WO2009153463A1 - Peptides immunogenes issus de la proteine midkine comme vaccin anticancereux - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to the use as an anticancer vaccine of peptides derived from the Midkine protein capable of inducing CD4 + T and / or CD8 + T lymphocytes which recognize said midkine protein in the majority of individuals of the Caucasian population, in many types of cancers.
  • the invention also relates to the use of such peptides recognized by Midkine-specific CD4 + and / or CD8 + T lymphocytes, in the majority of individuals of the Caucasian population, in many types of cancers, such as reagent for the immunomonitoring of the cellular response against midkine during cancer or anticancer treatment.
  • Tumor cells express a set of proteins that healthy cells do not express or little, or that are found in only a few cell types. These proteins being preferentially expressed in the tumor cells, can constitute a tumor antigen, that is to say a protein present in the tumor and which induces an immune response capable of recognizing the tumors and ideally eliminating them. This response may be either an antibody response as the antigen is membrane-bound or a cellular response involving CD8 + or CD4 + T cells. Most tumor antigens are intracellular and induce a cellular response. They are prime targets for vaccine development.
  • T cells contribute to the cellular immune response directed against tumors. They can be induced spontaneously in patients with cancer and infiltrate tumors, giving in rare cases a spontaneous regression. They can be induced by vaccines that are intended to facilitate their recruitment.
  • CD8 + T cells are cytotoxic (CTL CD8 + ) and can lyse tumor cells. The lysis of cells during their recognition involves perforin and granzymes.
  • CD8 + T cells recognize the tumor antigen in the form of peptides, called CD8 + T epitopes, that are present on the surface of tumors by HLA class I molecules (HLA-A, HLA-B and HLA-C). .
  • CD4 + helper T cells recognize tumor antigens in the form of peptides, termed CD4 + T epitopes, presented to them by HLA class II molecules.
  • CD4 + T cell recognition of tumors can be achieved directly when tumors express class II molecules or indirectly through the capture of cell debris by dendritic cells that are cells that have a high number of cells. HLA class II molecules on their surface.
  • CD4 + T lymphocytes involved in anti-tumor immunity play a multiple role in the control of tumors and in particular are involved in the recruitment and maintenance of CD8 + CTLs.
  • CD4 + T cells play a role in dendritic cell (DC) activation via a CD40-dependent mechanism.
  • DC dendritic cell
  • Tumor specific antigens This is the most important group of antigens, which was initially found in melanomas but is actually expressed in many tumors. These antigens are also called “Cancer Testis” because of their expression in the testes which is the only healthy tissue that expresses them. Some of these antigens are also expressed in the placenta or ovaries. Because the testes and placenta lack conventional HLA molecules, these antigens are not visible to T cells in normal tissues. The main antigens are the MAGE-A, MAGE-B, MAGE-C, GAGE, LAGE and SSX antigens. * Differentiation antigens
  • Differentiation antigens are proteins expressed by tumors and by the cell tissue that gave rise to them.
  • the best known examples are melanoma antigens which are also expressed in melanocytes. These are tyrosinases (TYRO, TRP-I and TRP-2) and GpIOO and MELAN-A / MART-1 antigens.
  • Other differentiation antigens are also known for prostate tumors (kallikrein-4 and PSA) or cancer of the digestive tract (CEA).
  • Over-expressed antigens are highly expressed proteins in many tumor cells, whereas their expression level is low in normal cells. This is the case of the HER-2 / neu antigen which is found in about 30% of carcinomas of the breast and ovaries and in some carcinomas of the colon and kidney. P53 is also frequently overexpressed in tumors. This protein, which inhibits cell multiplication, is normally very quickly recycled to normal cells. Telomerase (hTERT) is found in more than 80% of tumors, regardless of tissue origin, whereas it is absent or low-noise in normal cells. The action of telomerase serves to compensate for the reduction in telomeres that occurs during cell division.
  • Apoptosis inhibiting proteins such as the Survivin protein are a family of proteins that, by inhibiting caspases, inhibit cell death.
  • Other antigens Other categories of antigens are antigens resulting from mutation or genetic arrangement (MUM-I, CDK4, beta-catenin, HLA-A2, BCR-ABL, CASP-8) and tumor antigens of viral origin (E6 and E7 proteins of papillomaviruses involved in cancer of the cervix).
  • T lymphocytes capable of recognizing tumor cells that express these proteins. It is indeed possible that they are only weakly immunogenic because of tolerance mechanisms or the absence of T epitopes in their sequence. It is also possible that they are capable of inducing an immune response but that the induced cells do not recognize the tumors.
  • the T epitopes derived from these proteins may indeed not be presented on the surface of the tumor cells because of an insufficient level of expression or poor protein pretreatment in the tumor cells.
  • Midkine protein also known as NEGF2 (Neurite outgrowth-promoting factor 2)
  • NEGF2 Neuronal growth factor 2
  • NEGF2 Neuronal growth factor 2
  • the midkine gene is located on chromosome 11 at position 1 IpI 1.2. It has 4 exons and has a size of 3.5kb; the coding sequence corresponds to NCBI access number M69148 (SEQ ID NO: 1 in the attached sequence listing).
  • the regulatory region contains a retinoic acid response site and two WT1 tumor suppressor response sites (Wilms Tumor Suppressor 1).
  • the retinoic acid response site is responsible for the induction of Midkine expression by retinoic acid, whereas the WT1 response sites are involved in the decrease of WT1 expression.
  • a variant splicing of the human Midkine protein, called INSP 106, has also been described (PCT International Application WO 2004/052928).
  • Midkine is a 143 amino acid protein rich in basic residues and has five disulfide bridges [(37,61); (45.70); (52,74); (84,116); (94.126)].
  • the human sequence corresponds to SwissProt access number P21741 ( Figure 1 and SEQ ID NO: 2 in the attached sequence listing). It is expressed in the form of a precursor comprising a signal peptide of 22 amino acids (FIG. 1). It has about 50% homology with the protein Pleiotrophin.
  • the structure of Midkine was resolved by NMR in 1997.
  • the protein has two different domains, each consisting of three anti-parallel beta sheets maintained by disulfide bridges; the two domains are connected by a flexible region.
  • Biological activity requires only the C-terminal domain. This domain is conserved and is found from the Drosophila to the man, which confirms its functional role. It also has two sites for fixing heparin. At least four receptors capable of binding midkine are known, which gives it many activities: members of the Syndecan family which are proteoglycans comprising heparin sulphates; PTP ⁇ which is a proteoglycan comprising chondroitin sulfate; ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase); LRP which is a member of the LDL receptor family.
  • midkine is mainly expressed during embryogenesis with peak expression in the midgut.
  • Midkine is involved in the development of neurons. It causes the growth of neurites and the migration of nerve cells. It is involved in the development of the neuromuscular junction and the protection of neurons.
  • Midkine is involved in the development of teeth, lungs, kidneys and bones.
  • Midkine deficient mice are viable and are only affected in neuronal functions consistent with the role of midkine in the development of the nervous system. It has also been observed that mice rendered defective for the midkine gene are less affected than control mice by the induction of nephritis. They are also less prone to restenosis (narrowing of the arteries due to the proliferation of damaged arterial tissues).
  • Midkine is overexpressed in many tumors whereas in healthy individuals and adults its expression is less and local (small intestine, brain). Midkine is one of the 40 most expressed genes in tumors compared to healthy tissues (Velculescu et al, Nat Genet, 1999, 23, 387-388). Midkine is overexpressed in about 80% of the cases of many human cancers, particularly carcinomas.
  • Elevated expression has been correlated with poor prognosis in bladder cancer, glioblastoma, and neuroblastoma (O'Brien, Cancer Res., 1996, 56, 2515-2518).
  • overexpression of midkine is correlated with increased resistance to chemotherapy in human gastric cancer cell lines. Its expression is not only tissue.
  • a high level of midkine has been observed in the serum of more than 60% of patients with carcinomas (Muramatsu et al., J. Biochem., 2003, 132, 259-371). This level decreases when the tumor is removed. The presence of midkine in the serum could therefore have a diagnostic value. Midkine seems to have many activities related to tumorigenesis.
  • Midkine or its modulators are useful for stimulating angiogenesis, rhematopoiesis, preventing atherosclerosis and restenosis, inhibiting apoptosis, in the prevention and treatment of inflammatory, cardiac pathologies (myocardial infarction), cerebral, hepatic, nerve, renal, ocular (retinopathies), neurofibrosis, respiratory (asthma and pulmonary hyperplasia), post-surgical (Requests US 2003/0072739, US 2003/0185794, US 2004/0077579, US 2005/0079151, US 2006/0148738 and US 2005/0130928; European application EP 1832296, PCT International Applications WO 2007/055397 and WO 2000/031541; U.S.
  • the Midkine protein which possesses a preferential expression in tumors contains peptides capable of inducing specific CD4 + and / or CD8 + T lymphocytes that recognize the Midkine protein expressed by tumor cells in many types of cancer. among the majority of individuals in the Caucasian population.
  • These peptides represent potential candidates for prophylactic or therapeutic vaccination against cancer, since they are capable of inducing a CD4 + T and CD8 + T response directed against the tumor, in the majority of vaccinated patients, to the extent that where: (i) they are derived from an antigen expressed by many tumors, (ii) they are capable of inducing specific CD4 + and CD8 + T cells recognizing the antigen expressed by the tumors, and (iii) they are recognized by CD4 + and CD8 + T cells in the majority of individuals in the Caucasian population because they take into account the polymorphism of HLA molecules and are restricted to predominant HLA molecules in the Caucasian population.
  • these peptides that are recognized by T lymphocytes are recognized by T lymphocytes
  • CD4 + and / or T CD8 + specific for a tumor antigen expressed by the majority of tumors are useful for the immunomonitoring of the cellular response against Midkine during the course of a cancer and especially after an anticancer treatment (surgical, chemotherapy, radiotherapy, immunotherapy).
  • the present invention accordingly relates to the use of a midkine protein derived from the peptide comprising at least one CD4 + T epitope or CD8 + T cells restricted to HLA molecules predominant in the Caucasian population or a polynucleotide encoding said peptide, for the preparation of an anti-cancer vaccine for the treatment of cancers associated with tumor overexpression of said midkine protein.
  • Midkine (precursor of 143 amino acids or mature protein (positions 23 to 143 of the precursor) that a peptide fragment of at least 8 consecutive amino acids of said protein.
  • “Midkine” means a Midkin protein derived from which mammal, preferably, is the human protein The positions of the peptides derived from midkine are indicated with reference to the human sequence (SwissProt P21741, Figure 1 and SEQ ID NO: 2).
  • Preponderant HLA molecule in the Caucasian population or "predominant HLA molecule” means an HLA I molecule (HLA-A HLA-B or HLA-C) or predominant HLA II molecule. These are the HLA-A, HLA-B and HLA-C molecules comprising an alpha chain encoded by an allele whose frequency is greater than 5% in the Caucasian population, as specified in Table I below.
  • HLA II molecules comprising a beta chain encoded by an allele whose frequency is greater than 5% in the Caucasian population, as specified in Table II below.
  • the predominant HLA II molecules (gene frequency> 5%) are indicated in bold
  • CD4 + T epitope of the Midkine restricted to the predominant HLA II molecules in the Caucasian population means a peptide of 11 to 15 amino acids which binds at least one HLA II molecule, predominant in the Caucasian population and is recognized by CD4 + T cells in individuals of this population; the peptide comprises a sequence of 9 amino acids including the anchoring residues to HLA II molecules, flanked at one of its ends, preferably at both ends, with at least 2 amino acids, preferably 3 amino acids.
  • CD8 + T epitope of the Midkine restricted to the predominant HLA I molecules in the Caucasian population is understood to mean a peptide of 8 to 13 amino acids which binds at least one predominant HLA I molecule in the Caucasian population and is recognized by lymphocytes. CD8 + T in individuals of this population; the peptide comprises a sequence of 8 to 9 amino acids including the anchoring residues to the HLA I molecules.
  • Cancer is a cancer associated with the overexpression of the Midkine protein by tumor cells such as, but not limited to: cancers of the esophagus, stomach, colon, pancreas, thyroid, lung, breast, bladder, uterine, ovarian, prostate, hepatocellular carcinoma, osteosarcoma, neuroblastoma, glioblastoma, astrocytoma, leukemia, and tumors. WiIm.
  • the term "natural or synthetic amino acid” is intended to mean the naturally occurring ⁇ -amino acids commonly found in the proteins (A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F).
  • amino acids D derived from amino acids L and the analogs of the preceding amino acids .
  • hydrophobic amino acid is understood to mean an amino acid selected from (one-letter code): A, V, L, I, P, W, F and M.
  • aromatic amino acid is meant an amino acid selected from (one-letter code): F, W and Y.
  • the peptides according to the invention are recognized by CD4 + and / or CD8 + T lymphocytes in the majority of individuals insofar as they are presented by HLA I and HLA II molecules which are predominant in the Caucasian population. They are immunogenic, ie they are capable of inducing Midkine-specific CD4 + and / or CD8 + T lymphocytes from the precursors present in the majority of naive individuals or to stimulate such T cells. in the majority of individuals with cancer associated with overexpression of midkine. In addition, the CD4 + and / or CD8 + T cells that are induced in the majority of individuals recognize midkine expressed by the tumors of these individuals.
  • the immunogenicity of the peptides may be determined, in particular from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), by any appropriate assay known to those skilled in the art, for example: a cell proliferation test, a cytotoxicity test, a test ELISPOT (assay for cytokine-producing cells) or a cytokine assay (IFN- ⁇ , IL-2, IL-4, IL-10, IL-5, TNF- ⁇ and TGF- ⁇ ).
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • the invention encompasses natural or synthetic variant peptides obtained by mutation (insertion, deletion, substitution) of one or more amino acids in the midkine sequence, since said peptide retains good affinity for the predominant HLA molecules and is immunogenic.
  • the natural variants result in particular from the polymorphism of midkine.
  • HLA DR HLA DR
  • Binding patterns for HLA DR molecules are described in particular in Sturnolio et al., Nat. Biotech, 1999, 17, 533-534 and Rammensee et al, Immunogenetics, 1995, 41, 178-228.
  • the amino acid residues involved in the binding to the HLA-I molecules (anchoring residues) and the effect of the modifications of these residues on the binding to the HLA-I molecules are known to those skilled in the art.
  • Peptide binding motifs to HLA class I molecules are described in Rammensee et al., Immunogenetics, 1995, 41, 178-228 and in Table III below.
  • the invention also encompasses the modified peptides derived from the foregoing by introduction of any modification at the level of amino acid residue (s), peptide bond or peptide ends, since said modified peptide retains a good affinity for the molecules. HLA preponderant and is immunogenic.
  • modifications which are introduced into the peptides by conventional methods known to those skilled in the art, include in a nonlimiting manner: the substitution of an amino acid by a nonproteinogenic amino acid (amino acid D or the like of an acid amine); adding a chemical group (lipid, oligo or polysaccharide) at a reactive function, in particular the side chain R; modification of the peptide bond (-CO-NH-), in particular by a retro-type or retro-inverso bond (-NH-CO-) or a bond different from the peptide bond; cyclization; the fusion of a peptide (epitope of interest for vaccination, label useful for the purification of the peptide, especially in cleavable form with a protease); the fusion of the sequence of said peptide with that of a protein, in particular an ⁇ chain of an HLA I or HLA II molecule, a ⁇ chain of an HLA II molecule or the extracellular domain of said chain or else a sequence of targeting in the
  • said peptide is constituted by the Midkine protein.
  • it is the human protein of sequence SEQ ID NO: 2.
  • the present invention encompasses the use of the denatured midkine protein by any suitable means known to those skilled in the art, and in particular reduced midkine protein.
  • the present invention also encompasses the use of variants of Midkine protein in which at least one of the cysteines involved in a disulfide bridge is replaced by another amino acid, for example a serine.
  • the present invention also encompasses the use of amino acids of at least eight peptides derived from the midkine protein that comprise at least one CD4 + T epitope or CD8 + T cells as defined above.
  • the invention encompasses the use of peptides that bind to one of the HLA I molecules and / or one of the HLA II molecules. More frequent in the Caucasian population, in particular the HLA-A2 molecule (Table I) and / or the HLA-DR7, HLA-DRB4, HLA-DP401 or HLA-DP402 molecules (Table II).
  • the invention also encompasses the use of peptides which bind several different HLA I and / or HLA II molecules, so as to widen the immunization coverage to the majority of the Caucasian population.
  • the invention also encompasses the use of peptides of at least 8 amino acids from the Midkine N-terminal domain (positions 1-84 with reference to the midkine precursor sequence) which comprise at least one CD4 + T epitope. or T CD8 + as defined above.
  • said fragment has a length of
  • amino acids From 8 to 100 amino acids, preferably from 8 to 50 amino acids, preferably from 10 to 25 amino acids (10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 , 23, 24 or 25 amino acids).
  • said peptide is a fragment of at least 8 amino acids of the Midkine protein comprising at least one CD8 + T epitope restricted to the HLA-A2 molecule, which peptide comprises at least the 14 positions. at 21 or 114-122 of the amino acid sequence of said midkine protein.
  • said peptide comprises positions 12 to 21, 13 to 21, 13 to 22, 14 to 22 or 13 to 122 of the amino acid sequence of said midkine protein.
  • said peptide is constituted by positions 12 to 21 (MDK 12-21), 13 to 21 (MDK 13-21), 13 to 22 (MDK 13-22), 14 to 22 (MDK 14-22) 113-122 (MDK 113-122) or 114-122 (MDK 114-122) of the amino acid sequence of Midkine protein; these peptides correspond, respectively, to the sequences SEQ ID NO: 3 to 8 in the sequence listing in the appendix.
  • said peptide is a fragment of at least 8 amino acids of the Midkine protein comprising at least one CD4 + T epitope restricted to at least one predominant HLA II molecule in the Caucasian population, which peptide comprises at least positions 9 to 15, 14 to 28, 52 to 64, 64 to 78, 70 to 84, 74 to 88, 78 to 92, 84 to 98, 99 to 113, 105 to 119, 1 to 124 or 119 to 133 of the amino acid sequence of said protein Midkine.
  • these peptides are the peptides of SEQ ID NO: 9, 10, 13 to 15, 21 to 26, 28, 29 and 30 (Table VII).
  • said predominant HLA II molecule in the Caucasian population is chosen from the HLA-DR1, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DRI1, HLA-DR1, HLA-DR1 and HLA-DR1 molecules.
  • HLA II molecules are advantageously coded respectively by the HLA DRB 1 * 0101, DRB 1 * 0301, DRB1 * 0401, DRB1 * 0701, DRB1 * 11O1, DRB1 * 13O1, DRB1 * 15O1, DRB3 * 0101, DRB4 * 0104 alleles, DRB5 * 0101, DP * 0401 and DP * 0402.
