JPS62288A - 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法に関し、更
に詳しくは、該製造法における増収方法に関する。

従来の技術 各種のＬ−アミノ酸が発酵法によって製造されているが
、数種のものを除いて必ずしも満足すべき収量での生産
が行われているとはいえない。例えば、必須アミノ酸と
して各種の分野で需要の増大が期待されているＬ　−１
−ＩＪシトファン（以下ｒ　Ｔｒｐ　Ｊと略記する）の
発酵による製造方法は、プレピパクテリワム属、コリネ
バクテリウム属、バチルス属、エッシエリヒア属等に属
する微生物を栄養培地に培養し、蓄積するＬ　−）　Ｉ
Ｊブトファン（以下、ｒ　Ｔｒｐ　Ｊと略記する）を分
離回収する方法が知られていて、更に、これらの生産性
を高めるために、Ｔｒｐ生成に関与する遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡで形質転
換した微生物等を用いる方法が各種薬剤耐性変異菌株を
用いる方法とともに提案されている（例えば、特開昭５
７−８０３９８５号、特開昭５９−１２００９１号、特
開昭５９−１５６２９２号公報参照）。

また、その他のアミノ酸についても同様の試みがなされ
ている〔例えば、特開昭５７−１８６４９６号（スレオ
ニン）、同昭５８−８９３号（インロイシン）、同昭５
８−１３４９９４号（フェニルアラニン）等〕。

上述の如く、Ｔｒｐをはじめとして、各種アミノ酸の生
産性を高める目的で各種の生産菌が提案されているが、
いまだに一部のアミノ酸を除いて、工業的製造法として
、満足できる生産性を実現したものは見い出せない。一
方、本発明者らは、種種の微生物の培養によるＴｒｐの
生産性について検討したところ、培養液中のＴｒｐの蓄
積濃度がある程度以上に高まると、その生産能が低下し
てくることを見い出した。そこで、本発明者らは、発酵
法によるＴｒｐの生産性を高めるために、単に生産菌の
変異等によるだけでなく、微生物の培養条件とＴｒｐの
生産性の関連について研究したところ、培養液中に蓄積
するＴｒｐを晶析させることにより発酵培養液からＴｒ
ｐを発酵系外に除去せしめれば。

Ｔｒｐの蓄積による、その生産能の劣化を防ぐことがで
きることを見い出した。そして、この現象はＴｒｐ以外
の発酵法により生産される他のアミノ酸の製造方法にも
応用できることを確認し本発明を完成した。

しかして、本発明は、発酵法によｆｉＬ−アミノ酸を製
造するに際し、培養液中に蓄積するＬ−アミノ酸を晶析
せしめながら発酵を継続、することを特徴とするＬ−ア
ミノ酸の製造方法を提供するものである。即ち、本発明
は、発酵法によりム−アミノ酸を製造するに際し、培養
液中に蓄積する該アミノ酸を晶析せしめることにより、
培養液中のＬ−アミノ酸の濃度を一定量以下に維持でき
るため、それらの高濃度蓄積による生産性の阻害発現を
回避できる。したがって、目的とするＬ−アミノ酸を高
い収率で製造できるものである。

本発明にいうＬ−アミノ酸とは、発酵生産に際し、培養
液中の蓄積量がある程度高まシ、生産性に阻害を与える
可能性のあるアミノ酸であれば、その種類を問わず包含
されるものである。よシ好適には比較的水溶性の低いア
ミノ酸であって、例えば、トリブトファン、チロシン、
ロイシン、インロイシン、フェニルアラニン、ヒスチジ
ン、スレオニン、バリン等がその具体的なものとして挙
げられる。

なお、本発明の効果を奏するＬ−アミノ酸の蓄積量は、
対象となるアミノ酸の油類、栄養培地組成、培養濃度等
によって変動するため臨界的でないが、一般に、約５が
１以上に達するものであればよい。

次に、培養液中に蓄積するアミノ酸を晶析せしめる方法
としては、生産菌の生理活性に悪影響を与えないもので
あれば、それが、物理的方法であるか化学的方法である
かを問わず用いることができる。例えば、培養液中に、
生成アミノ酸の晶析を促進せしめる効果を有する物質を
添加するか、培養温度、培養−等を調整する方法を挙げ
ることができる。かかるアミノ酸の晶析を促進せしめる
効果を有する物質の具体的なものとしては、生産するア
ミノ酸そのものを種結晶として用いるか、通常の発酵に
おいて、消泡剤として使用される界面活性剤を添加する
のが効果的である。就中、界面活性剤の添加は、それが
、培養液中の各種組成物の凝集等に作用し、培養液中の
アミノ酸の溶解度を低下せしめる効果を発揮するために
、各種アミノ酸を効率よく晶析できる。そして、晶析効
果のある界面活性剤の具体的なものとしては、非イオン
性界面活性剤に属するものであって、例えば、トリトン
Ｘ−１００（ローム・アンド・ハース社製）、プルロニ
ックＬ−６１（加電化工業社製）、アデカノールＬＧ１
２６（同前）、ニラサンノニオン（日本油脂工業社製）
、ダウＤＫＸＩ−０３８Ａ（ダウコーニング社製）等を
好適なものとして挙げることができる。

