WO2012023569A1 - Ｒｎａ抽出用溶液 - Google Patents

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WO2012023569A1
WO2012023569A1 PCT/JP2011/068620 JP2011068620W WO2012023569A1 WO 2012023569 A1 WO2012023569 A1 WO 2012023569A1 JP 2011068620 W JP2011068620 W JP 2011068620W WO 2012023569 A1 WO2012023569 A1 WO 2012023569A1
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rna
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biological sample
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PCT/JP2011/068620
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真紀子 吉本
英雄 秋山
信正　均
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Toray Industries Inc
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Toray Industries Inc
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01C—AMMONIA; CYANOGEN; COMPOUNDS THEREOF
    • C01C3/00—Cyanogen; Compounds thereof
    • C01C3/20—Thiocyanic acid; Salts thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C39/00—Compounds having at least one hydroxy or O-metal group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C39/02—Compounds having at least one hydroxy or O-metal group bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring monocyclic with no unsaturation outside the aromatic ring
    • C07C39/04—Phenol
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N2001/2866—Grinding or homogeneising

Definitions

  • the present invention relates to a solution for extracting substantially pure RNA from a biological sample.
  • RNA contributes to the phenotype of an organism with the kind and expression level, and for gene expression analysis, it is important to extract RNA with high purity from various biological materials.
  • RNA extraction methods include phenol extraction, precipitation from chaotropic salt solutions, and adsorption onto silica membranes.
  • Patent Document 1 discloses a solution containing 2 to 5 M guanidine and 40 to 60% phenol for the purpose of RNA extraction. By using this solution, RNA extraction can now be efficiently performed in 3 hours using an ultracentrifuge before 2 days or more. This method is called a single step method.
  • Patent Document 2 discloses an extraction solution for simultaneously extracting and separating each of these components from a sample containing RNA, DNA, and protein as a further improvement of the method described in Patent Document 1 above. It is disclosed. Specifically, it describes that RNA is extracted and separated into an aqueous layer using a phenol solution containing 0.5 to 2 M guanidine and having a concentration of 30 to 50%.
  • RNA can be extracted by the same operation using each solution. That is, the biological tissue is homogenized with each solution, and the homogenate is centrifuged and separated into layers using a hydrophobic organic solvent such as chloroform. After centrifugation, the uppermost aqueous layer containing RNA is recovered, RNA is precipitated using alcohol, and RNA can be extracted by washing.
  • a hydrophobic organic solvent such as chloroform
  • RNA isolated using the solutions and methods described in Patent Documents 1 and 2 is still contaminated with an amount of genomic DNA that can be detected by reverse transcription-polymerase chain reaction assay (RT-PCR) (
  • RT-PCR reverse transcription-polymerase chain reaction assay
  • RNA isolated by these methods must be further purified to remove contaminating DNA.
  • RNA sample One common method for removing DNA contaminated as impurities in the extracted RNA sample is to treat the RNA sample with deoxyribonuclease (DNase).
  • DNase deoxyribonuclease
  • phenol / chloroform extraction or protein denaturation must be performed again to remove DNase after treatment.
  • extracting in combination with a silica membrane column it is necessary to repeat the column washing operation.
  • DNA contamination is reduced by this DNase treatment, there is a problem in that these efforts are increased, and further RNA loss occurs, resulting in a decrease in the amount of RNA extracted.
  • Patent Document 3 reports a method of using an RNA extraction reagent at a pH of less than 4 as a method for avoiding DNA contamination in an RNA sample without performing DNase treatment.
  • nucleic acids are depurinated and degraded under acidic conditions, and it is difficult to isolate RNA that has not been substantially degraded.
  • the dissolution equilibrium of DNA in the aqueous / organic layer under acidic conditions is biased so that it is distributed to the organic layer.
  • the conventional solution for extracting RNA from a biological sample could not extract substantially pure RNA not contaminated with DNA when quantification is required. There was a problem.
  • an additional step such as DNase treatment was required.
  • the present invention is intended to solve these problems and provides a solution for extracting substantially pure RNA from a biological sample.
  • the inventors of the present invention have now studied the composition of a conventional RNA extraction solution, and found that the phenol concentration is particularly related to the effect of preventing DNA contamination, thereby completing the present invention.
  • a solution for extracting RNA from a biological sample containing RNA and at least DNA (A) 50% by volume of phenol over the total amount of solution, (B) 3 to 10% by volume of a polyhydric alcohol based on the total amount of the solution, (C) a guanidinium salt having a concentration of 0.5 to 2.0 M based on the total amount of the solution; (D) a thiocyanate having a concentration of 0.1 to 0.5 M based on the total amount of the solution, and (e) a buffer for maintaining the pH of the solution at 4 to 6, Containing solution.
  • a biological sample containing RNA and at least DNA (A) 50% by volume of phenol over the total amount of solution, (B) 3 to 10% by volume of a polyhydric alcohol based on the total amount of the solution, (C) a guanidinium salt having a concentration of 0.5 to 2.0 M based on the total amount of the solution; (D) 0.1 to 0.5 M thiocyanate with respect to the total amount of the solution, and (e) a buffering agent for maintaining the pH of the solution at 4 to 6, Homogenizing with a solution containing Mixing the obtained homogenate with an organic solvent for separating the aqueous layer; Centrifuging the resulting mixture; A step of recovering the RNA-containing aqueous layer produced by centrifugation; A method for extracting RNA from the biological sample.
  • a biological sample containing RNA and at least DNA (A) 50% by volume of phenol over the total amount of solution, (B) 3 to 10% by volume of a polyhydric alcohol based on the total amount of the solution, (C) a guanidinium salt having a concentration of 0.5 to 2.0 M based on the total amount of the solution; (D) 0.1 to 0.5 M thiocyanate with respect to the total amount of the solution, and (e) a buffering agent for maintaining the pH of the solution at 4 to 6, (F) an organic solvent for separating the aqueous layer, Homogenizing with a solution containing Centrifuging the resulting homogenate; A step of recovering the RNA-containing aqueous layer produced by centrifugation; A method for extracting RNA from the biological sample.
  • RNA having such a purity that it can be used as it is even in applications requiring quantitativeness without requiring additional treatment such as DNase treatment that may cause recovery loss.
  • RNA of interest with high purity even in body fluids such as blood that contain a large amount of RNase and other contaminants among biological samples.
  • FIG. 1 is an electrophoretogram of nucleic acid extracted from serum using the solution of the present invention in Example 1.
  • FIG. 2 is an electrophoretogram of nucleic acid extracted from serum using the solution described in Patent Document 2 in Comparative Example 1.
  • FIG. 3 is an electrophoretogram of nucleic acid extracted from serum using the solution described in Patent Document 1 in Comparative Example 2.
  • FIG. 4 is an electrophoretogram of nucleic acids extracted from serum using the solutions of the present invention in Examples 2-5.
  • FIG. 5 is an electrophoretogram of nucleic acids extracted from serum using the solutions of the present invention in Examples 6-12.
  • FIG. 6 is an electrophoresis diagram of nucleic acids extracted from serum using the solution of the present invention and the solution described in Patent Document 3 in Example 13 and Comparative Example 3.
  • FIG. 7 is an electrophoretogram of nucleic acids extracted from cultured cells using the solution of the present invention in Example 14.
  • FIG. 8 is an electrophoretogram of nucleic acids extracted from serum using the solutions of the present invention in Examples 15 and 16.
  • FIG. 9 is an electrophoretogram of nucleic acids extracted from serum using the solution described in Patent Document 3 in Comparative Example 4.
  • FIG. 10 is an electrophoresis diagram of nucleic acids extracted from serum using the solutions of the present invention in Examples 17 and 18.
  • the present invention is a solution for extracting RNA from a biological sample, and includes the following (a) to (e) as its components.
  • D a thiocyanate having a concentration of 0.1 to 0.5 M (0.1 M or more and 0.5 M or less) with respect to the total amount of the solution, and
  • the biological sample used in the present invention contains RNA and at least DNA.
  • substantially pure RNA can be extracted from the biological sample by using the solution of the present invention.
  • substantially pure RNA means RNA that is originally free from contamination after the DNA originally contained in the biological sample is separated. Whether or not RNA is substantially pure can be determined by whether or not DNA is detected by electrophoresis.
  • “Agilent RNA 6000 pico kit” (model number 5067-1513) manufactured by Agilent Technologies, Inc. can detect recommended 50 pg / ⁇ L to 5000 pg / ⁇ L of nucleic acid, and this is used to evaluate the presence or absence of DNA contamination. be able to.
  • RNA contamination is sufficiently suppressed when no peak is detected, so that it is substantially pure. It can be determined that RNA has been obtained.
  • RNA purity can be evaluated by analyzing the amount of mixed DNA by quantitative PCR. For example, when a real-time PCR apparatus and “SYBR Green” (fluorescent dye) are used, double-stranded DNA of 60 pg can be detected, which can be evaluated.
  • the extracted nucleic acid is added to a PCR reaction solution containing a primer, DNA synthase, and “SYBR Green”, PCR amplification is performed, and the amount of mixed DNA is quantified by comparing with a previously prepared calibration curve. Analysis.
  • the total amount of the solution means the total volume of the solution including all of the above (a) to (e).
  • 50% by volume of phenol with respect to the total amount of the solution means that more than 500 mL of phenol is contained in 1 L of the solution after mixing all the components.
  • a guanidinium salt having a concentration of 0.5 to 2.0M with respect to the total amount of the solution means that the final concentration of the solution is 0.5M or more and 2.0M or less, that is, after all the components are mixed. It means that 0.5 mol or more and 2 mol or less of guanidinium salt is contained in 1 L of the solution.
  • the solution of the present invention contains (a) phenol exceeding 50% by volume with respect to the total amount of the solution. It has been clarified that when the phenol concentration exceeds 50% by volume, which is different from the prior art, the contamination of DNA as an impurity is reduced in the aqueous layer from which RNA is extracted.
  • the solution of the present invention contains, for example, 51% by volume or more, 52% by volume or more, 53% by volume or more, 54% by volume or more, or 55% by volume or more phenol. Preferably, it contains 53% by volume or more of phenol, more preferably 55% by volume or more.
  • the concentration of phenol is (b) polyhydric alcohol, (c) 0.5 to 2.0 M guanidinium salt, (d) 0.1 to 0.5 M, which is another component of the solution of the present invention.
  • concentration of phenol is preferably 75% by volume or less, and in order to reduce the influence of oxidation of phenol, the concentration of phenol Is more preferably 65% by volume or less.