  • said peptide binds at least four different HLA II molecules predominant in the Caucasian population and comprises at least positions 9 to 15, 14 to 28 or 110 to 124 of the amino acid sequence of said midkine protein.
  • Said peptide advantageously comprises the positions 1 to 15 4 to 18 5 9 to 21, 9 to 22, 9 to 23 or l4 to 28 of the amino acid sequence of midkine protein.
  • said peptide is constituted by positions 1 to 15 (MDK 1-15), 4 to 18 (MDK 4-18), 9 to 21 (MDK 9-21), 9 to 22 (MDK 9-22) , 9-23 (MDK 9-23), 14-28 (MDK 14-28), or 110-124 (MDK 110-124) of the amino acid sequence of Midkine protein; these peptides correspond, respectively, to the sequences SEQ ID NO: 9 to 15 in the sequence listing in the appendix.
  • said peptide advantageously comprises several CD4 + and / or CD8 + T epitopes of the Midkine protein, optionally combined with other CD4 + , TCD8 + or T epitopes.
  • the epitopes are advantageously CD4 + T epitopes. or CD8 + T derived from tumor antigen as described at http://www.cancerimmunity.org/peptidedatabase/tumorspecific.htm, including CD4 + or CD8 + T epitopes derived from MAGE, NY-ESO-I or survivin.
  • said peptide is a fragment of the Midkine protein comprising at least one CD8 + T epitope restricted to the HLA-A2 molecule and at least one CD4 + T epitope restricted to at least four HLA II molecules.
  • various predominant in the Caucasian population which peptide comprises positions 9 to 21, 9 to 22, 9 to 23 or 110 to 124 of the amino acid sequence of said midkine protein.
  • said peptide is constituted by positions 9 to 21 (MDK 9-21), 9 to 22 (MDK 9-22), 9 to 23 (MDK 9-23) or 110 to 124 (MDK 1 10-124) of the amino acid sequence of the Midkine protein.
  • Such a peptide advantageously makes it possible to induce both CD4 + and CD8 + T lymphocytes specific for numerous tumors in the majority of the individuals of the Caucasian population presenting these tumors.
  • the different epitopes can be included in the vaccine composition in the form of a mixture of isolated peptides, a multiepitopic peptide, a fusion protein or a polynucleotide encoding the foregoing peptides / protein.
  • the said peptides / protein may be modified or associated with liposomes or lipids, in particular in the form of lipopeptides.
  • said polynucleotide is included in a vector, in particular an expression vector.
  • epitopes that can be incorporated into the vaccine composition of the invention, mention may be made especially of: MAGE CD8 + T epitopes as described in the US Pat.
  • MAGE CD4 + T epitopes such as MAGE-A3 267-282 restricted to DR1 (PCT International Application WO 02/095051); MAGE-A3 149-160 restricted to DR4 and DR7 (Kobayashi et al, Cancer Research, 2001, 61, 4773-4778); MAGE-A3 191-205 and 281-295 restricted to DR1 (Consogno et al., Blood, 2003, 101, 1038-1044, Manici et al., J. Exp.
  • an epitope B consisting of a sugar (Alexander et al., cited above), said epitope B being preferably in the form of a glycopeptide, and
  • an epitope B of Midkine specifically recognized by antibodies directed against said tumor antigen.
  • said peptide derived from midkine is a multi-epitopic peptide comprising the concatenation of at least two identical or different epitopes of which at least one is a CD4 + T epitope and / or CD8 + T of Midkine.
  • the multi-epitope peptide advantageously comprises other epitopes (CD4 + T epitope or CD8 + T of another tumor antigen), as defined above.
  • the sequences of the different epitopes are linked together by a peptide bond or separated by heterologous sequences, that is to say sequences different from those naturally present at this position in the sequence. amino acids of Midkine.
  • said multiepitopic peptide has a length of 20 to 1000 amino acids, preferably 20 to 100 amino acids.
  • Said multiepitopic peptide advantageously comprises a label fused at one of its ends for the purification or detection of said fragment.
  • the tag particularly a polyhistidine sequence or an epitope B of an antigen, is preferably separated from the multiepitope sequence by a protease cleavage site so as to isolate the multiepitope sequence from the fusion.
  • said peptide derived from Midkine is a lipopeptide comprising a peptide or a multiepitopic fragment, as defined above.
  • Said lipopeptide is especially obtained by adding a lipid on an ⁇ -amino function or on a reactive function of the side chain of an amino acid of said peptide or multiepitopic fragment; it may comprise one or more chains derived from C 4-20 fatty acids, optionally branched or unsaturated (palmitic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, 2-amino hexadecanoic acid, pimelautide, trimetauxide) or a derivative of a steroid.
  • the preferred lipid portion is in particular represented by a N ⁇ -acetyl-lysine N ⁇ (palmitoyl) group, also called Ac-K (Pam).
  • said peptide derived from midkine is fused with a heterologous protein or protein fragment (fusion protein).
  • the peptide or multiepitopic fragment may be fused with the NH 2 or COOH end of said protein or inserted into the sequence of said protein.
  • said fusion protein consists of a peptide as defined above, fused with a targeting sequence in the endosome, preferably derived from a human invariable chain Ii or from the protein LAMP-I.
  • the targeting sequences in the endosome and their use for the targeting of antigens in the endosome are notably described in Sanderson et al. (Proc Nat Sci USA, 1995, 92, 7217-7222), Wu et al. (Proc Nat Sci USA, 1995, 92, 11671-11675) and Thompson et al. (J. Virol., 1998, 72, 2246-2252).
  • said fusion protein consists of a peptide as defined above, fused with one of the chains of an HLA molecule, preferably the beta chain of an HLA II molecule or the alpha chain of an HLA I molecule, or with a fragment thereof corresponding to a soluble HLA molecule, in particular a fragment corresponding to the domain extracellular preceded by the homologous signal peptide or a heterologous signal peptide.
  • Said peptide is advantageously inserted between the signal peptide and the NH 2 end of the extracellular domain of the ⁇ or ⁇ chain, as described for the HLA-DR molecule (Kolzin et al, PNAS, 2000, 97, 291-296).
  • said peptide or said multiepitopic fragment are fused with a protein facilitating their purification or their detection, known to those skilled in the art such as Glutathione-S-Transferase (GST) and fluorescent proteins (GFP and derivatives).
  • GST Glutathione-S-Transferase
  • GFP fluorescent proteins
  • the sequence of the peptide or multi-epitope fragment of interest is preferably separated from the rest of the protein by a protease cleavage site, to facilitate the purification of said peptide or said multiepitopic fragment.
  • said polynucleotide encodes a peptide, a multi-epitope fragment or a fusion protein as defined above.
  • the sequence of said polynucleotide is that of the cDNA coding for said peptide or multiepitopic fragment or said fusion protein. Said sequence may advantageously be modified in such a way that codon usage is optimal in the host in which it is expressed.
  • said polynucleotide may be linked to at least one heterologous sequence.
  • heterologous sequence is understood to mean a nucleic acid sequence encoding midkine, any nucleic acid sequence other than those which, in nature, are immediately adjacent to said nucleic acid sequence encoding said Midkine peptide.
  • said polynucleotide is inserted into a vector.
  • the term vector is understood to mean a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid with which it is associated.
  • One type of vector that can be used in the present invention includes, but is not limited to, a linear or circular DNA or RNA molecule consisting of chromosomal, non-chromosomal, synthetic, nucleic acids. or semi-synthetic, such as in particular a viral vector, a plasmid or an RNA vector.
  • nucleic acid molecule of interest in which a nucleic acid molecule of interest can be inserted in order to introduce and maintain it in a eukaryotic or prokaryotic host cell are known per se; the choice of an appropriate vector depends on the use envisaged for this vector (for example replication of the sequence of interest, expression of this sequence, maintenance of this sequence in extrachromosomal form, or integration into the chromosomal material of the host), as well as the nature of the host cell.
  • naked nucleic acids DNA or RNA
  • viral vectors such as adenoviruses, retroviruses, lentiviruses and AAVs
  • sequence of interest has been inserted beforehand
  • said sequence isolated or inserted in a plasmid vector
  • these methods can advantageously be combined, for example by using electroporation associated with liposomes.
  • said vector comprises all the elements necessary for the expression of the peptide or of the protein as defined above.
  • said vector comprises an expression cassette including at least one polynucleotide as defined above, under the control of appropriate transcriptional regulatory and possibly translational sequences (promoter, activator, intron, initiation codon ( ATG), stop codon, polyadenylation signal, splice site).
  • the vaccine composition according to the invention advantageously comprises a pharmaceutically acceptable vehicle, a carrier substance and / or an adjuvant.
  • the pharmaceutically acceptable vehicles, the carrier substances and the adjuvants are those conventionally used.
  • the adjuvants are advantageously chosen from the group consisting of: oily emulsions, mineral substances, bacterial extracts, oligonucleotides containing CpG, saponin, alumina hydroxide, monophosphoryl lipid A and squalene.
  • the carrier substances are advantageously selected from the group consisting of: unilamellar or multilamellar liposomes, ISCOMS, virosomes, viral pseudoparticles, saponin micelles, solid microspheres of saccharide nature (poly (lactide-co-glycolide)) or auriferous, and nanoparticles.
  • the vaccine composition comprises an effective peptide / protein / lipopeptide / vector dose for obtaining a prophylactic / therapeutic effect on cancer associated with tumor overexpression of midkine as defined above. This dose is determined and adjusted according to factors such as the age, sex and weight of the subject.
  • the vaccine composition is generally administered according to the usual vaccination protocols, at doses and for a time sufficient to induce a cell response directed against Midkine protein. Administration may be subcutaneous, intramuscular, intravenous, intradermal, intraperitoneal, oral, sublingual, rectal, vaginal, intranasal, inhalation or transdermal.
  • composition is in a dosage form adapted to a chosen administration: sterile injectable solution, powder, tablets, capsules, suspension, syrup, suppositories, which are prepared according to the standard protocols.
  • composition it comprises at least one CD4 + T epitope and a Midkine CD8 + T epitope, in the form of a mixture of peptides, a multiepitopic fragment and / or a DNA vector. an expression encoding said peptides or said fragment as defined above.
  • composition comprises at least the peptide MDK 9-21, MDK 9-22, MDK 9-23 or MDK 110-124.
  • the peptide MDK 9-21, MDK 9-22 or MDK 9-23 is combined with peptide MDK 74-88 or 78-92, peptide MDK 14-28 or 99-113 and peptide MDK 4-18.
  • Such peptide combinations which bind the HLA-A2 molecule and the set of molecules HLA-DR1, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DRI, HLA-DR13, HLA-DRl5, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DP401 and HLA-DP402 (Table VII) advantageously makes it possible to induce CD4 + and CD8 + T cells in almost all of the cells. vaccinated individuals.
  • composition comprises a peptide including a universal CD4 + T epitope and / or a CD4 + T and / or CD8 + T epitope of another tumor antigen, as defined above.
  • Multiepitope peptide, fusion protein, lipopeptide, recombinant vector can be used in immunotherapy for the treatment of tumors overexpressing midkine.
  • Said peptides or derivatives are used either as a vaccine or in cell therapy, or even by a combination of both approaches.
  • Cellular therapy comprises, the preparation of antigen presenting cells (dendritic cells) by a conventional protocol comprising isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from a patient to be treated and culturing of the dendritic cells in the presence of peptide (s).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • s peptide
  • the subject of the present invention is also a vaccine composition, characterized in that it comprises at least one peptide fragment derived from midkine as defined above, a multiepitopic peptide, a fusion protein, a lipopeptide or a vector such as defined above, and a pharmaceutically acceptable carrier, a carrier substance or an adjuvant.
  • the present invention also relates to a method of antitumor vaccination, prophylactic or therapeutic, characterized in that it comprises the administration of a vaccine composition as defined above, to an individual, by any appropriate means as defined above.
  • the subject of the present invention is also the use of at least one peptide as defined above for the preparation of an immunomonitoring reagent of the cellular response against midkine intended for the evaluation of the prognosis or follow-up of cancer treatment (surgery, radiotherapy, chemotherapy, immunotherapy).
  • said reagent comprises a peptide or a fusion protein as defined above, for example labeled and / or complexed with an HLA molecule, in the form of multimeric HLA / peptide complexes such as tetramers of HLA / peptide complexes, labeled.
  • the subject of the present invention is also an in vitro method for immunomonitoring the cellular response against midkine in an individual suffering from cancer, characterized in that it comprises:
  • CD4 + T lymphocytes and / or CD8 + T cells specific for midkine by any appropriate means.
  • the method according to the invention makes it possible to follow the evolution of the CD8 + T and / or CD8 + T response directed against midkine during a cancer or an antitumor treatment, in particular antitumor immunotherapy;
  • Midkine-specific CD4 + T lymphocytes may be of TH1 type (secretion of IFN-gamma), TH2 (secretion of IL-4) or regulatory T (secretion of IL-10 or of TGF- ⁇ ); it is expected that the TH1 type T response is a sign of a favorable evolution of the cancer whereas the regulatory T response is a sign of an unfavorable evolution of this cancer.
  • Detection is performed from a biological sample containing CD4 + and / or CD8 + T cells, including a sample of mononuclear cells isolated from a peripheral blood sample (PBMCs).
  • PBMCs peripheral blood sample
  • Midkine-specific CD4 + and / or CD8 + T cells are detected by any means, known per se.
  • direct means such as flow cytometry in the presence of multimeric complexes as defined above, or indirect means such as lymphocyte proliferation assays, cell cytotoxicity assays and cytokine assays.
  • lymphocyte proliferation assays such as IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 and IFN-gamma
  • IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 and IFN-gamma in particular by immunoenzymatic techniques (ELISA, RIA, ELISPOT) or by flow cytometry (assay of intracellular cytokines).
  • a cell suspension (PBMC, PBMC depleted in CD4 + or CD8 + cells, T lymphocytes previously enriched by an in vitro culture step with the peptides as defined above or cloned T lymphocytes) is placed in the presence of said peptides and if necessary.
  • appropriate presenting cells such as dendritic cells, autologous or heterologous PBMCs, lymphoblastoid cells such as those obtained after infection with EBV or genetically modified cells.
  • the presence of Midkine-specific CD4 + and / or CD8 + T cells in the initial suspension is detected using the peptides, by one of the following methods:
  • the proliferation of Midkine-specific CD4 + and / or CD8 + T cells is measured by incorporation of tritiated thymidine into the DNA of the cells.
  • ELISPOT test makes it possible to reveal the presence of cytokine secreting T cells (IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN- ⁇ , TNF- ⁇ and TGF- ⁇ ) specific for a peptide as defined above.
  • the principle of this test is described in Czerkinsky et al. , J. Immunol. Methods, 1983, 65, 109-121 and Schstoff et al, J. Immunol. Methods, 1997, 210, 167-174, and its implementation is illustrated in International Application WO 99/51630 or Gahéry-Ségard et al., J. Viral., 2000, 74, 1694-1703.
  • cytokine-secreting midkine-specific T cells IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN-gamma, TNF- ⁇ and TGF- ⁇
  • cytokine assay present in the culture supernatant, by an enzymatic immunoassay, in particular using a commercial kit, or by detection of intracellular cytokines in flow cytometry.
  • the principle of detection of intracellular cytokines is described in Goulder et al. , J. Exp. Med., 2000, 192, 1819-1832 and Maecker et al, J. Immunol. Methods, 2001, 255, 27-40 and its implementation is illustrated in Draenert et al, J. Immunol. Methods, 2003, 275, 19-29. * multimeric complexes
  • a biological sample preferably peripheral blood mononuclear cells (PBMC)
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • marked multimeric complexes in particular with a fluorochrome, formed by the binding between soluble HLA molecules and peptides as defined above and the cells labeled with said multimeric complexes are analyzed, in particular by flow cytometry.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the biological sample prior to bringing the biological sample into contact with said complexes, it is enriched in CD4 + T cells and / or CD8 + T cells, by bringing it into contact with anti-CD4 or anti-CD8 antibodies.
  • the HLA / peptide multimeric complexes can be prepared from native molecules extracted from cells expressing an HLA I molecule and or
  • HLA can in particular be truncated (deletion of the transmembrane domain) and their sequence can be modified in order to make them soluble or to facilitate the pairing of alpha and beta chains (Novak et al, cited above).
  • the loading of HLA molecules with the peptide can be done by contacting a preparation of HLA molecules as above, with the peptide.
  • soluble and biotinylated HLA molecules are incubated, for 72 hours at 37 ° C., with a 10-fold excess of peptides as defined above, in a 10 mM phosphate-citrate buffer, 0.15 NaCl. M at a pH of between 4.5 and 7.
  • the peptide sequence can be introduced into one of the chains of the HLA molecule as a fusion protein that allows the preparation of HLA / peptide multimeric complexes from appropriate host cells expressing said fusion protein. Said complexes can then be labeled, in particular with biotin.
  • the multimeric complexes of tetramer type are obtained in particular by adding to the charged HLA molecules, streptavidin labeled with a fluorochrome in a quantity four times smaller (mole to mole) relative to the molecules.
  • the assembly is then incubated for a sufficient time, for example overnight at room temperature.
  • the multimeric complexes can also be formed, either by incubation of HLA / peptide monomers with streptavidin-coupled magnetic beads as described for HLA I molecules (Bodinier et al., Nature,
  • HLA / peptide monomers into vesicles lipids as described for murine class II MHC molecules (Prakken, Nature Medicine, 2000, 6, 1406-1410).
  • HLA / peptide complexes especially of the tetramer type, a suspension of cells (PBMC, PBMC depleted in CD4 + and / or CD8 + cells, T lymphocytes previously enriched by an in vitro culture step with peptides such as defined above or cloned T lymphocytes) with HLA / peptide multimeric complexes at a suitable concentration (for example of the order of 10 to 20 ⁇ g / ml), for a time sufficient to allow the binding between the complexes and the Midkine-specific CD4 + and / or CD8 + T cells (e.g., on the order of 1 to 3 hours).
  • PBMC PBMC depleted in CD4 + and / or CD8 + cells
  • T lymphocytes previously enriched by an in vitro culture step with peptides such as defined above or cloned T lymphocytes
  • HLA / peptide multimeric complexes at a suitable concentration (for example of the order of 10 to 20
  • the present invention also relates to an immunomonitoring reagent comprising at least one peptide as defined above.
  • said reagent is included in a box (kit).
  • Said immunomonitoring reagent advantageously comprises a peptide or a fusion protein as defined above, optionally labeled or complexed, in particular complexed with labeled HLA molecules, for example biotinylated, in the form of multimeric HLA / peptide complexes such as tetramers. of HLA / peptide complexes, labeled.
  • Another subject of the present invention is therefore a method for analyzing Midkine-specific CD4 + and / or CD8 + T lymphocytes, characterized in that it comprises at least the following steps:
  • the analysis of the cells comprises the sorting of said cells.
  • the present invention further relates to a peptide fragment derived from Midkine, a multiepitopic peptide, a fusion protein, a lipopeptide, as defined above.
