WO2010050516A1 - Ｌ－アミノ酸の製造方法 - Google Patents

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陶三 西山
直明 田岡
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Definitions

  • the present invention combines 1) the reaction of racemizing an N-succinyl amino acid with an N-acylamino acid racemase, and 2) the reaction of specifically hydrolyzing an N-succinyl-L-amino acid with an L-succinylase.
  • the present invention relates to a method for efficiently producing an L-amino acid from an enantiomeric mixture of N-succinyl amino acids.
  • Optically active amino acids particularly optically active unnatural amino acids are useful compounds as synthetic raw materials and intermediates for agricultural chemicals, pharmaceuticals and the like. How to efficiently produce optically active amino acids, particularly unnatural amino acids, is an important industrial issue.
  • racemic N-acetylamino acid is used as a raw material, and D-aminoacylase or L-aminoacylase is used to optically resolve the D-form or L-form to obtain an amino acid with high optical purity.
  • D-aminoacylase or L-aminoacylase is used to optically resolve the D-form or L-form to obtain an amino acid with high optical purity.
  • pattern document 1 There is a method to acquire (patent document 1). In this method, the maximum yield of optically active amino acid is 50%, and half of the racemate is wasted. Thus, attempts have been made to improve the yield by combining aminoacylase with N-acylamino acid racemase that racemizes the remaining N-acetylamino acid.
  • N-acylamino acid racemase has low reactivity with N-acylamino acids (Non-Patent Documents 1 and 2 and Patent Document 6). Have also been reported to be more reactive with N-succinylamino acids (Non-patent Documents 1 and 2 and Patent Document 6). Furthermore, it has also been reported that L-succinylase acts on the N-succinyl form of natural L-amino acids (Non-patent Documents 1 and 2 and Patent Document 6). However, there is no known method for efficiently producing L-amino acids from an enantiomeric mixture of N-succinyl-amino acids by combining N-acylamino acid racemase and L-succinylase.
  • R 1 may have a substituent, an alkyl group having 5 to 20 carbon atoms, an optionally substituted alkenyl group having 5 to 20 carbon atoms, or a substituent.
  • the N-succinyl amino acid represented by the above formula or a salt thereof has not been known so far.
  • JP 2006-254789 A Japanese Patent Laid-Open No. 2001-46088 JP 2001-314191 A Japanese Patent Laid-Open No. 2002-238581 JP 2007-82534 A JP 2008-61642 A
  • An object of the present invention is to provide an L-amino acid production method that is more efficient than the conventional method.
  • the present inventors have conducted a reaction of racemizing N-succinylamino acid using N-acylamino acid racemase, and N-succinyl-L-amino acid using L-succinylase.
  • the present inventors have found that the reactivity can be improved by precipitating the produced amino acid out of the reaction system during the reaction in which the reaction of specifically hydrolyzing is combined, and the present invention has been completed.
  • the present invention relates to a method for producing an L-amino acid by allowing an L-succinylase to act on an enantiomeric mixture of N-succinylamino acids, wherein the produced L-amino acid is precipitated in the presence of N-acylamino acid racemase.
  • the dissolution concentration of the L-amino acid is preferably 1% by weight or less.
  • the substrate N-succinylamino acid is represented by the general formula (I);
  • R may have an optionally substituted alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, an optionally substituted alkenyl group having 2 to 20 carbon atoms, or an optionally substituted group.
  • the produced L-amino acid is represented by the general formula (II);
  • R in the above formulas (I) and (II) is a 4-bromobenzyl group, a 3-fluorobenzyl group, a naphthylmethyl group, an indanyl group, or a 6-heptenyl group.
  • a transformant transformed with a vector containing a DNA encoding N-acylamino acid racemase and a DNA encoding L-succinylase as N-acylamino acid racemase and L-succinylase is used. use.
  • the present invention also relates to a general formula (III);
  • R 1 may have a substituent, an alkyl group having 5 to 20 carbon atoms, an optionally substituted alkenyl group having 5 to 20 carbon atoms, or a substituent.
  • R in the above formula (III) is a 4-bromobenzyl group, a 3-fluorobenzyl group, a 2-naphthylmethyl group, a 2-indanyl group, or a 6-heptenyl group.
  • the “enantiomeric mixture” of the present invention is a mixture of L-form and D-form containing D-form in a range of more than 0% to less than 100%.
  • the N-succinyl amino acid that is the raw material of the present invention has the general formula (I);
  • R has an optionally substituted alkyl group having 1 to 20 carbon atoms, an optionally substituted alkenyl group having 2 to 20 carbon atoms, and a substituent.
  • the alkyl group having 1 to 20 carbon atoms may be linear or branched.
  • alkenyl group having 2 to 20 carbon atoms include ethenyl group, propenyl group, butenyl group, pentenyl group, hexenyl group, heptenyl group, octenyl group and the like.
  • alkynyl group having 2 to 20 carbon atoms examples include ethynyl group, propynyl group, butynyl group, pentynyl group, hexynyl group, heptynyl group, octynyl group and the like.
  • aryl group having 4 to 20 carbon atoms examples include phenyl group, naphthyl group, anthranyl group, pyridyl group, pyrimidyl group, indanyl group, and indenyl group.
  • Examples of the aralkyl group having 5 to 20 carbon atoms include benzyl group, naphthylmethyl group, anthranylmethyl group, pyridylmethyl group, pyrimidylmethyl group, indanylmethyl group, and indenylmethyl group.
  • the alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, aryl group and aralkyl group may have a substituent, and examples of the substituent include a halogen atom, a hydroxyl group, an amino group, and a nitro group.
  • N-succinyl amino acid represented by the formula (I) include N-succinyl-DL-4-bromophenylalanine, N-succinyl-DL-3-fluorophenylalanine, N-succinyl-DL-2- Examples include naphthylalanine, N-succinyl-DL-2-indanylglycine, N-succinyl-DL-6-heptenylglycine, and the like.
  • the L-succinylase used in the present invention is an enzyme that selectively hydrolyzes (desuccinylates) the succinyl group of the N-succinyl amino acid represented by the general formula (I), and includes N-acyl amino acid racemase and Is an enzyme that racemizes the enantiomer of the N-succinyl amino acid represented by the general formula (I).
  • the enantiomeric mixture of N-succinyl amino acids can be converted into an L-amino acid consisting essentially of a single enantiomer. Furthermore, in a preferred embodiment of the present invention, when the accumulated concentration of L-amino acid after the reaction process or after completion of the reaction is higher than the dissolved concentration, L-amino acid is precipitated out of the reaction system, and the reaction proceeds efficiently.
  • D-succinylase D-form selective desuccinylation
  • an enantiomeric mixture of N-succinyl amino acids consists essentially of a single enantiomer by applying the above principle of the present invention. It can be efficiently converted to D-amino acid.
  • D-aminoacylase is known as an enzyme that selectively hydrolyzes N-succinylamino acid in D form (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-61642), it has not been shown that practical activity has been obtained.
  • the dissolution concentration is the weight percent of amino acids that can be dissolved in the reaction solution after completion of the reaction, and can be measured by the method described below.
  • L-amino acid is added until it is no longer soluble in the reaction solution after completion of the reaction, and then centrifuged.
  • the resulting amino acid in the solution obtained by filtering the supernatant is subjected to quantitative analysis by high performance liquid chromatography and calculated.
  • the weight% of the produced amino acid (including the precipitated produced amino acid and the dissolved produced amino acid) in the reaction solution after completion of the reaction can be measured by the method described below. After the reaction is completed, the reaction solution is sampled uniformly, including the precipitated amino acid, and the precipitated amino acid is solubilized using an appropriate solvent, and the amino acid in the solution is quantitatively analyzed by high performance liquid chromatography. ,calculate.
  • the dissolution concentration is preferably 3% by weight or less, more preferably 1% by weight or less.
  • L-amino acid is produced in excess of the above-mentioned dissolution concentration, L-amino acid is precipitated.
  • the weight percentage of the produced amino acid in the reaction solution after the reaction is high, and preferably more than twice the dissolution concentration. More preferably, it is 5 times or more.
  • the method for producing an L-amino acid of the present invention can be carried out by allowing an enantiomeric mixture of N-succinylamino acid serving as a substrate, L-succinylase and N-acylamino acid racemase to coexist in a suitable solvent.
