが可能である。
このようなプロテアーゼ処理を施したモロヘイャ酵素処理エキス溶液は次のように して得ることができる。
モロヘイヤ酵素処理エキス溶液は、 モロヘイヤ加水液、 即ち水又は温水にモロヘイ ャ葉を混合したモロヘイヤ葉溶液からのモロヘイヤ抽出液、 モロヘイヤエキス粉末を水 に溶解させたモロヘイヤエキス水溶液又はモロヘイヤピューレ溶液等のモロヘイヤェキ ス溶液に蛋白質分解酵素即ちプロテアーゼを作用させることによって得ることができる。 例えば、 モロヘイヤ葉の場合、 硬い茎の部分を除去したモロヘイヤ葉に水又は温水を加 水した後、 スチーム加熱し、 これを破砕処理する。 次いで、 破砕処理したモロヘイヤ葉 を熱風乾燥することによつて得られたモ口ヘイャ乾燥葉に 1 0倍乃至 4 0倍、 好ましく は 2 0倍乃至 3 0倍重量程度の蒸留水熱水を加水する。 その後、 9 5 °C以上の温度で加 熱殺菌処理を施した後、適当な温度まで冷却し、ウォーターバス中で液温を保ったまま、 少量の水に溶解した適量のプロテアーゼを原料の乾燥葉重量乃至乾燥葉相当重量に対し て適量添加する。 プロテアーゼを添加した後、 1 0分おきに攪拌を行い、 プロテアーゼ 添加から 3 0分乃至 2時間、 好ましくは 4 5分乃至 9 0分経過後、 9 5 °C乃至沸 S養状態 で 5分から 1 0分間保持することによりプロテアーゼを失活させ、 目の開き 8 5 0 μ πι のふるいでろ過後、 N o . 2のろ紙を用いて吸引ろ過することにより、 モロヘイヤ酵素 処理エキス溶液を得ることができる。 合成樹脂による吸着処理は、 好ましくはろ過後の 溶液、 少なくとも固液分離してモロヘイヤ葉等を除去した溶液を用いる。 プロテアーゼ 処理のための液温、 酵素濃度、 p H等の処理条件は、 使用するプロテアーゼが最適に作 用するように調整すればよい。
モロヘイャ酵素処理ェキス溶液を作成するための使用酵素としてはプロテアーゼ酵 素であれば特に制限はないが、 好適にはェンドぺプチダーゼもしくはェンドぺプチダー ゼを主体とする複合酵素である。また複数の酵素を組み合わせて使用することもできる。
本発明に用いられる蛋白質分解酵素即ちプロテアーゼは、 ぺプチド結合の加水分解 ,
lb
反応に対して触媒作用をする酵素である。 特に限定されるものではないが、 エンド型の 酵素もしくはェンド型の複合酵素であることが好ましい。 中でも Bacillus属の産生する 蛋白質分解酵素がより好ましい。 さらに好適には Bacillus subtilis 及び Bacillus thermoproteolyticusの産生する蛋白質分解酵素である。また複数の酵素を組み合わせて 使用することもできる。
プロテアーゼ処理する際の PH、処理温度、処理時間、 処理濃度は、特に限定される ものではないが、使用酵素によって適宜選択し得る。好ましくは、 pH5. 0〜8. 5、 より好ましくは pH5. 5〜7. 0、 処理温度 40°C乃至 70°C、 好ましくは、 50°C 乃至 6 5 °C、 そして処理時間 1 5分乃至 2時間、 好ましくは 45分乃至 90分、 また、 好ましい酵素濃度はモロヘイヤの乾燥重量に換算して 0. 0 1乃至 3重量％、 好適には 0. 05〜2重量％、 更に好適には 0. 1〜1. 5重量0 /。である。 しかしながら、酵素の 種類により、 これら条件を変更してもよいことは勿論である。 例えば、 Bacillus subtilis 由来のプロテアーゼを使用する場合には、 pH6. 0乃至 7. 0、 処理温度 55°C乃至 60 °C、処理時間 1時間乃至 2時間、処理濃度はモロヘイャの乾燥重量の 0. 1乃至 1. 0重量0 /0が好ましい。 また、 Bacillus thermoproteolyticus由来のプロテアーゼのひとつ を使用する場合には、 pH6. 0乃至 7. 0、 処理温度 60°C乃至 70°C、 処理時間 1 時間乃至 2時間、 処理濃度はモロヘイヤの乾燥重量の 0. 1乃至 1. 0重量％が好まし い。
酵素処理後は、 加熱により酵素を失活させ、 濾過等任意の方法で固液分離を行い、 抽出液を回収する。 酵素の失活方法は、 使用酵素によって適宜選択されるが、 加熱によ つて行うことが可能で、例えば 95 °C乃至沸騰状態で 5〜 1 0分間程度放置すればょレ、。
「モ口ヘイャ合成樹脂吸着画分組成物」 とは、 モロヘイヤエキス溶液好ましくはモ ロヘイヤ蛋白質分解酵素処理エキス溶液を合成樹脂吸着剤で処理し、 吸着画分を溶液分 離によって得られる合成樹脂吸着画分組成物を意味し、具体的には、モロヘイヤ加水液、 即ち水又は温水にモ口ヘイャ葉を混合したモ口ヘイャ葉溶液から得られるモ口ヘイャ抽 出液、 モロヘイヤエキス粉末を水に溶解させたモ口ヘイヤエキス水溶液又はモロヘイヤ ピューレ溶液等のモロヘイヤエキス溶液、 又はこれらをプロテアーゼ処理してなるモロ ヘイャ酵素処理エキス溶液を合成樹脂吸着剤で吸着処理し、 合成樹脂吸着剤へ通液し水 押し後、 例えば 60%エタノ一ルを通液して回収することにより溶出処理して得られる合 成樹脂吸着画分組成物を意味する。 これら合成樹脂吸着画分組成物は、 液状又は固体状 であってもよく、 合成樹脂吸着画分液それ自体、 それを濃縮した濃厚な濃縮液、 さらに はそれらを凍結乾燥した粉体、 或いは該粉体を固めてなる錠剤であってもよい。
なお、 本明細書中では、 モロヘイヤエキス溶液又はこれらをプロテアーゼ処理して なるモロヘイャ酵素処理エキス溶液を合成樹脂吸着剤で吸着処理し、 その吸着画分を溶 出溶媒により溶出処理して得られる液状の合成樹脂吸着画分組成物及びそれを乾燥して 粉末ィ匕したものをモロヘイヤ分画処理工キス又は分画処理工キス、 あるいは吸着処理ェ キス又は吸着画分エキスと呼ぶこともある。 溶出処理は、 使用する合成樹脂吸着剤に適 した溶出溶媒'を選定することができる。 芳香族系の合成樹脂吸着剤を用いた場合には、 多量の水を用いても良いし、 より効率を上げるために 5 0〜7 0 %、 好ましくは 5 5〜 6 5 %濃度に水で希釈したエタノールを用いることができる。
このようにして得られたモロヘイャ分画処理溶液及びそれを濃縮した濃縮液は脱ァ ノレコールしてそのまま、 或いは果汁や野菜ジユース等の他の清涼飲料水に混合して飲料 として使用できる。 また、 それを凍結乾燥した粉体又は固形錠剤からなるモロヘイヤ合 成樹脂吸着画分組成物は、 それ自体、 健康食品、 機能性食品、 健康補助食品等として利 用できる他、 清涼飲料水や食品の配合剤として使用することができる。 このように本発 明のモロヘイヤ合成樹脂吸着画分組成物は、 医薬品の他、 食品や食品用配合剤、 あるい は容器詰飲料として有効に利用することができる。 本発明のモロヘイヤ合成樹月旨吸着画 分組成物を含有してなる飲食物の好ましい形態は、 該合成樹脂吸着画分組成物を含有し てなる飴、 ゼリー、 錠菓、 飲料、 スープ、 麵、 煎餅、 和菓子、 冷菓、 焼き菓子等の食品 や飲料であり、 特に好ましくは、 該合成樹脂吸着画分組成物を含有してなる果汁飲料、 野菜ジュース、 果物野菜ジュース、 茶飲料、 コーヒー飲料、 スポーツドリンク等の容器 詰飲料である。