  • the present invention also relates to a polynucleotide, an expression cassette, a recombinant vector, a prokaryotic or modified eukaryotic host cell derived from the preceding peptides / protein.
  • the invention encompasses in particular: a) expression cassettes comprising at least one polynucleotide as defined above, under the control of appropriate transcriptional regulatory and possibly translational sequences (promoter, enhancer, intron, codon of initiation (ATG), stop codon, polyadenylation signal), and b) recombinant vectors comprising a polynucleotide according to the invention.
  • these vectors are expression vectors comprising at least one expression cassette as defined above.
  • the polynucleotides, the recombinant vectors and the transformed cells as defined above are especially useful for the production of the peptides, multiepitopic fragments and fusion proteins according to the invention.
  • the polynucleotides according to the invention are obtained by conventional methods, known per se, following the standard protocols such as those described in Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. A USUBEL, 2000, Wiley and Son Inc., Library of Congress, USA). For example, they can be obtained by amplification of a nucleic sequence by PCR or RT-PCR, by screening genomic DNA libraries by hybridization with a homologous probe, or by total or partial chemical synthesis.
  • Recombinant vectors are constructed and introduced into host cells by conventional methods of recombinant DNA and genetic engineering, which are known per se.
  • peptides and their derivatives are prepared by standard techniques known to those skilled in the art, in particular by solid or liquid phase synthesis or by expression of a recombinant DNA in a suitable cellular system (eukaryote or prokaryote). More precisely:
  • peptides and their derivatives can be synthesized in solid phase, according to the Fmoc technique, originally described by Merrifield et al. (J. Am Chem Soc., 1964, 85: 2149-) and purified by reverse phase high performance liquid chromatography,
  • the lipopeptides may especially be prepared according to the process described in International Applications WO 99/40113 or WO 99/51630.
  • the peptides and derivatives such as the variants, the multiepitopic fragments and the fusion proteins can also be produced from the corresponding cDNAs, obtained by any means known to those skilled in the art; the cDNA is cloned into a eukaryotic or prokaryotic expression vector and the protein or fragment produced in the cells modified with the recombinant vector are purified by any appropriate means, in particular by affinity chromatography.
  • FIG. 2 illustrates the peptide specificity of CD8 + T lymphocytes induced against the peptides of Midkine.
  • T cell lines (267.29A, 278.1 IA, 314.28) were obtained by stimulation of T cells from three healthy individuals expressing HLA-A2 (267, 278, 314). After 4 weeks of culture, their specificity was tested by Elispot IFN- ⁇ .
  • FIG. 3 illustrates the restriction to HLA-A2 of CD8 + T lymphocytes specific for Midkine peptides.
  • the restriction was evaluated by Elispot IFN- ⁇ , using C 1 R and C 1 R-A2 cells (C 1 R transfected with HLA-A2).
  • FIG. 4 illustrates the recognition of cells transfected with a Midkine expression plasmid by CD8 + T lymphocytes specific for peptides of Midkine.
  • C1R-A2 cells were transfected with a recombinant pcDNA3.1 plasmid containing the midkine coding sequence (pMDK).
  • pMDK midkine coding sequence
  • Activation of CD8 + T cells by pMDK-transfected or non-transfected C1R-A2 cells was assessed by Elispot IFN- ⁇ .
  • - Figure 5 illustrates the expression of midkine in tumor cells. Expression of Midkine was assessed in C1R-A2, DLD-I and Hep G2 cells by flow cytometry using an anti-Midkine antibody.
  • Gray surface negative control. Area under the black line: natural expression of Midkine.
  • Black surface Expression of midkine after transfection of cells by a Midkine expression plasmid.
  • FIG. 6 illustrates the recognition of tumor lines by CD8 + T lymphocytes specific for Midkine peptides. Recognition of tumors was tested by IFN- ⁇ Elispot using cell HLA-A2 "1" CIR-A2 (MDK "), DLD-I (MDK”) and Hep G2 (MDK +). The cells marked with a star were cultured in the presence of IFN- ⁇ .
  • FIG. 7 illustrates the detection of Midkine-specific CD8 + T lymphocytes by labeling with specific tetramers.
  • T cell lines 314.7 (A and C) and 314.28 (B and D) are specific for the MDK 114-122 and MDK 13-21 peptides, respectively.
  • Each line was labeled with anti-CD8 antibody and HLA-A2 / MDK1 14-122 (A and B) and HLA-A2 / MDK13-21 (C and D) tetramers and analyzed by flow cytometry. The percentage of each cell population is indicated in each quadrant.
  • FIG. 8 illustrates the restriction to HLA II of the CD4 + T lymphocytes specific for the peptide 9-23 of Midkine.
  • the restriction was evaluated by Elispot IFN- ⁇ , using L cells transfected with an HLA II molecule (HLA-DR7, -DRl 1, -DRl 5, -DRB5) and loaded with the peptide 9-23.
  • FIG. 9 illustrates the detection of the recognition of tumor lysates by the T 331.24 line of CD4 + T lymphocytes specific for the Midkine peptide 9-23. Recognition of tumors was tested by IFN- ⁇ Elispot, using HeLa cells (MDK "), HeLa-pMDK (MDK +) and Hep G2 (MDK +).
  • Example 1 Induction of a Specific CD8 + T Response of Peptides of the Midkine Protein
  • peptides were synthesized according to the Fmoc strategy in solid phase parallel synthesis, purified by HPLC and controlled by mass spectrometry (ES-MS). b) Obtaining CD8 + T Lines Specific for Midkine Peptides and Restricted to HLA-A2
  • peripheral blood mononuclear cells PBMCs
  • HLA-A2 molecule peripheral blood mononuclear cells
  • the PBMCs were then cultured in AIM V (LIFE TECHNOLOGIES) medium and incubated overnight at 37 ° C in the presence of 5% CO 2 /95% air.
  • CD8 + T cells were purified from non-adherent cells by immunomagnetic sorting and frozen.
  • the adherent cells were differentiated into immature dendritic cells by culture for 5 days in AIM V medium containing 100 ⁇ / ml of GM-CSF and 100 ⁇ / ml of IL-4 and then in mature dendritic cells by 2 days of culture in the presence of 1 ⁇ g / ml of LPS, 1000 U / ml of IL-4 and 1000 U / ml of GM-CSF.
  • the mature dendritic cells were incubated in the presence of 5 ⁇ g / ml of beta-2-microglobulin and 10 ⁇ g / ml of each of the peptides of Table IV.
  • the peptide-specific CD8 + T cell lines were cultured in the presence of C1R-A2 cells transfected with a recombinant plasmid pcDNA3.1 (IN VITROGEN) comprising the coding sequence of Midkine under the control of the CMV promoter and the polyadenylation signal. bovine growth hormone. Activation of CD8 + T cells by these transfected C1R-A2 cells was assessed by ELISPOT as specified below. d) Recognition of tumor cells by CD8 + T lymphocytes specific for Midkine peptides
  • CD8 + T cell lines were cultured in the presence of different tumor lines: DLD-I (ATCC® # CCL-221) and Hep G2 (ATCC® # HB-8065). The activation of CD8 + T cells by these tumor cells was evaluated by ELISPOT as specified below. e) ELISPOT
  • Anti-IFN-gamma antibodies (1-D1K, MABTECH) diluted to 2.5 ⁇ g / ml in PBS buffer were adsorbed on nitrocellulose (MILLIPORE) plates for 1 hour at 37 ° C. The plates were then washed with PBS and then saturated with ISCOVE medium containing 10% human serum AB group (100 .mu.l / well) for 2 h at 37.degree.
  • the antigen-presenting cells are either cells of the ClR line of lymphoblastoid B cells (Hogan et al., J. Immunol., 1988, 141, 2519-), lacking HLA-A and HLA-B molecules, transfected with the CDNA encoding HLA-A2 (C1R-A2) and loaded with a single peptide (10 ⁇ g peptide) or the mixture peptides (10 ⁇ g of each peptide), or C1R-A2 cells transfected with a Midkine expression plasmid, or else tumor cells expressing midkine.
  • C1R-A2 CDNA encoding HLA-A2
  • the ClR cells transfected with HLA-A2 (30,000 cells / well) and 5000 lymphocytes to be tested were then added to the plates and incubated for 24 hours. 37 ° C., in the presence or in the absence of a single peptide (10 ⁇ g of peptide) or of a mixture of peptides (10 ⁇ g of each peptide).
  • the peptides are used at different concentrations ranging from 0.001 to 10 ⁇ g / mL.
  • the CD8 + T cell line 267.29A is specific for peptides 12-21, 13-21, 13-22.
  • the line 278.1 IA is specific for peptides 13-21, 13-22 and 14-22.
  • the line 314.28 is specific for peptide 114-122 and to a lesser extent for peptide 113-122.
  • the peptides 12-21, 13-21, 13-22, 14-22, 113-122 and 114-122 are therefore immunogenic and induce CD8 + T cells in healthy HLA-A2 + donors. Restriction of peptide-specific CD8 + T cell lines by the HLA-A2 molecule is shown in Figure 3. Only HLA-A2 (C1R-A2) cells can present the peptides to specific T cell lines.
  • ClR cells do not stimulate them even in the presence of peptides
  • C1R-A2 cells were transfected with a pcDNA3.1 plasmid recombinant comprising the Midkine coding sequence
  • Figure 4 shows that CD8 + T lymphocyte 278.1 IA lines (specific for peptides 13-22 and 14-22), 297.58 (specific for peptides 12-21, 13-21 and 14- 22) and 314.48 (specific for peptide 114-122) are activated by the transfected cells and the CIR-A2 cells loaded by the peptides but not by the non-transfected cells.
  • Midkine contains six peptides divided into two groups of overlapping peptides capable of inducing activation of HLA-A2 restricted CD8 + T cells that selectively recognize tumor cells expressing midkine.
  • Each lymphocyte line (500,000 cells) obtained in Example 1 was labeled for 1 hour in the dark and at 4 ° C., with 50 ⁇ g / ml of tetramer in 200 ⁇ l of PBS 2% FCS.
  • These tetramers are HLA-A2 molecules loaded with peptide 13-21 or 114-122, biotinylated and complexed with streptavidin labeled with phycoerythrin, prepared according to the technique previously described in NOVAK et al. (J. Clin. Investig., 1999, 104, R63-R67) or in KURODA et al. (J. Virol., 2000, 74, 18, 8751-8756).
  • Peptides of 15 amino acids (15-mer) covering the entire human midkine sequence were selected according to the presence of aromatic or hydrophobic residues in position 3 or 4, for anchoring in pocket P 1 HLA-DR and HLA-DP4 molecules.
  • the peptides were synthesized according to the Fmoc strategy in solid phase parallel synthesis, purified by HPLC and controlled by mass spectrometry (ES-MS).
  • HLA II binding assays are binding assays in competition with enzyme immunoassay, as described in US Pat. No. 6,649,166 and PCT International Application WO 03/040299, respectively for HLA-DR and HLA molecules. -DP4.
  • the implementation of these tests for measuring the binding activity of peptides derived from different antigens is illustrated in US Pat. No. 6,649,166 and PCT International Applications WO 02/090382, WO 03/040299 and WO 2004/014936.
  • peptides HA 306-318 PYVKQNTLKLAT, SEQ ID NO: 31
  • A3 152-166 EAEQLRA YLDGTGVE, SEQ ID NO: 32
  • MT 2-16 AKTIAYDEEARRGLE, SEQ ID NO: 33.
  • Bl 21-36 (TERVRLVTRHIYNREE, SEQ ID NO: 34) YKL (AAYAAAKAAALAA, SEQ ID NO: 35), LOL 191-210 (ESWGAVWRIDTPDKLTGPFT, SEQ ID NO: 36), Oxy 271-287 (EKKYFAATQFEPLAARL, SEQ ID NO: 37) and E2 / E168 (AGDLLAIETDKATI SEQ ID NO: 38), biotinylated at the NH 2 terminal residue, according to the protocol described in Texier et al., J. Immunol., 2000, 164, 3177-3184), are used as tracer under the conditions as specified in the following.
  • PBMCs Peripheral blood mononuclear cells
  • HLA-DR and HLA-DP genotype were previously determined by SSP, using the OLERUP SSP TM HLA-DPB1 and HLA-DRB1 kit, were separated on a Ficoll gradient.
  • the PBMCs were then cultured in AIM V medium (LIFE TECHNOLOGIES) and incubated in flasks in an oven at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 /95% air.
  • the non-adherent cells were recovered, and then the CD4 + T cells were purified using anti-CD4 antibodies coupled to magnetic beads (MYLTENYI BIOTEC kit), and frozen.
  • the adherent cells were incubated for 5 days, in AIM V medium containing 1000 U / ml of GM-CSF and 1000 U / ml of IL-4, then the cells differentiated into dendritic cells (immature dendritic cells) were then cultured for 2 days, in the presence of 1 ⁇ g / ml of LPS, 1000 U / ml of IL-4 and 1000 U / ml of GM-CSF, so as to induce their maturation.
  • the mature dendritic cells (100,000 cells / well) were then incubated with a mixture of peptides (10 ⁇ g of each peptide in IMDN medium (INVITROGEN) supplemented with glutamine (24 mM, SIGMA), asparagine ( 55 mM, SIGMA), arginine (150 mM, SIGMA), penicillin (50 IU / ml, INVITROGEN), streptomycin (50 mg / ml, INVITROGEN) and 10% human serum), for 4 hours at 37 ° C.
  • IMDN medium IGITROGEN
  • the mature dendritic cells were then washed and incubated, in the presence of CD4 + T lymphocytes (100,000 cells / well) previously thawed, in medium containing 1000 U / ml of IL-6 and 10 ng / ml of IL-12. .
  • the culture was stimulated for the first time, using mature dendritic cells previously thawed and loaded with two peptide mixtures covering the entire Midkine sequence (mixture of MDK1 to MDK9 peptides and then mixing MDK1 to MDK18 peptides) in medium containing IL-2 (10 U / ml) and IL-7 (5 ng / ml).
  • Anti-IFN-gamma antibodies (1-D1K, MABTECH) diluted to 2.5 ⁇ g / ml in PBS buffer were adsorbed on nitrocellulose (MILLIPORE) plates for 1 hour at 37 ° C. The plates were then washed with PBS and then saturated with ISCOVE medium containing 10% human serum AB group (100 .mu.l / well) for 2 h at 37.degree.
  • the antigen presenting cells are either immature autologous dendritic cells prepared as specified above, or a mouse fibroblast line (L-line), transfected with the cDNA encoding one of the HLA-DR or HLA molecules.
  • the dendritic cells (10 5 cells / well) or L cells transfected with one of the HLA-DR or HLA-DP4 molecules (30,000 cells / well) and 5000 test lymphocytes were then added to the plates and incubated 24 h at 37 ° C., in the presence or in the absence of a single peptide (10 ⁇ g) or a mixture of peptides (10 ⁇ g of each peptide).
  • the tumor lines tested are the Hep G2 line which expresses the
  • Midkine peptide 9-23-specific CD4 + T was incubated in the presence of dendritic cells previously loaded with lysates of tumor lines and its activation was assessed by Elispot as specified above.
  • HLA class II binding sites are in the N-terminal part of midkine, i.e. in the signal peptide (1-
  • peptide 9-23 binds to 8 different HLA II molecules with relative affinities often reflecting high affinity (relative activity less than 10).
  • Other peptides also bind to several HLA II molecules such as peptides 1-15, 4-18, 14-28.
  • the CD4 + T cell lines 331.16, 331.24 and 343.1 were obtained by in vitro stimulation of T cells using mature autologous dendritic cells loaded with two pools of peptides covering the entire midkine sequence. The study of their specificity was made by Elispot IFN- ⁇ and showed that the three lines were specific for peptide 9-23. Each line was tested by Elispot IFN- ⁇ for its ability to be stimulated by L cells transfected with an HLA-DR or HLA-D P4 molecule and loaded with peptide 9-23.
  • FIG. 8 shows that the peptide 9-23 can be presented by the DR7 molecule to the 331 donor lines (331, 16 and 331.24) and that the 343.1 line is restricted to DR1 1 but not to DR15 and DRB5.
  • the CD4 + T cell line 331.24 was incubated in the presence of dendritic cells previously loaded with the lysates of tumor lines and its activation was evaluated by Elispot IFN- ⁇ .
  • Figure 9 shows that the 331.24 line is stimulated by dendritic cells loaded with the lysate of transfected HeIa cells but not by the untransfected HeIa cells. This confirms the specificity of the 331.24 T cell line and its ability to recognize midkine present in the transfected cell lysate. It also recognizes midkine naturally produced by Hep G2 tumor line.
  • peptide 9-23 binds to 8 different HLA II molecules and induces a specific in vitro CD4 + T response that is restricted to different class II HLA molecules.
  • CD4 + T cells induced against this peptide can recognize tumor lysates expressing midkine and presented by dendritic cells. Since this peptide overlaps with the signal peptide (1-22), it can be deduced from these experiments that peptide 9-22 also has CD4 + T epitopes since the signal peptide of Midkine is cleaved in the cell between Amino acids 22 and 23.
  • peptides 9-23 and 9-22 include peptides 12-21, 13-21, 13-22 and 14-22 which have CD8 + T epitopes.
  • the peptides 9-23 and 9-22 may thus induce responses CD4 + and CD8 + T cells specific for tumors expressing midkine.

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Abstract

Peptide issu de la protéine Midkine comprenant au moins un épitope T CD4+ ou T CD8+ restreint aux molécules HLA prépondérantes dans la population caucasienne ou polynucléotide codant ledit peptide, comme vaccin anticancéreux ou comme réactif pour l'immunomonitoring de la réponse cellulaire contre la Midkine au cours d'un cancer ou d'un traitement anticancéreux.

Description

PEPTIDES IMMUNOGENES ISSUS DE LA PROTEINE MIDKINE COMME VACCIN ANTICANCEREUX
L'invention est relative à l'utilisation comme vaccin anticancéreux, de peptides issus de la protéine Midkine capables d'induire des lymphocytes T CD4+ et/ou T CD 8+ reconnaissant ladite protéine Midkine chez la majorité des individus de la population caucasienne, dans de nombreux types de cancers.
L'invention est également relative à l'utilisation de tels peptides reconnus par des lymphocytes T CD4+ et/ou T CD8+ spécifiques de la protéine Midkine, chez la majorité des individus de la population caucasienne, dans de nombreux types de cancers, comme réactif pour l'immunomonitoring de la réponse cellulaire contre la Midkine au cours d'un cancer ou d'un traitement anticancéreux.