  • an aqueous solvent may be used, or an aqueous solvent and an organic solvent may be mixed and used.
  • the organic solvent include toluene, ethyl acetate, n-butyl acetate, hexane, isopropanol, diisopropyl ether, methanol, acetone, dimethyl sulfoxide and the like.
  • the reaction is carried out, for example, at a temperature of 10 ° C to 70 ° C, preferably 30 ° C to 55 ° C.
  • the pH of the reaction solution is maintained at, for example, 4 to 10, preferably 6 to 9.
  • the reaction can be carried out in batch mode or continuous mode.
  • the reaction substrate is added at a feed concentration of, for example, 0.1% to 70% (w / v), preferably 3% to 50% (w / v).
  • the L-amino acids produced in the reaction can be isolated and purified by conventional methods.
  • the reaction solution containing the L-amino acid produced by the reaction can be isolated and purified by performing a treatment such as chromatography.
  • the filtrate obtained by removing microbial cells from the reaction solution can be isolated and purified by neutralization crystallization using hydrochloric acid or the like, and the precipitated target product is filtered off.
  • the filtrate which removed the microbial cell from the reaction liquid can also be used for reaction of the next process as it is.
  • the N-acyl amino acid racemase used in the present invention has the ability to racemize the N-succinyl amino acid represented by the formula (I).
  • Such enzymes include, but are not particularly limited, specifically, Geobacillus (Geobacillus) genus and Thermus (Thermus) genus include microbial enzymes from belonging to such, preferably, Geobacillus Kausutofirasu (Geobacillus kaustophilus) , An enzyme derived from microorganisms such as Thermus thermophilus . More preferred are enzymes derived from Geobacillus kaustophilus NBRC102445 and Thermus thermophilus HB8.
  • the gene encoding the amino acid sequence of the N-acyl amino acid racemase derived from Geobacillus kaustophilus NBRC102445 is represented by SEQ ID NO: 2.
  • the L-succinylase used in the present invention has the ability to hydrolyze the L form of the N-succinyl amino acid represented by the formula (I).
  • Such enzymes are not particularly limited, but typical examples include enzymes derived from microorganisms belonging to the genus Geobacillus , and preferably derived from microorganisms such as Geobacillus kaustophilus. It is an enzyme. More preferably, it is an enzyme derived from Geobacillus kaustophilus NBRC102445, and the gene encoding the amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 1.
  • microorganisms are available to those skilled in the art from various depository institutions.
  • the depository organization includes an organization corresponding to a deposit number for identifying each microorganism.
  • the microorganism identified by the NBRC number is available from the Biological Resource Department of the National Institute of Technology and Evaluation, 2-5-8, Kazusa Kamashi, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan. It can also be separated from nature. It is also possible to obtain strains having properties more advantageous for this reaction by causing mutations in these microorganisms.
  • a microorganism culture solution obtained by culturing the above-mentioned microorganism or transformant in an appropriate medium can be used as an enzyme, and a treated product of the culture can also be used.
  • the treated product include a culture supernatant obtained by a collection operation such as centrifugation from a microorganism culture solution, a microorganism cell, a disrupted product of the microorganism, a cell-free extract obtained from the disrupted product, and an immobilized cell And purified purified enzymes, immobilized enzymes, and the like.
  • Examples of the “host” described in the present specification include bacteria, yeasts, filamentous fungi, plant cells, animal cells, and the like, but bacteria are preferable from the introduction and expression efficiency, and Escherichia coli is particularly preferable.
  • a vector containing DNA can be introduced into a host cell by a known method. When Escherichia coli is used as the host cell, the vector can be introduced into the host by using, for example, a commercially available Escherichia coli HB101 competent cell (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • vector described in the present specification is not particularly limited as long as it can express a gene encoded by DNA in an appropriate host.
  • examples of such vectors include plasmid vectors, phage vectors, cosmid vectors, and shuttle vectors that can exchange genes with other host strains can also be used.
  • Such vectors usually contain regulatory elements such as lacUV5 promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lpp promoter, tufB promoter, recA promoter, pL promoter, etc., and an expression unit operably linked to DNA. It can be suitably used as an expression vector.
  • pUCN18 can be preferably used.
  • the plasmid pUCN18 is modified by changing the 185th T of pUC18 (manufactured by Takara Bio Inc., GenBank Accession No. L09136) to A by destroying the NdeI site, and further changing the 471-472th GC to TG. This is a plasmid in which an NdeI site has been newly introduced.
  • the regulatory factor refers to a base sequence having a functional promoter and any associated transcription element (eg, enhancer, CCAAT box, TATA box, SPI site, etc.).
  • operably linked means that a gene is operably linked to various regulatory elements such as promoters and enhancers that regulate the expression of the gene. It is well known to those skilled in the art that the type and kind of the control factor can vary depending on the host.
  • the “transformant” described in the present specification is obtained by incorporating a DNA encoding a polypeptide into a vector and introducing it into a host cell.
  • the “transformant” described in this specification includes not only cultured cells but also processed products thereof.
  • the treated product as used herein means, for example, a cell treated with a surfactant or an organic solvent, a dried cell, a disrupted cell, a crude cell extract or the like, and those immobilized by a known means. To do.
  • the culture of the transformant described in the present specification can be performed using a normal liquid nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, organic nutrients and the like as long as it grows.
  • both a DNA encoding an N-acylamino acid racemase and a DNA encoding an L-succinylase are introduced, and a trait having the activities of both N-acylamino acid racemase and L-succinylase is introduced.
  • a converter can also be used. If such a transformant is used, it is not necessary to prepare N-acylamino acid racemase and L-succinylase separately, and the production method of the present invention can be carried out more easily.
  • the transformant containing both the DNA encoding the N-acylamino acid racemase and the DNA encoding the L-succinylase of the present invention is the same in both the DNA encoding the N-acylamino acid racemase and the DNA encoding the L-succinylase.
  • these two types of DNA are incorporated into two different vectors of different incompatibility groups, and these two types of vectors are introduced into the same host cell. Can also be obtained.
  • Examples of transformants containing both the DNA encoding the N-acyl amino acid racemase and the DNA encoding L-succinylase of the present invention include E. coli HB101 (pNIGHK).
  • % means “% by weight” unless otherwise specified.
  • the recombination vector pNHK was constructed by inserting the second GC into a TG and inserting it between the EcoRI recognition site and the BamHI recognition site downstream of the lac promoter of the plasmid into which the NdeI site was newly introduced.
  • E. E. coli HB101 competent cells Takara Bio Inc.
  • coli HB101 pNHK
  • the obtained transformant was inoculated into 5 ml of 2 ⁇ YT medium (tripton 1.6%, yeast extract 1.0%, NaCl 0.5%, pH 7.0) containing 200 ⁇ g / ml ampicillin at 37 ° C. Cultured with shaking for 24 hours. The cells were collected by centrifugation and suspended in 5 ml of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0). This was crushed using a UH-50 type ultrasonic homogenizer (manufactured by SMT), and then the cell residue was removed by centrifugation to obtain a cell-free extract. The succinylase activity of this cell-free extract was measured, and the expression of 5 U succinylase activity was observed.
  • coli HB101 (pNIG) was obtained.
  • the obtained transformant was inoculated into 5 ml of 2 ⁇ YT medium (tripton 1.6%, yeast extract 1.0%, NaCl 0.5%, pH 7.0) containing 200 ⁇ g / ml ampicillin at 37 ° C. Cultured with shaking for 24 hours. The cells were collected by centrifugation and suspended in 5 ml of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0). This was crushed using a UH-50 type ultrasonic homogenizer (manufactured by SMT), and then the cell residue was removed by centrifugation to obtain a cell-free extract.
  • the cell-free extract was assayed for N-acyl amino acid racemase activity, and the expression of N-acyl amino acid racemase activity 2U was observed.
  • a gene obtained by adding an NdeI recognition site and an EcoRI recognition site to the N-acylamino acid racemase gene (SEQ ID NO: 3) derived from Thermus thermophilus HB8 strain was obtained by PCR using DNA polymerase PrimeSTAR (Takara Shuzo). The DNA fragment obtained by the above PCR was inserted between the NdeI recognition site and EcoRI recognition site downstream of the lac promoter of the plasmid pUCN18 to construct a recombinant vector pNIT. Using the recombinant vector pNIT, E. E.