本発明で得られるモロヘイヤ合成樹脂吸着画分組成物は、 味 ·臭いに特異な厭味が 少ないことから液状又は固形形態で経口投与により摂取することが可能であり、 それ自 体または適宜製剤上の都合で賦形剤などと混合して粉末、 顆粒、 錠剤、 カプセル剤など の形態で投与することができる。 摂取量は、 年齢、 血圧の程度により異なるが、 粉体換 算で通常 1回 10mg〜2000mgであり、好ましくは 1回 50mg〜l 000mg、 さらに好ましくは 1回 100mg〜50 Omgである。 また 1日 1〜 3回の摂取回数で 効果が得られるが、 必要に応じて回数を増やすこともできる。 また、 飲料に含有させる 場合は、 500mL当り 50mg〜2500mg、 さらに好ましくは 100 m g〜 80 Omgである。
また、 本発明で得られたモ口ヘイャ合成樹脂吸着画分組成物はそれ自体または適宜 製剤上の都合で賦形剤などと混合して粉末、 顆粒、 錠剤、 カプセル剤などの形態で投与 することができる。 また、 上記のとおり、 飴、 ゼリー、 錠菓、飲料、 スープ、 麵、 煎餅、 和菓子、 冷菓、 焼き菓子など各種の食品に配合 '添加して摂取することも可能である。 好ましくは、 他の飲食物、 特に好ましくは、 野菜ジュース、 果汁ジュース、 野菜果汁ミ ックスジュース、 茶飲料、 コーヒー飲料、 スポーツドリンク等の飲料に適量配合して使 用するのがよい。 このようにすることにより、 野菜ジュース等に含まれる栄養素を日常 的に摂取できるばかりでなく、 高血圧症の消費者にとっても極自然に血圧上昇抑剤を摂 取することができる。
本発明のモ口ヘイャ合成樹脂吸着画分組成物の血圧降下作用の検討は、 自然発症性 高血圧ラットに本発明のモロヘイヤエキスを経口投与し、 投与前、 投与後経時的に血圧 を測定することにより行つた。
さらに本発明のモロヘイヤ合成樹脂吸着画分組成物が有する血管拡張乃至弛緩作用、 即ち血圧降下作用のメカニズムは、 従来から報告されているモロヘイヤ葉が含むニコチ アナミンが有すると考えられている A C E阻害活性によるものではなく、 血管弛緩作 用 ·血管拡張作用によるものであることも確認した。 すなわち本発明のモロヘイヤ酵素 処理工キスが有する血圧降下作用は、 モロヘイャ葉が含有するニコチアナミンによるも のではないことを確認した。 本発明はこれら新しい知見に基づいて完成されたものであ る。
更に、 本発明のモロヘイヤ合成樹脂吸着画分組成物について詳細にその作用と効果 を検討したところ、 特に高い血圧に対しては良好に低下させ、 やや高めの血圧に対して は軽度に血圧降下の効果を示し、 高血圧の病状の程度に即した効き目を示すことが判明 した。 また、 長期投与することで、 血圧の上昇を抑制することができること、 投与を中 止しても急激に血圧が上昇することがなく、 摂取のし忘れによる急激なリバウンドがな いことが確認された。 このように、 本発明の合成樹脂吸着画分組成物は、 有効性だけで なく、 安全性が極めて高いものである。
本発明のモ口ヘイャ合成樹脂吸着画分組成物は、 モロヘイヤエキス溶液好ましくは モロヘイヤ蛋白質分解酵素処理エキス溶液を合成樹脂吸着剤で処理し、 有効成分を含有 する吸着画分を溶液分離によって容易に分離精製し取得することができる上、 モロヘイ ャ葉それ自体や合成樹月旨吸着剤処理を施さな 、従来のモロヘイヤエキスと比較して、 そ の血管弛緩作用、 特に血圧降下作用はより強ィヒされることが確認、された。 本発明の血管 弛緩剤は、 高血圧症、 心不全症、 狭心症、 心臓弁膜症、 虚血性心疾患症若しくは心筋梗 塞の治療剤又は予防剤、 特に血圧降下剤として有益である。 また、 モロヘイヤはビタミ ン類ゃミネラル類、 食物繊維が豊富で栄養価が高い植物であるため、 血圧降下作用のあ る単一の成分を分離精製したものと比較した場合、 本発明のモ口ヘイャ合成樹脂吸着画 分組成物は複数の成分を含有しているため、 さらなる効果も期待できる。 また、 本発明 のモロヘイヤ分画処理エキスは、 有効性だけでなく、 安全性が高いことが確認されてい ることから、 医薬品、 食品、 特に特定保健用食品、 健康食品、 野菜ジュース等の飲料、 特に容器詰飲料等に好適である。 ^
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なお、 本発明のモロヘイヤ合成樹脂吸着画分組成物をさらに詳細に分析した結果、 分子量の大きさによって、 4つの画分に分けられ （R > S 1 > S 2〉T)、 そのうち分子 量が小さな画分 （S 2および T) により強い血圧降下作用があることが明らかになった。 また、 その画分にアデニンが含まれることが判明した。 同じプリン塩基であるグアノシ ンとアデノシンは本発明のモロヘイャ分画処理工キス中に極微量し力含まれていない。
以下、 本発明を実施例により具体的に説明する。 なお、 本発明はこれらの実施例に 限定されるものではない。
[実施例 1 ]
1 . モロヘイヤエキス A (プロテアーゼ処理なし） の調製；
硬い茎を除去したモロヘイヤ葉をスチーム加熱後、 破砗し熱風乾燥を行い、 モロへ ィャ乾燥葉を得た。 このモロヘイャ乾燥葉 5 0 gに 2 0倍重量の 6 0 °C前後の蒸留水熱 水を加水し、 9 5 °C以上に加熱して殺菌処理を施した後 6 0 °Cまで冷却し、 ウォーター パス中で液温 6 0 °Cに保ったまま 1 0分おきに撹拌を行った。 1 時間後に、 9 5 °C達温 で 5分間保持し、 目の開き 8 5 0 μ ιηのふるいでろ過後、 次いで N o . 2のろ紙を使用 し吸引ろ過を行い、 モロヘイヤエキス溶液を得た。 このエキス溶液を適当な濃度まで減 圧濃縮した後、 凍結乾燥を行い 6 . 8 gの褐色の粉末を得た。 所謂、 従来のモロヘイヤ エキスである。 以下、 この粉末を 「A」 と称する。
2 . モロヘイヤ吸着画分エキス Ae (プロテアーゼ処理なし。 S P 2 0 7吸着処理あり） の調製；
プロテアーゼ未処理のモロヘイヤ葉から得られた上記エキス Aの吸着画分を調製し た。
純水に湿潤状態の合成吸着剤 S P 2 0 7 (三菱化学社製） 8 0 c cをガラスカラム へ充填し、 +分な純水を通液して S P 2 0 7充填力ラムとした。