Les cellules tumorales expriment un ensemble de protéines que les cellules saines n'expriment pas ou peu, ou qui ne sont retrouvées que dans quelques types cellulaires. Ces protéines étant préférentiellement exprimées dans les cellules tumorales, peuvent constituer un antigène tumoral, c'est-à-dire une protéine présente dans la tumeur et qui induit une réponse immunitaire capable de reconnaître les tumeurs et idéalement de les éliminer. Cette réponse peut être aussi bien une réponse en anticorps dans la mesure où l'antigène est membranaire qu'une réponse cellulaire impliquant des lymphocytes T CD8+ ou CD4+. La plupart des antigènes tumoraux sont intracellulaires et induisent une réponse cellulaire. Ils constituent des cibles privilégiées pour le développement de vaccins.
Les lymphocytes T contribuent à la réponse immunitaire cellulaire dirigée contre les tumeurs. Ils peuvent être induits spontanément chez les patients atteints de cancer et infiltrer les tumeurs, donnant dans des cas rares une régression spontanée. Ils peuvent être induits par des vaccins qui sont prévus pour faciliter leur recrutement. Il existe deux sortes de lymphocytes T impliqués dans l'immunité antitumorale. Les lymphocytes T CD8+ sont cytotoxiques (CTL CD8+) et peuvent lyser les cellules tumorales. La lyse de cellules lors de leur reconnaissance fait intervenir la perforine et les granzymes. Les lymphocytes T CD8+ reconnaissent l'antigène tumoral sous la forme de peptides, dénommés épitopes T CD8+, que leur présentent les molécules HLA de classe I (HLA-A, HLA-B et HLA-C) présentes à la surface des tumeurs. Les lymphocytes T CD4+ de type auxiliaire reconnaissent les antigènes de tumeurs sous la forme de peptides, dénommés épitopes T CD4+, que leur présentent les molécules HLA de classe II. La reconnaissance par les lymphocytes T CD4+ des tumeurs peut se faire de manière directe lorsque les tumeurs expriment des molécules de classe II ou de manière indirecte grâce à la capture de débris cellulaires par les cellules dendritiques qui sont des cellules qui possèdent un nombre élevé de molécules HLA de classe II à leur surface. Les lymphocytes T CD4+ impliqués dans l'immunité anti-tumorale jouent un rôle multiple dans le contrôle des tumeurs et en particulier interviennent dans le recrutement et le maintien des CTL CD8+. Les lymphocytes T CD4+ jouent un rôle d'activation des cellules dendritiques (DC) via un mécanisme dépendant du CD40. Ils augmentent la sécrétion d'IL-12 par les DC et l'expression à leur surface de molécules de co-stimulation ou d'adhésion (I-CAM-1, CD80, CD86). Cette activation permet le recrutement de CTL. En outre, les résultats observés chez des souris n'exprimant pas de molécules de classe I indiquent également que les lymphocytes T auxiliaires exercent un contrôle des tumeurs via des mécanismes indé- pendants des CTL probablement via l'activation de macrophages. Enfin, les lymphocytes T CD4+ peuvent eux-mêmes être cytotoxiques. Les cellules dendritiques interviennent également dans l'immunité anti-tumorale en initiant cette réponse. Les lymphocytes T naïfs spécifiques des tumeurs sont en effet recrutés et activés par les cellules dendritiques et non par les cellules tumorales. La découverte des premiers antigènes tumoraux dans les années 1990 a été à l'origine de nombreuses études sur ces protéines exprimées dans les tumeurs. En fonction de leur mode d'expression, les antigènes tumoraux ont été répartis en plusieurs catégories.
* Les antigènes spécifiques des tumeurs II s'agit du groupe d'antigènes le plus important, qui a été initialement découvert dans les mélanomes mais qui en fait est exprimé dans de nombreuses tumeurs. Ces antigènes sont également appelés "Cancer Testis" en raison de leur expression dans les testicules qui est le seul tissu sain qui les expriment. Certains de ces antigènes sont également exprimés dans le placenta ou les ovaires. Les testicules et le placenta étant dépourvus de molécules HLA conventionnelles, ces antigènes ne sont pas visibles pour les lymphocytes T dans les tissus sains. Les principaux antigènes sont les antigènes MAGE-A, MAGE-B, MAGE-C, GAGE, LAGE et SSX. *Les antigènes de différenciation
Les antigènes de différentiation sont des protéines exprimées par des tumeurs et par le tissu cellulaire qui lui a donné naissance. Les exemples les plus connus sont des antigènes du mélanome qui sont également exprimés dans les méla- nocytes. Il s'agit des tyrosinases (TYRO, TRP-I et TRP-2) et des antigènes GpIOO et MELAN-A/MART-1. D'autres antigènes de différenciation sont également connus pour des tumeurs de la prostate (kallikreine-4 et PSA) ou le cancer de l'appareil digestif (CEA).
*Les antigènes surexprimés Les antigènes surexprimés sont des protéines fortement exprimées dans de nombreuses cellules tumorales alors que leur taux d'expression est peu élevé dans les cellules normales. C'est le cas de l'antigène HER-2/neu qui est retrouvé chez environ 30 % des carcinomes du sein et des ovaires et dans certains carcinomes du colon et du rein. La P53 est également fréquemment surexprimée dans les tumeurs. Cette protéine qui inhibe la multiplication cellulaire est normalement très rapidement recyclée dans les cellules normales. La télomerase (hTERT) est trouvée chez plus de 80 % des tumeurs, quelle que soit leur origine tissulaire alors qu'elle est absente ou exprimée à bas bruit dans les cellules normales. L'action de la télomerase sert à compenser la réduction des télomères qui a lieu lors de la division cellulaire. Le maintien d'une longueur constante des télomères par la télomerase favorise la prolifération cellulaire et donc la tumorigénèse. Les protéines inhibitrices de l'apoptose (IAP) comme la protéine Survivine constituent une famille de protéines qui, en inhibant les caspases, inhibent la mort cellulaire. * Autres antigènes Les autres catégories d'antigènes sont les antigènes résultant d'une mutation ou d'un arrangement génétique (MUM-I, CDK4, béta-caténine, HLA- A2, BCR-ABL, CASP-8) et les antigènes tumoraux d'origine virale (protéines E6 et E7 des papillomavirus impliqués dans le cancer du col de l'utérus).
Bien que de nombreux antigènes tumoraux aient été déjà découverts, les vaccins pour lutter contre le cancer ne sont pas au point. Les essais de vaccination demeurent assez décevants et les cas de régression provoqués par les vaccins sont rares. Ces échecs résultent d'une faible immunogénicité des antigènes identifiés ou de mécanismes d'échappement qui font que la tumeur n'exprime plus l'antigène cible. Les antigènes ciblés ne sont souvent pas vitales pour la cellule si bien que l'échappement tumoral peut avoir lieu. Les antigènes identifiés l'ont été principalement sur des mélanomes et ne sont pas adaptés aux nombreux autres cancers. Il y a peu d'antigènes connus ayant un large spectre d'expression et qui permettent de disposer d'un vaccin adapté à de nombreux cancers. Il s'agit principalement des antigènes surexprimés tels que la télomérase et la survivine (Demande Internationale PCT WO 2007/036638).
Pourtant, il existe de nombreuses protéines préférentiellement expri- mées dans les cellules tumorales quelle que soit leur origine et qui donc pourraient constituer des vaccins adaptés à de nombreux cancers. Pour que ces protéines aient un intérêt vaccinal, il est nécessaire de montrer qu'elles induisent des lymphocytes T capables de reconnaître des cellules tumorales qui expriment ces protéines. Il est en effet possible qu'elles ne soient que faiblement immunogènes en raison de méca- nismes de tolérance ou l'absence d'épitopes T dans leur séquence. Il est également possible qu'elles soient capables d'induire une réponse immunitaire mais que les cellules induites ne reconnaissent pas les tumeurs. Les épitopes T issus de ces protéines peuvent en effet ne pas être présentés à la surface des cellules tumorales en raison d'un niveau insuffisant d'expression ou d'un mauvais apprêtement des protéines dans les cellules tumorales.
La protéine Midkine (MDK), également dénommée NEGF2 (Neurite outgrowth-promoting factor 2), a été mise en évidence en 1988, en tant que protéine de cellules de carcinome embryonnaire induite par l'acide rétinoïque (Kadomatsu et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1988, 151, 1312-1318; pour une revue voir http://www.midkine.org). Chez l'homme, le gène de la Midkine est localisé sur le chromosome 11 en position 1 IpI 1.2. Il comporte 4 exons et a une taille de 3,5kb ; la séquence codante correspond au numéro d'accès NCBI M69148 (SEQ ID NO : 1 dans la liste de séquences en annexe). La région 5' régulatrice contient un site de réponse à l'acide rétinoïque et deux sites de réponses au suppresseur de tumeur WTl (Wilms Tumor Suppressor 1). Le site de réponse à l'acide rétinoïque est responsable de l'induction de l'expression de la Midkine par l'acide rétinoïque, alors que les sites de réponses à WTl interviennent dans la diminution de l'expression par WTl. Un variant d'épissage de la protéine Midkine humaine, dénommé INSP 106, a également été décrit (Demande Internationale PCT WO 2004/052928).
La Midkine est une protéine de 143 acides aminés riche en résidus basiques et qui possède cinq ponts disulfure [(37,61) ; (45,70) ; (52,74) ; (84,116) ; (94,126)]. La séquence humaine correspond au numéro d'accès SwissProt P21741 (Figure 1 et SEQ ID NO: 2 dans la liste des séquences en annexe). Elle est exprimée sous la forme d'un précurseur comportant un peptide signal de 22 acides aminés (Figure 1). Elle présente environ 50 % d'homologie avec la protéine Pleiotrophine. La structure de la Midkine a été résolue par RMN en 1997. La protéine comporte deux domaines différents, chacun constitué par trois feuillets béta anti-parallèles maintenus par des ponts disulfure; les deux domaines sont reliés par une région flexible. L'activité biologique (croissance des neurites, fibrinolyse et migration des cellules nerveuses) ne nécessite que le domaine C- terminal. Ce domaine est conservé et est retrouvé depuis la drosophile jusqu'à l'homme, ce qui confirme son rôle fonctionnel. II comporte également deux sites de fixation de l'héparine. On connaît au moins quatre récepteurs capables de lier la Midkine ce qui lui confère de nombreuses activités: les membres de la famille Syndecan qui sont des protéoglycanes comportant des héparine sulfates; PTPζ qui est un protéoglycane comportant des chondroïtine sulfate; ALK {Anaplastic Lymphoma Kinase); LRP qui est un membre de la famille des récepteurs des LDL.
Chez un individu normal, la Midkine est principalement exprimée lors de l'embryogenèse avec un pic d'expression en milieu de gestation. La Midkine intervient dans le développement des neurones. Elle provoque la croissance des neurites et la migration des cellules nerveuses. Elle intervient dans le développement de la jonction neuromusculaire et la protection des neurones. Lors de l'embryogenèse, la Midkine intervient dans le développement des dents, des poumons, des reins et des os. Les souris déficientes pour le gène de la Midkine sont viables et elles ne sont affectées que dans des fonctions neuronales en accord avec le rôle de la Midkine dans le développement du système nerveux. Il a également été observé que les souris rendues déficientes pour le gène de la Midkine sont moins affectées que les souris témoin par l'induction de néphrites. Elles sont également moins sujettes à la restenose (rétrécissement des artères du à la prolifération des tissus artériels endommagés). La Midkine est surexprimée dans de nombreuses tumeurs alors que chez des individus sains et adultes son expression est moindre et locale (intestin grêle, cerveau). La Midkine fait partie des 40 gènes les plus exprimés dans les tumeurs par rapport aux tissus sains (Velculescu et al, Nat. Genêt., 1999, 23, 387-388). La Midkine est surexprimée dans environ 80 % des cas de nombreux cancers humains en particulier de carcinomes. Son expression élevée a été observé notamment dans les cancers de l'œsophage, de l'estomac, du colon, du pancréas, de la thyroïde, des poumons, du sein, de la vessie, de l'utérus, de l'ovaire, de la prostate, les carcinomes hépatocellulaires, les ostéosarcomes, les neuroblastomes, les glioblastomes, les astro- cytomes, les leucémies et les tumeurs de WiIm (Moon et al. , Gynécologie Oncology, 2003, 88, 289-297; Hidaka et al, Leukemia Res., 2007, 8, 1045-1051; Maeda et al, Br. J. Cancer, 2007, 97, 405-411; Ren ét al, World J. Gastroenterol., 2006, 12, 2006- 2010). Une expression élevée a été corrélée avec un mauvais pronostic dans les cancers de la vessie, les glioblastomes et les neuroblastomes (O' Brien, Cancer Res., 1996, 56, 2515-2518). En outre, la surexpression de la Midkine est corrélée avec une résistance accrue à la chimiothérapie dans des lignées de cellules humaines de cancer gastrique. Son expression n'est pas uniquement tissulaire. Un niveau élevé de Midkine a été observé dans le sérum de plus de 60 % des patients atteints de carcinomes (Muramatsu et al, J. Biochem., 2003, 132, 259-371). Ce niveau diminue lorsque la tumeur est retirée. La présence de Midkine dans le sérum pourrait donc avoir une valeur diagnostique. La Midkine semble posséder de nombreuses activités en relation avec la tumorigénèse. Elle possède en effet une activité transformante, anti- apoptotique, mitogénique, angiogénique, fibrinolytique et chimiotactique (Kadomatsu et al, Cancer Letters, 2004, 127-143). Il a été montré qu'une stratégie antisens ciblant le gène de la Midkine supprime la tumorigénèse d'un carcinome chez la souris (Takei ét al, Cancer Research, 2001, 61, 8486-8491).
Du fait de ses nombreuses activités biologiques, la Midkine ou ses modulateurs (inhibiteurs) sont utiles pour stimuler l'angiogénèse, rhématopoïèse, prévenir l'athérosclérose et la resténose, inhiber l'apoptose, dans la prévention et le traitement de pathologies inflammatoires, cardiaques (infarctus du myocarde), cérébrales, hépatiques, nerveuses, rénales, oculaires (rétinoptahies), neurofïbromateuses, respiratoires (asthme et hyperplasie pulmonaire), post-chirurgicales (Demandes américaines US 2003/0072739, US 2003/0185794, US 2004/0077579, US 2005/0079151, US 2006/0148738 et US 2005/0130928; Demande européenne EP 1832296, Demandes Internationales PCT WO 2007/055397 et WO 2000/031541 ; Brevets US 5,629,284 ; US 6,383, 480 ; US 6,572,851). En outre, du fait de l'expression fréquente de la Midkine dans les tumeurs, associée à la présence de la protéine dans le sang et l'urine, ainsi que de l'existence d'un polymorphisme de la Midkine associé au risque de cancer, la Midkine représente un marqueur pour l'évaluation du risque, le diagnostic et le pronostic du cancer (Brevet US 7,090,983 et Demandes US 2003/0149534 et US 2004/0219614). La détection de la Midkine est notamment effectuée à l'aide d'anticorps monoclonaux spécifiques d'une Midkine tronquée correspondant aux positions 23 à 25 et 82 à 143 du précurseur de la Midkine (Demande américaine US 2004/0219614). Le promoteur de la Midkine est également utilisé dans des stratégies de gène-suicide.
En revanche, l'immunogénicité de la protéine Midkine n'a pas été étudiée.
Les Inventeurs ont montré que la protéine Midkine qui possède une expression préférentielle dans les tumeurs contenait des peptides capables d'induire des lymphocytes T CD4+ et/ou T CD8+ spécifiques reconnaissant la protéine Midkine exprimée par les cellules tumorales dans de nombreux types de cancers, chez la majo- rite des individus de la population caucasienne. Ces peptides représentent des candidats potentiels pour la vaccination prophylactique ou thérapeutique contre les cancers, étant donné qu'ils sont susceptibles d'induire une réponse T CD4+ et T CD8+ dirigée contre la tumeur, chez la majorité des patients vaccinés, dans la mesure où : (i) ils sont issus d'un antigène exprimé par de nombreuses tumeurs, (ii) ils sont aptes à induire des lymphocytes T CD4+ et T CD8+ spécifiques reconnaissant l'antigène exprimé par les tumeurs, et (iii) ils sont reconnus par des lymphocytes T CD4+ et T CD8+ chez la majorité des individus de la population caucasienne du fait qu'ils prennent en compte le polymorphisme des molécules HLA et sont restreints aux molécules HLA prépondérantes dans la population caucasienne. En outre, ces peptides qui sont reconnus par des lymphocytes T
CD4+ et/ou T CD8+ spécifiques d'un antigène tumoral exprimé par la majorité des tumeurs, sont utiles pour l'immunomonitoring de la réponse cellulaire contre la Midkine au cours de l'évolution d'un cancer et notamment après un traitement anticancéreux (chirurgical, chimiothérapie, radiothérapie, immunothérapie).
La présente invention a en conséquence pour objet l'utilisation d'un peptide issu de la protéine Midkine comprenant au moins un épitope T CD4+ ou T CD8+ restreint aux molécules HLA prépondérantes dans la population caucasienne ou d'un polynucléotide codant ledit peptide, pour la préparation d'un vaccin anticancéreux, destiné au traitement des cancers associés à une surexpression tumorale de ladite protéine Midkine.
Définitions - On entend par "peptide issu de la Midkine" aussi bien la protéine
Midkine (précurseur de 143 acides aminés ou protéine mature (positions 23 à 143 du précurseur) qu'un fragment peptidique d'au moins 8 acides aminés consécutifs de ladite protéine. On entend par « Midkine », une protéine Midkine issue de n'importe quel mammifère ; de préférence, il s'agit de la protéine humaine. Les positions des peptides issus de la Midkine sont indiquées en référence à la séquence humaine (SwissProt P21741, Figure 1 et SEQ ID NO: 2).
- On entend par « molécule HLA prépondérante dans la population caucasienne » ou « molécule HLA prépondérante », une molécule HLA I (HLA-A HLA-B ou HLA-C) ou HLA II prépondérante. Il s'agit des molécules HLA-A, HLA-B et HLA-C comprenant une chaîne alpha codée par un allèle dont la fréquence est supérieure à 5 % dans la population caucasienne, comme précisé au Tableau I ci-dessous.
Figure imgf000010_0001
* les molécules HLA I prépondérantes (fréquence génique> 5 % ) sont indiquées en gras
II s'agit également des molécules HLA II comprenant une chaîne béta codée par un allèle dont la fréquence est supérieure à 5 % dans la population caucasienne, comme précisé au Tableau II ci-dessous.
Figure imgf000010_0002
les molécules HLA II prépondérantes (fréquence génique> 5 %) sont indiquées en gras Certaines des molécules HLA prépondérantes dans la population caucasienne et notamment les molécules HLA-DP401 et HLA-DP402 sont également prépondérantes dans d'autres populations (Amérique du Sud, Inde, Japon, Afrique ; Tableau II). En conséquence, les peptides selon l'invention ne sont pas restreints à une utilisation dans la population caucasienne, et ils peuvent également être utilisés pour vacciner des individus de pays autres que ceux d'Amérique du Nord et d'Europe, dans lesquels lesdites molécules HLA sont prépondérantes, comme précisé au Tableau II.
