WO2011001402A2 - Procede d'inactivation d'au moins un agent pathogene dans un echantillon de plasma sanguin humain - Google Patents

Procede d'inactivation d'au moins un agent pathogene dans un echantillon de plasma sanguin humain Download PDF

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WO2011001402A2
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Jean-Michel Boiron
Jean-Paul Maurel
Zoran Ivanovic
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Universite Sciences et Technologies Bordeaux 1
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Universite Victor Segalen Bordeaux 2
Universite Sciences et Technologies Bordeaux 1
Etablissement Francais du Sang
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    • A61L2103/05—Living organisms or biological materials
    • A61L2103/09—Blood or products thereof

Definitions

  • the present invention relates to a method of inactivating at least one pathogen of a human blood plasma sample, to a plasma obtained by this method and to a device for implementing the method.
  • the human blood plasma obtained is a biologically active plasma in which at least one pathogen is inactivated.
  • references in parentheses refer to the list of references presented at the end of the text.
  • Securing human blood plasma which can be considered as the inactivation of pathogens and the safeguarding of its therapeutic properties, is currently provided by chemical methods. These are processes comprising the addition to the plasma of chemical substances capable of decontaminating it, for example solvents and detergents, etc., processes combining chemical substances and physico-chemical processes, for example photosensitive molecules associated with illumination. by a light radiation of given wavelength (UV for example), or thermal processes, for example pasteurization at 60 0 C after addition of Protein stabilizers, filtration, gamma irradiation ... (Ref.1) C. Naegelen et al. [Evolution of labile blood product preparation (PSL) techniques: inactivation of pathogens in PSL], Clinical and Biological Transfusion 16 (2006) pp.179-189.
  • PSL labile blood product preparation
  • High pressure treatment processes are known in the food industry to inactivate certain pathogens such as molds, bacteria and sometimes viruses.
  • pathogens such as molds, bacteria and sometimes viruses.
  • A. JOFRE et al. [LWT Food Science and Technology 42 (5) (2009) p.924-928, entitled "Efficiency of high hydrostatic pressure at 600 MPa against micro-organisms by challenge test convenience") (Ref.2) describe the application of a pressure of 600 MPa to secure food.
  • human blood plasma has specific biological properties. Indeed, the plasma comprises about three hundred different proteins. The most important proteins in proportion are albumin, antibodies or immunoglobulins, fibrinogen, alpha 1 antitrypsin, alpha 2 macroglobulin, transferrin, lipoproteins (HDL and LDL). It also includes coagulation factors that are taken in most cases as a reference for measuring the biological activity of plasma. Plasma is "biologically active" when the activity of coagulation factors, including the factors City, V and Xl present in the plasma is greater than 50% (European Pharmacopeia 5.6 01/2007: 1646 (Ref 6). may, through some of its proteins, interact with the membranes of certain microorganisms (A.
  • the present invention solves such defects, disadvantages and obstacles of the prior art by providing a method of inactivating at least one pathogen of a human blood plasma sample comprising at least 5 cycles each comprising :
  • the present invention relates to a method of inactivating at least one pathogen of a human blood plasma sample comprising at least 5 cycles each comprising:
  • the inventors have shown that, surprisingly and unexpectedly, the characteristics of the process of the invention have a synergistic effect on the inactivation of biological targets, for example at least one pathogenic agent, thus allowing inactivate said targets while maintaining the biological activity of the human blood plasma sample.
  • the method of the invention allows the inactivation of at least one pathogen without introduction of external products and does not require a purification step thus reducing the time and costs of production.
  • the method of the invention therefore advantageously to inactivate at least one pathogen present in the human blood plasma but also to maintain the biological activity of said sample of human blood plasma.
  • sample of human blood plasma any plasma sample from a human regardless of its origin, age, sex, size and / or weight.
  • the sample may also have been previously treated by any technique known to those skilled in the art for, for example, its preservation, for example by freezing
  • inactivation is meant the suppression of the biological activity of at least one pathogen or set of pathogens.
  • inactivation does not allow recovery of the biological activity of the pathogen.
  • Inactivation can be observed by any method known to those skilled in the art. By for example, it may be the absence of growth of a pathogen in a medium adapted for its growth and / or to transmit its pathogenic activity ["Pathogen inactivation techniques", JPR PELLETIER, S. TRANSUE, EL SNYDER, Best Practice & Research Clinic Haematology vol.19 (1) (2006), pp.205-242] (Ref.12)
  • pathogen any biological entity known to those skilled in the art.
  • it may be a bacterium, a mold, a virus, a yeast, an infectious protein and / or parasites.
  • the pathogen may be selected from the group comprising the pathogens of the European Pharmacopoeia described in European Pharmacopoeia 6.0, 5.1 General Texts on Microbiology 01/2008: 50101 (Ref.13), for example it may be act as disease-causing pathogens, for example Candida albicans, Aspergillus Niger, Bacillus subtilis or responsible for nocosomal diseases, for example Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.
  • thermodynamics are understood to mean the increase or decrease in temperature resulting from compression or decompression, in particular of a liquid or gaseous component in a closed system because of the first principle of thermodynamics.
  • the initial pressure P 0 is for example the pressure at which the sample is located before implementing the method of the invention.
  • the pressure P 0 may be equal to the atmospheric pressure, or any blood plasma storage pressure less than Pi.
  • the initial pressure may be, for example equal to about 0.1 MPa.
  • the human blood plasma sample to which the process of the invention is subject is preferably contained in any container known to those skilled in the art to be resistant to the pressures of the process of the invention.
  • any container known to those skilled in the art to be resistant to the pressures of the process of the invention for example, in hermetic and / or deformable containers, for example a sampling tube, a plastic bag for transfusion, a sterile container, a specific packaging, for example packages described in Y. LAMBERT, G. DEMAZEAU, A. LARGETEAU, S. LABORDE-CROUBIT, M. CABANNES and JM BOUVIER, ["New packaging solutions for high pressure treatments of foods". High Pressure Research. 2000, vol 19, 207-212] (Ref 15).
  • the package may comprise an inner surface in contact with the plasma chemically and biologically compatible with the plasma and an outer surface in contact with the transmitting medium chemically compatible with the latter, for example in terms of permeability, etc. as described in the Pharmacopoeia
  • the packaging may for example comprise a connector, that is to say means for filling and / or empty packaging.
  • a connector may allow the filling and / or the use, for example therapeutic human blood plasma after implementation of a method according to the invention.
  • the hermetic package may be any package known to those skilled in the art preferably responding to the following 4 criteria: (i) the preservation of hermeticity of said packaging and its connectors, (ii) the chemical compatibility between the inner surface of the packaging and its connection with the plasma, and with a pressure transmitting medium for its external part, (iii) the maintenance of the barrier properties in particular in order to avoid any gas transfer or chemical molecules through the wall, (iv) safeguarding the chemical integrity of the package, that is to say the non-release of chemical molecules to the plasma container.
  • the pressure can be applied isostatically by means of a pressure transmitter liquid.
  • any medium known to those skilled in the art may be used in the method of the invention.
  • it may be a liquid or gaseous medium.
  • it may be a liquid medium that is easy to implement and often chosen as a function of its melting temperature, especially when it is used at low temperature, for example a medium whose melting point is less than the treatment temperature of the sample, for example an apolar liquid medium, for example hexane, glycol or a polar medium, for example propanol, n-butanol, ethanol, acetic acid, isopropanol
  • the liquid transmitting medium is selected from the group consisting of a glycol and water mixture, for example Kryo Lauda, and ethanol.
  • pressure isostatically allows advantageously to compress and relax uniformly and without pressure gradient at any point in the sample.
  • the initial temperature T 0 of the sample before compression can be chosen, for example, as a function of the rate of rise in pressure Vi, of the chemical nature of the millet and pressure transmitter, and of the value pressure.
  • the initial temperature may range from -18 ° C to -3 ° C.
  • the compression and / or the expansion are adiabatic.
  • the pressure Pi may be equal to
  • Pi may be from -10 0 C to -3 ° C, preferably from -8 ° C to -4 ° C, even more preferably equal to about -5 ° C.
  • the pressure Pi can be maintained for a period of 110 to 130 seconds per cycle, for example for a duration of 120 seconds per cycle.
  • the present invention also relates to the use of the method defined above for the inactivation of at least one pathogen and / or a set of pathogens in human blood plasma.
  • the present invention also relates to the human blood plasma obtained by the method defined above.
  • the human blood plasma obtained by the method of the invention can be advantageously used in the medical field, for example for the treatment of various pathologies, for transfusions as described in the document of the French Agency of
  • the plasma obtained by the process of the invention advantageously has the biological properties of the blood plasma. according to the standards of the European Pharmacopoeia and also of the French Legislation.
  • FIGS. 1A to C are histograms representing the percentage of plasma protein activity (ordinate) as a function of pressure in Mega Pascal (MPa) (abscissa). In particular, they respectively represent the effect of the value of the pressure on the activity of coagulation factor VIIIIc (FIG. 1A), coagulation factor V (FIG. 1B) and coagulation factor X1 (FIG. 1C).
  • the application rate is 3.33 MPa.
  • s "1 the application time, also referred to as maintaining the pressure, for 10 minutes at room temperature.
  • FIGS. 2A-C are histograms representing the percentage of plasma protein (ordinate) activity as a function of pressure in MPa (abscissa) for three different rates of application of pressure. In particular, they respectively represent the effect of the rate of application of the pressure on the activity of the coagulation factor Ville (FIG. 2A), the coagulation factor V (FIG. 2B), the coagulation factor X1 (FIG. 2C). ) for different pressure values (100, 150, 200 and 250 MPa), the pressure being applied for 10 minutes at room temperature.
  • FIGS. 3A to C are histograms representing the percentage of plasma protein activity (ordinate) as a function of the pressure in MPa (abscissa) and of different modes of application of the pressure and for the same total duration of treatment.
  • the application rate of the pressure is 3.33 MPa. s "1 at room temperature.
  • Figures 3A, 3B and 3C respectively show the effect of the pressure application mode on the activity of coagulation factors VIIIIc, V and XI in continuous mode (10 minutes), cyclic modes (5 cycles of 2 minutes and 20 cycles of 30 seconds).
  • FIGS. 4A to C are histograms representing the percentage of plasma protein activity (ordinate) as a function of the pressure in MPa (abscissa) for two values of the temperature: ambient and
  • the application rate of the pressure is greater than or equal to 50 MPa. s "1 and the time of application of the pressure 10 minutes.
  • Figures 4A, 4B and 4C respectively show the effect of temperature on the activity of coagulation factors depending on the value of the pressure .
  • FIGS. 5A-C are histograms representing the percentage of plasma protein (ordinate) activity as a function of the pressure in MPa (abscissa), the rate of application of the pressure and the temperature.
  • FIGS. 5A-C respectively show the effect of the combination of a fast application rate, a cyclic application of pressure and temperatures on the activity of coagulation factors VIIIIc, V and Xl , the application speed being greater than or equal to 50 MPa.
  • s "1 the application time of 2 minutes repeated 5 times and the temperature of -15 ° C.
  • Fig. 6 is a diagram illustrating the inactivation of Staphylococcus aureus in human blood plasma (ordinate) as a function of temperature (abscissa) for a combination of parameters characteristic of the treatment: a rate of application of the pressure of 50 MPa. s "1 , a cyclic mode of application of the pressure of 5 cycles of 2 min and for a pressure of 200 MPa.
  • this figure represents the drastic effect of the temperature on the inactivation by high pressures of Staphylococcus aureus suspended in human blood plasma.
  • Fig. 7 is a diagram illustrating the inactivation of Staphylococcus aureus (ordinate) as a function of temperature. (abscissa) in human blood plasma for increasing pressure values ranging from 200 to 300 MPa.
  • FIG. 8 is a diagram showing the inactivation of S. aureus, P. aeruginosa, A. niger and C. albicans (ordinate) as a function of temperature (abscissa). In particular, this figure represents the effect of temperature on the inactivation of 4 microorganisms suspended in a sample of human blood plasma.
  • FIG. 9 is a histogram showing the inactivation of Staphylococcus aureus (ordinate) as a function of the pressure (abscissa) and the rate of application of the pressure.
  • this figure represents the effect of the rate of application of the pressure on the inactivation of Staphylococcus aureus suspended in human blood plasma by selecting as mode of application of the pressure 5 cycles of 2 minutes and a temperature about -5 ° C.
  • FIG. 10 is a histogram showing the percentage of coagulation factor activity (ordinate) versus pressure (abscissa) for various values of the rate of pressure application.
  • Figure 10A shows the percentage of City factor activity (FVIIIc) and
  • Figure 10B the percentage of factor V (FV) activity.
  • this figure represents the effect of the rate of application of the pressure on the activity of coagulation factors during a cyclic treatment (5 ⁇ 2 min) at low temperature (temperature of about -5 ° C. ).
  • FIG. 11 is a photograph showing the optical microscope observation (Objective * 100) of blood contaminated with Plasmodium berghei before (A) and after treatment with the "High Pressure Plasma Safety Pressing Method” (B).
  • N Core
  • C Cytoplasm
  • V Vacuole
  • FIG. 12 represents the result of a Western Blot analysis of human blood plasma samples infected or not by the infectious protein of the hamster prion (263 K), TIx: Infected control not treated with the method, HPIx: Sample infected treated by the method, TNx: Witness Negative untreated by the process, HPNx: Negative control processed by the process.
  • FIG. 13 is a histogram showing the destructive efficiency (ED) (ordinate) as a function of the pressure (abscissa).
  • the application rate of the pressure was 3.33 MPa. s "1 , the continuous mode of application (MA), the treatment time of 10 minutes and the treatment temperature of 25 ° C.
  • FIG. 14 is a histogram showing the destructive efficiency (ED) (ordinate) as a function of the pressure (abscissa). The application rate of the pressure was 3.33 MPa. s "1 (full sticks) or 50 MPa. s " 1 (hatched sticks).
  • FIG. 15 is a histogram showing the destructive efficiency (ED) (ordinate) as a function of the pressure (abscissa).
  • the application rate of the pressure was 3.33 MPa. s "1.
  • the application of the pressure mode was 5 cycles of 2 minutes (hatched bars), 20 cycles of 30 seconds (open bars) or a 10-minute cycle (solid bars)
  • FIG. 16 is a histogram showing the destructive efficiency (ED) (ordinate) as a function of the pressure (abscissa). The temperature was -5 ° C (hatched sticks) or 25 ° C (full sticks)
  • FIG. 17 is a diagram showing the inactivation of S. aureus, P. aeruginosa, A. niger, C. albicans and B. subtilis (ordinate) as a function of temperature (abscissa).
  • FIGS. 18A and B are histograms representing the percentage of plasma protein activity (% act) (ordinate) as a function of pressure (P) in Mega Pascal (MPa) (abscissa). In particular, they respectively represent the effect of the value of the pressure on the activity of coagulation factor VIIIIc (FIG. 18A), coagulation factor V (FIG. 18B).
  • FIG. 19 represents the intensity of the fluorescence (ordinate) as a function of the dilution factor (abscissa). The crosses correspond to the results obtained with the method (HP), the black squares to the results obtained with a control "T".
  • FIG. 20 represents the intensity of the fluorescence (ordinate) as a function of the dilution factor (abscissa).
  • the crosses correspond to the results obtained with the method (HP), the black squares to the results obtained with a control "T".
  • Figure 21 shows the FACS diagrams.
  • SSC signal correlated to the cell complexity
  • FSC signal correlated to the relative size of the cells
  • Event to the total number of events (cell) in the defined population
  • % Parent to the number of events in the population defined by the total number of events expressed as a percentage
  • mean as the mean value of the fluorescence intensity
  • Samples of about 4 mL of fresh human blood plasma were collected and placed in sealed tubes, and then frozen at -30 0 C waiting to be treated under high pressure.
  • the treatment conditions were as follows: a pressure application rate of 100 MPa in 30 seconds (3.33 MPa.s -1 ), a treatment time of 10 minutes continuously at the desired pressure. that is to say from 100 MPa to 250 MPa and an ambient temperature of the order of 20 ° C.
  • the activity of coagulation factors was chosen as a reference in order to determine the biological activity of human blood plasma. This activity was determined before and after treatment with the activated partial thromboplastin time method described in the STA CK instructions.
  • PREST Diagnostica Stago
  • This assay consists in measuring, in the presence of cephalin and activator, the coagulation time of an immuno-depleted plasma factor to be assayed, the missing coagulation factor being provided by the sample to be tested.
  • the percentage of residual activity is then determined by the ratio between the activity value after high pressure treatment and the activity value before high pressure treatment. The effect of the value of the pressure on the percentage of residual activity for these three coagulation factors is shown in FIGS. 1A to C.
  • Example 2 Measurement of the biological activity of human blood plasma after treatment under high pressures as a function of the rate of application of the pressure
  • Fresh human blood plasma was prepared according to the method described in Example 1.
  • the treatment conditions were: a treatment time of 10 minutes continuously at a given pressure ranging from 100 to 250 MPa, at a temperature of the order of 20 ° C.
  • the rate of application of the pressure was chosen as a variable.
  • three speeds have been chosen with sufficiently different values on the one hand and values accessible for an industrial equipment produced by the skilled person on the other hand, that is to say 100 MPa in 30 seconds (or 3.33 MPa s -1 ) (value identical to the rate of application of the pressure used in Example 1), 100 MPa in 12 seconds (8.33 MPa.s -1 ) and 100 MPa in 2 seconds (50 MPa.s "1 ).
  • the biological activity of the human blood plasma was measured after treatment with the percentage of activity of the coagulation factors as described in Example 1 (City factor, factor V and factor Xl) measured by the method of time. The percentage of residual activity relative to the activity before high pressure treatment of each of the coagulation factors for the same pressure values but with application rates.
  • variable pressure 3.33 MPa. s "1 , 8.33 MPa s " 1 and 50 MPa. s "1 are shown in Figure 2.