1 5 g の乾燥葉を使用し 3 0倍加水で処理する以外は上記 「 1 . モロヘイヤエキス A (プロテアーゼ処理なし。 吸着処理なし） の調製」 と同様の処理を実施し、 得られた モロヘイヤエキス溶液 30 OmL (B r i x 0. 9、 pH6. 0) を前記ガラスカラム へ SV= 4の速度で通液後、 10 b e d容量の純水にて十分にモロヘイヤエキス溶液を 洗い出した。 モロヘイヤエキス溶液通液開始直後からカラム排出液を回収し、 素通り画 分とした。 次いで、 60%濃度に調整したエタノールを 5 b e d容量通液し、 通液開始 から 1Z2 b e d容量のカラム排出液を廃棄した後、 カラム排出液の回収を開始しエタ ノール通液終了まで回収した。 これを吸着画分とした。 素通り画分、 吸着画分をそれぞ れ減圧濃縮した後、 凍結乾燥して、 粉末状の素通り画分エキス （Ael) 1. 9 gおよび 吸着画分エキス （Ae2) 0. 29 gを得た。 なお、 「b e d」 とは、 吸着剤の充填容積 (=かさ） を示す。
[実施例 2]
1. モロヘイヤ酵素処理エキス B (プロテアーゼ処理あり） の調製；
硬い茎を除去したモロヘイヤ葉をスチーム加熱後、 破砕し熱風乾燥を行い、 モロへ ィャ乾燥葉を得た。 このモロヘイャ乾燥葉 50 gに 20倍重量の 60 °C前後の蒸留水熱 水を加水し、 95 °C以上に加熱して殺菌処理を施した後 60°Cまで冷却し、 ウォーター バス中で液温 60°Cに保ち、 原料の乾燥モロヘイヤ葉に対して 0. 7%重量のプロテア ーゼ Nァマノ G (株式会社天野ェンザィム社製） を少量の水に溶解して添加した。 その 後、 液温 60°Cに保ったまま 10分おきに撹拌を行った。 酵素添加から 1時間経過後、 96 °C達温で 5分間保持し、 目の開き 850 μπιのふるいでろ過後、 次いで N o. 2の ろ紙を使用し吸引ろ過を行い、 モロヘイヤ酵素処理エキス溶液を得た。 この酵素処理ェ キス溶液を適当な濃度まで減圧濃縮した後、 凍結乾燥を行！/、15. 75 gの褐色のモ口 ヘイャ酵素処理エキスの粉末を得た。 以下、 この粉末を 「B」 と称する。
2. モロヘイヤ吸着画分エキス _Be (プロテアーゼ処理あり。 SP 207吸着処理あり） 実施例 1と同様に、 純水に湿潤状態の合成吸着剤 S P 207 (三菱化学社製） 80 c cをガラスカラムへ充填し、 十分な純水を通液して S P 207充填カラムとした。 1 5 gの乾燥葉を使用し 30倍加水で処理する以外は上記 「 1. モロヘイヤ酵素処理ェ キス B (プロテアーゼ処理あり） の調製；」 と同様の処理を実施し、 得られたモロヘイ ャ酵素処理エキス溶液 30 OmL (B r i x 1. 2, pH6. 0) を前記ガラスカラム へ SV- 4の速度で通液後、 10 b e d容量の純水にて十分にモロヘイヤエキスを洗い 出した。 モロヘイヤ酵素処理エキス溶液通液開始直後からカラム排出液を回収し、 素通 り画分とした。 次いで、 60%濃度に調整したエタノールを 5 b e d容量通液し、 通液 開始から 1Z2 b e d容量のカラム排出液を廃棄した後、 カラム排出液の回収を開始し エタノール通液終了まで回収した。 これを吸着画分とした。 素通り画分、 吸着画分をそ れぞれ減圧濃縮した後、 凍結乾燥して、 粉末状の素通り画分エキス （Bel) 2. 1 gお よび吸着画分エキス （Be 2) 0. 8 gを得た。 なお、 「b e d」 とは、 吸着剤の充填容 積 （=力'さ） を示す。
3. モロヘイヤ吸着画分エキス B' e2 (プロテアーゼ処理あり。 SP 70吸着処理あり） の調製；
純水に湿潤状態の合成吸着剤 SP 70 (三菱化学社製， 芳香族系合成吸着剤） 80 c cをガラスカラムへ充填し、 十分な純水を通液して SP 70充填カラムとする。
上記 「1. モロヘイヤ酵素処理エキス B (プロテアーゼ処理あり） の調製」 と同様の処 理を実施して得られたモロヘイヤ酵素処理エキス溶液 30 OmL (B r i x l. 2, p H6. 0) を前記ガラスカラムへ SV= 4の速度で通液後、 1 O b e d容量の純水にて 十分にモロヘイヤエキスを洗い出した。 モロヘイヤエキス溶液通液開始直後からカラム 排出液を回収し、 素通り画分とした。 次いで、 60%濃度に調整したエタノールを 5 b e d容量通液し、 通液開始から 1Z2 b e d容量のカラム排出液を廃棄した後、 カラム 排出液の回収を開始しエタノール通液終了まで回収した。 これを吸着画分とした。 素通 り画分は廃棄し、 吸着画分を減圧濃縮した後、 凍結乾燥して吸着画分エキス （Β' e2) Δ
57 gを得た ここで用いる 「b e d」 とは、 吸着剤の充填容積 （ かさ） を示す (
[実施例 3]
1. モロヘイヤ酵素処理エキス B， （プロテアーゼ処理あり） の調製；
硬い茎を除去したモロヘイヤ葉をスチーム加熱後、 破砕し熱風乾燥を行い、 モロへ ィャ乾燥葉を得た。 このモロヘイャ乾燥葉 50 gに 20倍重量の 60 °C前後の蒸留水熱 水を加水し、 95 °C以上に加熱して殺菌処理を施した後 60°Cまで冷却し、 ウォーター バス中で液温 60°Cに保ち、 原料の乾燥モロヘイヤ葉に対して 0. 7%重量のサモアー ゼ Y10 (大和化成製） を少量の水に溶解して添加した。 その後、 液温 60°Cに保った まま 10分おきに撹拌を行つた。 酵素添加から 1時間経過後、 95 °C達温で 5分間保持 し、 目の開き 850 imのふるいでろ過後、 次いで No. 2のろ紙を使用し吸引ろ過を 行い、 モロヘイヤ酵素処理エキス溶液を得た。 この酵素処理エキス溶液を適当な濃度ま で減圧濃縮した後、 凍結乾燥を行い 7 gの褐色の酵素処理エキス粉末を得た。 以下、 こ の粉末を 「B'」 と称する。
2. モロへィャ吸着画分エキス B，， e (プロテアーゼ処理あり。 SP 207吸着処理あ り） の調製；
純水に湿潤状態の合成吸着剤 S P 207 (三菱化学社製） 1 500 c cをガラス力 ラムへ充填し、 十分な純水を通液して S P 207充填力ラムとする。
500 gの乾燥葉を使用し 20倍加水で用いる酵素は P C 10 F (大和化成製， Bacillus thermoproteolyticus Rokko由来） で処理する以外は実施例 2の 2と同様の処 理を実施し得られたモロヘイヤエキス溶液 1000 OmL (B r i x 1. 2, pH6. 1) を前記ガラスカラムへ SV= 4の速度で通液後、 10 b e d容量の純水にて十分に モロヘイヤエキスを洗い出す。 モロヘイヤエキス溶液通液開始直後からカラム排出液を 回収し、 素通り画分とする。 次いで、 60%濃度に調整したエタノールを 5 b e d容量 通液し、 通液開始から 1 2 b e d容量の力ラム排出液を廃棄した後、 力ラム排出液の „ ,
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回収を開始しエタノール通液終了まで回収する。 これを吸着画分とする。 素通り画分は 廃棄し、 吸着画分を減圧濃縮した後、 凍結乾燥して吸着画分エキス （Β'' e2) 23. l gを得た。 ここで用いる 「b e d」 とは、 吸着剤の充填容積 （=かさ） を示す。 [実施例 4]