  • coli HB101 competent cells (Takara Bio Inc.) coli HB101 (pNIT) was obtained.
  • the obtained transformant was inoculated into 5 ml of 2 ⁇ YT medium (tripton 1.6%, yeast extract 1.0%, NaCl 0.5%, pH 7.0) containing 200 ⁇ g / ml ampicillin at 37 ° C. Cultured with shaking for 24 hours.
  • the cells were collected by centrifugation and suspended in 5 ml of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0). This was crushed using a UH-50 type ultrasonic homogenizer (manufactured by SMT), and then the cell residue was removed by centrifugation to obtain a cell-free extract.
  • the cell-free extract was assayed for N-acyl amino acid racemase activity, and expression of N-acyl amino acid racemase activity 1U was observed.
  • the racemase activity of N-acylamino acid racemase was measured by the method described below.
  • the substrate N-acetyl-D-methionine solution 100 ⁇ l (final concentration 20 mM), cobalt chloride aqueous solution 5 ⁇ l (final concentration 1 mM), Tris-HCl (0.5 M / pH 7.5) 50 ⁇ l (final concentration 50 mM), 245 ⁇ l of sterilized distilled water was mixed, and 50 ⁇ l of L-aminoacylase solution (20 mg / ml, N-acetyl-L-methionine produced by racemase is deacylated to produce L-methionine) in this reaction solution, and enzyme solution 50 ⁇ l was added and the reaction was carried out at 30 ° C., and the reaction was stopped by adding 1N HCl at an appropriate time.
  • the produced L-methionine is quantified by high performance liquid chromatography, and the enzyme activity is calculated.
  • the enzyme activity was defined as 1 unit (U) when 1 ⁇ mole of N-acetyl-L-methionine was produced from N-acetyl-D-methionine per minute.
  • Example 1 Production of L-4- bromophenylalanine 2.2 g of DL-4-bromophenylalanine, 0.99 g of succinic anhydride and 20 ml of acetic acid were mixed, reacted at 55 ° C. for 4 h, concentrated and crystallized with ethyl acetate. Analysis was performed to obtain 2.1 g of N-succinyl-DL-4-bromophenylalanine. N- succinyl -DL-4-bromo-phenylalanine substrate solution (pH 8) was prepared and after addition of aqueous solution of cobalt chloride to a final concentration of 1 mM, and cultured in the same manner as in Reference Example 1 and Reference Example 3 E. E.
  • Example 2 Production of L-3 -fluorophenylalanine 2.0 g of DL-3-fluorophenylalanine, 0.99 g of succinic anhydride and 20 ml of acetic acid were mixed, reacted at 55 ° C. for 4 h, concentrated and then crystallized with ethyl acetate. Analysis was performed to obtain 1.9 g of N-succinyl-DL-3-fluorophenylalanine. N- succinyl -DL-3- fluorophenylalanine substrate solution (pH 8) was prepared, after addition of aqueous solution of cobalt chloride to a final concentration of 1 mM, and cultured in the same manner as in Reference Example 1 and Reference Example 3 E. E.
  • N- succinyl -DL-2-naphthylalanine of substrate solution (pH 8) was prepared, after addition of aqueous solution of cobalt chloride to a final concentration of 1 mM, and cultured in the same manner as in Reference Example 1 and Reference Example 3 E. E. coli HB101 (pNHK) and E. When the culture solution of E. coli HB101 (pNIG) was mixed (final substrate concentration was 9% by weight) and the reaction was carried out at 45 ° C., 2-naphthylalanine was precipitated in the reaction solution. After stirring for 20 hours, the conversion rate (mol%) and optical purity (% ee) were determined by analyzing the substrate and product in the reaction solution by high performance liquid chromatography.
  • the optical purity of L-2-naphthylalanine is 100% e.e. e. Met.
  • the accumulated concentration of L-2-naphthylalanine calculated from the conversion rate was 6.2% by weight. Further, when the dissolved concentration of L-2-naphthylalanine was quantitatively analyzed and measured by high performance liquid chromatography, it was 0.2 wt% or less.
  • Example 4 Production of L-2-indanylglycine 2.5 g of DL-2-indanylglycine, 1.44 g of succinic anhydride and 30 ml of acetic acid were mixed, reacted at 55 ° C. for 4 h, concentrated and then ethyl acetate was added. Crystallization of N-succinyl-DL-2-indanylglycine (3.2 g) was obtained. N- succinyl -DL-2-indanylglycine of substrate solution (pH 8) was prepared, after addition of aqueous solution of cobalt chloride to a final concentration of 1 mM, and cultured in the same manner as in Reference Example 11 and Reference Example 3 E. E.
  • Example 5 Production of L-6-heptenylglycine 2.0 g of DL-6-heptenylglycine, 1.29 g of succinic anhydride and 20 ml of acetic acid were mixed, reacted at 55 ° C. for 4 h, concentrated and then ethyl acetate was added. Was obtained, and 1.4 g of N-succinyl-DL-6-heptenylglycine was obtained.
  • N- succinyl -DL-6- heptenyl glycine substrate solution (pH 8) was prepared and after addition of aqueous solution of cobalt chloride to a final concentration of 1 mM, and cultured in the same manner as in Reference Example 1 and Reference Example 3 E. E.
  • the accumulated concentration of L-6-heptenylglycine calculated from the conversion rate was 5.7% by weight. Further, when the dissolved concentration of L-6-heptenylglycine was quantitatively analyzed and measured by high performance liquid chromatography, it was 0.5% by weight or less.
  • the culture solution of E. coli HB101 (pNIG) was mixed (final substrate concentration was 6% by weight), and the reaction was carried out at 45 ° C. After stirring for 21 hours, the conversion rate (mol%) and optical purity (% ee) were determined by analyzing the substrate and product in the reaction solution by high performance liquid chromatography. As a result, the conversion rate was 86. 0.0 mol%, the optical purity of L-phenylalanine is 100% e.e. e. Met. The accumulated concentration of L-phenylalanine calculated from the conversion rate was 3.2% by weight. The dissolved concentration of L-phenylalanine was quantitatively analyzed and measured by high performance liquid chromatography and found to be 4% by weight.
  • Example 6 Preparation of transformant transformed with vector containing L-succinylase and N-acylamino acid racemase gene
  • SEQ ID NO: 1 derived from Geobacillus caustophilus NBRC102445 strain
  • a gene obtained by adding a SacI recognition site and a BamHI recognition site to a gene modified to G was obtained by PCR using DNA polymerase PrimeSTAR (Takara Shuzo).
  • the DNA fragment obtained by the above PCR was inserted between the SacI recognition site and the BamHI recognition site of the plasmid pNIG prepared in Reference Example 3 to construct a recombinant vector pNIGHK.
  • E. E. coli HB101 competent cells manufactured by Takara Bio Inc.
  • E. coli HB101 (pNIGHK) was obtained.
  • the obtained transformant was inoculated into 5 ml of 2 ⁇ YT medium (tripton 1.6%, yeast extract 1.0%, NaCl 0.5%, pH 7.0) containing 200 ⁇ g / ml ampicillin at 37 ° C. Cultured with shaking for 24 hours. The cells were collected by centrifugation and suspended in 5 ml of 100 mM phosphate buffer (pH 7.0).
  • Example 7 Production of L-6-heptenylglycine using a transformant transformed with a vector containing L-succinylase and N-acylamino acid racemase gene N-succinyl-DL in the same manner as in Example 5.
  • a substrate solution (pH 8) of -6-heptenylglycine was prepared, and an aqueous cobalt chloride solution was added to a final concentration of 1 mM, followed by culturing in the same manner as in Example 6 .
  • a culture solution of E. coli HB101 pNIGHK
  • 6-heptenylglycine was precipitated in the reaction solution.
  • the conversion rate (mol%) was determined by analyzing the substrate and product in the reaction solution by high performance liquid chromatography. As a result, the conversion rate was 99.6 mol%. Further, the product was derivatized with di-tert-butyl dicarbonate to N-tert-butoxycarbonyl 6-heptenylglycine, and optical purity (% ee) analysis was performed by high performance liquid chromatography. . e. Met. The accumulated concentration of L-6-heptenylglycine calculated from the conversion rate was 5.7% by weight. Further, when the dissolved concentration of L-6-heptenylglycine was quantitatively analyzed and measured by high performance liquid chromatography, it was 0.5% by weight or less.