  • Example 3 Measurement of the biological activity of human blood plasma after treatment under high pressures depending on the mode of application of the pressure
  • Fresh human blood plasma was prepared according to the method described in Example 1.
  • the treatment conditions under high pressures were: a rate of application of the constant pressure, equal to 100 MPa in 30 seconds (ie 3 , 33 MPa. S "1 ), the temperature of the order of 20 0 C, a treatment time of 10 minutes at a pressure ranging from 100 to 250 MPa.
  • the samples were placed in a high-pressure liquid phase direct compression generator device of the "Framatome" type and the transmitting medium was the glycol / water mixture (Kryo Lauda).
  • the mode of application of the pressure varies according to a continuous mode, that is to say the maintenance of the constant pressure for a time of 10 minutes, or a cyclic mode, that is to say 5 cycles of 2 minutes at the selected pressure or 20 cycles of 30 seconds at the selected pressure.
  • the cycles correspond, for example to compression of the sample, the maintenance of the pressure for a suitable time and the expansion of the sample.
  • the duration of the cycles has been chosen in such a way that it can be transposed on an industrial scale.
  • the biological activity of the human blood plasma was measured by the percentage of residual activity of the coagulation factors as described in Example 1 (City factor, factor V and factor Xl). The activity of these coagulation factors was measured by the activated partial thromboplastin time method described in the STA CK Instructions for Use. PREST (Diagnostica Stago) (Ref 19).
  • Factor X1 always had a particular behavior compared to the other two coagulation factors insofar as its activity was little or not (with errors of experience) disturbed by the pressure.
  • the factor V is more sensitive than the factor City to the cyclic mode of application of the pressure, that is, its residual activity appears to be more saved for cyclic application than for continuous application for the same value of pressure.
  • this phenomenon is more pronounced for a cyclic mode corresponding to 5 cycles of 2 minutes compared to 20 cycles of 30 seconds.
  • Example 4 Measurement of the biological activity of human blood plasma after treatment under high pressures as a function of temperature
  • Fresh human blood plasma was prepared according to the method described in Example 1.
  • the treatment conditions were: a rate of application of the constant pressure and equal to 50 MPa. s "1 , a continuous treatment time of 10 minutes at a pressure of between 100 and 300 MPa.
  • the samples were placed in a high pressure generator equipment by indirect compression set up internally with ethanol as the transmitting medium.
  • the measurement of the biological activity of the human blood plasma was measured by the percentage of residual activity of the coagulation factors as described in Example 1 (City factor, factor V and factor Xl) measured by the method. activated partial thromboplastin time described in the STA CK instructions. PREST (Diagnostica Stago) (Ref 19).
  • EXAMPLE 5 Measurement of the biological activity of the human blood plasma after treatment under high pressures by combining three parameters that are characteristic of the treatment: the rate of application of the pressure, the mode of application of the pressure and a low temperature
  • Fresh human blood plasma was prepared according to the procedure detailed in Example 1.
  • the samples were placed in a high pressure generator equipment by indirect compression set up internally with ethanol as the transmitting medium.
  • the treatment process consisted in associating a set of parameters associated with the pressure: rate of application of the pressure, mode of application of the pressure and temperature, in particular low temperature, ie a temperature about -15 ° C.
  • Example 1 The percentage of residual activity of the coagulation factors already taken as references in Example 1 (City factor, factor V and factor Xl) was as in Example 1 measured by the partial thromboplastin time method with activator .
  • Example 6 Example of inactivation of a pathogen in human blood plasma at high pressures as a function of temperature.
  • Staphylococcus aureus is a well-identified pathogen and causes many nosocomial diseases. This pathogen was chosen as a model in this example.
  • a dense suspension ie greater than 10 8 CFU / mL
  • CFU Colony Forming Unit
  • ATCC 6538 tryptone-salt broth
  • TCS Tryptic Soy Agar
  • the contaminated plasma samples were then placed in sterile and sealed tubes, then kept in the freezer awaiting treatment by an inactivation process.
  • a count of the samples is made in order to determine the destructive efficiency of this treatment.
  • cascade dilutions of the samples are carried out in TS broth.
  • two petri dishes are inoculated as follows: 1 ml of the dilution is placed at the bottom of the dish and then supercooled TCS agar is poured. After homogenization and gelation, the petri dishes are put in an oven at 35 ° C for 48h. Boxes containing between 15 and 300 isolated colonies are then selected for enumeration, and, after counting colonies, the concentration of S. aureus is determined by the following calculation:
  • ⁇ c sum of the colonies counted on all the boxes retained nor: number of boxes retained at the first dilution
  • n 2 number of boxes retained at the second dilution
  • N 0 concentration of S. aureus before high pressure treatment
  • the inactivation treatment used was that described in Example No. 5.
  • the values of the associated parameters were a speed of 50 MPa. After 1 , 5 cycles of 2 minutes for the mode of application, only the temperature was taken into account as a variable (from -25 ° C to + 35 ° C).
  • the samples were placed in a high pressure generator equipment by indirect compression set up internally with ethanol as the transmitting medium.
  • Figure 6 shows the effect of temperature during such treatment on its destructive efficacy vis-à-vis S. aureus.
  • an example of a method of the invention via the appropriate combination of the 3 parameters associated with the value of the pressure: rate of application of the pressure, mode of application of the pressure and temperature has a synergistic effect on the inactivation of S. aureus.
  • Example 7 Example of Inactivation of a Pathogen in Human Blood Plasma under High Pressures as a Function of Temperature and Pressure Value
  • the value of the pressure was set at 200 MPa. While retaining the values of the parameters associated with the pressure (application speed of 50 MPa ⁇ sec -1 and cyclic application mode of 5 cycles of 2 minutes), the inventors sought to evaluate whether the surprising effect related to amplification of the destructive efficacy of S. aureus for a narrow range of temperature could be observed for various pressure values (200 MPa, 250 MPa, 300 MPa). In other words, this example aims to investigate whether the inactivation of S. aureus observed at 200 MPa can also be observed at other pressures, in particular at 250 MPa and 300 MPa.
  • the samples were placed in a high pressure generating equipment set up internally with ethanol as the transmitting medium.
  • FIG. 7 gives the evolution of the destructive efficiency of S. aureus as a function of temperature for three values of the pressure, all the other parameters associated with the treatment remaining constant (speed of application of 50 MPa.s s -1 and cyclic application mode of 5 cycles of 2 minutes) shows a very particular phenomenon.
  • Example 8 Example of inactivation of pathogens in human blood plasma under high pressures as a function of temperature.
  • the value of the pressure was set at 200 MPa.
  • the values of the parameters associated with the pressure were as follows: application speed of 50 MPa. s "1 and cyclical enforcement mode 5 cycles of 2 minutes.
  • the inventors have investigated whether the surprising effect related to an amplification of the destructive efficiency of S. aureus in a particular temperature range was observed for other pathogens of the European Pharmacopoeia such as Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Candida albicans (ATCC 10231) and Aspergillus niger (ATCC 16404) by maintaining 200 MPa as the pressure value (Figure 8).
  • the methods for preparation and enumeration of plasma samples contaminated with S. aureus and P. aeruginosa are identical to those described in Example 6.
  • the protocol is identical to that of exception of the culture medium which is Sabouraud agar (AES Chemunex) and the incubation temperature which is 28 ° C. Spores of A. niger were obtained by incubating the strain for 28 days in Roux flasks containing Sabouraud agar and recovered by washing these flasks with a mixture of water and water. Tween 80 (0.5 g / L) in the presence of glass beads.
  • the samples were placed in a high pressure generator equipment by indirect compression set up internally with ethanol as the transmitting medium.
  • FIG. 8 demonstrates quite surprisingly and unexpectedly, despite very important differences in the structure of the pathogenic agents: two bacteria, including a Gram-positive shell (S. aureus) and a Gram bacillus. Negative (P. aeruginosa), spore-shaped mold (A. niger), and yeast (C. albicans), amplifying the destructive efficacy for a particular area or particular temperature range. This temperature range covered (with errors of experience) that of S. aureus (Temperature equal to -6 ° C ⁇ 5 ° C).
  • the difference observed at very low temperature is a function of the sensitivity of each of the microorganisms vis-à-vis in particular the pressure.
  • the method of the invention via the particular combination of the parameters associated with the value of the pressure (speed of application of the pressure, mode of application of the pressure and temperature) has a synergistic effect on the inactivation of a set of biological targets.
  • Example 9 Example of inactivation of a pathogen at high pressures as a function of the speed of application of the pressure
  • the samples were placed in a high-pressure liquid-phase direct compression generator device of the "Framatome” type and the transmitting medium was the glycol / water mixture (Kryo Lauda) for the speed of 3.33 MPa. s "1.
  • a generator equipment of high pressure indirect compression implemented internally as transmitting medium with ethanol was used to the speed of 50 MPa ⁇ s" 1
  • the method of the invention thus allows the inactivation of pathogens in human plasma with a synergistic effect.
  • Example 10 Example of Implementation of a Method for Inactivating at Least One Pathogen in Human Blood Plasma
  • the samples were placed in a high pressure liquid phase generator device by direct compression type "Framatome” and the transmitter medium was the glycol / water mixture (Kryo Lauda) for the speed of 3.33 MPa. s "1.
  • High pressure indirect compression generating equipment set up internally with as the transmitting medium ethanol was used for the speed of 50 MPa.s "1
  • the City factor activity safeguard is greater than 70%, and that of factor V greater than 50%, which meets both the requirements of the European Pharmacopoeia (activity of coagulation factors greater than 50%) (Ref 6) but also to those of the French Legislation (coagulation factor activity higher than 50% except for the City factor for which the activity must be greater than 70%) (Ref 17) .
  • the present invention thus makes it possible to inactivate at least one pathogen in human blood plasma while retaining its biological activity.
  • Example 11 Inactivation of Plasmodium berghei (hematozoan) and Trypanosoma brucei brucei (extracellular protozoan) by implementing a method of the invention
  • An example of inactivation process of a pathogen according to the invention was then tested on parasite models likely to contaminate the blood products of Plasmodium berghei part (hematozoan) and secondly Trypanosoma brucei brucei (extracellular protozoan).
  • the samples were placed in a high pressure generator equipment by indirect compression set up internally with ethanol as the transmitting medium.
  • an example of inactivation process according to the invention is effective for the inactivation of one part Plasmodium berghei (hematozoan) and secondly Trypanosoma brucei brucei (extracellular protozoan) .
  • the method of the invention can inactivate pathogens such as parasites while maintaining the biological activity of human blood plasma.
  • Example 12 Implementation of an Example Method According to the Invention on the Infectious Prion Protein Present in a Sample of Human Blood Plasma
  • the Prion infectious protein is currently one of the objectives of securing biological products.
  • the hamster prion was chosen as a model.
  • the samples were treated in pairs, a tubing containing plasma contaminated with the infected brain meal and a tubing containing plasma contaminated with the non-brain meal. infected, using an example pathogen inactivation method according to the invention combining the appropriate combination of parameters associated with the pressure that is to say a rate of application of the pressure of 100 MPa in 2 seconds, or a rate of increase of the pressure and decrease of the pressure of 50 MPa.
  • a rate of application of the pressure of 100 MPa in 2 seconds or a rate of increase of the pressure and decrease of the pressure of 50 MPa.
  • s "1 of a user applying pressure of 5 cycles of 2 minutes the compression of the sample, maintaining the pressure for 120 seconds and the pressure decrease, the compression being equal to a pressure P of 200 MPa
  • the temperature of the sample at the pressure Pi was about -5 ° C.
  • the samples were placed in a high-pressure generating equipment by indirect compression set up internally with the ethanol-transmitting medium .
  • the analysis of the samples was carried out using the following protocol: extraction of the prion protein by precipitation with NaPTA 4%, proteinase K digestion at 200 ⁇ g / ml, detection of PrP Sc by Western Blot (the antibody used being the 3F4 antibody).
  • Example 13 Evaluation of the value of the pressure on the inactivation of a pathogen (S. aureus) in a human blood plasma sample by treatment at high pressures for 10 minutes minutes continuously at room temperature (25 ° C) and with a relatively moderate and conventional pressure application rate (VA) (3.33 MPa s -1 ).
  • Staphylococcus aureus is a well-identified pathogen and causes many nosocomial diseases This pathogen was chosen as a model in this example.
  • the temperature was maintained at 25 ° C.
  • the rate of application of the pressure (VA) was 3.33 MPa. s "1
  • the duration of treatment was 10 minutes keeping constant pressure value.
  • FIG. 13 represents the values of the destructive efficiency.
  • Example 14 Evaluation of inactivation of a pathogen (S. aureus) in a blood plasma sample through treatment at high pressures at room temperature (25 ° C.), a mode of application of pressure continuous, a duration of 10 min with different application speeds VA of the pressure
  • the mode of application of the pressure MA was continuous and the rate of application of the pressure was relatively "conventional" (ie 3.33 MPa.s -1 ).
  • the treatment time was 10 minutes and the treatment temperature was 25 ° C.
  • the purpose of this example is to have an evaluation of the effect of the speed of application (VA) of the pressure on the inactivation of S. aureus, the values of the other parameters remaining constant: a mode of continuous MA application of pressure, a treatment temperature of 25 ° C and a treatment time of 10 minutes.
  • VA speed of application
  • the pressure values were 200 MPa, 250 MPa and 300 MPa. Higher values were not selected as the biological activity of human blood plasma was significantly impaired above 300 MPa.
  • FIG. 14 represents the destructive efficiency ED with respect to S. aureus according to the value of the pressure for different values of the application speed of the pressure VA.
  • Example 15 Evaluation of inactivation of a pathogen (S. aureus) in a sample of human blood plasma through treatment at high pressures at room temperature (25 ° C.), with a rate of application of the pressure VA 3.33 MPa. s "1 depending on the application of pressure (MA), continuous (10 min), or cyclic (5 cycles of 2 min or 20 cycles of 30 seconds)
  • example 13 only a continuous application mode was applied.
  • the objective was to evaluate the role of the pressure application mode (MA), for pressure values of 200 MPa, 250 MPa and 300 MPa - the biological activity of the plasma being significantly altered above 300 MPa.
  • the other parameters were kept constant: application speed of 3.33 MPa. s "1 and treatment temperature of 25 ° C.
  • FIG. 15 is a histogram representing the destructive efficiency (ED) (ordinate) as a function of the pressure (abscissa).
  • the application rate of the pressure was 3.33 MPa. s "1.
  • the application of the pressure mode was 5 cycles of 2 minutes (hatched bars), 20 cycles of 30 seconds (open bars) or a cycle of
  • FIG. 15 shows that the mode of application of the pressure is continuous or cyclically has no effect (with errors of experience) on the value of the efficiency. destructive (ED) of S. aureus at both 200 MPa and 250 MPa. For the pressure value of 300 MPa, there is a slight increase in the value of destructive efficiency for a cyclic mode of application. However, it should be noted that the improvement made, of the order of 1, 5, is not significant.
  • the application mode of the pressure MA was continuous and the rate of application of the pressure was relatively "conventional", that is to say equal to 3.33 MPa. s "1.
  • the ree of treatment was 10 minutes and the treatment temperature was
  • the objective of this example is to evaluate the impact of the treatment temperature on the inactivation of S. aureus.
  • FIG. 16 is a histogram representing the destructive efficiency (ED) (ordinate) as a function of the pressure (abscissa). The temperature was -5 ° C (hatched sticks) or 25 ° C (full sticks)
  • FIG. 16 shows a marked increase in the inactivation of S. aureus when the treatment temperature goes from + 25 ° C. to the negative temperature of -5 ° C. (hatched sticks). However, it appears that this effect is capped when the pressure increases from 250 MPa to 300 MPa, no increase in the value of the destructive efficiency being observed between these two values of the pressure.
  • Example 17 Study of the synergistic effect of inactivation of pathogens other than S aureus
  • the microorganisms of the European Pharmacopoeia were chosen as pathogens [S. aureus (ATCC 6538), P. aeruginosa (ATCC 9027), C. albicans (ATCC10231), A. niger (ATCC 16404), B. subtilis in the vegetative state (ATCC 9372)].
  • FIG. 17 is a diagram representing the destructive efficacy with respect to S. aureus, P. aeruginosa, A. niger, C. albicans and B. subtilis (ordinate) as a function of temperature (abscissa).
  • Example 18 Evaluation of the biological activity of human blood plasma by applying the parameter values characterizing an example of pathogen inactivation method of Example 17
  • the residual activity of the coagulation factors City and V was determined by the partial thromboplastin method with activator described in Example 1.
  • FIGS. 18A and B are histograms representing the percentage of plasma protein activity (% act) (ordinate) as a function of the pressure (P) in Mega Pascal (MPa) (abscissa).
  • FIG. 18 shows that at 200 MPa a relative activity of the City Factor of about 75% is observed and that of the Factor V about 58%. These values are higher than those required by the European Legislation (50% for the City factor and for the Factor V) and the French Legislation (70% for the City Factor and 50% for the Factor V
  • an example of a method of the invention makes it possible to obtain a significant destructive efficiency of the most baroresistant pathogenic agent: S aureus, that is to say a destructive efficiency of the order of 5 maintaining the biological activity of the City and V Factors.
  • an exemplary method of the invention makes it possible to obtain both a synergy of inactivation of the pathogens present in the human blood plasma while retaining the biological activity of the proteins present in the blood. blood plasma.
  • Example 19 Evaluation of the irreversibility of the inactivation of a pathogen through the "Method of securing at least one pathogen in a blood plasma sample" in a sample of human blood plasma.
  • the pathogen selected was S. aureus (ATCC 6538) because of its high resistance to pressure effects (also called baroresistance).
  • This suspension was used to prepare, on the one hand, a No. 1 tube of a volume of 4 ml serving as a control and, on the other hand, a No. 2 tube of a volume also of 4 ml intended to be submitted.