1. モロヘイャピューレからのモ口ヘイヤエキス C ' (プロテアーゼ処理なし） の調製； 硬い茎を除去したモロヘイヤ葉茎をスチームブランチング後、 破碎しピューレ状に した状態で凍結保管した。 この凍結ピューレを流水中で解凍し、 ピューレ重量に対し 1.5 倍重量の蒸留水を加水し、 ジューサーミキサーにて均一に混合した。 これを 95°C以上 に加熱殺菌後 60°Cまで冷却し、 ウォーターバス中で液温 60°Cに保ち、 その後、 10 分おきに撹拌を行った。
1 時間経過後、 95 °C達温で 5分間保持し、 遠心分離器にて処理しピューレ分を除 去した。 これを目"の開き 850 πιのふるいでろ過後、 次いで No. 2のろ紙を使用し 吸引ろ過を行い、 モロヘイヤエキス (C，) を得た。
2. モロヘイヤ吸着画分エキス C' e (プロテアーゼ処理なし。 SP 207吸着処理あり） の調製；
次に純水に湿潤状態の合成吸着剤 S P 207 (三菱化学社製） 80 c cをガラス力 ラムへ充填し、 十分な純水を通液して S P 207充填力ラムとする。 上記操作により得 られたピューレ由来のモロヘイヤエキス溶液 30 OmL (B r i x 0. 8， pH 7. 0) を前記ガラスカラムへ SV= 4の速度で通液後、 10 b e d容量の純水にて十分にモロ ヘイヤエキス溶液を洗い出す。 モロヘイヤエキス溶液通液開始直後からカラム排出液を 回収し、 素通り画分とする。 次いで、 60%濃度に調整したエタノールを 5 b e d容量 通液し、 通液開始から 1/2 b e d容量のカラム排出液を廃棄した後、 カラム排出液の 回収を開始しエタノール通液終了まで回収する。 これを吸着画分とする。 素通り画分、 吸着画分をそれぞれ減圧濃縮した後、 凍結乾燥して素通り画分エキス （C' el) 1. 8 or
9 gおよび吸着画分エキス （C' e2) 0. 14 gを得た。 ここで用いる 「b e d」 とは、 吸着剤の充填容積 （=かさ） を示す。
[実施例 5]
1. モロヘイヤピューレからのモロヘイヤ酵素処理エキス C (プロテアーゼ処理あり） の調整；
硬!/、茎を除去したモロヘイャ葉茎をスチームブランチング後、 破砕しピューレ状に した状態で凍結保管した。 この凍結ピューレを流水中で解凍し、 ピューレ 1000 gに 対し 1. 5倍重量の蒸留水 （1500 g) を加水し、 ジューサーミキサーにて均一に混 合した。 これを 95 °C以上に加熱殺菌後 60°Cまで冷却し、 ウォーターバス中で液温 6 0°Cに保ち初期ピューレ重量 （1000 g) に対し 0. 05%重量のプロテアーゼ Nァ マノ G (株式会社天野ェンザィム社製） を少量の水に溶解して添加した。 その後、 10 分おきに撹拌を行った。 酵素添加から 1時間経過後、 95 °C達温で 5分間保持し、 遠心 分離器にて処理しピューレ分を除去した。 これを目の開き 850 μιηのふるいでろ過後、 次いで No. 2のろ紙を使用し吸引ろ過を行い、 ピューレ由来のモロヘイヤ酵素処理ェ キス溶液を得た。 このエキス溶液を適当な濃度まで減圧濃縮後、 凍結乾燥を行い 23 g の褐色の粉末を得た。 この酵素処理エキス粉末を以下 「C」 と称する。
2. モロヘイヤ吸着画分エキス C e (プロテアーゼ処理あり。 SP 207吸着処理あり） の調製；
次に純水に湿潤状態の合成吸着剤 S P 207 (三菱化学社製） 80 c cをガラス力 ラムへ充填し、 十分な純水を通液して S P 207充填カラムとする。 上記操作により得 られたピューレ由来のモロヘイヤ酵素処理エキス溶液 30 OmL (B r i x 1. 6, p H6. 5) を前記ガラスカラムへ SV== 4の速度で通液後、 10 b e d容量の純水にて 十分にモロヘイヤエキスを洗い出す。 モロヘイャ酵素処理エキス溶液通液開始直後から カラム排出液を回収し、 素通り画分とする。 次いで、 60%濃度に調整したエタノール を 5 b e d容量通液し、 通液開始から 1/2 b e d容量のカラム排出液を廃棄した後、 カラム排出液の回収を開始しエタノール通液終了まで回収する。 これを吸着画分とする。 素通り画分、 吸着画分をそれぞれ減圧濃縮した後、 凍結乾燥して素通り画分エキス （C e l) 2. 1 gおよび吸着画分エキス （C e 2) 0. 9 gを得た。 ここで用いる 「b e d」 とは、 吸着剤の充填容積 （=かさ） を示す。
[実施例 6 ]
モロヘイャ吸着画分エキス De2の調製 （酵素処理あり。 S P 850吸着処理あり） ； 純水に湿潤状態の合成樹脂吸着剤 SP 850 (三菱化学社製， 芳香族系合成吸着剤） 80 c cをガラスカラムへ充填し、十分な純水を通液して S P 850充填カラムとする。 実施例 2のモ口ヘイャ酵素処理エキス Bと同様の処理を実施し得られたモ口ヘイヤエキ ス溶液 300mL (B r i x 1. 0, pH6. 0) を前記ガラスカラムへ S V= 4の速 度で通液後、' 10 b e d容量の純水にて十分にモロヘイヤエキスを洗い出す。 モロヘイ ヤエキス溶液通液開始直後からカラム排出液を回収し、 素通り画分とする。 次いで、 6 0 %濃度に調整したエタノールを 5 b e d容量通液し、 通液開始から 1 / 2 b e d容量 のカラム排出液を廃棄した後、 カラム排出液の回収を開始しエタノ一ル通液終了まで回 収する。 これを吸着画分とする。 素通り画分は廃棄し、 吸着画分を減圧濃縮した後、 凍 結乾燥して吸着画分エキス （De 2) 0. 47 gを得た。 ここで用いる 「b e d」 とは、 吸着剤の充填容積 （=かさ） を示す。
上記実施例で使用した酵素は下記表のとおりである。
表 2 <使用酵素 >
Figure imgf000028_0001
[試験例 1 ]
1. モロヘイヤエキス溶液 （吸着処理なし） の血圧降下評価試験；
自然発症性高血圧ラット （ S H R) への単回投与時の降圧効果；
自然発症性高血圧ラット（以下、 SHR)を用いて単回投与時の降圧効果を調べた。 上記実施例 1、 2、 3及び 5で得られた吸着処理を行う前段階の粉末状のモロヘイ ヤエキス A、酵素処理エキス B、酵素処理エキス B，、酵素処理エキス Cを 1 O O Omg /k g (SHRの体重） となるように注射用水に溶解し、 粉末 A、 B、 B， については 1 7週齢 （雄性）、 粉末 Cについては 18週齢 （雄性） の高血圧自然発症ラット （SHR /Ho s、 SPF) へ胃ゾンデを用いて単回経口投与を行った。 投与前、 投与後 4時間 後、 8時間後及び 24時間後に非観血的に血圧を測定した。 試験に用いた動物数は下記 表のとおりである。 なお、 各群 7匹で行ったが、 明らかに異常な血圧変動を示した個体 のデータは削除した。