  • the range of the preferred phenol concentration is a range in which these upper and lower limits are arbitrarily combined, more preferably 52% by volume to 65% by volume, 53% by volume to 65% by volume, particularly preferably 55% by volume or more. 65% by volume or less.
  • the solution of the present invention contains (b) 3 to 10% by volume of polyhydric alcohol with respect to the total amount of the solution.
  • the polyhydric alcohol in the present invention is an aliphatic alcohol having a plurality of hydroxyl groups, and the phenol component (a) and the aqueous solution (c) or (d) in the solution of the present invention are mixed to form a uniform solution. What can be maintained can be used.
  • the polyhydric alcohol is preferably an aliphatic alcohol having 2 to 6 carbon atoms and 2 to 6 carbon atoms.
  • glycerol, ethylene glycol, propylene glycol, erythritol and the like can be mentioned, and glycerol is more preferable.
  • the polyhydric alcohol can be used in an amount of 3 to 10% by volume based on the total amount of the solution of the present invention so that the solution of the present invention is maintained as a uniform solution and the phenol component is not excessively distributed to the aqueous layer.
  • the solution of the present invention contains (c) a guanidinium salt having a concentration of 0.5 to 2.0 M with respect to the total amount of the solution.
  • the guanidinium salt is preferably guanidinium thiocyanate or guanidinium hydrochloride.
  • Guanidinium salts have the effect of protecting RNA from degradation and maintaining phenol in solution in aqueous solution.
  • the solution of the present invention contains (d) thiocyanate at a concentration of 0.1 to 0.5M with respect to the total amount of the solution.
  • thiocyanate an inorganic salt of thiocyanic acid can be preferably used, and ammonium thiocyanate and sodium thiocyanate can be more preferably used. Further, it may be a mixture of a plurality of different inorganic salts of thiocyanic acid. For example, a mixture of ammonium thiocyanate and sodium thiocyanate can be preferably used.
  • Thiocyanate is believed to enhance the extraction of RNA from biological samples.
  • the concentration of guanidinium thiocyanate is included in the concentration of guanidinium salt described above, but not in the concentration of thiocyanate.
  • the solution of the present invention includes (e) a buffering agent for maintaining the pH of the solution at 4-6.
  • a buffering agent for maintaining the pH of the solution at 4-6.
  • an organic salt or an inorganic salt having a buffering property which is usually used for maintaining the pH in a desired range can be used.
  • organic salts and inorganic salts of sodium, potassium, lithium or ammonium such as phosphate, acetate, citrate, phthalate, tartrate or lactate are included.
  • sodium acetate and sodium citrate are more preferably used.
  • the concentration of the buffering agent is not particularly limited as long as it is sufficient to maintain the solution of the present invention at the intended pH of 4 to 6, but a concentration of 0.02 to 0.2 M with respect to the total amount of the solution of the present invention. It is preferable that In order to adjust the pH of the solution of the present invention, an appropriate acid or alkaline aqueous solution such as hydrochloric acid or sodium hydroxide solution may be appropriately added in addition to the buffer.
  • the solution of the present invention may contain a surfactant such as polyoxyethylene sorbitan, sodium dodecyl sulfate, and sarcosine in order to denature proteins in biological samples and assist in purification of the target RNA.
  • a surfactant such as polyoxyethylene sorbitan, sodium dodecyl sulfate, and sarcosine in order to denature proteins in biological samples and assist in purification of the target RNA.
  • the solution of the present invention may contain an antioxidant such as hindered amine phenol and quinoline in order to prevent the oxidation of phenol.
  • the solution of the present invention can be used in an amount of 1 volume or more, preferably 3 volumes or more when extracting the target RNA.
  • a biological sample is homogenized in the solution of the present invention to form a homogenate.
  • the homogenization method is not particularly limited, but a general homogenizer can be used in addition to stirring by vortex or the like, crushing with an injection needle.
  • an organic solvent for separating the aqueous layer is added to the homogenate and then centrifuged.
  • the organic solvent added here is preferably about 2 to 40% by volume of the homogenate. Centrifugation can usually be performed at 6,000 x G to 20,000 x G for 3 minutes to 30 minutes, for example, at a speed of 12,000 x G for 10 minutes at room temperature. There is no particular limitation on time.
  • the desired substantially pure RNA is extracted into the aqueous layer.
  • DNA, protein, and the like are separated into an organic layer or, when an intermediate layer is formed, into an organic layer and an intermediate layer.
  • the organic solvent for separating the aqueous layer includes an aqueous layer containing the target RNA extracted using the solution of the present invention, an organic layer and / or an intermediate layer containing DNA, etc. It is a liquid organic compound used for separation.
  • this organic solvent those having the same degree of hydrophilicity as phenol or more hydrophobic can be used.
  • an organic compound having a water / octanol partition coefficient CLogP value generally used as an index indicating hydrophilicity of 1.4 (ClogP value of phenol) or more can be used, and the ClogP value is 1.4. Those in the range of 5 to 5 can be preferably used.
  • the CLogP value can be calculated by using a program such as “Chem Draw” (registered trademark), for example.
  • Examples of the organic solvent used in the present invention include chloroform (1.952), p-bromoanisole (3.064), 1-bromo-3-chloropropane (1.847), 4-bromoveratrol (2.7345).
  • the organic solvent for separating the aqueous layer can be formed by using the solution of the present invention containing (a) to (e) as described above and added to the homogenate. ) To (e) may be contained in advance in the solution of the present invention. In the case of a conventional solution with a phenol concentration of 50% or less, if this organic solvent is included in advance, the solution separates into two layers, an aqueous layer and an organic layer, before mixing with the biological sample. Although difficult, in the phenol concentration of the solution of the present invention, the organic solvent is uniformly mixed in the solution of the present invention and can be stored as a single solution.
  • the solution of the present invention containing the organic solvent in advance can be homogenized by adding a biological sample and then immediately centrifuged to separate the aqueous layer containing RNA. Therefore, it is preferable because the procedure can be greatly simplified as compared with the case where an organic solvent is added to the homogenate later.
  • the organic solvent for separating the aqueous layer is previously contained in the solution of the present invention containing the above (a) to (e), the content of the organic solvent is adjusted according to the kind of the organic solvent to be added and the phenol concentration of the solution.
  • the organic solvent can be selected within a range that is uniformly mixed in the solution of the present invention.
  • chloroform when chloroform is selected as the organic solvent when the phenol concentration of the solution of the present invention is 65%, an arbitrary amount up to 27% by volume with respect to 100% of the total amount of the solution containing the above (a) to (e) It is preferable to include Specifically, it is preferable to add an arbitrary volume of chloroform up to 27 mL to 100 mL of the solution containing the above (a) to (e). More preferably, it contains 5 to 25% by volume of chloroform, more preferably 10 to 20% by volume of chloroform with respect to 100% of the total amount of the solution containing the above (a) to (e).
  • the chloroform preferably contains any volume up to 14%, more preferably 6 to 13 volumes, with respect to 100% of the total amount of the solution containing the above (a) to (e). %, More preferably 8-12% by volume.
  • p-bromoanisole is selected as the organic solvent when the phenol concentration of the solution is 65%
  • an arbitrary amount up to 22% by volume can be added to 100% of the total amount of the solution containing the above (a) to (e).
  • it contains 5 to 20% by volume, more preferably 10 to 18% by volume.
  • p-bromoanisole when the phenol concentration is 58%, p-bromoanisole preferably contains an arbitrary volume up to 13% by volume with respect to 100% of the total amount of the solution containing the above (a) to (e). Preferably it contains 3 to 11% by volume, more preferably 5 to 9% by volume.
  • RNA can be precipitated by adding lower alcohol to the aqueous layer containing RNA, and the precipitated RNA can be recovered.
  • RNA precipitated by adding lower alcohol to an aqueous layer containing RNA may be adsorbed on a carrier capable of adsorbing RNA, such as a silica membrane column, and then eluted from the carrier (column) and recovered.
  • a carrier capable of adsorbing RNA such as a silica membrane column
  • the lower alcohol used here include ethanol and isopropanol.
  • the concentration can be determined in accordance with a general nucleic acid ethanol precipitation or isopropanol precipitation method or a manufacturer recommended concentration of a carrier such as a silica membrane column.
  • the solution of the present invention can be produced by mixing the above (a) to (e) so as to have respective concentrations.
  • the mixing procedure is not particularly limited.
  • high concentration solutions can be prepared in advance and then mixed.
  • a 6M guanidine thiocyanate aqueous solution, a 6M ammonium thiocyanate aqueous solution, and 1M sodium acetate are prepared in advance, mixed to the desired concentration, and further added with glycerol, phenol and insufficient water. it can.
  • the solution of the present invention in which the organic solvent for separating the aqueous layer is previously contained in the solution containing the above (a) to (e) has the desired concentration of (a) to (e) and the organic solvent. It can manufacture by mixing so that it may become.
  • the biological sample used in the present invention is not particularly limited as long as it contains RNA and at least DNA.
  • a protein may be included in addition to DNA.
  • Specific examples include cultured cells, culture fluids of cultured cells, living tissues such as surgical sections and biopsy samples, living cells, blood, blood components (serum, plasma), body fluids such as urine, saliva, and tears.
  • any sample containing RNA can be used.
  • the biological sample is a cell pellet or tissue piece
  • it may be mixed with the solution of the present invention as it is after collection, or may be diluted with PBS or water and then mixed with the solution of the present invention.
  • it is preferable to dilute with water or PBS after preparing a homogenate of a biological sample.
  • body fluids especially blood
  • RNA-degrading enzymes in which case conventional methods can extract substantially pure RNA. It was very difficult.
  • contaminants such as proteins can be effectively extracted into the organic layer, so that the target RNA can be obtained with high purity.
  • the intermediate layer that appears after centrifugation is reduced and clear layer separation is possible, separation of the aqueous layer containing the target RNA is easy.
  • RNA extracted using the solution of the present invention is a ribonucleic acid in which a plurality of ribonucleotides are phosphodiester-linked, and is not limited by the molecular weight, the number of bases, or the origin.
  • RNA is classified into mRNA (messenger RNA), tRNA (transfer RNA), rRNA (ribosomal RNA), ncRNA (noncoding RNA), snRNA (nuclear small RNA), snoRNA (nuclear small molecule) in terms of functional classification.
  • RNA and the like, but there are no known chemical structural differences other than molecular weight (number of bases), and all are included in RNA in the present invention.
