WO2009080910A2 - Procédé de criblage de composés utilisables pour le traitement de troubles respiratoires - Google Patents

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Christian Gestreau
Richard Warth
Dirk Heitzmann
Jörg Thomas
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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    • G01N2800/12—Pulmonary diseases

Definitions

  • the present invention relates to the use of a method of screening compounds for the treatment of respiratory disorders in a mammal. It finds particular application in the identification of new candidate molecules for the treatment of respiratory disorders.
  • respiration is regulated by three chemical parameters of the arterial blood: i) the increase in carbon dioxide, or hypercapnia. ii) decreased blood pH, or acidosis. iii) the decrease of oxygen concentration in the blood, or hypoxia.
  • sleep apnea syndrome is a real public health problem. This syndrome is often associated with obesity. For example, in the United States, about 3 million men and 1.5 million women suffer from sleep apnea syndrome. This syndrome could have negative consequences on the state of health of the people suffering from it, for example by worsening the cardiovascular diseases as indicated by the article of Namen and collaborators ((2002) «Increase Physician-reported sleep apnea: the National Ambulatory Medical Care Survey. "Chest 121 (6): 1741-1747 (Ref 5)).
  • sleep apnea syndromes have a heterogeneous etiology and can be classified according to the likely underlying pathologies.
  • the subgroup of obstructive sleep apnea is characterized by upper airway obstruction that prevents proper and efficient ventilation.
  • the subgroup of central sleep apnea is characterized by defects in the regulation of respiration at the level of the brainstem, the nerve control of the respiratory muscles no longer functioning transiently.
  • the mixed apnea subgroup corresponds to central apnea followed by obstructive sleep apnea.
  • non-hypercapnic central apnea is characterized by periods of hyperventilation that result in a reduction in the concentration of arterial carbon dioxide called hypocapnia.
  • the reduction of carbon dioxide results in a lack of stimulation of the brainstem breathing centers which results in longer breaks in breathing, and therefore, causes a reduction in arterial oxygen concentration.
  • sleep apnea syndrome therapy includes surgical procedures and devices for establishing positive pressure in the upper respiratory tract.
  • the TASK-1 channels are part of a family comprising the TASK 1, TASK 2 and TASK 3 channels. These are K + channels with 4 transmembrane domains and two channel domains (K2P channels) (Goldstein SA et al (2005), "International Union Pharmacology, LV. Nomemclature and molecular relationship of two-pot potassium channels ". Pharmacol Rev., 57, 527-540. (Ref 6)).
  • TWIK-related acid sensitive K + (TASK) heteroneric express motorkines channels TASK-1 (KNCK3) and TASK-3 (KNCK9) subunits.” J. Neurosci, 24, 6693-6702 (Ref 9)). These channels produce a K + current that is inhibited by external acidification and subsequent activation of G protein-coupled receptors (Mathie A (2007) “Neuronal two pore domain potassium channels and their regulation by G protein-coupled receptors”. J. Physiol, 578, 377-385 (Ref 10)).
  • TASK-1 channels are abundant in the brain, adrenal glands, blood vessels, and heart, and based on observations of knock-out mice for TASK-1, it has been shown that noted that the genetic inactivation of TASK-1 leads to aldosterone secretion disorders, arterial hypertension and changes in the electrocardiogram, and pulmonary hypertension can also be observed. it has been found that the use of TASK-1 inhibitors for therapeutic treatment is not an acceptable solution.
  • hypoxia leads to an increase in ventilation which leads to a reduction in arterial carbon dioxide (hypocapnia) and results in an increase in arterial pH (respiratory alkalosis).
  • Respiratory alkalosis affects the regulation of breathing and leads to irregular breathing patterns, especially during sleep phases.
  • substances capable of inhibiting respiratory alkalosis for example acetazolamide, can improve the respiratory patterns and symptoms associated with high altitude by increasing the elimination of bicarbonate by the kidneys, which has as a consequence the decrease of the arterial pH.
  • acetazolamide may cause side effects, for example by disrupting electrolyte homeostasis.
  • the present invention specifically addresses the aforementioned need by providing a method of screening • for the identification of candidate molecules for the treatment of respiratory disorders in a mammal, said screening method comprising a step of determining whether the functional activity of a TASK-2 ion channel polypeptide (KCNK5) in the presence of a test molecule is decreased or suppressed with respect to the functional activity of said TASK-2 ion channel in the absence of said test molecule.
  • KCNK5 TASK-2 ion channel polypeptide
  • test molecule is considered a candidate molecule for the treatment of respiratory disorders in a mammal.
  • the inventors of the present invention are indeed the first to have demonstrated that the TASK-2 channels, also called KCNK5, are present in certain regions of the respiratory centers of the brain stem and play a surprising role in the breathing.
  • TASK-2 channels also called KCNK5
  • In vitro experiments on a brainstem preparation from neonatal mice show a marked decrease in respiratory activity during anoxia. This decrease is no longer observed on brainstem preparations from mice disabled for the TASK-2 channel. Inhibition or absence of TASK-2 therefore protects against anoxia.
  • These data indicate that the expression of these channels at the level of certain neurons is directly or indirectly associated with chemoreception.
  • the inventors of the present invention have further demonstrated the expression of these TASK-2 channels at certain neurons known to be directly or indirectly associated with chemoreception.
  • mice invalidated for the TASK-2 inactive channel exhibit a remarkable maintenance of respiration during hypoxia, unlike mouse-type wild that have a strong respiratory depression.
  • adaptation to hypoxia may include a body defense mechanism by reducing the expression of TASK-2 channels.
  • this physiological adaptation probably requires several hours and does not work for an immediate response to short-term hypoxia.
  • TASK-2 may make it possible to anticipate the down-regulation defense mechanisms of TASK-2 expression.
  • TASK-1 and TASK-3 channels which are probably also involved in the regulation of respiration due to their expression in multiple groups of chemosensitive respiratory neurons (Sirois et al., 2000). "The TASK-1 two-pore domain K + channel is a molecular substrate for neuronal effects of anesthetic inhalation.” J.
  • TASK-2 in the central nervous system is extremely weak and limited to restricted groups of neurons in the breathing circuits (Reyes R et al (1998) "Cloning and expression of a new pH-sensitive two-pore domain K + channel from human kidney.” J. Biol Chem, 273, 30863-30869 (Ref. 15)). Moreover, TASK-2 is not or very weakly expressed in the heart where TASK-1 is very strongly expressed. Thus, the very limited expression of TASK-2 in the central nervous system and its virtual absence in the heart constitutes a huge advantage for the specific inhibition of TASK-2.
  • Respiratory disorders means respiratory deficiencies due to dysfunction of the central nervous system, particularly any respiratory insufficiency related to a malfunction of brain respiratory centers located at the level of the brainstem.
  • Respiratory disorders include, but are not limited to: sleep apnea syndrome, respiratory forms of sudden infant death syndrome, altitude sickness breathing models, respiratory syndrome Ondine or congenital alveolar hypoventilation syndrome, disorders due to accidental or intentional drug intoxication (eg absorption of barbiturates or opioids), respiratory depression related to general anesthesia, acute respiratory failure and severe hypoxemia.
  • test molecule means a molecule tested by the method of the invention to determine whether it decreases or suppresses the activity of the TASK-2 channel or its expression.
  • candidate molecule means a molecule identified by the practice of the present invention as decreasing or suppressing the activity of the TASK-2 channel or its expression.
  • the present invention makes it possible to identify candidate molecules for the treatment of respiratory disorders in a mammal, whether human or animal.
  • test molecules for the practice of the present invention may be selected for example randomly in molecular libraries or, for example, from biologically acceptable molecules capable of interacting with an ion channel.
  • test molecules capable of decreasing or suppressing the activity of TASK-2 mention may be made, for example, of quinine, quinidine, clofilium, lidocaine, bupivacaine, doxapram and volatile anesthetics such as halothane.
  • an antibody against TASK-2 may also be mentioned.
  • This antibody can be manufactured by techniques known to those skilled in the art.
  • This antibody may be, for example, a polyclonal, monoclonal, chimeric, or Fab fragment.
  • the step of determining the functional activity of TASK-2 can be carried out according to one of the methods known to those skilled in the art for determining the activity of an ion channel. It can be as an example of a method such as that described for the KCNK2 channel in WO 05/054866 (PCT / EP / 2004/012823 - Bayer Healthcare
  • the step of determining whether the functional activity of the TASK-2 polypeptide is decreased or suppressed may include:
  • TASK-2 having functional activity, with said test molecule, and ii) a measurement of the functional activity of the TASK-2 polypeptide and / or its expression in the presence of said test molecule.
  • the cell expressing the TASK-2 polypeptide may express it endogenously or in recombinant form.
  • Methods for expressing this polypeptide by cells for the practice of the present invention are described for example in WO 00/27871 (COS cells or xenopus oocytes) and in the other aforementioned documents.
  • the functional activity can be measured by one or more parameter (s) chosen from the group comprising: the ion current flowing through the TASK-2 polypeptide, the change of potential membrane of the cell expressing the TASK-2 polypeptide, the change in the intracellular ionic concentration of the cell expressing the TASK-2 polypeptide.
  • a parameter chosen from the group comprising: the ion current flowing through the TASK-2 polypeptide, the change of potential membrane of the cell expressing the TASK-2 polypeptide, the change in the intracellular ionic concentration of the cell expressing the TASK-2 polypeptide.
  • the functional activity can be determined, for example, by measuring the ionic current flowing through the TASK-2 polypeptide, the ion current flowing through the TASK-2 polypeptide possibly being, for example, an efflux of rubidium ions.
  • the measurement of the ion current passing through the TASK-2 polypeptide is carried out by measuring the efflux of rubidium ions, this measurement being able to be carried out for example by atomic absorption spectroscopy, for example as indicated in FIG.
  • test molecule which decreases the activity of TASK-2 preferably by at least 10%, preferably by at least 50%, and even more preferably by 75, 90 or 100% is identified. as a candidate molecule to decrease the activity of TASK-2.
  • the invention notably allows the identification of candidate molecules for the treatment of disorders.
  • Respiratory selected from the group consisting of sleep apnea syndrome, respiratory forms of sudden infant death syndrome, models of pathological breathing due to altitude.