表 3 <試験群 >
Figure imgf000029_0001
結果 （粉末 Α、 Β、 Β ' ) ；
投与 2 4時間後までの収縮期血圧の変動を図 1に示す。 投与 2 4時間後までの拡張 期血圧の変動を図 2に示す。 投与 2 4時間後までの心拍数の変動を図 3に示す。 投与 2
4時間後までの平均血圧の変動を図 4に示す。 投与 2 4時間後までの S H Rの収縮期血 圧の日内変動を図 5に示す。
結果 （粉末 B、 B ' の粉末 Αとの比較） ；
モロヘイヤエキス Aの血圧変動は日内変動幅であると判断できる。 一方、 酵素処理 エキス Bおよび酵素処理エキス B 'は、投与 4時間後にそれぞれ強い血圧降下を示した。 また、 平均血圧においても Bおよび B ' は投与後 4時間後にそれぞれ強い血圧降下を示 した。
上記実施例 2 ( B) 及び実施例 3 ( B ' ) の試験結果から明らかなように、 モロヘイ ャ葉を蛋白分解酵素で処理することによって得られた酵素処理エキスは、 酵素処理を行 わない葉から得られた従来のエキスよりも、 より強い血圧降下作用を示した。 各図にお いて、 各値は平均値を示す。
結果 （粉末 C) ；
投与 2 4時間後までの収縮期血圧および拡張期血圧の変動を図 6に示す。
収縮期血圧および拡張期血圧ともに投与 8時間後にぉレ、て投与前の測定値と比較して統 計学的に有意な低下が確認された。 モロヘイヤピューレ原料にぉレ、てもプロテアーゼ酵 素処理により、 その血圧降下作用が増強されることが確認された。
[試験例 2] モロヘイヤ合成樹脂吸着画分エキス （吸着処理あり） の血圧降下評価試験 自然発症性高血圧ラット （SHR) への単回投与時の降圧効果； 合成樹脂吸着画分エキス A e 2 (プロテアーゼ処理なし。 吸着処理あり） とモロヘイ ヤエキス A (プロテアーゼ処理なし。 吸着処理なし） の比較；
1 7週齢の雄性 SHR/H o s (n = 8) に実施例 1で得られた吸着画分エキス (Ae2) を 1000mg/k g (SHRの体重） となるように単回経口投与し、 その効 果を確認した。 投与 24時間後までの収縮期血圧の変動を図 7に示す。 結果 （粉末 A e 2と Aの比較） ； ； 吸着画分土キス A e 2 (プロテアーゼ処理なし。 吸着処理あり） は、 同実施例 1の モロヘイヤエキス A (プロテアーゼ処理なし。 吸着処理なし） に関する結果 （図 1の A 参照） と比較して 24時間後で強い血圧降下作用を示した。 これにより、 吸着画分ェキ スが持続性の優れた血圧効果作用を有することが明らかとなった。
[試験例 3] 合成樹脂吸着画分エキス B e (プロテアーゼ処理あり。 吸着処理あり） の単回投与時の 降圧効果； 上記試験例 2と同様に、 実施例 2で得られた吸着画分 (B e l, B e 2) の各粉末 を用いて雄 SHR/Ho sラットへの単回投与試験を実施した。 投与ボリュームは 10 mL/k gとした。 試験に用いた動物数は下記表のとおりである。
表 4 動物数
素通り画分 （B e1 ) 1000mg/kg 7
吸着画分 （B e2) 1000mg/kg 7
結果 （粉末 Be l 、 Be 2 ) ； 上記実施例 2で得られた合成樹脂吸着画分エキス （B e 1及び B e 2 ) の投与 2 4 時間後までの平均血圧の変動を図 8に示す。 実施例 2で得られたプロテアーゼ処理粉末 B (酵素処理あり。 樹脂吸着処理なし。 ) の投与 2 4時間後までの平均血圧の変動を図 9 に示す。 図 8より、 素通り画分よりも吸着画分の方がより強い血圧降下作用を示して おり、 またその効果は 2 4時間後まで持続していることが示された。 図 9の結果と比較 して、 吸着画分は血圧降下作用が 続的であり、 血圧降下作用の強さも優れている。
[試験例 4 ]
前処理としてのプロテアーゼ処理の効果試験；
次にプロテアーゼ未処理のモロヘイヤ吸着画分エキス A e 2 (実施例 1 ) と、 プロ テアーゼ処理を施したモロヘイヤ吸着画分エキス B e 2 (実施例 2 ) の比較を行った。 その結果を図 1 0及び表 5に示す。
表 5
Figure imgf000031_0001
また、実施例 4の C' e 2と実施例 5の C e 2吸着画分収量の比較を行つたところ、 モロヘイヤピューレを固液分離して得られる溶液に関して、 酵素処理を行つた実施例で o丄
は酵素処理を行わない実施例と比較して 6 . 4倍収量が多かった。
このことからピューレ状態の場合においても酵素加水分解処理後に吸着処理を行う ことで （実施例） より強い血圧降下作用を示す吸着画分を効率よく得ることができるこ とが確認された。
ところで、 それぞれの吸着処理へ供した溶液の B r i X測定値より算出される可溶 性固形分量 （溶液ボリューム X B r i x測定値 ÷ 1 0 0 ) に対する吸着画分の割合は次 式で算出される。
吸着画分/ (B r i x測定値より算出される可溶性固形分量） X 1 0 0 (%) 本実施例におけるこれら吸着画分の割合は、測定の結果、酵素処理を行わない場合、 実施例 1では 1 0 . 7 %、 実施例 4では 5 . 8 %であった。 一方、 酵素処理を行ったェ キスの合成樹脂吸着を行った場合は、 実施例 2— 3は 1 9 %、 実施例 2— 2では 2 2 .
2 %、実施例 3 _ 2では 1 9 . 3 %、実施例 5では 1 8 . 8 %、 実施例 6では 1 5 . 7 % であった。
以上のことから、 モロヘイヤをプロテアーゼ処理したエキスはその状態に関らず固 液分離後、 N o . 2のろ紙でろ過した溶液が本特許製法で得られる吸着画分をその溶液 の B r i x測定値より算出される可溶性固形分量 （溶液ボリューム X B r i x測定値 ÷ 1 0 0 ) に対して 1 5 %以上含有する組成であると定義することができる。
使用する合成吸着剤の量は通液する溶液中の吸着成分を十分に吸着できる量であれ ばよく、 好ましくは通液する溶液を B r i X 1 %にしたときの容積に対しその 1 Z 8倍 量以上の合成吸着剤を使用する。
結果；
図 1 0から明らかなとおり、 血圧降下作用の面で優れている吸着画分は、 プロテア ーゼ処理を施していない実施例 1の画分エキス A eでは 0 . 2 9 gであったが、 予めプ 口テアーゼ処理を施した実施例 2では 0 . 8 gであり、 酵素処理を行わないものと比べ て酵素処理を行ったものの方がおよそ 2 . 8倍多かった。 また上記表 5から明らかなと おり、 各例の全体の固形分量 （素通り画分 +吸着画分） に対する吸着画分の割合は、 実 施例 1の画分エキス A e 2で 1 0. Ί %であり実施例 2の画分エキス B e 2では 22.