  • a treatment comprising the application of a pressure of 200 MPa at a speed of 50 MPa. s "1 , according to a mode of application of 5 cycles of 2 minutes at a temperature of -5 ° C (condition of an exemplary method of the invention).
  • the tubes No. 1 and No. 2 were kept in the freezer for 14 days.
  • Example 20 Inactivation of strains of S. aureus multi-resistant to antibiotics by implementing an exemplary method of the invention.
  • Table 2 below represents the results of the destructive efficiency (ED) obtained according to the strains tested.
  • Example 21 Inactivation of the Measles Virus Taken as a Virus Contaminating Human Blood Plasma by an Example of a Method of the Invention
  • This example aims to evaluate the effectiveness of an exemplary method of the invention vis-à-vis a virus.
  • the inventors have selected as virus that of measles.
  • the infectivity of the measles virus before and after treatment with an example of a method of the invention was evaluated by infecting vero cells (S. ROZENBLATT, T. KOCH, O. PINHASI, S. BRATOSIN, " Infective substructures, Measuring viruses from Acutely and Persistently Infected CeIIs, J. of Virology (1979), 32, pp. 329-333 (Ref 21)).
  • Table 3 Title of the virus before application of an example of the method of the invention (before HP) or after application of an example of the method of the invention (after HP)
  • an example of a method of the invention makes it possible to inactivate the measles virus in human blood plasma.
  • Example 22 Inactivation of the Human Immunodeficiency Virus (HIV) taken as a virus contaminating human blood plasma by an example of the method of the invention
  • HIV is a retrovirus that infects CD4 + T cells. At the beginning of the infection, it binds to these receptors and then fuses with the membrane of the host cell. Its two RNA strands are then retranslated into double-stranded DNA thanks to its reverse transcriptase. Integrase then allows this DNA to integrate into the genome of the host cell.
  • the infection is carried out on HeLa P4 cells, which have a Lac Z reporter gene whose expression is under the control of a promoter activated by the Tat protein.
  • a Lac Z reporter gene whose expression is under the control of a promoter activated by the Tat protein.
  • a first sample was subjected to an exemplary method of the invention, namely a pressure of 200 MPa, an application speed of 50 MPa. s "1 , a mode of application of the pressure of 5 cycles of 2 minutes and a temperature of -5 ° C while the second was placed in the refrigerated bath in which plunged the experiment chamber (" witness of At the end of these treatments, the viral supernatants were recovered to infect 96-well plates in which HeLa P4 cells were cultured according to the protocol described in P. CHARNEAU, G. MIRAMBEAU, P. ROUX, S. PAULOUS, H. BUC, F. CLAVEL, "HIV-1 Reverse Transcription - A termination step at the center of the genome", J.
  • FIG. 19 represents the intensity of fluorescence (ordinate) as a function of the dilution factor (abscissa). The crosses correspond to the results obtained with (HP), the black squares to the results obtained with a control "T".
  • results reported in FIG. 19 show a decrease in the signal detected in the wells having been infected by the viral supernatants subjected to an example of the method of the invention compared to those having received the viral supernatants of the "temperature control ". There has therefore been an inactivation of HIV-1 by an exemplary method of the invention. The viral supernatants of this plate were still recovered to infect new cells. The infection process is identical to the aforementioned infection method. The results observed 72 h after this reinfection are shown in FIG.
  • Blood parasites are a problem for transfusions and injections of blood products. Indeed, post-injection parasitosis of these products has been reported, including malaria, more rarely leishmaniasis, and in South America, Chagas disease.
  • the third the "temperature control" was immersed in the refrigerated bath in which the high-pressure chamber was placed in order to evaluate the effect of freezing alone on the parasites,
  • Each of the samples control or having undergone high pressure treatment, was observed by optical microscopy.
  • the microscope used was an OLYMPUS CA20.
  • P. berghei, Tbb and T. Feo the samples were then injected into healthy mice. The number of surviving mice one month after the injection then made it possible to conclude on the inactivating effect of the application of this treatment.
  • T. cruzi and L. donovani the samples were put back into contact with the culture media specified above and were placed in the incubator for 5 weeks at 35 ° C. for T. cruzi and at 28 ° C. without CO2. for L.donovani to observe a possible multiplication of parasites.
  • the sample volume was 1 mL of suspension of high pressure treated parasites for 9 mL of culture medium.
  • the "transport" controls correspond to the samples having followed the same experimental conditions with the exception of the treatment with an example of the process of the invention and remained all day at room temperature.
  • the "temperature” controls correspond to the samples having been immersed in the refrigerated bath in which the high pressure chamber was placed in order to evaluate the effect of freezing alone on the parasites.
  • an example of a method that is the subject of the present invention makes it possible to inactivate all the parasites tested.
  • the objective of the present invention is to verify that the plasma having been subjected to a process which is the subject of the invention is not immunogenic.
  • monocytes were placed in the presence of plasma treated according to an exemplary method of the invention.
  • DCs dendritic cells
  • Monocytes were prepared from a whole blood bag according to the method described hereinafter.
  • the blood was distributed in Falcon tubes (registered trademark) at 50 mL per tube and the tubes were centrifuged for 15 min at 900 rpm without brake. The plasma was then removed and the pellet is taken up in PBS (qs 50 ml). After homogenization, the tubes were again centrifuged for 15 min at 2500 rpm without brake. The "buffy coat" present between the "plasma-PBS” and “red blood cells” layers is removed and then supplemented with RPMI (qs 35 mL). After homogenization, this suspension was poured very gently into a tube containing 15 ml of Ficoll. The tubes were centrifuged for 20 min at 2000 rpm without brake.
  • the serum was then aspirated and the monocyte-containing ring was removed and transferred to a new Falcon tube.
  • the tubes were supplemented with RPMI + L-Glutamine + SVF 8% medium (qs 50 mL) and then centrifuged. for 10 minutes at 1500 revolutions per minute.
  • the supernatants were removed and the pellets were taken up in 5 ml of medium before being pooled in a single Falcon tube, which was supplemented to 50 ml with medium. After centrifugation for 10 min at 900 rpm, the supernatants were removed, and the pellets were taken up in 20 ml of medium.
  • the cells were counted in Malassez cell to determine the concentration. After centrifugation at 1500 rpm for 10 min, the pellets were resuspended in a medium volume defined to have a monocyte concentration of about 4.10 6 cells / mL.
  • monocytes were then distributed in 6-well plates at a concentration of 4.10 6 cells / mL (2 mL / well). Plates were incubated for 2 hours to allow monocytes to adhere to the bottom of puffs.
  • the monocyte culture medium comprising RPM I (marketed by Sigma), Fetal Calf Serum (FBS) and penicillin was subsequently replaced by:
  • GMSCF granulocyte-macrophage colony stimulating factor
  • IL4 interleukin 4
  • the plates were then incubated for 3 to 5 days at 37 ° C / 5% CO 2.
  • Supernatants containing dendritic cells (DC) were recovered and centrifuged. After washing with phosphate buffered saline (Phosphate Buffer Saline (PBS)) containing the cells, they were resuspended in phosphate buffered saline (PBS).
  • PBS phosphate buffered saline
  • the suspensions thus prepared were divided and placed in the presence of markers coupled to a fluorochrome. These markers are generally IgGs capable of binding specifically to markers expressed on the cell surface. The following markers have been selected:
  • ⁇ CD14 expressed on the surface of monocytes but not DC
  • ⁇ CD40 and HLA-Dr over-expressed on the surface of DC
  • ⁇ CD80 expressed on the surface of mature DCs.
  • a population of P1 cells was defined according to the size of the expected cells (SSC: Sideways Scatter Channel - signal correlated to the cellular complexity, FSC: Forward Scatter Channel - signal correlated with the relative size of the cells).
  • SSC Sideways Scatter Channel - signal correlated to the cellular complexity
  • FSC Forward Scatter Channel - signal correlated with the relative size of the cells.
  • results obtained are shown in Table 5 below: The most significant results are those obtained with the CD14 and CD40 markings. Indeed, the CD14 marker is expressed only on the surface of monocytes and not DC while the CD40 marker is over-expressed on DC.
  • the monocytes remained in their initial form, the fluorescence associated with the CD14 marker being higher than that of CD40.
  • the method of the present invention makes it possible to inactivate at least one pathogen, for example a pathogen in human blood plasma, while maintaining the biological activity of said plasma.
  • the plasma obtained can, for example be used in the therapeutic field.
  • Tf is a factor H and plasminogen binding protein. The Journal of Immunology vol.179 (5): 2979-

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Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé d'inactivation d'au moins un agent pathogène d'un échantillon de plasma sanguin humain comprenant la compression adiabatique dudit échantillon, la température dudit plasma à la pression P1 étant compris entre -10°C et -3°C du fait de la compression, le maintien éventuel de la pression Pi durant un temps compris entre 110 et 130 secondes, et la détente adiabatique de l'échantillon. La présente invention se rapporte également à l'utilisation du procédé de l'invention et au plasma obtenu par le procédé de l'invention. Le procédé et les produits obtenus par ce procédé trouvent notamment des applications dans les domaines thérapeutiques et non thérapeutiques.

Description

PROCEDE D' INACTIVATION D'AU MOINS UN AGENT PATHOGENE DANS UN ECHANTILLON DE PLASMA SANGUIN HUMAIN
DESCRIPTION
Domaine technique
[001] La présente invention se rapporte à un procédé d'inactivation d'au moins un agent pathogène d'un échantillon de plasma sanguin humain, à un plasma obtenu par ce procédé et à un dispositif pour la mise en œuvre du procédé.
[002] Le plasma sanguin humain obtenu est un plasma biologiquement actif dans lequel au moins un agent pathogène est inactivé.
[003] Le procédé et les produits obtenus par ce procédé trouvent notamment des applications dans les domaines thérapeutiques et non thérapeutiques.
[004] Dans la description ci-dessous, les références entre parenthèses (Réf) renvoient à la liste des références présentées à la fin du texte.
Etat de la technique
[005] La sécurisation du plasma sanguin humain, qui peut être considérée comme l'inactivation des agents pathogènes et la sauvegarde de ses propriétés thérapeutiques, est actuellement assurée par des procédés chimiques. Il s'agit de procédés comprenant l'ajout dans le plasma de substances chimiques susceptibles de le décontaminer, par exemple des solvants et détergents etc., des procédés associant substances chimiques et procédés physico-chimiques, par exemple des molécules photosensibles associées à une illumination par une radiation lumineuse de longueur d'onde donnée (UV par exemple), ou des procédés thermiques, par exemple la pasteurisation à 600C après ajout de stabilisateurs de protéines, la filtration, l'irradiation gamma... (Réf.1 ) C. Naegelen et al. [Evolution des techniques de préparation des produits sanguins labiles (PSL) : inactivation des pathogènes dans les PSL], Transfusion Clinique et Biologique 16 (2006) pp.179-189.
[006] Ces procédés sont contraignants du fait que tout ajout d'une substance étrangère dans le plasma sanguin humain implique à l'issue du procédé une étape d'élimination et/ou de purification du plasma ou qu'ils affectent les propriétés du plasma. Cette étape finale ne permet pas d'obtenir un plasma sanguin « identique ». En effet, l'élimination des substances chimiques n'est jamais totale et peut entrainer une toxicité à long terme, par exemple par accumulation. Par ailleurs, le traitement du plasma à des températures élevées, c'est-à-dire supérieure ou égale à 600C dénature les protéines présentes et donc de ce fait oblige à ajouter encore des produits chimiques pour stabiliser ces protéines.
[007] Des procédés de traitements sous hautes pressions sont connus dans le domaine agro-alimentaire pour inactiver certains agents pathogènes tels que des moisissures, des bactéries et parfois des virus. Par exemple A. JOFRE et al. [LWT Food Science and Technology 42(5) (2009) p.924-928, intitulé « Efficiency of high hydrostatic pressure at 600 MPa against food-borne micro-organisms by challenge test convenience »] (Ref.2) décrivent l'application d'une pression de 600 MPa afin de sécuriser des aliments.
[008] D'autres procédés ont été utilisés afin d'inactiver des agents pathogènes, par exemple Staphylococcus aureus {S. aureus) dans du jambon (CC. TASSOU et al. « Temperature-assisted high hydrostatic pressure inactivation of Staphylococcus aureus in a ham model System: évaluation in sélective and non sélective médium » J. Applied Microbiology 104 (2008), 1764-1773 (Ref.3). Les résultats obtenus ont montré qu'il était nécessaire d'appliquer une pression de 500 MPa à 200C pendant 45 minutes afin d'atteindre une réduction de 5 log de la quantité de pathogènes présents. Une réduction de 6 log était atteinte à 400 MPa avec un chauffage du milieu à 55°C pendant les 7 premières minutes du traitement. Les pressions et températures utilisées dans cet article ne permettent pas le maintien de l'activité biologique du plasma sanguin humain.
[009] Des travaux antérieurs ont également mis en évidence qu'il était notamment nécessaire d'atteindre des valeurs élevées de la pression (environ 500 MPa) afin d'obtenir une réduction à température ordinaire, c'est-à-dire à 200C de 6 log de la population de Staphylococcus aureus (S. aureus) au sein d'un milieu modèle tel que le bouillon tryptone-sel [Y. RIGALDIE : « Sur l'impact des traitements sous Hautes Pressions dans la décontamination et la stérilisation de formes pharmaceutiques renfermant des molécules thérapeutiques sensibles aux procédés énergétiques » Thèse de l'Université Bordeaux 1 (01 juillet 2002) N°d'ordre 2526 (Réf. 4)]. Les valeurs élevées de la pression nécessaires pour inactiver certains pathogènes dont S. aureus sont une contrainte importante pour la mise au point d'un procédé d'inactivation d'un agent pathogène dans du plasma sanguin tout en conservant l'activité biologique dudit plasma.
[0010] Par ailleurs dans Y. RIGALDIE et al. [« Pharmaceuticals perspectives of High Pressures : a soft tool for sterilization of fragile drugs » Defect and Diffusion Forum 208-209 (2002), 55-58 (Réf. 5)] il a été montré d'une part que l'inactivation de S. aureus par un traitement Hautes Pressions en continu atteignait dans un milieu modèle (par exemple un bouillon tryptone-sel) environ 2,3 log pour un traitement de 10 minutes à 600 MPa et d'autre part que de basses températures (-170C) avait peu d'effet sur l'inactivation par rapport à la température ambiante.
[0011] II est connu que le plasma sanguin humain possède des propriétés biologiques spécifiques. En effet, le plasma comprend environ trois cents protéines différentes. Les protéines les plus représentées en proportion sont l'albumine, les anticorps ou Immunoglobulines, le fibrinogène, l'alpha 1 antitrypsine, l'alpha 2 macroglobuline, la transferrine, les lipoprotéines (HDL et LDL). Il comprend également les facteurs de coagulation qui sont pris dans la plupart des cas comme référence pour mesurer l'activité biologique du plasma. Le plasma est « biologiquement actif » lorsque l'activité des facteurs de coagulation, notamment les facteurs Ville, V et Xl présents dans le plasma est supérieure à 50% (Pharmacopée Européenne 5.6 01/2007 :1646 (Réf. 6). Le plasma peut, au travers de certaines de ses protéines, interagir avec les membranes de certains micro-organismes (A. KUNERT et al. The Journal of Immunology 179 (2007), 2979-2988 (Ref.7) ou induire la sporulation (l'introduction dans le plasma d'une suspension composée d'environ 50% de forme végétative de B.subtilis et de 50% de forme sporulée de B. subtilis conduit très rapidement à une sporulation quasi-totale).
[0012] Différentes études ont montré que le traitement du plasma sanguin à des pressions comprises entre 200 et 500 MPa à une température de -100C n'était pas intéressante pour la conservation des produits sanguins et que cette méthode n'était pas à retenir pour l'inactivation de virus et de microorganismes dans les produits sanguins (A. M. MATSER et al. « High Pressure processing for préservation of blood products » High Pressure Research 25 (2005), p.37-41 ) (Ref.8).
[0013] La demande internationale WO 02/056824 (Réf. 9) décrit un procédé de stérilisation de produits sanguins utilisant des valeurs de pressions incompatibles avec la conservation de l'activité biologique du plasma sanguin. Différentes combinaisons de températures et pressions sont testées, cependant ces combinaisons ne permettent pas de maintenir l'activité des facteurs de coagulation Ville, V et Xl afin d'obtenir un plasma sanguin humain biologiquement actif. Par ailleurs, dans ce document, les procédés diffèrent en fonction de l'agent pathogène ; ce qui rend ces procédés difficilement industhalisables.
[0014] D'autres essais ont été réalisés dans l'état de la technique afin d'inactiver S. aureus dans le plasma sanguin (« Deciphering
Mechanisms for Infectious Agent Inactivation Using Cyclic High Pressure or Pressure Cycling Technology » F. TAO et al. (BBI Inc.- Boston Biomedica Inc.) BIOPHYSICS 2003 - Poster 021604 (Réf.10).
[0015] Dans l'article de S. DUSING et al. [« Inactivation of viruses in plasma by cycled puises of high pressure » Trends in High Pressure Bioscience and Biotechnology, Ed. R. HAYASHI, Elsevier Science BV (2002)] (Ref.11 ), seuls sont pris en compte le mode d'application de la pression, notamment des cycles de 60 secondes à hautes pressions c'est- à-dire entre environ 400 et 500 MPa, séparés par 300 secondes à pression ambiante et des basses températures c'est-à-dire environ -200C. Les pressions utilisées dans ce document ne sont pas compatibles avec la conservation de l'activité biologique du plasma sanguin humain.
[0016] Aussi, il existe un réel besoin dans l'état de la technique palliant ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, en particulier d'un procédé permettant d'inactiver au moins un agent pathogène dans le plasma sanguin humain et permettant également de garder l'activité de protéines plasmatiques, par exemple les facteurs Ville, V et Xl afin que le plasma soit biologiquement actif.