  • a step subsequent to the identification of a candidate molecule may be a step of studying the effect of said molecule on respiratory disorders, for example after administration of the candidate molecule to an animal model presenting breathing or put in conditions causing respiratory disorders.
  • Another aspect of the invention thus relates to the use of a molecule modulating the functional activity of the TASK-2 polypeptide and / or inhibiting its expression, for the preparation of a composition for the treatment of respiratory disorders.
  • RNA encoding TASK-2 or TASK-2 can be determined for example by one of the immunochemical methods known to those skilled in the art, for example by immunoassay, a Western blot technique or immunohistochemistry.
  • the screening of the present invention can be carried out in a cell-free or cell-free system. Any cell expressing TASK-2 can be used.
  • the TASK-2 polypeptide may be naturally expressed in the cell or may be introduced therein by a genetic recombination technique known to those skilled in the art. Examples of genetic recombination protocols that can be used for the implementation of the present invention are described in the three aforementioned documents.
  • a candidate molecule may for example be a sequence complementary to the polynucleotide sequence encoding TASK-2 (or KCNK5) which is capable of blocking the channel transcription.
  • Expression vectors derived from retroviruses, adenovirus, vaccinia or herpes virus or other bacterial viruses can be used to deliver nucleotide sequences complementary to target organs, tissues or cell populations. Methods known to those skilled in the art can be used for the construction of vectors that express the nucleic acid sequence complementary to the polynucleotides of the TASK-2 coding genes (Scott JK, Smith GP (1990). epitope library. "Science, 249: 386-390 (Ref 17)). Methods known to those skilled in the art can be used to construct expression vectors containing TASK-2 coding sequences as well as transcriptional and translational control elements. These methods include DNA techniques recombinant in vitro, synthetic techniques and in vivo genetic recombination. The three aforementioned documents describe methods that can be used for constructing vectors for implementing the present invention.
  • Figure 1 is a photograph of TASK-2 channels present on the ventral surface of the rostral spinal bulb.
  • Figure 2 is a histogram showing the experimental results of Example 2 below in vitro demonstration of TASK-2 channel intervention in central chemosensitivity mechanisms.
  • the ordinate axis represents the frequency of the respiratory rhythmic activity (expressed in number of cycles per minute), and the abscissa axis, the various tests implemented in this example.
  • the white bars correspond to the results obtained on the wild mice and the black bars on the mutant TASK-2 mice.
  • Figure 3 is a histogram showing the experimental results of Example 3 below in vivo demonstration of intervention of TASK-2 channels in the mechanisms of respiration.
  • the ordinate axis represents the ventilatory flow rate per minute ("minute volume" or MV) expressed in ml / min / g of body weight, and the abscissa axis, the various tests implemented in this example. .
  • Figure 4 shows a recording "patch-clamp" the TASK-2 current (intensity I in picoamperes (pA)) on transfected HEK cells with 1 I DNA encoding human TASK-2 channel.
  • Figure 5 depicts the location of TASK-2 channels present in the brainstem of an adult mouse. A: whole brain, ventral surface of the brain stem around the facial motor nucleus (VII) and enlargement showing the retrotrapezoid nucleus and the parafacial respiratory group (RTN / pfRG). From B to E: localization of cells expressing TASK-2 on coronal sections. B: mesencephalon, dorsal raphe (DR).
  • C rostral bridge, lateral nucleus of the superior olive (LSO).
  • D caudal bridge, ventral surface (RTN / pfRG) and parvocellular reticular nucleus (PCRtA).
  • E rostral spinal bulb, caudal end of VII.
  • F Summary diagram showing the distribution of TASK-2 expressing cells on a sagittal section of the brainstem.
  • 3N oculomotor nucleus
  • 4V 4 th ventricle
  • 7N facial nucleus
  • 1ON vagal motor dorsal nucleus
  • 12N hypoglossal nucleus
  • Amb ambiguous core
  • AP area postrema
  • CIC caudal nucleus of lower colliculus
  • ILL intermediate nucleus of lateral lemniscus
  • IO lower olive
  • Self nucleus of the solitary tract.
  • Figure 6 illustrates the respiratory adaptation measured by the plethysmography technique in response to hypercapnia and short-lived hypoxia in awake mice. This adaptation is similar in wild mice or mice disabled for TASK-2.
  • the ordinate axis represents the ventilatory flow rate per minute ("minute volume" or MV) expressed in ml / min / g of body weight, the respiratory rate (RF) and the tidal volume (VT), the x-axis, the different tests implemented in this example as a function of time.
  • FIGS 7A and B illustrate the respiratory adaptation measured by the plethysmography technique in response to long-term hypoxia.
  • the strong respiratory depression observed in wild mice is totally absent in TASK-2-disabled mice.
  • the y-axis represents the tidal volume (VT), the frequency respiratory (RF) and ventilatory flow rate per minute (MV, expressed in ml / min / g); the abscissa axis represents the different tests implemented in this example as a function of time.
  • B the same parameters are represented on a longer time scale; TE, expiration time.
  • C are shown examples of original traces for individual animals at different times (1, 2, 3 and 4 as indicated in B, last trace of the bottom).
  • wild-type and mutant mice show increased respiration (point 2). This response is followed by depression (point 3) observable only in wild mice. After 12 hours of hypoxia (point 4) all mice show similar ventilation.
  • Figure 8 is a histogram showing the expression of messenger RNAs of TASK-1, TASK-2 and erythropoietin (EPO) in kidney and brainstem in mice maintained for 12 hours in an environment hypoxic. These are quantitative PCR results (8 mice per group).
  • Figure 9A illustrates the expression of TASK-2 in the area around the facial motor nucleus (retrotrapezoid nucleus and parafacial respiratory group) on a whole mouse brain aged 1 day. This area is preserved in the block recording technique.
  • B schematic representation of the block preparation where the structures of the medulla oblongata and the most caudal part of the bridge are preserved.
  • An electrode placed on the cervical root C4 makes it possible to record the activity of the phrenic nerve representing the respiratory activity.
  • C example of recording trace (C4) and integration (JC4) inspiratory puffs from which the amplitude, the surface and the duration of the inspiratory (Tl) and expiratory (TE) phases are measured.
  • D examples of respiratory activity (JC4) under normoxic (control) and anoxic conditions obtained on block preparations of wild mice (task2 + / +) or mutants (task2 - / -).
  • E Histogram of respiratory frequencies (RF) under control conditions, anoxia, respiratory or metabolic acidosis and alkalosis for wild (WT), heterozygous (task2 +/-) or homozygous (task2 - / -) mice.
  • RF Histogram of respiratory frequencies
  • the experiments in this example demonstrate the presence of TASK-2 channels in a major nerve structure belonging to the respiratory centers of the brainstem. These experiments were performed on adult heterozygous mutant mice (TASK-2 + / - ), and the TASK-2 gene, which is invalidated, is replaced by a coding sequence for an enzyme called beta-galactosidase. Cells that normally express the TASK-2 channels can be easily identified by the standard histochemical revelation technique using I 1 X-GaI as a substrate that turns blue when hydrolyzed.
  • FIG. 1 illustrates the TASK-2 channels present on the ventral surface of the rostral spinal bulb. This is a cross-section illustrating the presence of X-gal labeling in neurons of the ventral surface of the rostral spinal bulb (retotrapezoidal nucleus, RTN).
  • this zone plays a fundamental role in central chemosensitivity, that is to say, in the processes of adaptation of ventilation in response to a chemical variation of the internal environment (blood, cerebrospinal fluid or CSF). Thanks to the unique location of these channels in areas as soon as involved in the control of respiration, it is therefore possible to specifically modulate respiration by a method acting on TASK-2.
  • Example 2 In Vitro Demonstration of the Intervention of TASK-2 Channels in the Central Mechanisms of Respiratory Adaptation
  • mice active TASK-2 channels
  • mutant TASK-2 mice mutant TASK-2 mice that do not express active TASK-2 channels
  • the brainstem of wild-type or mutant mice (TASK-2 " ⁇ ) is rapidly dissected in ice, isolated from adjacent tissues, and placed in artificial (ARF) equilibrated CFL (95% O 2 , 5). % CO 2 ).
  • the ventral root of the C4 spinal segment is at the origin of the phrenic nerve which innervates the diaphragm. This nerve root is sucked inside a glass electrode to collect the spontaneous rhythmic activity generated spontaneously by the preparation.
  • the electrical activity of the root C4 is filtered, amplified, visualized and stored on computer to analyze a posteriori the respiratory parameters (frequency, amplitude, duration). The tests consisted in modifying the quantity of dissolved gases in the LCRa or its chemical composition and comparing the respiratory activities.
  • Figure 2 is a histogram showing the experimental results of this example ("bulk" preparation: respiratory rate and electrical activity of the phrenic nerve C4 root recorded in wild-type mice and task2 - / -).
  • Control Artificial CSF balanced 95% O 2 , 5% CO 2 .
  • Anoxia 95% N 2 , 5% CO 2 .
  • the ordinate axis represents the frequency of the respiratory rhythmic activity (expressed in number of cycles per minute), and the abscissa axis, the various tests implemented in this example.
  • the white bars correspond to the results obtained on the wild mice and the black bars on the mutant TASK-2 mice.
  • mice [76] In this example, the inventors also used "wild-type" mice and mutant TASK-2 mice. [77] The respiration of the mice was measured with a plethysmographic apparatus (EMKA technologies, France).
  • FIG. 3 is a histogram showing the experimental results of this example illustrating the ventilatory responses of wild-type and TASK-2 - / - mice on prolonged exposure to hypoxia (8% O2).
  • the ordinate axis represents the ventilatory flow rate per minute ("minute volume" or MV, expressed in ml / min / g), and the abscissa axis, the various tests implemented in this example.
  • the white bars correspond to the results obtained on the wild mice and the black bars on the mutant TASK-2 mice.
  • hypoxia caused a transient increase in respiration in all animals (hyperventilation secondary to peripheral chemoreceptor stimulation) (not shown).
  • hypoxia caused a transient increase in respiration in all animals (hyperventilation secondary to peripheral chemoreceptor stimulation) (not shown).
  • hypoxia resulted in a reduction in respiratory movements or depression that is only seen in wild-type mice.