次に、界面活性剤は培養全期間中、何時添加してもよい
が、一般に、菌体の対数増殖後期に添加するのが好まし
い。そして、その添加量は界面活性剤の種類によって異
なるので臨界的でないが、通常、培養液量に対して、消
泡剤としての約１０倍量、具体的には約０．２〜ｉ、　
ｏ　（ｖ／ｖ＞　Ｔｏとなるように定めることができる
。

以上により、培養液中のアミノ酸の蓄積濃度を一定量以
下に抑制することができるため、生成アミノ酸自体によ
るその生産性の阻害、物質移動に与える悪影響等を軽減
でき、最終的に単位培養液量当シの各アミノ酸の蓄積量
を飛躍的に高めることができる。

かくして、蓄積するアミノ酸は、それ自体公知の分離精
製法によって、培養物中よシ単離できる。

以下本発明を実施例によって更に具体的に説明する。

種母培地にて、３３．５℃１８時間培養した見ｃｏｉｌ
　（ＡＴＣＣ３１７４３）を４　％　３．０１ジヤー　
７　ｙ−メンタ−に接種し、培養温度３０℃通気量０．
５Ｖ、Ｖ、Ｍ、ｐ＋（６，８〜７．１の範囲にアンモニ
ア水にて調整し、菌体を増殖させた。以後２０　ｗ／ｖ
　％、アントラニル酸５０　ｗ／ｖ％、グルコースを連
続供給しつつ培養を続行した。培養途中（培養７６時間
目）Ｌ−）リプトファン２９．６が！の時期に、Ｉ、−
）リグドアアン結晶を１７？／１１になるよう添加し、
培養温度を２５℃、ｐＨを６６０迄下げ、１時間その状
態を保った後、元の培養温度−に戻した。その結果、Ｌ
−トリプトファンの結晶が析出しはじめ、培養口液中の
Ｌ−トＩＪブト７アン濃度は２２．７１−７１迄低下し
、Ｌ　−）　ＩＪブトファンの生成量は１００時間目に
３９．５νｌに達した（なお、培養途中でＬ　−）　Ｉ
Ｊグトファンの添加、培養温度、−の変化を行わないで
培養を継続した場合のＬ−）リグトファンの生成量は３
１．４．ν！であった）。Ｌ−）リグトファンの分析は
キサンナドロール法、　Ｔ、Ｌ、Ｃ法によった。

種母培地 バタトトリグトン　　　１０１１／ｌ 酵母エキス　　　　　５めり ＮａＣｌ２　Ｐ／１ テトラサイクリン　　　　１０　ｍｙ／ｌ　ＰＨ７，０
生産培地 グルコース　　　　４０４句　（添加液）カブミノ酸　
　　　　　２０シフ　　　２０ｗ／ｖチアントラニル酸
浴液硫酸アンモニウム　　　１０１ｉＰ／ｌ　　　　２
０ｗ、＾傷グルコース溶液すン酸−カリワム　　　２９
−／ｌ　　　　を連続供給した。

硫酸マグネシウム　　　　１ｈり 酵母エキス　　　　　１ｈ句 アントラニル酸　　　０．５５１−７１炭酸カルシワム
　　　　　３シな 硫酸、第一鉄　　　２０ｔｔｑ／１ テトラサイクリン　　　１０−ツメ１７，０適用 実施例１と同様にＥ、　ｃｏｉｌ　（ＡＴＣＣ３１７４
３）の菌体を増殖させた後、２０　ｗ／ｖ　％アントラ
ニル酸及び５０　ｗ／ｖ　％のグルコースを連続供給し
つつ培養を続行した。培養途中（培養５２時間目）に、
界面活性剤プルロニ、りＬ−６１を１チを添加すると、
トリプトファン生成濃度２５　？／ｌにてＬ−トリプト
ファンの結晶が析出しはじめ、以後もＬ−トリブトファ
ンの生成も続き培譬１２０時間目に、４０、３　？／Ｉ
ＩのＬ−トリプトファンを生成・蓄積した。なお、この
時培養口液中のＬ　−ト！Ｊブト７アン濃度は、１９．
１６Ｐ／ｌであった。種母培地、生産培地は、実施例１
と同様である。