[0017] II existe également un réel besoin dans l'état de la technique de trouver un procédé permettant d'inactiver au moins un agent pathogène dans le plasma sanguin humain et permettant également de garder l'activité biologique sans introduction de produits externes, par exemple des produits chimiques, et sans étape postérieure de purification afin d'éliminer des produits introduits susceptibles d'être toxiques, par exemple par accumulation ou tout autre processus.
[0018] En particulier, il existe un réel besoin dans l'état de la technique de trouver un procédé plus efficace permettant de réduire les coûts, de diminuer le temps nécessaire pour l'inactivation et d'améliorer l'efficacité d'inactivation d'au moins un agent pathogène tout en conservant l'activité biologique du plasma sanguin humain.
Description de l'invention [0019] La présente invention permet de résoudre notamment ces défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur en fournissant un procédé d'inactivation d'au moins un agent pathogène d'un échantillon de plasma sanguin humain comprenant au moins 5 cycles comprenant chacun :
la compression dudit échantillon de sa pression initiale Po à une pression P1, P1 éta nt com pri s d e 1 90 à 21 0 M Pa , l a température dudit plasma à la pression P1 étant comprise entre -100C et -3°C du fait de la compression,
- le maintien éventuel de la pression P1 durant un temps compris de 1 10 à 130 secondes, et
la détente de l'échantillon jusqu'à la pression P0, la vitesse d'augmentation de la pression pour ladite compression et la vitesse de diminution de la pression pour ladite détente sont réalisées à une vitesse V1 comprise de 47,5 à 52,5
MPa.s"1.
[0020] En d'autres termes, la présente invention a pour objet un procédé d'inactivation d'au moins un agent pathogène d'un échantillon de plasma sanguin humain comprenant au moins 5 cycles comprenant chacun :
la compression dudit échantillon de sa pression initiale Po à une pression P1, P1 éta nt com pri s d e 1 90 à 21 0 M Pa , l a température dudit plasma à la pression P1 étant comprise entre -100C et -3°C du fait de la compression,
- le maintien éventuel de la pression P1 durant un temps compris de 1 10 à 130 secondes, et
la détente de l'échantillon jusqu'à la pression P0, ladite compression et ladite détente étant réalisée à une vitesse V1 de 47,5 à 52,5 MPa.s"1. [0021] De manière surprenante et totalement inattendue, les inventeurs ont démontré que la combinaison des différents paramètres définis dans le procédé de l'invention permet d'inactiver au moins un agent pathogène avec une efficacité très supérieure aux procédés de l'état de la technique, et permet en outre de conserver l'activité biologique de l'échantillon de plasma sanguin humain traité.
[0022] En outre, les inventeurs ont montré que, de manière surprenante et inattendue, les caractéristiques du procédé de l'invention ont un effet synergique sur l'inactivation de cibles biologiques, par exemple au moins un agent pathogène, permettant ainsi d'inactiver lesdites cibles tout en conservant l'activité biologique de l'échantillon de plasma sanguin humain.
[0023] De plus le procédé de l'invention permet l'inactivation d'au moins un agent pathogène sans introduction de produits externes et ne nécessite pas d'étape de purification permettant ainsi de réduire le temps et les coûts de réalisation.
[0024] Le procédé de l'invention permet donc avantageusement d'inactiver au moins un agent pathogène présent dans le plasma sanguin humain mais également de conserver l'activité biologique dudit échantillon de plasma sanguin humain.
[0025] Dans la présente par « échantillon de plasma sanguin humain», il est entendu tout échantillon de plasma provenant d'un être humain quel que soit son origine, âge, sexe, taille et/ou poids. L'échantillon peut également avoir été préalablement traité par toute technique connue de l'homme du métier pour, par exemple, sa conservation, par exemple par congélation
[0026] Dans la présente par « inactivation», il est entendu la suppression de l'activité biologique d'au moins un agent pathogène ou d'un ensemble d'agents pathogènes. Par exemple, l'inactivation ne permet pas une reprise de l'activité biologique de l'agent pathogène. L'inactivation peut être constatée par toute méthode connue de l'homme du métier. Par exemple, il peut s'agir de l'absence de croissance d'un agent pathogène dans un milieu adapté pour sa croissance et/ou de transmettre son activité pathogène [« Pathogen inactivation techniques » , J. P. R. PELLETIER, S. TRANSUE , E. L. SNYDER, Best Practice & Research Clinic Haematology vol.19 (1 ) (2006) ,pp.205-242 ] (Ref.12)
[0027] Dans la présente par « agent pathogène » il est entendu toute entité biologique connue de l'homme du métier. Par exemple, il peut s'agir d'une bactérie, d'une moisissure, d'un virus, d'une levure, d'une protéine infectieuse et/ou de parasites. Par exemple, l'agent pathogène peut être choisi dans le groupe comprenant les agents pathogènes de la pharmacopée européenne décrit dans Pharmacopée Européenne 6.0, 5.1 Textes Généraux sur la microbiologie 01 /2008 :50101 (Ref.13), par exemple il peut s'agir d'agents pathogènes responsables de maladies, par exemple Candida albicans, Aspergillus Niger, Bacillus subtilis ou encore responsables de maladies nocosomiales, par exemple Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa.
[0028] Dans la présente par « adiabatique », il est entendu l'accroissement ou la d im inution de température résultant de la compression ou de la décompression notamment d'un constituant liquide ou gazeux dans un système clos en raison du premier principe de la thermodynamique. [E. HECHT « Physique » Editeur : De Boech (1999)] (Réf. 14)
[0029] Dans la présente la pression initiale P0 est par exemple la pression à laquelle se trouve l'échantillon avant la mise en œuvre du procédé de l'invention. Par exemple, la pression P0 peut être égale à la pression atmosphérique, ou toute pression de stockage de plasma sanguin inférieure à Pi. La pression initiale peut être, par exemple égale à environ 0,1 MPa.
[0030] Dans la présente par « vitesse d'augmentation et/ou de diminution de la pression », il est entendu une vitesse exprimée en Méga Pascal par seconde (MPa. s"1). Elle peut être linéaire et/ou variable, dans ce dernier cas on parle alors plutôt de cinétique.
[0031] Selon l'invention, l'échantillon de plasma sanguin humain auquel est soumis le procédé de l'invention est de préférence contenu dans tout contenant connu de l'homme du métier pour être résistant aux pressions du procédé de l'invention. Par exemple, dans des contenants hermétiques et/ou déformables, par exemple un tube de prélèvement, une poche plastique pour transfusion, un récipient stérile, un emballage spécifique par exemple des emballages décrits dans Y. LAMBERT, G. DEMAZEAU, A. LARGETEAU, S. LABORDE-CROUBIT, M. CABANNES and J. M. BOUVIER, [« New packaging solutions for high pressure treatments of foods ». High Pressure Research. 2000, vol 19, 207-212] (Réf. 15).
[0032] Par exemple, l'emballage peut comprendre une surface interne en contact avec le plasma compatible chimiquement et biologiquement avec le plasma et une surface externe en contact avec le milieu transmetteur compatible chimiquement avec ce dernier, par exemple en terme de perméabilité, etc tel que décrit dans la Pharmacopée
Européenne 5.0 01/2005 : 30203 (Réf. 16)
[0033] L'emballage peut par exemple comprendre une connectique, c'est-à-dire des moyens permettant de remplir et/ou de vider l'emballage. Par exemple, une connectique peut permettre le remplissage et/ou l'utilisation, par exemple thérapeutique du plasma sanguin humain après mise en œuvre d'un procédé selon l'invention.
[0034] Par exemple, l'emballage hermétique peut être tout emballage connu de l'homme du métier répondant de préférence aux 4 critères suivants : (i) la conservation de l'herméticité dudit emballage et sa connectique, (ii) la compatibilité chimique entre la surface intérieure de l'emballage et de sa connectique avec le plasma, et avec un milieu transmetteur de pression pour sa partie externe, (iii) le maintien des propriétés barrières notamment afin d'éviter tout transfert gazeux ou de molécules chimiques au travers de la paroi, (iv) la sauvegarde de l'intégrité chimique de l'emballage, c'est-à-dire le non relargage de molécules chimiques vers le contenant plasma.
[0035] Dans la présente, la pression peut être appliquée de manière isostatique au moyen d'un liquide transmetteur de pression.
[0036] Dans la présente par « application de la pression de manière isostatique », il est entendu l'application uniforme de la pression en tout point de l'échantillon.
[0037] Dans la présente par « milieu transmetteur », il est entendu tout milieu connu de l'homme du métier susceptible d'être utilisé dans le procédé de l'invention. Par exemple, il peut s'agir d'un milieu liquide ou gazeux. Par exemple, il peut s'agir d'un milieu liquide facile à mettre en œuvre et souvent choisi en fonction de sa température de fusion, notamment lors de son utilisation à basse température, par exemple un milieu dont la température de fusion est inférieure à la température de traitement de l'échantillon par exemple un milieu liquide apolaire, par exemple l'hexane, le glycol ou d'un milieu polaire, par exemple le propanol, le n-butanol, l'éthanol, l'acide acétique, l'isopropanol, de préférence le milieu liquide transmetteur est choisi dans le groupe comprenant un mélange glycol et eau, par exemple le Kryo 30 Lauda, et l'éthanol.
[0038] L'application de la pression de manière isostatique permet avantageusement de comprimer et de détendre de manière uniforme et sans gradient de pression en tout point de l'échantillon.
[0039] Dans la présente par « activité biologique d'un échantillon de plasma sanguin humain », il est entendu une activité des facteurs Ville, V et Xl présents dans le plasma supérieure à 50% telle qu'indiquée par la norme de la Pharmacopée Européenne relative au plasma humain viro- inactivé (Pharmacopée Européenne 5.6 01/2007 :1646 (Réf.6) et/ou supérieure à 70% pour le facteur Ville et supérieure à 50% pour les facteurs V et Xl telle que requise par la Législation française (Réf.17). [0040] Dans la présente, la température initiale T0 de l'échantillon avant compression peut être choisie, par exemple, en fonction de la vitesse de montée en pression Vi, de la nature chimique du mil ieu transmetteur de pression et de la valeur de la pression. Par exemple, la température initiale peut être comprise de -18°C à -3°C.
[0041] Selon un mode particulier de réalisation du procédé de l'invention, la compression et/ou la détente sont adiabatiques.
[0042] Dans la présente invention, la pression Pi peut être égale à
200 MPa.
[0043] Dans la présente la température dudit plasma à la pression
Pi peut être comprise de -100C à -3°C, de préférence de -8°C à -4°C, de manière encore plus préférée égale à environ -5°C.
[0044] Dans la présente invention, la pression Pi peut être maintenue pendant une durée de 110 à 130 secondes par cycle, par exemple pendant une durée de 120 secondes par cycle.
[0045] La présente invention a également pour objet l'utilisation du procédé défini précédemment pour l'inactivation d'au moins un agent pathogène et/ou d'un ensemble d'agents pathogènes dans le plasma sanguin humain.
[0046] La présente invention a également pour objet le plasma sanguin humain obtenu par le procédé défini précédemment.
[0047] Le plasma sanguin humain obtenu par le procédé de l'invention peut être avantageusement utilisé dans le domaine médical, par exemple pour le traitement de différentes pathologies, pour des transfusions comme décrit dans le document de l'Agence Française de
Sécurité Sanitaire des Produits de Santé « Transfusion de plasma frais congelé : produits, indications » (2002) (Réf. 18) et/ou toute autre pathologie.
[0048] Le plasma obtenu par le procédé de l'invention possède de manière avantageuse les propriétés biologiques du plasma sanguin humain selon les normes de la pharmacopée européenne et également de la Législation Française.
[0049] D'autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous, illustrés par les figures annexées, donnés à titre illustratif.
Brève description des figures
- Les figures 1 A à C sont des histogrammes représentant le pourcentage d'activité de protéines plasmatiques (ordonnée) en fonction de la pression en Méga Pascal (MPa) (abscisse). En particulier, elles représentent respectivement l'effet de la valeur de la pression sur l'activité du facteur de coagulation VIIIIc (figure 1A), du facteur de coagulation V (figure 1 B), du facteur de coagulation Xl (figure 1 C), la vitesse d'application est de 3,33 MPa. s"1, le temps d'application, également dénommé maintien de la pression, de 10 minutes à température ambiante.
- Les figures 2 A à C sont des histogrammes représentant le pourcentage d'activité de protéines plasmatiques (ordonnée) en fonction de la pression en MPa (abscisse) pour trois vitesses différentes d'application de la pression. En particulier, elles représentent respectivement l'effet de la vitesse d'application de la pression sur l'activité du facteur de coagulation Ville (figure 2A), du facteur de coagulation V (figure 2B), du facteur de coagulation Xl (figure 2C) pour différentes valeurs de la pression (100, 150, 200 et 250 MPa), la pression étant appliquée pendant 10 minutes à température ambiante.
- Les figures 3 A à C sont des histogrammes représentant le pourcentage d'activité de protéines plasmatiques (ordonnée) en fonction de la pression en MPa (abscisse) et de différents modes d'application la pression et pour une même durée totale de traitement. La vitesse d'application de la pression est de 3,33 MPa. s"1 à température ambiante. En particulier, les figures 3A, 3B et 3C représentent respectivement l'effet du mode d'application de la pression sur l'activité des facteurs de coagulation VIIIIc, V et XI en mode continu (10 minutes), modes cycliques (5 cycles de 2 minutes et 20 cycles de 30 secondes).
- Les figures 4 A à C sont des histogrammes représentant le pourcentage d'activité de protéines plasmatiques (ordonnée) en fonction de la pression en MPa (abscisse) pour deux valeurs de la température : ambiante et
-15°C. La vitesse d'application de la pression est supérieure ou égale à 50 MPa. s"1 et le temps d'application de la pression de 10 minutes. En particulier, les figures 4A, 4B et 4C représentent respectivement l'effet de la température sur l'activité des facteurs de coagulation en fonction de la valeur de la pression.
- Les figures 5 A à C sont des histogrammes représentant le pourcentage d'activité de protéines plasmatiques (ordonnée) en fonction de la pression en MPa (abscisse), de la vitesse d'application de la pression et de la température. En particulier, les figures 5 A à C représentent respectivement l'effet de la combinaison d'une vitesse d'application rapide, d'une application cyclique de la pression et des températures sur l'activité des facteurs de coagulation VIIIIc, V et Xl, la vitesse d'application étant supérieure ou égale à 50 MPa. s"1, le temps d'application de 2 minutes répété 5 fois et la température de -15°C.
- La fig u re 6 est u n d iag ram me représentant l ' i nactivation de Staphylococcus aureus dans du plasma sanguin humain (ordonnée) en fonction de la température (abscisse) pour une combinaison de paramètres caractéristiques du traitement : une vitesse d'application de la pression de 50 MPa. s"1, d'un mode d'application cyclique de la pression de 5 cycles de 2 min et pour une pression de 200 MPa. En particulier, cette figure représente l'effet drastique de la température sur l'inactivation par des hautes pressions de Staphylococcus aureus en suspension dans du plasma sanguin humain.
- La fig u re 7 est u n d iag ram me représentant l ' i nactivation de Staphylococcus aureus (ordonnée) en fonction de la température (abscisse) dans du plasma sanguin humain pour des valeurs croissantes de pression allant de 200 à 300 MPa.
- La figure 8 est un diagramme représentant l'inactivation de S. aureus, de P. aeruginosa, de A. niger et de C. albicans (ordonnée) en fonction de la température (abscisse). En particulier, cette figure représente l'effet de la température sur l'inactivation de 4 microorganismes mis en suspension dans un échantillon de plasma sanguin humain.
- La figure 9 est un h istog ramme représentant l' inactivation de Staphylococcus aureus (ordonnée) en fonction de la pression (abscisse) et de la vitesse d'application de la pression. En particulier, cette figure représente l'effet de la vitesse d'application de la pression sur l'inactivation de Staphylococcus aureus en suspension dans du plasma sanguin humain en sélectionnant comme mode d'application de la pression 5 cycles de 2 minutes et une température de -5°C environ.
- La figure 10 est un histogramme représentant le pourcentage d'activité de facteurs de coagulation (ordonnée) en fonction de la pression (abcisse) pour diverses valeurs de la vitesse d'application de la pression. La figure 10A représente le pourcentage d'activité du facteur Ville (FVIIIc) et la figure 10B le pourcentage d'activité du facteur V (FV). En particulier, cette figure représente l'effet de la vitesse d'application de la pression sur l'activité des facteurs de coagulation au cours d'un traitement cyclique (5χ2min) à basse température (Température d'environ -5°C).
- La figure 11 est une photographie représentant l'observation au microscope optique (Objectif *100) de sang contaminé par Plasmodium berghei avant (A) et après traitement par le « Procédé Hautes Pressions de Sécurisation du Plasma » (B). (N : Noyau, C : Cytoplasme, V : Vacuole)
- La figure 12 représente le résultat d'une analyse par Western Blot d'échantillons de plasma sanguin humain infectés ou non par la protéine infectieuse du prion de hamster (263 K), TIx : Témoin infecté non traité par le procédé, HPIx : Echantillon infecté traité par le procédé, TNx : Témoin négatif non traité par le procédé, HPNx : Témoin négatif traité par le procédé.
- La figure 13 est un histogramme représentant l'efficacité destructrice (ED) (ordonnée) en fonction de la pression (abscisse). La vitesse d'application de la pression était de 3.33 MPa. s"1, le mode d'application (MA) continu, la durée de traitement de 10 minutes et la température de traitement de 25°C.
- La figure 14 est un histogramme représentant l'efficacité destructrice (ED) (ordonnée) en fonction de la pression (abscisse). La vitesse d'application de la pression était de 3.33 MPa. s"1 (bâtons pleins) ou de 50 MPa. s"1 (bâtons hachurés).
