WO2011107614A2 - Méthode d'évaluation du potentiel sensibilisant et/ou irritant d'un composé test - Google Patents

Méthode d'évaluation du potentiel sensibilisant et/ou irritant d'un composé test Download PDF

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WO2011107614A2
WO2011107614A2 PCT/EP2011/053399 EP2011053399W WO2011107614A2 WO 2011107614 A2 WO2011107614 A2 WO 2011107614A2 EP 2011053399 W EP2011053399 W EP 2011053399W WO 2011107614 A2 WO2011107614 A2 WO 2011107614A2
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating the sensitizing and / or irritating potential of a test compound and to a kit for carrying out said method.
  • Irritation is a reversible inflammation of living tissue by chemical action at contact website. It is recognized by edema following an influx of fluids into the tissues, redness, heat and / or pain.
  • epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts are stimulated to release cytokines IL1, TNF alpha, IL6, IL8 into the skin, as well as mediators such as prostaglandins (PGE2), which will initiate the inflammatory response.
  • PGE2 prostaglandins
  • the sensitization phase during which the antigen / allergen is presented to the immune system and in particular to the T lymphocytes that record the molecular signal and regulate, via the cytokines produced, the other cell populations involved (B-lymphocytes, CD8-T cells). endothelial cells, macrophages, mast cells, keratinocytes etc.);
  • the second phase the second phase, called the effector phase, during which different skin cell populations will intervene via chemical mediators responsible for pathological disorders.
  • the effector phase the second phase, called the effector phase, during which different skin cell populations will intervene via chemical mediators responsible for pathological disorders.
  • anaphylactic antibodies such as IgE
  • histamine the main vector of allergic manifestations.
  • cytotoxic T cells TCD8
  • TCD8 cytotoxic T cells
  • the new European constraints now require the use of non-animal methods and it is therefore essential to develop alternative methods for determining whether a new composition or a new product is likely to pose a risk to the animal. man by its sensitizing properties.
  • the present invention is based on the elucidation of the global change in terms of gene expression from cutaneous tissues or cells exposed to toxic agents and more particularly sensitizers in comparison with unexposed irritants or control tissues / cells. exposed to the only vehicle necessary for the solubilization or the application of the substances tested.
  • the inventors have shown that the in vivo recognition of a substance is not done at the level of the draining ganglion, as is generally admitted, but at the level of the tissue where the substance comes into contact with the body in this case: the skin. This would explain why some substances are sensitizing in one tissue and not in another as is often observed. It thus appears that it is the reaction of the cutaneous tissue that instructs the message to the cells presenting the allergen: the dendritic cells will then transmit it to the T cells in the draining ganglion.
  • the present invention relates to a method for evaluating the sensitizing and / or irritating potential of a test compound, preferably the sensitizing and irritating potential of a test compound, comprising the steps of:
  • the method according to the present invention may further comprise a step c) of determining the sensitizing and / or irritating potential of a test compound, preferably the sensitizing and irritating potential of a test compound.
  • said step c) may consist of a step of selecting said compound as having a sensitizing and / or irritating potential, preferably a sensitizing and irritating potential, if the level of expression is greater than a threshold value.
  • the method according to the present invention is an in vitro method.
  • biological sample refers to any solid or liquid sample from a subject.
  • said biological sample is a skin sample.
  • the skin sample is a skin sample reconstructed in vitro, such as EpiSkin (EPISKIN, Lyon France), EpiDerm TM (MATEK Corporation, Ashland, MA) or SkinEthic TM RHE (SKINETHIC, Nice , France).
  • EpiSkin EPISKIN, Lyon France
  • EpiDerm TM MATEK Corporation, Ashland, MA
  • SkinEthic TM RHE SKINETHIC, Nice , France
  • the skin sample does not include the addition of other additional cell types, and even more preferably no additional Langerhans cells.
  • the measurement of the expression of said at least one gene of step b) makes it possible to determine the level of expression of said gene.
  • test compound may be a compound of varied nature, structure and origin, including a biological compound, a chemical compound, synthetic compound, etc.
  • the test compound can be any product that is in an isolated form or in admixture with other products.
  • the test compound can be defined in terms of structure and / or composition or be defined functionally.
  • the test compound may, for example, be an isolated and structurally defined product, an isolated product of indefinite structure, a mixture of known and characterized products or a composition comprising one or more products.
  • One or more compounds can thus be tested, in admixture or separately.
  • compositions may be, for example, samples of a cosmetic or dermatological product.
  • test compound is suitable for use on the skin and can be used in a cosmetic or dermatological composition.
  • the present invention is particularly suitable for identifying the sensitizing and irritating potential of a large number of compounds. This simple and efficient screening can be accomplished in a very short time.
  • the described methods can be partially automated, thus enabling efficient and simultaneous screening of various and diverse compounds, either as a mixture or in separate form.
  • the level of expression of said gene is evaluated by measuring the level of expression of the polypeptide encoded by said gene or a fragment thereof, or by measuring the level of expression of the gene.
  • mRNA of said gene or fragment thereof is performed by analyzing the expression of mRNA transcripts or mRNA precursors, such as native RNA, of said gene.
  • Said assay can be performed by preparing the mRNA / cDNA of cells from a biological sample of a patient, and hybridizing the mRNA / cDNA with a reference polynucleotide.
  • the mRNA / cDNA prepared can be used in a hybridization or amplification assay which includes, but is not limited to, Southern and Northen analyzes, polymerase chain reaction (PCR) assays, such as quantitative PCR (Taqman ) and the use of "probes arrays" such as GeneChip® DNA templates (AFFYMETRIX).
  • PCR polymerase chain reaction
  • probes arrays such as GeneChip® DNA templates (AFFYMETRIX).
  • the analysis of the expression of the level of transcribed mRNA of the said at least one gene involves a nucleic acid amplification process, such as, for example, RT-PCR (experimental embodiment described in US Pat. No. 4,683,202), the ligase chain reaction (BARANY, Proc Natl Acad Sci USA, vol.88, p: 189-193, 1991), self sustained sequence replication (GUATELLI) et al., Proc Natl Acad Sci USA, vol.87, p: 1874-1878, 1990), the transcriptional amplification system.
  • RT-PCR experimental embodiment described in US Pat. No. 4,683,202
  • the ligase chain reaction BARANY, Proc Natl Acad Sci USA, vol.88, p: 189-193, 1991
  • GUILLI self sustained sequence replication
  • the method according to the present invention comprises a further step of amplification of the mRNA or cDNA of said gene, of the sequence complementary thereto or of a fragment thereof. this.
  • the amplification primers are defined as a pair of nucleic acid molecules that can match the 3 'and 5' regions of a gene, specifically (positive and negative strands, or conversely) and frame a short region of said gene.
  • Amplification primers have a length of 10 to 30 nucleotides and allow the amplification of a region of a length of between 50 and 200 nucleotides.
  • the primers used in the context of the present invention are chosen from those listed in Tables 1 to 4.
  • the measurement of the expression of said at least one gene is performed by measuring the level of expression of the polypeptide encoded by said gene.
  • Said assay can be performed using an antibody (eg, a radiolabeled antibody, labeled with a chromophore, a fluorophore, or an enzyme), an antibody derivative (eg an antibody conjugated to a substrate or a protein or a ligand of a protein of a ligand / protein pair (eg, biotin-streptavidin)) or an antibody fragment (e.g., a single chain antibody, a hypervariable domain of an isolated antibody, etc.) that specifically binds to the polypeptide encoded by said gene.
  • an antibody eg, a radiolabeled antibody, labeled with a chromophore, a fluorophore, or an enzyme
  • an antibody derivative eg an antibody conjugated to a substrate or a protein or a ligand of a protein of a lig
  • Said assays can be performed by numerous techniques within the abilities of those skilled in the art including, but not limited to, immunoassays based on the use of enzymatic activity ("immunoassay enzyme" EIA), immunoassays. logics based on the use of radioactive isotopes (RIA), Western blot analysis and enzyme linked immunoabsorbent assay (ELISA).
  • EIA immunoassay enzyme
  • RIA radioactive isotopes
  • ELISA enzyme linked immunoabsorbent assay
  • polypeptide means a sequence comprising at least two amino acids
  • polypeptide means a sequence comprising at least two amino acids
  • polypeptide means a sequence comprising at least two amino acids
  • polypeptide means a sequence comprising at least two amino acids
  • polypeptide means a sequence comprising at least two amino acids
  • polypeptide means a sequence comprising at least two amino acids
  • polypeptide means a sequence comprising at least two amino acids
  • polypeptide means a sequence comprising at least two amino acids
  • polypeptide amino acids
  • peptide protein
  • mRNA or cDNA fragment is meant a sequence of at least 50 nucleic acids, for example at least 100 or 150 nucleic acids, preferably at least 200 nucleic acids. as an example of at least 250 or 350 nucleic acids, and particularly preferably a polypeptide of at least 400 nucleic acids.
  • fragment of the polypeptide is meant a sequence of at least 50 amino acids, for example at least 100 or 150 amino acids, preferably at least 100 amino acids. at least 200 amino acids, by way of example of at least 250 or 350 amino acids, and particularly preferably a polypeptide of at least 400 amino acids.
  • said method makes it possible to evaluate the sensitizing and / or irritating potential of a test compound, preferably the sensitizing and irritating potential of a test compound, in humans, in which step b) comprises the measurement of expression of at least one gene selected from the group consisting of: CCL2, CCL20, CCL22, CD207, CDH3, CDSN, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCP1, MMP9, NRF2, PDZK1IP1, S100A4, S100A7, S100A9, STAT1, TPSAB1, TYR, VIM, CCL27, CLEC4A, DSC1, DSG2, EPHX1, GUSB, IL10RB, IL20RA, IL22R, KEAP1, KRT10, KRT14, KRT18, LOR, S100A11, SERPINB3, STAT3, TIMP3, and VEGF.
  • step b) comprises the measurement of expression of at least one gene selected from the group consisting of: C
  • step b) comprises measuring the expression of at least one gene selected from the group consisting of: CCL27 , CLEC4A, DSC1, DSG2, EPHX1, GUSB, IL10RB, IL20RA, IL22R, KEAP1, KRT10, KRT14, KRT18, LOR, S100A11, SERPINB3, STAT3, TIMP3 and VEGF.
  • step b) comprises measuring the expression of at least one gene selected from the group consisting of: CCL2, CCL20, CCL22, CD207, CDH3, CDSN, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCP1, MMP9, NRF2, PDZK1IP1, S100A4, S100A7, S100A9, STAT1, TPSAB1, TYR and VIM.
  • said method makes it possible to evaluate the sensitizing and / or irritating potential of a test compound, preferably the sensitizing and irritating potential of a test compound, in the mouse, in which step b) comprises level measurement.
  • step b) comprises level measurement.