  • RNA generally having a base number of about 15 to 500 bases called mill RNA and miRNA (microRNA) having a base number of about 18 to 25 bases are also included in the RNA of the present invention.
  • RNA and DNA differ in the main difference in the primary chemical structure between RNA and DNA.
  • a hydroxyl group (—OH) at the ribose 2′-position which is a constituent sugar
  • the structural difference between RNA and DNA decreases as the number of bases decreases. Since the difference is small, it is difficult to separate them by extraction.
  • RNA having a relatively small number of bases such as small ⁇ ⁇ RNA can be extracted with high purity.
  • RNA analysis using qRT-PCR or microarray does not require DNase treatment and can be easily analyzed in the absence of noise due to the presence of DNA.
  • RNA extraction solution Preparation of RNA extraction solution
  • RNA extraction solution Each solution was mixed to prepare an RNA extraction solution so that the final concentration of each component of the solution was as follows. ⁇ 58 vol% phenol ⁇ 5 vol% glycerol ⁇ 0.8M guanidinium thiocyanate (mixed in aqueous solution) ⁇ 0.4M ammonium thiocyanate (mixed in aqueous solution) ⁇ 0.1M sodium acetate buffer (mixed in aqueous solution), adjusted to pH 5.
  • RNA extraction from biological sample RNA was extracted using serum as a biological sample containing RNA, DNA, and protein. 900 ⁇ L of the solution prepared in (1) above and 300 ⁇ L of serum were mixed by vortexing and homogenized. 60 ⁇ L of p-bromoanisole was added to the homogenate, mixed, and centrifuged at 12,000 ⁇ G for 10 minutes at room temperature. Centrifugation formed an aqueous layer containing RNA, an organic layer containing DNA and protein, and an intermediate layer. Of these, 400 ⁇ L of the aqueous layer was separated into another tube.
  • RNA in the aqueous layer-no enzyme treatment Add 1.5-fold volume of 100% ethanol to the aqueous layer containing RNA separated in (2), and add 700 ⁇ L to “RNeasy Mini Spin Column” of “miRNeasy mini kit” (Qiagen Co., Ltd.), which is a nucleic acid purification column.
  • the solution was centrifuged at 8000 ⁇ G for 15 seconds to adsorb nucleic acid to the column, and the liquid that passed through the column was discarded. The same operation was repeated until there was no ethanol-mixed RNA sample, and all the nucleic acid contained in the aqueous layer was adsorbed to the column.
  • the column was washed twice with Buffer RWT 700 ⁇ L and Buffer RPE 500 ⁇ L, dried, and then eluted with 30 ⁇ L RNase-free water to obtain a purified and concentrated RNA sample It was.
  • RNA Extraction Solution Preparation of RNA Extraction Solution The final concentration of the solution was adjusted so that the phenol concentration was 50% by volume, and the other composition was the same as in Example 1, and the solution described in Patent Document 2 was prepared. .
  • Example 2 (2) RNA extraction from a biological sample As in Example 1, serum was used as a biological sample.
  • Example 1 the same procedure as in Example 1 was performed.
  • RNA Extraction Solution A solution similar to the extraction solution described in Patent Document 1 was prepared except that the phenol concentration was 60% by volume. That is, the final concentration was 60% by volume phenol, 2M guanidinium thiocyanate, 0.1M sodium acetate, 0.2% by volume 2-mercaptoethanol, and the pH was 4.
  • RNA extraction from a biological sample As in Example 1, serum was used as a biological sample. (3a) Purification and concentration of RNA in the aqueous layer-no enzyme treatment- The same operation as in Example 1 was performed.
  • Example 2 (1) Preparation of RNA Extraction Solution The solution was prepared so that the final concentration of the solution was the same as that of Example 1 except that the phenol concentration was 55% by volume. (2) RNA extraction from a biological sample As in Example 1, serum was used as a biological sample. (3a) Purification and concentration of RNA in the aqueous layer-no enzyme treatment- The same operation as in Example 1 was performed. (3b) Purification and concentration of RNA from aqueous layer -with RNase treatment- The same operation as in Example 1 was performed. (4) Purity evaluation by electrophoresis It carried out similarly to Example 1. The results are shown in FIG.
  • Example 3 (1) Preparation of RNA Extraction Solution The solution was prepared so that the final concentration of the solution was the same as that of Example 1 except that the phenol concentration was 65% by volume. (2) RNA extraction from a biological sample As in Example 1, serum was used as a biological sample. (3a) Purification and concentration of RNA in the aqueous layer-no enzyme treatment- The same operation as in Example 1 was performed. (4) Purity evaluation by electrophoresis It carried out similarly to Example 1. The result is shown in lane 2 of FIG. The same peak as in Example 1 was detected, and it was confirmed that only RNA was extracted with high purity. The above results are summarized in Table 1.
  • Example 4 (1) Preparation of RNA Extraction Solution The solution was prepared so that the final concentration of the solution was the same as that of Example 1 except that the phenol concentration was 53% by volume. (2) RNA extraction from a biological sample As in Example 1, serum was used as a biological sample. (3a) Purification and concentration of RNA in the aqueous layer-no enzyme treatment- The same operation as in Example 1 was performed. (4) Purity evaluation by electrophoresis It carried out similarly to Example 1. The result is shown in lane 3 of FIG. The same peak as in Example 1 was detected, and it was confirmed that only RNA was extracted with high purity. The above results are summarized in Table 1.
  • RNA extraction solution A solution having the same composition as that of Example 1 was prepared.
  • Table 1 The above results are summarized in Table 1.
  • RNA extraction solution A solution having the same composition as that of Example 1 was prepared.
  • (4) Purity evaluation by electrophoresis It carried out similarly to Example 1. The result is shown in lane 1 of FIG. The same peak as in Example 1 was detected, and it was confirmed that only RNA was extracted with high purity. The above results are summarized in Table 1.
  • RNA extraction solution A solution having the same composition as that of Example 1 was prepared.
  • (4) Purity evaluation by electrophoresis It carried out similarly to Example 1. The result is shown in lane 2 of FIG. The same peak as in Example 1 was detected, and it was confirmed that only RNA was extracted with high purity.
  • Table 1 The above results are summarized in Table 1.
  • RNA extraction solution A solution having the same composition as that of Example 1 was prepared.
  • (4) Purity evaluation by electrophoresis It carried out similarly to Example 1. The result is shown in lane 3 of FIG. The same peak as in Example 1 was detected, and it was confirmed that only RNA was extracted with high purity.
  • Table 1 The above results are summarized in Table 1.
  • RNA extraction solution A solution having the same composition as that of Example 1 was prepared.
  • (4) Purity evaluation by electrophoresis It carried out similarly to Example 1. The result is shown in lane 4 of FIG. The same peak as in Example 1 was detected, and it was confirmed that only RNA was extracted with high purity.
  • Table 1 The above results are summarized in Table 1.
  • RNA extraction solution A solution having the same composition as that of Example 1 was prepared.
  • (4) Purity evaluation by electrophoresis It carried out similarly to Example 1. The result is shown in lane 5 of FIG. The same peak as in Example 1 was detected, and it was confirmed that only RNA was extracted with high purity.
  • Table 2 The above results are summarized in Table 2.
  • RNA extraction solution A solution having the same composition as that of Example 1 was prepared.
  • (4) Purity evaluation by electrophoresis It carried out similarly to Example 1. The result was shown in the lane 6 of FIG. 5. The same peak as in Example 1 was detected, and it was confirmed that only RNA was extracted with high purity.
  • Table 2 The above results are summarized in Table 2.
  • RNA extraction solution A solution having the same composition as that of Example 1 was prepared.
  • RNA extraction solution A solution was prepared by adding hydrochloric acid to the solution prepared in Example 1 to adjust the pH of the solution to 4.2.
  • RNA extraction from a biological sample As in Example 1, serum was used as a biological sample.
  • Table 2 The above results are summarized in Table 2.
  • RNA extraction solution A solution was prepared by adding hydrochloric acid to the solution prepared in Comparative Example 1 to adjust the pH of the solution to 3.6.
  • RNA extraction from biological sample As in Example 1, serum was used as a biological sample.
  • Table 3 The above results are summarized in Table 3.
  • RNA extraction solution A solution having the same composition as that of Example 1 was prepared.
  • RNA extraction from biological sample The same procedure as in Example 1 was performed except that cultured cells (HEK293 cells) suspended in 300 ⁇ L of PBS were used as biological samples instead of 300 ⁇ L of the serum of Example 1.
  • RNA extraction solution Each solution was mixed to prepare an RNA extraction solution so that the final concentration of each component of the solution was as follows. That is, a solution was prepared by adding 60 ⁇ L of p-bromoanisole to 900 ⁇ L of the solution having the same composition as in Example 1.
  • RNA extraction from biological sample 900 ⁇ L of the solution prepared in the above (1) and 300 ⁇ L of serum were vortexed and homogenized. Centrifuge for 10 minutes at 12,000 ⁇ G at room temperature. Centrifugation formed an aqueous layer containing RNA, an organic layer containing DNA and protein, and an intermediate layer. Of these, 350 ⁇ L of the aqueous layer was separated into another tube.
  • RNA extraction solution Each solution was mixed to prepare an RNA extraction solution so that the final concentration of each component of the solution was as follows. That is, 90 ⁇ L of chloroform was further added to 900 ⁇ L of the solution having the same composition as that of Example 1 to prepare a solution.
  • RNA extraction from biological sample Prepared in (1) above 900 ⁇ L of the prepared solution and 300 ⁇ L of serum were vortexed and homogenized. Centrifuge for 10 minutes at 12,000 ⁇ G at room temperature. Centrifugation formed an aqueous layer containing RNA, an organic layer containing DNA and protein, and an intermediate layer.
  • RNA Extraction Solution A solution having the same composition as Comparative Example 3 was prepared except that the phenol concentration was 55% by volume.
  • Example 17 (1) Preparation of RNA Extraction Solution The final concentration of the solution was pH 4, and a solution was prepared so as to have the same composition as in Example 1 except this. (2) RNA extraction from a biological sample As in Example 1, serum was used as a biological sample. (3a) Purification and concentration of RNA in the aqueous layer-no enzyme treatment- The same operation as in Example 1 was performed. (3b) Purification and concentration of RNA from aqueous layer -with RNase treatment- The same operation as in Example 1 was performed. (4) Purity evaluation by electrophoresis It carried out similarly to Example 1. The results are shown in FIG. 10 (lanes 1, 2, 5).