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Abstract

　本発明は、アミノ酸のＮ－サクシニル体のエナンチオマー混合物に、Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼの共存下に、Ｌ－サクシニラーゼを作用させてＬ体を特異的に加水分解することにより、Ｌ－アミノ酸を製造する方法に関する。特には、特に溶解濃度の低いアミノ酸のＮ－サクシニル体を原料として、生成したＬ－アミノ酸を反応系外に析出させつつ反応させることにより、高収率でＬ－アミノ酸を製造する方法に関する。本発明によれば、光学純度の高いＬ－アミノ酸、特に医薬品、農薬等の原料として有用な、Ｌ－アミノ酸を効率的に製造することができる。

Description

Ｌ－アミノ酸の製造方法
　本発明は、１）Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ－サクシニルアミノ酸をラセミ化する反応、及び２）Ｌ－サクシニラーゼを用いてＮ－サクシニル－Ｌ－アミノ酸を特異的に加水分解する反応を組み合わせることにより、Ｎ－サクシニルアミノ酸のエナンチオマー混合物からＬ－アミノ酸を効率的に製造する方法に関する。
　光学活性アミノ酸、特に光学活性非天然アミノ酸は、農薬、医薬品等の合成原料及び中間体として有用な化合物である。光学活性なアミノ酸、特に非天然アミノ酸をいかにして効率的に製造するかは、産業上重要な課題となっている。
　この課題を解決する方法の１つとして、ラセミ体Ｎ－アセチルアミノ酸を原料として、Ｄ－アミノアシラーゼ或いはＬ－アミノアシラーゼを用いることによりＤ体或いはＬ体に光学分割し、光学純度が高いアミノ酸を取得する方法がある（特許文献１）。この方法では光学活性アミノ酸の取得収率が最高で５０％であり、ラセミ体の半分が無駄になる。そこで、残存するＮ－アセチルアミノ酸をラセミ化するＮ－アシルアミノ酸ラセマーゼとアミノアシラーゼを組み合わせて、収率を向上させる試みがなされてきた。ところが、Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼとアミノアシラーゼを組み合わせた分割は反応性が低く、アミノ酸の収率が７０から７５％に留まっており、更にはＮ－アシル体基質が残存し、その分離工程が必要となることから実用化への障害となっていた（特許文献２、３、４、５）。
　また、Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼのＮ－アシルアミノ酸に対する反応性が低いことが明らかであったが(非特許文献１、２、特許文献６）、近年、Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼがＮ－アセチルアミノ酸よりもＮ－サクシニルアミノ酸に対する反応性のほうが高いことが報告されている(非特許文献１、２、特許文献６）。更には、天然Ｌ－アミノ酸のＮ－サクシニル体に対してＬ－サクシニラーゼが作用することも報告されている(非特許文献１、２、特許文献６）。しかしながら、Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼとＬ－サクシニラーゼを組み合わせて、Ｎ－サクシニル－アミノ酸のエナンチオマー混合物からＬ－アミノ酸を効率的に製造する方法については知られていない。
　また、本製造法において使用可能な原料である一般式（III）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（式中、Ｒ１は置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数２～２０のアルキニル基、置換基を有していてもよいインダニル基、置換基を有していてもよいナフチルメチル基、またはフルオロベンジル基、クロロベンジル基またはブロモベンジル基を示す。）で表されるＮ－サクシニルアミノ酸またはその塩についてはこれまでに知られていない。
特開２００６－２５４７８９号公報 特開２００１－４６０８８号公報 特開２００１－３１４１９１号公報 特開２００２－２３８５８１号公報 特開２００７－８２５３４号公報 特開２００８－６１６４２号公報
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００４年、４３巻、２２４頁 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６年、４５巻、４４５５頁
　本発明の目的は、従来法よりも効率的なＬ－アミノ酸の製造法の提供を課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ－サクシニルアミノ酸をラセミ化する反応と、Ｌ－サクシニラーゼを用いてＮ－サクシニル－Ｌ－アミノ酸を特異的に加水分解する反応を組み合わせた反応時に、生成するアミノ酸を反応系外に析出させることによって反応性を高められることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち本発明は、Ｎ－サクシニルアミノ酸のエナンチオマー混合物にＬ－サクシニラーゼを作用させて、Ｌ－アミノ酸を製造する方法であって、Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼの共存下に、生成させたＬ－アミノ酸を析出させつつ反応を行うことを特徴とするＬ－アミノ酸の製造方法、である。
　本発明の製造方法において、好ましくは、上記Ｌ－アミノ酸の溶解濃度は１重量％以下である。
　また、本発明の製造方法において、好ましくは、基質であるＮ－サクシニルアミノ酸が一般式（I）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭素数１～２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数２～２０のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数２～２０のアルキニル基、置換基を有していてもよい炭素数４～２０のアリール基、または置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアラルキル基を示す。）で表されるＮ－サクシニルアミノ酸であり、製造されるＬ－アミノ酸が一般式 （II）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
（式中、Ｒは前記と同じ置換基を表す）で表されるＬ－アミノ酸である。
　本発明のより好ましい実施態様において、上記式（I）及び（II）におけるＲが４－ブロモベンジル基、３－フルオロベンジル基、ナフチルメチル基、インダニル基、または６－ヘプテニル基である。
　また本発明の好ましい実施態様においては、Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼ及びＬ－サクシニラーゼとして、Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡとＬ－サクシニラーゼをコードするＤＮＡを含むベクターで形質転換された形質転換体を使用する。
　また本発明は、一般式（III）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
（式中、Ｒ１は置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数２～２０のアルキニル基、置換基を有していてもよいインダニル基、置換基を有していてもよいナフチルメチル基、またはフルオロベンジル基、クロロベンジル基またはブロモベンジル基を示す。）で表されるＮ－サクシニルアミノ酸またはその塩でもある。
　本発明の好ましい態様においては、上記式（III）におけるＲが４－ブロモベンジル基、３－フルオロベンジル基、２－ナフチルメチル基、２－インダニル基、または６－ヘプテニル基である
　本発明によれば、溶解濃度が低いアミノ酸のＮ-サクシニル体を原料として反応を行うことで生成するアミノ酸を反応系外に析出させることを可能とし、反応阻害を回避し、効率的にＬ-アミノ酸を製造できることが明らかになった。
　以下、本発明を、実施形態を用いて詳細に説明する。本発明はこれらにより限定されるものではない。
　本発明の「エナンチオマー混合物」とはＤ体を０％超～１００％未満の範囲で含むＬ体及びＤ体の混合物である。本発明の原料であるＮ－サクシニルアミノ酸は一般式（I）；
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
で表され、種々の公知方法で合成することができる。例えば、
１）アミノ酸及びアミノ酸と当量以上の無水コハク酸を酢酸中で反応後、溶媒留去を行い、酢酸エチル・メタノール中で再結晶させる方法
２）アミノ酸及びアミノ酸と当量以上の無水コハク酸を水中でｐＨをアルカリ側に保ちながら反応後、ｐＨを酸性にして結晶として析出させる方法、
等によって取得できる。
　前記式（I）において、Ｒは置換基を有していてもよい炭素数１～２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数２～２０のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数４～２０のアリール基、もしくは置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアラルキル基を示す。
　前記炭素数１～２０のアルキル基としては、直鎖状であっても分岐鎖状であっても良く、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンタニル基、ヘキサニル基、ヘプタニル基、オクタニル基等が挙げられる。前記炭素数２～２０のアルケニル基としては、エテニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、ヘプテニル基、オクテニル基等が挙げられる。
　前記炭素数２～２０のアルキニル基としては、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、ヘプチニル基、オクチニル基等が挙げられる。
　前記炭素数４～２０のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基、アントラニル基、ピリジル基、ピリミジル基、インダニル基、インデニル基等が挙げられる。
　前記炭素数５～２０のアラルキル基としては、ベンジル基、ナフチルメチル基、アントラニルメチル基、ピリジルメチル基、ピリミジルメチル基、インダニルメチル基、インデニルメチル基等が挙げられる。
　上記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基及びアラルキル基は置換基を有していても良く、置換基としては、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、ニトロ基等が挙げられる。
　前記式（I）で表されるＮ－サクシニルアミノ酸として、具体的には、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－４－ブロモフェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－３－フルオロフェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－２－ナフチルアラニン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－２－インダニルグリシン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－６－ヘプテニルグリシン等が挙げられる。