- Au sens de la présente invention les termes « prévalent », « prédominant » et « prépondérant » sont considérés comme équivalents et utilisés indifféremment.
- On entend par "épitope T CD4+ de la Midkine restreint aux molécules HLA II prépondérantes dans la population caucasienne", un peptide de 11 à 15 acides aminés qui lie au moins une molécule HLA II, prépondérante dans la popula- tion caucasienne et est reconnu par des lymphocytes T CD4+ chez les individus de cette population ; le peptide comprend une séquence de 9 acides aminés incluant les résidus d'ancrage aux molécules HLA II, flanquée à l'une de ses extrémités, de préférence aux deux extrémités, par au moins 2 acides aminés, de préférence 3 acides aminés. - On entend par "épitope T CD8+ de la Midkine restreint aux molécules HLA I prépondérantes dans la population caucasienne", un peptide de 8 à 13 acides aminés qui lie au moins une molécule HLA I prépondérante dans la population caucasienne et est reconnu par des lymphocytes T CD8+ chez les individus de cette population; le peptide comprend une séquence de 8 à 9 acides aminés incluant les résidus d'ancrage aux molécules HLA I.
- On entend par « cancer », un cancer associé à la surexpression de la protéine Midkine par des cellules tumorales tel que de façon non-limitative : les cancers de l'œsophage, de l'estomac, du colon, du pancréas, de la thyroïde, des poumons, du sein, de la vessie, de l'utérus, de l'ovaire, de la prostate, les carcinomes hépatocellulaires, les ostéosarcomes, les neuroblastomes, les glioblastomes, les astro- cytomes, les leucémies et les tumeurs de WiIm. - On entend par acide aminé naturel ou synthétique, les 20 α-acides aminés naturels communément trouvés dans les protéines (A, R, N, D, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y et V), certains acides aminés rarement rencontrés dans les protéines (hydroxyproline, hydroxylysine, méthyllysine, diméthyllysine..), les acides aminés qui n'existent pas dans les protéines tels que la β-alanine, l'acide γ-amino- butyrique, l'homocystéine, l'ornithine, la citrulline, la canavanine, la norleucine, la cyclohexylalanine..., les acides aminés D dérivés des acides aminés L et les analogues des acides aminés précédents.
- On entend par acide aminé hvdrophobe, un acide aminé sélectionné parmi (code à une lettre) : A, V, L, I, P, W, F et M.
- On entend par acide aminé aromatique, un acide aminé sélectionné parmi (code à une lettre) : F, W et Y.
Les peptides selon l'invention sont reconnus par des lymphocytes T CD4+ et/ou T CD8+ chez la majorité des individus dans la mesure où ils sont présentés par des molécules HLA I et HLA II qui sont prépondérantes dans la population caucasienne. Ils sont immunogènes c'est à dire qu'ils sont capables d'induire des lymphocytes T CD4+ et/ou T CD8+ spécifiques de la Midkine à partir des précurseurs présents chez la majorité des individus naïfs ou bien de stimuler de tels lymphocytes T chez la majorité des individus présentant un cancer associé à la surexpression de la Midkine. En outre, les lymphocytes T CD4+ et/ou T CD8+ qui sont induits chez la majorité des individus reconnaissent la Midkine exprimée par les tumeurs de ces individus. L'immunogénicité des peptides peut être déterminée, notamment à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMCs), par tout essai approprié connu de l'Homme du métier comme par exemple : un test de prolifération cellulaire, un test de cytotoxicité, un test ELISPOT (dosage des cellules productrices de cytokines) ou un test de dosage des cytokines (IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-IO, IL-5, TNF-α et TGF-β).
L'invention englobe les peptides variants naturels ou synthétiques obtenus par mutation (insertion, délétion, substitution) d'un ou plusieurs acides aminés dans la séquence de la Midkine, dès lors que ledit peptide conserve une bonne affinité pour les molécules HLA prépondérantes et est immunogène. Les variants naturels résultent notamment du polymorphisme de la Midkine. En outre, d'autres variants peuvent être aisément construits étant donné que les résidus d'acides aminés impliqués dans la liaison aux molécules HLA- DR et HLA-DP4 (résidus d'ancrage) et l'effet des modifications de ces résidus sur la liaison aux molécules HLA-DR et HLA- DP4 sont connus de l'Homme du métier ; la Demande Internationale PCT WO 03/040299 enseigne notamment que pour lier HLA-DP4, le résidu en P6 doit être aromatique ou hydrophobe ou consister en un résidu de cystéine (C), et au moins l'un des résidus Pl, P9 est tel que Pl est aromatique ou hydrophobe et/ou P9 est aromatique ou hydrophobe ou consiste en un résidu C, D, Q, S, T ou E, alors que le résidu en P4 peut être n'importe quel résidu d'acide aminé. Le Brevet américain US 6,649,166 décrit une méthode générale permettant de déterminer les résidus d'ancrage aux molécules HLA DR (P 1 , P4, P6, P7 et P9) et la nature des mutations de ces résidus permettant de modifier l'affinité pour les molécules HLA DR. Des motifs de liaison aux molécules HLA DR sont décrits notamment dans Sturnolio et al, Nat. Biotech, 1999, 17, 533-534 et Rammensee et al, Immunogenetics, 1995, 41, 178-228. Les résidus d'acides aminés impliqués dans la liaison aux molécules HLA-I (résidus d'ancrage) et l'effet des modifications de ces résidus sur la liaison aux molécules HLA-I sont connus de l'Homme du métier. Les motifs de liaison des peptides aux molécules HLA de classe I sont décrits dans Rammensee et al, Immunogenetics, 1995, 41, 178-228 et dans le Tableau III ci-dessous.
Tableau III : Motifs de liaison des principaux allèles HLA-A*
Figure imgf000013_0001
* les résidus majeurs d'ancrage sont en gras.
Il est également connu que certaines substitutions améliorent l'affinité des peptides pour les molécules HLA I sans perturber leur antigénicité c'est le cas de l'introduction d'une tyrosine en position 1 sur un peptide se liant à HLA-A2 (Tourdot et al., Eur. J. Immunol., 2000, 30, 3411-3421).
L'invention englobe également les peptides modifiés dérivés des précédents par introduction de toute modification au niveau de résidu(s) d'acide aminé, de la liaison peptidique ou des extrémités des peptides, dès lors que ledit peptide modifié conserve une bonne affinité les molécules HLA prépondérantes et est immunogène. Ces modifications qui sont introduites dans les peptides par les méthodes classiques connues de l'Homme du métier, incluent de façon non-limitative : la substitution d'un acide aminé par un acide aminé non-protéinogénique (acide aminé D ou analogue d'acide aminé) ; l'addition de groupement chimique (lipide, oligo ou polysaccharide) au niveau d'une fonction réactive, notamment de la chaîne latérale R ; la modification de la liaison peptidique (-CO-NH-), notamment par une liaison du type rétro ou rétro-inverso (-NH-CO-) ou une liaison différente de la liaison peptidique ; la cyclisation ; la fusion d'un peptide (épitope d'intérêt pour la vaccination ; étiquette utile pour la purification du peptide, notamment sous forme clivable par une protéase) ; la fusion de la séquence dudit peptide avec celle d'une protéine, notamment une chaîne α d'une molécule HLA I ou HLA II, une chaîne β d'une molécule HLA II ou le domaine extracellulaire de ladite chaîne ou bien encore une séquence de ciblage dans l'endosome dérivée notamment de la chaîne invariable Ii ou de la protéine LAMP-I ; le couplage à une molécule appropriée, notamment un marqueur, par exemple un fluorochrome ou la biotine. Ces modifications sont destinées en particulier à augmenter la stabilité et plus particulièrement la résistance à la protéolyse, ainsi que la solubilité, l'immunogénicité ou à faciliter la purification ou la détection, soit du peptide selon l'invention, soit de cellules CD4+ et/ou CD8+ spécifiques dudit peptide. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ledit peptide est constitué par la protéine Midkine. De préférence, il s'agit de la protéine humaine de séquence SEQ ID NO : 2.
La présente invention englobe l'utilisation de la protéine Midkine dénaturée par tout moyen approprié connu de l'Homme du métier, et notamment la protéine Midkine réduite.
La présente invention englobe également l'utilisation de variants de la protéine Midkine dans lesquels l'une au moins des cystéines impliquées dans un pont disulfure est remplacée par un autre acide aminé, par exemple une serine.
La présente invention englobe également l'utilisation de peptides d'au moins 8 acides aminés issus de la protéine Midkine qui comprennent au moins un épitope T CD4+ ou T CD8+ tel que définis ci-dessus. L'invention englobe l'utilisation de peptides qui lient l'une des molécules HLA I et/ou l'une des molécules HLA II les plus fréquentes dans la population caucasienne, notamment la molécule HLA-A2 (Tableau I) et/ou les molécules HLA-DR7, HLA-DRB4, HLA-DP401 ou HLA-DP402 (Tableau II). L'invention englobe également l'utilisation de peptides qui lient plusieurs molécules HLA I et/ou HLA II prépondérantes différentes, de façon à élargir la couverture vaccinale à la majorité de la population caucasienne.
L'invention englobe également l'utilisation de peptides d'au moins 8 acides aminés du domaine N-terminal de la Midkine (positions 1 à 84 en référence à la séquence du précurseur de la Midkine) qui comprennent au moins un épitope T CD4+ ou T CD8+ tel que définis ci-dessus. Conformément à l'invention, ledit fragment présente une longueur de
8 à 100 acides aminés, de préférence de 8 à 50 acides aminés, de manière préférée de iθ à 25 acides aminés (10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 acides aminés).
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ledit peptide est un fragment d'au moins 8 acides aminés de la protéine Midkine comprenant au moins un épitope T CD8+ restreint à la molécule HLA-A2, lequel peptide comprend au moins les positions 14 à 21 ou 114 à 122 de la séquence en acides aminés de ladite protéine Midkine.
De préférence, ledit peptide comprend les positions 12 à 21, 13 à 21, 13 à 22, 14 à 22 ou 1 13 à 122 de la séquence en acides aminés de ladite protéine Midkine.
De manière préférée, ledit peptide est constitué par les positions 12 à 21 (MDK 12-21), 13 à 21(MDK 13-21), 13 à 22 (MDK 13-22), 14 à 22 (MDK 14-22), 113 à 122 (MDK 113-122) ou 114 à 122 (MDK 114-122) de la séquence en acides aminés de la protéine Midkine ; ces peptides correspondent, respectivement aux séquences SEQ ID NO : 3 à 8 dans le listage des séquences en annexe.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ledit peptide est un fragment d'au moins 8 acides aminés de la protéine Midkine comprenant au moins un épitope T CD4+ restreint à au moins une molécule HLA II prépondérante dans la population caucasienne, lequel peptide comprend au moins les positions 9 à 15, 14 à 28, 52 à 64, 64 à 78, 70 à 84, 74 à 88, 78 à 92, 84 à 98, 99 à 113, 105 à 119, 1 10 à 124 ou 119 à 133 de la séquence en acides aminés de ladite protéine Midkine. Des exemples de ces peptides sont les peptides de séquence SEQ ID NO : 9, 10, 13 à 15, 21 à 26, 28, 29 et 30 (Tableau VII).
De préférence, ladite molécule HLA II prépondérante dans la population caucasienne est choisie parmi les molécules HLA-DRl, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DRI l, HLA-DRl 3, HLA-DRl 5, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA- DRB5, HLA-DP401 et HLA-DP402. Lesdites molécules HLA II sont avantageusement codées respectivement par les allèles HLA DRB 1*0101, DRB 1*0301, DRBl*0401, DRBl*0701, DRB1*11O1, DRB1* 13O1, DRB1* 15O1, DRB3*0101, DRB4*0104, DRB5*0101, DP*0401 et DP*0402. De préférence, ledit peptide lie au moins quatre molécules HLA II différentes, prépondérantes dans la population caucasienne et comprend au moins les positions 9 à 15, 14 à 28 ou 110 à 124 de la séquence en acides aminés de ladite protéine Midkine. Ledit peptide comprend avantageusement les positions 1 à 15, 4 à 185 9 à 21, 9 à 22, 9 à 23 ou l4 à 28 de la séquence en acides aminés de la protéine Midkine.
De manière préférée, ledit peptide est constitué par les positions 1 à 15 (MDK 1-15), 4 à 18 (MDK 4-18), 9 à 21 (MDK 9-21), 9 à 22 (MDK 9-22), 9 à 23 (MDK 9-23), 14 à 28 (MDK 14-28), ou 110 à 124 (MDK 110-124) de la séquence en acides aminés de la protéine Midkine ; ces peptides correspondent, respectivement aux séquences SEQ ID NO : 9 à 15 dans le listage des séquences en annexe.
Conformément à l'invention, ledit peptide comprend avantageusement plusieurs épitopes T CD4+ et/ou CD8+ de la protéine Midkine, éventuellement associés à d'autres épitopes T CD4+, TCD8+ ou B. Les épitopes sont avantageusement des épitopes T CD4+ ou T CD8+ issus d'antigène tumoraux tels que décrits sur le site http://www.cancerimmunity.org/peptidedatabase/tumorspecific.htm, notamment des épitopes T CD4+ ou T CD8+ issus de MAGE, NY-ESO-I ou de la survivine.
Selon une disposition avantageuse, des modes de réalisation précédents ledit peptide est un fragment de la protéine Midkine comprenant au moins un épitope T CD8+ restreint à la molécule HLA-A2 et au moins un épitope T CD4+ restreint à au moins quatre molécules HLA II différentes prépondérantes dans la population caucasienne, lequel peptide comprend les positions 9 à 21 , 9 à 22, 9 à 23 ou 110 à 124 de la séquence en acides aminés de ladite protéine Midkine. De préfé- rence, ledit peptide est constitué par les positions 9 à 21 (MDK 9-21), 9 à 22 (MDK 9- 22), 9 à 23 (MDK 9-23) ou 110 à 124 (MDK 1 10-124) de la séquence en acides aminés de la protéine Midkine.
Un tel peptide permet avantageusement d'induire à la fois des lymphocytes T CD4+ et T CD8+ spécifiques de nombreuses tumeurs chez la majorité des individus de la population caucasienne présentant ces tumeurs.
Les différents épitopes peuvent être inclus dans la composition vaccinale sous la forme d'un mélange de peptides isolés, d'un peptide multiépi- topique, d'une protéine de fusion ou d'un polynucléotide codant les peptides/protéine précédents. Lesdits peptides/protéine peuvent être modifiés ou associés à des liposomes ou des lipides, en particulier sous forme de lipopeptides. De préférence, ledit polynucléotide est inclus dans un vecteur, notamment un vecteur d'expression.
Parmi les épitopes pouvant être incorporés dans la composition vaccinale de l'invention, on peut citer notamment : - les épitopes T CD8+ de MAGE tels que décrits dans le Brevet US
6,063,900 et la Demande PCT WO 2004/052917,
- les épitopes T CD4+ de MAGE tels que MAGE-A3 267-282 restreint à DRl (Demande Internationale PCT WO 02/095051) ; MAGE-A3 149-160 restreint à DR4 et DR7 (Kobayashi et al, Cancer Research, 2001, 61, 4773-4778) ; MAGE- A3 191-205 et 281-295 restreints à DRl 1 (Consogno et al, Blood, 2003, 101, 1038-1044 ; Manici et al., J. Exp. Med., 1999, 189, 871-876) et MAGE-A3 121-134 restreint à DR13 (Brevet US 6,716,809) ; MAGE-Al 281-292 restreint à DR15 (Demande Internationale PCT WO 00/78806) ; MAGE-A6 102-116, 121-144, 140- 170, 145-160, 150-165 et 246-263 restreints à DR4 (Tatsumi et al, Clinical Cancer Research, 2003, 9, 947-954) MAGE-Al 281-292 restreint à DRl 5 (Demande Internationale PCT WO 00/78806) ; MAGE- A6 102-1 16, 121-144, 140-170, 145- 160, 150-165 et 246-263 restreints à DR4 (Tatsumi et al, Clinical Cancer Research, 2003, 9, 947-954) et les épitopes MAGE restreints à HLA-DP4 tels que décrits dans la Demande Internationale PCT WO 2007/026078, - un épitope T CD8+ de la survivine choisi parmi : survivine 96-104
(LTLGEFLKL, SEQ ID NO : 39) ou 95-104 (ELTLGEFLKL, SEQ ID NO : 40), survivine-2B 80-88 (AYACNTSTL, SEQ ID NO : 41) et les peptides tels que décrits dans le Tableau I de Bachinsky et al, Cancer Immun., 2005, 5, 6-,
- un épitope T CD4+ de la survivine tel que décrit dans la Demande Internationale PCT WO 2007/036638 et notamment le peptide 19-33, 90-104 ou 93- 107,
- un épitope T CD4+ universel naturel ou synthétique tel que le peptide de la toxine tétanique TT 830-846 (O1SULLIVAN et al, J. Immunol., 1991, 147, 2663-2669), le peptide de Phémagglutinine du virus de la grippe HA 307-319 (O'Sullivan et al, précité), le peptide PADRE (KXV AA WTLKAA, SEQ ID NO : 16; Alexander et al., Immunity, 1994, 1, 751-761) et des peptides issus des antigènes de Plasmodium falciparum tels que le peptide CS.T3 (Sinigaglia et al, Nature, 1988, 336, 778-780) et les peptides CSP, SSP2, LSA-I et EXP-I (Doolan et al., J. Immunol., 2000, 165, 1 123-1137),
- un épitope B constitué par un sucre (Alexander et al., précité), ledit épitope B étant de préférence sous la forme d'un glycopeptide, et
- un épitope B de la Midkine reconnu spécifiquement par des anticorps dirigés contre ledit antigène tumoral.
La combinaison d'épitope(s) T CD4+ et/ou T CD8+ de la Midkine avec l'un au moins des épitopes tels que définis ci-dessus permet avantageusement d'améliorer la réponse immunitaire anti-tumorale et notamment l'établissement d'une mémoire immunitaire de long terme.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ledit peptide issu de la Midkine est un peptide multi-épitopique comprenant la concaténation d'au moins deux épitopes identiques ou différents dont l'un au moins est un épitope T CD4+ et/ou T CD8+ de la Midkine. Le peptide multi-épitopique comprend avantageusement d'autres épitopes (épitope T CD4+ ou T CD8+ d'un autre antigène tumoral), tels que définis ci-dessus. Conformément à l'invention, les séquences des différents épitopes, sont reliées entre elles par une liaison peptidique ou séparées par des séquences hétérologues, c'est-à-dire des séquences différentes de celles naturelle- ment présentes à cette position dans la séquence en acides aminés de la Midkine. De préférence, ledit peptide multiépitopique présente une longueur de 20 à 1000 acides aminés, de manière préférée de 20 à 100 acides aminés. Ledit peptide multiépitopique comprend avantageusement une étiquette fusionnée à l'une de ses extrémités, pour la purification ou la détection dudit fragment. L'étiquette, notamment une séquence polyhistidine ou un épitope B d'un antigène, est de préférence séparée de la séquence multiépitopique par un site de clivage d'une protéase de façon à isoler la séquence multiépitopique, à partir de la fusion.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ledit peptide issu de la Midkine est un lipopeptide comprenant un peptide ou un fragment multiépitopique, tels que définis ci-dessus. Ledit lipopeptide est notamment obtenu par addition d'un lipide sur une fonction α-aminée ou sur une fonction réactive de la chaîne latérale d'un acide aminé dudit peptide ou fragment multiépitopique ; il peut comprendre une ou plusieurs chaînes dérivées d'acides gras en C4-20, éventuellement ramifiées ou insaturées (acide palmitique, acide oléique, acide linoléique, acide linolénique, acide 2- amino hexadécanoïque, pimélautide, trimétauxide) ou un dérivé d'un stéroïde. La partie lipidique préférée est notamment représentée par un groupe Nα-acétyl-lysine Nε(palmitoyl), également dénommé Ac-K(Pam).