  • the reduction of arterial carbon dioxide subsequent to initial hyperventilation was an important factor in wild type mice (in white on the histogram of Figure 1) to reduce their respiration.
  • the invalidated animals for the TASK2 channel have on the contrary a sustained ventilation. throughout the duration of hypoxia.
  • hypoxia is a powerful stimulus for respiration, including under conditions of hypocapnia (respiratory alkalosis). It is likely that respiratory alkalosis is no longer able to activate TASK-2 canals of the central nervous system.
  • mice and conditions used in this experiment were identical to those of Example 1.
  • the vector used for the generation of TASK-2 mice ";” contains a gene encoding beta-galactosidase as described in Mitchell KJ et al. (2001) "Functional analysis of secreted and transmembrane proteins critical to mouse development”. Nat Genet, 28, 241-249 (Ref 18).
  • the expression of TASK-2 cells was visualized using a TASK-2 promoter activity in directing the TASK-2 mice "/ +. Surprisingly, specific labeling with X-gal Ie is restricted few regions of the brainstem. No cell expressing TASK-2 has found in other areas of the brain.
  • the cells expressing TASK-2 form a bilateral column extending over 1.5 mm, from 500-700 ⁇ m in front of the obex to the rostral pole of the facial motor nucleus (VII). These cells form clusters located in the marginal zone on the surface of the brainstem and in the tissue parenchyma between 100 to 300 ⁇ m deep (see Figure 5).
  • This region corresponds to the peri-facial region comprising the retrotrapezoid nucleus and the parafacial respiratory group (RTN / pfRG).
  • the TASK-2 channels are present on the ventral surface of the rostral spinal bulb, more particularly in the region corresponding to the retrotrapezoid nucleus (RTN) and the parafacial respiratory group (pfRG). ).
  • mice used in this experiment are identical to that of Example 2 above.
  • mice used in this experiment are identical to those of the previous example. [106] For this experiment, 8 TASK-2 + / + mice and 7 TASK-2 '7 " mice were used.
  • RNAs were isolated from the kidney and brainstem of mice using the Mini RNeasy Kit (Qiagen). For reverse transcription, a reverse transcriptase (Promega) was used according to the protocol provided by the manufacturer. A real time polymerase chain reaction was performed with the LightCycler system (Roche) using SYBR Green PCR Kit (Qiagen). The transcription of the TASK-2, TASK-1 and erythropoietin genes was measured and normalized with respect to the expression of beta-actin.
  • primers used and the conditions for performing the real time polymerization reaction were as follows.
  • Primers for beta-actin sense primer, 5 'CCACCGATCCACACAGAGTACTT 3' (SEQ ID NO: 1); Antisense primer, 5 'GACAGGATGCAGAAGGAGATTACTG 3 (SEQ ID NO: 2)'.
  • Primers for erythropoietin sense primer, 5 'AGAATGGAGGTGGAAGAACAG 3' (SEQ ID NO: 3); Antisense primer, 5 'TGTCTATATGAAGCTGAAGGGT 3' (SEQ ID NO: 4).
  • Primers for TASK-2 sense primer, 5 'GCTTTGGGGACTTTGTGG 3' (SEQ ID NO: 5); Antisense primer, 5 'AAAGAGGGACAGCCAAGC 3' (SEQ ID NO: 6).
  • the hybridization temperature of the primers was 55 ° C.
  • TASK-2 - / - mice showed decreases in respiratory rate similar to the change in pH. However, this response to anoxia was completely suppressed in TASK-2 - / - mice ( Figure 9 D and E). [129] This experiment shows that there exists in TASK-2 - / - mice a response to hypoxia which results in an increase in the duration of the inspirations without a change in the respiratory rate. [130] Thus, the potassium channel TASK-2 is therefore a new target for inhibiting respiratory depression and stimulating breathing under hypoxic conditions. 2
  • Example 8 Implementation of a Screen According to the Present Invention
  • HEK Human Embryonic Kidney cells
  • pRES-CD8-hTASK2 the DNA complementary to the human TASK-2 channel gene
  • the TASK-2 currents are recorded by the voltage-clamp method (patch-clamp in whole cell configuration). The currents are activated by voltage jumps from a rest potential at -95V up to variable values between -80 and + 45mV.
  • the currents are recorded in whole cell configuration using an EPC-10 amplifier (HEKA).
  • the "patch" pipette contains a 95 K-gluconate solution, 30 mM KCl, 4.8 mM Na 2 HPO 4 , 1.2 mM
  • the external solution is a RINGER solution: 145 mM

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Abstract

La présente invention se rapporte à l'utilisation d'un procédé de criblage pour l'identification de molécules candidates utilisables pour le traitement de troubles respiratoires chez un mammifère, ledit procédé de criblage comprenant une étape consistant à déterminer si l'activité fonctionnelle d'un polypeptide TASK-2 en présence d'une molécule test est diminuée ou supprimée par rapport à l'activité fonctionnelle dudit polypeptide TASK-2 en l'absence de ladite molécule test, la molécule test étant considérée comme étant une molécule candidate lorsqu'elle diminue ou supprime ladite activité fonctionnelle.

Description

PROCÉDÉ DE CRIBLAGE DE COMPOSÉS UTILISABLES POUR LE TRAITEMENT DE TROUBLES RESPIRATOIRES
Domaine technique de l'invention
[1] La présente invention se rapporte à l'utilisation d'un procédé de criblage de composés pour le traitement de troubles respiratoires chez un mammifère. Elle trouve notamment une application dans l'identification de nouvelles molécules candidates pour le traitement des troubles respiratoires.
[2] Dans la description ci-dessous, les références entre parenthèses (Réf) renvoient à la liste des références présentée après les exemples.
Art antérieur [3] L'adaptation centrale de la respiration aux besoins physiologiques est un phénomène chémosensible qui passe par des modifications de l'activité électrique de neurones spécialisés situés majoritairement dans le tronc cérébral. Ces neurones respiratoires ce répartissent en petits groupes formant des colonnes dans le tronc cérébral qui s'étendent de la partie ventrolatérale du bulbe rachidien caudal à la partie dorsolatérale de la protubérance annulaire (Richter DW, Spyer KM (2001) « Studying rhythmogenesis of breathing : comparison of in vivo and in vitro models ». Trends Neurosci, 24, 464-472 (Réf 1) et Feldman JL, DeI Negro (2006) « Looking for inspiration : new perspectives on respiratory rhythm ». Nat Rev Neurosci, 7, 232-242. (Ref 2)). Il n'est donc pas surprenant que des déficiences de canaux ioniques soient impliquées dans des physiopathologies respiratoires, par exemple liées à un séjour prolongé en altitude, ou à différentes maladies comme le syndrome de l'apnée du sommeil et le syndrome de la mort subite du nourrisson.
[4] Chez les mammifères, la respiration est régulée par trois paramètres chimiques du sang artériel : i) l'augmentation en dioxyde de carbone, ou hypercapnie. ii) la diminution du pH sanguin, ou acidose. iii) la diminution de la concentration d'oxygène dans le sang, ou hypoxie.
[5] L'activité du réseau de neurones contrôlant la respiration est donc adaptée en fonction des différents paramètres précités (Feldman JL et al. (2003) « Breathing : rhythmicity, plasticity, chemosensivity »: Annu Rev Neurosci, 26, 239-266 (Réf 3)). [6] Les variations de ces paramètres sont mesurées grâce à des chémorécepteurs. Ces chémorécepteurs détectent les variations de pH et de pression partielle en CO2 artériel au niveau périphérique grâce aux chémorécepteurs des corps carotidiens, et au niveau du tronc cérébral grâce aux chémorécepteurs centraux situés dans les noyaux du raphé et le noyau retrotrapézoïde (Severson et al. (2003) « Midbrainserotonergic neurons are central pH chemoreceptors ». Nat Neurosci, 6, 1139- 1140. (Réf 4)). Les signaux électriques des chémorécepteurs participent à l'adaptation de l'activité respiratoire aux besoins physiologiques de l'organisme.
[7] Parmi les pathologies liées à des défauts de la régulation de la respiration, le syndrome de l'apnée du sommeil est un véritable problème de santé publique. Ce syndrome est souvent associé à l'obésité. Par exemple, aux Etats-Unis, environ 3 millions d'hommes et 1 ,5 million de femmes souffrent du syndrome de l'apnée du sommeil. Ce syndrome pourrait avoir des conséquences négatives sur l'état de santé des personnes en souffrant, par exemple en empirant les maladies cardiovasculaires comme l'indique l'article de Namen et collaborateurs ((2002) « Increase Physician-reported sleep apnea : the National Ambulatory Médical Care Survey ». Chest 121(6) : 1741-1747 (Réf 5)). [8] Les différentes formes d'apnée du sommeil ont en commun l'apparition durant le sommeil de pauses pathologiques dans la respiration (de plus de 10 secondes chez l'adulte, de plus de 8 secondes chez l'enfant), ce qui entraîne une hypoxie avec une alimentation en oxygène du cerveau et des tissus périphériques réduite. Les syndromes de l'apnée du sommeil ont une étiologie hétérogène et peuvent être classifiés selon les pathologies sous-jacentes probables. Par exemple, le sous-groupe des apnées obstructives du sommeil est caractérisé par une obstruction des voies respiratoires supérieures qui empêchent une ventilation correcte et efficace. Le sous-groupe des apnées centrales du sommeil est caractérisé par des défauts de la régulation de la respiration au niveau du tronc cérébral, la commande nerveuse des muscles respiratoires ne fonctionnant plus de façon transitoire. Le sous-groupe des apnées mixtes correspond à une apnée centrale suivie d'une apnée obstructive.
[9] De manière intéressante, l'une des formes centrales de l'apnée (« apnée centrale non hypercapnique ») est caractérisée par des périodes d'hyperventilation qui ont pour résultat une réduction de la concentration de dioxyde de carbone artériel appelée hypocapnie. La réduction du dioxyde de carbone, à son tour, entraîne un défaut de stimulation des centres respiratoires du tronc cérébral qui se traduit par des pauses plus longues dans la respiration, et par conséquent, provoque une réduction de la concentration de l'oxygène artériel.