  • step b) comprises measuring the expression of at least one gene selected from the group consisting of: BDEFENSIN, C10, CCR2, CD160, CD207, CD83, CJUN, CLEC4D, CLEC7A, CMYC, COX2, CYCLINA1, CYCLINE1, CYP2E1, CYP7A1, DAPK2, EDA2R, EGR2, FCER1, Fcgr1, GATA-2, GATA-3, Histr2, ICAM2, IEX1, IL12rb, IL-15, IL-19, IL-20, JUNK1, JUNK2, Krt17, Krt6, LY9, LY96, LYN, MIP1A, MKP1, MKP3, MMP12, MYELOPEROXIDASE, NOTCH3, PPARA, St6gall, TECK, TLR13, Tpsabl, VEGF and
  • step b) comprises measuring the expression of at least one gene chosen from the group consisting of: 41BB , ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP1, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, Col3al, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, ASF, FOSB, FYB, G-CSF R, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL-11RA
  • step b) of said method for evaluating the sensitizing and / or irritating potential, preferably the sensitizing and irritating potential of a test compound comprises measuring the expression of at least 2, of at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, of at least 12, of at least 13, of at least 14, of at least 15, of at least 16, of at least 17, and even more preferably of at least 18 genes chosen from group consisting of: 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, Col3al, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FA
  • step b) of said method for evaluating the sensitizing and irritating potential of a test compound comprises measuring the expression of at least 2, at least 3, of at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, and even more preferably at least 18 genes selected from the group consisting of: 41BB, ABCA6, Adam 8 , ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, CoBal, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, FAS, FOSB, FYB, G-CSF
  • a test compound has a sensitizing and / or irritating potential, preferably a sensitizing and irritating potential, if overexpression of at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, at least 8, at least 9, at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17 and even more preferably at least 18 of said genes is observed with respect to their levels of expression in the absence of said test compound.
  • the term "sensitizing potential” means the risk for the test compound of causing an immunological reaction when it is brought into contact with a mammal, preferably a human.
  • the sensitizing potential can be considered as the risk of developing an allergy in contact with the test compound.
  • irrigation potential is meant the risk for the test compound to cause reversible inflammation of living tissue by chemical action at the site of contact.
  • the present invention relates to a method for evaluating the sensitizing potential of a test compound, comprising the steps of:
  • BDEFENSIN measuring the expression of at least one gene selected from the group consisting of: BDEFENSIN, C10, CCR2, CD160, CD207, CD83, CJUN, CLEC4D, CLEC7A, CMYC, COX2, CYCLINA1, CYCLINE1, CYP2E1, CYP7A1, EDA2R, EGR2, FCER1, Fcgr1, GATA-2, GATA-3, Histr2, ICAM2, IEX1, IL12rb, IL-15, IL-19, IL-20, JUNK1, JUNK2, Krt17, Krt6, LY9, LY96, LYN, MIP1A, MKP1, MKP3, MMP12, MYELOPEROXIDASE, NOTCH3, PPARA, St6gall, TECK, TLR13, Tpsabl, VEGF, ZAP70, CCL27, CLEC4A, DSC1, DSG2, EPHX1, GUSB, IL10
  • step b) of said sensitizing potential evaluation method comprises measuring the expression of at least 2, at least 3, at least 4, at least 5, at least 6, at least 7, and even more preferably at least 8 genes selected from the group consisting of: BDEFENSIN, C10, CCR2, CD160, CD207, CD83, CJUN, CLEC4D, CLEC7A, CMYC, COX2, CYCLINA1 , CYCLINE1, CYP2E1, CYP7A1, EDA2R, EGR2, FCER1, Fcgr1, GATA-2, GATA-3, Histr2, ICAM2, IEX1, IL12rb, IL-15, IL-19, IL-20, JUNK1, JUNK2, Krt17, Krt6 , LY9, LY96, LYN, MIP1A, MKP1, MKP3, MMP12, MYELOPEROXIDASE, NOTCH3, PPARA, St6gall, TECK, TLR13, T
  • the method according to the present invention makes it possible to evaluate whether the test compound is likely to cause a contact allergy or atopic dermatitis.
  • the method according to the present invention further comprises a step of comparing the level of expression of said gene with a reference value.
  • This reference value can serve as a positive and / or negative control.
  • a positive control can for example be performed by comparing the level of expression of said at least one gene in the presence of the test compound with the level of expression of said at least one gene in the presence of a compound known as sensitizer and / or irritant. For example, if the level of expression of said at least one gene in the presence of the test compound is greater than or equal to the level of expression of said at least one gene in the presence of a compound known as a sensitizer and / or irritant, it will be possible to conclude the potential sensitizing and / or irritating said compound.
  • a compound known as a sensitizer By way of example of a compound known as a sensitizer, mention may be made of 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, p-phenylenediamine, dinitrochlorobenzene, benzaldehyde, resorcinol, tetramethyl thiuram disulfide and oxazolone.
  • a sensitizing composition such as the "fragrance mix”.
  • SLS sodium lauryl sulphate
  • octanoic acid cholobenzene
  • lactic acid bromobutane
  • methyl salicylate methyl salicylate
  • a negative control can be carried out in the absence of the test compound or in the presence of a compound known to be non-sensitizing and non-irritating, such as, for example, olive oil, olive oil or glycerol, cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) and dipropylene glycol.
  • CTAB cetyltrimethylammonium bromide
  • a test compound has a sensitizing and / or irritating potential, preferably a sensitizing and irritating potential, if overexpression of said gene is observed with respect to its level of expression in the absence of said test compound.
  • overexpression is meant a significantly higher level of expression of said gene relative to its normal expression level.
  • overexpression means a level of expression in a biological sample that is greater than at least 20% of the normal level of expression of said gene, preferably greater than at least 50%> of the normal level of expression of said gene, and particularly preferably greater than at least 90% of the normal level of expression said gene.
  • the "level of expression in the absence of said test compound” or "normal level” is the level of expression of said gene in a control sample corresponding potentially to the biological sample of a patient not exhibiting a sensitization reaction and and / or irritation or, preferably, the average level of expression of said gene in different control samples.
  • step b) is carried out between 2 and 24 hours after step a), more preferably between 4 and 18 hours after step a), particularly preferably between 5 and 7 hours after step a) and preferably every 6 hours after step a).
  • the present invention relates to the use of at least one gene selected from the group consisting of: 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, CoBal, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, FAS, FOSB, FYB, G-CSF R, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL-1 IRA, IL-16, IL-17R, ILIRa, IL1RAP,
  • the present invention relates to the use of at least one gene selected from the group consisting of: 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, Col3al, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, FAS, FOSB, FYB, G-CSF R, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL-1 IRA, IL-16, IL-17R, ILIRa, IL1RAP, IL-24, IP10, ITAK, ITGAM, IT
  • the present invention also relates to a kit for implementing the method according to the present invention, comprising means for detecting the level of expression of at least one gene selected from the group consisting of: 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, CoBal, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, FAS, FOSB, FYB, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70 , HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL-11RA, IL-16, IL-17R
  • said kit will comprise at least one pair of primers allowing the amplification of at least one gene selected from the group consisting of: 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, CoBal, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, FAS, FOSB, FYB, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL -11RA, IL-16, IL-17R, ILIRa, IL1RAP
  • said kit will comprise at least one pair of primers allowing the amplification of at least one gene selected from the group consisting of: 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, CoBal, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, FAS, FOSB, FYB, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL -11RA, IL-16, IL-17R, ILIRa, IL1RAP
  • CBA / J mice from European distributors were used.
  • the age of the animals was between 7 and 12 weeks.
  • the animals were kept in standard conditions and had free access to food and water. 2 animals per group were used.
  • the dorsal surface of each ear was treated with 25 ⁇ / ear of the test solution.
  • the diluent used was Acetone / Olive Oil (50/50 v / v) or DMF.
  • the substances tested are alpha hexyl cinnamaldehyde (HCA) 25%, Isoeugenol 50%, Lauryl sulphate (SLS) 50%, Hydroxy citronelal (OHC), 50%; 0.1% PPD, 25% octanoic acid.
  • HCA alpha hexyl cinnamaldehyde
  • SLS Lauryl sulphate
  • OOC Hydroxy citronelal
  • An ear biopsy was retrieved after 6h, 12h or 24h of treatment with an 8mm punch and the outer leaflet was removed with tongs and immediately frozen in liquid nitrogen.
  • Tables 1 and 2 are expressed as the rate of increase relative to the negative control.
  • the average of the 3-time expression levels of the kinetics (3h, 6h and 24h after application of the substance) was calculated.
  • Table 1 lists the genes that are induced by both sensitizing and irritating substances and Table 2 that of genes specifically induced by sensitizing substances. The expression of these genes is not increased in response to the vehicle that served as control.
  • the inducing products that have been used in this clinical study are therefore the fragrance mix (8%), the nickel in sulphate form and the sodium lauryl sulphate (LSS).
  • the targeted steps of skin reactions studied are those that take place in the skin, especially in the epidemic, during the early stages of the process. Assumed to be less complex than later stages involving a larger number of cell types, they should allow for better discrimination between different types of responses.
  • the analysis will therefore focus on the first 12 hours following the application of the product and on the phenomena taking place in the skin and more particularly in the epidermis.
  • the two application groups are:
  • Group 1 12 subjects with 3 double nickel patches on one forearm and 2 double patches with irritant and one untreated area on the other forearm (Nickel allergic).
  • Group 2 12 subjects with 3 double fragrance mix patches on one forearm and 2 double patches with irritant and one untreated area on the other forearm
  • the untreated zone replaced an application time of the irritant, which was included in the randomization scheme assigned to each subject.
  • the non treated was randomized with application times of the irritant on the forearm corresponding to the irritant.
  • Each forearm is divided into three zones that correspond to the different application times for an inductor product. Two samples were taken per zone.
  • the aim of the study was to identify biomarkers that distinguish sensitizing and / or irritating substances, but also to define the "minimal tissue" that can be used in vitro culture to express enough genes selected to allow the analysis and classification of these substances in an in vitro model.
  • Table 3 shows all the genes overexpressed by both the Nickel sensitizers and "Fragrance Mix” and the SLS irritant in humans.
  • genes specifically expressed by irritating and sensitizing molecules are common with those found in mice such as C2TA, CCL2, CCL20, CCL22, CD14, CD83, FASCIN, IL10RA, IL2RG, IL4R, KRT17, MMP9, S100A8, STAT1.
  • the other genes found had not been tested, or have no equivalent (like IL-8) in mice.

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Abstract

L'invention se rapporte à une méthode d'évaluation du potentiel sensibilisant et/ou irritant d'un composé test et à une trousse pour la mise en œuvre de ladite méthode.

Description

Méthode d'évaluation du potentiel sensibilisant et/ou irritant d'un composé test
La présente invention se rapporte à une méthode d'évaluation du potentiel sensibilisant et/ou irritant d'un composé test et à une trousse pour la mise en œuvre de ladite méthode.
Les industries de la parfumerie, de la cosmétique et de la pharmacie se doivent de rester compétitives et performantes et continuer à proposer régulièrement des produits nouveaux, avec comme contrainte de répondre aux normes de sécurité pour l'homme et son environnement attachées à leur utilisation. Or l'allergie de contact est l'un des risques majeurs associés à l'utilisation de tels produits.