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ledit peptide issu de la Midkine est fusionné avec une protéine ou un fragment de protéine hétérologue (protéine de fusion).
Le peptide ou le fragment multiépitopique peuvent être fusionnés avec l'extrémité NH2 ou COOH de ladite protéine ou insérés dans la séquence de ladite protéine. Selon un mode de réalisation avantageux de ladite protéine de fusion, elle est constituée par un peptide tel que défini ci-dessus, fusionné avec une séquence de ciblage dans l'endosome, dérivée de préférence d'une chaîne invariable humaine Ii ou de la protéine LAMP-I. Les séquences de ciblage dans l'endosome et leur utilisation pour le ciblage d'antigènes dans l'endosome sont notamment décrites dans Sanderson et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 7217-7222), Wu et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 11671-11675) et Thompson ét al. (J. Virol., 1998, 72, 2246-2252).
Selon une disposition avantageuse de ladite protéine de fusion, elle est constituée par un peptide tel que défini ci-dessus, fusionné avec l'une des chaînes d'une molécule HLA, de préférence la chaîne béta d'une molécule HLA II ou la chaîne alpha d'une molécule HLA I, ou bien avec un fragment de celle-ci correspondant à une molécule HLA soluble, notamment un fragment correspondant au domaine extracellulaire précédé du peptide signal homologue ou d'un peptide signal hétéro- logue. Ledit peptide est avantageusement inséré entre le peptide signal et l'extrémité NH2 du domaine extracellulaire de la chaîne α ou β, comme décrit pour la molécule HLA-DR ( Kolzin et al, PNAS, 2000, 97, 291-296).
Alternativement, ledit peptide ou ledit fragment multiépitopique sont fusionnés avec une protéine facilitant leur purification ou leur détection, connue de l'Homme du métier comme notamment la Glutathione-S- Transférase (GST) et les protéines fluorescentes (GFP et dérivées). Dans ce cas, la séquence du peptide ou du fragment multiépitopique d'intérêt est de préférence séparée du reste de la protéine par un site de clivage d'une protéase, pour faciliter la purification dudit peptide ou dudit fragment multiépitopique. Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ledit polynucléotide code pour un peptide, un fragment multiépitopique ou une protéine de fusion tels que définis ci-dessus.
Conformément à l'invention, la séquence dudit polynucléotide est celle de l'ADNc codant pour ledit peptide ou fragment multiépitopique ou ladite protéine de fusion. Ladite séquence peut avantageusement être modifiée de façon à ce que l'usage des codons soit optimal chez l'hôte dans lequel elle est exprimée. En outre, ledit polynucléotide peut être lié à au moins une séquence hétérologue.
Au sens de la présente invention, on entend par séquence hétérologue relativement à une séquence d'acide nucléique codant pour la Midkine, toute séquence d'acide nucléique autre que celles qui, dans la nature, sont immédiatement adjacentes à ladite séquence d'acide nucléique codant ledit peptide de la Midkine. De préférence, ledit polynucléotide est inséré dans un vecteur. Au sens de la présente invention, on entend par vecteur une molécule d'acide nucléique capable de transporter un autre acide nucléique à laquelle elle est associée. Un type de vecteur qui peut être utilisé dans la présente invention inclut, de façon non-limitative, une molécule d'ADN ou d'ARN linéaire ou circulaire constituée d'acides nucléiques chromosomiques, non-chromosomiques, synthétiques ou semi-synthétiques, tel que notamment un vecteur viral, un plasmide ou un vecteur à ARN.
De nombreux vecteurs dans lesquels on peut insérer une molécule d'acide nucléique d'intérêt afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote ou procaryote, sont connus en eux-mêmes ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de cette séquence sous forme extrachromosomique, ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte), ainsi que de la nature de la cellule hôte. Par exemple, on peut utiliser des acides nucléiques nus (ADN ou ARN) ou des vecteurs viraux tels que les adénovirus, les rétrovirus, les lentivirus et les AAV dans lesquels a été insérée préalablement la séquence d'intérêt ; on peut également associer ladite séquence (isolée ou insérée dans un vecteur plasmidique) avec une substance lui permettant de franchir la membrane des cellules hôtes, telle qu'un transporteur comme un nanotransporteur ou une prépa- ration de liposomes, ou de polymères cationiques, ou bien l'introduire dans ladite cellule hôte en utilisant des méthodes physiques telles que l'électroporation ou la micro injection. En outre, on peut avantageusement combiner ces méthodes, par exemple en utilisant l'électroporation associée à des liposomes.
De préférence, ledit vecteur comprend tous les éléments nécessaires à l'expression du peptide ou de la protéine tels que définis ci-dessus. Par exemple, ledit vecteur comprend une cassette d'expression incluant au moins un polynucléotide tel que défini ci-dessus, sous le contrôle de séquences régulatrices de la transcription et éventuellement de la traduction appropriées (promoteur, activateur, intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation, site d'épissage). La composition vaccinale selon l'invention comprend avantageusement un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une substance porteuse et/ou un adjuvant.
Les véhicules pharmaceutiquement acceptables, les substances porteuses et les adjuvants sont ceux classiquement utilisés. Les adjuvants sont avantageusement choisis dans le groupe constitué par : les émulsions huileuses, les substances minérales, les extraits bactériens, les oligonucléotides contenant des CpG, la saponine, Phydroxyde d'alumine, le mono- phosphoryl —lipide A et le squalène.
Les substances porteuses sont avantageusement sélectionnées dans le groupe constitué par : les liposomes unilamellaires ou multilamellaires, les ISCOMS, les virosomes, les pseudoparticules virales, les micelles de saponine, les microsphères solides de nature saccharidique (poly(lactide-co-glycolide)) ou aurifère, et les nano- particules.
La composition vaccinale comprend une dose efficace de peptide/protéine/lipopeptide/vecteur permettant d'obtenir un effet prophy- lactique/thérapeutique sur le cancer associé à une surexpression tumorale de la Midkine tel que défini ci-dessus. Cette dose est déterminée et ajustée en fonction de facteurs tels que l'âge, le sexe et le poids du sujet. La composition vaccinale est généralement administrée selon les protocoles usuels de vaccination, à des doses et pendant une durée suffisante pour induire une réponse cellulaire dirigée contre la protéine Midkine. L'administration peut être sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intradermique, intrapéritonéale, orale, sublinguale, rectale, vaginale, intra- nasale, par inhalation ou par application transdermique.
La composition se présente sous une forme galénique adaptée à une administration choisie : solution stérile injectable, poudre, comprimés, gélules, suspension, sirop, suppositoires, qui sont préparés selon les protocoles standard.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite composition, elle comprend au moins un épitope T CD4+ et un épitope T CD8+ de la Midkine, sous forme d'un mélange de peptides, d'un fragment multiépitopique et/ou d'un vecteur d'expression codant lesdits peptides ou ledit fragment, tels que définis ci-dessus. , Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation de ladite composition, elle comprend au moins le peptide MDK 9-21, MDK 9-22, MDK 9-23 ou MDK 110-124.
De préférence, le peptide MDK 9-21, MDK 9-22 ou MDK 9-23 est combiné au peptide MDK 74-88 ou 78-92, au peptide MDK 14-28 ou 99-113 et au peptide MDK 4-18.
Une telle combinaisons de peptides qui lie la molécule HLA-A2 et l'ensemble des molécules HLA-DRl, HLA-DR3, HLA-DR4, HLA-DR7, HLA-DRI l, HLA-DR13, HLA-DRl 5, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DP401 et HLA-DP402 (Tableau VII) , permet avantageusement d'induire des lymphocytes T CD4+ et T CD8+ chez la quasi-totalité des individus vaccinés.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de ladite composition, elle comprend un peptide incluant un épitope T CD4+ universel et/ou un épitope T CD4+ et/ou T CD8+ d'un autre antigène tumoral, tel que défini ci-dessus.
Les peptides selon la présente invention et les produits dérivés
(peptide multiépitopique, protéine de fusion, lipopeptide, vecteur recombinant) peuvent être utilisés en immunothérapie dans le traitement des tumeurs surexprimant la Midkine. Lesdits peptides ou produits dérivés sont utilisés, soit comme vaccin, soit en thérapie cellulaire, ou bien encore par une combinaison des deux approches.
La thérapie cellulaire comprend, la préparation de cellules présentatrices d'antigènes (cellules dendritiques) par un protocole classique comprenant l'isolement de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) d'un patient à traiter et la mise en culture des cellules dendritiques en présence de peptide(s). Dans une seconde étape les cellules présentatrices d'antigène chargées avec le peptide sont réinjectées au patient.
La présente invention a également pour objet une composition vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un fragment peptidique issu de la Midkine tel que défini ci-dessus, un peptide multiépitopique, une protéine de fusion, un lipopeptide ou un vecteur tels que définis ci-dessus, et un véhicule pharmaceuti- quement acceptable, une substance porteuse ou un adjuvant.
La présente invention a également pour objet une méthode de vaccination antitumorale, prophylactique ou thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle comprend l'administration d'une composition vaccinale telle que définie ci-dessus, à un individu, par tout moyen approprié tel que défini ci-dessus.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un peptide tel que défini ci-dessus pour la préparation d'un réactif d'immunomoni- toring de la réponse cellulaire contre la Midkine, destiné à l'évaluation du pronostic ou au suivi du traitement d'un cancer (chirurgie, radiothérapie, chimiothérapie, immunothérapie). De préférence, ledit réactif comprend un peptide ou une protéine de fusion tels que définis ci-dessus, par exemple marqué et/ou complexé à une molécule HLA, sous la forme de complexes multimériques HLA/peptide comme des tétramères de complexes HLA/peptide, marqués.
La présente invention a également pour objet une méthode in vitro, d'immunomonitoring de la réponse cellulaire contre la Midkine chez un individu présentant un cancer, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- la mise en contact d'un échantillon biologique dudit individu avec un peptide tel que défini ci-dessus, et
- la détection de lymphocytes T CD4+ et/ou T CD8+ spécifiques de la Midkine, par tout moyen approprié. La méthode selon l'invention permet de suivre l'évolution de la réponse T CD4+ et/ou T CD8+ dirigée contre la Midkine au cours d'un cancer ou bien d'un traitement antitumoral, notamment une immunothérapie antitumorale ; les lymphocytes T CD4+ spécifiques de la Midkine peuvent être de type THl (sécrétion d'IFN-γ), TH2 (sécrétion d'IL-4) ou T régulateur (sécrétion d'IL-10 ou de TGF-β) ; il est attendu que la réponse T de type THl est signe d'une évolution favorable du cancer alors que la réponse T régulatrice est signe d'une évolution défavorable de ce cancer. La détection est effectuée à partir d'un échantillon biologique contenant des cellules T CD4+ et/ou T CD8+, notamment un échantillon de cellules mononucléées isolées à partir d'un prélèvement de sang périphérique (PBMCs). Les lymphocytes T CD4+ et/ou T CD8+ spécifiques de la Midkine sont détectés par tous moyens, connus en eux-mêmes. Par exemple, on peut utiliser des moyens directs comme la cytométrie de flux en présence de complexes multimériques tels que définis ci-dessus, ou bien des moyens indirects comme les tests de prolifération lymphocytaire, les tests de cytotoxicité cellulaire et les dosages de cyto- kines telles que l'IL-2, l'IL-4, l'IL-5, IL-IO et l'IFN-γ, notamment par des techniques immunoenzymatiques (ELISA, RIA, ELISPOT) ou par cytométrie de flux (dosage des cytokines intracellulaires).
De manière plus précise :
Une suspension de cellules (PBMC, PBMC déplétées en cellules CD4+ ou CD8+, lymphocytes T préalablement enrichis par une étape de culture in vitro avec les peptides tels que définis ci-dessus ou des lymphocytes T clones) est mise en présence desdits peptides et au besoin de cellules présentatrices appropriées, telles que des cellules dendritiques, des PBMC autologues ou hétérologues, des cellules lymphoblastoïdes telles que celles obtenues après infection par le virus EBV ou des cellules génétiquement modifiées. La présence de cellules T CD4+ et/ou T CD 8+ spécifiques de la Midkine, dans la suspension initiale est détectée à l'aide des peptides, selon l'une des méthodes suivantes :
* test de prolifération :
La prolifération des cellules T CD4+ et/ou T CD8+ spécifiques de la Midkine est mesurée par incorporation de thymidine tritiée dans l'ADN des cellules.
* test ELISPOT : Le test ELISPOT permet de révéler la présence de cellules T sécrétant de cytokines (IL-2, IL-4, IL-5, IL-IO, IFN-γ, TNF-α et TGF-β) spécifiques d'un peptide tel que défini ci-dessus. Le principe de ce test est décrit dans Czerkinsky et al. , J. Immunol. Methods, 1983, 65, 109-121 et Schmittel et al, J. Immunol. Methods, 1997, 210, 167-174, et sa mise en œuvre est illustrée dans la Demande Internationale WO 99/51630 ou Gahéry-Ségard et al, J. Viral., 2000, 74, 1694-1703.
* détection des cytokines :
La présence de cellules T spécifiques de la Midkine, sécrétant des cytokines (IL-2, IL-4, IL-5, IL-IO, IFN-γ, TNF-α et TGF-β) est détectée, soit par dosage des cytokines présentes dans le surnageant de culture, par un test immuno- enzymatique, notamment à l'aide d'un kit commercial, soit par détection des cytokines intracellulaires en cytométrie de flux. Le principe de détection des cytokines intracellulaires est décrit dans Goulder et al. , J. Exp. Med., 2000, 192, 1819-1832 et Maecker et al, J. Immunol. Methods, 2001, 255, 27-40 et sa mise en œuvre est illustrée dans Draenert et al, J. Immunol. Methods, 2003, 275, 19-29. * complexes multimériques
- un échantillon biologique, de préférence des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC), est mis en contact avec des complexes multimériques marqués, notamment par un fluorochrome, formés par la liaison entre des molécules HLA solubles et des peptides tels que définis ci-dessus, et - les cellules marquées par lesdits complexes multimériques sont analysées, notamment par cytométrie de flux. De manière avantageuse, préalablement à la mise en contact de l'échantillon biologique avec lesdits complexes, on l'enrichit en cellules T CD4+ et/où T CD8+, en le mettant en contact avec des anticorps anti-CD4 ou anti-CD8.
Les complexes multimériques HLA /peptide peuvent être préparés à partir de molécules natives extraites de cellules exprimant une molécule HLA I et ou
HLA II ou de molécules recombinantes produites dans des cellules hôte appropriées comme précisé, par exemple dans NOVAK et al. (J. Clin. Investig., 1999, 104, R63-
R67) ou dans KURODA et al. (J. Virol., 2000, 74, 18, 8751-8756). Ces molécules
HLA peuvent notamment être tronquées (délétion du domaine transmembranaire) et leur séquence peut-être modifiée afin de les rendre solubles ou bien de faciliter l'appariement des chaînes alpha et béta (Novak et al, précité).
Le chargement de molécules HLA avec le peptide peut se faire par mise en contact d'une préparation de molécules HLA comme ci-dessus, avec le peptide. Par exemple, des molécules HLA solubles et biotinylées sont incubées, pendant 72 heures à 37°C, avec un excès d'un facteur 10 de peptides tels que définis ci-dessus, dans un tampon phosphate-citrate 10 mM, NaCl 0,15 M à un pH compris entre 4,5 et 7.
Alternativement, la séquence du peptide peut être introduite dans l'une des chaînes de la molécule HLA sous forme d'une protéine de fusion qui permet la préparation de complexes multimériques HLA /peptides à partir de cellules hôtes appropriées exprimant ladite protéine de fusion. Lesdits complexes peuvent ensuite être marqués, notamment par la biotine.
Les complexes multimériques de type tétramère sont notamment obtenus en ajoutant aux molécules HLA chargées, de la streptavidine marquée par un fluorochrome en quantité quatre fois moindre (mole à mole) par rapport aux molécules
HLA. L'ensemble étant ensuite incubé pendant une durée suffisante, par exemple une nuit à température ambiante.
Les complexes multimériques peuvent également être formés, soit par incubation de monomères HLA /peptides avec des billes magnétiques couplées à la streptavidine comme décrit pour les molécules HLA I (Bodinier et al., Nature,
2000, 6, 707-710), soit par insertion de monomères HLA /peptides dans des vésicules lipidiques comme décrit pour les molécules du CMH de classe II murines (Prakken, Nature Medicine, 2000,6, 1406-1410).
Pour utiliser ces complexes multimériques HLA /peptide notamment de type tétramère, on met en contact une suspension de cellules (PBMC, PBMC déplétéës en cellules CD4+ et/ou CD8+, lymphocytes T préalablement enrichis par une étape de culture in vitro avec des peptides tels que définis ci-dessus ou des lymphocytes T clones) avec des complexes multimériques HLA /peptide à une concentration appropriée (par exemple de l'ordre de 10 à 20 μg/ml), pendant une durée suffisante pour permettre la liaison entre les complexes et les lymphocytes T CD4+ et/ou CD8+ spécifiques de la Midkine (par exemple, de l'ordre de 1 à 3 heures). Après lavage, la suspension est analysée par cytométrie de flux : on visualise le marquage des cellules par les complexes multimériques qui sont fluorescents. La cytométrie de flux permet de séparer les cellules marquées par les complexes multimériques HLA/peptide des cellules non marquées et d'effectuer ainsi un tri cellulaire. La présente invention a également pour objet un réactif d'immunomonitoring comprenant au moins un peptide tel que défini ci-dessus. De préférence, ledit réactif est inclus dans un coffret (kit). Ledit réactif d'immunomonitoring comprend avantageusement un peptide ou une protéine de fusion tels que définis ci-dessus, éventuellement marqués ou complexés, notamment complexés à des molécules HLA marquées, par exemple biotinylées, sous la forme de complexes multimériques HLA/peptide comme des tétramères de complexes HLA/peptide, marqués.