[10] Apparemment, les patients souffrant de ces formes d'apnée du sommeil ont un retard dans la stimulation de la respiration induite par l'hypoxie.
[11] Plusieurs facteurs conduisant à la réduction de la stimulation de la respiration peuvent aggraver les syndromes de l'apnée du sommeil : par exemple les substances ayant un effet sur la respiration, comme l'alcool et les tranquillisants, ou un séjour à haute altitude. [12] Actuellement, la thérapie des syndromes de l'apnée du sommeil comprend des procédures chirurgicales et des dispositifs pour établir une pression positive au niveau des voies respiratoires supérieures.
[13] Le traitement par ventilation assistée par pression positive continue par voie nasale (nCPAP) durant le sommeil est le procédé le plus efficace à ce jour pour améliorer les symptômes cliniques. Cependant, ce traitement nécessite que le patient soit connecté de manière permanente au système par l'intermédiaire d'un masque. Ainsi, le fait que la technique soit peu pratique limite son succès thérapeutique.
[14] À côté des interventions chirurgicales et du traitement nCPAP, quelques approches pharmacologiques ont été réalisées pour améliorer la respiration chez des patients souffrant d'apnée du sommeil, par exemple en utilisant de la progestérone, de la théophylline, de l'acétazolamide et de la protriptyline.
[15] Même si ces substances sont capables de stimuler la respiration au moins chez une partie des patients, aucune d'entre elles ne s'est avérée réellement efficace pour le traitement des syndromes de l'apnée du sommeil. En outre, certaines de ces substances présentent des effets secondaires importants. Ainsi, de nombreuses industries pharmaceutiques cherchent de nouvelles molécules qui permettraient de traiter le syndrome des apnées du sommeil.
[16] Des chercheurs se sont intéressés dans le passé au développement d'inhibiteurs de canaux potassiques TASK-1 qui semblent stimuler la respiration. Les canaux TASK-1 font partie d'une famille comprenant les canaux TASK 1 , TASK 2 et TASK 3. Ce sont des canaux K+ avec 4 domaines transmembranaires et deux domaines canal (canaux K2P) (Goldstein SA et al. (2005), « International Union Pharmacology. LV. Nomemclature and molecular relationship of two-P potassium channels ». Pharmacol Rev, 57, 527-540. (Réf 6)). Ces canaux sont actifs sous Ia forme de monomères, d'hétérodimères et d'homodimères (Czirjak G, Enyedi P (2001), « Formation of functionnal heterodimers between the TASK-1 and TASK-3 two pore domain potassium channel subunits ». J Biol Chem, 277, 5426-5432. (Réf 7), voir Kang D et al. (2004), « Functionnal expression of TASK-1/TASK-3 heteromers in cérébral granule cells ». J.Physiol, 554, 64-77 (Réf 8) et Berg AP et al. (2004), « Motoneurons express heteromeric TWIK-related acid sensitive K+ (TASK) channels contanining TASK-1 (KNCK3) and TASK-3 (KNCK9) subunits ». J. Neurosci, 24, 6693-6702 (Réf 9)). Ces canaux produisent un courant K+ de inhibé par l'acidification externe et à la suite de l'activation de récepteurs couplés aux protéines G (Mathie A (2007) « Neuronal two pore domain potassium channels and their régulation by G protein coupled receptors ». J. Physiol, 578, 377-385 (Réf 10)). Ils sont activés par des anesthésiques volatiles (par exemple l'halothane, l'isoflurane) (voir Patel AJ, Honore E (2001) « Properties and modulation of mammalian 2P domain K+ channels ». Trends Neurosci, 24, 339-346 (Réf 11). [17] Les canaux TASK-1 sont abondants dans le cerveau, les glandes surrénales, les vaisseaux sanguins et le cœur. Sur la base des observations faites sur des souris « knock-out » pour TASK-1 , il a été noté que l'inactivation génétique de TASK-1 conduit à des troubles de la sécrétion d'aldostérone, à de l'hypertension artérielle et à des changements dans Pélectrocardiogramme. De plus, une hypertension pulmonaire peut également être observée. Pour ces différentes raisons, il est apparu que l'utilisation d'inhibiteurs de TASK-1 pour un traitement thérapeutique ne soit pas une solution acceptable. [18] II a été montré récemment que la chémosensibilité centrale en réponse à une hypercapnie persiste chez des souris doubles mutantes TASK1/TASK3 alors que la chémosensibilité des neurones du raphé est supprimée (Mulkey et al. (2007) « TASK channel détermine pHsensitivity in select respiratory neurons but do not contribute to central respiratory chemosensitivity ». J Neurosci, 27, 14049-14058. (Réf 12)).
[19] Le terme « syndrome de mort subite du nourrisson » est utilisé pour les cas inexpliqués de mort des jeunes enfants et qui représente la principale cause de mortalité chez les enfants âgés d'un mois à un an.
Dans la plupart des cas, la cause de la mort n'est pas clairement identifiée, mais les troubles de la respiration semblent jouer un rôle important. Pour les enfants à risque, un système de surveillance respiratoire est disponible, mais il n'existe pas aujourd'hui de traitement pharmaceutique.
[20] A haute altitude, l'hypoxie conduit à une augmentation de la ventilation qui conduit elle-même à une réduction du dioxyde de carbone artériel (hypocapnie) et a pour conséquence une augmentation du pH artériel (alcalose respiratoire). L'alcalose respiratoire affecte la régulation de la respiration et conduit à des modes de respiration irrégulière, particulièrement pendant les phases de sommeil. Il a été montré que des substances capables d'inhiber l'alcalose respiratoire, par exemple l'acétazolamide, peuvent améliorer les modes respiratoires et les symptômes associés à la haute altitude par augmentation de l'élimination du bicarbonate par les reins, ce qui a pour conséquence la diminution du pH artériel. Toutefois, l'utilisation d'acétazolamide peut causer des effets secondaires, en perturbant par exemple l'homéostasie électrolytique.
[21] En résumé, peu de substances sont actuellement connues pour traiter ces troubles respiratoires, et celles qui sont connues sont soit insuffisamment efficaces, soit présentent des effets secondaires négatifs qui limitent leur utilisation pour des traitements dans la durée. En outre, les chercheurs ne disposent pas de suffisamment de moyens pour mettre en évidence de nouvelles substances candidates pour le traitement des troubles respiratoires. [22] II existe donc un réel besoin de nouveaux moyens permettant d'identifier de nouvelles molécules candidates pour le traitement des troubles respiratoires.
Exposé de l'invention
[23] La présente invention répond précisément au besoin précité en fournissant un procédé • de criblage pour l'identification de molécules candidates pour le traitement de troubles respiratoires chez un mammifère, ledit procédé de criblage comprenant une étape consistant à déterminer si l'activité fonctionnelle d'un polypeptide canal ionique TASK-2 (KCNK5) en présence d'une molécule test est diminuée ou supprimée par rapport à l'activité fonctionnelle dudit canal ionique TASK-2 en l'absence de ladite molécule test.
[24] S'il est déterminé que l'activité de TASK-2 est diminuée ou supprimée lors de la mise en œuvre du procédé de l'invention, alors la molécule test est considérée comme une molécule candidate pour le traitement de troubles respiratoires chez un mammifère.
[25] Les inventeurs de la présente invention sont en effet les premiers à avoir mis en évidence que les canaux TASK-2, également nommés KCNK5, sont présents dans certaines régions des centres respiratoires du tronc cérébral et jouent de manière surprenante un rôle dans la respiration. Des expériences in vitro sur une préparation de tronc cérébral provenant de souris nouveaux-nés, présentent une forte diminution de l'activité respiratoire lors d'une anoxie. Cette diminution n'est plus observée sur des préparations de tronc cérébral provenant de souris invalidées pour le canal TASK-2. L'inhibition ou l'absence de TASK-2 protège donc contre l'anoxie. Ces données indiquent que l'expression de ces canaux au niveau de certains neurones est directement ou indirectement associée à la chémoréception. [26] Les inventeurs de la présente invention ont en outre démontré l'expression de ces canaux TASK-2 au niveau de certains neurones connus pour être directement ou indirectement associée à la chémoréception.
[27] Les inventeurs ont montré par ailleurs que les souris mutantes invalidées pour le canal TASK-2 inactifs (« knock-out » TASK-2) présentent un remarquable maintien de la respiration au cours d'une hypoxie, contrairement aux souris de type sauvage qui présentent une forte dépression respiratoire. Ces résultats démontrent que chez la souris en condition in vivo l'inactivation des canaux TASK-2 modifie profondément la réponse ventilatoire à l'hypoxie et résulte en une stimulation de la respiration.
[28] De manière intéressante, il a été mis en évidence à partir d'un système de culture cellulaire in vitro que l'expression de TASK-2 est réduite après plusieurs heures d'hypoxie due à la sensibilité à l'hypoxie du promoteur TASK-2 (Brazier et al. (2005) « Cloning of the human TASK-2 (KCNK5) promoter and its régulation by chronic hypoxia ». Biochem Biophys Res Commun 336 :1251-1258 (Réf 13)).
[29] Ainsi, l'adaptation à l'hypoxie (par exemple lors d'un séjour à haute altitude), peut inclure un mécanisme de défense du corps par réduction de l'expression des canaux TASK-2. Cependant, cette adaptation physiologique nécessite probablement plusieurs heures et ne fonctionne pas pour une réponse immédiate à une hypoxie à court terme.
[30] Dans ces cas d'hypoxie à court terme, l'inactivation pharmacologique de TASK-2 peut permettre d'anticiper les mécanismes de défense de régulation négative de l'expression de TASK-2. [31] En outre, contrairement aux canaux TASK-1 et TASK-3, qui sont probablement eux aussi impliqués dans la régulation de la respiration du fait de leur expression dans de multiples groupes de neurones respiratoires chémosensibles (Sirois et al. (2000) « The TASK-1 two-pore domain K+ channel is a molecular substrate for neuronal effects of inhalation anesthesic ». J. Neurosci, 20, 6347-6354 (Réf 14)), l'expression de TASK-2 dans le système nerveux central est extrêmement faible et limitée à des groupes restreints de neurones des circuits de la respiration (Reyes R et al. (1998) « Cloning and expression of a novel pH-sensitive two pore domain K+ channel from human kidney ». J. Biol Chem, 273, 30863-30869 (Réf 15)). De plus, TASK-2 n'est pas ou très faiblement exprimé dans le cœur où TASK-1 est très fortement exprimé. Ainsi, l'expression très limitée de TASK-2 dans Ie système nerveux central et son absence virtuelle dans le cœur constitue un énorme avantage pour l'inhibition spécifique de TASK-2.