L'allergie cutanée de contact (ou dermatite atopique) est un problème de santé publique majeur chez l'homme. Elle représente une manifestation immunotoxique environnementale sérieuse, contraignante, dont il est important d'anticiper les effets lorsque l'on met sur le marché des produits susceptibles de la provoquer. La sensibilisation cutanée et, par conséquent la manifestation allergique associée, est le résultat dans un premier temps de l'interaction d'une molécule allergénique avec des cellules spécialisées de l'épiderme, les cellules présentatrices de l'antigène (cellules de Langerhans, cellules dendritiques) puis dans un second temps de leurs présentations par ces cellules à des lymphocytes effecteurs T CD4+ et CD8+. Ce sont ces derniers qui sont à la base de la réaction allergique et inflammatoire. Néanmoins, les allergènes, en particulier ceux qui peuvent être présents dans un parfum, sont des petites molécules qui ne peuvent pas être reconnues directement. Leur reconnaissance nécessite leur association préalable avec des protéines du soi. Ainsi, c'est le complexe hétérodimérique néoformé dans la peau qui sera ultérieurement présenté aux cellules T dans les ganglions proximaux. Par conséquent, la faculté d'une molécule chimique (composé de parfum ou ingrédient cosmétique) à s'associer à une protéine de l'utilisateur de ce produit est un préalable obligatoire à l'induction de la réaction pathologique (cutanée) consécutive. Cette réaction pathologique (cutanée) pourra soit être une irritation, soit une sensibilisation, soit dans la majorité des cas, à la fois une irritation et une sensibilisation.
L'irritation est une inflammation réversible des tissus vivants par action chimique au site de contact. Celle-ci se reconnaît par un œdème consécutif à un afflux de fluides dans les tissus, une rougeur, de la chaleur et/ou de la douleur. En réponse à une agression chimique, les kératinocytes de l'épiderme et les fïbroblastes du derme sont stimulés et vont libérer dans la peau des cytokines IL1, TNF alpha, IL6, IL8, ainsi que des médiateurs comme les prostaglandines (PGE2) qui vont initier la réponse inflammatoire.
Les hypersensibilités retardées et immédiates à la base de la sensibilisation impliquent une notion de « mémoire » ce qui souligne leur caractère irréversible contrairement à l'irritation. Dans un cas comme dans l'autre, les mécanismes se déroulent en deux phases :
la première, dite phase de sensibilisation, pendant laquelle l'antigène/allergène est présenté au système immunitaire et en particulier aux lymphocytes T qui enregistrent le signal moléculaire et régulent, via les cytokines produites, les autres populations cellulaires impliquées (lymphocytes B, T CD8, cellules endothéliales, macrophages, mastocytes, kératinocytes etc ..) ;
- la seconde phase, dite la phase effectrice, pendant laquelle différentes populations cellulaires cutanées vont intervenir par l'intermédiaire de médiateurs chimiques responsables des désordres pathologiques. Dans le cas de l'hypersensibilité immédiate, la génération d'anticorps anaphylactiques comme les IgE, en se fixant sur les mastocytes et les basophiles, va conduire à la libération d'histamine, principal vecteur des manifestations allergiques. Dans le cas de l'hypersensibilité retardée, ce sont des cellules T de type cytotoxique (TCD8) qui en détruisant les kératinocytes sont responsables des lésions cutanées.
Ainsi, même si d'un point de vue histologique les dermatites de contact allergiques et irritantes sont très voisines, les conséquences immuno logiques analysées au niveau cellulaire ne sont pas pour autant similaires. Il est par conséquent important de posséder des méthodologies fiables permettant de les distinguer. Une approche prédictive originale est d'autant plus nécessaire qu'actuellement aucune corrélation claire n'a été mise en évidence entre une structure moléculaire donnée et l'allergénécité prise au sens large du terme. Jusqu'à présent, des animaux étaient utilisés pour identifier les molécules sensibilisantes au niveau cutané et le LLNA (local lymph node assay) basé sur la prolifération induite des lymphocytes ganglionnaires après contact avec le sensibilisant a été développé. Ce test a été adopté comme « Testing guideline 429 » par l'Organisation de coopération et de développement économiques (OCDE) et est considéré encore à ce jour comme le test de référence pour la détermination d'un agent chimique sensibilisant.
Les nouvelles contraintes européennes imposent désormais l'utilisation de méthodes n'utilisant pas d'animaux et il est donc indispensable de mettre au point des méthodes alternatives permettant de déterminer si une composition nouvelle ou un produit nouveau est susceptible de représenter un risque pour l'homme par ses propriétés sensibilisantes. La présente invention est basée sur l'élucidation du changement global en terme d'expression génique à partir de tissus cutanés ou de cellules exposés à des agents toxiques et plus particulièrement des sensibilisants en comparaison avec des irritants ou des tissus/cellules témoins non exposés ou exposés au seul véhicule nécessaire à la solubilisation ou l'application des substances testées.
De manière surprenante, les Inventeurs ont mis en évidence que certains gènes représentent la signature moléculaire de l'action sensibilisante et/ou irritante, permettant ainsi de différencier l'action d'un sensibilisant en comparaison d'un irritant, démontrant ainsi que les toxiques répondant à ces qualificatifs impliquent des voies métaboliques identifiables.
De plus, les Inventeurs ont mis en évidence que certains gènes représentent à la fois la signature moléculaire de l'action sensibilisante et irritante, permettant ainsi de différencier en un seul test le potentiel à la fois sensibilisant et irritant d'un composé.
Par ailleurs, les Inventeurs ont montré que la reconnaissance in vivo d'une substance ne se fait pas au niveau du ganglion drainant, comme cela est généralement admis, mais bien au niveau du tissu où la substance entre en contact avec l'organisme dans le cas présent : la peau. Cela expliquerait pourquoi certaines substances sont sensibilisantes dans un tissu et pas dans un autre comme cela est souvent observé. Il apparaît donc que c'est la réaction du tissu cutané qui instruit le message aux cellules présentatrices de l'allergène : les cellules dendritiques vont alors le transmettre aux lymphocytes T dans le ganglion drainant.
Les Inventeurs ont mis en évidence que la peau constitue un modèle suffisant pour mettre en évidence des biomarqueurs spécifiques de la sensibilisation et/ou de l'irritation chez l'homme et chez la souris, et qu'il n'est pas nécessaire d'ajouter d'autres types cellulaires si l'analyse des gènes identifiés est réalisée à un temps donné. Le modèle EPISKIN peut ainsi être le tissu de référence pour évaluer le caractère sensibilisant et/ou irritant d'un composant test. Ainsi, la présente invention se rapporte à une méthode d'évaluation du potentiel sensibilisant et/ou irritant d'un composé test, de préférence du potentiel sensibilisant et irritant d'un composé test, comprenant les étapes de:
a) mise en contact d'un composé test avec un échantillon biologique;
b) mesure de l'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 41BB (membre 9 de la superfamille du TNF), ABCA6 (Cassette de fixation de
ΓΑΤΡ, sous famille A membre 6), Adam 8 (ADAM metallopeptidase domaine 8), ADAM 17 (disintegrine and metallopeptidase domaine 17), APC (adenomateux polypose coli), ATM (gène de l'ataxia telangiectasia), B7DC (PCD 1 ligand 2), BCL3 (Cellules B CLL/lymphome 3), BLC (CXC chimiokine ligand 13), BTK (tyrosine kinase de l'agammaglobulinemie de Burton), CAECAM (Molécule d'adhésion cellulaire ressemblant à l'antigène carcinoembryonnaire 1), CASP1 (interleukine 1-beta convertase), CASP12 (caspase 12), CCR1 (CC chimiokine récepteur 1), CCR5 (CC chimiokine récepteur 5), CCR7 (CC chimiokine récepteur 7), CD 122 (récepteur beta de l'interleukine 2), CD 124 (récepteur de l'interleukine 4), CD 163 (CD 163 molécule), CD209 (CD209 molécule), CD23 (récepteur de faible affinité pour le fragment Fc des IgE 2 (CD23)), CD244 (CD244 molécule), CD24A (CD24 molécule), CD25 (récepteur alpha de l'interleukine 2), CD34 (CD34 molécule), CD44 (CD44 molécule), CHEK1 (homologue du checkpoint 1), CLEC4E (lectine de type C domaine famille 4, membre E), CMYB (protéine c-myb), Colla (collagène, type I, alpha 1), Co al (collagène, type III, alpha 1), CTGF (facteur de croissance du tissu connectif), CXCR5 (CXC chimiokine récepteur 5), CYCLINE1 (cycline El), DR5 (Récepteur de mort 5), DR6 (Récepteur de mort 6), ELC (CC chimiokine ligand 1), EMBP (proteoglycane 3), ENG (endogline), EOT (CC chimiokine ligand 11), EOT2 (CC chimiokine ligand 24), FAK (protéine tyrosine kinase 2), FAS (Membre 6 de la superfamille du TNF récepteur), FOSB (FOSb), FYB (Protéine de fixation de FYN), G-CSF R (récepteur du facteur de croissance des colonies 3), GITRL (Membre 18 de la superfamille du TNF), GM-CSF R (sous unité alpha du récepteur du GM-CSF), HSP60 (chaperonine), HSP70 (Protéine de choc thermique à 70kDa), HYALURONIDASE (hyaluronoglucosaminidase 1), 1309 (CC chimiokine ligand Ibis), ICOS (costimulateur inductible des cellules T), ID1 (Inhibiteur de la fixation de 1ADN 1), ID3 (Inhibiteur de la fixation de 1ADN 3), IGSF3 (Membre 3 de la superfamille des immunoglobulines), IL-10RA (récepteur alpha de rinterleukine 10), IL- 1 IRA (récepteur alpha de rinterleukine 11), IL- 16 (interleukine 16), IL-17R (récepteur alpha de rinterleukine 17), ILIRa (récepteur type 1 de rinterleukine 1), IL1RAP (protéine accessoire du récepteur de rinterleukine 1), IL-24 (interleukine 24), IP10 (CxC chimiokine ligand 13), ITAK (CxC chimiokine ligand 11), ITGAM (CDl lb antigène), ITGB6 (integrine, beta 6), JAK 3 (Janus kinase 3), JUNB (jun B proto-oncogene), KC (CxC chimiokine ligand 2), Krtl3 (kératine 13), LAMA1 (laminine, alpha 1), LAMA3A (laminine alpha 3A), LAMC2 (laminine, gamma 