  • Example 18 (1) Preparation of RNA Extraction Solution The final concentration of the solution was pH 6, and the solution was prepared so as to have the same composition as Example 1 except this. (2) RNA extraction from a biological sample As in Example 1, serum was used as a biological sample. (3a) Purification and concentration of RNA in the aqueous layer-no enzyme treatment- The same operation as in Example 1 was performed. (3b) Purification and concentration of RNA from aqueous layer -with RNase treatment- The same operation as in Example 1 was performed. (4) Purity evaluation by electrophoresis It carried out similarly to Example 1. The results are shown in FIG. 10 (lanes 3, 4, 5).

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Abstract

生物試料から実質的に純粋なＲＮＡを抽出するための溶液が開示されている。ＲＮＡと、少なくともＤＮＡを含む生物試料からＲＮＡを抽出するための溶液は、（ａ）溶液の総量に対して５０容量％超過のフェノール、（ｂ）溶液の総量に対して３～１０容量％の多価アルコール、（ｃ）溶液の総量に対して０．５～２．０Ｍ濃度のグアニジニウム塩、（ｄ）溶液の総量に対して０．１～０．５Ｍ濃度のチオシアン酸塩、及び（ｅ）溶液のｐＨを４～６に維持するための緩衝剤、を含む。

Description

ＲＮＡ抽出用溶液
　本発明は、生物試料から実質的に純粋なＲＮＡを抽出するための溶液に関する。
　ＤＮＡに書き込まれた遺伝情報は多種多様な組み合わせでＲＮＡに転写され、生物は複雑な表現型を示している。ＲＮＡは種類、発現量をもって生物の表現型に寄与していることが明らかとなっており、遺伝子発現分析のためには、様々な生物材料からＲＮＡを純度高く抽出することが重要である。この目標を達成するために、これまで多くのＲＮＡ抽出方法が開発されている。頻繁に使用されているＲＮＡの単離方法は、フェノール抽出、カオトロピック塩溶液からの沈殿、及びシリカメンブレンへの吸着などがある。
　特許文献１には、ＲＮＡの抽出を目的とする、２～５Ｍのグアニジンと４０～６０％のフェノールを含む溶液が開示されている。この溶液を用いることにより、それ以前は超遠心機を使用し２日以上を要した作業を３時間で効率的にＲＮＡ抽出を行えるようになった。この方法は、シングルステップ方法と称されている。
　特許文献２には、上記の特許文献１に記載されている方法をさらに改良したものとして、ＲＮＡとＤＮＡとタンパク質とを含む試料から、これら各成分を同時に抽出して分離するための抽出溶液が開示されている。具体的には、０．５～２Ｍのグアニジンを含む濃度３０～５０％のフェノール溶液を用いてＲＮＡを水層に抽出して分離することが記載されている。
　特許文献１及び２に記載の溶液は、その組成は異なるが、いずれも各溶液を用いて同様の操作でＲＮＡを抽出することができる。即ち、各溶液で生物組織をホモジナイズし、クロロホルムなどの疎水性有機溶媒を用いて、そのホモジェネートを遠心して層分離する。遠心分離後、ＲＮＡを含む最上部の水層を回収し、アルコールを用いてＲＮＡを沈殿させ、洗浄することで、ＲＮＡを抽出することができる。
　しかし、特許文献１及び２に記載の溶液及び方法を用いて単離されたＲＮＡには、逆転写－ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ（ＲＴ－ＰＣＲ）により検出され得る程度の量のゲノムＤＮＡがなお混入（残存）しているため、例えばＲＴ－ＰＣＲの場合にＲＮＡの定量性を失わせる等の問題がある（特許文献３、例えば段落０００５）。従って、これらの方法によって単離されたＲＮＡは、混入するＤＮＡを除くためにさらに精製されなければならない。
　抽出したＲＮＡサンプル中に不純物として混入しているＤＮＡを除去するための一般的な１つの方法は、ＲＮＡサンプルをデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）で処理することである。しかし、ＤＮａｓｅによる処理は、液層で行う場合には処理後にＤＮａｓｅを除くために再度フェノール／クロロホルム抽出やタンパク質の変性を行わなければならない。また、シリカメンブレンカラムを組み合わせて抽出する場合には、カラムの洗浄作業を重ねて行う必要がある。このＤＮａｓｅによる処理によりＤＮＡの混入は減少するが、これらの手間が増加し、さらにＲＮＡのロスが生じてＲＮＡの抽出量が減少してしまうという問題がある。
　特許文献３には、ＤＮａｓｅ処理を行うことなくＲＮＡサンプルへのＤＮＡの混入を避ける方法として、ｐＨ４未満においてＲＮＡ抽出試薬を用いる方法が報告されている。しかし、核酸は酸性下で脱プリン化され、分解してしまうことが一般によく知られており、実質的に分解されていないＲＮＡを単離することは困難である。また、酸性下におけるＤＮＡの水層／有機層への溶解平衡は有機層に分配されるように偏ることから、ｐＨ４未満においてＲＮＡ抽出試薬を用いることにより、水相へのゲノムＤＮＡの混入抑制効果はある程度期待できるが、塩基数の小さいＤＮＡ断片の混入を完全に抑制することは不可能である。
米国特許第４８４３１５５号 特開平５－３４４８８６号公報 特表２００７－５３２１４０号公報
　以上のように、生物試料からＲＮＡを抽出するための従来の溶液では、定量性が求められるような場合に、ＤＮＡが混入していない実質的に純粋なＲＮＡを抽出することができなかったという課題があった。そして、混入したＤＮＡを除くために、ＤＮａｓｅ処理などの付加工程が必要であった。本発明は、これらの課題を解決しようとするものであって、生物試料から実質的に純粋なＲＮＡを抽出するための溶液を提供する。
　本発明者らは、今回、従来のＲＮＡ抽出用溶液の組成について検討し、特にフェノール濃度がＤＮＡの混入を防ぐ効果に関係することを見出して本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下のものを提供する。
［１］ＲＮＡと、少なくともＤＮＡを含む生物試料からＲＮＡを抽出するための溶液であって、
（ａ）溶液の総量に対して５０容量％超過のフェノール、
（ｂ）溶液の総量に対して３～１０容量％の多価アルコール、
（ｃ）溶液の総量に対して０．５～２．０Ｍ濃度のグアニジニウム塩、
（ｄ）溶液の総量に対して０．１～０．５Ｍ濃度のチオシアン酸塩、及び
（ｅ）溶液のｐＨを４～６に維持するための緩衝剤、
を含む溶液。
［２］フェノール濃度が、溶液の総量に対して５５～６５容量％である、［１］に記載の溶液。
［３］水層を分離するための有機溶媒をさらに含む、［１］又は［２］に記載の溶液。
［４］生物試料が培養細胞の培養液である、［１］～［３］のいずれか１項に記載の溶液。
［５］生物試料が生物の体液成分である、［１］～［３］のいずれか１項に記載の溶液。
［６］生物試料が生物の血液成分である、［１］～［３］のいずれか１項に記載の溶液。
［７］　ＲＮＡと少なくともＤＮＡを含む生物試料を、
（ａ）溶液の総量に対して５０容量％超過のフェノール、
（ｂ）溶液の総量に対して３～１０容量％の多価アルコール、
（ｃ）溶液の総量に対して０．５～２．０Ｍ濃度のグアニジニウム塩、
（ｄ）溶液の総量に対して０．１～０．５Ｍ濃度のチオシアン酸塩、及び
（ｅ）溶液のｐＨを４～６に維持するための緩衝剤、
を含む溶液と共にホモジェナイズする工程と、
　得られたホモジェネートを、水層を分離するための有機溶媒と混合する工程と、
　得られた混合物を遠心分離する工程と、
　遠心分離により生成した、ＲＮＡ含有水層を回収する工程と、
を含む、前記生物試料からＲＮＡを抽出する方法。
［８］　ＲＮＡと少なくともＤＮＡを含む生物試料を、
（ａ）溶液の総量に対して５０容量％超過のフェノール、
（ｂ）溶液の総量に対して３～１０容量％の多価アルコール、
（ｃ）溶液の総量に対して０．５～２．０Ｍ濃度のグアニジニウム塩、
（ｄ）溶液の総量に対して０．１～０．５Ｍ濃度のチオシアン酸塩、及び
（ｅ）溶液のｐＨを４～６に維持するための緩衝剤、
（ｆ）水層を分離するための有機溶媒、
を含む溶液と共にホモジェナイズする工程と、
　得られたホモジェネートを遠心分離する工程と、
　遠心分離により生成した、ＲＮＡ含有水層を回収する工程と、
を含む、前記生物試料からＲＮＡを抽出する方法。
［９］　フェノール濃度が、（ａ）～（ｅ）の溶液の総量に対して５５～６５容量％である、請求項７又は８に記載の方法。
　本発明の溶液を用いることにより、生物試料から、ＤＮＡの混入がない実質的に純粋なＲＮＡを簡便に抽出することができるようになる。また、本発明によれば、回収ロスの原因となりうるＤＮａｓｅ処理などの付加処理を必要とせずに、定量性が求められる用途においてもそのまま用いることができるような純度のＲＮＡを得ることが可能となる。特に、生物試料のうち、ＲＮＡ分解酵素やその他の夾雑物が非常に多く含まれている血液等の体液においても、目的とするＲＮＡを高純度で抽出することが可能である。
図１は、実施例１において、本発明の溶液を用いて血清から抽出した核酸の電気泳動図である。 図２は、比較例１において、特許文献２に記載の溶液を用いて血清から抽出した核酸の電気泳動図である。 図３は、比較例２において、特許文献１に記載の溶液を用いて血清から抽出した核酸の電気泳動図である。 図４は、実施例２～５において、本発明の溶液を用いて血清から抽出した核酸の電気泳動図である。 図５は、実施例６～１２において、本発明の溶液を用いて血清から抽出した核酸の電気泳動図である。 図６は、実施例１３、比較例３において、本発明の溶液、特許文献３に記載の溶液を用いて血清から抽出した核酸の電気泳動図である。 図７は、実施例１４において、本発明の溶液を用いて培養細胞から抽出した核酸の電気泳動図である。 図８は、実施例１５、１６において、本発明の溶液を用いて血清から抽出した核酸の電気泳動図である。 図９は、比較例４において、特許文献３に記載の溶液を用いて血清から抽出した核酸の電気泳動図である。 図１０は、実施例１７、１８において、本発明の溶液を用いて血清から抽出した核酸の電気泳動図である。
　本発明は、生物試料からＲＮＡを抽出するための溶液であって、次の（ａ）～（ｅ）をその成分として含む。
（ａ）溶液の総量に対して５０容量％超過のフェノール、
（ｂ）溶液の総量に対して３～１０容量％（３容量％以上１０容量％以下）の多価アルコール、
（ｃ）溶液の総量に対して０．５～２．０Ｍ（０．５Ｍ以上２．０Ｍ以下）濃度のグアニジニウム塩、
（ｄ）溶液の総量に対して０．１～０．５Ｍ（０．１Ｍ以上０．５Ｍ以下）濃度のチオシアン酸塩、及び
（ｅ）溶液のｐＨを４～６に維持するための緩衝剤。
　本発明で用いる生物試料は、ＲＮＡと、少なくともＤＮＡを含むものである。また、本発明の溶液を用いることにより、上記生物試料から実質的に純粋なＲＮＡを抽出することができる。ここで、「実質的に純粋なＲＮＡ」とは、生物試料に当初含まれていたＤＮＡが分離されて、実質的にその混入のないＲＮＡを意味する。ＲＮＡが実質的に純粋かどうかは、電気泳動によりＤＮＡが検出されるか否かにより判断することができる。例えば、アジレント・テクノロジー株式会社製「Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ６０００ピコキット」（型番５０６７－１５１３）は推奨５０ｐｇ／μＬ～５０００ｐｇ／μＬの核酸を検出することができるので、これを用いてＤＮＡの混入の有無を評価することができる。具体的には、抽出した核酸をＲＮａｓｅ処理してから「Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ６０００ピコキット」を用いて電気泳動した場合に、ピークが検出されないときは十分にＤＮＡの混入が抑制されており、実質的に純粋なＲＮＡが得られていると判断することができる。また、混入したＤＮＡ量を定量ＰＣＲにより分析することで、ＲＮＡの純度を評価することができる。例えば、リアルタイムＰＣＲ装置と「ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ」（蛍光色素）を用いると、６０ｐｇの２本鎖ＤＮＡを検出することができるので、これを用いて評価することができる。具体的には、プライマーとＤＮＡ合成酵素と「ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ」を含むＰＣＲ反応溶液に、抽出した核酸を加えてＰＣＲ増幅を行い、予め作成した検量線と比較することにより、混入したＤＮＡ量を定量的に分析することができる。