2 %であり、酵素処理を行った場合は、酵素処理を行わなかった場合に比べておよそ 2.
1倍多かった。 以上の結果から、 分画処理を施すに先立ってプロテアーゼによる酵素処 理を行うことで、 より強レ、血圧降下作用を示す吸着画分エキスを効率よく得ることがで きることが確認できた。
[試験例 5]
単回投与による有効性と安全性の確認試験；
実施例 2で得られたモ口ヘイャ吸着画分エキス B e 2の有効性と安全性を確認する 目的で、 異なる週齢の SHR/Ho sにエキスを単回経口投与し、 その血圧変動を比較 した。 試験に用いた SHR/Ho sは加齢に伴い血圧が上昇する。 そのため、 週齢が異 なるラットでの比較は、 高血圧の重症度の違いに対する効果を比較することとなる。 ま た、 投与 24時間後の血圧変動を確認することで、 翌日の飲み忘れなどの場合に有害事 象が起こらないかを確認した。
試験は、 1 4週齢、 あるいは 23週齢の雄性 S HR/H o sに実施例 2で得られた モロヘイヤ合成樹脂吸着画分エキス B e 2を 1 00 Omg/k g単回経口投与し、 その 効果を確認した。 結果を図 1 1に示す。 各値は平均値 +あるいは一標準誤差を示す （n = 7)0 異なる文字 （アルファベット） 間では統計学的に有意な差があることを示す。
；
1 4週齢の SHR/Ho sは投与前の血圧が 20 3. 80mmHgであったが、 投 与 24時間後には 1 96. 6 3 mmH gまで低下した。 一方、 23週齢の S HRZH O S は投与前の血圧が 226. 8 1 mmH gであったが、 投与 24時間後には 202. 43 mmHgまで低下した。 すなわち、 投与前の血圧測定値に関係なく、 投与 24時間後に は 200 mmH g前後にまで低下した。 投与 28時間後の血圧測定の結果、 201. 7 5 mmH gを示した。 考察；
投与 2 8時間後の血圧測定の結果、投与 2 4時間後までに低下した血圧を維持され、 急激なリバゥンドはなレ、ことも確認された。 実施例 2で得られたモ口ヘイャ合成樹脂吸 着画分エキス Be2は高い血圧に対しては良好に低下させ、 低い血圧に対しては軽度に低 下させることが確認された。 すなわち、 正常な血圧の人が摂取しても異常な低血圧を呈 しないことが示唆された。 また、 投与を中止しても急激に血圧が上昇しなかった。 すな わち、 摂取し忘れても低下した血圧が急激に上昇せず、 それによる副作用が生じないこ とが示唆された。 よって、 当該エキスは有効性だけでなく、 安全性が高い素材であるこ とが確認された。
[試験例 6 ]
長期投与による血圧上昇抑制効果の確認試験；
5週齢の雄性 S H R/H o sに実施例 2の吸着画分エキス B e 2を 9 0 0 m g Z k g ( S H Rの体重） で 1日 1回、 5 6日間反復経口投与した。 対照群には注射用水を同 様に投与した。 結果を図 1 2に示す。 各値は平均値を示す。 また、 図中、 「*」 は対照群 と比較して危険率 5 %以下で統計学的に有意な差があったことを示す。 「**」 は対照群と 比較して危険率 1 %以下で統計学的に有意な差があったことを示す。
結果；
対照群では加齢とともに血圧は上昇した。 し力 し、 モロヘイヤ吸着画分エキス投与 群では投与 4週目より、対照群と比較して統計学的に有意な血圧上昇抑制が確認された。 この結果から、 モロヘイヤ吸着画分エキスは継続摂取することで血圧の上昇を抑制でき ることが確認された。 。 λ
34
[試験例 7]
I.血圧降下作用機序の確認；
1. AC Ε阻害活性の有無について；
モロヘイヤ中に極めて微量に含まれるニコチアナミンが AC E阻害活性を有するこ とが知られている。 そこで、 本発明のモロヘイヤ分画処理エキスの血圧降下の機序を検 ff寸する為に、 すでに報告されている A C E阻害活性に関して検討した。
雄性 SDラット 7〜 10週齢をペントバルビタール （50mgZk g、 i p) で麻 酔後、 体表面心電図 （I I誘導） を記録した。 大腿動脈に力ニューレを挿入して全身血 圧を測定した。 大腿静脈には昇圧物質投与用の力ニューレを揷入し、 十二指腸内には検 体注入用のカテーテルを留置した。麻酔状態は、ペントバルビタールを適宜皮下投与（目 安： 10〜： L 5mgZk gZh r) して維持した。 循環動態が安定した時点で、 アンジ ォテンシン I (l g/k g、 i V)を静脈内投与した。 すると、 アンジォテンシン Iは 生体内のアンジォテンシン変換酵素（AC E)の働きでアンジォテンシン I Iに変わり、 血圧を上昇させた。 血圧が回復したら実施例 2のモロヘイヤ吸着画分エキス Be2を更に 陽イオン交換処理し、 その吸着画分として得られるさらに精製したエキス （実施例 7参 照） を十二指腸内に投与し （500mgZk g)、 投与 30分および 60分の時点で同用 量のアンジォテンシン Iを静脈内投与して昇圧反応を確認した。 結果を図 13に示す。 各値は平均値 +標準誤差を示す （N=6)。
結果；
エキス投与時（Control)におけるアンジォテンシン I投与による昇圧反応は + 56.