2), LARC (CC chimiokine ligand 20), LIX (CxC chimiokine ligand 6), LPTN (C chimiokine ligand 1), LRPl (Protéine apparentée au récepteur des lipoprotéines de faible densité 1), LSST (carbohydrate (N- acetylglucosamine 6-0) sulfotransferase 4 ), LTA (lymphotoxine alpha), LTBR (récepteur de la lymphotoxine B), MARCKS (protéine kinase C riche en alanine myristoylaté), MCP1 (CC chimiokine ligand 13), MCP2 (CC chimiokine ligand 8), MCP3 (CC chimiokine ligand 7), MCP5 (CC chimiokine ligand 2), Mcpt6 (tryptase beta 2), M-CSF (Facteur de stimulation des colonies de macrophage), MIG (CxC chimiokine ligand 9), MIP1G (CC chimiokine ligand 9), MMP2 (metallopeptidase de matrice 2), MMP9 (metallopeptidase de matrice 9), MR1 (récepteur au mannose C type 1), MYD88 (Différenciation myeloide 88), MyhlO (Chaîne lourde de la Myosine 10), NCAM (molécule de l'adhésion cellulaire neurale), NFKB PI 05 (facteur nucléaire des cellules B-l), ONCM (oncostatine M), OSMR (récepteur oncostatine M), Procr (protéine C récepteur), RANTES (CC chimiokine ligand 5), RGS1 (régulateur des G-protéine 1), RGS14 (régulateur des G-protéine 14), RGS16 (régulateur des G-protéine 16), RGS3 (régulateur des G-protéine 3), RIPK1 (récepteur interagissant avec la kinase serine-threonine 1), Sele (selectine E), SELP (selectine P), SLP76 (protéine du cytosol des lymphocytes 2), SMAD6 (MAD homologue 36), SOCS-2 (suppresseur du signaling des cytokines 2), SOCS-3 (suppresseur du signaling des cytokines 3), STAT2 (signal transduceur and activateur de transcription 2), TANK (membre de la famille TRAF associé au NF-KAPPA-B), TARC (CC chimiokine ligand 17), TECK (CC chimiokine ligand 25), Thbd (thrombomoduline), TIRAP (toll-interleukine 1 récepteur), TLR2 (toll-like récepteur 2 ), TNFRP75 (récepteur du TNF p75), TRAF1 (facteur associé au TNF récepteur 1), TRAF3 (facteur associé au TNF récepteur 3), VAVl (oncogène vav 1), VEGFR (FMS-like tyrosine kinase 1), VEGI (membre 15 de la superfamille du TNF), BDEFENSIN (defensine, beta 4), C10 (CC chmiokine ligand 6), CCR2 (CC chimiokine récepteur 2), CD 160 (CD 160 molécule), CD207 (CD207 molécule, langerine), CD83 (CD83 molécule), CJUN (oncogène jun), CLEC4D (lectine de type C domaine famille 4, membre D), CLEC7A (Lectine de type C domaine famille 7, membre A), CMYC (v-myc), COX2 (synthase de prostaglandin-endoperoxide 2), CYCLINA1 (cycline Al), CYCLINE1 (cycline El), CYP2E1 (cytochrome P450, famille 2, sousfamille E, polypeptide 1), CYP7A1 (cytochrome P450, famille 7, sous famille A, polypeptide 1), DAPK2 (kinase associée à la mort 2), EDA2R (récepteur de l'ectodysplasin A2), EGR1 (gène de croissance précoce 1), EGR2 (gène de réponse précoce 2), FCER1 (récepteur de haute affinité pour le fragment Fc des IgE), Fcgrl (antigène CD64), FTH1P (ferritine, polypeptide lourd 1), GATA-2 (Protéine de fixation GATA-2), GATA- 3 (Protéine de fixation GATA-3), HISTR2 (récepteur de Γ histamne 2), ICAM2 (molécule d'adhésion intercellulaire 2), IEX1 (gène de la réponse immédiate 1), IL12rb (récepteur béta 1 de l'interleukine 12), IL-15 (interleukine 15), IL- 19 (interleukine 19), IL-20 (interleukine 20), JUNK1 (protéine kinase activée par les mitogènes 8), JUNK2 (protéine kinase activée par les mitogènes 9), Krtl7 (kératine 17), Krt6 (kératine 6B), LY9 (antigène CD229), LY96 (lymphocyte antigen 96), LYN (v-yes-1), MIP1A (CC chimiokine ligand 3), MKP1 (phosphatase de spécificité duale 1), MKP3 (Protéine kinase activée par les mitogènes 3), MMP12 (metallopeptidase de matrice 12 ( elastase du macrophage )), MYELOPEROXIDASE (MPO), NOTCH3 (Notch homologue 3 (Drosophile)), PPARA (récepteur alpha du peroxisome activé par la prolifération), , St6gall (ST6 beta-galactosamide alpha-2,6-sialyltranferase 1), TECK (CC chimiokine ligand 25), TLR13 (Récepteur Toll-Like 13), Tpsabl (tryptase alpha/beta 1), VEGF (facteur de croissance endothelium vasculaire A), ZAP70 (protéine kinase associée à la chaîne zeta (TCR) 70kDa), CCL2 (CC chimiokine ligand 2), CCL20 (CC chimiokine ligand 20), CCL22 (CC chimiokine ligand 22), CD207 (langerine), CDH3 (cadherine 3), CDSN (corneodesmosine), FASCIN (fascine), IL2RG (récepteur de l'interleukine 2 chaîne gamma), IL4R (récepteur de l'interleukine 4), KRT17 (Kératine 17), KRT2 (Kératine 2), LCP1 (Protéine du cytosol lymphocytaire 1), MMP9 (metallopeptidase de la matrice 9), NRF2 (Facteur nucléaire issus des erythrocytes 2), PDZK1IP1 (protéine d'interaction PDZK1), S100A4 (Protéine fixant le calcium S 100 A4), S100A7 (Protéine fixant le calcium S 100 A7), S100A9 (Protéine fixant le calcium S 100 A9), STAT1 (signal transduceur et activateur de la transcription 1), TPSAB1 (tryptase alpha/beta 1), TYR (tyrosinase), VIM (Vimentine), CCL27 (CC chimiokine ligand 27), CLEC4A (lectine de type C domaine famille 4, membre A), DSC1 (desmocolline 1), DSG2 (desmogleine 2), EPHX1 (hydrolase epoxide 1), GUSB (glucuronidase, beta), IL10RB (récepteur beta de l'interleukin 10), IL20RA (récepteur alpha de l'interleukin 20), IL22R (récepteur de l'interleukine 22), KEAP1 (Protéine associée ressemblant à kelch 1), KRT10 (Kératine 10), KRT14 (Kératine 14), KRT18 (Kératine 18), LOR (Loricrine), S100A11 (Protéine fixant le calcium S 100 Ai l), SERPINB3 (Serpine B3), STAT3 (signal transduceur et activateur de la transcription 3), TIMP3 (inhibiteur tissulaire de metalloproteinase 3), et VEGF (facteur de croissance de l'endothélium vasculaire), de préférence dans le groupe constitué par : 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, Col3al, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, F AS, FOSB, FYB, G-CSF R, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL- 1 IRA, IL-16, IL- 17R, ILIRa, IL1RAP, IL-24, IP10, ITAK, ITGAM, ITGB6, JAK 3, JUNB, KC, Krtl3, LAMA1, LAMA3A, LAMC2, LARC, LIX, LPTN, LRP1, LSST, LTA, LTBR, MARCKS, MCP1, MCP2, MCP3, MCP5, Mcpt6, M-CSF, MIG, MIP1G, MMP2, MMP9, MR1, MYD88, MyhlO, NCAM, NFKB P105, ONCM, OSMR, Procr, RANTES, RGS1, RGS14, RGS16, RGS3, RIPK1, Sele, SELP, SLP76, SMAD6, SOCS-2, SOCS-3, STAT2, TANK, TARC, TECK, Thbd, TIRAP, TLR2, TNFRP75, TRAF1, TRAF3, VAV1, VEGFR, VEGI, CCL2, CCL20, CCL22, CD207, CDH3, CDSN, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCP1, MMP9, NRF2, PDZK1IP1, S100A4, S100A7, S100A9, STAT1, TPSAB1, TYR et VIM.
De préférence, la méthode selon la présente invention peut comprendre en outre une étape c) de détermination du potentiel sensibilisant et/ou irritant d'un composé test, de préférence du potentiel sensibilisant et irritant d'un composé test.
Préférentiellement, ladite étape c) peut consister en une étape de sélection dudit composé comme présentant un potentiel sensibilisant et/ou irritant, de préférence un potentiel sensibilisant et irritant, si le niveau d'expression est supérieur à une valeur seuil.
De préférence, la méthode selon la présente invention est une méthode in vitro.
Tel qu'utilisé ici, le terme « échantillon biologique » se réfère à tout échantillon solide ou liquide issu d'un sujet.
De préférence, ledit échantillon biologique est un échantillon de peau.
Dans un mode de réalisation particulier, l'échantillon de peau est un échantillon de peau reconstruite in vitro, comme le EpiSkin (EPISKIN, Lyon France), EpiDerm™ (MATEK Corporation, Ashland, MA)) ou SkinEthic™ RHE (SKINETHIC, Nice, France).
De manière encore préférée, l'échantillon de peau ne comprend pas l'addition d'autres types cellulaires supplémentaires, et encore préférentiellement pas de cellules de Langerhans supplémentaires. Au sens de la présente invention, la mesure de l'expression dudit au moins un gène de l'étape b) permet de déterminer le niveau d'expression dudit gène.
Le composé test peut être un composé de nature, structure et origine variées, notamment un composé biologique, un composé chimique, synthétique, etc.
Le composé test peut être tout produit qui se présente sous une forme isolée ou en mélange avec d'autres produits. Le composé test peut être défini en termes de structure et/ou de composition ou être défini sur le plan fonctionnel. Le composé test peut, par exemple, être un produit isolé et structurellement défini, un produit isolé de structure indéfinie, un mélange de produits connus et caractérisés ou une composition comprenant un ou plusieurs produits. Un ou plusieurs composés peuvent ainsi être testés, en mélange ou de manière séparée.
De telles compositions peuvent être, par exemple, des échantillons d'un produit cosmétique ou dermatologique.
De préférence, ledit composé test est apte à être utilisé sur la peau et peut être utilisé dans une composition cosmétique ou dermatologique. La présente invention est particulièrement adaptée à l'identification du potentiel sensibilisant et irritant d'un nombre important de composés. Ce criblage simple et efficace peut être accompli en un laps de temps très court. Les méthodes décrites peuvent en particulier être partiellement automatisées, autorisant ainsi le criblage efficace et simultané de composés divers et nombreux, soit sous forme de mélange soit sous forme séparée.
De préférence, dans la méthode selon la présente invention, le niveau d'expression dudit gène est évalué par mesure du niveau d'expression du polypeptide codé par ledit gène ou un fragment de celui-ci, ou par mesure du niveau d'expression de l'ARNm dudit gène ou d'un fragment de celui-ci. Dans un mode de réalisation préféré, l'expression dudit au moins un gène est effectuée par analyse de l'expression de transcrits d'ARNm ou de précurseurs d'ARNm, tel qu'un ARN natif, dudit gène. Ladite analyse peut être réalisée en préparant l'ARNm/ADNc de cellules d'un échantillon biologique d'un patient, et hybridation de l'ARNm /ADNc avec un polynucléotide de référence. L'ARNm/ADNc préparé peut être utilisé dans une analyse par hybridation ou amplification qui inclut, sans s'y limiter, les analyses Southern et Northen, les analyses par PCR (« polymerase chain reaction »), telle que la PCR quantitative (Taqman) et l'utilisation de sondes (« probes arrays ») telles que les matrices ADN GeneChip® (AFFYMETRIX) .