[32] La séquence peptidique de TASK-2, son organisation au niveau des membranes cellulaires et le gène codant sont décrits dans WO 00/27871 (PCTYI B99/01886 - appartenant au CNRS, déposée le 9 novembre 1999 et publiée le 18 mai 2000). Ce document décrit également la distribution cellulaire de TASK-2 chez l'humain et chez la souris, la distribution d'ARNm TASK-2 dans le rein adulte, la carte chromosomique de TASK-2, l'expression de TASK-2 dans des cellules COS transfectées et dans des ovocytes de xenope, la sensibilité des courants de TASK-2 au pH, ainsi que la régulation de TASK-2 en fonction du pH, ainsi que les propriétés biophysiques et pharmacologiques de TASK-2. Ces éléments sont utilisables dans la présente pour comprendre et mettre en œuvre la présente invention.
[33] On entend par « troubles respiratoires » des insuffisances respiratoires dues à un dysfonctionnement du système nerveux central, en particulier toute insuffisance respiratoire liée à un défaut de fonctionnement des centres respiratoires cérébraux situés au niveau du tronc cérébral.
[34] Parmi les troubles respiratoires, on peut citer, sans s'y limiter : le syndrome des apnées du sommeil, les formes respiratoires du syndrome de mort subite du nourrisson, les modèles de respiration pathologique due à l'altitude, le syndrome d'Ondine ou syndrome d'hypoventilation alvéolaire congénitale, les troubles dus à une intoxication accidentelle ou volontaire par un médicament (par exemple par absorption de barbituriques ou de morphiniques), la dépression respiratoire liée à une anesthésie générale, l'insuffisance respiratoire aiguë et l'hypoxémie sévère.
[35] On entend par « molécule test » une molécule testée par le procédé de l'invention pour déterminer si elle diminue ou supprime l'activité du canal TASK-2 ou son expression.
[36] On entend par « molécule candidate » une molécule identifiée par la mise en œuvre de la présente invention comme diminuant ou supprimant l'activité du canal TASK-2 ou son expression.
[37] La présente invention permet d'identifier des molécules candidates pour le traitement de troubles respiratoires chez un mammifère, qu'il soit humain ou animal.
[38] Les molécules test pour la mise en œuvre de la présente invention peuvent être choisies par exemple de manière aléatoire dans des banques moléculaires ou, par exemple, parmi des molécules biologiquement acceptables et capables d'interagir avec un canal ionique.
[39] Comme molécules test susceptibles de diminuer ou supprimer l'activité de TASK-2, on peut citer par exemple la quinine, la quinidine, le clofilium, la lidocaïne, Ia bupivacaïne, le doxapram ainsi que les anesthésiques volatils tels que l'halothane.
[40] Comme molécule candidate, on peut citer par exemple aussi un anticorps dirigé contre TASK-2. Cet anticorps peut être fabriqué par les techniques connues de l'homme du métier. Cet anticorps peut être par exemple un anticorps polyclonal, monoclonal, chimérique, un fragment Fab.
[41] On entend par « activité fonctionnelle » la capacité du canal potassique à conduire et contrôler les mouvements ioniques à travers la membrane cellulaire.
[42] Selon l'invention, l'étape de détermination de l'activité fonctionnelle de TASK-2 peut être réalisée suivant une des méthodes connues de l'homme du métier pour déterminer l'activité d'un canal ionique. Il peut s'agir à titre d'exemple d'une méthode telle que celle décrite pour le canal KCNK2 dans le document WO 05/054866 (PCT/EP/2004/012823 - Bayer Healthcare
AG, déposée le 12 novembre 2004 et publiée le 16 juin 2005), d'une méthode telle que celle décrite pour les canaux TASK-2, TWIK-1 , TREK-1 et TASK-1 dans le document WO 00/27871 précité, ou encore d'une méthode telle que celle décrite pour le canal TREK-2 décrite dans WO
02/00715 (PCT/IB01/01436 - CNRS, déposée le 27 juin 2001 et publiée le
3 janvier 2002).
[43] Selon l'invention, l'étape consistant à déterminer si l'activité fonctionnelle du polypeptide TASK-2 est diminuée ou supprimée peut comprendre :
i) une mise en contact d'une cellule exprimant un polypeptide
TASK-2 présentant une activité fonctionnelle, avec ladite molécule test, et ii) une mesure de l'activité fonctionnelle du polypeptide TASK-2 et/ou de son expression en présence de ladite molécule test.
[44] Des exemples de mise en œuvre de cette étape sont notamment décrits dans les trois documents précités.
[45] Selon l'invention, la cellule exprimant le polypeptide TASK-2 peut l'exprimer de manière endogène ou sous forme recombinante. Des procédés permettant de faire exprimer ce polypeptide par des cellules pour la mise en œuvre de la présente invention sont décrits par exemple dans WO 00/27871 (cellules COS ou ovocytes de xenope) et dans les autres documents précités.
[46] De manière générale, selon l'invention, l'activité fonctionnelle peut être mesurée par un ou plusieurs paramètre(s) choisi(s) dans le groupe comprenant : le courant ionique traversant le polypeptide TASK-2, le changement du potentiel membranaire de la cellule exprimant le polypeptide TASK-2, le changement de la concentration ionique intracellulaire de la cellule exprimant le polypeptide TASK-2. Des exemples de mesure d'activité fonctionnelle d'un canal utilisables dans la présente invention sont donnés par exemple dans chacun des trois documents précités.
[47] Selon l'invention, l'activité fonctionnelle peut être déterminée par exemple par mesure du courant ionique traversant le polypeptide TASK-2, le courant ionique traversant le polypeptide TASK-2 pouvant être par exemple un efflux d'ions rubidium. De préférence, la mesure du courant ionique traversant le polypeptide TASK-2 est réalisée par la mesure de l'efflux d'ions rubidium, cette mesure pouvant être réalisée par exemple par spectroscopie d'absorption atomique, par exemple comme indiqué dans
GiII et collaborateurs (2007) (GiII S et al. (2007« A cell-based rb(+)-flux assay of the kv1.3 potassium channel ». Assay Drug Dev Technol 5, 373- 80 (Réf 16)).
[48] Selon l'invention, une molécule test qui diminue l'activité de TASK-2 de préférence d'au moins 10%, de préférence d'au moins 50%, et encore plus préférentiellement 75, 90 ou 100% est identifiée comme une molécule candidate pour diminuer l'activité de TASK-2.
[49] L'invention permet notamment l'identification de molécules candidates pour le traitement de troubles . respiratoires choisis dans le groupe comprenant Ie syndrome des apnées du sommeil, les formes respiratoires du syndrome de mort subite du nourrisson, les modèles de respiration pathologique due à l'altitude.
[50] Une étape ultérieure à l'identification d'une molécule candidate peut être une étape d'étude de l'effet de ladite molécule sur les troubles respiratoires, par exemple après administration de la molécule candidate à un modèle animal présentant des troubles de la respiration ou mis dans des conditions entraînant des troubles respiratoires.
[51] Un autre aspect de l'invention concerne donc l'utilisation d'une molécule modulant l'activité fonctionnelle du polypeptide TASK-2 et/ou inhibant son expression, pour la préparation d'une composition pour le traitement de troubles respiratoires.
[52] Suivant une variante de la présente invention, il est également possible de cribler des molécules pour rechercher celles qui ont la capacité d'augmenter, de diminuer ou de supprimer l'expression génique de TASK- 2. Il s'agit par exemple de déterminer, pour chaque molécule testée, le niveau d'ARNm codant TASK-2 ou de TASK-2 généré. Cette détermination peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier. Il peut s'agir d'une méthode qualitative ou quantitative. Des méthodes de détermination utilisables dans la présente invention peuvent être trouvées par exemples dans les documents WO 05/054866, WO 00/27871 et WO 02/00715. La présence d'un ARNm codant TASK-2 ou de TASK-2 peut être déterminée par exemple par l'une des méthodes immunochimiques connues de l'homme du métier, par exemple par immuno-dosage, une technique Western blot ou par immunohistochimie.
[53] Le criblage de la présente invention peut être réalisé dans un système sans cellule ou avec cellule. N'importe quelle cellule exprimant TASK-2 peut être utilisée. Le polypeptide TASK-2 peut être exprimé naturellement dans la cellule ou peut y être introduit par une technique de recombinaison génétique connue de l'homme du métier. Des exemples de protocoles de recombinaison génétique utilisables pour la mise en œuvre de la présente invention sont décrits dans les trois documents précités.
[54] Ainsi, selon cette variante, une molécule candidate peut être par exemple une séquence complémentaire de la séquence polynucléotidique codant TASK-2 (ou KCNK5) qui est susceptible de bloquer la transcription de canal.
[55] Les vecteurs d'expression dérivés des rétrovirus, adénovirus, du virus de la vaccine ou de l'herpès ou d'autres virus bactériens peuvent être utilisés pour délivrer des séquences nucléotidiques complémentaires aux organes cibles, tissus ou populations cellulaires. Des procédés connus de l'homme du métier peuvent être utilisés pour la construction de vecteurs qui expriment la séquence d'acide nucléique complémentaire aux polynucléotides des gènes codant TASK-2 (Scott JK, Smith GP (1990) « Searching for peptide ligands with an epitope library ». Science, 249 :386-390 (Réf 17)). Des méthodes connues de l'homme du métier peuvent être utilisées pour construire des vecteurs d'expression contenant des séquences codant TASK-2 ainsi que les éléments contrôlant la transcription et la traduction. Ces méthodes incluent les techniques d'ADN recombinant in vitro, les techniques synthétiques et la recombinaison génétique in vivo. Les trois documents précités décrivent des méthodes utilisables pour la construction de vecteurs pour la mise en œuvre de la présente invention.