　本発明において、溶液の総量とは、上記（ａ）～（ｅ）の全てを含む溶液の全容量を意味する。例えば、溶液の総量に対して５０容量％超過のフェノールとは、全成分を混合させた後の溶液１Ｌ中に、５００ｍＬを超過するフェノールを含んでいることを意味する。また、例えば、溶液の総量に対して０．５～２．０Ｍ濃度のグアニジニウム塩とは、溶液の終濃度が０．５Ｍ以上２．０Ｍ以下であること、すなわち各成分を全て混合させた後の溶液１Ｌ中に、０．５ｍｏｌ以上２ｍｏｌ以下のグアニジニウム塩が含まれていることを意味する。
　本発明の溶液は、（ａ）溶液の総量に対して５０容量％超過のフェノールを含む。フェノール濃度を従来技術と異なる５０容量％超過にすると、ＲＮＡが抽出される水層に、不純物としてのＤＮＡの混入が減少する効果のあることが明らかになった。本発明の溶液は、例えば、５１容量％以上、５２容量％以上、５３容量％以上、５４容量％以上又は５５容量％以上のフェノールを含む。好ましくは、５３容量％以上、より好ましくは５５容量％以上のフェノールを含む。また、フェノールの濃度は、本発明の溶液の他の成分である（ｂ）の多価アルコール、（ｃ）の０．５～２．０Ｍグアニジニウム塩、（ｄ）の０．１～０．５Ｍチオシアン酸塩を各所定濃度において均一に混和した状態で本発明の溶液を調製する都合から、７５容量％以下であることが好ましく、またフェノールが酸化されることによる影響を減らすため、フェノールの濃度は６５容量％以下であることがより好ましい。好ましいフェノール濃度の範囲は、これらの上限と下限を任意に組み合わせた範囲であるが、より好ましくは５２容量％以上６５容量％以下、５３容量％以上６５容量％以下、特に好ましくは５５容量％以上６５容量％以下である。
　本発明の溶液は、（ｂ）溶液の総量に対して３～１０容量％の多価アルコールを含む。本発明における多価アルコールは、複数の水酸基を有する脂肪族アルコールであって、本発明の溶液中の（ａ）のフェノール成分及び（ｃ）や（ｄ）の水溶液を混和して均一な溶液として維持することができるものを用いることができる。多価アルコールとしては、２～４個の水酸基を有する炭素数２～６個の脂肪族アルコールが好ましい。例えば、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、エリスリトールなどが挙げられ、グリセロールがより好ましい。多価アルコールは、本発明の溶液を均一な溶液として維持し、フェノール成分が過度に水層に分配されないように、本発明の溶液の総量に対して３～１０容量％を用いることができる。
　本発明の溶液は、（ｃ）溶液の総量に対して０．５～２．０Ｍ濃度のグアニジニウム塩を含む。グアニジニウム塩としては、具体的にはチオシアン酸グアニジニウムや塩酸グアニジニウムが好ましい。グアニジニウム塩は、ＲＮＡを分解から保護し、水性の溶液中でフェノールを溶液状態に維持する効果がある。
　本発明の溶液は、（ｄ）溶液の総量に対して０．１～０．５Ｍ濃度のチオシアン酸塩を含む。チオシアン酸塩としては、チオシアン酸の無機塩が好ましく用いることができ、より好ましくはチオシアン酸アンモニウム、チオシアン酸ナトリウムを用いることができる。また、複数の異なるチオシアン酸の無機塩の混合物であってもよく、例えばチオシアン酸アンモニウムとチオシアン酸ナトリウムとの混合物を好ましく用いることができる。チオシアン酸塩は、生物試料からのＲＮＡの抽出を増強すると考えられている。なお、本発明の溶液がチオシアン酸グアニジニウムを含む場合、該チオシアン酸グアニジニウムの濃度は、上記したグアニジニウム塩の濃度に含め、チオシアン酸塩の濃度には含めない。
　本発明の溶液は、（ｅ）溶液のｐＨを４～６に維持するための緩衝剤を含む。緩衝剤としては、ｐＨを所望の範囲に維持するために通常用いられる緩衝性を示す有機塩や無機塩を使用することができる。具体的には、ナトリウム、カリウム、リチウム又はアンモニウムの、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、フタル酸塩、酒石酸塩又は乳酸塩などの有機塩及び無機塩が含まれる。これらの組合せの中でも、酢酸ナトリウムやクエン酸ナトリウムがより好ましく用いられる。また、これらの複数の有機塩や無機塩を組み合わせて用いてもよい。この緩衝剤の濃度は、本発明の溶液を目的とするｐＨ４～６に維持するために十分であれば特に限定されないが、本発明の溶液の総量に対して０．０２～０．２Ｍの濃度となることが好ましい。本発明の溶液のｐＨを調整するために、緩衝剤に加えて、適当な酸又はアルカリ水溶液、例えば塩酸や水酸化ナトリウム溶液を適宜添加してもよい。
　本発明の溶液には、生物試料中のタンパク質を変性させて目的とするＲＮＡの精製を補助するために、ポリオキシエチレンソルビタン、ドデシル硫酸ナトリウム、サルコシンなどの界面活性剤が含まれてもよい。また、本発明の溶液には、フェノールの酸化を防止するために、ヒンダードアミンフェノール、キノリンなどの酸化防止剤が含まれてもよい。
　本発明の溶液は、例えば、生物試料が液体状態の場合、目的のＲＮＡを抽出するときには、その１倍容量以上、好ましくは３倍容量以上を用いることができる。
　本発明の溶液を用いて目的のＲＮＡを抽出する手順の例を以下に示す。まず、生物試料を本発明の溶液中でホモジナイズしてホモジェネートを形成させる。ホモジナイズの方法は特に限定はないが、ボルテックスなどによる攪拌、注射針による破砕のほか、一般的なホモジナイザーを使用することができる。次に、水層を分離するための有機溶媒をこのホモジェネートに加えたのち、これを遠心分離する。ここで加える有機溶媒は、好ましくは、ホモジェネートの２容量％～４０容量％程度を用いる。また遠心分離は、通常、６，０００ｘＧ～２０，０００ｘＧで３分間～３０分間、例えば、速度１２，０００ｘＧの条件で室温１０分間行うことができるが、液層が分離すればよく、速度、温度、時間に特に制限はない。遠心分離すると、目的とする実質的に純粋なＲＮＡは水層に抽出される。一方、ＤＮＡやタンパク質等は有機層に、又は中間層が生じた場合は有機層及び中間層に分離される。
　水層を分離するための有機溶媒とは、本発明の溶液を用いて抽出された目的のＲＮＡが含まれる水層と、ＤＮＡ等が含まれる有機層及び／又は中間層（生じた場合）とに分離するために用いる液体の有機化合物である。この有機溶媒としては、親水性の度合いがフェノールと同じか、より疎水性であるものを用いることができる。例えば、親水性を示す指標して一般に用いられる水／オクタノール分配係数ＣＬｏｇＰの値が１．４（フェノールのＣＬｏｇＰ値）以上の有機化合物であれば使用することができ、ＣＬｏｇＰの値が１．４～５の範囲のものを好ましく用いることができる。ここで、ＣＬｏｇＰ値は、例えば「Ｃｈｅｍ　Ｄｒａｗ」（登録商標）等のプログラムを用いて推算値を求めることができる。本発明において用いる有機溶媒としては、例えば、クロロホルム（１．９５２）、ｐ－ブロモアニソール（３．０６４）、１－ブロモ－３－クロロプロパン（１．８４７）、４－ブロモベラトロール（２．７３４５）、６－ブロモ－１，４－ベンゾジオキサン（３．０００５）、１－ブロモ－４－トリフルオロメトキシベンゼン（４．１７３）、１－ブロモ－２，４－ジメトキシベンゼン（２．８５４５）、４－フルオロアニソール（２．３４４）、４－ブロモトルエン（３．５０４）、４－ブロモ酪酸エチル（１．７７２）などが挙げられるが、これに限らない。ここで、上記の各有機溶媒の（）中の数値は「Ｃｈｅｍ　Ｄｒａｗ」で求められたＣＬｏｇＰの値である。
　上記の水層を分離するための有機溶媒は、上記のように（ａ）～（ｅ）を含む本発明の溶液を用いて形成させてホモジェネートに添加して用いることができるが、上記（ａ）～（ｅ）を含む本発明の溶液に予め含まれていてもよい。従来のフェノール濃度が５０％以下の溶液の場合は、この有機溶媒を予め含めようとすると生物試料と混和するまえに溶液が水層と有機層の２層に分離してしまうため抽出溶液として使用困難であったが、本発明の溶液のフェノール濃度においては有機溶媒が本発明の溶液に均一に混和し、単一の溶液として保存可能である。この有機溶媒を予め含有する本発明の溶液は、生物試料を加えてホモジナイズしてホモジェネートとしたあと、直ちに遠心分離することでＲＮＡを含む水層を分離させることができる。従って、有機溶媒をホモジェネートに後から加える場合に比べ、手順を非常に単純化することができるので、好ましい。
　水層を分離するための有機溶媒が上記（ａ）～（ｅ）を含む本発明の溶液に予め含まれる場合の当該有機溶媒の含有量は、加える有機溶媒の種類と溶液のフェノール濃度にあわせて、有機溶媒が本発明の溶液中で均一に混和する範囲で選定することができる。例えば、本発明の溶液のフェノール濃度が６５％であるときに有機溶媒としてクロロホルムを選択する場合には、上記（ａ）～（ｅ）を含む溶液の総量１００％に対し２７容量％までの任意の容量を含むことが好ましい。具体的には、上記（ａ）～（ｅ）を含む溶液１００ｍＬにクロロホルムを２７ｍＬまでの任意の容量を加えることが好ましい。上記（ａ）～（ｅ）を含む溶液の総量１００％に対し、より好ましくは５～２５容量％、さらに好ましくは１０～２０容量％のクロロホルムを含む。また、フェノール濃度が５８％であるときには、クロロホルムは上記（ａ）～（ｅ）を含む溶液の総量１００％に対し１４％までの任意の容量を含むことが好ましく、より好ましくは６～１３容量％、さらに好ましくは８～１２容量％を含む。また、溶液のフェノール濃度が６５％であるときに有機溶媒としてｐ－ブロモアニソールを選択する場合には、上記（ａ）～（ｅ）を含む溶液の総量１００％に対し２２容量％までの任意の容量を含むことが好ましく、より好ましくは５～２０容量％、さらに好ましくは１０～１８容量％を含む。また、同様にフェノール濃度が５８％であるときには、ｐ－ブロモアニソールは上記（ａ）～（ｅ）を含む溶液の総量１００％に対し１３容量％までの任意の容量を含むことが好ましく、より好ましくは３～１１容量％、より好ましくは５～９容量％を含む。
　本発明の溶液を用いて水層に抽出されたＲＮＡをさらに精製、濃縮するために、ＲＮＡが含まれる水層に低級アルコールを加えてＲＮＡを沈澱させ、沈澱したＲＮＡを回収することができる。あるいは、ＲＮＡが含まれる水層に低級アルコールを加えて沈澱させたＲＮＡを、ＲＮＡを吸着しうる担体、例えばシリカメンブレンカラムに吸着させたあと、担体（カラム）から溶出して回収しても良い。ここで用いる低級アルコールとしては、エタノール、イソプロパノールなどが挙げられる。その濃度は、一般的な核酸のエタノール沈殿、イソプロパノール沈殿の手法又はシリカメンブレンカラム等の担体のメーカー推奨濃度に準じて決めることができる。
　本発明の溶液は、上記の（ａ）～（ｅ）を各濃度となるように混和することで製造することができる。その混和の手順としては特に制限はない。溶液の組成によっては、予め高濃度の各溶液を調製してからそれらを混和することもできる。例えば、６Ｍのチオシアン酸グアニジン水溶液、６Ｍのチオシアン酸アンモニウム水溶液、１Ｍの酢酸ナトリウムを予め準備し、目的の濃度に混和してから、さらにグリセロール、フェノールと不足分の水を加えて調製することができる。水層を分離するための有機溶媒が上記（ａ）～（ｅ）を含む溶液に予め含まれる本発明の溶液も、同様にして、（ａ）～（ｅ）及び当該有機溶媒が所望の濃度となるように混和することで製造することができる。