- La figure 15 est un histogramme représentant l'efficacité destructrice (ED) (ordonnée) en fonction de la pression (abscisse). La vitesse d'application de la pression était de 3.33 MPa. s"1. Le mode d'application de la pression était de 5 cycles de 2 minutes (bâtons hachurés), de 20 cycles de 30 secondes (bâtons vides) ou d'un cycle de 10 minutes (bâtons pleins)
- La figure 16 est un histogramme représentant l'efficacité destructrice (ED) (ordonnée) en fonction de la pression (abscisse). La température était de - 5°C (bâtons hachurés) ou de 25°C (bâtons pleins)
- La figure 17 est un diagramme représentant l'inactivation de S. aureus, de P. aeruginosa, de A. niger, de C. albicans et de B. subtilis (ordonnée) en fonction de la température (abscisse).
- Les figures 18 A et B sont des histogrammes représentant le pourcentage d'activité de protéines plasmatiques (%act) (ordonnée) en fonction de la pression (P) en Méga Pascal (MPa) (abscisse). En particulier, elles représentent respectivement l'effet de la valeur de la pression sur l'activité du facteur de coagulation VIIIIc (figure 18A), du facteur de coagulation V (figure 18B).
- La figure 19 représente l'intensité de la fluorescence (ordonnée) en fonction du facteur de dilution (abscisse). Les croix correspondent aux résultats obtenus avec le procédé (HP), les carrés noirs aux résultats obtenus avec un témoin « T ».
- La figure 20 représente l'intensité de la fluorescence (ordonnée) en fonction du facteur de dilution (abscisse). Les croix correspondent aux résultats obtenus avec le procédé (HP), les carrés noirs aux résultats obtenus avec un témoin « T ».
- La figure 21 représente les diagrammes de FACS. Sur les diagrammes SSC correspond au signal corrélé à la complexité cellulaire, FSC :signal corrélé à la taille relative des cellules, « event » au nombre total d'événements (cellule) dans la population définie, %Parent au nombre d'événements dans la population définie par le nombre total d'événements exprimé en pourcentage et « mean » à la valeur moyenne de l'intensité de fluorescence.
EXEMPLES
Exemple 1 : mesure de l'activité biologique du plasma sanguin humain après traitement sous hautes pressions
[0050] Des échantillons de 4 mL environ de plasma sanguin humain frais ont été prélevés et placés dans des tubes étanches, puis mis à congeler à -300C dans l'attente d'être traités sous hautes pressions.
[0051] Les conditions de traitement étaient les suivantes : une vitesse d'application de la pression de 100 MPa en 30 secondes (3,33 MPa. s"1), une durée de traitement de 10 minutes de manière continue à la pression désirée, c'est à dire de 100 MPa à 250 MPa et une température ambiante de l'ordre de 200C.
[0052] Les échantillons ont été placés dans un dispositif générateur de hautes pressions en phase liquide par compression directe de type « Framatome », le milieu transmetteur était le mélange glycol/eau (Kryo 30
Lauda).
[0053] Par application continue de la pression, il est entendu une application constante de la pression à une valeur donnée.
[0054] L'activité des facteurs de coagulation : facteur Ville, facteur V et facteur Xl a été choisie comme référence afin de déterminer l'activité biologique du plasma sanguin humain. Cette activité a été déterminée avant et après traitement par la méthode du temps de céphaline avec activateur décrite dans la notice d'utilisation STA CK. PREST (Diagnostica Stago) (Réf 19). Ce dosage consiste à mesurer, en présence de céphaline et d'activateur, le temps de coagulation d'un plasma immuno- déplété en facteur à doser, le facteur de coagulation manquant étant apporté par l'échantillon à tester. Pour chaque facteur de coagulation, le pourcentage d'activité résiduelle est ensuite déterminé par le rapport entre la valeur d'activité après traitement hautes pressions et la valeur d'activité avant traitement hautes pressions. L'effet de la valeur de la pression sur le pourcentage d'activité résiduelle pour ces trois facteurs de coagulation est présenté sur les figures 1 A à C.
[0055] L'analyse de l'activité résiduelle des facteurs de coagulation vis-à-vis de la pression, présentée sur la figure 1 , a montré que l'activité du facteur Xl était peu affectée après traitement à des pressions de 100 MPa et 250 MPa (soit 1000 bar et 2500 bar), en revanche les facteurs Ville et V étaient, dans ce domaine de pression, très sensibles à la pression entraînant une forte perte d'activité, c'est-à-dire de l'ordre de 80 à 100% pour une pression d'environ 250 MPa.
[0056] Tel que démontré dans cet exemple, le traitement du plasma sanguin à des pressions croissantes de 100 MPa à 250 MPa entraîne une forte diminution de l'activité des facteurs Ville et V ce qui conduit à considérer que tout procédé de sécurisation du plasma sanguin humain, c'est-à-dire tout procédé permettant l'inactivation des micro-organismes pathogènes par application de hautes pressions, s'accompagne d'une perte d'activité importante de l'activité des facteurs de coagulation et donc de la perte de l'activité biologique du plasma sanguin.
Exemple 2 : mesure de l'activité biologique du plasma sanguin humain après traitement sous hautes pressions en fonction de la vitesse d'application de la pression
[0057] Du plasma sanguin humain frais a été préparé selon le procédé décrit dans l'exemple 1. Les conditions de traitement étaient : une durée de traitement de 10 minutes de manière continue à une pression donnée allant de 100 à 250 MPa, à une température de l'ordre de 200C.
[0058] La vitesse d'application de la pression a été choisie comme variable. Dans cet exemple, trois vitesses ont été choisies avec des valeurs suffisamment différentes d'une part et des valeurs accessibles pour un équipement industriel réalisé par l'Homme de l'Art d'autre part, c'est-à-dire 100 MPa en 30 secondes (ou 3,33 MPa. s"1) (valeur identique à la vitesse d'application de la pression utilisée dans l'exemple 1 ), 100 MPa en 12 secondes (8,33 MPa.s"1) et 100 MPa en 2 secondes (50 MPa.s"1).
[0059] Les échantillons ont été placés dans un dispositif générateur de hautes pressions en phase liquide par compression directe de type « Framatome » et le milieu transmetteur était le mélange glycol/eau (Kryo 30 Lauda) pour les vitesses de 3,33 MPa.s"1 et 8,33 MPa.s"1. Un équipement générateur de hautes pressions par compression indirecte mis en place en interne avec comme milieu transmetteur l'éthanol a été utilisé pour la vitesse de 50 MPa.s"1
[0060] L'activité biologique du plasma sanguin humain a été mesurée après traitement par le pourcentage d'activité des facteurs de coagulation tel que décrit dans l'exemple 1 (facteur Ville, facteur V et facteur Xl) mesuré par la méthode du temps de céphaline avec activateur [0061] Les pourcentages d'activité résiduelle par rapport à l'activité avant traitement hautes pressions de chacun des facteurs de coagulation pour les mêmes valeurs de pression mais avec des vitesses d'application de la pression variables : 3,33 MPa. s"1, 8,33 MPa. s"1 et 50 MPa. s"1 sont représentés sur la figure 2.
[0062] L'analyse des résultats présentés sur la figure 2 a montré que la vitesse d'application de la pression dans le domaine allant de 3,33 MPa. s"1 à 50 MPa. s"1, quelle que soit la valeur de la pression de traitement et quelle que soit la nature du facteur de coagulation (facteur Ville, facteur V, facteur Xl) a peu d'effet (aux erreurs expérimentales près) sur l'activité des facteurs de coagulation, au moins pour des pressions comprises entre 100 MPa et 250 MPa.
[0063] L'absence d'effet de la vitesse d'application de la pression sur l'activité biologique du plasma est surprenante compte tenu de l'enseignement technique décrit dans la littérature, par exemple dans la demande internationale WO 00/48641 (Réf. 20) qui préconise des accroissements de pression très rapides, allant jusqu'à 1000 MPa. s"1. De plus, l'application de ces accroissements très rapides de pression sont très difficiles à mettre en œuvre avec un équipement industriel.
Exemple 3 : mesure de l'activité biologique du plasma sanguin humain après traitement sous hautes pressions en fonction du mode d'application de la pression
[0064] Du plasma sanguin humain frais a été préparé selon le procédé décrit dans l'exemple 1. Les conditions de traitement sous hautes pressions étaient : une vitesse d'application de la pression constante, égale à 100 MPa en 30 secondes (soit 3,33 MPa. s"1), la température de l'ordre de 200C, une durée de traitement de 10 minutes à une pression variant de 100 à 250 MPa.
[0065] Les échantillons ont été placés dans un dispositif générateur de hautes pressions en phase liquide par compression directe de type « Framatome » et le milieu transmetteur était le mélange glycol/eau (Kryo 30 Lauda). [0066] Le mode d'application de la pression varie selon un mode continu, c'est-à-dire le maintien de la pression constante pendant un temps de 10 minutes, ou un mode cyclique, c'est-à-dire 5 cycles de 2 minutes à la pression sélectionnée ou 20 cycles de 30 secondes à la pression sélectionnée. Les cycles correspondent, par exemple à une compression de l'échantillon, le maintien de la pression pendant un temps approprié et la détente de l'échantillon. La durée des cycles a été choisie de telle manière qu'elle puisse être transposable à l'échelle industrielle.
[0067] L'activité biologique du plasma sanguin humain a été mesurée par le pourcentage d'activité résiduelle des facteurs de coagulation tel que décrit dans l'exemple 1 (facteur Ville, facteur V et facteur Xl). L'activité de ces facteurs de coagulation a été mesurée par la méthode du temps de céphaline avec activateur décrite dans la notice d'utilisation STA CK. PREST (Diagnostica Stago) (Réf 19).
[0068] Les valeurs obtenues pour l'activité résiduelle des trois facteurs de coagulation pris comme références à l'issue de ces trois types de traitement (un en mode continu et deux en mode cyclique) pour une vitesse d'application de la pression correspondant à 3,33 MPa. s"1 et une température de l'ordre de 200C sont données sur la figure 3.
[0069] La comparaison de l'application d'une pression en mode cyclique (5 cycles de 2 minutes) par rapport à une application en mode continu pour une même durée de 10 minutes et pour une même valeur de la pression appliquée (la vitesse d'application et la température étant constantes) montre une différence de comportement entre le facteur Ville et le facteur V.
[0070] Le facteur Xl présentait toujours un comportement particulier par rapport aux deux autres facteurs de coagulation dans la mesure où son activité était peu ou pas (aux erreurs d'expérience près) perturbée par la pression.
[0071] Tel que démontré dans cet exemple, le facteur V est plus sensible que le facteur Ville au mode d'application cyclique de la pression, c'est-à-dire que son activité résiduelle apparaît davantage sauvegardée pour une application cyclique que pour une application continue pour une même valeur de la pression.
[0072] De plus de manière inattendue et surprenante, ce phénomène est plus accentué pour un mode cyclique correspondant à 5 cycles de 2 minutes par rapport à 20 cycles de 30 secondes.
Exemple 4 : mesure de l'activité biologique du plasma sanguin humain après traitement sous hautes pressions en fonction de la température
[0073] Du plasma sanguin humain frais a été préparé selon le procédé décrit dans l'exemple 1.
[0074] Les conditions de traitement étaient : une vitesse d'application de la pression constante et égale à 50 MPa. s"1, une durée de traitement en continu de 10 minutes à une pression comprise entre 100 et 300 MPa.
[0075] Les échantillons ont été placés dans un équipement générateur de hautes pressions par compression indirecte mis en place en interne avec comme milieu transmetteur l'éthanol.
[0076] Dans cet exemple, deux températures différentes de traitement ont été testées, soit la température ambiante (approximativement 200C), soit une température négative voisine de -15°C.
[0077] La mesure de l'activité biologique du plasma sanguin humain a été mesurée par le pourcentage d'activité résiduelle des facteurs de coagulation tel que décrit dans l'exemple 1 (facteur Ville, facteur V et facteur Xl) mesurée par la méthode du temps de céphaline avec activateur décrite dans la notice d'utilisation STA CK. PREST (Diagnostica Stago) (Réf 19).
[0078] Les pourcentages d'activité résiduelle (par rapport à l'activité avant traitement hautes pressions) des trois facteurs de coagulation pris comme références à l'issue de ces traitements (pour une vitesse d'application de la pression de 100 MPa en 2 secondes (soit 50 MPa. s"1), une durée de traitement de 10 minutes en mode continu) mais avec deux températures différentes (200C et -15°C environ) sont données sur la figure 4.
[0079] II apparaît de manière surprenante et inattendue que les trois facteurs de coagulation ont des comportements différents vis-à-vis de la variation de température (entre 200C et -15°C environ). Le facteur Xl demeure insensible à la température, dans les limites des erreurs expérimentales, et conserve une activité proche de 90%, quelles que soient les conditions. En revanche, la sauvegarde d'activité des facteurs Ville et V est favorisée à basses températures, en particulier c'est pour le facteur V que ce phénomène semble le plus amplifié. Par exemple à 220 MPa à -15°C, l'activité du facteur V est supérieure à 50% (et répond donc aux normes de la Pharmacopée Européenne), alors que dans les mêmes conditions de pression mais à température ambiante, c'est à dire à 200C environ, elle est très faible (environ 10%).
[0080] Tel que démontré dans cet exemple, un effet de synergie important entre basse température et vitesse d'application de la pression existe pour la conservation de l'activité des facteurs Ville et V, nettement amplifié pour le facteur V.
Exemple 5 : mesure de l'activité biologique du plasma sanguin humain après traitement sous hautes pressions en associant trois paramètres caractéristiques du traitement : la vitesse d'application de la pression, le mode d'application de la pression et une basse température
[0081] Du plasma sanguin humain frais a été préparé selon la procédure détaillée dans l'exemple 1.
[0082] Les échantillons ont été placés dans un équipement générateur de hautes pressions par compression indirecte mis en place en interne avec comme milieu transmetteur l'éthanol. [0083] Le procédé de traitement a consisté à associer un ensemble de paramètres associés à la pression : vitesse d'application de la pression, mode d'application de la pression et température, en particulier basse température, c'est à dire une température de -15°C environ.
[0084] Différentes valeurs de la pression comprises entre 100 MPa et 250 MPa ont été testées. Les valeurs des paramètres associés ont été de 50 MPa. s"1 pour la vitesse d'application de la pression, de 5 cycles de 2 minutes pour le mode d'application et une température de -15°C environ.
[0085] Le pourcentage d'activité résiduelle des facteurs de coagulation pris déjà comme références dans l'exemple 1 (facteur Ville, facteur V et facteur Xl) a été comme dans l'exemple 1 mesurée par la méthode du temps de céphaline avec activateur.
[0086] Les pourcentages d'activité résiduelle (par rapport à l'activité avant traitement hautes pressions) des trois facteurs de coagulation, à l'issue d'un traitement dans les conditions décrites ci-dessus, sont montrés sur la figure 5.
[0087] Tel que démontré dans cet exemple, de manière surprenante et inattendue, un très grand effet de synergie est observé au travers de la combinaison des paramètres associés au paramètre pression pour les facteurs Ville et V (l'effet le plus important étant observé pour le facteur V). Par exemple à 240 MPa (soit 2400 bar) l'activité du facteur V est de l'ordre de 90% et celle du facteur Ville voisine de 70%. Ces valeurs d'activités sont compatibles avec la Législation française (J. O. n°123 du 28 mai 2003, Arrêté du 29 avril 2003 fixant la liste et les caractéristiques des produits sanguins labiles) (Réf 17) et permet, en outre l'utilisation thérapeutique du plasma sanguin humain obtenu.
[0088] Si l'on se réfère à l'exemple N°1 où seule la valeur de la pression était prise en compte, on observait à 250 MPa une valeur de l'activité proche de 10% pour le facteur Ville et proche de zéro pour le facteur V. [0089] Tel que démontré dans cet exemple, la combinaison des 3 paramètres associés à la pression : vitesse d'application de la pression, mode d'application de la pression et température permet de manière surprenante le maintien de l'activité des facteurs de coagulation et donc le maintien de l'activité biologique du plasma sanguin humain.
Exemple 6 : exemple d'inactivation d'un agent pathogène dans le plasma sanguin humain sous hautes pressions en fonction de la température.
[0090] Staphylococcus aureus est un agent pathogène bien identifié et provoque de nombreuses maladies nosocomiales. Cet agent pathogène a été choisi comme modèle dans cet exemple.
[0091] Une suspension dense, c'est à dire supérieure à 108 UFC/mL
(UFC : Unité Formant Colonie) de S. aureus (ATCC 6538) a été préparée dans du bouillon tryptone-sel (TS) (AES Chemunex) à partir d'une culture de 48h sur gélose trypticase soja (TCS) (AES Chemunex). Cette suspension a servi à contaminer du plasma sanguin humain à raison de 10 ml_ de suspension pour 300 ml_ de plasma.
[0092] Les échantillons de plasma contaminés ont alors été placés dans des tubes stériles et étanches, puis conservés au congélateur dans l'attente de traitement par un procédé d'inactivation.
[0093] Avant et après procédé d'inactivation, un dénombrement des échantillons est réalisé afin de déterminer l'efficacité destructrice de ce traitement. Pour cela, des dilutions en cascade des échantillons sont réalisées dans du bouillon TS. Pour chaque dilution, deux boîtes de pétri sont ensemencées de la manière suivante : 1 ml_ de la dilution est placé au fond de la boîte puis de la gélose TCS en surfusion est versée. Après homogénéisation et gélification, les boîtes de pétri sont mises à l'étuve à 35°C pendant 48h. Les boîtes contenant entre 15 et 300 colonies isolées sont ensuite sélectionnées pour le dénombrement, et, après comptage des colonies, la concentration en S. aureus est déterminée par le calcul suivant :
N = ≥
(H1 + 0,1 X n2) x d
avec N : concentration en S. aureus (en UFC/mL)
∑c: somme des colonies comptées sur toutes les boîtes retenues ni : nombre de boîtes retenues à la première dilution
n2 : nombre de boîtes retenues à la deuxième dilution
d : taux de dilution de la première dilution [0094] L'efficacité destructrice du traitement est ensuite calculée de la façon suivante :
Figure imgf000027_0001
avec ED : efficacité destructrice
N : concentration en S. aureus après traitement hautes pressions
N0 : concentration en S. aureus avant traitement hautes pressions
[0095] Le traitement d'inactivation mis en œuvre était celui décrit à l'exemple N°5. Pour une valeur constante de la pression (200 MPa), les valeurs des paramètres associés ont été une vitesse de 50 MPa. s"1, 5 cycles de 2 minutes pour le mode d'application. Seule la température a été prise en compte comme variable (de -25°C environ à +35°C environ).