2mmHgであった。 投与 30分後および 60分後にァンジォテンシン Iを投与した場 合、 昇圧反応はそれぞれ + 57. 7mmHg、 +58. 2mmHgであり、 変化は認め られなかった。 すなわち、 モロヘイヤ吸着画分エキス投与によりアンジォテンシン Iか らアンジォテンシン I Iへの変換を阻害する作用は確認できなかった。 よって、 モロへ ィャ吸着画分エキスには、 すでに報告されているような AC E阻害作用は無いことが確 01_
35
認された。
2. 血管弛緩作用に関する試験；
本発明のモロヘイヤ吸着画分ェキスは従来から報告されている ACE阻害活性がな いことが上記試験例で確認された。 そこで、 血圧降下のメ力二ズムを解明する為にさら なる試験を実施した。
雄性 SDラットから摘出した胸部大動脈を用いてリング状標本を作成し、酸素化し た 37 °Cの TVi'ode液中で血管の張力を計測した。 血管収縮物質 （phenylephrine) で 血管を収縮させた後 （Ph e O. 1 μΜ) に、 実施例 2のモロヘイヤ吸着画分エキス Β e 2を、 100、 300、 1000、 3000 μ g ZmL添加し、 血管弛緩作用の有無 を観察した。 その結果を図 14に示す。 また、 上記試験例 7の 1で使用したエキスをさ らに精製したものについても、 同様の実験を行った。 その結果を図 15に示す。 なお、 Phenylephrine を添加した際の張力を 100%とし、' それより低下した場合を血管が弛 緩した状態とした。
なお、 精製は下記実施例 7のようにして行った。
H¾；
図 14に示すように、 本発明のモロヘイヤエキスは 1000 g/mL以上で統計 学的に有意な弛緩作用を示した。 よって、 本発明のモロヘイヤ吸着画分エキスの血圧降 下作用の作用機序が、 血管弛緩作用に基づくことが明らかとなった。 これは、 モロヘイ ャに関する、 新たな知見である。 本発明のモロヘイヤ吸着画分エキスは 1000 μ gZ mLより統計学的に有意な弛緩作用を示した。 また、 図 15から明らかなとおり、 さら に精製したものについては、 500 μ g/mLより統計学的に有意な弛緩作用を示した。 各値は平均値土標準誤差を示す。
各値は平均値土標準誤差を示す （N=4)。 「*」 は、 phenylephrine添加時の張力と 比較して統計学的に有意な差があったことを示す。 [実施例 7]
モロヘイヤエキスからの血圧降下活性画分の精製；
試験例 7の 2におけるモロヘイヤ吸着画分エキス B e 2の精製は以下のようにして 行った。
表 6 モロヘイヤ乾燥葉（100%) 酵素処理抽出
I
合成吸着剤 SP207吸着 エキス（6%) 陽イオン交換クロマトグラフィー（PK208樹脂'吸着) ェキ-ス (4%) ゲルろ過クロマトグラニフィー（HW40EC樹脂)
エキス R エキス S- 1 エキス S-2 エキス T
(2.47%) (0.78%) (0.31%) (0.30%)
実施例 2の方法により、 モロヘイヤ吸着画分エキス Be2を調製した。 その後、 前記 吸着剤画分 28. 4 gを使用し、 PK 208樹脂を用いた陽イオン交換カラムクロマト グラフィー、 HW40EC樹脂を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより、 分子量の 大きい画分からエキス R (1 1. 1 2 g)、 エキス S— 1 (3. 48 g)、 エキス S— 2 (1. 39 g)、 エキス T (1. 36 g) を得た。 それぞれの画分について、 血管弛緩作 用を比較したところ、 S— 2及び Tに強レ、血管弛緩作用力 S観察された。 結果を図 17に 示す。
Tからは、 イソクエノレシトリン、 ハイ ド口ペリン等のフラボノイ ド誘導体がピーク として検出された。 S— 2画分からはアデニンが検出された。
[試験例 8]
反射性頻脈発生の確認試験；
ヒ ドララジン等の血管を拡張する医薬品には、 血管抵抗減少に伴う反射性の心拍数 の増加が知られている。 反射性の心拍数の增加は、 頻脈、 心悸亢進、 胸内苦悶、 逆説的 血圧上昇、 動悸などにつながり、 患者の QOLや医薬品服用に対するコンプライアンス 低下につながる。 モロヘイヤには試験例 7で確認されたように、 過剰に収縮した血管を 弛緩させる作用がある。 そこで、 試験例 7で使用したさらに精製したエキスの投与時の 心拍类女の変ィ匕を確認した。
雄性 SDラット 7〜： 10週齢をペントバルビタール （10mgZk g、 i p) で麻 酔後、 体表面心電図 （Π誘導） を記録した。 大腿動脈に力ニューレを挿入して全身血圧 を測定した。 大腿静脈には昇圧物質投与用の力ニューレを挿入し， 十二指腸内には検体 注入用のカテーテルを留置した。 麻酔状態は、 ペントバルビタールを適宜皮下投与 （目 安： 10〜： 1 5mgZk g/h r) して維持した。 循環動態が安定した時点で検体 （5 0 Omg/k g) を十二指腸内に投与し、 30分および 60分の時点で心拍数を測定し た。 結果を図 16に示す。 各値は平均値を示す （N=6)。 「**」 は投与直後と比較して 危険率 1 %以下で統計学的に有意な差があったことを示す。
結果；
試験例 7で使用したさらに精製したエキスの投与時点の心拍数は 426. 33 B.
P. M (非麻酔下での参考値は 372〜419B. P. M) であった。 し力 し、 エキス を投与 60分後において心拍数には有意な低下 （394. 17 B. P. M Pく 0. 0 1)が認められた。 よって、モロヘイヤエキス投与により反射性頻脈は起こらなかった。 また、 麻酔時に起こった心拍数の増加をむしろ低下させ、 正常な心拍数に近づける効果 が確認された。 [試験例 9]
モロヘイャ合成樹脂吸着画分組成物中の蛋白質のァミノ酸構成にっレ、て確認試験； 実施例 2で得た粉末状の素通り画分エキス （B e l) および吸着画分エキス （Be 2) を 1 00 m g /L濃度になるように調製し、 遊離ァミノ酸および酸加水分解後のァ ミノ酸について H PLC分析を行った。 HP LC分析の条件は下表のとおりである。 な お、 酸加水分角军処理は、 サンプル 100〜： l O O O p pmに調整し、 その 2 mLを採取 し、 そこに 6mo 1 ZL塩酸 0. 5 mLを添加してオートクレーブで 121°C 3時間処 理をして行った。 結果を図 18に示す。
表 7
Figure imgf000039_0001
上記試験結果から、 遊離のァミノ酸の大部分は素通り画分へ移行していることが判 明した。
また、 ァミノ酸増分つまり水溶性蛋白質構成ァミノ酸量はそれぞれで確認できるが 吸着画分でより多い。 このことは水溶性蛋白質の多くが吸着画分へと分離されていると 言える。
よってモロヘイャ葉の酵素加水分解処理により生成した水溶性蛋白質の多くは合成 吸着剤処理により、 その吸着画分へと分離されていると推測でき、 本発明および本発明 を利用して製造されたモロヘイヤ由来組成物はこれら水 ? ト生蛋白質ゃぺプチドが有する 機能性が期待できる素材である。
上記試験結果より、 本発明のモロヘイヤ合成樹脂吸着画分組成物、 特にモロヘイヤ 酵素処理エキス溶液を合成樹脂吸着分画して得られるモロヘイャ合成樹脂吸着画分組成 物は、 下記式 （A) で算出されるアミノ酸を含有し、 かつ各アミノ酸濃度が下記式 （1) から （3) の要件を全て満たしていることが明らかになった。
(A) ァミノ酸増分 =酸加水分解後のァミノ酸量一酸加水分解前のァミノ酸量
ここで、 ァミノ酸増分は、 任意の濃度のモ口ヘイャ合成樹脂吸着画分組成物溶液 2mLに対し、 0. 5mLの 6 N塩酸を添加してオートクレープにて 1 2 1°Cで 3時間の処理を行った場合のァミノ酸増分を意味する。