　本発明で用いるＬ－サクシニラーゼとは、一般式（I）で表されるＮ－サクシニルアミノ酸のサクシニル基をＬ体選択的に加水分解（脱サクシニル化）する酵素であり、Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼとは、一般式（I）で表されるＮ－サクシニルアミノ酸のエナンチオマーをラセミ化する酵素である。
　本発明の反応においては、Ｎ－サクシニルアミノ酸のエナンチオマー混合物のうちＬ体のみがＬ－サクシニラーゼによって特異的に加水分解（脱サクシニル化）され、目的のＬ－アミノ酸が生成する。この際、Ｎ－サクシニル－Ｄ－アミノ酸が過剰となるので、Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼによってＮ－サクシニル－Ｄ－アミノ酸からＮ－サクシニル－ＤＬ－アミノ酸へのラセミ化反応が進行する。Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼにより生成したＮ－サクシニル－Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－サクシニラーゼによって目的のＬ－アミノ酸へと変換される。
　以上のＬ体特異的加水分解反応とラセミ化反応の組み合わせにより、Ｎ－サクシニルアミノ酸のエナンチオマー混合物を実質的に単一のエナンチオマーからなるＬ－アミノ酸に変換することができる。更に本発明の好ましい実施態様では、上記反応過程或いは反応終了後のＬ－アミノ酸の蓄積濃度がその溶解濃度以上となるとＬ－アミノ酸が反応系外に析出し、反応は効率的に進行する。
　なお、高活性のＤ－サクシニラーゼ（Ｄ体選択的に脱サクシニル化）を用いれば、本発明の上記原理を適用して、Ｎ－サクシニルアミノ酸のエナンチオマー混合物を、実質的に単一のエナンチオマーからなるＤ－アミノ酸へ効率的に変換することができる。ただし、Ｎ－サクシニルアミノ酸をＤ体選択的に加水分解する酵素としてＤ－アミノアシラーゼが知られている（特開2008-61642）が、実用的な活性が得られたことは示されていない。
　ここで、溶解濃度とは、反応終了後の反応液中に溶解可能なアミノ酸の重量％であり、以下に述べる方法で測定できる。反応終了後の反応液に溶けなくなるまでＬ－アミノ酸を添加した後に遠心処理しその上清をフィルターろ過した溶液中の生成アミノ酸を高速液体クロマトグラフィーにて定量分析測定を行い、算出する。
　また、反応終了後の反応液中の生成アミノ酸（析出した生成アミノ酸と溶解している生成アミノ酸を含む）の重量％は以下に述べる方法で測定できる。反応終了後の反応液を析出した生成アミノ酸を含めて均一にサンプリングし、析出した生成アミノ酸を適当な溶媒を用いて可溶化しその溶液中のアミノ酸を高速液体クロマトグラフィーにて定量分析測定を行い、算出する。
　上記溶解濃度は、好ましくは３重量％以下、より好ましくは１重量％以下である。上記溶解濃度を超えてＬ－アミノ酸が生成するとＬ－アミノ酸が析出し、その際、反応終了後の反応液中の生成アミノ酸の重量％は高いほうが好適であり、好ましくは溶解濃度の２倍以上、より好ましくは５倍以上である。
　本発明のＬ－アミノ酸の製造方法は、適当な溶媒中に、基質となるＮ－サクシニルアミノ酸のエナンチオマー混合物と、Ｌ－サクシニラーゼ及びＮ－アシルアミノ酸ラセマーゼとを共存させることにより実施できる。
　反応には水系溶媒を用いてもよいし、水系の溶媒と有機系の溶媒とを混合して用いてもよい。有機系溶媒としては、例えば、トルエン、酢酸エチル、酢酸ｎ－ブチル、ヘキサン、イソプロパノール、ジイソプロピルエーテル、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。反応は例えば１０℃～７０℃、好ましくは３０℃～５５℃の温度で行われる。反応液のｐＨは例えば４～１０、好ましくは６～９に維持する。
　反応は、バッチ方式あるいは連続方式で実施できる。バッチ方式の場合、反応基質は例えば０．１％から７０％（ｗ／ｖ）、好ましくは３％から５０％（ｗ／ｖ）の仕込み濃度で添加される。
　反応で生じたＬ－アミノ酸は、常法により、それぞれを単離、精製できる。反応で生じたＬ－アミノ酸を含む反応液を、クロマトグラフィー等の処理を行うことにより、単離、精製できる。或いは、反応液から微生物菌体を除去したろ液を塩酸等を用いて中和晶析し、析出した目的物をろ別することによっても単離、精製できる。また、反応液から微生物菌体を除去したろ液をそのまま次工程の反応に使用することもできる。
　本発明に使用するＮ－アシルアミノ酸ラセマーゼは、前記式（I）に示されるＮ－サクシニルアミノ酸をラセミ化する能力を有する。そのような酵素としては、特に制限はないが、具体的には、ゲオバチルス（Geobacillus）属及びサーマス（Thermus）属などに属する微生物由来の酵素が挙げられ、好ましくは、ゲオバチルス・カウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）等の微生物に由来する酵素である。より好ましくはゲオバチルス・カウストフィラス（Geobacilluskaustophilus）ＮＢＲＣ１０２４４５、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）ＨＢ８に由来する酵素である。ゲオバチルス・カウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）ＮＢＲＣ１０２４４５に由来するＮ－アシルアミノ酸ラセマーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子は配列番号２で示される。
　本発明に使用するＬ－サクシニラーゼは、前記式（I）に示されるＮ－サクシニルアミノ酸のＬ体を加水分解する能力を有する。そのような酵素としては、特に制限はないが、代表的なものとして、ゲオバチルス（Geobacillus）属等に属する微生物由来の酵素が挙げられ、好ましくはゲオバチルス・カウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）等の微生物に由来する酵素である。より好ましくはゲオバチルス・カウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）ＮＢＲＣ１０２４４５に由来する酵素であり、そのアミノ酸配列をコードする遺伝子は配列番号１で示される。
　これらの微生物は、さまざまな寄託機関より当業者が入手可能である。寄託機関としては、各微生物を特定する受託番号に対応する機関が挙げられる。具体的には、ＮＢＲＣ番号で特定される微生物は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８にある独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門より入手可能である。また、自然界から分離することもできる。なお、これらの微生物に変異を生じさせてより本反応に有利な性質を有する株を得ることもできる。また、これらの微生物から単離した酵素遺伝子を通常の方法で各種宿主ベクター系に導入した形質転換体の利用も可能である。
　本発明においては、酵素として、上記微生物または形質転換体を適当な培地中で培養して得られる微生物培養液を使用できるほか、培養物の処理物を使用することもできる。該処理物としては、微生物培養液から遠心分離などの集菌操作によって得られる培養上清、微生物菌体、微生物菌体の破砕物、該破砕物より得られる無細胞抽出物、固定化菌体、精製された精製酵素、固定化酵素等が挙げられる。
　本明細書において記述されている、ＤＮＡの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Molecular Cloning 2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)、Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）等の成書に記載されている方法により実施できる。
　本明細書内に記載される「宿主」としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。ＤＮＡを含むベクターは、公知の方法により宿主細胞に導入できる。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば、市販のEscherichia coli HB101コンピテントセル（タカラバイオ社製）を用いることにより、当該ベクターを宿主に導入できる。
　本明細書内に記載される「ベクター」は、適当な宿主内でＤＮＡがコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。
　このようなベクターは、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、ＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＵＣＮ１８が好適に使用できる。プラスミドｐＵＣＮ１８は、ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、GenBank Accession No. L09136）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１－４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミドである。
　前記制御因子は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。上記の「作動可能に連結」という用語は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
　本明細書において記述されている「形質転換体」は、ポリペプチドをコードするＤＮＡを、ベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる。なお、本明細書において記述されている「形質転換体」は、培養菌体は言うまでもなく、その処理物も含まれる。ここで言う処理物とは、例えば、界面活性剤や有機溶媒で処理した細胞、乾燥細胞、破砕処理した細胞、細胞の粗抽出液等のほか、公知の手段でそれらを固定化したものを意味する。本明細書において記述されている形質転換体の培養は、それが増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて実施できる。
　本発明の製造方法を実施するに際しては、Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡ及びＬ－サクシニラーゼをコードするＤＮＡの両者を導入され、Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼ及びＬ－サクシニラーゼの両方の活性を有する形質転換体を用いることもできる。このような形質転換体を用いれば、Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼとＬ－サクシニラーゼをそれぞれ別個に調製する必要がなく、本発明の製造方法をより簡便に実施することができる。
　本発明のＮ－アシルアミノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡ及びＬ－サクシニラーゼをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体は、Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡ及びＬ－サクシニラーゼをコードするＤＮＡの両者を同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することによって得られるほか、これら２種のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それら２種のベクターを同一の宿主細胞に導入することによっても得られる。本発明のＮ－アシルアミノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡ及びＬ－サクシニラーゼをコードするＤＮＡの両者を含む形質転換体の例としては、後述するＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＩＧＨＫ）が挙げられる。