La présente invention a ainsi, en outre, pour objet un procédé d'analyse de lymphocytes T CD4+ et/ou T CD8+ spécifiques de la Midkine, caracté- risé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes :
- la mise en contact, in vitro, d'un échantillon cellulaire avec des complexes multimériques HLA /peptide marqués, notamment par un fluorochrome, lesdits complexes étant formés par la liaison de molécules HLA solubles avec au moins un peptide tel que défini ci-dessus, et - l'analyse des cellules liées auxdits complexes HLA /peptide, notamment en cytométrie de flux. Selon un mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, l'analyse des cellules (lymphocytes T CD4+ et/ou T CD8+) comprend le tri desdites cellules.
La présente invention a en outre pour objet un fragment peptidique issu de la Midkine, un peptide multiépitopique, une protéine de fusion, un lipopeptide, tels que définis ci-dessus.
La présente invention a également pour objet un polynucléotide, une cassette d'expression, un vecteur recombinant, une cellule hôte procaryote ou euca- ryote modifiée, dérivés des peptides/protéine précédents.
L'invention englobe en particulier : a) des cassettes d'expression comprenant au moins un polynucléotide tel que défini ci-dessus, sous le contrôle de séquences régulatrices de la transcription et éventuellement de la traduction appropriées (promoteur, activateur, intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation), et b) des vecteurs recombinants comprenant un polynucléotide conforme à l'invention. Avantageusement ces vecteurs sont des vecteurs d'expression comprenant au moins une cassette d'expression telle que définie ci-dessus.
Les polynucléotides, les vecteurs recombinants et les cellules transformées tels que définis ci-dessus, sont utiles notamment pour la production des peptides, fragments multiépitopiques et protéines de fusion selon l'invention. Les polynucléotides selon l'invention sont obtenus par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. A USUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). Par exemple, ils peuvent être obtenus par amplification d'une séquence nucléique par PCR ou RT-PCR, par criblage de banques d'ADN génomique par hybridation avec une sonde homologue, ou bien par synthèse chimique totale ou partielle. Les vecteurs recombinants sont construits et introduits dans des cellules hôtes par les méthodes classiques d'ADN recombinant et de génie génétique, qui sont connues en elles-mêmes.
Les peptides et leurs dérivés (variants, peptides modifiés, lipo- peptides, fragments multiépitopiques, protéines de fusion) tels que définis ci-dessus, sont préparés par les techniques classiques connues de l'Homme du métier, notam- ment par synthèse en phase solide ou liquide ou par expression d'un ADN recombinant dans un système cellulaire approprié (eucaryote ou procary ote). De manière plus précise :
- les peptides et leurs dérivés (variants, peptides multiépitopiques) peuvent être synthétisés en phase solide, selon la technique Fmoc, originellement décrite par Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc, 1964, 85: 2149-) et purifiés par chromatographie liquide haute performance en phase inverse,
- les lipopeptides peuvent être notamment préparés selon le procédé décrit dans les Demandes Internationales WO 99/40113 ou WO 99/51630. - les peptides et dérivés tels que les variants, les fragments multiépitopiques et les protéines de fusion peuvent également être produits à partir des ADNc correspondants, obtenus par tout moyen connu de l'homme du métier ; l'ADNc est clone dans un vecteur d'expression eucaryote ou procaryote et la protéine ou le fragment produits dans les cellules modifiées par le vecteur recombinant sont purifiés par tout moyen approprié, notamment par chromatographie d'affinité.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre de l'objet de la présente invention, avec référence aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 représente la séquence peptidique de la Midkine humaine
(SEQ ID NO : 2). La séquence complète correspond au précurseur. Le peptide signal est indiqué en caractères gras et souligné.
- la figure 2 illustre la spécificité peptidique des lymphocytes T CD8+ induits contre les peptides de la Midkine. Les lignées de lymphocytes T (267.29A, 278.1 IA, 314.28) ont été obtenues par stimulation de lymphocytes T de trois individus sains exprimant HLA-A2 (267, 278, 314). Après 4 semaines de culture, leur spécificité a été testée par Elispot IFN-γ.
- la figure 3 illustre la restriction à HLA-A2 des lymphocytes T CD8+ spécifiques des peptides de la Midkine. La restriction a été évaluée par Elispot IFN-γ, à l'aide de cellules C 1 R et C 1 R- A2 (C 1 R transfectées par HLA- A2).
- la figure 4 illustre la reconnaissance des cellules transfectées par un plasmide d'expression de la Midkine, par des lymphocytes T CD8+ spécifiques des peptides de la Midkine. Les cellules C1R-A2 ont été transfectées par un plasmide pcDNA3.1 recombinant contenant la séquence codante de la Midkine (pMDK). L'activation des lymphocytes T CD8+ par les cellules C1R-A2 transfectées par pMDK ou non transfectées a été évaluée par Elispot IFN-γ. - la figure 5 illustre l'expression de la Midkine dans les cellules tumorales. L'expression de la Midkine a été évaluée dans les cellules C1R-A2, DLD-I et Hep G2 par cytométrie de flux, à l'aide d'un anticorps anti-Midkine. Surface grise: contrôle négatif. Aire sous le trait noir: expression naturelle de la Midkine. Surface noire: expression de la Midkine après transfection des cellules par un plasmide d'expression de la Midkine.
- la figure 6 illustre la reconnaissance des lignées tumorales par les lymphocytes T CD8+ spécifiques des peptides de la Midkine. La reconnaissance des tumeurs a été testée par Elispot IFN-γ, à l'aide de cellules HLA-A2"1" CIR-A2 (MDK"), DLD-I (MDK") et Hep G2 (MDK+). Les cellules marquées d'une étoile ont été cultivées en présence d'IFN-γ.
- la figure 7 illustre la détection de lymphocytes T CD8+ spécifiques de la Midkine par marquage avec des tétramères spécifiques. Les lignées de lymphocytes T 314.7 (A et C) et 314.28 (B et D) sont spécifiques respectivement des peptides MDK 114-122 et MDK 13-21. Chaque lignée a été marquée au moyen d'un anticorps anti-CD8 et des tétramères HLA-A2 / MDKl 14-122 (A et B) et HLA-A2 / MDK13- 21 (C et D) et analysée par cytométrie de flux. Le pourcentage de chaque population de cellules est indiqué dans chaque quadrant.
- la figure 8 illustre la restriction à HLA II des lymphocytes T CD4+ spécifiques du peptide 9-23 de la Midkine. La restriction a été évaluée par Elispot IFN-γ, à l'aide de cellules L transfectées par une molécule HLA II (HLA-DR7, -DRl 1, -DRl 5, -DRB5) et chargées par le peptide 9-23.
- la figure 9 illustre la mise en évidence de la reconnaissance de lysats de tumeur par la lignée T 331.24 de lymphocytes T CD4+ spécifiques du peptide 9-23 de la Midkine. La reconnaissance des tumeurs a été testée par Elispot IFN-γ, à l'aide de cellules HeLa (MDK"), HeLa-pMDK (MDK+) et Hep G2 (MDK+). Exemple 1 : Induction d'une réponse T CD8+ spécifique de peptides de la protéine Midkine
1) Matériels et méthodes a) Peptides
Sept peptides représentant des épitopes T CD8+ potentiels restreints à la molécule HLA-A2, Pallèle HLA de classe I le plus représenté dans la population Caucasienne, ont été sélectionnés à l'aide du programme BIMAS (http://www- bimas.cit.nih.gov). Les séquences des peptides sélectionnés sont présentées dans le Tableau IV et la liste de séquences jointe en annexe.
Tableau IV: Liste des peptides sélectionnés
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Les peptides ont été synthétisés selon la stratégie Fmoc en synthèse parallèle sur phase solide, purifiés par HPLC et contrôlés par spectrométrie de masse (ES-MS). b) Obtention de lignées de lymphocytes T CD8+ spécifiques de peptides de la Midkine et restreintes à HLA- A2
Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de sujets sains possédant la molécule HLA-A2 ont été séparées sur un gradient de Ficoll. Les PBMCs ont ensuite été mises en culture dans du milieu AIM V (LIFE TECHNOLOGIES) et incubées pendant une nuit à 37°C, en présence de 5% CO2/95% air. Les lymphocytes T CD8+ ont été purifiés à partir des cellules non adhérentes par tri immunomagnétique et congelés. Les cellules adhérentes ont été différenciées en cellules dendritiques immatures par 5 jours de culture dans du milieu AIM V contenant lOOOU/ml de GM-CSF et lOOOU/ml d'IL-4 puis en cellules dendritiques matures par 2 jours de culture en présence de 1 μg/ml de LPS, 1000 U/ml d'IL-4 et 1000 U/ml de GM-CSF. Les cellules dendritiques matures ont été incubées en présence de 5 μg/ml de beta-2-microglobuline et 10 μg/ml de chacun des peptides du Tableau IV. Apres 4 heures, les cellules ont été lavées puis mises en culture dans des plaques en 96 puits, en présence de lymphocyte T CD8 purifiés, dans du milieu IMDM contenant 10 % de sérum humain de groupe AB, de l'IL-6 (lOOOU/mL) et de PIL-12 (5 ng/mL). Chaque semaine, la culture a été re-stimulée par des cellules dendritiques matures, autologues et chargées avec le mélange de peptides précité, dans du milieu contenant 20 U/mL d'IL-2 et 10 ng/mL d'IL-7. Apres 4 semaines de culture, la spécificité des lignées de cellules T contenues dans chaque puits a été testée par Elispot IFNγ. c*) Présentation de la protéine Midkine aux lymphocytes T CD8+ spécifiques des peptides de la Midkine
Les lignées de lymphocytes T CD8+ spécifiques du peptide ont été cultivées en présence de cellules C1R-A2 transfectées avec un plasmide pcDNA3.1 (IN VITROGEN) recombinant comprenant la séquence codante de la Midkine sous le contrôle du promoteur CMV et du signal de polyadénylation de l'hormone de croissance bovine. L'activation des lymphocytes T CD8+ par ces cellules C1R-A2 transfectées a été évaluée par ELISPOT comme précisé ci-dessous. d) Reconnaissance de cellules tumorales par les lymphocytes T CD8+ spécifiques des peptides de la Midkine
Les lignées de lymphocytes T CD8+ spécifiques du peptide ont été cultivées en présence de différentes lignées tumorales : DLD-I (ATCC® # CCL-221) et Hep G2 (ATCC® # HB-8065). L'activation des lymphocytes T CD8+ par ces cellules tumorales a été évaluée par ELISPOT comme précisé ci-dessous. e) ELISPOT
Des anticorps anti-IFN-γ (1-D1K, MABTECH) dilués à 2,5 μg/ml dans du tampon PBS ont été adsorbés sur des plaques de nitrocellulose (MILLIPORE) pendant 1 heure à 37°C. Les plaques ont ensuite été lavées avec du PBS puis saturées avec du milieu ISCOVE contenant 10 % de sérum humain du groupe AB (100 μl/puits), pendant 2 h à 37 °C.
Les cellules présentatrices d'antigène sont, soit des cellules de lignée ClR de cellules lymphoblastoïdes B (Hogan et ai, J. Immunol., 1988, 141, 2519-), dépourvues de molécules HLA-A et HLA-B, transfectées avec l'ADNc codant pour HLA-A2 (C1R-A2) et chargées avec un seul peptide (10 μg de peptide) ou le mélange de peptides (10 μg de chaque peptide), soit des cellules C1R-A2 transfectées avec un plasmide d'expression de la Midkine, ou bien encore des cellules tumorales exprimant la Midkine.
Pour vérifier la spécificité des lignées vis-à-vis de la molécule HLA-A2, les cellules ClR transfectées avec HLA-A2 (30 000 cellules/puits) et 5000 lymphocytes à tester ont ensuite été ajoutés dans les plaques et incubées 24 h à 37°C, en présence ou en l'absence d'un seul peptide (10 μg de peptide) ou d'un mélange de peptides (10 μg de chaque peptide). Pour les analyses dose-réponse, les peptides sont utilisées à différentes concentration variant de 0,001 à 10 μg/mL. Pour analyser la reconnaissance par les lymphocytes T CD8+ spécifiques de peptides, des cellules exprimant HLA-A2 transfectées par la Midkine, les cellules ClR transfectées avec HLA-A2 et avec un plasmide d'expression de la Midkine (30 000 cellules/puits) et 5000 lymphocytes à tester ont ensuite été ajoutés dans les plaques et incubées 24 h à 37°C. Pour analyser la reconnaissance des cellules tumorales exprimant la
Midkine par les lymphocytes T CD8+ spécifiques de peptides, les cellules tumorales (30 000 cellules/puits) et 5000 lymphocytes à tester ont ensuite été ajoutés dans les plaques et incubées 24 h à 37°C.
Après trois lavages successifs avec de l'eau, du tampon PBS Tween 0,05%, et du PBS seul, 100 μl d'anticorps secondaire anti-IFN-γ biotinylé (7-B6-1- biotin, MABTECH), dilué à 0,25 μg/ml dans du PBS contenant 1% BSA, a été ajouté dans chaque puits. Après une heure d'incubation à température ambiante, les plaques ont été lavées à nouveau puis incubées pendant une heure à température ambiante avec 100 μl/puits d'Extravidin-AKP (E-2636, SIGMA,), diluée au 1/6000. Après lavage des plaques en tampon PBS, 100 μl de substrat NBT/BCIP (B-5655, SIGMA) dilué dans de l'eau (1 tablette dans 10 ml d'eau) ont été distribués dans chaque puits. La révélation immunoenzymatique a été arrêtée après environ 10 minutes, par rinçage extensif des plaques dans l'eau. Après séchage des plaques, les spots colorés ont été comptés à l'aide d'un lecteur automatique (AID). Les lignées sont considérées posi- tives lorsque le nombre de spots est supérieur à trois fois celui obtenu avec le témoin négatif (témoin sans peptides) avec un minimum de 50 spots. Le témoin sans cellules présentatrices permet de vérifier la spécificité de la réponse pour HLA-A2 (témoin de restriction).
2) Résultats
La capacité de la protéine Midkine à induire une réponse immunitaire cellulaire spécifique de cellules tumorales a été évaluée. Pour ce faire, des épitopes T CD8+ restreints à la molécule HLA-A2, la molécule HLA I la plus fréquente dans la population Caucasienne, ont tout d'abord été identifiés dans la séquence de la Midkine. Ensuite, la capacité des cellules T CD8+ induites par ces épitopes à reconnaître sélectivement une lignée tumorale exprimant la Midkine a été analysée. Les peptides synthétisés ont été testés pour leur capacité à induire une Λ réponse in vitro à partir de cellules collectées chez des sujets sains possédant la molécule HLA- A2. Six de ces peptides ont induit des lymphocytes T CD8+: MDK 13-21, MDK 13-22, MDK 12-21, MDK 14-22, MDK 113-122 et MDK 114-122. Comme le montre la figure 2, la lignée de lymphocytes T CD8+ 267.29A est spécifique des peptides 12-21, 13-21, 13-22. La lignée 278.1 IA est spécifique des peptides 13-21, 13-22 et 14-22. La lignée 314.28 est spécifique de peptide 114-122 et dans une moindre mesure du peptide 113-122. Les peptides 12-21, 13-21, 13-22, 14-22, 113- 122 et 114-122 sont donc immunogènes et induisent des lymphocytes T CD8+ chez des donneurs sains HLA- A2+. La restriction des lignées de lymphocytes T CD8+ spécifiques de peptides par la molécule HLA- A2 est montrée à la figure 3. Seules les cellules HLA- A2 (C1R-A2) peuvent présenter les peptides aux lignées de lymphocytes T spécifiques. Les cellules ClR (HLA- A2") ne les stimulent pas, même en présence des peptides. Afin de vérifier que les cellules présentatrices étaient capables d'apprêter correctement la Midkine, les cellules C1R-A2 ont été transfectées avec un plasmide pcDNA3.1 recombinant comprenant la séquence codante de la Midkine. La figure 4 montre que les lignées de lymphocytes T CD8+ 278.1 IA (spécifique des peptides 13-22 et 14-22), 297.58 (spécifique des peptides 12-21, 13-21 et 14-22) et 314.48 (spécifique du peptide 114-122) sont activées par les cellules transfectées et par les cellules CIR-A2 chargées par les peptides mais pas par les cellules non transfectées. La reconnaissance de lignées tumorale exprimant ou n'exprimant pas la Midkine par les lymphocytes T CD8+ spécifiques des peptides de Midkine a également été étudiée. La figure 6 montre l'expression ou non de la Midkine par les différentes lignées. Sur la figure 7, on observe que les lignées de lymphocytes T CD8+ 267..29 A (spécifique des peptides 13-22, 12-22 et 13-21), 278.1 IA (spécifique des peptides 13-22 et 14-22), et 314.48 (spécifique du peptide 114-122) reconnaissent les cellules Hep G2 qui exprime naturellement la Midkine mais pas les cellules ClR- A2 et DLD-I qui n'expriment pas la Midkine. La reconnaissance est légèrement meilleure lorsque les cellules Hep G2 sont cultivée en présence d'IFN-γ, du fait de l'augmentation de l'expression des molécules HLA sur les cellules. La lignée 297.58 (spécifique des peptides 12-21, 13-21 et 14-22) reconnaît les cellules Hep G2 uniquement lorsqu'elles sont cultivées en présence d'IFN-γ.
L'ensemble de ces résultats montrent que la Midkine contient six peptides répartis en deux groupes de peptides chevauchants capables d'induire une activation de lymphocytes T CD8+ restreints à HLA-A2 et qui reconnaissent sélectivement des cellules tumorales exprimant la Midkine.
Exemple 2: Détection de lymphocytes T CD8+ spécifiques de peptides de la Midkine par marquage avec des tétramères spécifiques
Chaque lignée de lymphocytes (500 000 cellules) obtenue à l'exemple 1 a été marquée pendant 1 heure à l'obscurité et à 4°C, avec 50 μg/mL de tétramère dans 200 μL de PBS 2% SVF. Ces tétramères sont des molécules HLA-A2 chargées par le peptide 13-21 ou 114-122, biotinylées et complexées à de la strepta- vidine marquée à la phycoérythrine, préparées selon la technique précédemment décrite dans NOVAK et al. (J. Clin. Investig., 1999, 104, R63-R67) ou dans KURODA et al. (J. Virol., 2000, 74, 18, 8751-8756). Les cellules ont ensuite été lavées 2 fois en PBS puis marquées pendant 30 min à 4°C à l'aide d'un anticorps anti- CD8 FITC (BD BIOSCIENCES). Après un lavage en PBS, les cellules ont été fixées à l'aide de 50 μL de PBS contenant 1 % de paraformaldehyde (PAF). Les marquages ont été analysés sur un cytomètre de flux FACSCalibur (BD BIOSCIENCES). Les résultats sont présentés à la figure 7. Exemple 3 : Induction d'une réponse T CD4+ spécifique de peptides de Ia protéine Midkine 1) Matériels et méthodes a) Peptides
Des peptides de 15 acides aminés (15-mères) couvrant la totalité de la séquence de la Midkine humaine (SWISSPROT P21741, SEQ ID NO : 2 et figure 1) ont été sélectionnés en fonction de la présence de résidus aromatiques ou hydro- phobes en position 3 ou 4, pour l'ancrage dans la poche P 1 des molécules HLA-DR et HLA-DP4.