( 1 ) G 1 yが V a 1の 3重量倍以上、 かつ G 1 yが I 1 eの 3重量倍以上； (2) S e j：、 A 1 a及び L e uから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸が V a 1の
2重量倍以上、 かつ S e r、 A 1 a及び L e uから選ばれる少なくとも 1つのァ ミノ酸が I 1 eの 2重量倍以上；
(3) §が¥ & 1の1重量倍以上、 かつ A r g力 S I 1 eの 1重量倍以上； [試験例 10] I.血圧降下作用機序の確認;
II. 血管弛緩作用メカニズムに関する試験；
試験例 7の第 2項で血管弛緩作用に関する試験を行ったが、 さらに血管弛緩作用の メカニズムを明らかにするために、ラットの胸部大動脈を用いてリング状標本を作成し、 酸素化した栄養液中で血管の張力を計測することによつて本発明の樹脂吸着画分エキス の血管弛緩作用につレ、て以下のとおり試験を行つた。 ^
40
栄養液中に血管収縮物質としてのフエ二レフヱリン （phenylephrine) を 0 . 1 μ M の濃度になるように加えて血管を収縮させた後、 上記実施例 2で得たモロヘイャ吸着画 分エキス B e 2をそれぞれ 0 . 5 mg/ml, 1 . 0 mg/ml、 2 . 5 mg/ml及び 5 . 0 mg/ml となるように該栄養液中に添加して、 血管拡張作用の有無を観察した （n二 6)。
次に、 血管拡張作用を抑制する L-NAME (—酸化窒素 (NO) 産生抑制） を 1 0 0 μ Μ、 またはィンドメタシン （P G I 2抑制剤） 1 0 μ Μの濃度になるように予め栄養液 中に添加した状態で、 同様の操作、 即ちフエ二レフエリンとモロヘイヤ吸着画分エキス B e 2を添加して血管弛緩作用における血管内皮細胞の関与について観察を行った。 さ らに内皮を除去した血管を用いて同様の操作を行うことにより 血管弛緩作用における 血管内皮細胞の関与について調べた （各 n=6)。 結果を図 1 9に示す。
図中の 「L-NAME」 は、 L-NAME+フエ二レフエリン +モロヘイヤエキス B e 2を 意味し、 「Indomethacin」 は、 インドメタシン +フエ二レフエリン +モロヘイヤエキス B e 2を意味する。
図中の *印から明らかなとおり、 フエ二レフエリン添加時の張力と比較して危険率 5%以下で統計学的に有意な差があった
また、 図中の * *印から明らかなとおり、 フエ二レフヱリン添加時の張力と比較し て危険率 1%以下で統計学的に有意な差があった。
ロ^:；
図 1 9力 ら明ら力なとおり、 モロヘイヤ吸着画分エキス B e 2は 0 . 5 mg/mlより統 計学的に有意に、 かつ濃度依存的に血管弛緩作用を示した。 インドメタシン （P G I 2 抑制剤） で前処置したものは、 モロヘイヤ吸着画分エキス B e 2による血管弛緩反応に 影響を与えなかった。 一方、 L-NAME (NO産生抑制） で前処置した場合は、 モロヘイ ャ吸着画分エキス B e 2による血管弛緩の濃度-反応曲線の右方への移動は僅かであつ た。
内皮を除去した血管を用いて同様の操作を行った場合、 モロヘイヤ吸着画分エキス B e 2による血管弛緩の濃度-反応曲線の変化は、 L-NAME を前処置した場合と同様であ つ 7こ。
このことから、 本発明の合成樹脂吸着画分組成物は、 血管内皮に作用するものでは ないことが明らかとなった。
上記の試験結果から明らかなとおり、 本発明のモロヘイヤ吸着画分エキスは血管内 皮機能が低下した状態でも効果を発揮して血管を弛緩するので、 血管全体の機能低下に 依存せずに、 動脈硬化等の循環器系疾患を有する高血圧症患者に対しても安心して投与 することが可能である。 産業上の利用可能性
本発明のモロヘイャ吸着画分エキス、 即ちモロヘイヤ合成樹脂吸着画分組成物は、 優れた血管弛緩作用、 特に血圧降下作用を有し、 味 ·臭いに特異な厭味が少ないことか ら経口投与により摂取することが可能であり、 健康食品、 健康飲料、 特定保健用食品等 に有効に利用できるものである。 さらに副作用の恐れがなく、 経済的精神的負担も軽い ため、 安全に長期間継続して摂取することが可能であり、 高血圧の予防、 改善、 治療に 適している。 また、 本発明のモロヘイヤ吸着画分エキスは、 モロヘイヤに含まれている ことが従来から知られていた A C E阻害活性を有する二コチアナミンを有効成分とする ものではなく、 血管弛緩作用を作用機序とする従来品とは全く異なったものであり、 そ の効果が期待されるものである。

Claims

請求の範囲
1. モロヘイヤエキス溶液を合成樹脂吸着剤で吸着処理し、 その吸着画分を溶出溶媒に より溶出処理して回収される血管弛緩作用を有するモロヘイャ合成樹脂吸着画分組成 物。
2. モロヘイヤエキス溶液がモロヘイヤをプロテアーゼ処理して得られるモロヘイヤ酵 素処理工キス溶液である請求項 1に記載のモ口ヘイャ合成樹脂吸着画分組成物。
3. プロテアーゼが、 エンドべプチダーゼである請求項 2に記载のモロヘイヤ合成樹脂 吸着画分組成物。
4. ェンドぺプチダーゼが、 Bacillus 由来のエンドぺプチダーゼである請求項 3に記载 のモロヘイャ合成樹脂吸着画分組成物。
5. 合成樹脂吸着剤が芳香族重合体を母体とする合成樹脂吸着剤である請求項:！乃至 4 のいずれか 1項に記載のモロヘイヤ合成樹脂吸着画分組成物。
6. 下記式 （A) で算出されるアミノ酸を含有し、 かつ各アミノ酸濃度が下記式 （1) から （3) の要件を全て満たすことを特徴とする請求項 1乃至 5のいずれか 1項に記 載のモ口ヘイャ合成樹脂吸着画分組成物。
(A) ァミノ酸増分 =酸加水分解後のァミノ酸量一酸加水分解前のァミノ酸量； ここで、 ァミノ酸増分は、 任意の濃度のモ口ヘイャ合成樹脂吸着画分組成物溶液 2mLに対し、 0. 5mLの 6N塩酸を添加してオートクレーブにて 121°Cで 3時間の処理を行った場合のアミノ酸増分を意味する。
(l) G l yが Va lの 3重量倍以上、 かつ G 1 yが I 1 eの 3重量倍以上；
(2) S e r、 A 1 a及び L e uから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸が V a 1の 2重量倍以上、 かつ S e r、 A 1 a及び L e uから選ばれる少なくとも 1つのァ ミノ酸が I 1 eの 2重量倍以上；
( 3 ) A r gが V a 1の 1重量倍以上、 かつ A r g力 S I 1 eの 1重量倍以上；
7. モロヘイヤエキス溶液を合成樹脂吸着剤で吸着処理し、 その吸着画分を溶出溶媒に より溶出処理して回収することを特徴とする血管弛緩作用を有するモロヘイャ合成樹 脂吸着画分組成物の製造方法。
8 . モロヘイヤエキス溶液がモロヘイヤをプロテアーゼ処理して得られるモロヘイヤ酵 素処理エキス溶液である請求項 7に記載のモロヘイヤ合成樹脂吸着画分組成物の製造 方法。
9 . プロテアーゼが、 エンドぺプチダーゼである請求項 8に記載のモロヘイヤ合成樹脂 吸着画分組成物の製造方法。
1 0 . ェンドぺプチダーゼが Bacillus由来のェンドぺプチダーゼである請求項 9に記載 のモ口ヘイャ合成樹脂吸着画分組成物の製造方法。
1 1 . 合成樹脂吸着剤が芳香族重合体を母体とする合成樹脂吸着剤である請求項 7に記 載のモ口ヘイャ合成樹脂吸着画分組成物の製造方法。
1 2 . 請求項 1乃至 6の!/、ずれか 1項に記載のモ口ヘイャ合成樹脂吸着画分組成物を含 んでなる血管弛緩剤。
1 3 . 請求項 1乃至 6のいずれか 1項に記載のモ口ヘイャ合成樹脂吸着画分,組成物を含 んでなる飲食物。
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