[0096] Les échantillons ont été placés dans un équipement générateur de hautes pressions par compression indirecte mis en place en interne avec comme milieu transmetteur l'éthanol.
[0097] La figure 6 montre l'effet de la température au cours d'un tel traitement sur son efficacité destructrice vis-à-vis de S. aureus.
[0098] De manière tout à fait inattendue et surprenante, il apparaît un domaine étroit en température entre -100C et -5°C où l'efficacité destructrice de S. aureus est amplifiée. Ce même phénomène est observé en changeant avec le même appareillage la nature du milieu transmetteur : le mélange glycol/eau (Kryo 30 Lauda) au lieu de l'éthanol. Pour les très basses températures (température inférieure à -100C), le rôle de la température semble critique puisque la sensibilité de S. aureus vis-à-vis du traitement imposé décroît très rapidement (l'efficacité destructrice ED diminuant drastiquement) alors que la variation est plus progressive pour les températures supérieures à -5°C.
[0099] Tel que démontré dans cet exemple, un exemple de procédé de l'invention via la combinaison appropriée des 3 paramètres associés à la valeur de la pression: vitesse d'application de la pression, mode d'application de la pression et température a un effet synergique sur l'inactivation de S. aureus.
[00100] En outre et de manière très surprenante, il apparaît comme représenté sur la figure 6 qu'il existe un domaine de température où l'inactivation de S. aureus est exacerbée. Par exemple entre -15°C et - 100C l'efficacité destructrice passe de 1 ,5 à sensiblement 5 ce qui constitue un accroissement tout à fait inattendu. Exemple 7 : exemple d'inactivation d'un agent pathogène dans le plasma sanguin humain sous hautes pressions en fonction de la température et de la valeur de la pression
[00101] Dans l'exemple 6, la valeur de la pression avait été fixée à 200 MPa. Tout en conservant les valeurs des paramètres associés à la pression (vitesse d'application de 50 MPa .s"1 et mode d'application cyclique de 5 cycles de 2 minutes), les inventeurs ont cherché à évaluer si l'effet surprenant lié à une amplification de l'efficacité destructrice de S. aureus pour un domaine étroit de température pouvait être observé pour diverses valeurs de la pression (200 MPa, 250 MPa, 300 MPa). [00102] En d'autres termes, cet exemple a pour but d'étudier si l'inactivation de S. aureus observée à 200 MPa peut être également observée à d'autres pressions, en particulier à 250 MPa et 300 MPa.
[00103] Les méthodes de préparation et de dénombrement des échantillons sont identiques à celles décrites dans l'exemple N°6.
[00104] Les échantillons ont été placés dans un équipement générateur de hautes pressions mis en place en interne avec comme milieu transmetteur l'éthanol.
[00105] L'analyse de la figure 7 donnant l'évolution de l'efficacité destructrice de S. aureus en fonction de la température pour trois valeurs de la pression, tous les autres paramètres associés au traitement demeurant constants (vitesse d'application de 50 MPa. s"1 et mode d'application cyclique de 5 cycles de 2 minutes) montre un phénomène tout à fait particulier.
[00106] Tel que démontré dans cet exemple, dans un domaine de pression compris entre 200 et 300 MPa, il semble que l'inactivation du pathogène soit maximum dans un intervalle de température particulier et étroit de -5°C±2 0C.
[00107] En outre, il est surprenant que le phénomène d'amplification de l'inactivation de S. aureus puisse être observé dans un intervalle de pression, l'inactivation destructrice augmentant lorsque la pression croit.
Exemple 8 : exemple d'inactivation d'agents pathogènes dans le plasma sanguin humain sous hautes pressions en fonction de la température.
[00108] Dans l'exemple 6, la valeur de la pression avait été fixée à 200 MPa. Dans cet exemple, les valeurs des paramètres associés à la pression étaient les suivants : vitesse d'application de 50 MPa. s"1 et mode d'application cyclique de 5 cycles de 2 minutes. Les inventeurs ont cherché à déterminer si l'effet surprenant lié à une amplification de l'efficacité destructrice de S. aureus dans un intervalle de température particulier était observé pour d'autres agents pathogènes de la Pharmacopée Européenne tels que Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Candida albicans (ATCC 10231 ) et Aspergillus niger (ATCC 16404) en maintenant 200 MPa comme valeur de la pression (Figure 8).
[00109] Les méthodes de préparation et de dénombrement des échantillons de plasma contaminé par S. aureus et P.aeruginosa sont identiques à celles décrites dans l'exemple 6. Pour C. albicans et A. niger, le protocole est identique à l'exception du milieu de culture qui est la gélose Sabouraud (AES Chemunex) et de la température d'incubation qui est de 28°C. Les spores de A. niger ont été obtenues en laissant incuber la souche pendant14 jours à 28°C dans des fioles de Roux contenant de la gélose Sabouraud et ont été récupérées en lavant ces fioles à l'aide d'un mélange d'eau et de Tween 80 (0,5 g/L) en présence de billes de verre.
[00110] Les échantillons ont été placés dans un équipement générateur de hautes pressions par compression indirecte mis en place en interne avec comme milieu transmetteur l'éthanol.
[00111] L'analyse de la figure 8 démontre de manière tout à fait surprenante et inattendue malgré des différences très importantes au niveau de la structure des agents pathogènes : deux bactéries, dont un coque Gram positif (S. aureus) et un bacille Gram négatif (P. aeruginosa), une moisissure sous forme de spores (A. niger), et une levure (C. albicans), l'amplification de l'efficacité destructrice pour un domaine particulier ou intervalle de températures particulier. Cet intervalle de température recouvrait (aux erreurs d'expériences près) celui de S. aureus (Température égale à -6°C ± 5°C).
[00112] La différence observée à très basse température, c'est-à-dire des températures inférieures à -5°C, est fonction de la sensibilité de chacun des micro-organismes vis-à-vis notamment de la pression.
[00113] Tel que démontré dans cet exemple, le procédé de l'invention via la combinaison particulière des paramètres associés à la valeur de la pression (vitesse d'application de la pression, mode d'application de la pression et température) a un effet synergique sur l'inactivation d'un ensemble de cibles biologiques.
Exemple 9 : exemple d'inactivation d'un agent pathogène sous hautes pressions en fonction de la vitesse d'application de la pression
[00114] Afin d'évaluer l'apport de la vitesse d'application de la pression dans le phénomène de synergie entre les trois paramètres associés au procédé d'inactivation (vitesse d'application de la pression, mode d'application de la pression et température), du plasma sanguin humain contaminé par S. aureus (préparé selon le protocole décrit à l'exemple 6) a été traité dans les conditions suivantes : un mode d'application cyclique de 5 cycles de 2 minutes, une température d'environ -5°C, et une pression de 200 MPa, 250 MPa ou 300 MPa. Pour chacun de ces traitements, deux vitesses d'application de la pression ont été utilisées, à savoir 3,33 MPa. s"1 et 50 MPa. s"1. Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 9.
[00115] Les protocoles de mise en œuvre, de préparation et de dénombrement sont identiques à ceux de l'exemple 6.
[00116] Les échantillons ont été placés dans un dispositif générateur de hautes pressions en phase liquide par compression directe de type « Framatome » et le milieu transmetteur était le mélange glycol/eau (Kryo 30 Lauda) pour la vitesse de 3,33 MPa. s"1. Un équipement générateur de hautes pressions par compression indirecte mis en place en interne avec comme milieu transmetteur l'éthanol a été utilisé pour la vitesse de 50 MPa.s"1
[00117] Les résultats présentés dans la figure 9 démontrent bien qu'il faut associer à la fois une vitesse d'application rapide (50 MPa.s"1) à un mode d'application cyclique (5 cycles de 2 minutes) et une température négative (environ -5°C) afin d'obten ir l'effet synerg ique pour que l'inactivation de S. aureus soit la plus efficace. [00118] En particulier à 200 MPa, cet effet de synergie est bien démontré car en utilisant une vitesse d'application de 3,33 MPa. s"1, l'efficacité destructrice ED (inactivation du pathogène) du traitement était très faible, voir nulle, alors qu'en utilisant une vitesse d'application de 50 MPa. s"1, elle est proche de 5.
[00119] En outre, il apparaît que la vitesse d'application de la pression (VA) associée à un mode (MA) cyclique d'application de la pression, 5 cycles de 2 minutes, et à une température de -5°C joue un rôle primordial dans l'inactivation de S. aureus.
[00120] La comparaison entre les résultats observés à la figure 14 de l'exemple 14 ci-dessous et ceux de la figure 9 démontre que les paramètres associés à la pression, le choix particulier de la vitesse d'application de la pression, le mode d'application de la pression et la température conduit à des effets de synergie très surprenants et inexpliqués sur l'inactivation de S. aureus.
[00121] Le procédé de l'invention permet donc l'inactivation d'agents pathogènes dans le plasma humain avec un effet synergique.
Exemple 10 : exemple de mise en œuvre d'un procédé d'inactivation d'au moins un agent pathogène dans le plasma sanguin humain
[00122] Afin d'évaluer l'effet de la vitesse d'application de la pression au cours d'un traitement cyclique (5 cycles de 2 minutes) à une température d'environ -5°C sur la sauvegarde de l'activité des facteurs de coagulation (F Ville et F V), deux vitesses d'application ont été testées (3,33 MPa. s"1 et 50 MPa. s"1) pour des valeurs croissantes de pression
(150 MPa à 250 MPa).
[00123] Les échantillons ont été placés dans un dispositif générateur de hautes pressions en phase liquide par compression directe de type « Framatome » et le milieu transmetteur était le mélange glycol/eau (Kryo 30 Lauda) pour la vitesse de 3,33 MPa. s"1. Un équipement générateur de hautes pressions par compression indirecte mis en place en interne avec comme milieu transmetteur l'éthanol a été utilisé pour la vitesse de 50 MPa.s"1
[00124] Les pourcentages d'activité résiduelle (par rapport à l'activité avant la mise en œuvre d'un procédé d'inactivation) des facteurs de coagulation Ville et V, à l'issue de la mise en œuvre d'un procédé d'inactivation dans les conditions décrites ci-dessus, sont montrés sur la figure 10.
[00125] L'examen de la figure 10 démontre que la valeur de la vitesse d'application a peu d'influence sur la sauvegarde de l'activité des facteurs Ville et V. Il a été montré, dans l'exemple 9, qu'une vitesse d'application rapide (50 MPa.s"1) permettait d'augmenter considérablement (effet synergique) l'efficacité destructrice (inactivation) du procédé d'inactivation d'agents pathogènes quand ce paramètre est combiné de façon appropriée à un traitement cyclique (5 cycles de 2 minutes) et une basse température (T = -6°C ± 5°C).
[00126] De plus, il est important de remarquer qu'en choisissant une pression de 200 MPa, une vitesse d'application de la pression de 50 MPa.s"1, un cyclage de 5 cycles de 2 minutes et une température de l'ordre de -5°C, la sauvegarde d'activité du facteur Ville est supérieure à 70%, et celle du facteur V supérieure à 50%, ce qui répond à la fois aux exigences de la Pharmacopée Européenne (activité des facteurs de coagulation supérieure à 50%) (Réf. 6) mais aussi à celles de la Législation Française (activité des facteurs de coagulation supérieure à 50% sauf pour le facteur Ville pour lequel l'activité doit être supérieure à 70%) (Réf. 17).
[00127] Tel que démontré dans cet exemple, la présente invention permet donc d'inactiver au moins un agent pathogène dans le plasma sanguin humain tout en conservant son activité biologique.
Exemple 11 : inactivation de Plasmodium berghei (hématozoaire) et Trypanosoma brucei brucei (protozoaire extracellulaire) par mise en œuvre d'un procédé de l'invention [00128] Un exemple de procédé d'inactivation d'un agent pathogène selon l'invention a été ensuite testé sur des modèles de parasites susceptibles de contaminer les produits sanguins d'une part Plasmodium berghei (hématozoaire) et d'autre part Trypanosoma brucei brucei (protozoaire extracellulaire).
[00129] Pour chacun des deux parasites, 10 échantillons de sang de souris (Mus musculus) contaminés ont été traités. Les valeurs des paramètres associés à la pression étaient : une vitesse d'application de la pression de 50 MPa. s"1, un mode d'application de la pression de 5 cycles de 2 minutes, une température d'environ -5°C, une pression initiale de 0,1 MPa et une pression de 200 MPa.
[00130] Les échantillons ont été placés dans un équipement générateur de hautes pressions par compression indirecte mis en place en interne avec comme milieu transmetteur l'éthanol.
[00131] En parallèle, un échantillon témoin non traité a été conservé ainsi qu'un témoin de température (échantillon équilibré à -15°C pendant 30 minutes). Chaque échantillon a ensuite été observé en microscopie optique puis injecté à une souris. Les conclusions de l'observation microscopique d'une part et les résultats concernant le nombre de souris survivantes un mois après l'injection sont présentés dans le tableau 1 ci- dessous
[00132] tableau 1 : résultats microscopiques et nombre de souris survivantes
Figure imgf000034_0001
[00133] Les résultats de l'observation microscopique sont en outre illustrés à la figure 11.
[00134] Tel que démontré dans cet exemple, un exemple de procédé d'inactivation selon l'invention est efficace pour l'inactivation d'une part de Plasmodium berghei (hématozoaire) et d'autre part de Trypanosoma brucei brucei (protozoaire extracellulaire).
[00135] Tel que démontré dans cet exemple, le procédé de l'invention permet d'inactiver des agents pathogènes tels que des parasites tout en conservant l'activité biologique du plasma sanguin humain.
Exemple 12 : mise en œuvre d'un exemple de procédé selon l'invention sur la protéine infectieuse du prion présente dans un échantillon de plasma sanguin humain
[00136] La protéine infectieuse du Prion constitue actuellement l'un des objectifs de la sécurisation de produits biologiques. Le prion de hamster a été choisi comme modèle.
[00137] Du plasma sanguin humain contaminé par du broyât de cerveau de hamster infecté par la protéine infectieuse du prion (263 K) (EFS Pyrénées-Méditerranée) a été utilisé.
[00138] A partir desdits broyats de cerveau de hamster infecté par la souche 263 K (IBH), des échantillons de plasma sanguin humain (1 mL) ont été contaminés puis placés dans des tubulures fermées de manière étanche d'une part et résistant à la pression d'autre part.
[00139] En parallèle des échantillons négatifs (non contaminés) ont été préparés dans les mêmes conditions en ajoutant alors du broyât de cerveau de hamster sain (NBH). Les tubulures ont été placées aussitôt après préparation dans la carboglace.
[00140] Les échantillons ont été traités par paire, une tubulure contenant du plasma contaminé par le broyât de cerveau infecté et une tubulure contenant du plasma contaminé par le broyât de cerveau non infecté, en utilisant un exemple de procédé d'inactivation d'agent pathogène selon l'invention associant la combinaison appropriée de paramètres associés à la pression c'est à dire une vitesse d'application de la pression de 100 MPa en 2 secondes, soit une vitesse d'augmentation de la pression et de diminution de la pression de 50 MPa. s"1' un mode d'application de la pression de 5 cycles de 2 minutes, soit la compression de l'échantillon, le maintien de la pression pendant 120 secondes et la diminution de la pression, la compression étant égale à une pression Pi de 200 MPa, la température de l'échantillon à la pression Pi était d'environ - 5°C. Les échantillons ont été placés dans un équipement générateur de hautes pressions par compression indirecte mis en place en interne avec comme milieu transmetteur l'éthanol.
[00141] L'analyse des échantillons a été menée au travers du protocole suivant : extraction de la protéine prion par précipitation au NaPTA 4%, digestion à la protéinase K à 200μg/mL, détection de la PrPSc par Western Blot (l'anticorps utilisé étant l'anticorps 3F4).
[00142] Une comparaison 2 à 2 des signaux obtenus, le prion migrant à environ 27-29 kDa pour les échantillons infectés, a montré une très forte diminution de la quantité de PrPSc pour ceux ayant été soumis à un exemple de procédé selon l'invention par rapport à ceux non traités (Figure 12 comparaison des échantillons traités HPM à HPI4 par rapport aux échantillons non traités TM à TI4). Ces résultats étaient en outre reproductibles pour les 4 couples d'échantillons infectés (témoin T non traité et échantillon traité par le procédé de l'invention). Il apparaît donc clairement que la protéine infectieuse PrPSc a été modifiée par la mise en œuvre d'un exemple de procédé selon l'invention ; ce qui suggère une répercussion négative quant à son pouvoir infectieux.
Exemple 13 : Evaluation de la valeur de la pression sur l'inactivation d'un agent pathogène (S. aureus) au sein d'un échantillon de plasma sanguin humain par un traitement sous hautes pressions pendant 10 minutes en continu à température ambiante (25°C) et avec une vitesse d'application de la pression (VA) relativement modérée et conventionnelle (3.33 MPa. s"1). [00143] Staphylococcus aureus est un agent pathogène bien identifié et provoque de nombreuses maladies nosocomiales. Cet agent pathogène a été choisi comme modèle dans cet exemple.
[00144] Les protocoles de mise en œuvre, de préparation et de dénombrement sont identiques à ceux de l'exemple 6.