Avantageusement, l'analyse de l'expression du niveau d'ARNm transcrit dudit au moins un gène implique un procédé d'amplification des acides nucléiques, comme par exemple la RT-PCR (mode de réalisation expérimental décrit dans le Brevet US 4,683,202), la réaction en chaîne par la ligase (BARANY, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.88, p: 189-193, 1991), la réplication de séquences auto-entretenue (« self sustained séquence réplication ») (GUATELLI et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.87, p: 1874-1878, 1990), le système d'amplification transcriptionnelle. (KWOH et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.86, p: 1173-1177, 1989), la « Q-Beta Replicase » (LIZARDI et al, Biol. Technology, vol.6, p: 1197, 1988), la « rolling circle réplication » (U. S. Patent No. 5,854,033) ou toute autre méthode d'amplification d'acides nucléiques, suivie d'une étape de détection des molécules amplifiées par des techniques bien connues de l'homme du métier. Ces modes de détection sont particulièrement utiles pour la détection de molécules d'acides nucléiques en très faibles quantités.
Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, la méthode selon la présente invention comprend une étape supplémentaire d'amplification de l'ARNm ou de l'ADNc dudit gène, de la séquence complémentaire de celle-ci ou d'un fragment de celle-ci.
Telles qu'utilisées ici, les amorces d'amplifications sont définies comme étant une paire de molécules d'acides nucléiques qui peuvent s'apparier respectivement aux régions 3' et 5' d'un gène de façon spécifique (brins positif et négatif, ou inversement) et encadrent une courte région dudit gène. De manière générale, les amorces d'amplification ont une longueur de 10 à 30 nucléotides et permettent l'amplification d'une région d'une longueur comprise entre 50 et 200 nucléotides. Avantageusement, les amorces utilisées dans le cadre de la présente invention sont choisies parmi celles listées dans les tableaux 1 à 4.
Dans un autre mode de réalisation préféré, la mesure de l'expression dudit au moins un gène est réalisée par mesure du niveau d'expression du polypeptide codé par ledit gène. Ladite analyse peut être réalisée en utilisant un anticorps (par exemple, un anticorps radiomarqué, marqué avec un chromophore, un fluorophore, ou une enzyme), un dérivé d'anticorps (par exemple un anticorps conjugué à un substrat ou à une protéine ou un ligand d'une protéine d'un couple ligand/protéine (par exemple biotine-streptavidine)) ou un fragment d'anticorps (par exemple un anticorps à une seule chaîne, un domaine hypervariable d'un anticorps isolé, etc.) qui se lie spécifiquement au polypeptide codé par ledit gène. Lesdites analyses peuvent être réalisées par de nombreuses techniques à la portée de l'homme du métier incluant, sans s'y limiter, les tests immuno logiques basés sur l'utilisation d'activité enzymatique (« enzyme immunoassay » EIA), les tests immuno logiques basés sur l'utilisation d'isotopes radioactifs (RIA), l'analyse par Western blot et les tests ELISA (« enzyme linked immunoabsorbant assay »).
Au sens de la présente invention, on entend par « polypeptide » une séquence comprenant au moins deux acides aminés, et les termes « polypeptide », « peptide » et « protéine » peuvent être indifféremment utilisés. Par « fragment de l'ARNm ou de l'ADNc », on entend une séquence d'au moins 50 acides nucléiques, à titre d'exemple d'au moins 100 ou 150 acides nucléiques, de préférence d'au moins 200 acides nucléiques, à titre d'exemple d'au moins 250 ou 350 acides nucléiques, et de manière particulièrement préférée un polypeptide d'au moins 400 acides nucléiques.
Par « fragment du polypeptide », on entend une séquence d'au moins 50 acides aminés, à titre d'exemple d'au moins 100 ou 150 acides aminés, de préférence d'au moins 200 acides aminés, à titre d'exemple d'au moins 250 ou 350 acides aminés, et de manière particulièrement préférée un polypeptide d'au moins 400 acides aminés.
Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel sensibilisant et/ou irritant d'un composé test, de préférence du potentiel sensibilisant et irritant d'un composé test, chez l'homme, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : CCL2, CCL20, CCL22, CD207, CDH3, CDSN, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCP1, MMP9, NRF2, PDZK1IP1, S100A4, S100A7, S100A9, STAT1, TPSAB1, TYR, VIM, CCL27, CLEC4A, DSC1 , DSG2, EPHX1, GUSB, IL10RB, IL20RA, IL22R, KEAP1, KRT10, KRT14, KRT18, LOR, S100A11, SERPINB3, STAT3, TIMP3, et VEGF.
Encore préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel sensibilisant d'un composé test chez l'homme, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : CCL27, CLEC4A, DSC1, DSG2, EPHX1, GUSB, IL10RB, IL20RA, IL22R, KEAP1, KRT10, KRT14, KRT18, LOR, S100A11, SERPINB3, STAT3, TIMP3 et VEGF. Alternativement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel sensibilisant et irritant d'un composé test chez l'homme, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : CCL2, CCL20, CCL22, CD207, CDH3, CDSN, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCP1, MMP9, NRF2, PDZK1IP1, S100A4, S100A7, S100A9, STAT1, TPSAB1, TYR et VIM.
Préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel sensibilisant et/ou irritant d'un composé test, de préférence le potentiel sensibilisant et irritant d'un composé test, chez la souris, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure du niveau d'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, CoBal, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, F AS, FOSB, FYB, G-CSF R, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL-11RA, IL-16, IL- 17R, ILIRa, IL1RAP, IL-24, IP10, ITAK, ITGAM, ITGB6, JAK 3, JUNB, KC, Krtl3, LAMA1, LAMA3A, LAMC2, LARC, LIX, LPTN, LRP1, LSST, LTA, LTBR, MARCKS, MCP1, MCP2, MCP3, MCP5, Mcpt6, M-CSF, MIG, MIP1G, MMP2, MMP9, MR1, MYD88, MyhlO, NCAM, NFKB P105, ONCM, OSMR, Procr, RANTES, RGS1, RGS14, RGS16, RGS3, RIPK1, Sele, SELP, SLP76, SMAD6, SOCS-2, SOCS-3, STAT2, TANK, TARC, TECK, Thbd, TIRAP, TLR2, TNFRP75, TRAF1, TRAF3, VAV1, VEGFR, VEGI, BDEFENSIN, C10, CCR2, CD160, CD207, CD83, CJUN, CLEC4D, CLEC7A, CMYC, COX2, CYCLINA1, CYCLINE1, CYP2E1, CYP7A1, EDA2R, EGR2, FCER1, Fcgrl, GATA-2, GATA- 3, HISTR2, ICAM2, IEX1, IL12rb, IL-15, IL-19, IL-20, JUNK1, JUNK2, Krtl7, Krt6, LY9, LY96, LYN, MIP1A, MKP1, MKP3, MMP12, MYELOPEROXIDASE, NOTCH3, PPARA, St6gall, TECK, TLR13, Tpsabl, VEGF et ZAP70.
Encore préférentiellement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel sensibilisant d'un composé test chez la souris, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : BDEFENSIN, C10, CCR2, CD160, CD207, CD83, CJUN, CLEC4D, CLEC7A, CMYC, COX2, CYCLINA1, CYCLINE1, CYP2E1, CYP7A1, DAPK2, EDA2R, EGR2, FCER1, Fcgrl, GATA-2, GATA-3, HISTR2, ICAM2, IEX1, IL12rb, IL-15, IL-19, IL-20, JUNK1, JUNK2, Krtl7, Krt6, LY9, LY96, LYN, MIP1A, MKP1, MKP3, MMP12, MYELOPEROXIDASE, NOTCH3, PPARA, St6gall, TECK, TLR13, Tpsabl, VEGF et ZAP70.
Alternativement, ladite méthode permet d'évaluer le potentiel sensibilisant et irritant d'un composé test chez la souris, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASPl, CASPl 2, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, Col3al, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, F AS, FOSB, FYB, G-CSF R, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL-11RA, IL-16, IL-17R, ILIRa, IL1RAP, IL-24, IP10, ITAK, ITGAM, ITGB6, JAK 3, JUNB, KC, Krtl3, LAMA1, LAMA3A, LAMC2, LARC, LIX, LPTN, LRP1, LSST, LTA, LTBR, MARCKS, MCP1, MCP2, MCP3, MCP5, Mcpt6, M-CSF, MIG, MIP1G, MMP2, MMP9, MR1, MYD88, MyhlO, NCAM, NFKB P105, ONCM, OSMR, Procr, RANTES, RGS1, RGS14, RGS16, RGS3, RIPK1, Sele, SELP, SLP76, SMAD6, SOCS-2, SOCS-3, STAT2, TANK, TARC, TECK, Thbd, TIRAP, TLR2, TNFRP75, TRAF1, TRAF3, VAV1, VEGFR et VEGI.
De préférence, l'étape b) de ladite méthode d'évaluation du potentiel sensibilisant et/ou irritant, de préférence du potentiel sensibilisant et irritant d'un composé test, comprend la mesure de l'expression d'au moins 2, d'au moins 3, d'au moins 4, d'au moins 5, d'au moins 6, d'au moins 7, d'au moins 8, d'au moins 9, d'au moins 10, d'au moins 11, d'au moins 12, d'au moins 13, d'au moins 14, d'au moins 15, d'au moins 16, d'au moins 17, et encore préférentiellement d'au moins 18 gènes choisis dans le groupe constitué par : 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, Col3al, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, FAS, FOSB, FYB, G-CSF R, GITRL, GM- CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL- 10RA, IL-11RA, IL-16, IL-17R, ILIRa, IL1RAP, IL-24, IP10, ITAK, ITGAM, ITGB6, JAK 3, JUNB, KC, Krtl3, LAMA1, LAMA3A, LAMC2, LARC, LIX, LPTN, LRP1, LSST, LTA, LTBR, MARCKS, MCP1, MCP2, MCP3, MCP5, Mcpt6, M-CSF, MIG, MIP1G, MMP2, MMP9, MR1, MYD88, MyhlO, NCAM, NFKB P105, ONCM, OSMR, Procr, RANTES, RGS1, RGS14, RGS16, RGS3, RIPK1, Sele, SELP, SLP76, SMAD6, SOCS-2, SOCS-3, STAT2, TANK, TARC, TECK, Thbd, TIRAP, TLR2, TNFRP75, TRAF1, TRAF3, VAV1, VEGFR, VEGI, BDEFENSIN, C10, CCR2, CD 160, CD207, CD83, CJUN, CLEC4D, CLEC7A, CMYC, COX2, CYCLINA1, CYCLINE1, CYP2E1, CYP7A1, EDA2R, EGR2, FCER1, Fcgrl, GATA-2, GATA-3, HISTR2, ICAM2, IEX1, IL12rb, IL-15, IL-19, IL-20, JUNK1, JUNK2, Krtl7, Krt6, LY9, LY96, LYN, MIP1A, MKP1, MKP3, MMP12, MYELOPEROXIDASE, NOTCH3, PPARA, St6gall, TECK, TLR13, Tpsabl, VEGF, ZAP70, CCL2, CCL20, CCL22, CD207, CDH3, CDSN, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCP1, MMP9, NRF2, PDZK1IP1, S100A4, S100A7, S100A9, STAT1, TPSAB1, TYR, VIM, CCL27, CLEC4A, DSC1, DSG2, EPHX1, GUSB, IL10RB, IL20RA, IL22R, KEAP1, KRT10, KRT14, KRT18, LOR, S100A11, SERPINB3, STAT3, TIMP3 et VEGF.