　本発明において用いる生物試料は、ＲＮＡと、少なくともＤＮＡを含むものであれば、特に制限はない。例えば、目的とするＲＮＡから分離したい不純物成分として、ＤＮＡのほかにタンパク質を含むものであってもよい。具体的には、培養細胞、培養細胞の培養液、手術切片や生検サンプル等の生体組織、生体細胞、血液、血液成分（血清、血漿）、尿、唾液、涙等の体液などが挙げられるが、これらに限られず、ＲＮＡの含まれる任意の試料を使用し得る。これらの生物試料に本発明の溶液を適用する場合には、生物試料が体液等の液体試料である場合には、採取後そのまま本発明の溶液と混和してもよいし、ＰＢＳや水で希釈してから本発明の溶液と混和してもよい。生物試料が細胞ペレットや組織片である場合には、採取後そのまま本発明の溶液と混和してもよいし、ＰＢＳや水で希釈してから本発明の溶液と混和してもよいが、ＲＮＡの分解を避けるため、希釈する場合にはより好ましくは生物試料のホモジェネートを作成してから水やＰＢＳで希釈することが好ましい。
　生物試料のうち体液、特に血液には、ＲＮＡの分解酵素やその他の夾雑物が非常に多く含まれていることがあり、その場合に従来の方法では実質的に純粋なＲＮＡを抽出することが非常に困難であった。本発明の溶液は、フェノールを５０容量％超過にすることにより、タンパク質などの夾雑物を効果的に有機層に抽出することができるため、目的とするＲＮＡを純度高く得ることが可能である。また、遠心分離後に出現する中間層が減少し、明確な層分離が可能となるので、目的とするＲＮＡの含まれる水層の分離が容易である。
　本発明の溶液を用いて抽出するＲＮＡは、複数のリボヌクレオチドがホスホジエステル結合したリボ核酸であって、その分子量、塩基数や由来によって限定されない。一般に、ＲＮＡは、機能分類上、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｎｃＲＮＡ（ノンコーディングＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（核小体低分子ＲＮＡ）、等多くの種類に分類されているが、化学構造的には分子量（塩基数）以外に差は知られておらず、いずれも本発明におけるＲＮＡに含まれる。一般にｓｍａｌｌ ＲＮＡと呼ばれる塩基数が１５～５００塩基程度のＲＮＡや、一般に塩基数が１８～２５塩基程度のｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）も本発明におけるＲＮＡに含まれる。
　一般に、ＲＮＡとＤＮＡとの一次化学構造の主な差異は、構成糖であるリボース２’－位の水酸基（－ＯＨ）の有無であり、それぞれ塩基数が小さくなるほどＲＮＡとＤＮＡとの構造的な差異が小さくなるため、両者を抽出により分離することが難しくなる。しかし、本発明の溶液を用いれば、ｓｍａｌｌ ＲＮＡといった塩基数の比較的小さいＲＮＡについても、純度高く抽出することが可能である。
　通常、ＤＮＡとＲＮＡとが混在している状態では吸光光度計又は発光光度計を用いてそれぞれを区別して定量することは困難であるが、本発明の溶液を用いることで実質的に純粋なＲＮＡを得ることができるので、これらを用いたＲＮＡの定量が可能となる。また、本発明の溶液を用いることで、ｑＲＴ－ＰＣＲやマイクロアレイを使用したＲＮＡの解析において、ＤＮａｓｅによる処理を必要とせず、ＤＮＡの混在するによるノイズがない状態で簡便に解析することができる。
　本発明は、以下の実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例に限定されないものとする。
　＜実施例１＞
　（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
　溶液の各成分の終濃度が以下になるように、それぞれを混合してＲＮＡ抽出用の溶液を調製した。
・５８容量％フェノール
・５容量％グリセロール
・０．８Ｍチオシアン酸グアニジニウム（水溶液にて混合）
・０．４Ｍチオシアン酸アンモニウム（水溶液にて混合）
・０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（水溶液にて混合）、ｐＨが５になるように調整。
　（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
　ＲＮＡと、ＤＮＡ及びタンパク質を含む生物試料として血清を用いてＲＮＡ抽出を行った。上記（１）で調製した溶液９００μＬと血清３００μＬをボルテックスで混和し、ホモジナイズした。ホモジェネートに６０μＬのｐ－ブロモアニソールを加えて混和し、室温で１２，０００ｘＧで１０分間遠心した。遠心により、ＲＮＡを含有する水層と、ＤＮＡ及びタンパク質を含有する有機層と中間層が形成された。このうち、水層４００μＬを別のチューブに分離した。
　（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮－酵素処理なし－
　（２）で分離したＲＮＡを含む水層に１．５倍容量の１００％エタノールを加え、核酸の精製カラムである「ｍｉＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ」（株式会社キアゲン製）の「ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ」に７００μＬ加え、８０００ｘＧで１５秒遠心してカラムに核酸を吸着させ、カラムを通過した液は廃棄した。エタノール混和ＲＮＡサンプルがなくなるまで同作業を繰り返し、水層に含まれていた核酸をすべてカラムに吸着させた。その後「ｍｉＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ」のプロトコルに従い、Ｂｕｆｆｅｒ ＲＷＴ ７００μＬ、Ｂｕｆｆｅｒ ＲＰＥ ５００μＬで２回カラムを洗浄し、カラムを乾燥させた後、３０μＬのＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ水で溶出し、精製、濃縮したＲＮＡサンプルを得た。
　（３ｂ）水層からのＲＮＡの精製、濃縮－ＲＮａｓｅ処理有り－
　抽出された核酸がＲＮＡであることを確認するために、（２）で分離したサンプルに対してＲＮａｓｅ処理を行った。（２）で分離したＲＮＡを含む水層に１．５倍容量の１００％エタノールを加え、（３ａ）と同様に核酸をカラムに吸着させた。Ｂｕｆｆｅｒ ＲＷＴ ３５０μＬで洗浄した後、希釈したＲＮａｓｅを加えてカラムに吸着した核酸をＲＮａｓｅ処理し、Ｂｕｆｆｅｒ ＲＷＴ ３５０μＬ、Ｂｕｆｆｅｒ ＲＰＥ ５００μＬで２回カラムを洗浄して、カラムを乾燥させた後、３０μＬのＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ水で溶出し、精製、濃縮したＲＮＡサンプルを得た。
　（４）電気泳動による純度評価
　（３ａ）、（３ｂ）で得た各ＲＮＡサンプル１μＬを７０℃で２分熱変性したあと、急冷した。アジレント・テクノロジー株式会社製「Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ６０００ピコキット」（型番５０６７－１５１３）を用いて、電気泳動を行った。その結果を図１に示した。また、「Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００」のＳｍｅａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ機能により、２５－５００ｎｔのピークエリアの面積を算出してピークのサイズと検出された核酸量（濃度）を確認した。
　（３ａ）の酵素処理なしサンプルでは、２００ｂａｓｅより小さいサイズのピークが１本のみ確認された（レーン１）。また、このときに算出された核酸量は８１６ｐｇ／μＬであった。一方、（３ｂ）のＲＮａｓｅ処理したサンプルの電気泳動パターンを確認すると、ピークは全く検出されなかった（レーン２）。また、このときの核酸量は６１ｐｇ／μＬと算出された。血清の代わりに核酸を含まないＰＢＳを用いて実施例１と同様に操作して検出系のノイズを確認する（レーン３：ＢＬＡＮＫ）と、このときの核酸量は６３ｐｇ／μＬであったことから、レーン２で算出された核酸量はノイズであると考えられた。以上のことから、抽出された核酸はＤＮＡを含まないＲＮＡのみであったことが確認された。なお、別途合成した２２～２５塩基のＲＮＡを電気泳動して得られた泳動距離と本実施例で得られたピークの泳動距離は同等であったことから、レーン１で確認されたＲＮＡは２２～２５塩基であると考えられた。
　以上の結果を表１にまとめた。
　＜比較例１＞
　（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
　溶液の終濃度は、フェノール濃度を５０容量％とし、これ以外は実施例１と同じ組成になるように調製して、特許文献２に記載の溶液を調製した。
　（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
　実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
　（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮－酵素処理なし－
　実施例１と同様に行った。
　（３ｂ）水層からのＲＮＡの精製、濃縮－ＲＮａｓｅ処理有り－
　実施例１と同様に行った。
　（３ｃ）水層からのＲＮＡの精製、濃縮－ＤＮａｓｅ処理有り－
　実施例１の（３ｂ）において、ＲＮＡを含む水層を（３ｂ）のＲＮａｓｅに代えてＤＮａｓｅで処理して精製、濃縮したサンプルを得た。以上のほかは、実施例１と同様に行った。
　（４）電気泳動による純度評価
　実施例１と同様に行った。その結果を図２に示した。
　酵素処理していないサンプルからは２本の強いピーク（塩基数が２００塩基と５００塩基付近）と１本の弱いピーク（実施例１と同塩基数）が検出された（レーン１）。ＲＮａｓｅ処理有りサンプルでは、２００塩基と５００塩基のピークにはほとんど変化がなかったことから、２本のピークはＲＮＡではないことが明らかとなった（レーン２）。一方、レーン１で見られた、１本の弱いピークは消失したことから、実施例１と同様にこのピークはＲＮＡであったことが確認された。ＤＮａｓｅ処理したサンプルでは、２本の強いピークが消失し、非常に短く分解された断片が検出された（レーン３）ことから、この２本の強いピークは、混入したＤＮＡ断片であったことがわかった。
　以上のように、フェノール濃度が５０容量％の溶液を用いた場合は、ＤＮＡの混入が確認され、純粋なＲＮＡが抽出されなかった。
　以上の結果を表３にまとめた。
　＜比較例２＞
　（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
　フェノール濃度が６０容量％である以外は、特許文献１に記載の抽出用溶液と同様の溶液を調製した。即ち、終濃度が６０容量％フェノール、２Ｍチオシアン酸グアニジニウム、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．２容量％２－メルカプトエタノールとし、ｐＨは４とした。
　（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
　実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
　（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮－酵素処理なし－
　実施例１と同様に行った。
　（４）電気泳動による純度評価
　実施例１と同様に行った。その結果を図３に示した。
　比較例１と同様の３本のピークが確認された。このことから、ＤＮＡ断片が混入していることが確認された。
　以上の結果を表３にまとめた。
　＜実施例２＞
　（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
　溶液の終濃度は、フェノール濃度を５５容量％とし、これ以外は実施例１と同じ組成になるように溶液を調製した。
　（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
　実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
　（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮－酵素処理なし－