[56] D'autres avantages apparaîtront encore à la lecture des exemples qui suivent donnés à titre illustratif en référence aux figures annexées.
Brève description des figures [57] La figure 1 est une photographie de canaux TASK-2 présents à la surface ventrale du bulbe rachidien rostral.
[58] La figure 2 est un histogramme représentant les résultats expérimentaux de l'exemple 2 ci-dessous de mise en évidence in vitro de l'intervention des canaux TASK-2 dans les mécanismes de chémosensibilité centrale. Sur cette figure, l'axe des ordonnées représente la fréquence de l'activité rythmique respiratoire (exprimée en nombre de cycles par minute), et l'axe des abscisses, les différents tests mis en œuvre dans cet exemple. Les barres blanches correspondent aux résultats obtenus sur les souris sauvages et les barres noires sur les souris TASK-2 mutantes.
[59] La figure 3 est un histogramme représentant les résultats expérimentaux de l'exemple 3 ci-dessous de mise en évidence in vivo de l'intervention des canaux TASK-2 dans les mécanismes de la respiration. Sur cette figure, l'axe des ordonnées représente le débit ventilatoire par minute (« minute volume » ou MV) exprimé en ml/min/g de poids corporel, et l'axe des abscisses, les différents tests mis en œuvre dans cet exemple.
[60] La figure 4 représente un enregistrement en « patch-clamp » du courant TASK-2 (intensité I en picoampères (pA)) sur des cellules HEK transfectées avec de I1ADN codant pour le canal TASK-2 humain. [61] La figure 5 décrit la localisation des canaux TASK-2 présents dans le tronc cérébral d'une souris adulte. A: cerveau entier, surface ventrale du tronc cérébral autour du noyau moteur facial (VII) et agrandissement montrant le noyau rétrotrapézoïde et le groupe respiratoire parafacial (RTN/pfRG). De B à E : localisation des cellules exprimant TASK-2 sur des sections coronales. B: mésencéphale, raphé dorsal (DR). C: pont rostral, noyau latéral de l'olive supérieure (LSO). D: pont caudal, surface ventrale (RTN/pfRG) et noyau réticulaire parvocellulaire (PCRtA). E: bulbe rachidien rostral, extrémité caudal du VII. F; schéma récapitulatif montrant la distribution des cellules exprimant TASK-2 sur une coupe sagittale du tronc cérébral. Autres abréviations: 3N, noyau oculomoteur; 4V, 4eme ventricule; 7N, noyau facial; 1ON, noyau dorsal moteur vagal; 12N, noyau hypoglosse; Amb, noyau ambigu; AP, area postrema; CIC, noyau caudal du colliculus inférieur; ILL, noyau intermédiaire du lemnisque latéral; IO, olive inférieure; me5, tractus trigéminal mésencéphalique; Soi, noyau du tractus solitaire.
[62] La figure 6 illustre l'adaptation respiratoire mesurée par la technique de pléthysmographie en réponse à l'hypercapnie et à l'hypoxie de courte durée chez la souris éveillée. Cette adaptation est similaire chez les souris sauvages ou les souris invalidées pour TASK-2. Sur cette figure, l'axe des ordonnées représente le débit ventilatoire par minute (« minute volume » ou MV) exprimé en ml/min/g de poids corporel, la fréquence respiratoire (RF) et le volume courant (VT), l'axe des abscisses, les différents tests mis en œuvre dans cet exemple en fonction du temps.
[63] Les figures 7 A et B illustrent l'adaptation respiratoire mesurée par la technique de pléthysmographie en réponse à l'hypoxie de longue durée. La forte dépression respiratoire qui est observée chez les souris sauvages est totalement absente chez les souris invalidées pour TASK-2. En A, les axes des ordonnées représentent le volume courant (VT), la fréquence respiratoire (RF) et le débit ventilatoire par minute (MV, exprimé en ml/min/g) ; l'axe des abscisses représente les différents tests mis en œuvre dans cet exemple en fonction du temps. En B, les mêmes paramètres sont représentés sur une échelle de temps plus longue ; TE, temps d'expiration. En C, sont représentés des exemples de traces originales pour des animaux individuels à différents temps (1 , 2, 3 et 4 comme indiqué en B, dernière trace du bas). Immédiatement après le changement en atmosphère hypoxique, les souris sauvages et les souris mutantes présentent une augmentation de la respiration (point 2). Cette réponse est suivie par une dépression (point 3) observable uniquement chez les souris sauvages. Après 12 heures d'hypoxie (point 4) toutes les souris présentent une ventilation similaire.
[64] La figure 8 est un histogramme représentant l'expression des ARN messagers de TASK-1 , TASK-2 et de l'érythropoïétine (EPO) dans le rein et dans le tronc cérébral chez des souris maintenues pendant 12 heures dans un environnement hypoxique. Il s'agit de résultats de PCR quantitative (8 souris par groupe).
[65] La figure 9 A illustre l'expression de TASK-2 dans la zone située autour du noyau moteur facial (noyau rétrotrapézoïde et groupe respiratoire parafacial) sur un cerveau entier de souris âgée de 1 jour. Cette zone est préservée dans la technique d'enregistrement en bloc. B : représentation schématique de la préparation en bloc où les structures du bulbe rachidien et de la partie la plus caudale du pont sont préservées. Une électrode placée sur la racine cervicale C4 permet d'enregistrer l'activité du nerf phrénique représentant l'activité respiratoire. C: exemple de trace d'enregistrement (C4) et d'intégration (JC4) des bouffées inspiratoires à partir desquelles l'amplitude, la surface et la durée des phases inspiratoires (Tl) et expiratoires (TE) sont mesurées. D: exemples d'activité respiratoire (JC4) en conditions normoxiques (contrôle) et anoxiques obtenus sur des préparations en bloc de souris sauvages (task2+/+) ou mutantes (task2-/-). E: Histogramme des fréquences respiratoires (RF) en conditions contrôle, anoxie, acidose respiratoire ou métabolique et alcalose pour des souris sauvages (WT), hétérozygotes (task2+/-) ou homozygotes (task2-/-).
EXEMPLES
Exemple 1 : Mise en évidence de l'expression de TASK-2 dans les cellules neuronales du tronc cérébral
[66] Les expériences de cet exemple démontrent la présence de canaux TASK-2 dans une structure nerveuse majeure appartenant aux centres respiratoires du tronc cérébral. Ces expériences ont été réalisées à partir de souris mutantes hétérozygotes adultes (TASK-2+/"). Le gène TASK-2 qui est invalidé est remplacé par une séquence codante pour une enzyme, la beta-galactosidase. Grâce à cette enzyme, les cellules qui expriment normalement les canaux TASK-2 peuvent être facilement identifiée par la technique histochimique classique de révélation utilisant I1X-GaI comme substrat qui devient bleu lorsqu'il est hydrolyse.
[67] Après un protocole de fixation au para-formaldéhyde, le tissu nerveux est prélevé puis la technique de révélation X-GAL est pratiquée sur des coupes transversales de tronc cérébral de 30μm d'épaisseur, obtenues à l'aide d'un cryostat. À l'issue de cette réaction, les cellules exprimant les canaux TASK-2 sont colorées en bleu (flèche sur la figure 1).
[68] Les résultats obtenus montrent la présence de cellules exprimant
TASK-2 dans des zones discrètes du tronc cérébral. À titre d'exemple, la figure 1 illustre les canaux TASK-2 présents à la surface ventrale du bulbe rachidien rostral. Il s'agit d'une coupe transversale illustrant la présence de marquage X-gal dans des neurones de la surface ventrale du bulbe rachidien rostral (noyau rétrotrapézoïdal, RTN).
[69] Comme le montrent de très nombreuses études, cette zone joue un rôle fondamental dans la chémosensibilité centrale, c'est-à-dire dans les processus d'adaptation de la ventilation en réponse à une variation chimique du milieu intérieur (sang, liquide cérébrospinal ou LCR). Grâce à la localisation unique de ces canaux dans des zones dès impliquées dans le contrôle de la respiration, il est donc envisageable de moduler spécifiquement la respiration par un procédé agissant sur TASK-2.
Exemple 2: Mise en évidence in vitro de l'intervention des canaux TASK-2 dans les mécanismes centraux d'adaptation de la respiration
[70] Dans cet exemple, les inventeurs ont utilisé des souris « type sauvage » (canaux TASK-2 actifs) et des souris TASK-2 mutantes n'exprimant pas de canaux TASK-2 actifs (« TASK-2";" »). Ces souris ont été produites initialement par le laboratoire de W. SKARNES à San Francisco dans le domaine public. Elles ont été rétrocroisées dans le fond génétique C57BI/6J puis élevées et produites au sein même des laboratoires des inventeurs.
[71] Les expériences de cet exemple démontrent des changements dans l'activité respiratoire lors d'une anoxie. Ces expériences ont été réalisées sur la préparation de tronc cérébral isolé in vitro à partir de souriceaux âgés de 1 à 3 jours préparation "en bloc").
[72] Le tronc cérébral de souris sauvages ou mutantes (TASK-2"Λ) est rapidement disséqué dans la glace, isolé des tissus adjacents, puis placé dans du LCR artificiel (LCRa) équilibré dans du carbogène (95% O2, 5% CO2). La racine ventrale du segment spinal C4 est à .l'origine du nerf phrénique qui innerve le diaphragme. Cette racine nerveuse est aspirée à l'intérieur d'une électrode de verre afin de recueillir l'activité respiratoire rythmique générée spontanément par la préparation. L'activité électrique de la racine C4 est filtrée, amplifiée, visualisée et stockée sur ordinateur pour analyser a posteriori les paramètres respiratoires (fréquence, amplitude, durée). Les tests ont consisté à modifier la quantité de gaz dissous dans le LCRa ou sa composition chimique et à comparer les activités respiratoires.
[73] La figure 2 est un histogramme représentant les résultats expérimentaux de cet exemple (préparation « en bloc » : fréquence respiratoire et activité électrique de la racine C4 du nerf phrénique enregistrée chez les souris sauvages et task2-/-). Contrôle : LCR artificiel équilibré en 95% O2, 5% CO2. Anoxie : 95% N2, 5% CO2. L'axe des ordonnées représente la fréquence de l'activité rythmique respiratoire (exprimée en nombre de cycles par minute), et l'axe des abscisses, les différents tests mis en œuvre dans cet exemple. Les barres blanches correspondent aux résultats obtenus sur les souris sauvages et les barres noires sur les souris TASK-2 mutantes.