Encore préférentiellement, l'étape b) de ladite méthode d'évaluation du potentiel sensibilisant et irritant d'un composé test, comprend la mesure de l'expression d'au moins 2, d'au moins 3, d'au moins 4, d'au moins 5, d'au moins 6, d'au moins 7, d'au moins 8, d'au moins 9, d'au moins 10, d'au moins 11, d'au moins 12, d'au moins 13, d'au moins 14, d'au moins 15, d'au moins 16, d'au moins 17, et encore préférentiellement d'au moins 18 gènes choisis dans le groupe constitué par : 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, CoBal, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, FAS, FOSB, FYB, G-CSF R, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL-11RA, IL-16, IL- 17R, ILIRa, IL1RAP, IL-24, IP10, ITAK, ITGAM, ITGB6, JAK 3, JUNB, KC, Krtl3, LAMA1, LAMA3A, LAMC2, LARC, LIX, LPTN, LRP1, LSST, LTA, LTBR, MARCKS, MCP1, MCP2, MCP3, MCP5, Mcpt6, M-CSF, MIG, MIP1G, MMP2, MMP9, MR1, MYD88, MyhlO, NCAM, NFKB P105, ONCM, OSMR, Procr, RANTES, RGS1, RGS14, RGS16, RGS3, RIPK1, Sele, SELP, SLP76, SMAD6, SOCS-2, SOCS-3, STAT2, TANK, TARC, TECK, Thbd, TIRAP, TLR2, TNFRP75, TRAF1, TRAF3, VAV1, VEGFR, VEGI, CCL2, CCL20, CCL22, CD207, CDH3, CDSN, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCP1, MMP9, NRF2, PDZK1IP1, S100A4, S100A7, S100A9, STAT1, TPSAB1, TYR et VIM. Ainsi, on pourra conclure qu'un composé test présente un potentiel sensibilisant et/ou irritant, de préférence un potentiel sensibilisant et irritant, si une surexpression d'au moins 2, d'au moins 3, d'au moins 4, d'au moins 5, d'au moins 6, d'au moins 7, d'au moins 8, d'au moins 9, d'au moins 10, d'au moins 11, d'au moins 12, d'au moins 13, d'au moins 14, d'au moins 15, d'au moins 16, d'au moins 17 et encore préférentiellement d'au moins 18 desdits gènes est observée par rapport à leurs niveaux d'expression en l'absence dudit composé test. On entend par « potentiel sensibilisant », le risque pour le composé test de provoquer une réaction immunologique lors de sa mise en contact avec un mammifère, de préférence un humain. Ainsi, le potentiel sensibilisant peut être considéré comme le risque de développer une allergie au contact du composé test. On entend par « potentiel irritant », le risque pour le composé test de provoquer une inflammation réversible des tissus vivants par action chimique au site de contact.
Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, la présente invention se rapporte à une méthode d'évaluation du potentiel sensibilisant d'un composé test, comprenant les étapes de:
a) mise en contact d'un composé test avec un échantillon biologique;
b) mesure de l'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : BDEFENSIN, C10, CCR2, CD160, CD207, CD83, CJUN, CLEC4D, CLEC7A, CMYC, COX2, CYCLINA1, CYCLINE1, CYP2E1, CYP7A1, EDA2R, EGR2, FCER1, Fcgrl, GATA-2, GATA-3, HISTR2, ICAM2, IEX1, IL12rb, IL-15, IL-19, IL-20, JUNK1, JUNK2, Krtl7, Krt6, LY9, LY96, LYN, MIP1A, MKP1, MKP3, MMP12, MYELOPEROXIDASE, NOTCH3, PPARA, St6gall, TECK, TLR13, Tpsabl , VEGF, ZAP70, CCL27, CLEC4A, DSC1, DSG2, EPHX1, GUSB, IL10RB, IL20RA, IL22R, , KEAP1, KRT10, KRT14, KRT18, LOR, S100A11, SERPINB3, STAT3, TIMP3 et VEGF. De préférence, l'étape b) de ladite méthode d'évaluation du potentiel sensibilisant comprend la mesure de l'expression d'au moins 2, d'au moins 3, d'au moins 4, d'au moins 5, d'au moins 6, d'au moins 7, et encore préférentiellement d'au moins 8 gènes choisis dans le groupe constitué par : BDEFENSIN, C10, CCR2, CD 160, CD207, CD83, CJUN, CLEC4D, CLEC7A, CMYC, COX2, CYCLINA1, CYCLINE1, CYP2E1, CYP7A1, EDA2R, EGR2, FCER1, Fcgrl, GATA-2, GATA- 3, HISTR2, ICAM2, IEX1, IL12rb, IL-15, IL-19, IL-20, JUNK1, JUNK2, Krtl7, Krt6, LY9, LY96, LYN, MIP1A, MKP1, MKP3, MMP12, MYELOPEROXIDASE, NOTCH3, PPARA, St6gall, TECK, TLR13, Tpsabl, VEGF, ZAP70, DSG2, EPHX1, GUSB, IL10RB, IL20RA, IL22R, KEAP1, KRT10, KRT14, KRT18, LOR, S100A11, SERPINB3, STAT3, TIMP3 et VEGF.
De préférence, la méthode selon la présente invention permet d'évaluer si le composé test est susceptible de provoquer une allergie de contact ou dermatite atopique.
De préférence, la méthode selon la présente invention comprend en outre une étape de comparaison du niveau d'expression dudit gène avec une valeur de référence. Cette valeur de référence peut servir de contrôle positif et/ou négatif. Un contrôle positif peut par exemple être effectué en comparant le niveau d'expression dudit au moins un gène en présence du composé test avec le niveau d'expression dudit au moins un gène en présence d'un composé connu comme sensibilisant et/ou irritant. Par exemple, si le niveau d'expression dudit au moins un gène en présence du composé test est supérieur ou égal au niveau d'expression dudit au moins un gène en présence d'un composé connu comme sensibilisant et/ou irritant, on pourra en conclure au potentiel sensibilisant et/ou irritant dudit composé. A titre d'exemple de composé connu comme sensibilisant, on peut citer l'acide 2,4,6- trinitrobenzene sulfonique, la p-phénylenediamine, le dinitrochlorobenzène, le benzaldehyde, le résorcinol, le disulfure de tétraméthyl thiurame, l'oxazolone, le chloroAtranol, le diphenylcyclopropénone le potassium dichromate, l'aldéhyde cinnamique, le 2-Bromo-2-(bromomethyl)glutaronitrile, le glyoxal, la saccharine, le formaldehyde, l'anhydride trimellitique, le méthylchloroisothiazolinone, le benzoate de benzyl, Γ alpha- hexyl cinnamaldehyde, l'eugenol, le 2- mercaptobenzothiazole, l'soeugenol, la diphénylcyclopropénone (DPCP), le lauryl gallate (LG), la 3-3-dimethylaminopropylamine (3-DMAPA), l'aldéhyde cinnamique (CA), le citral (Cal), la 1 ,4-hydroquinone (HQ), le glutaraldéhyde (GA), la 1,2- benzisothiazolin-3-one (Ben), la phénylacetaldéhyde (PA) et le lilial (Li), préferentiellement parmi la diphénylcyclopropénone, le lauryl gallate, la 1,4- hydroquinone et le glutaraldéhyde, et de manière particulièrement préférée la 1 ,4- hydroquinone.
Alternativement, dans le cadre de la présente invention, on peut utiliser une composition sensibilisante, comme le « fragrance mix ».
A titre d'exemple de composé connu comme irritant, on peut citer le LaurylSulfate de Sodium (SLS), l'acide octanoïque, le cholobenzene, l'acide lactique, le bromo- butane, le méthyl salicylate et le butanol. Un contrôle négatif peut être réalisé en l'absence du composé test ou en présence d'un composé connu comme non sensibilisant et non irritant comme par exemple l'huile d'olive, l'huile d'olive ou du glycérol, le cétyl trimethylammonium bromide (CTAB) et le dipropylène glycol. Dans le cadre de la présente invention, on pourra conclure qu'un composé test présente un potentiel sensibilisant et/ou irritant de préférence un potentiel sensibilisant et irritant, si une surexpression dudit gène est observée par rapport à son niveau d'expression en l'absence dudit composé test. On entend par « surexpression », un niveau d'expression signifïcativement plus élevé dudit gène par rapport à son niveau d'expression normal. De préférence, on entend par surexpression un niveau d'expression dans un échantillon biologique qui est supérieur à au moins 20% du niveau normal d'expression dudit gène, de préférence supérieur à au moins 50%> du niveau normal d'expression dudit gène, et de manière particulièrement préférée supérieur à au moins 90% au niveau normal d'expression dudit gène.
Le « niveau d'expression en l'absence dudit composé test » ou « niveau normal » est le niveau d'expression dudit gène dans un échantillon contrôle correspondant potentiellement à l'échantillon biologique d'un patient ne présentant pas de réaction de sensibilisation et/ou d'irritation ou, de préférence, à la moyenne du niveau d'expression dudit gène dans différents échantillons contrôle.
De préférence, l'étape b) est réalisé entre 2 et 24 heures après l'étape a), de manière encore préférée entre 4 et 18 heures après l'étape a), de manière particulièrement préférée entre 5 et 7 heures après l'étape a) et de manière préférée entre toute 6 heures après l'étape a).
Selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à l'utilisation d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, CoBal, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, FAS, FOSB, FYB, G-CSF R, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL- 1 IRA, IL- 16, IL-17R, ILIRa, IL1RAP, IL-24, IP10, ITAK, ITGAM, ITGB6, JAK 3, JUNB, KC, Krtl3, LAMA1, LAMA3A, LAMC2, LARC, LIX, LPTN, LRP1, LSST, LTA, LTBR, MARCKS, MCP1, MCP2, MCP3, MCP5, Mcpt6, M-CSF, MIG, MIP1G, MMP2, MMP9, MR1, MYD88, MyhlO, NCAM, NFKB P105, ONCM, OSMR, Procr, RANTES, RGSl, RGS14, RGSl 6, RGS3, RIPK1, Sele, SELP, SLP76, SMAD6, SOCS-2, SOCS-3, STAT2, TANK, TARC, TECK, Thbd, TIRAP, TLR2, TNFRP75, TRAF1, TRAF3, VAV1, VEGFR, VEGI, BDEFENSIN, C10, CCR2, CD 160, CD207, CD83, CJUN, CLEC4D, CLEC7A, CMYC, COX2, CYCLINA1, CYCLINE1, CYP2E1, CYP7A1, EDA2R, EGR2, FCER1, Fcgrl, GATA-2, GATA-3, HISTR2, ICAM2, IEX1, IL12rb, IL-15, IL-19, IL-20, JUNK1, JUNK2, Krtl7, Krt6, LY9, LY96, LYN, MIP1A, MKP1, MKP3, MMP12, NOTCH3, PPARA, St6gall, TECK, TLR13, Tpsabl, VEGF, ZAP70, CCL2, CCL20, CCL22, CD207, CDH3, DEFB1, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCP1, MMP9, NRF2, PDZK1IP1, S100A4, S100A7, S100A9, STAT1, TPSAB1, TYR, VIM, CCL27, CLEC4A, DSC1, DSG2, EPHX1, GUSB, IL10RB, IL20RA, IL22R, KEAP1, KRT10, KRT14, KRT18, LOR, S100A11, SERPINB3, STAT3, TIMP3, et VEGF, pour l'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant et/ou irritant d'un composé test.