Les séquences des peptides sélectionnés sont présentées dans le Tableau V et la liste de séquences jointe en annexe.
Les peptides ont été synthétisés selon la stratégie Fmoc en synthèse parallèle sur phase solide, purifiés par HPLC et contrôlés par spectrométrie de masse (ES-MS).
Tableau V: Peptides sélectionnés (SEQ ID NO: 9, 10, 13-15 et 18-30)
Peptide Positions* Séquence
MDK1 MDK 1-15 M Q H R G F L L L T L L A L L
MDK2 MDK4-18 R G F L L L T L L A L L A L T
MDK3 MDK 9-23 L T L L A L L A L T S A V A K
MDK4 MDK14-28 L L A L T S A V A K K K D K V
MDK5 MDK 18-32 T S A V A K K K D K V K K G G
MDK6 MDK 25-39 K D K V K K G G P G s E C A E
MDK7 MDK 38-52 A E W A W G P C T P s S K D C
MDK8 MDK 52-64 C G V G F R E G T C G A Q T Q
MDK9 MDK 64-78 Q T Q R I R C R V P C N W K K
MDK10 MDK 70-84 C R V P C N W K K E F G A D C
MDK11 MDK 74-88 C N W K K E F G A D C K Y K F
MDK12 MDK 78-92 K E F G A D C K Y K F E N W G
MDK13 MDK 84-98 C K Y K F E N W G A C 0 G G T
MDKH MDK 89-103 E N W G A C D G G T G T K V R
MDK15 MDK 99-113 G T K V R Q G T L K K A R Y N
MDK16 MDK 105-119 G T L K K A R Y N A Q C Q E T
MDK17 MDK 110-124 A R Y N A Q C Q E T I R V T K
MDK18 MDK 119-133 E T I R V T K P C T P K T K A
* les positions sont numérotées en référence à la séquence du précurseur de la Midkine humaine de 143 acides aminés (SwissProt P21741, figure 1 et SEQ ID NO: 2). b) Test de liaison HLA H/peptide
Les tests de liaison aux molécules HLA II sont des tests de liaison en compétition avec une révélation immuno-enzymatique, tels que décrits dans le brevet américain US 6,649,166 et la Demande Internationale PCT WO 03/040299, respectivement pour les molécules HLA-DR et HLA-DP4. La mise ne œuvre de ces tests pour mesurer l'activité de liaison de peptides issus de différents antigènes, est illustrée dans le brevet américain US 6,649,166 et les Demandes Internationale PCT WO 02/090382, WO 03/040299 et WO 2004/014936.
De manière plus précise, les peptides : HA 306-318 (PKYVKQNTLKLAT, SEQ ID NO: 31), A3 152-166 (EAEQLRA YLDGTGVE, SEQ ID NO: 32), MT 2-16 (AKTIAYDEEARRGLE, SEQ ID NO: 33), Bl 21-36 (TERVRLVTRHIYNREE, SEQ ID NO: 34) YKL (AAYAAAKAAALAA, SEQ ID NO: 35), LOL 191-210 (ESWGAVWRIDTPDKLTGPFT, SEQ ID NO: 36), Oxy 271- 287 (EKKYFAATQFEPLAARL, SEQ ID NO: 37) et E2/E168 (AGDLLAIETDKATI SEQ ID NO : 38), biotinylés au niveau du résidu NH2 terminal, selon le protocole décrit dans Texier et al, J. Immunol., 2000, 164, 3177-3184), sont utilisés comme traceur dans les conditions telles que précisées dans le ci-après.
TABLEAU VI : Conditions des tests de liaison aux molécules HLA II
Figure imgf000037_0001
La sensibilité de chaque test est reflétée par les IC observées avec les peptides non-biotinylés qui correspondent aux traceurs. La concentrations (nM) de peptide compétiteur qui inhibe 50% de la liaison maximale du peptide traceur bioti- nylé (IC50) a été calculée pour chaque peptide. Les résultats sont exprimés sous la forme d'activité relative (rapport de l'ICso du peptide compétiteur sur celle du peptide de référence (peptides non-biotinylé qui correspond au traceur). Une activité relative inférieure à 100 caractérise les peptides actifs. c) Obtention de lignées de lymphocytes T CD4+ spécifiques de peptides de la Midkine et restreintes aux molécules HLA II prépondérantes Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) d'individus sains dont le génotype HLA-DR et HLA-DP a été préalablement déterminé par SSP, à l'aide du kit OLERUP SSP™ HLA-DPBl et HLA-DRBl, ont été séparées sur un gradient de Ficoll. Les PBMCs ont ensuite été mises en culture dans du milieu AIM V (LIFE TECHNOLOGIES) et incubées dans des flasques, à l'étuve à 37°C en présence de 5% CO2/95 % air. Après une nuit d'incubation, les cellules non adhérentes ont été récupérées, puis les lymphocytes T CD4+ ont été purifiées à l'aide d'anticorps anti- CD4 couplés à des billes magnétiques (kit MYLTENYI BIOTEC), et congelés. Les cellules adhérentes ont été incubées pendant 5 jours, dans du milieu AIM V contenant 1000 U/ml de GM-CSF et 1000 U/ml d'IL-4, puis les cellules différenciées en cellules dendritiques (cellules dendritiques immatures) ont ensuite été cultivées pendant 2 jours, en présence de 1 μg/ml de LPS, 1000 U/ml d'IL-4 et 1000 U/ml de GM-CSF, de manière à induire leur maturation.
Les cellules dendritiques matures (100 000 cellules/puits) ont alors été incubées avec un mélange de peptides (10 μg de chaque peptide dans du milieu IMDN (INVITROGEN) supplémenté avec de la glutamine (24 mM, SIGMA), de l'asparagine (55 mM, SIGMA), de l'arginine (150 mM, SIGMA), de Ia pénicilline (50UI/ml, INVITROGEN), de la streptomycine (50 mg/ml, INVITROGEN) et 10 % de sérum humain)), pendant 4 heures à 37°C. Les cellules dendritiques matures ont ensuite été lavées puis incubées, en présence des lymphocytes T CD4+ (100 000 cellules/puits) préalablement décongelés, dans du milieu contenant 1000 U/ml d'IL-6 et 10 ng/ml d'IL-12. Après 7 jours (J7), la culture a été stimulée une première fois, au moyen de cellules dendritiques matures préalablement décongelées et chargées par deux mélanges de peptides couvrant l'intégralité de la séquence de la Midkine (mélange des peptides MDKl à MDK9 puis mélange des peptides MDK 1 à MDKl 8), dans du milieu contenant de l'IL-2 (10 U/ml) et de l'IL-7 (5 ng/ml). Après trois stimulations supplémentaires (Jl 4, J21, J28) au moyen de cellules dendritiques chargées, dans du milieu contenant uniquement de l'IL-7 (5 ng/ml), les cellules ont été testées en ELISPOT, 6 jours au moins après la dernière stimulation. d) ELISPOT
Des anticorps anti-IFN-γ (1-D1K, MABTECH) dilués à 2,5 μg/ml dans du tampon PBS ont été adsorbés sur des plaques de nitrocellulose (MILLIPORE) pendant 1 heure à 37°C. Les plaques ont ensuite été lavées avec du PBS puis saturées avec du milieu ISCOVE contenant 10 % de sérum humain du groupe AB (100 μl/puits), pendant 2 h à 37 °C. Les cellules présentatrices d'antigène sont, soit des cellules dendritiques autologues immatures préparées comme précisé ci-dessus, soit une lignée de fibroblastes de souris (lignée L), transfectée avec l'ADNc codant pour l'une des molécules HLA-DR ou HLA-DP4 à tester (Yu et al, Hum. Immunol., 1990, 27, 132-135), de façon à vérifier la spécificité des lignées vis-à-vis des molécules HLA-DR et HLA-DP4. Les cellules dendritiques (105 cellules/puits) ou des cellules L transfectées par l'une des molécules HLA-DR ou HLA-DP4 (30 000 cellules/puits) et 5000 lymphocytes à tester ont ensuite été ajoutés dans les plaques et incubées 24 h à 37°C, en présence ou en l'absence d'un seul peptide (10 μg) ou d'un mélange de peptides (10 μg de chaque peptide). Après trois lavages successifs avec de l'eau, du tampon PBS Tween 0,05%, et du PBS seul, 100 μl d'anticorps secondaire anti-IFN- γ conjugué à la biotine (7-B6-l-biotin, MABTECH), dilué à 0,25 μg/ml dans du PBS contenant 1% BSA, a été ajouté dans chaque puits. Après une heure d'incubation, les plaques ont été lavées à nouveau et incubées avec 100 μl/puits d'Extravidin-AKP (E- 2636, SIGMA,), diluée au 1/6000. Après lavage des plaques en tampon PBS, 100 μl de substrat NBT/BCIP (B-5655, SIGMA) dilué dans de l'eau (1 tablette dans 10 ml d'eau) ont été distribués dans chaque puits. La révélation immunoenzymatique a été arrêtée après environ 10 minutes, par rinçage extensif des plaques dans l'eau, et les spots colorés ont été comptés à l'aide d'un lecteur automatique (AID). Les lignées sont considérées positives lorsque le nombre de spots est supérieur à trois fois celui obtenu avec le témoin négatif (témoin sans peptides) avec un minimum de 50 spots.
Le témoin sans cellules présentatrices permet de vérifier la spécificité de la réponse pour HLA-DR ou HLA-DP4 (témoin de restriction). e) Reconnaissance de cellules tumorales par les lymphocytes T CD4"1" spécifiques des peptides de la Midkine
Les lignées tumorales testées sont la lignée Hep G2 qui exprime la
Midkine, la lignée tumorale HeIa qui n'exprime pas la Midkine et la lignée HeIa- pMDK qui correspond aux cellules HeLa transfectées transitoirement par un plasmide d'expression de la Midkine tel que décrit à l'exemple 1. Les cellules collectées ont été lysées par des cycles de congélation/ décongélation. La lignée 331.24 de lymphocytes
T CD4+ spécifiques du peptide 9-23 de la Midkine a été incubée en présence de cellules dendritiques préalablement chargées par les lysats de lignées tumorales et son activation a été évaluée par Elispot comme précisé ci-dessus.
2) Résultats a) Activité de liaison des peptides de la Midkine vis-à-vis des molécules HLA II
La plupart des sites de liaison aux molécules HLA de classe II se situent dans la partie N-terminale de la Midkine, c'est-à-dire dans le peptide signal (1-
22; Tableau VII).
Figure imgf000040_0001
* les valeurs sont les moyennes d'au moins deux expériences indépendantes. Les peptides de la région N-terminale ont une bonne affinité pour au moins 4 molécules HLA II molécules. En particulier, le peptide 9-23 se lie à 8 molécules HLA II différentes avec des affinités relatives traduisant souvent une haute affinité (activité relative inférieure à 10). D'autres peptides se lient également à plusieurs molécules HLA II tels que les peptides 1-15, 4-18, 14-28.
En revanche, les peptides issus du reste de la séquence ne présentent pas d'activité de liaison significative pour au moins quatre molécules HLA II prépondérantes dans la population caucasienne, à l'exception d'un peptide de la région C- terminale (110-124) qui se lie avec une bonne affinité à quatre molécules HLA II. b) Induction d'une réponse T CD4+ spécifique par les peptides de la Midkine
La capacité des peptides de la Midkine à induire in vitro une stimulation de lymphocytes T CD4+ spécifiques, a été évaluée à partir de prélèvements sanguins d'individus sains (non porteurs de tumeur). Il s'agit d'évaluer la capacité à recruter des lymphocytes précurseurs CD4+ alors qu'ils sont chez un individu naïf à une très faible fréquence, c'est-à-dire d'effectuer une immunisation in vitro au moyen de ces peptides.
Les lignées de lymphocytes T CD4+ 331.16, 331.24 et 343.1 ont été obtenues par stimulation in vitro de lymphocytes T au moyen de cellules dendritiques autologues matures chargés par deux pools de peptides couvrant l'intégralité de la séquence de la Midkine. L'étude de leur spécificité a été faite par Elispot IFN-γ et a montré que les trois lignées étaient spécifiques du peptide 9-23. Chaque lignée a été testée par Elispot IFN-γ pour sa capacité à être stimulée par des cellules L transfectées par une molécule HLA-DR ou HLA-D P4 et chargées par le peptide 9-23. La figure 8 montre que le peptide 9-23 peut être présenté par la molécule DR7 aux lignées du donneur 331 (331. 16 et 331.24) et que la lignée 343.1 est restreinte à DRl 1 mais pas à DR15 et DRB5.
La lignée de lymphocytes T CD4+ 331.24 a été incubée en présence de cellules dendritiques préalablement chargées par les lysats de lignées tumorales et son activation a été évaluée par Elispot IFN-γ. La figure 9 montre que la lignée 331.24 est stimulée par des cellules dendritiques chargées par le lysat de cellules HeIa transfectées mais pas par les cellules HeIa non transfectées. Ceci confirme la spécificité de la lignée de lymphocytes T 331.24 et sa capacité à reconnaître la Midkine présente dans le lysat de cellules transfectée. Elle reconnaît également la Midkine produite naturellement par lignée tumorale Hep G2.
L'ensemble des résultats montre que le peptide 9-23 se lie à 8 molécules HLA II différentes et induit une réponse T CD4+ spécifique in vitro qui est restreinte à des molécules HLA de classe II différentes. De plus les cellules T CD4+ induites contre ce peptide peuvent reconnaître des lysats de tumeurs exprimant la Midkine et présentés par des cellules dendritiques. Comme ce peptide se chevauche avec le peptide signal (1-22), on peut déduire de ces expériences que le peptide 9-22 comporte également des épitopes T CD4+ dans la mesure où le peptide signal de la Midkine est clivé dans la cellule entre les acides aminés 22 et 23. Il est intéressant de noter que les peptides 9-23 et 9-22 incluent les peptides 12-21, 13-21, 13-22 et 14-22 qui comportent des épitopes T CD8+. Les peptides 9-23 et 9-22 peuvent donc induire des réponses T CD4+ et T CD8+ spécifiques de tumeurs exprimant la Midkine.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1 °) Utilisation d'un peptide issu de la protéine Midkine comprenant au moins un épitope T CD4+ ou T CD8+ restreint aux molécules HLA prépondérantes dans la population caucasienne ou d'un polynucléotide codant ledit peptide, pour la préparation d'un vaccin anticancéreux.
2°) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit peptide est constitué par la protéine Midkine humaine de séquence SEQ ID NO : 2.
3°) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit peptide est un fragment d'au moins 8 acides aminés de la protéine Midkine compre- nant au moins un épitope T CD8+ restreint à la molécule HLA- A2, lequel peptide comprend au moins les positions 14 à 21 ou 114 à 122 de la séquence en acides aminés de ladite protéine Midkine.
4°) Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit peptide est constitué par les positions 12 à 21, 13 à 21, 13 à 22, 14 à 22, 113 à 122 ou 114 à 122 de la séquence en acides aminés de la protéine Midkine.
5°) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit peptide est un fragment d'au moins 8 acides aminés de la Midkine comprenant au moins un épitope T CD4+ restreint à au moins quatre molécules HLA II différentes prépondérantes dans la population caucasienne, lequel peptide comprend au moins les positions 9 à 15, 14 à 28 ou 110 à 124 de la séquence en acides aminés de ladite protéine Midkine.
6°) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que ledit peptide est constitué par les positions 1 à 15, 4 à 18 ou 14 à 28 de la séquence en acides aminés de ladite protéine Midkine. 7°) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1, 3 et 5, caractérisée en ce que ledit peptide comprend au moins un épitope T CD8+ restreint à la molécule HLA-A2 et au moins un épitope T CD4+ restreint à au moins quatre molécules HLA II différentes prépondérantes dans la population caucasienne, lequel peptide est constitué par les positions 9 à 21, 9 à 22, 9 à 23 ou 110 à 124 de la séquence en acides aminés de ladite protéine Midkine.
8°) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que ledit peptide est un peptide multi-épitopique comprenant la concaténation d'au moins deux épitopes identiques ou différents dont l'un au moins est un épitope T CD4+ et/ou T CD8+ de la Midkine tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 7.
9°) Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que ledit peptide multi-épitopique comprend un épitope T CD4+ ou T CD8+ d'un autre antigène tumoral.
10°) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que ledit peptide est fusionné à une protéine ou un fragment de protéine hétérologue. 11°) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que ledit peptide est un lipopeptide.
12°) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit polynucléotide code pour un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 2 à 10. 13°) Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que ledit polynucléotide est inséré dans un vecteur d'expression.
14°) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que ledit vaccin comprend un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une substance porteuse et/ou un adjuvant. 15°) Utilisation d'un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 10 pour la préparation d'un réactif d'immunomonitoring de la réponse cellulaire contre la Midkine, destiné à l'évaluation du pronostic ou au suivi du traitement d'un cancer.
16°) Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que ledit peptide est sous la forme de tétramères de complexes molécule HLA/peptide, marqués.
17°) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisée en ce que le cancer est sélectionné dans le groupe constitué par: les cancers de l'œsophage, de l'estomac, du colon, du pancréas, de la thyroïde, des poumons, du sein, de la vessie, de l'utérus, de l'ovaire, de la prostate, les carcinomes hépatocellulaires, les ostéosarcomes, les neuroblastomes, les glioblastomes, les astro- cytomes, les leucémies et les tumeurs de WiIm. 18°) Composition vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 3 à 11 ou un vecteur tel que défini à la revendication 13, et un véhicule pharmaceutiquement acceptable, une substance porteuse ou un adjuvant. 19°) Méthode in vitro, d'immunomonitoring de la réponse cellulaire contre la Midkine chez un individu présentant un cancer, caractérisée en ce qu'elle comprend :
- la mise en contact d'un échantillon biologique dudit individu avec un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 10 et 16, et - la détection de lymphocytes T CD4+ et/ou T CD8+ spécifiques de la Midkine, par tout moyen approprié.
20°) Kit d'immunomonitoring de la réponse cellulaire contre la Midkine, caractérisé en ce qu'il comprend un peptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 10 et 16. 21°) Peptide issu de la Midkine tel que défini à l'une quelconque des revendications 3 à 11.
22°) Polynucléotide codant le peptide selon la revendication 21. 23°) Vecteur d'expression comprenant le polynucléotide selon la revendication 22. 24°) Cellule hôte modifiée par le polynucléotide selon la revendication 22 ou le vecteur selon la revendication 23.
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