　実施例１と同様に行った。
　（３ｂ）水層からのＲＮＡの精製、濃縮－ＲＮａｓｅ処理有り－
　実施例１と同様に行った。
　（４）電気泳動による純度評価
　実施例１と同様に行った。その結果を図４に示した。
　実施例１と同様のピークが検出され（レーン１）、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことが確認された。ＲＮａｓｅ処理を行ったサンプル（レーン５；ＲＮａｓｅ（＋））ではＢＬＡＮＫと同レベルまで減少していることから、抽出された核酸がＲＮＡのみであることが確認できた。
　以上の結果を表１にまとめた。
　＜実施例３＞
　（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
　溶液の終濃度は、フェノール濃度を６５容量％とし、これ以外は実施例１と同じ組成になるように溶液を調製した。
　（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
　実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
　（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮－酵素処理なし－
　実施例１と同様に行った。
　（４）電気泳動による純度評価
　実施例１と同様に行った。その結果を図４のレーン２に示した。
　実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことが確認された。
　以上の結果を表１にまとめた。
　＜実施例４＞
　（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
　溶液の終濃度は、フェノール濃度を５３容量％とし、これ以外は実施例１と同じ組成になるように溶液を調製した。
　（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
　実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
　（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮－酵素処理なし－
　実施例１と同様に行った。
　（４）電気泳動による純度評価
　実施例１と同様に行った。その結果を図４のレーン３に示した。
　実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことが確認された。
　以上の結果を表１にまとめた。
　＜実施例５＞
　（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
　実施例１と同じ組成の溶液を調製した。
　（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
　ホモジェネートに６０μＬのｐ－ブロモアニソールを加える代わりに、２４０μＬのクロロホルムを加え、これ以外は実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
　（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮－酵素処理なし－
　実施例１と同様に行った。
　（４）電気泳動による純度評価
　実施例１と同様に行った。その結果を、図４のレーン４に示した。
　実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことが確認された。
　以上の結果を表１にまとめた。
　＜実施例６＞
　（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
　実施例１と同じ組成の溶液を調製した。
　（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
　ホモジェネートに６０μＬのｐ－ブロモアニソールを加える代わりに、１００μＬの４－ブロモベラトロールを加え、これ以外は実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
　（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮－酵素処理なし－
　実施例１と同様に行った。
　（４）電気泳動による純度評価
　実施例１と同様に行った。その結果を図５のレーン１に示した。
　実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことが確認された。
　以上の結果を表１にまとめた。
　＜実施例７＞
　（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
　実施例１と同じ組成の溶液を調製した。
　（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
　ホモジェネートに６０μＬのｐ－ブロモアニソールを加える代わりに、１００μＬの６－ブロモ－１，４－ベンゾジオキサンを加え、これ以外は実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
　（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮－酵素処理なし－
　実施例１と同様に行った。
　（４）電気泳動による純度評価
　実施例１と同様に行った。その結果を図５のレーン２に示した。
　実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことが確認された。
　以上の結果を表１にまとめた。
　＜実施例８＞
　（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
　実施例１と同じ組成の溶液を調製した。
　（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
　ホモジェネートに６０μＬのｐ－ブロモアニソールを加える代わりに、１００μＬの１－ブロモ－４－トリフルオロメトキシベンゼンを加え、これ以外は実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
　（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮－酵素処理なし－
　実施例１と同様に行った。
　（４）電気泳動による純度評価
　実施例１と同様に行った。その結果を図５のレーン３に示した。
　実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことが確認された。
　以上の結果を表１にまとめた。
　＜実施例９＞
　（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
　実施例１と同じ組成の溶液を調製した。
　（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
　ホモジェネートに６０μＬのｐ－ブロモアニソールを加える代わりに、１００μＬの１－ブロモ－２，４，－ジメトキシベンゼンを加え、これ以外は実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
　（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮－酵素処理なし－
　実施例１と同様に行った。
　（４）電気泳動による純度評価
　実施例１と同様に行った。その結果を図５のレーン４に示した。
　実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことが確認された。
　以上の結果を表１にまとめた。
　＜実施例１０＞
　（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
　実施例１と同じ組成の溶液を調製した。
　（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
　ホモジェネートに６０μＬのｐ－ブロモアニソールを加える代わりに、１００μＬの４－フルオロアニソールを加え、これ以外は実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
　（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮－酵素処理なし－
　実施例１と同様に行った。
　（４）電気泳動による純度評価
　実施例１と同様に行った。その結果を図５のレーン５に示した。
　実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことが確認された。
　以上の結果を表２にまとめた。
　＜実施例１１＞
　（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
　実施例１と同じ組成の溶液を調製した。
　（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
　ホモジェネートに６０μＬのｐ－ブロモアニソールを加える代わりに、１００μＬの４－ブロモトルエンを加え、これ以外は実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
　（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮－酵素処理なし－
　実施例１と同様に行った。
　（４）電気泳動による純度評価
　実施例１と同様に行った。その結果を図５のレーン６に示した
　実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことが確認された。
　以上の結果を表２にまとめた。
　＜実施例１２＞
　（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
　実施例１と同じ組成の溶液を調製した。
　（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
　ホモジェネートに６０μＬのｐ－ブロモアニソールを加える代わりに、１００μＬの４－ブロモ酪酸エチルを加え、これ以外は実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
　（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮－酵素処理なし－
　実施例１と同様に行った。
　（４）電気泳動による純度評価
　実施例１と同様に行った。その結果を図５のレーン７に示した。
　実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことが確認された。
　以上の結果を表２にまとめた。
　＜実施例１３＞
　（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
　実施例１で調製した溶液に塩酸を加えて、溶液のｐＨを４．２に調整した溶液を調製した。
　（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
　実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
　（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮－酵素処理なし－
　実施例１と同様に行った。
　（４）電気泳動による純度評価
　実施例１と同様に行った。その結果を図６のレーン１に示した。
　溶液のｐＨが４．２においても実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことがわかった。
　以上の結果を表２にまとめた。
　＜比較例３＞
　（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
　比較例１で調製した溶液に塩酸を加えて、溶液のｐＨを３．６に調整した溶液を調製した。
　（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