[74] Les résultats obtenus montrent qu'en condition contrôle (95% O2, 5% CO2), la fréquence respiratoire ne diffère pas entre les animaux sauvages et TASK-2 mutants. En anoxie (LCRa équilibré dans un gaz dépourvu d'oxygène : 95% N2, 5% CO2), la fréquence respiratoire des animaux sauvages chute d'environ 40%. Cette réponse classique, appelée dépression respiratoire hypoxique, n'est plus observée chez les souriceaux mutants TASK-2'Λ (comparaison statistique, *** : p<0.001).
[75] Ces expériences démontrent que l'activité respiratoire in vitro des souriceaux soumis à une anoxie est significativement plus fréquente après invalidation du gène codant pour les canaux TASK-2. Ainsi, dans des conditions de dépression respiratoire, il est envisageable de restaurer l'activité respiratoire centrale par un procédé agissant sur TASK-2.
Exemple 3 : Mise en évidence in vivo de l'intervention des canaux TASK-2 dans les mécanismes de la respiration
[76] Dans cet exemple, les inventeurs ont également utilisé des souris « type sauvage » et des souris TASK-2 mutantes. [77] La respiration des souris a été mesurée avec un appareil pléthysmographique (EMKA technologies, France).
[78] La figure 3 est un histogramme représentant les résultats expérimentaux de cet exemple illustrant les réponses ventilatoires des souris sauvages et TASK-2-/- lors d'une exposition prolongée à l'hypoxie (8% O2). Sur cette figure, l'axe des ordonnées représente le débit ventilatoire par minute (« minute volume » ou MV, exprimé en ml/min/g), et l'axe des abscisses, les différents tests mis en œuvre dans cet exemple. Les barres blanches correspondent aux résultats obtenus sur les souris sauvages et les barres noires sur les souris TASK-2 mutantes.
[79] Différentes conditions d'exposition à l'oxygène ont été testées. Le débit ventilatoire par minute (ml/min/g) a été mesuré pendant le contrôle (con) (21 % de d'oxygène) et lors d'une hypoxie à 8% d'oxygène correspondant à une altitude de 6500m au-dessus du niveau de la mer. L'hypoxie a été testée pendant 1 à 6 heures.
[80] L'hypoxie a entraîné une augmentation transitoire de la respiration chez tous les animaux (hyperventilation consécutive à la stimulation des chémorécepteurs périphériques) (non illustrée). Secondairement, l'exposition prolongée à l'hypoxie a entraîné une réduction des mouvements respiratoires ou dépression qui s'observe uniquement chez les souris de type sauvage. La réduction de dioxyde de carbone artériel consécutive à l'hyperventilation initiale a été un facteur important chez les souris de type sauvage (en blanc sur l'histogramme de la figure 1) pour réduire leur respiration.
[81] Les animaux invalidés pour le canal TASK2 présentent au contraire une ventilation soutenue. pendant toute la durée de l'hypoxie.
[82] II apparaît clairement que suite à l'inactivation des canaux TASK-2, l'hypoxie est un stimulus puissant pour la respiration, y compris dans des conditions d'hypocapnie (alcalose respiratoire). Il est probable que l'alcalose respiratoire ne soit plus capable d'activer les canaux TASK-2 du système nerveux central.
[83] Les résultats de ces expériences démontrent clairement qu'une souris « TASK-2 knock-out » présente une respiration augmentée pendant l'hypoxie en comparaison à une souris de type sauvage. [84] Ainsi, l'inhibition de TASK-2 apparaît comme un moyen de traitement des troubles de la respiration.
[85] En conclusion, il apparaît que l'inactivation des canaux potassiques TASK-2 comme moyen pour stimuler la respiration dans des conditions hypoxiques est une nouvelle stratégie qui se distingue des approches thérapeutiques utilisées dans l'art antérieur.
Exemple 4 : Localisation de l'expression de TASK-2 dans le tronc cérébral
[86] Les souris et les conditions utilisées dans cette expérience étaient identiques à celles de l'exemple 1.
[87] Le vecteur utilisé pour la génération de souris TASK-2 ";" contient un gène codant pour la béta-galactosidase tel que décrit dans Mitchell KJ et al. (2001) « Functional analysis of secreted and transmembrane proteins critical to mouse development ». Nat Genêt, 28, 241-249 (Réf 18). L'expression des cellules TASK-2 a été visualisée en utilisant un promoteur de TASK-2 dirigeant l'activité dans les souris TASK-2"/+. De manière surprenante, un marquage spécifique avec Ie X-gal est restreint a peu de régions du tronc cérébral. Aucune cellule exprimant TASK-2 n'a été trouvée dans d'autres régions du cerveau.
[88] Le marquage présent au niveau du bulbe rachidien est limité à la partie ventrolatérale de la surface ventrale.
[89] Les cellules exprimant TASK-2 forment une colonne bilatérale s'étendant sur 1 ,5 mm, à partir de 500-700 μm en avant de l'obex jusqu'au pôle rostral du noyau moteur facial (VII). Ces cellules forment des amas localisés dans la zone marginale à la surface du tronc cérébral et dans le parenchyme tissulaire entre 100 à 300 μm de profondeur (voir Figure 5).
Cette région correspond à la région péri-faciale regroupant le noyau rétrotrapézoïde et le groupe respiratoire parafacial (RTN/pfRG).
[90] Dans la protubérance annulaire (ou pont), les cellules exprimant TASK-2 sont observées dans la partie latérale de l'olive supérieure (Figure 5 C), le noyau réticulaire parvocellulaire (Figure 5 D), et les noyaux du raphé dorsal et du lemnisque latéral intermédiaire. Un marquage partiel est détecté dans le colliculus caudal inférieur.
[91] Aucun marquage n'a été détecté dans la moelle épinière cervicale correspondant au noyau moteur phrénique.
[92] Comme démontré dans l'exemple 1 et dans cette expérience, les canaux TASK-2 sont présents à la surface ventrale du bulbe rachidien rostral, plus particulièrement dans la région correspondant au noyau rétrotrapézoïde (RTN) et le groupe respiratoire parafacial (pfRG).
[93] Les résultats obtenus montrent la présence de cellules exprimant TASK-2 dans des zones discrètes du tronc cérébral. [94] Grâce à Ia localisation unique de ces canaux dans des zones clés impliquées dans le contrôle de Ia respiration, il est donc envisageable de moduler spécifiquement la respiration par un procédé agissant sur TASK- 2.
Exemple 5 : Effet de l'hypoxie et de l'hypercapnie sur la respiration des souris en condition in vivo
[95] Les souris utilisées dans cette expérience sont identiques à celle de l'exemple 2 précédent.
[96] Pour cette expérience, 10 souris TASK-2 +/+ et 7 souris TASK-2 ~'~ ont été utilisés.
[97] Les chémorécepteurs centraux et périphériques contribuent à l'adaptation de la respiration en détectant les variations de pH et des gaz du sang (Vizek M et al. (1987) « Biphasic ventilatory response of adult cats to sustained hypoxia has central origin ». J Appl Physiol, 63, 1658-
1664.(Réf 19)). Les cellules chémoréceptrices périphériques situées dans les corps carotidiens contrôlent plus particulièrement l'augmentation rapide de la ventilation en réponse à l'hypoxie. [98] L'adaptation respiratoire en réponse à une hypoxie ou une hypercapnie de courte durée a été étudiée chez les souris sauvages et mutantes (TASK-2 ";").
[99] La respiration des souris a été mesurée avec un appareil pléthysmographique (EMKA technologies, France).
[100] Dans les conditions normales (21 % d'oxygène), les paramètres respiratoires étaient identiques chez des souris TASK-2'A et les souris sauvages.
[101] Les deux types de souris montrent une augmentation similaire de la respiration en réponse à un environnement comprenant 5% de CO2
(hypercapnie) (Figure 6A). Une diminution de la concentration d'oxygène de 21 % à 9% a également induit une augmentation de la respiration identique chez les deux types de souris (Figure 6B). [102] L'hypoxie était transitoire et l'augmentation maximale de la respiration est apparue après quelques minutes.
[103] Cette expérience montre une adaptation respiratoire normale en réponse à une hypoxie de courte durée, laquelle est liée à la sensibilité à l'oxygène des cellules chémosensibles périphériques situées dans les corps carotidiens. La réponse à l'hypercapnie est également inchangée chez les souris mutantes.
Exemple 6 : Effet de l'hypoxie prolongée sur la transcription de TASK-2
[104] La réponse à une hypoxie prolongée a également été étudiée. Cette réponse a été mesurée à 8% en oxygène sur une période de plusieurs heures.
[105] Les souris utilisées dans cette expérience sont identiques à celles de l'exemple précédent. [106] Pour cette expérience, 8 souris TASK-2+/+ et 7 souris TASK-2'7" ont été utilisées.
[107] Au cours d'une hypoxie de 2 heures, une diminution de la respiration a été observée chez les souris contrôles (Figure 7A). Une dépression hypoxique du débit ventilatoire (minute volume ou MV, exprimé en ml/min/g) a été causée en particulier par une diminution de la fréquence respiratoire (RF). Cette dépression respiratoire induite en réponse à une hypoxie chronique était absente chez les souris TASK-2 ''".
[108] Cet exemple montre que la réponse initiale à l'hypoxie est normale chez les souris TASK-2"7". Cette réponse correspond à la stimulation des chémorécepteurs périphériques (Takakura AC et al. (2006) « Peripheral chemoreceptor inputs to retrotrapezoid nucleus (RTN) CO2-sensitive neurons in rats ». J. Appl Physiol, 63, 1658-1664 (Réf 20). Au contraire, la dépression respiratoire centrale induite par l'hypoxie chronique est totalement absente chez les souris TASK-2 ~'~.
[109] Cette expérience indique donc clairement que le canal TASK-2 est un élément critique pour la sensibilité médullaire à l'hypoxie.