[00145] Les échantillons ont été placés dans un équipement générateur de hautes pressions par compression indirecte mis en place en interne avec comme milieu transmetteur l'éthylène glycol associé avec de l'eau Kryo 30 lauda (60% monoéthylène glycol et 40% d'eau).
[00146] La température a été maintenue à 25°C. La vitesse d'application de la pression (VA) était de 3.33 MPa. s"1 La durée de traitement était de 10 minutes en maintenant la valeur constante de la pression. Plusieurs valeurs de la pression ont été utilisées afin d'évaluer l'impact sur l'inactivation de l'agent pathogène S. aureus à 200 MPa, 250 MPa, 300 MPa, 400 MPa.
[00147] La figure 13 représente les valeurs de l'efficacité destructrice
(ED) observées pour chacune de ces pressions.
[00148] Les résultats obtenus montrent que la pression, au moins jusqu'à 400 MPa, a peu d'effet sur l'inactivation de S. aureus du fait des valeurs relativement faibles de l'efficacité destructrice (ED).
Exemple 14: Evaluation de l'inactivation d'un agent pathogène (S. aureus) dans un échantillon de plasma sanguin au travers d'un traitement sous hautes pressions à température ambiante (25°C), un mode d'application de la pression continu, une durée de 10 min avec différentes vitesses d'application VA de la pression [00149] Dans l'exemple 13 ci-dessus, le mode d'application de la pression MA était continu et la vitesse d'application de la pression était relativement « conventionnelle » (soit 3,33 MPa. s"1) . La d u rée d e traitement était de 10 minutes et la température de traitement était de 25°C.
[00150] Le but de cet exemple est d'avoir une évaluation de l'effet de la vitesse d'application (VA) de la pression sur l'inactivation de S. aureus, les valeurs des autres paramètres demeurant constantes : un mode d'application MA continu de la pression, une température de traitement de 25°C et une durée de traitement de 10 minutes.
[00151] Afin d'avoir une évaluation de l'impact de la vitesse d'application VA sur l'inactivation de S. aureus, deux vitesses très différentes d'application de la pression ont été choisies : une vitesse conventionnelle 3,33 MPa. s"1 et une vitesse rapide 50 MPa. s"1.
[00152] Les valeurs de la pression étaient de 200 MPa, 250 MPa et 300 MPa. Des valeurs plus élevées n'ont pas été sélectionnées, l'activité biologique du plasma sanguin humain étant fortement altérée au-delà de 300 MPa.
[00153] Les protocoles de mise en œuvre, de préparation et de dénombrement sont identiques à ceux de l'exemple 6.
[00154] La figure 14 représente l'efficacité destructrice ED vis-à-vis de S. aureus selon la valeur de la pression pour différentes valeurs de la vitesse d'application de la pression VA.
[00155] L'analyse des résultats illustrés à la figure 14 montre, qu'aux erreurs d'expériences près, on n'observe aucun effet de la vitesse d'application VA de la pression sur la valeur de l'efficacité destructrice de S. aureus. En effet, l'efficacité destructrice quelle que soit la pression et/ou la vitesse est inférieure à 1.
[00156] Ce résultat laisse à penser que la vitesse d'application de la pression n'est pas un paramètre susceptible de jouer un rôle important dans l'inactivation d'un agent pathogène tel que S. aureus, d'où l'importance des paramètres associés à la pression puisqu'il a été montré que la VA était un facteur primordial quand un MA cyclique et des températures négatives (-50C) étaient utilisés (cf. exemple 9). Exemple 15 : Evaluation de l'inactivation d'un agent pathogène (S. aureus) au sein d'un échantillon de plasma sanguin humain au travers d'un traitement sous hautes pressions à température ambiante (25°C), avec une vitesse d'application de la pression VA 3.33 MPa. s"1 en fonction du mode d'application de la pression (MA), continu (10 min.), ou cyclique ( 5 cycles de 2 min. ou 20 cycles de 30 secondes)
[00157] Dans l'exemple 13, seul un mode d'application continu a été appliqué. Dans cet exemple, l'objectif était d'évaluer le rôle du mode d'application de la pression (MA), pour des valeurs de la pression de 200 MPa, 250 MPa et 300 MPa - l'activité biologique du plasma étant fortement altérée au-delà de 300 MPa. Les autres paramètres ont été maintenus constants : vitesse d'application de 3,33 MPa. s"1 et température de traitement de 25°C.
[00158] Les protocoles de mise en œuvre, de préparation et de dénombrement sont identiques à ceux de l'exemple 6.
[00159] La figure 15 est un histogramme représentant l'efficacité destructrice (ED) (ordonnée) en fonction de la pression (abscisse). La vitesse d'application de la pression était de 3.33 MPa. s"1. Le mode d'application de la pression était de 5 cycles de 2 minutes (bâtons hachurés), de 20 cycles de 30 secondes (bâtons vides) ou d'un cycle de
10 minutes (bâtons pleins).
[00160] L'analyse de la figure 15 montre que le mode d'application de la pression soit de manière continue soit de manière cyclique n'a pas d'effet (aux erreurs d'expériences près) sur la valeur de l'efficacité destructrice (ED) de S. aureus tant à 200 MPa qu'à 250 MPa. Pour la valeur de la pression de 300 MPa, on observe une légère augmentation de la valeur de l'efficacité destructrice pour un mode d'application cyclique. Cependant il faut noter que l'amélioration apportée, de l'ordre de 1 ,5, n'est pas significative.
[00161] Cet exemple démontre donc clairement que le mode d'application de la pression ne permet pas d'atteindre des valeurs importantes de l'inactivation d'un agent pathogène tel que S. aureus.
Exemple 16 : Evaluation de l'inactivation d'un agent pathogène (S. aureus) au sein d'un échantillon de plasma humain par un traitement sous hautes pressions avec un mode d'application de la pression MA continu, une durée de 10 min. une vitesse d'application VA de 3,33
MPa. s"1 en fonction du température de traitement : 25°C et -5°C.
[00162] Dans l'exemple 13, le mode d'application de la pression MA était continu et la vitesse d'application de la pression était relativement « conventionnelle », c'est-à-dire égale à 3,33 MPa. s"1. La d u rée d e traitement était de 10 minutes et la température de traitement était de
25°C.
[00163] L'objectif de cet exemple est d'évaluer l'impact de la température de traitement sur l'inactivation de S. aureus.
[00164] Deux températures de traitement ont été sélectionnées : d'une part +25°C comme dans l'exemple 13 et d'autre part une température négative : -5°C.
[00165] Les autres valeurs des paramètres ont été maintenues constantes et égales à celles utilisées dans l'exemple 13 soit MA continu, durée de traitement de 10 minutes et une vitesse d'application (VA) de
3,33 MPa.s"1.
[00166] Les protocoles de mise en œuvre, de préparation et de dénombrement sont identiques à ceux de l'exemple 6.
[00167] Les résultats obtenus sont donnés à la figure 16. La figure 16 est un histogramme représentant l'efficacité destructrice (ED) (ordonnée) en fonction de la pression (abscisse). La température était de - 5°C (bâtons hachurés) ou de 25°C (bâtons pleins)
[00168] L'analyse de la figure 16 montre un net accroissement de l'inactivation de S. aureus lorsque la température de traitement passe de +25°C à celle négative de -5°C (bâtons hachurés). Il apparaît cependant que cet effet soit plafonné lorsque la pression augmente de 250 MPa à 300 MPa, aucun accroissement de la valeur de l'efficacité destructrice n'étant observé entre ces deux valeurs de la pression. Exemple 17 : Etude de l'effet de synergie d'inactivation d'agents pathogènes autres que S aureus
[00169] Les mêmes valeurs des paramètres que ceux utilisés à l'exemple 6, soit une pression de 200 MPa, un mode d'application cyclique de la pression MA de 5 cycles de 2 minutes et une vitesse d'application de la pression VA de 50 MPa. s"1 ont été mises en œuvre.
[00170] Le domaine de température exploré était compris entre -
15°C et +30°C.
[00171] Les 5 micro-organismes de la Pharmacopée européenne ont été choisis comme agents pathogènes [S. aureus (ATCC 6538), P. aeruginosa (ATCC 9027), C. albicans (ATCC10231 ), A. niger (ATCC 16404), B. subtilis à l'état végétatif (ATCC 9372)].
[00172] Les méthodes de préparation et de dénombrement des échantillons de plasma contaminé par S. aureus et P. aeruginosa étaient identiques à celles décrites dans l'exemple 6, à l'exception du milieu de culture pour C. albicans et A. niger, pour lesquels la gélose utilisée est la gélose Sabouraud (AES Chemunex)
[00173] Dans le cas de B. subtilis la méthode de préparation consistait à repiquer la souche ATCC 9372 dans un bouillon cœur-cervelle mis à incuber 24h à 35°C. Cette culture est ensuite centrifugée à 12 000 g pendant 4 min et le culot est remis en suspension dans 10 mL de bouillon TS. Cette suspension a ensuite servi à contaminer 300 ml_ de plasma sanguin humain
[00174] Les résultats observés sont donnés à la figure 17. La figure 17 est un diagramme représentant l'efficacité destructrice vis-à-vis de S. aureus, de P. aeruginosa, de A. niger, de C. albicans et de B. subtilis (ordonnée) en fonction de la température (abscisse).
[00175] De manière tout à fait surprenante, il apparaît que, quelle que soit la nature du micro-organisme étudié (S. aureus, P. aeruginosa, C. albicans, A. niger, B. subtilis), on observe un effet d'amplification de l'efficacité destructrice dans un certain domaine de températures.
[00176] De façon inattendue, les domaines de températures où cette amplification de l'inactivation pour l'ensemble des 5 micro-organismes de la Pharmacopée européenne est observée se recouvrent. Ainsi, on peut donc définir un domaine commun de températures où l'ensemble des micro-organismes pathogènes est inactivé.
[00177] Cet exemple démontre donc clairement qu'un exemple de procédé de l'invention permet d'inactiver l'ensemble des 5 microorganismes de la pharmacopée européenne avec un effet synergique de par le choix particulier de la pression, de la vitesse de compression et détente et le mode d'application (MA) de la pression, par exemple une pression de 200 MPa, une vitesse VA= 50 MPa. s"1, un mode d'application de la pression de 5 cycles de 2 minutes et une température (T) comprise de -10°C à -3°C.
[00178] En outre, cet exemple démontre clairement qu'un exemple de procédé de l'invention permet d'inactiver l'ensemble des agents pathogènes présents dans un échantillon de plasma.
Exemple 18 : Evaluation de l'activité biologique du plasma sanguin humain en appliquant les valeurs des paramètres caractérisant un exemple de procédé d'inactivation des agents pathogènes de l'exemple 17 [00179] Un procédé de traitement du plasma sanguin humain avec une pression de P=150 MPa, 200 MPa, 250 MPa et 300 MPa, une vitesse d'application de VA= 50 MPa. s"1, un mode d'application MA= 5 cycles de 2 minutes et -10°C<T<-3°C a été appliqué à du plasma sanguin humain.
[00180] Une valeur médiane de la température (-50C) a été choisie pour cette évaluation.
[00181] Des échantillons de 4 ml_ environ de plasma sanguin humain frais ont été prélevés et placés dans des tubes étanches, puis mis à congeler à -300C dans l'attente d'être traités sous hautes pressions.
[00182] L'activité résiduelle des facteurs de coagulation Ville et V a été déterminée par la méthode du temps de céphaline avec activateur décrite dans l'exemple 1.
[00183] Les activités résiduelles des protéines supports des facteurs de coagulation Ville et V sont donnés à la figure générale 18. - Les figures 18 A et B sont des histogrammes représentant le pourcentage d'activité de protéines plasmatiques (%act) (ordonnée) en fonction de la pression (P) en Méga Pascal (MPa) (abscisse).
[00184] L'analyse de la figure 18 montre qu'à 200 MPa on observe une activité relative du Facteur Ville d'environ 75 % et celle du Facteur V d'environ 58%. Ces valeurs sont supérieures à celles requises par la Législation européenne (50% pour le facteur Ville et pour le Facteur V) et la Législation française (70% pour le Facteur Ville et 50% pour le Facteur
V).
[00185] Ainsi, un exemple de procédé de l'invention permet d'obtenir une efficacité destructrice importante de l'agent pathogène le plus barorésistant : S aureus, c'est-à-dire une efficacité destructrice de l'ordre de 5 tout en maintenant l'activité biologique des Facteurs Ville et V.
[00186] En d'autres termes, un exemple de procédé de l'invention permet d'obtenir à la fois une synergie d'inactivation des agents pathogènes présents dans le plasma sanguin humain tout en conservant l'activité biologique des protéines présentes dans le plasma sanguin. Exemple 19 : Evaluation de l'irréversibilité de l'inactivation d'un agent pathogène au travers du « Procédé de sécurisation d'au moins un agent pathogène dans un échantillon de plasma sanguin » dans un échantillon de plasma sanguin humain.
[00187] L'agent pathogène choisi était S. aureus (ATCC 6538) du fait de sa forte résistance aux effets de pression (appelée encore barorésistance).
[00188] Une suspension de S. aureus dans le plasma sanguin a été préparée selon le procédé décrit à l'exemple 6 de façon à obtenir un titrage de l'ordre de N= 1 .1O5 UFC /ml_.
[00189] Cette suspension a servi à préparer d'une part un tube N°1 d'un volume de 4 ml_ servant de témoin et d'autre part un tube N°2 d'un volume également de 4 ml_ destiné à être soumis à un traitement comprenant l'application d'une pression de 200MPa, à une vitesse de 50 MPa. s"1, selon un mode d'application de 5 cycles de 2 minutes à une température de -5°C (condition d'un exemple de procédé de l'invention).
[00190] Les tubes N°1 et N°2 ont été gardés au congélateur pendant 14 jours.
[00191] Ensuite les contenus de ces 2 tubes ont servi à ensemencer des bouillons de culture cœur-cervelle.
[00192] Après 48 heures d'incubation à 35 0C, si on observe une reprise de croissance importante pour le milieu de culture ensemencé par le tube témoin N°1 -non traité par un exemple de Procédé de l'invention, en revanche aucune reprise de croissance n'a pu être décelée pour le milieu de culture ensemencé par le tube N°2 traité selon les conditions d'un exemple de Procédé de l'invention.
[00193] Une autre observation a été menée au bout de 7 jours. Pour le milieu de culture ensemencé par le tube N°2 traité par un exemple de Procédé de l'invention, elle n'a toujours pas permis de mettre en évidence une reprise de croissance. [00194] Compte tenu des valeurs nutritives du bouillon cœur-cervelle, bien connues de l'Homme de l'art, l'absence de croissance au bout d'un temps d'incubation relativement long de 7 jours démontre que l'inactivation d'un agent pathogène selon le Procédé tel que S. aureus, considéré comme très barorésistant, est irréversible.
[00195] Comme démontré dans cet exemple, un exemple de procédé de l'invention permet donc une inactivation irréversible d'agents pathogènes tels que S. aureus. Exemple 20 : inactivation de souches de S. aureus multi-résistantes aux antibiotiques par mise en œuvre d'un exemple de procédé de l'invention.
[00196] L'inactivation par un exemple de procédé de l'invention de deux souches de S. aureus présentant de multiples résistances aux antibiotiques : ATBR1 (P+) et ATBR2 (P") a été testée et comparée à la souche de référence de S. aureus (ATCC 6358).
[00197] Les protocoles mis en œuvre lors des tests relatifs aux deux souches ATBR1 (P+) et ATBR2 (P") sont identiques à ceux décrits dans l'exemple 6.
[00198] Le tableau ci-dessous donne les valeurs de l'efficacité destructrice (ED) observées pour les 3 souches : ATBR1 (P+) et ATBR2 (P") et celle de référence (ATCC 6358) après traitement selon les conditions de pression, de vitesse d'application, de mode d'application et de température décrites dans l'exemple 19 (VA= 50 MPa. s"1, MA= 5 cycles de 2 minutes, T= - 5°C, P= 200 MPa).
[00199] Le tableau 2 ci-dessous représente les résultats de l'efficacité destructrice (ED) obtenue en fonction des souches testées.
ATCC 6538
Souche
ATBRi (P+) ATBR2 (P-)
« de
référence »
ED « 4,9 « 4 « 6,2 [00200] II apparaît que pour les souches de S. aureus la résistance aux antibiotiques d'une part et le comportement vis-à-vis d'un exemple du procédé de l'invention d'autre part ne sont pas comparables.
[00201] En effet la souche particulièrement résistante aux antibiotiques ATBR2 (P") apparaît très sensible aux effets d'un exemple de procédé de l'invention (ED de l'ordre de 6,2) et la valeur de l'efficacité destructrice est même supérieure à celle observée dans les mêmes conditions pour la souche de référence (ATCC 6358).
[00202] On remarque également que quelle que soit la souche de S. aureus particulièrement résistante aux antibiotiques [ATBR1 (P+) et ATBR2 (P")], on observe - après application d'un exemple de procédé de l'invention une valeur importante de l'efficacité destructrice.
Exemple 21 : inactivation du virus de la rougeole pris comme virus contaminant du plasma sanguin humain par un exemple de procédé de l'invention.
[00203] Cet exemple a pour objectif d'évaluer l'efficacité d'un exemple de procédé de l'invention vis-à-vis d'un virus.
[00204] Dans une première étape, les inventeurs ont sélectionné comme virus celui de la rougeole.
[00205] L'infectivité du virus de la rougeole avant et après traitement par un exemple de Procédé de l'invention a été évalué en infectant des cellules vero (S. ROZENBLATT, T. KOCH, O. PINHASI, S. BRATOSIN , "Infective substructures od Measles virus from Acutely and Persistently lnfected CeIIs", J. of Virology (1979),32, p. 329-333 (Réf 21 )).
[00206] Le protocole mis en œuvre pour l'évaluation de l'infectivité est décrit dans R. RUSTIGIAN « Persistent Infection of CeIIs in Culture by Measles Virus, I. Development and Characteristics of HeLa Sublines Persistently lnfected with Complète Virus », J. of Bacteriology (1966), 92, p.1792-1804 (Réf 22).