　以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の記載において、「％」は特に断らない限り「重量％」を意味する。
　（参考例１）Ｌ－サクシニラーゼの調製
　ゲオバチルス・カウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）ＮＢＲＣ１０２４４５株由来のＬ－サクシニラーゼ遺伝子（配列番号１）にＥｃｏＲＩ認識部位とＢａｍＨＩ認識部位を付加した遺伝子を、ＤＮＡポリメラーゼＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲを行い取得した。上記のＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、GenBank Accession No. L09136）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１－４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＥｃｏＲＩ認識部位とＢａｍＨＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＨＫを構築した。組換えベクターｐＮＨＫを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＨＫ）を得た。得られた形質転換体を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。これを、ＵＨ－５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のサクシニラーゼ活性を測定し、サクシニラーゼ活性５Ｕの発現が認められた。
　（参考例２）Ｌ－サクシニラーゼの活性測定
　Ｌ－サクシニラーゼのサクシニラーゼ活性は以下に述べる方法で測定した。基質となるＮ－サクシニル－ＤＬ－フェニルアラニン溶液２５０μｌ（終濃度５０ｍＭ）、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（０．５Ｍ／ｐＨ７．５）２３０μｌを混和し、この反応液に酵素液２０μｌを加えて３０℃で反応を行い、適当な時間で１Ｎ　ＨＣｌ添加により反応停止させた。生成したＬ－フェニルアラニンを高速液体クロマトグラフィーにより定量し、酵素活性を算出した。酵素活性はＮ－サクシニル－ＤＬ－フェニルアラニンからＬ－フェニルアラニンが１分間に１μｍｏｌｅ生成された場合を１ｕｎｉｔ（Ｕ）と定義した。
　（参考例３）Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼの調製
　ゲオバチルス・カウストフィラスＮＢＲＣ１０２４４５株由来のＮ－アシルアミノ酸ラセマーゼ遺伝子（配列番号２）にＥｃｏＲＩ認識部位とＳａｃＩ認識部位を付加した遺伝子を、ＤＮＡポリメラーゼＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲを行い取得した。上記のＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣＮ１８のｌａｃプロモーターの下流のＥｃｏＲＩ認識部位とＳａｃＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＩＧを構築した。組換えベクターｐＮＩＧを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＩＧ）を得た。得られた形質転換体を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。これを、ＵＨ－５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のＮ－アシルアミノ酸ラセマーゼ活性を測定し、Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼ活性２Ｕの発現が認められた。　サーマス・サーモフィラスＨＢ８株由来のＮ－アシルアミノ酸ラセマーゼ遺伝子（配列番号３）にＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位を付加した遺伝子を、ＤＮＡポリメラーゼＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲを行い取得した。上記のＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣＮ１８のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＩＴを構築した。組換えベクターｐＮＩＴを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＩＴ）を得た。得られた形質転換体を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。これを、ＵＨ－５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のＮ－アシルアミノ酸ラセマーゼ活性を測定し、Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼ活性１Ｕの発現が認められた。
　（参考例４）Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼの活性測定
　Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼのラセマーゼ活性は以下に述べる方法で測定した。基質となるＮ－アセチル－Ｄ－メチオニン溶液を１００μｌ（終濃度２０ｍＭ）、塩化コバルト水溶液を５μｌ（終濃度１ｍＭ）、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（０．５Ｍ／ｐＨ７．５）を５０μｌ（終濃度５０ｍＭ）、滅菌蒸留水を２４５μｌを混和し、この反応液にＬ－アミノアシラーゼ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ、ラセマーゼによって生成するＮ－アセチル－Ｌ－メチオニンを脱アシル化しＬ－メチオニンを生成する）５０μｌ、及び酵素液５０μｌを加えて３０℃で反応を行い、適当な時間で１Ｎ　ＨＣｌ添加により反応停止させた。生成したＬ－メチオニンを高速液体クロマトグラフィーにより定量し、酵素活性を算出する。酵素活性はＮ－アセチル－Ｄ－メチオニンからＮ－アセチル－Ｌ－メチオニンが１分間に１μｍｏｌｅ生成された場合を１ｕｎｉｔ（Ｕ）と定義した。
　（実施例１）Ｌ－４－ブロモフェニルアラニンの製造
　ＤＬ－４－ブロモフェニルアラニン２．２ｇと無水コハク酸０．９９ｇ及び酢酸２０ｍｌを混合し、５５℃で４ｈ反応させ、濃縮後酢酸エチルでの晶析を行い、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－４－ブロモフェニルアラニン２．１ｇを取得した。Ｎ－サクシニル－ＤＬ－４－ブロモフェニルアラニンの基質溶液（ｐＨ８）を調製し、塩化コバルト水溶液を終濃度１ｍＭとなるように添加後、参考例１及び参考例３と同様に培養したＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＨＫ）及びＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＩＧ）の培養液を混合し（基質の終濃度は８重量％）、４５℃にて反応を行ったところ、反応液中に４－ブロモフェニルアラニンが析出した。１８時間攪拌後、反応液中の基質及び生成物を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、変換率（ｍｏｌ％）及び光学純度（％ｅ．ｅ．）を求めた結果、変換率は９８．０ｍｏｌ％、Ｌ－４－ブロモフェニルアラニンの光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。変換率より算出されるＬ－４－ブロモフェニルアラニンの蓄積濃度は５．５重量％であった。また、Ｌ－４－ブロモフェニルアラニンの溶解濃度を高速液体クロマトグラフィーにて定量分析測定したところ、０．５重量％以下であった。
　変換率（ｍｏｌ％）＝生成物量／（残存基質量＋生成物量）×１００
　光学純度（％ｅ．ｅ．）＝（Ａ－Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）×１００（Ａは対象とする鏡像異性体量でＢは対応する鏡像異性体量）
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞
［変換率の分析］
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ　５Ｃ１８－ＡＲ－ＩＩ
　　　　（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ナカライ社製）
溶離液：２０ｍＭ　リン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝８／２
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３０℃
測定波長：２１０ｎｍ
［光学純度の分析］
カラム：ＣＲＯＷＮＰＡＣ　ＣＲ（+）（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、ダイセル社製）
溶離液：過塩素酸水溶液（ｐＨ１．５）／メタノール＝８５／１５
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３０℃
測定波長：２１０ｎｍ。
　Ｎ－サクシニル－ＤＬ－４－ブロモフェニルアラニン１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δｐｐｍ：２．４４－２．５６（４Ｈ，ｍ），２．９４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ），３．１４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ），４．６２－４．６６（１Ｈ，ｍ），７．１４－７．１９（２Ｈ，ｍ），７．３９－７．４３（２Ｈ，ｍ）。
　（実施例２）Ｌ－３－フルオロフェニルアラニンの製造
　ＤＬ－３－フルオロフェニルアラニン２．０ｇと無水コハク酸０．９９ｇ及び酢酸２０ｍｌを混合し、５５℃で４ｈ反応させ、濃縮後酢酸エチルでの晶析を行い、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－３－フルオロフェニルアラニン１．９ｇを取得した。Ｎ－サクシニル－ＤＬ－３－フルオロフェニルアラニンの基質溶液（ｐＨ８）を調製し、塩化コバルト水溶液を終濃度１ｍＭとなるように添加後、参考例１及び参考例３と同様に培養したＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＨＫ）及びＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＩＧ）の培養液を混合し（基質の終濃度は８重量％）、４５℃にて反応を行ったところ、反応液中に３－フルオロフェニルアラニンが析出した。２０時間攪拌後、反応液中の基質及び生成物を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、変換率（ｍｏｌ％）及び光学純度（％ｅ．ｅ．）を求めた結果、変換率は９７．５ｍｏｌ％、Ｌ－３－フルオロフェニルアラニンの光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。変換率より算出されるＬ－３－フルオロフェニルアラニンの蓄積濃度は５．１重量％であった。また、Ｌ－３－フルオロフェニルアラニンの溶解濃度を高速液体クロマトグラフィーにて定量分析測定したところ、０．５重量％以下であった。