[11O] TeI que démontré dans cette expérience et dans l'exemple 2 précédent, l'inactivation des canaux potassiques TASK-2 est donc un moyen pour inhiber la dépression respiratoire et stimuler la respiration dans des conditions hypoxiques. Cette inactivation est donc une nouvelle stratégie qui se distingue des approches thérapeutiques utilisées dans l'art antérieur.
[111] L'adaptation respiratoire à une hypoxie chronique telle que décrite dans Powell et collaborateurs (Powell FL et al. (1998) « Time domain of the hypoxie ventilatory response ». Respir Physiol, 112, 123-134. (1998) (Réf 21)) a été étudiée dans les conditions suivantes : 10% de d'oxygène correspondant à une altitude de 5300m pendant 20 heures. [112] Durant les trois à quatre premières heures d'hypoxie, les souris contrôles ont montré une forte dépression du débit respiratoire avec une prolongation du temps d'expiration et une réduction de la fréquence respiratoire. Cette phase a été suivie par une phase d'adaptation caractérisée par une diminution du temps d'expiration qui est revenu à des valeurs normales après 10 à 12 heures (Figure 8 B et C). [113] Durant tout le temps de l'hypoxie, les paramètres respiratoires sont restés inchangés pour les souris TASK-2';". Ces souris présentent donc un phénotype respiratoire similaire à celui des souris contrôles après adaptation.
[114] Par ailleurs, une mesure de l'expression de TASK-2 a été effectuée. [115] Les souris ont été soumises dans un environnement avec 10% d'oxygène pendant 24 heures, la mesure de l'expression des ARN messagers de TASK-2 (ainsi que TASK-1 et l'érythropoïétine en contrôles) a ensuite été effectuée. [116] Les ARN ont été isolés à partir du rein et du tronc cérébral des souris en utilisant le Kit mini RNeasy (Qiagen). Pour la transcription inverse, une reverse transcriptase (Promega) a été utilisée selon le protocole fourni par le fabricant. Une réaction de polymérisation en chaîne en temps réel a été effectuée avec le système LightCycler (Roche) en utilisant le kit PCR SYBR Green (Qiagen). La transcription des gènes TASK-2, TASK-1 et de l'érythropoïétine a été mesurée et norrrialisée par rapport à l'expression de la béta-actine.
[117] Les amorces utilisées et les conditions de réalisation de la réaction de polymérisation en chaîne en temps réel étaient les suivantes. Amorces pour la béta-actine : Amorce sens, 5' CCACCGATCCACACAGAGTACTT 3' (SEQ ID N°1); Amorce antisens, 5' GACAGGATGCAGAAGGAGATTACTG 3 (SEQ ID N°2) '. Amorces pour l'érythropoïétine : Amorce sens, 5' AGAATGGAGGTGGAAGAACAG 3' (SEQ ID N°3); Amorce antisens, 5' TGTCTATATGAAGCTGAAGGGT 3'(SEQ ID N°4). Amorces pour TASK-2 : Amorce sens, 5' GCTTTGGGGACTTTGTGG 3' (SEQ ID N°5); Amorce antisens, 5' AAAGAGGGACAGCCAAGC 3'(SEQ ID N°6).
[118] La température d'hybridation des amorces étaient de 55 0C.
[119] Les résultats ont montré que la quantité d'ARNm codant pour TASK- 2 reste inchangée dans le rein et dans le tronc cérébral durant l'hypoxie. (Figure 8 A et B).
[120] La transcription du gène TASK-2 reste donc inchangée lors d'une hypoxie prolongée. Ainsi, le canal potassique TASK-2 est donc une nouvelle cible pour inhiber la dépression respiratoire et stimuler la respiration dans des conditions hypoxiques. Tel que démontré précédemment, l'inactivation de TASK-2 est donc une nouvelle stratégie qui se distingue des approches thérapeutiques utilisées dans l'art antérieur. Exemple 7 : Mise en évidence in vitro de l'intervention des canaux TASK-2 dans les mécanismes d'adaptation centrale de la respiration
[121] Cette expérience a été réalisée dans des conditions et sur des souriceaux identiques à ceux de l'exemple 2.
[122] Cette expérience démontre des changements dans l'activité respiratoire lors d'une anoxie, d'une acidose et d'un alcalose. [123] Une préparation en bloc de troncs cérébraux de souris néonatale qui comprennent les chémorécepteurs centraux a été effectuée (Figure 9 A-C). [124] La préparation en bloc a été effectuée sur des nouveau-nés de 1 à 3 jours. Chaque souriceau a été anesthésié avec de l'halothane. Le tronc cérébral et la moelle épinière cervicale ont été isolés et transférés dans une chambre d'enregistrement, la partie ventrale vers Ie haut, et perfusés avec un fluide cérébrospinal artificiel à un débit de 4 ml. min"1.
[125] Une mesure de la fréquence respiratoire, de la durée des bouffées respiratoires, de l'amplitude et de l'aire de surface des bouffées a été effectuée.
[126] Pour cette expérience, 10 souris TASK-2 +/+, 8 souris TASK-2 +/" et 7 souris TASK-2 "'" ont été utilisées.
[127] La fréquence respiratoire de base était identique chez tous les individus dans les conditions normales. Chez les souris contrôles, une acidose métabolique ou respiratoire a induit une augmentation de la fréquence respiratoire (environ + 40%), tandis qu'une alcalose et une anoxie ont provoqué une diminution significative de la fréquence respiratoire (environ - 40%).
[128] Les souris TASK-2 -/- ont montré des diminutions de la fréquence respiratoire similaires au changement de pH. Cependant, cette réponse à l'anoxie a été complètement supprimée dans les souris TASK-2 -/- (Figure 9 D et E). [129] Cette expérience montre qu'il existe chez les souris TASK-2 -/- une réponse à l'hypoxie qui se traduit par une augmentation de la durée des inspirations sans modification de la fréquence respiratoire. [130] Ainsi, le canal potassique TASK-2 est donc une nouvelle cible pour inhiber la dépression respiratoire et stimuler la respiration dans des conditions hypoxiques. 2
Exemple 8 : Mise en œuvre d'un criblage selon la présente invention
[131] La distribution de TASK-2 chez un être humain adulte, sa cartographie chromosomique, ses propriétés biophysique et pharmacologiques, sa régulation par le pH externe ont été étudiées d'après le document WO 00/27871.
[132] Le criblage suivant a été mis en œuvre . Des cellules HEK (Human Embryonnic Kidney cells) ont été transfectées avec un plamide contenant le DNA complémentaire du gène du canal TASK-2 humain (plRES-CD8- hTASK2) par la méthode à la lipofectamine. Après 24 heures de culture, les courants TASK-2 sont enregistrés par la méthode du voltage-clamp (patch-clamp en configuration cellules entière). Les courants sont activés par des sauts de voltage depuis un potentiel de repos à -95V jusqu'à des valeurs variables comprises entre -80 et +45mV.
[133] Les courants sont enregistrés en configuration cellule entière au moyen d'un amplificateur EPC-10 (HEKA). La pipette de « patch » contient une solution 95 K-gluconate, 30 mM KCI, 4,8 mM Na2HPO4 , 1 ,2 mM
NaH2PO4 , 5 mM glucose, 2,38 mM MgCI2 , 0,726 mM CaCI2 ,1 mM EGTA,
3 mM ATP, pH 7,2. La solution externe est une solution RINGER : 145 mM
NaCI, 0,4 mM KH2PO4 , 1 ,6 mM K2HPO4 , 5 mM glucose, 1 mM MgCI2 , 1 ,3 mM CaCI2 , 5 mM HEPES, pH 7,4. [134] Différentes drogues peuvent être appliquées à différentes concentrations par perfusion du bain externe et leurs effets sont évalués par la modification des courants par rapport aux conditions contrôles.
[135] Dans l'exemple de la Figure 4, on voit que l'application de Doxapram à 0,9 mM dans le bain a provoqué une diminution de 25% du courant évoqué par les sauts de potentiel.
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(Réf 21) Powell FL et al. (1998) « Time domain of the hypoxic ventilatory response ». Respir Physiol, 112, 123-134.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un procédé de criblage pour l'identification de molécules candidates pour Ie traitement de troubles respiratoires dus à un dysfonctionnement du système nerveux central chez un mammifère, ledit procédé de criblage comprenant une étape consistant à déterminer si l'activité fonctionnelle d'un polypeptide canal ionique TASK-2 en présence d'une molécule test est diminuée ou supprimée par rapport à l'activité fonctionnelle dudit canal ionique TASK-2 en l'absence de ladite molécule test, la molécule test étant considérée comme étant une molécule candidate lorsqu'elle diminue ou supprime ladite activité fonctionnelle.
2. Utilisation selon la revendication 1 , dans laquelle l'étape consistant à déterminer si l'activité fonctionnelle du polypeptide TASK-2 est diminuée ou supprimée comprend : i) une mise en contact d'une cellule exprimant un polypeptide TASK-2 présentant une activité fonctionnelle, avec ladite molécule test, et ii) une mesure de l'activité fonctionnelle du polypeptide TASK-2 et/ou de son expression en présence de ladite molécule test.
3. Utilisation selon la revendication 2, dans laquelle ladite cellule exprime le polypeptide TASK-2 de manière endogène.
4. Utilisation la revendication 3, dans laquelle ladite cellule exprime le polypeptide TASK-2 sous forme recombinante.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle ladite activité fonctionnelle est déterminée par une mesure choisie dans le groupe comprenant : une mesure du courant ionique traversant le polypeptide TASK-2, une mesure du changement du potentiel membranaire de la cellule exprimant le polypeptide TASK-2, une mesure du changement de la concentration ionique intracellulaire de la cellule exprimant le polypeptide TASK-2.
6. Utilisation selon la revendication 5, dans laquelle ladite activité fonctionnelle est déterminée par mesure du courant ionique traversant le polypeptide TASK-2, et dans laquelle le courant ionique traversant le polypeptide TASK-2 est un efflux d'ions rubidium.
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à
6, pour l'identification de molécules utilisables pour le traitement de troubles respiratoires dus à un dysfonctionnement du système nerveux central choisis dans le groupe comprenant le syndrome des apnées du sommeil, les formes respiratoires du syndrome de mort subite du nourrisson, les modèles de respiration pathologique due à l'altitude.
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