De préférence, selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à l'utilisation d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, Col3al, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, FAS, FOSB, FYB, G-CSF R, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL- 1 IRA, IL- 16, IL-17R, ILIRa, IL1RAP, IL-24, IP10, ITAK, ITGAM, ITGB6, JAK 3, JUNB, KC, Krtl3, LAMA1, LAMA3A, LAMC2, LARC, LIX, LPTN, LRP1, LSST, LTA, LTBR, MARCKS, MCP1, MCP2, MCP3, MCP5, Mcpt6, M-CSF, MIG, MIP1G, MMP2, MMP9, MR1, MYD88, MyhlO, NCAM, NFKB P105, ONCM, OSMR, Procr, RANTES, RGSl, RGS14, RGSl 6, RGS3, RIPK1, Sele, SELP, SLP76, SMAD6, SOCS-2, SOCS-3, STAT2, TANK, TARC, TECK, Thbd, TIRAP, TLR2, TNFRP75, TRAF1, TRAF3, VAV1, VEGFR, VEGI, CCL2, CCL20, CCL22, CD207, CDH3, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCP1, MMP9, NRF2, PDZK1IP1, S100A4, S100A7, S100A9, STAT1, TPSAB1, TYR et VIM pour l'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant et irritant d'un composé test.
La présente invention se rapporte également à une trousse pour la mise en œuvre de la méthode selon la présente invention, comprenant des moyens de détection du niveau d'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, CoBal, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, FAS, FOSB, FYB, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL-11RA, IL-16, IL-17R, ILIRa, IL1RAP, IL-24, IP10, ITAK, ITGAM, ITGB6, JAK 3, JUNB, KC, Krtl3, LAMA1, LAMA3A, LAMC2, LARC, LIX, LPTN, LRP1, LSST, LTA, LTBR, MARCKS, MCP1, MCP2, MCP3, MCP5, Mcpt6, M-CSF, MIG, MIP1G, MMP2, MMP9, MR1, MYD88, MyhlO, NCAM, NFKB P105, ONCM, OSMR, Procr, RANTES, RGS1, RGS14, RGS16, RGS3, RIPK1, Sele, SELP, SLP76, SMAD6, SOCS-2, SOCS-3, STAT2, TANK, TARC, TECK, TIRAP, TLR2, TNFRP75, TRAF1, TRAF3, VAV1, VEGFR, VEGI, CCL2, CCL20, CCL22, CD207, CDH3, CDSN, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCP1, MMP9, NRF2, PDZK1IP1, S100A4, S100A7, S100A9, STAT 1 , TPS AB 1 , TYR et VIM.
De préférence, ladite trousse comprendra au moins une paire d'amorces permettant l'amplification d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, CoBal, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, FAS, FOSB, FYB, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL-11RA, IL-16, IL-17R, ILIRa, IL1RAP, IL-24, IP10, ITAK, ITGAM, ITGB6, JAK 3, JUNB, KC, Krtl3, LAMA1, LAMA3A, LAMC2, LARC, LIX, LPTN, LRP1, LSST, LTA, LTBR, MARCKS, MCP1, MCP2, MCP3, MCP5, Mcpt6, M-CSF, MIG, MIP1G, MMP2, MMP9, MR1, MYD88, MyhlO, NCAM, NFKB P105, ONCM, OSMR, Procr, RANTES, RGS1, RGS14, RGS16, RGS3, RIPK1, Sele, SELP, SLP76, SMAD6, SOCS-2, SOCS-3, STAT2, TANK, TARC, TECK, TIRAP, TLR2, TNFRP75, TRAF1, TRAF3, VAV1, VEGFR, VEGI, C10, CCR2, CD160, CD207, CD83, CJUN, CLEC4D, CLEC7A, CMYC, COX2, CYCLINA1, CYCLINE1, CYP2E1, CYP7A1, EDA2R, EGR2, FCER1, Fcgrl, FTHIP, GATA-2, GATA-3, HISTR2, ICAM2, IEX1, IL12rb, IL-15, IL-19, IL-20, JUNK1, JUNK2, Krtl7, Krt6, LY9, LY96, LYN, MIP1A, MKP1, MKP3, MMP12, MYELOPEROXIDASE, NOTCH3, PPARA, St6gall, TECK, TLR13, Tpsabl, VEGF, ZAP70, CCL2, CCL20, CCL22, CD207, CDH3, CDSN, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCP1, MMP9, NRF2, PDZK1IP1, S100A4, S100A7, S100A9, STAT1, TPSAB1, TYR, VIM, CCL27, CLEC4A, DSC1, DSG2, EPHX1, GUSB, IL10RB, IL20RA, IL22R, KEAP1, KRT10, KRT14, KRT18, LOR, S100A11, SERPINB3, STAT3, TIMP3 et VEGF.
De préférence, ladite trousse comprendra au moins une paire d'amorces permettant l'amplification d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, CoBal, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, FAS, FOSB, FYB, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL-11RA, IL-16, IL-17R, ILIRa, IL1RAP, IL-24, IP10, ITAK, ITGAM, ITGB6, JAK 3, JUNB, KC, Krtl3, LAMA1, LAMA3A, LAMC2, LARC, LIX, LPTN, LRP1, LSST, LTA, LTBR, MARCKS, MCP1, MCP2, MCP3, MCP5, Mcpt6, M-CSF, MIG, MIP1G, MMP2, MMP9, MR1, MYD88, MyhlO, NCAM, NFKB P105, ONCM, OSMR, Procr, RANTES, RGS1, RGS14, RGS16, RGS3, RIPK1, Sele, SELP, SLP76, SMAD6, SOCS-2, SOCS-3, STAT2, TANK, TARC, TECK, TIRAP, TLR2, TNFRP75, TRAF1, TRAF3, VAV1, VEGFR, VEGI, CCL2, CCL20, CCL22, CD207, CDH3, CDSN, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCP1, MMP9, NRF2, PDZK1IP1, S100A4, S100A7, S100A9, STAT1, TPSAB1, TYR et VIM.
Exemples
1) Protocole LLNA
Animaux
Des souris CBA/J provenant des distributeurs européens ont été utilisées. L'âge des animaux était compris entre 7 et 12 semaines. Les animaux ont été maintenus dans des conditions standard et ont eu un accès libre à la nourriture et l'eau. 2 animaux par groupe ont été utilisés.
Traitement
La face dorsale de chaque oreille a été traitée avec 25 μΐ/oreille de la solution test. Le diluant utilisé était l'Acetone/Huile d'olive (50/50 v/v) ou DMF. Les substances testées sont alpha hexyl cinnamaldehyde (HCA) 25%, Isoeugenol, 50%, Lauryl sulfate (SLS) 50%, Hydroxy citronelal (OHC), 50%; PPD 0,1%, acide octanoique 25%. Une biopsie de l'oreille a été récupérée après 6h, 12h ou 24h de traitement avec un punch de 8mm et le feuillet externe a été retiré avec des pinces et immédiatement congelé dans l'azote liquide.
Résultats
Les résultats des tableaux 1 et 2 sont exprimés en taux d'augmentation par rapport au témoin négatif. La moyenne des taux d'expression au 3 temps de la cinétique (3h, 6h et 24h après application de la substance) a été calculée. Le tableau 1 présente la liste des gènes qui sont induits à la fois par les substances sensibilisantes et irritantes et le tableau 2 celui des gènes spécifiquement induits par les substances sensibilisantes. L'expression de ces gènes n'est pas augmentée en réponse au véhicule qui a servi de contrôle.
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Tableau 1 : Biomarqueurs spécifiques de la sensibilisation et de l'irritation dans le modèle LLNA
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Tableau 2 : Biomarqueurs spécifiques de la sensibilisation dans le modèle LLNA
2) Protocole clinique
Une étude mono-centrique avec comparaisons intra-individuelles, a été réalisée en double aveugle, randomisée et contrôlée avec un témoin non traité.
Afin d'éviter le recours à un trop grand nombre de patients, il apparaissait inutile d'introduire des groupes excipients ou patch seul puisque l'objectif de l'étude est la comparaison entre les types de réactions inflammatoires, irritation versus sensibilisation, et n'est pas une étude d'activité d'un produit par rapport à un autre.
Produits inducteurs
Suite à la directive 2003/15/CE, depuis le 11 mars 2005, 26 substances, ayant entre autres des propriétés parfumantes ou aromatiques, ont été identifiées comme étant potentiellement sensibilisantes et doivent figurer en clair dans la liste des ingrédients, quelle que soit leur fonction, dès que leur concentration dépasse 0,001% dans les produits non rincés (crèmes, etc..) et 0,01% dans les produits rincés (shampooings, etc.).
Parmi ces 26 substances figurent les 8 qui font partie de «Fragrance Mix », le produit que les médecins utilisent sous forme de patch pour savoir si un sujet est allergique au "parfum" de manière générale. Entre 1 et 2% de la population générale serait allergique à ce mélange.
La composition exacte du Fragrance Mix standard (8%) est la suivante:
* 1% Amyl Cinnamal (Aldéhyde Alpha Amyl Cinnamylique)
* 1% Cinnamyl Alcohol (Alcool Cinnamylique)
* 1% Cinnamal (Aldéhyde Cinnamique)
* 1% Eugénol
* 1% Geraniol
* 1% Hydroxycitronellal
* P/o Isoeugénol
* 1% Mousse de Chêne (Evernia Prunastri en INCI, Oak Moss en anglais) * 5% Sorbitan Sesquioleate (émulsifïant)
Les produits inducteurs qui ont été utilisés dans cette étude clinique sont donc le fragrance mix (8%), le Nickel sous forme sulfate et le Lauryl Sulfate de Sodium (LSS).
Choix des temps de cinétique
Dans cette étude, les étapes ciblées des réactions cutanées étudiées sont celles qui se déroulent dans la peau, plus particulièrement dans l'épidémie, au cours des premières phases du processus. Supposées moins complexe que les étapes tardives impliquant un plus grand nombre de types cellulaires, elles devraient permettre une meilleure discrimination entre les différents types de réponses. L'analyse portera donc en premier lieu sur les premières 12 h suivant l'application du produit et sur les phénomènes se déroulant dans la peau et plus particulièrement dans l'épiderme.
Mode de traitement
Les sujets inclus appartenaient à deux groupes : allergiques au nickel et allergiques au fragrance mix.
Les deux groupes d'application sont les suivants :
- Groupe 1 : 12 sujets avec 3 double patchs au nickel sur un avant-bras et 2 double patchs avec l'irritant et une zone non traitée sur l'autre avant-bras (Allergiques au nickel).
- Groupe 2 : 12 sujets avec 3 double patchs au fragrance mix sur un avant- bras et 2 double patchs avec l'irritant et une zone non traitée sur l'autre avant-bras
(Allergiques au fragrance mix).