[00207] Le titre viral initial était d'environ 2.103 unités/mL. [00208] Cette suspension virale a ensuite été répartie en deux tubes : le tube N°1 qui a servi de témoin non traité par le Procédé et le tube N°2 qui a subi les conditions suivantes : pression P=200 MPa, vitesse de compression détente VA= 50 MPa. s"1, mode d'application de la pression MA= 5 cycles de 2 minutes et température T=-5°C.
[00209] Après ce traitement le titre viral a été évalué dans le tube N°2 et comparé à celui du tube N°1 pris comme témoin (Tableau ci dessous).
[00210] Tableau 3 : titre du virus avant application d'un exemple de procédé de l'invention (avant HP) ou après application d'un exemple de procédé de l'invention (après HP)
Figure imgf000047_0001
[00211] Comme démontré dans cet exemple, un exemple de procédé de l'invention permet d'inactiver dans le plasma sanguin humain le virus de la rougeole.
Exemple 22 : inactivation du Virus de l'immunodéficience humaine (VIH) pris comme virus contaminant du plasma sanguin humain par un exemple de procédé de l'invention
[00212] Le VIH est un rétrovirus qui infecte les lymphocytes T CD4+. Au début de l'infection, il se fixe sur ces récepteurs, puis fusionne avec la membrane de la cellule hôte. Ses deux brins d'ARN sont alors rétrotranschts en ADN double brin grâce à sa transcriptase inverse. L'intégrase permet ensuite à cet ADN de s'intégrer dans le génome de la cellule hôte.
A. Principe du test de détection du VIH
[00213] L'inactivation du VIH par un exemple de procédé de l'invention a été évaluée par le test au 4-MUG décrit dans le document V.R. De SOULTRAIT, A. CAUMONT, V. PARISSI, N. MORELLET, M. VENTURA, C. LENOIR, S. LITVAK, M. FOURNIER, B. ROQUES « A novel short peptide is a spécifie inhibitor of the human immunodeficiency virus type 1 integrase » J. Mol. Biol. (2002), 31J3, p.45-58 (Réf 23). Ce test est basé sur l'expression de la protéine virale Tat, qui est un activateur de transcription des gènes du VIH-1. Pour ce test, l'infection est réalisée sur des cellules HeLa P4, qui possèdent un gène rapporteur Lac Z dont l'expression est sous le contrôle d'un promoteur activé par la protéine Tat. Ainsi, si le VIH n'est pas inactivé, il va pénétrer dans ces cellules, s'intégrer dans le génome, exprimer la protéine Tat q u i va alors activer la transcription du gène Lac Z. Ceci conduit à la synthèse de β-galactosidase, qui catalyse la dégradation du 4-MUG en un produit fluorescent. L'intensité de la fluorescence est alors mesurée et est proportionnelle à l'infectivité virale.
[00214] Les expériences ont été réalisées directement sur des surnageants viraux préparés par co-culture de cellules MT4 et H9 Lai selon le protocole décrit dans P. CHARNEAU, G. MIRAMBEAU, P. ROUX, S. PAULOUS, H . BUC, F. CLAVEL , « HIV-1 Reverse Transcription - A termination step at the center of the génome », J. Mol. Biol. (1994), 241 , p. 651 -662 (Réf 24).
[00215] Un premier échantillon a été soumis à un exemple de procédé de l'invention, à savoir une pression de 200 MPa, une vitesse d'application de 50 MPa. s"1, un mode d'application de la pression de 5 cycles de 2 minutes et une température de -5°C tandis que le second a été placé dans le bain réfrigéré dans lequel plongeait l'enceinte d'expérience (« témoin de température »). A la fin de ces traitements, les surnageants viraux ont été récupérés pour infecter des plaques 96 puits dans lesquels ont été cultivées des cellules HeLa P4 selon le protocole décrit dans P. CHARNEAU, G. MIRAMBEAU, P. ROUX, S. PAULOUS, H. BUC, F. CLAVEL , « HIV-1 Reverse Transcription - A termination step at the center of the génome », J. Mol. Biol. (1994), 241, P- 651 -662 (Réf 24). [00216] Après la première infection, les plaques ont été incubées pendant 72 h à 37°C et 5 % CO2, puis elles ont été révélées par la méthode du 4-MUG. En parallèle, les surnageants viraux ont été récupérés pour infecter une nouvelle plaque 96 puits, qui a été placée à l'étuve pendant 2 heures, le temps que les virus éventuellement présents puissent infecter les cellules. Le volume de surnageants viraux était de 100 μl_. Elle a ensuite été lavée avec une solution de PBS 1 X afin d'éliminer tous les éléments qui auraient pu être transportés avec les surnageants viraux, puis remise à l'étuve pendant 72 h. Une révélation au 4-MUG a alors été réalisée.
B Résultats
[00217] Les résultats ont été obtenus par le procédé décrit dans V.R.
De SOULTRAIT, A. CAUMONT, V. PARISSI, N. MORELLET, M. VENTURA, C. LENOIR, S. LITVAK, M. FOURNIER, B. ROQUES « A novel short peptide is a spécifie inhibitor of the human immunodeficiency virus type 1 integrase » J. Mol. Biol. (2002), 318, p.45-58 (Réf 23).
[00218] Pour chaque plaque, la moyenne des intensités de fluorescence mesurées dans les puits contenant les cellules non infectées (bruit de fond) a été soustraite aux valeurs détectées dans chaque autre puits. Les résultats obtenus après 72 h d'incubation sont présentés dans la figure 19. La figure 19 représente l'intensité de la fluorescence (ordonnée) en fonction du facteur de dilution (abscisse). Les croix correspondent aux résultats obtenus avec (HP), les carrés noirs aux résultats obtenus avec un témoin « T ».
[00219] Les résultats reportés dans la figure 19 montrent une diminution du signal détecté dans les puits ayant été infectés par les surnageants viraux soumis à un exemple de procédé de l'invention par rapport à ceux ayant reçu les surnageants viraux du « témoin de température ». Il y a donc eu une inactivation du VIH-1 par un exemple de procédé de l'invention. [00220] Les surnageants viraux de cette plaque ont tout de même été récupérés afin d'infecter de nouvelles cellules. Le procédé d'infection est identique au procédé d'infection précité. Les résultats observés 72 h après cette réinfection sont reportés dans la figure 20.
[00221] Les résultats de la réinfection (figure 20) révèlent qu'aucun signal n'a pu être détecté dans les puits ayant reçu les échantillons soumis à la pression. Ainsi, cet exemple démontre que l'ensemble de la population virale initiale a été inactivé par un exemple de procédé de l'invention. Exemple 22 : inactivation de divers parasites par un exemple de procédé de l'invention.
[00222] Les parasites sanguicoles posent un problème pour les transfusions et injections de produits dérivés du sang. En effet, des parasitoses post-injection de ces produits ont été reportées, notamment le paludisme, plus exceptionnellement la leishmaniose, et en Amérique du Sud, la maladie de Chagas.
[00223] Pour P. berghei, T.b.b. et T. Feo, l'ensemble des expériences a consisté à prélever du sang à des souris contaminées par le parasite à tester. Pour T. cruzi et L. donovani, les parasites ont été préparés par culture cellulaire dans du milieu LIT (Liver Infusion Tryptose) pour T. cruzi et RPMI 1640 plus SVF pour L. donovani.
[00224] Les échantillons ont ensuite été séparés en quatre lots :
- le premier échantillon correspondait au « témoin non traité »,
- le deuxième consistait en un « témoin de transport », c'est-à-dire qu'il a suivi le même parcours que les échantillons traités mais est resté toute la journée à température ambiante,
- le troisième, le « témoin de température », a été plongé dans le bain réfrigéré dans lequel était placée l'enceinte hautes pressions afin d'évaluer l'effet de la congélation seule sur les parasites,
- le dernier lot a été traité sous hautes pressions, en utilisant les paramètres suivant pression P = 200 MPa, vitesse d'application et de détente VA = 50 MPa. s"1, mode d'application de la pression MA = 5 cycles de 2min, température T≈ -5°C.
[00225] Chacun des échantillons : témoin ou ayant subi le traitement hautes pressions, a été observé par microscopie optique. Le microscope utilisé était un OLYMPUS CA20. Pour P. berghei, T.b.b. et T. Feo, les échantillons ont ensuite été injectés à des souris saines. Le nombre de souris survivantes un mois après l'injection a ensuite permis de conclure sur l'effet inactivant de l'application de ce traitement. Pour T. cruzi et L. donovani, les échantillons ont été remis au contact de milieux de culture précisés ci-dessus et ont été placés à l'incubateur pendant 5 semaines à 35°C pour T. cruzi et à 28 0C sans CO2 pour L.donovani afin d'observer une éventuelle multiplication des parasites. Le volume des échantillons était de 1 mL de suspension de parasites traités sous hautes pressions pour 9 mL de milieu de culture.
[00226] Les témoins « transport » correspondent aux échantillons ayant suivi les mêmes conditions expérimentales à l'exception du traitement par un exemple de procédé de l'invention et est resté toute la journée à température ambiante.
[00227] les témoins « température » correspondent aux échantillons ayant été plongés dans le bain réfrigéré dans lequel était placée l'enceinte hautes pressions afin d'évaluer l'effet de la congélation seule sur les parasites
[00228] Le Tableau 4 ci-dessous résume les résultats obtenus
Figure imgf000052_0001
[00229] Tel que démontré dans cet exemple, un exemple de procédé objet de la présente invention permet d'inactiver la totalité des parasites testés.
Exemple 23 : Evaluation de la non-toxicité du plasma traité par un exemple de procédé de l'invention
[00230] L'objectif de la présente invention est de vérifier que le plasma ayant été soumis à un procédé objet de l'invention n'est pas immunogène.
[00231] Dans cet exemple, des monocytes ont été mis en présence de plasma traité selon un exemple de procédé de l'invention. Une vérification que le plasma traité n'induit pas la formation de cellules dendritiques (DC), cellules impliquées dans la présentation de l'antigène au cours de la réponse immunitaire a été alors effectuée.
[00232] Des monocytes ont été préparés à partir d'une poche de sang total selon le procédé décrit ci après.
[00233] Le sang a été réparti dans des tubes Falcon (marque déposée) à raison de 50 mL par tube puis les tubes ont été centrifugés pendant 15 min à 900 tours par minutes sans frein. Le plasma a été ensuite éliminé et le culot est repris dans du PBS (qsp 50 mL). Après homogénéisation, les tubes ont été à nouveau centrifugés 15 min à 2500 tours par minutes sans frein. Le « buffy coat » présent entre les couches « plasma-PBS » et « globules rouges » est prélevé puis complété avec du RPMI (qsp 35 mL). Après homogénéisation, cette suspension a été versée très doucement dans un tube contenant 15 mL de Ficoll. Les tubes ont été centrifugés pendant 20 min à 2000 rpm sans frein. Le sérum a été ensuite aspiré puis l'anneau laiteux contenant les monocytes a été prélevé et transféré dans un nouveau tube Falcon. Les tubes ont été complétés avec du milieu RPMI + L-Glutamine + SVF 8% (qsp 50 mL) puis centrifugés pendant 10 min à 1500 tours par minutes. Les surnageants ont été éliminés et les culots ont été repris dans 5 ml_ de milieu avant d'être regroupés dans un seul tube Falcon, qui a été complété jusqu'à 50 ml_ avec du milieu. Après centrifugation pendant 10 min à 900 tours par minutes, les surnageants ont été éliminés, et les culots ont été repris dans 20 ml_ de milieu. Les cellules ont été comptées en cellule de Malassez afin de déterminer la concentration. Après centrifugation à 1500 tours par minutes pendant 10 min, les culots ont été remis en suspension dans un volume de milieu défini de façon à avoir une concentration de monocytes d'environ 4.106 cellules/mL.
[00234] Ces monocytes ont été ensuite répartis en plaques 6 puits à une concentration de 4.106 cellules/mL (2mL/puits). Les plaques ont été mises à incuber pendant 2 h afin que les monocytes adhèrent au fond des pu its. Le m il ieu de culture des monocytes comprenant du RPM I (commercialisé par la société Sigma), du Sérum de Veau Fœtal (SVF) et de la pénicilline a été ensuite remplacé par :
→ soit du milieu de culture seul (témoin négatif : Mono),
→ soit du milieu de culture additionné de 25 ng de facteur de stimulation de la croissance des granulocytes-macrophage (« Granulocyte-macrophage colony stimulating factor » (GMSCF)) et
10 ng d'interleukine 4 (IL4) (cocktail nécessaire pour la génération de DC : témoin positif : GMIL4),
→ soit du milieu de culture additionné de 10% de plasma non soumis au procédé (témoin non traité : Tém),
→ soit du milieu de culture additionné de 10% de plasma soumis au procédé (échantillon HP : HP).
[00235] Les plaques ont été ensuite mises à incuber pendant 3 à 5 jours à 37°C / 5% CO2. Les surnageants contenant les cellules dendritiques (DC) ont été récupérées et centrifugées. Après lavage avec du tampon phosphate salin (« Phosphate Buffer Salin » (PBS)) des culots contenant les cellules, ces derniers ont été remis en suspension dans du tampon phosphate salin (« Phosphate Buffer Salin » (PBS)). Les suspensions ainsi préparées ont été divisées et mises en présence de marqueurs couplés à un fluorochrome. Ces marqueurs sont généralement des IgG capables de se fixer spécifiquement à des marqueurs exprimés à la surface des cellules. Les marqueurs suivants ont été sélectionnés :
→ CD14 : exprimé à la surface des monocytes mais pas des DC, → CD40 et HLA-Dr : sur-exprimé à la surface des DC,
→ CD80 : exprimé à la surface des DC matures.
[00236] Après incubation pendant 15 min à température ambiante et dans le noir, les suspensions sont centrifugées, les culots contenant les cellules sont lavés avant d'être remis en suspension dans 200 μL de PBS. La lecture a été ensuite réalisée en cytométrie de flux avec le dispositif BD FACS Diva.
[00237] Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 21 .
[00238] Une population de cellules P1 a été définie en fonction de la taille des cellules attendues (SSC : Sideways Scatter Channel - signal corrélé à la complexité cellulaire, FSC : Forward Scatter Channel - signal corrélé à la taille relative des cellules). Les données prises en compte étaient les suivantes :
- #Events : nombre total d'événements (cellules) dans la population définie,
- %Parent : nombre d'événements dans la population définie divisé par le nombre total d'événements, exprimé en pourcentage,
- Mean : valeur moyenne (dans ce cas de l'intensité de fluorescence) pour les événements de la population définie.
[00239] Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 5 ci- dessous :
Figure imgf000056_0001
[00240] Les résultats les plus significatifs sont ceux obtenus avec les marquages CD14 et CD40. En effet, le marqueur CD14 est exprimé uniquement à la surface des monocytes et non des DC tandis que le marqueur CD40 est sur-exprimé sur les DC.
[00241] II a été observé alors que pour le témoin positif (GMIL4), il y a bien eu production de DC, la fluorescence associée au marqueur CD14 étant très faible tandis que celle associée au marqueur CD40 est très élevée.
[00242] Pour ce qui est du témoin négatif (Mono), les monocytes sont restés sous leur forme initiale, la fluorescence associée au marqueur CD14 étant plus élevée que celle du CD40.
[00243] En ce qui concerne les échantillons de plasma, il est nécessaire de les comparer deux à deux (Tém1/HP1 et Tém2/HP2). Pour chaque couple d'échantillon, aucune différence n'a pu être décelée au niveau des intensités de fluorescence pour chaque marqueur, ce qui signifie que le procédé objet de l'invention n'induit pas de modification du pouvoir immunogène du plasma. [00244] Tel que démontré dans les exemples précédents, le procédé de la présente invention, permet d'inactiver au moins un agent pathogène, par exemple un agent pathogène dans le plasma sanguin humain, tout en conservant l'activité biologique dudit plasma. Ainsi le plasma obtenu peut, par exemple être utilisé dans le domaine thérapeutique. Liste des références
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Claims

Revendications
1. Procédé d'inactivation d'au moins un agent pathogène d'un échantillon de plasma sanguin humain caractérisé en ce qu'il comprend au moins 5 cycles comprenant chacun :
la compression dudit échantillon de sa pression initiale Po à une pression Pi, Pi étant compris de 1 90 à 210 MPa, la compression de Po à Pi, la température dudit plasma à la pression Pi étant compris de -100C à -3°C du fait de la compression,
le maintien éventuel de la pression Pi durant un temps compris de 110 à 130 secondes, et
la détente de l'échantillon jusqu'à la pression P0,
la vitesse d 'augmentation de la pression pou r lad ite compression et la vitesse de diminution de la pression pour ladite détente étant réalisée à une vitesse Vi de 47,5 à 52,5 MPa/s"1.
2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel la compression et/ou la détente est adiabatique.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'agent pathogène est choisi dans le groupe comprenant les bactéries, les moisissures, les levures, les virus, les protéines infectieuses et/ou les parasites.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel l'échantillon est à une température initiale avant compression comprise de -18°C à -3°C.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel la pression initiale Po est de 0,1 MPa.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la pression Pi est maintenue pendant une durée de 120 secondes.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel la pression Pi est égale à 200 MPa.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel l'échantillon est dans un emballage hermétique.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel la pression est appliquée de manière isostatique au moyen d'un milieu transmetteur de pression.
10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel le milieu transmetteur de pression est un milieu liquide polaire ou apolaire.
11. Procédé selon la revendication 9 ou 10, dans lequel le milieu transmetteur est l'éthanol et/ou un mélange glycol et eau.
12. Utilisation du procédé selon la revendication 1 pour l'élimination sélective d'au moins un agent pathogène dans le plasma sanguin humain.
13. Plasma sanguin humain obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12.
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