　変換率（ｍｏｌ％）＝生成物量／（残存基質量＋生成物量）×１００
　光学純度（％ｅ．ｅ．）＝（Ａ－Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）×１００（Ａは対象とする鏡像異性体量でＢは対応する鏡像異性体量）
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞
［変換率の分析］
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ　５Ｃ１８－ＡＲ－ＩＩ
　　　　（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ナカライ社製）
溶離液：２０ｍＭ　リン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝８／２
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３０℃
測定波長：２１０ｎｍ
［光学純度の分析］
カラム：ＣＲＯＷＮＰＡＣ　ＣＲ（+）（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、ダイセル社製）
溶離液：過塩素酸水溶液（ｐＨ１．５）／メタノール＝８５／１５
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３０℃
測定波長：２１０ｎｍ。
　（実施例３）Ｌ－２－ナフチルアラニンの製造
　ＤＬ－２－ナフチルアラニン２．０ｇと無水コハク酸１．０２ｇ及び酢酸２５ｍｌを混合し、５５℃で４ｈ反応させ、濃縮後酢酸エチルでの晶析を行い、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－２－ナフチルアラニン２．３ｇを取得した。Ｎ－サクシニル－ＤＬ－２－ナフチルアラニンの基質溶液（ｐＨ８）を調製し、塩化コバルト水溶液を終濃度１ｍＭとなるように添加後、参考例１及び参考例３と同様に培養したＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＨＫ）及びＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＩＧ）の培養液を混合し（基質の終濃度は９重量％）、４５℃にて反応を行ったところ、反応液中に２－ナフチルアラニンが析出した。２０時間攪拌後、反応液中の基質及び生成物を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、変換率（ｍｏｌ％）及び光学純度（％ｅ．ｅ．）を求めた結果、変換率は９９．８ｍｏｌ％、Ｌ－２－ナフチルアラニンの光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。変換率より算出されるＬ－２－ナフチルアラニンの蓄積濃度は６．２重量％であった。また、Ｌ－２－ナフチルアラニンの溶解濃度を高速液体クロマトグラフィーにて定量分析測定したところ、０．２重量％以下であった。
　変換率（％）＝生成物量／（残存基質量＋生成物量）×１００
　光学純度（％ｅ．ｅ．）＝（Ａ－Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）×１００（Ａは対象とする鏡像異性体量でＢは対応する鏡像異性体量）
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞
［変換率の分析］
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ　５Ｃ１８－ＡＲ－ＩＩ
　　　　（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ナカライ社製）
溶離液：２０ｍＭ　リン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝８／２
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３０℃
測定波長：２１０ｎｍ
［光学純度の分析］
カラム：ＣＨＩＲＯＢＩＯＴＩＣ　Ｔ（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、Ａｓｔｅｃ社製）
溶離液：水／エタノール＝３／７
流速：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
測定波長：２１０ｎｍ。
　Ｎ－サクシニル－ＤＬ－２－ナフチルアラニン１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δｐｐｍ：２．３８－２．５０（４Ｈ，ｍ），３．１４（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ），４．７４－４．８７（１Ｈ，ｍ），７．３６－７．４５（３Ｈ，ｍ），７．０５－７．１５（４Ｈ，ｍ）。
　（実施例４）Ｌ－２－インダニルグリシンの製造
　ＤＬ－２－インダニルグリシン２．５ｇと無水コハク酸１．４４ｇ及び酢酸３０ｍｌを混合し、５５℃で４ｈ反応させ、濃縮後酢酸エチルでの晶析を行い、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－２－インダニルグリシン３．２ｇを取得した。Ｎ－サクシニル－ＤＬ－２－インダニルグリシンの基質溶液（ｐＨ８）を調製し、塩化コバルト水溶液を終濃度１ｍＭとなるように添加後、参考例１１及び参考例３と同様に培養したＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＨＫ）及びＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＩＧ）の培養液を混合し（基質の終濃度は８重量％）、４５℃にて反応を行ったところ、反応液中に２－インダニルグリシンが析出した。２０時間攪拌後、反応液中の基質及び生成物を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、変換率（ｍｏｌ％）及び光学純度（％ｅ．ｅ．）を求めた結果、変換率は１００ｍｏｌ％、Ｌ－２－インダニルグリシンの光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。変換率より算出されるＬ－２－インダニルグリシンの蓄積濃度は５．３重量％であった。また、Ｌ－２－インダニルグリシンの溶解濃度を高速液体クロマトグラフィーにて定量分析測定したところ、０．５重量％以下であった。
　変換率（％）＝生成物量／（残存基質量＋生成物量）×１００
　光学純度（％ｅ．ｅ．）＝（Ａ－Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）×１００（Ａは対象とする鏡像異性体量でＢは対応する鏡像異性体量）
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞
［変換率の分析］
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ　５Ｃ１８－ＡＲ－ＩＩ
　　　　（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ナカライ社製）
溶離液：２０ｍＭ　リン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝８／２
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３０℃
測定波長：２１０ｎｍ
［光学純度の分析］
カラム：ＣＲＯＷＮＰＡＣ　ＣＲ（+）（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、ダイセル社製）
溶離液：過塩素酸水溶液（ｐＨ１．５）／メタノール＝８５／１５
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３５℃
測定波長：２１０ｎｍ。
　Ｎ－サクシニル－ＤＬ－２－インダニルグリシン１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δｐｐｍ：２．４７－２．６１（４Ｈ，ｍ），２．７９－３．３１（５Ｈ，ｍ），４．５１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），７．０５－７．１５（４Ｈ，ｍ）。
　（実施例５）Ｌ－６－ヘプテニルグリシンの製造
　ＤＬ－６－ヘプテニルグリシン２．０ｇと無水コハク酸１．２９ｇ及び酢酸２０ｍｌを混合し、５５℃で４ｈ反応させ、濃縮後酢酸エチルでの晶析を行い、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－６－ヘプテニルグリシン１．４ｇを取得した。Ｎ－サクシニル－ＤＬ－６－ヘプテニルグリシンの基質溶液（ｐＨ８）を調製し、塩化コバルト水溶液を終濃度１ｍＭとなるように添加後、参考例１及び参考例３と同様に培養したＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＨＫ）及びＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＩＧ）の培養液を混合し（基質の終濃度は９重量％）、４５℃にて反応を行ったところ、反応液中に６－ヘプテニルグリシンが析出した。２４時間攪拌後、反応液中の基質及び生成物を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、変換率（ｍｏｌ％）を求めた結果、変換率は９９．６ｍｏｌ％であった。更に生成物を二炭酸ジｔｅｒｔ－ブチルでＮ－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル６－ヘプテニルグリシンへと誘導化し高速液体クロマトグラフィーにて光学純度（％ｅ．ｅ．）分析を行ったところ、１００％ｅ．ｅ．であった。変換率より算出されるＬ－６－ヘプテニルグリシンの蓄積濃度は５．７重量％であった。また、Ｌ－６－ヘプテニルグリシンの溶解濃度を高速液体クロマトグラフィーにて定量分析測定したところ、０．５重量％以下であった。
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞
［変換率の分析］
カラム：ＹＭＣ－Ａ３０３（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ＹＭＣ社製）
溶離液：２０ｍＭリン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝１／１
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３５℃
測定波長：２１０ｎｍ
［光学純度の分析］
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ　ＡＤ－ＲＨ（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、ダイセル社製）
溶離液：０．０２％　リン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝６５／３５
流速：０．７ｍｌ／分
カラム温度：３５℃
測定波長：２０５ｎｍ。