La zone non traitée a remplacé un temps d'application de l'irritant, ce qui a été inclus dans le schéma de randomisation attribué à chaque sujet. La zone non traitée a été randomisée avec les temps d'application de l'irritant sur l'avant-bras correspondant à l'irritant.
Chaque avant-bras est divisé en trois zones qui correspondent aux différents temps d'application pour un produit inducteur. Deux prélèvements ont été réalisés par zone.
Technique de prélèvement
Dans cette étude, la méthode de prélèvement par bulle de succion (Kiistala, 1968) a été utilisée pour obtenir des prélèvements épidermiques aussi purs que possible. La mise à disposition de prélèvements épidermiques non contaminés par des éléments dermiques est indispensable pour permettre une interprétation pertinente des résultats des analyses génomiques.
Analyse des biomarqueurs chez l'homme.
Le but de l'étude était d'une part de mettre en évidence des biomarqueurs permettant de distinguer les substances sensibilisantes et/ou irritantes mais aussi de définir le « tissu minimal » pouvant être utilisé en culture in vitro capable d'exprimer suffisamment des gènes sélectionnés pour permettre l'analyse et la classification de ces substances dans un modèle in vitro.
Pour analyser la composition du « tissu minimal », une analyse du transcriptome après application de substances irritantes et/ou sensibilisantes non pas sur des biopsies totales de peau mais sur des biopsies bulles de succion qui ne comprennent que l'épidémie a été réalisée chez l'homme.
Pour cette étude, le test a été réalisé sur des patients sensibilisés soit au Nickel soit au « fragrance mix », un mélange d'ingrédients de parfum utilisé pour analyser une sensibilisation.
Le tableau 3 montre l'ensemble des gènes surexprimés à la fois par les sensibilisants Nickel et « Fragrance Mix » et l'irritant SLS chez l'homme.
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Tableau 3 : Biomarqueurs spécifiques de la sensibilisation et de l'irritation chez l'homme
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Table 4 : gènes spécifiquement induit par les sensibilisants chez l'homme
On note qu'il est là aussi possible de définir des gènes spécifiquement exprimés par les molécules irritantes et sensibilisantes. La plupart de ces gènes sont communs avec ceux trouvés chez la souris comme C2TA, CCL2, CCL20, CCL22, CD14, CD83, FASCIN, IL10RA, IL2RG, IL4R, KRT17, MMP9, S100A8, STAT1. Les autres gènes trouvés n'avaient pas été testés, ou n'ont pas d'équivalent (comme IL-8) chez la souris.

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode d'évaluation du potentiel sensibilisant et irritant d'un composé test, comprenant les étapes de:
a) mise en contact d'un composé test avec un échantillon biologique;
b) mesure de l'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, Col3al, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, FAS, FOSB, FYB, G-CSF R, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL-11RA, IL-16, IL-17R, ILIRa, IL1RAP, IL-24, IP10, ITAK, ITGAM, ITGB6, JAK 3, JUNB, KC, Krtl3, LAMA1, LAMA3A, LAMC2, LARC, LIX, LPTN, LRP1, LSST, LTA, LTBR, MARCKS, MCP1, MCP2, MCP3, MCP5, Mcpt6, M- CSF, MIG, MIP1G, MMP2, MMP9, MR1, MYD88, MyhlO, NCAM, NFKB P105, ONCM, OSMR, Procr, RANTES, RGS1, RGS14, RGS16, RGS3, RIPK1, Sele, SELP, SLP76, SMAD6, SOCS-2, SOCS-3, STAT2, TANK, TARC, TECK, Thbd, TIRAP, TLR2, TNFRP75, TRAF1, TRAF3, VAV1, VEGFR, VEGI, CCL2, CCL20, CCL22, CD207, CDH3, CDSN, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCP1, MMP9, NRF2, PDZK1IP1, S100A4, S100A7, S100A9, STAT1, TPSAB1, TYR et VIM.
2. Méthode d'évaluation selon la revendication 1, comprenant en outre une étape de comparaison du niveau d'expression dudit au moins un gène avec une valeur de référence.
3. Méthode d'évaluation selon l'une des revendications 1 ou 2, dans laquelle le niveau d'expression dudit au moins un gène est évalué par mesure de l'expression du polypeptide codé par ledit gène ou un fragment de celui-ci, ou par mesure du niveau d'expression de l'ARNm dudit au moins un gène ou d'un fragment de celui-ci.
4. Méthode d'évaluation selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant une étape supplémentaire d'amplification de l'ARNm ou de l'ADNc dudit au moins un gène, de la séquence complémentaire de celle-ci ou d'un fragment de celle-ci.
5. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'étape b) comprend la mesure de l'expression d'au moins 2, d'au moins 3, d'au moins 4, d'au moins 5, d'au moins 6, d'au moins 7, d'au moins 8, d'au moins 9, d'au moins 10, d'au moins 11, d'au moins 12, d'au moins 13, d'au moins 14, d'au moins 15, d'au moins 16, d'au moins 17, et encore préférentiellement d'au moins 18 gènes choisis dans le groupe constitué par : 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, Col3al, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, FAS, FOSB, FYB, G-CSF R, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL-11RA, IL-16, IL-17R, ILIRa, IL1RAP, IL-24, IP10, ITAK, ITGAM, ITGB6, JAK 3, JUNB, KC, Krtl3, LAMA1, LAMA3A, LAMC2, LARC, LIX, LPTN, LRP1, LSST, LTA, LTBR, MARCKS, MCP1, MCP2, MCP3, MCP5, Mcpt6, M-CSF, MIG, MIP1G, MMP2, MMP9, MR1, MYD88, MyhlO, NCAM, NFKB P105, ONCM, OSMR, Procr, RANTES, RGS1, RGS14, RGS16, RGS3, RIPK1, Sele, SELP, SLP76, SMAD6, SOCS-2, SOCS-3, STAT2, TANK, TARC, TECK, Thbd, TIRAP, TLR2, TNFRP75, TRAF1, TRAF3, VAV1, VEGFR, VEGI, CCL2, CCL20, CCL22, CDH3, CDSN, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCP1, MMP9, NRF2, PDZKllPl, S100A4, S100A7, S100A9, STATl, TPSABl, TYR et VIM.
6. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, permettant d'évaluer le potentiel sensibilisant et irritant d'un composé test chez l'homme, comprenant une étape b) de mesure de l'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par CCL2, CCL20, CCL22, CD207, CDH3, CDSN, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCP1, MMP9, NRF2, PDZK1IP1, S100A4, S100A7, S100A9, STAT1, TPSAB1, TYR et VIM.
7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, permettant d'évaluer le potentiel sensibilisant et irritant d'un composé test chez la souris, comprenant une étape b) de mesure de l'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD 122, CD 124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, Col3al, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, FAS, FOSB, FYB, G-CSF R, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL-11RA, IL-16, IL-17R, ILIRa, IL1RAP, IL-24, IP10, ITAK, ITGAM, ITGB6, JAK 3, JUNB, KC, Krtl3, LAMA1, LAMA3A, LAMC2, LARC, LIX, LPTN, LRP1, LSST, LTA, LTBR, MARCKS, MCP1, MCP2, MCP3, MCP5, Mcpt6, M-CSF, MIG, MIP1G, MMP2, MMP9, MYD88, MyhlO, NCAM, NFKB P105, ONCM, OSMR, Procr, RANTES, RGS1, RGS14, RGS16, RGS3, RIPK1, Sele, SELP, SLP76, SMAD6, SOCS-2, SOCS-3, STAT2, TANK, TARC, TECK, Thbd, TIRAP, TLR2, TNFRP75, TRAF1, TRAF3, VAV1, VEGFR et VEGI.
8. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'étape b) est réalisée entre 2 et 24 heures après l'étape a), de manière encore préférée entre 4 et 18 heures après l'étape a), de manière particulièrement préférée entre 5 et 7 heures après l'étape a) et de manière préférée entre toute 6 heures après l'étape a).
9. Utilisation d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, CoBal, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, FAS, FOSB, FYB, G-CSF R, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL-11RA, IL-16, IL-17R, ILIRa, IL1RAP, IL-24, IP10, ITAK, ITGAM, ITGB6, JAK 3, JUNB, KC, Krtl3, LAMA1, LAMA3A, LAMC2, LARC, LIX, LPTN, LRP1, LSST, LTA, LTBR, MARCKS, MCP1, MCP2, MCP3, MCP5, Mcpt6, M-CSF, MIG, MIP1G, MMP2, MMP9, MR1, MYD88, MyhlO, NCAM, NFKB P105, ONCM, OSMR, Procr, RANTES, RGS1, RGS14, RGS16, RGS3, RIPK1, Sele, SELP, SLP76, SMAD6, SOCS-2, SOCS-3, STAT2, TANK, TARC, TECK, Thbd, TIRAP, TLR2, TNFRP75, TRAF1, TRAF3, VAV1, VEGFR, VEGI, CCL2, CCL20, CCL22, CD207, CDH3, CDSN, DEFB1, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCP1, MMP9, NRF2, PDZK1IP1, S100A4, S100A7, S100A9, STAT1, TPSAB1, TYR et VIM pour l'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant et irritant d'un composé test.
10. Trousse pour la mise en œuvre d'une méthode d'évaluation in vitro du potentiel sensibilisant et irritant selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant des moyens de détermination du niveau d'expression d'au moins un gène choisi dans le groupe constitué par : 41BB, ABCA6, Adam 8, ADAM 17, APC, ATM, B7DC, BCL3, BLC, BTK, CAECAM, CASP1, CASP12, CCR1, CCR5, CCR7, CD122, CD124, CD163, CD209, CD23, CD244, CD24A, CD25, CD34, CD44, CHEK1, CLEC4E, CMYB, Colla, CoBal, CTGF, CXCR5, CYCLINE1, DR5, DR6, ELC, EMBP, ENG, EOT, EOT2, FAK, FAS, FOSB, FYB, GITRL, GM-CSF R, HSP60, HSP70, HYALURONIDASE, 1309, ICOS, ID1, ID3, IGSF3, IL-10RA, IL-11RA, IL-16, IL-17R, ILIRa, IL1RAP, IL-24, IP10, ITAK, ITGAM, ITGB6, JAK 3, JUNB, KC, Krtl3, LAMA1, LAMA3A, LAMC2, LARC, LIX, LPTN, LRP1, LSST, LTA, LTBR, MARCKS, MCPl, MCP2, MCP3, MCP5, Mcpt6, M-CSF, MIG, MIP1G, MMP2, MMP9, MRl, MYD88, MyhlO, NCAM, NFKB P105, ONCM, OSMR, Procr, RANTES, RGSl, RGS14, RGSl 6, RGS3, RIPKl, Sele, SELP, SLP76, SMAD6, SOCS-2, SOCS-3, STAT2, TANK, TARC, TECK, TIRAP, TLR2, TNFRP75, TRAF1, TRAF3, VAV1, VEGFR, VEGI, CCL2, CCL20, CCL22, CD207, CDH3, CDSN, DEFBl, FASCIN, IL2RG, IL4R, KRT17, KRT2, LCPl, MMP9, NRF2, PDZK1IP1, S100A4, S100A7, S100A9, STAT1, TPSAB1, TYR et VIM.
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