実施例３　Ｌ−チロシンの製造方法 Ｌ−チロシン生産菌（ＡＴＣＣ２１５６８株）を、グル
コース１１ペグトン１１ｆ’Ｊｌエキス１％、ＮａＣｔ
Ｏ，３ｔＩ６の組成の種母培地で３０℃で２４時間培養
した前培養液３００　ａｔを、１０７の生産培地を含む
３０１容量のジャーファーメンタ−に接種して、培養温
度３０℃通気ｆｌ　０．５　Ｖ、Ｖ、ｍ、　ｐＨ７，０
〜７．２の範囲にアンモニア水にて調整し、菌体を増殖
させた。以後５０　ｗ／ｖ％、グルコースを連続供給し
つつ培養を続行した。培養途中（培養４８時間目）に、
界面活性剤プルロニックＬ−６１を１チ添加すると、Ｌ
−チロシン生成濃度４．８　ｉＩ／ｌにてＬ−チロシン
の結晶が析出しはじめ、以後もＬ−チロシンの生成が続
き、培養８４時間目に８．７がｌのＬ−チロシンを生成
・蓄積した。なお、この時培養Ｆ液中のＬ−チロシン濃
度は２．３が！であった。また、培養途中でプルロニッ
クＬ−６１を添加せずに培養を継続した場合のＬ−チロ
シン生成量は６．０がｌであった。

種母培地 グルコース　　　　　　　２チ ペプトン　　　　　　　　１チ “酵母エキス　　　　　　　１チ ＮａＣＬ　　　　　　　　　０．３　％　　　ｐＨ７，
２生産培地 グルコース　　　　　　　５％ に２Ｉ（ＰＯ４０，０５チ ＫＨ２ＰＯ４０，０５％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０２５チ 硫酸アンモニクム　　　　２チ ＮＺ−アミン０．５％ ピオチン　　　　　３０μｂ句−７．２実施例４　Ｌ−
ロイシンの製造方法 り一ロイシン生産菌（ＡＴＣＣ２１３０８株）を、グル
コース１％、ペプトン１チ、酵母エキス１％、ＮａＣＬ
０．３　％の組成の種母培地で３０℃で２４時間培養し
た前培養液３００ｒｎｌをＩＯＡ’の生産培地を含む３
０１容量のジャーファーメンタ−に接種して、培養温度
３２℃、通気量０．５　Ｖ、Ｖ、ｍ、、攪拌数５０　Ｏ
ｒｐｍ、　ｐｉ−１６，５〜６．６の範囲にアンモニア
水にて調整し、菌体を増殖させた。以後５０　ｗ／ｖ％
グルコースを連続供給しつつ培養を続行した。培養２４
時時間−攪拌数を４０　Ｏｒｐｍとし、４８時時間区界
面活性剤プルロニックＬ−６１を１％添加すると、Ｌ−
ロイシン生成濃度２７．６シノにてＬ−ロイシンの結晶
が析出しはじめ、以後もＬ−チロシンの生成が続き培養
７２時間目に３７．８ｉ！ＡのＬ−ロイシンを生成蓄積
した。なお、この時、培養Ｆ液中のし一ロイシン濃度は
、２５．８９−７７１であった。また培養途中でプルロ
ニックＬ−６１を添加せずに培養を継続した場合のＬ−
ロイシン生成量は３１．４が！であった。

生産培地 グルコース　　　　　　　５％ （ＮＨ４）２Ｓ０４２チ ＩＱ（２ＰＯ４０，１５ に２ＨＰＯ４０，０５ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，Ｏ２ ＭｎＳＯ４’４Ｈ２００，００２ ビオチン　　　　　３０μめり 肉エキス　　　　０．４チ ペプトン　　　　　１％

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、発酵法によりＬ−アミノ酸を製造するに際し、培養
   液中に蓄積するＬ−アミノ酸を晶析せしめながら発酵を
   継続することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法。 ２、Ｌ−アミノ酸を晶析せしめる手段が培養液中に界面
   活性剤を添加することからなる特許請求の範囲第１項記
   載のＬ−アミノ酸の製造方法。 ３、Ｌ−アミノ酸がトリプトファン、チロシン、ロイシ
   ン、イソロイシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、ス
   レオニン、セリン、バリンから選ばれる１又は２以上の
   アミノ酸である特許請求の範囲第１項又は第２項記載の
   Ｌ−アミノ酸の製造方法。 ４、界面活性剤がポリオキシエチレンポリオキシプロピ
   レンエーテル系の非イオン性界面活性剤である特許請求
   の範囲第１項から第３項のいずれかに記載のＬ−アミノ
   酸の製造方法。