　Ｎ－サクシニル－ＤＬ－６－ヘプテニルグリシン１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）δｐｐｍ：１．２５－１．３８（６Ｈ，ｍ），１．５１－１．６９（２Ｈ，ｍ），２．０１（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），２．３２－２．４４（４Ｈ，ｍ）,４．１６（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），４．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ），４．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．１Ｈｚ），５．７９（１Ｈ，ｍ），８．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）。
　（比較例）Ｌ－フェニルアラニンの製造
　ＤＬ－フェニルアラニン５．０ｇと無水コハク酸３．０ｇ及び酢酸３０ｍｌを混合し、５５℃で４ｈ反応させ、濃縮後酢酸エチルでの晶析を行い、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－フェニルアラニン４．５ｇを取得した。Ｎ－サクシニル－ＤＬ－フェニルアラニンの基質溶液（ｐＨ８）を調製し、塩化コバルト水溶液を終濃度１ｍＭとなるように添加後、参考例１及び参考例３と同様に培養したＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＨＫ）及びＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＩＧ）の培養液を混合し（基質の終濃度は６重量％）、４５℃にて反応を行った。２１時間攪拌後、反応液中の基質及び生成物を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、変換率（ｍｏｌ％）及び光学純度（％ｅ．ｅ．）を求めた結果、変換率は８６．０ｍｏｌ％、Ｌ－フェニルアラニンの光学純度は１００％ｅ．ｅ．であった。変換率より算出されるＬ－フェニルアラニンの蓄積濃度は３．２重量％であった。また、Ｌ－フェニルアラニンの溶解濃度を高速液体クロマトグラフィーにて定量分析測定したところ、４重量％であった。
　変換率（ｍｏｌ％）＝生成物量／（残存基質量＋生成物量）×１００
　光学純度（％ｅ．ｅ．）＝（Ａ－Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）×１００（Ａは対象とする鏡像異性体量でＢは対応する鏡像異性体量）
＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞
［変換率の分析］
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ　５Ｃ１８－ＡＲ－ＩＩ
　　　　（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ナカライ社製）
溶離液：２０ｍＭ　リン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝８／２
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３０℃
測定波長：２１０ｎｍ
［光学純度の分析］
カラム：ＣＲＯＷＮＰＡＣ　ＣＲ（-）（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、ダイセル社製）
溶離液：過塩素酸水溶液（ｐＨ２．５）
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３５℃
測定波長：２５４ｎｍ。
　（実施例６）Ｌ－サクシニラーゼとＮ－アシルアミノ酸ラセマーゼ遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換体の作製
　ゲオバチルス・カウストフィラスＮＢＲＣ１０２４４５株由来のＬ－サクシニラーゼ遺伝子（配列番号１）の６１５番目のＣをＧに改変した遺伝子にＳａｃＩ認識部位とＢａｍＨＩ認識部位を付加した遺伝子を、ＤＮＡポリメラーゼＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲを行い取得した。上記のＰＣＲで得られたＤＮＡ断片を参考例３で作製したプラスミドｐＮＩＧのＳａｃＩ認識部位とＢａｍＨＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＩＧＨＫを構築した。組換えベクターｐＮＩＧＨＫを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＩＧＨＫ）を得た。得られた形質転換体を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。これを、ＵＨ－５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のサクシニラーゼ活性及びＮ－アシルアミノ酸ラセマーゼ活性測定し、サクシニラーゼ活性４Ｕ及びＮ－アシルアミノ酸ラセマーゼ活性１Ｕの発現が認められた。
　（実施例７）Ｌ－サクシニラーゼとＮ－アシルアミノ酸ラセマーゼ遺伝子を含むベクターで形質転換された形質転換体を用いたＬ－６－ヘプテニルグリシンの製造
　実施例５と同様にしてＮ－サクシニル－ＤＬ－６－ヘプテニルグリシンの基質溶液（ｐＨ８）を調製し、塩化コバルト水溶液を終濃度１ｍＭとなるように添加後、実施例６と同様に培養したＥ．ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１（ｐＮＩＧＨＫ）の培養液を混合し（基質の終濃度は９重量％）、４５℃にて反応を行ったところ、反応液中に６－ヘプテニルグリシンが析出した。２４時間攪拌後、反応液中の基質及び生成物を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、変換率（ｍｏｌ％）を求めた結果、変換率は９９．６ｍｏｌ％であった。更に生成物を二炭酸ジｔｅｒｔ－ブチルでＮ－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル６－ヘプテニルグリシンへと誘導化し高速液体クロマトグラフィーにて光学純度（％ｅ．ｅ．）分析を行ったところ、１００％ｅ．ｅ．であった。変換率より算出されるＬ－６－ヘプテニルグリシンの蓄積濃度は５．７重量％であった。また、Ｌ－６－ヘプテニルグリシンの溶解濃度を高速液体クロマトグラフィーにて定量分析測定したところ、０．５重量％以下であった。
　＜高速液体クロマトグラフィー分析条件＞
［変換率の分析］
カラム：ＹＭＣ－Ａ３０３（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ＹＭＣ社製）
溶離液：２０ｍＭリン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝１／１
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３５℃
測定波長：２１０ｎｍ
［光学純度の分析］
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ　ＡＤ－ＲＨ（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、ダイセル社製）
溶離液：０．０２％　リン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝６５／３５
流速：０．７ｍｌ／分
カラム温度：３５℃

Claims (10)

  1. Ｎ－サクシニルアミノ酸のエナンチオマー混合物にＬ－サクシニラーゼを作用させて、Ｌ－アミノ酸を製造する方法であって、Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼの共存下に、生成させたＬ－アミノ酸を析出させつつ反応を行うことを特徴とするＬ－アミノ酸の製造方法。
  2. 上記Ｌ－アミノ酸の溶解濃度が１重量％以下である請求項１に記載の製造方法。
  3. 　上記Ｎ－サクシニルアミノ酸が一般式（I）；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭素数１～２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数２～２０のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数２～２０のアルキニル基、置換基を有していてもよい炭素数４～２０のアリール基、または置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアラルキル基を示す。）で表され、上記Ｌ－アミノ酸が一般式（II）；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、Ｒは前記と同じ置換基を表す。）で表される請求項１または２に記載の製造方法。
  4. 　上記式（I）及び（II）においてＲが４－ブロモベンジル基、３－フルオロベンジル基、ナフチルメチル基、インダニル基、または６－ヘプテニル基である請求項３記載の製造方法。
  5. 　Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼがゲオバチルス（Geobacillus）属或いはサーマス（Thermus）属、Ｌ－サクシニラーゼがゲオバチルス（Geobacillus）属に属する微生物由来である請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
  6. 　Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼがゲオバチルス・カウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、Ｌ－サクシニラーゼがゲオバチルス・カウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）由来である請求項５に記載の製造方法。
  7. 　Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼがゲオバチルス・カウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）ＮＢＲＣ１０２４４５、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）ＨＢ８、Ｌ－サクシニラーゼがゲオバチルス・カウストフィラス（Geobacillus kaustophilus）ＮＢＲＣ１０２４４５由来である請求項６に記載の製造方法。
  8. 　Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼとＬ－サクシニラーゼが、Ｎ－アシルアミノ酸ラセマーゼとＬ－サクシニラーゼをコードするＤＮＡを含むベクターで形質転換された形質転換体である請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
  9. 　一般式（III）；
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、Ｒ１は置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアルキル基、置換基を有していてもよい炭素数５～２０のアルケニル基、置換基を有していてもよい炭素数２～２０のアルキニル基、置換基を有していてもよいインダニル基、置換基を有していてもよいナフチルメチル基、またはフルオロベンジル基、クロロベンジル基またはブロモベンジル基を示す。）で表されるＮ－サクシニルアミノ酸またはその塩。
  10. 　上記式（III）においてＲが４－ブロモベンジル基、３－フルオロベンジル基、２－ナフチルメチル基、２－インダニル基、または６－ヘプテニル基である請求項９記載のＮ－サクシニルアミノ酸またはその塩。
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