　（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮－酵素処理なし－
　実施例１と同様に行った。
　（４）電気泳動による純度評価
　実施例１と同様に行った。その結果を図６のレーン２に示した比較例１と同様の３本のピークが確認された。このことから、フェノール濃度が５０容量％の溶液を用いた場合は、ｐＨを３．６としてもＤＮＡ断片が混入していることが確認された。
　以上の結果を表３にまとめた。
　＜実施例１４＞
　（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
　実施例１と同じ組成の溶液を調製した。
　（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
　実施例１の３００μＬの血清の代わりに、生物試料としてＰＢＳ３００μＬに懸濁した培養細胞（ＨＥＫ２９３細胞）を使用した以外は、実施例１と同様に行った。
　（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮－酵素処理なし－
　水層に加えるエタノール量を１．５倍容量ではなく、１．２５倍容量にした以外は、実施例１と同様に行った。
　（３ｂ）水層からのＲＮＡの精製、濃縮－ＲＮａｓｅ処理有り－
　水層に加えるエタノール量を１．５倍容量ではなく、１．２５倍容量にした以外は、実施例１と同様に行った。
　（４）電気泳動による純度評価
　使用するキットを「Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ６０００ピコキット」の代わりに、「Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ６０００ナノキット」（型番５０６７－１５１１）（アジレント・テクノロジー社製）を用いた以外は実施例１と同様に行った。その結果を図７に示した。
　（３ａ）の酵素処理なしサンプルでは、１８Ｓ、２８ＳリボソームＲＮＡがほとんど分解されることなく（ＲＩＮ値：２．３）抽出されていることが確認された（レーン１）。このときの核酸量は、７９ｎｇ／μＬと算出された。また、（３ｂ）のＲＮａｓｅで処理したサンプルでの結果、実施例１と同様ピークは全く検出されなかった（レーン２）。このときの核酸量は、４ｎｇ／μＬと算出された。また、サンプルを何も流さないときの検出系のノイズを確認する（レーン３）と、このときの核酸量は２ｎｇ／μＬであったことから、レーン２の核酸量はノイズであると考えられた。以上のことから、抽出された核酸はすべてＲＮＡであったことが確認された。
　以上の結果を表２にまとめた。
　＜実施例１５＞
　（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
　溶液の各成分の終濃度が以下になるように、それぞれを混合してＲＮＡ抽出用の溶液を調製した。すなわち、実施例１と同じ組成の溶液９００μＬに対しさらに６０μＬのｐ－ブロモアニソールを加えて溶液を調製した。
・５８容量％フェノール
・５容量％グリセロール
・０．８Ｍチオシアン酸グアニジニウム（水溶液にて混合）
・０．４Ｍチオシアン酸アンモニウム（水溶液にて混合）
・０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（水溶液にて混合）、ｐＨが５になるように調整
・上記の全量１００％に対し６．６容量％のｐ－ブロモアニソール
　（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
　上記（１）で調製した溶液９００μＬと血清３００μＬをボルテックスで混和し、ホモジナイズした。室温で１２，０００ｘＧで１０分間遠心した。遠心により、ＲＮＡを含有する水層と、ＤＮＡ及びタンパク質を含有する有機層と中間層が形成された。このうち、水層３５０μＬを別のチューブに分離した。
　（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮－酵素処理なし－
　実施例１と同様に行った。
　（３ｂ）水層からのＲＮＡの精製、濃縮－ＲＮａｓｅ処理有り－
　実施例１と同様に行った。
　（４）電気泳動による純度評価
　実施例１と同様に行った。その結果を図８のレーン１、３、５に示した。
　実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことがわかった（レーン１）。ＲＮａｓｅ処理有り（レーン３；ＲＮａｓｅ（＋））ではＢＬＡＮＫ（レーン５）と同レベルまで減少していることから、抽出された核酸がＲＮＡのみであることが確認できた。
　以上の結果を表２にまとめた。
　＜実施例１６＞
　（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
　溶液の各成分の終濃度が以下になるように、それぞれを混合してＲＮＡ抽出用の溶液を調製した。すなわち、実施例１と同じ組成の溶液９００μＬに対しさらに９０μＬのクロロホルムを加えて溶液を調製した。
・５８容量％フェノール
・５容量％グリセロール
・０．８Ｍチオシアン酸グアニジニウム（水溶液にて混合）
・０．４Ｍチオシアン酸アンモニウム（水溶液にて混合）
・０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（水溶液にて混合）、ｐＨが５になるように調整
・上記の全量１００％に対し１０容量％クロロホルム
　（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
　上記（１）で調製した溶液９００μＬと血清３００μＬをボルテックスで混和し、ホモジナイズした。室温で１２，０００ｘＧで１０分間遠心した。遠心により、ＲＮＡを含有する水層と、ＤＮＡ及びタンパク質を含有する有機層と中間層が形成された。このうち、水層３５０μＬを別のチューブに分離した。
　（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮－酵素処理なし－
　実施例１と同様に行った。
　（３ｂ）水層からのＲＮＡの精製、濃縮－ＲＮａｓｅ処理有り－
　実施例１と同様に行った。
　（４）電気泳動による純度評価
　実施例１と同様に行った。その結果を図８のレーン２、４、５に示した。
　実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことがわかった（レーン２）。ＲＮａｓｅ処理有り（レーン４；ＲＮａｓｅ（＋））ではＢＬＡＮＫ（レーン５）と同レベルまで減少していることから、抽出された核酸がＲＮＡのみであることが確認できた。
　以上の結果を表２にまとめた。
　＜比較例４＞
　（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
　フェノール濃度が５５容量％である以外は比較例３と同じ組成の溶液を調製した。
　（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
　実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
　（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮－酵素処理なし－
　実施例１と同様に行った。
　（３ｂ）水層からのＲＮＡの精製、濃縮－ＲＮａｓｅ処理有り－
　実施例１と同様に行った。
　（４）電気泳動による純度評価
　実施例１と同様に行った。その結果を図９に示した。
　（３ａ）の酵素処理なしサンプルでは、実施例１と比較してややブロードなピークが検出され（レーン１）、また（３ｂ）のＲＮａｓｅ処理したサンプルにおいてもピークが検出された（レーン２）。ＲＮａｓｅ処理有り（ＲＮａｓｅ（＋））においてもＢＬＡＮＫ（レーン２）より大きなピークが得られていることから、ＲＮＡ以外の核酸（ＤＮＡ）の混入が確認できた。
　以上の結果を表３にまとめた。
　＜実施例１７＞
　（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
　溶液の終濃度は、ｐＨ４とし、これ以外は実施例１と同じ組成になるように溶液を調製した。
　（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
　実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
　（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮－酵素処理なし－
　実施例１と同様に行った。
　（３ｂ）水層からのＲＮＡの精製、濃縮－ＲＮａｓｅ処理有り－
　実施例１と同様に行った。
　（４）電気泳動による純度評価
　実施例１と同様に行った。その結果を図１０（レーン１、２、５）に示した。
　実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことが確認された（レーン１）。ＲＮａｓｅ処理有り（レーン２；ＲＮａｓｅ（＋））ではＢＬＡＮＫ（レーン５）と同レベルまで減少していることから、抽出された核酸がＲＮＡのみであることが確認できた。
　以上の結果を表２にまとめた。
　＜実施例１８＞
　（１）ＲＮＡ抽出用溶液の調製
　溶液の終濃度は、ｐＨ６とし、これ以外は実施例１と同じ組成になるように溶液を調製した。
　（２）生物試料からのＲＮＡ抽出
　実施例１と同様に生物試料として血清を用いて行った。
　（３ａ）水層のＲＮＡの精製、濃縮－酵素処理なし－
　実施例１と同様に行った。
　（３ｂ）水層からのＲＮＡの精製、濃縮－ＲＮａｓｅ処理有り－
　実施例１と同様に行った。
　（４）電気泳動による純度評価
　実施例１と同様に行った。その結果を図１０（レーン３、４、５）に示した。
　実施例１と同様のピークが検出され、ＲＮＡのみが純度高く抽出されたことが確認された（レーン３）。ＲＮａｓｅ処理有り（レーン４；ＲＮａｓｅ（＋））ではＢＬＡＮＫ（レーン５）と同レベルまで減少していることから、抽出された核酸がＲＮＡのみであることが確認できた。
　以上の結果を表２にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003

Claims (9)

  1. 　ＲＮＡと、少なくともＤＮＡを含む生物試料からＲＮＡを抽出するための溶液であって、
    （ａ）溶液の総量に対して５０容量％超過のフェノール、
    （ｂ）溶液の総量に対して３～１０容量％の多価アルコール、
    （ｃ）溶液の総量に対して０．５～２．０Ｍ濃度のグアニジニウム塩、
    （ｄ）溶液の総量に対して０．１～０．５Ｍ濃度のチオシアン酸塩、及び
    （ｅ）溶液のｐＨを４～６に維持するための緩衝剤、
    を含む溶液。
  2. 　フェノール濃度が、溶液の総量に対して５５～６５容量％である、請求項１に記載の溶液。
  3. 　水層を分離するための有機溶媒をさらに含む、請求項１又は２に記載の溶液。
  4. 　生物試料が培養細胞の培養液である、請求項１～３のいずれか１項に記載の溶液。
  5. 　生物試料が生物の体液成分である、請求項１～３のいずれか１項に記載の溶液。
  6. 　生物試料が生物の血液成分である、請求項１～３のいずれか１項に記載の溶液。
  7. 　ＲＮＡと少なくともＤＮＡを含む生物試料を、
    （ａ）溶液の総量に対して５０容量％超過のフェノール、
    （ｂ）溶液の総量に対して３～１０容量％の多価アルコール、
    （ｃ）溶液の総量に対して０．５～２．０Ｍ濃度のグアニジニウム塩、
    （ｄ）溶液の総量に対して０．１～０．５Ｍ濃度のチオシアン酸塩、及び
    （ｅ）溶液のｐＨを４～６に維持するための緩衝剤、
    を含む溶液と共にホモジェナイズする工程と、
    　得られたホモジェネートを、水層を分離するための有機溶媒と混合する工程と、
    　得られた混合物を遠心分離する工程と、
    　遠心分離により生成した、ＲＮＡ含有水層を回収する工程と、
    を含む、前記生物試料からＲＮＡを抽出する方法。
  8. 　ＲＮＡと少なくともＤＮＡを含む生物試料を、
    （ａ）溶液の総量に対して５０容量％超過のフェノール、
    （ｂ）溶液の総量に対して３～１０容量％の多価アルコール、
    （ｃ）溶液の総量に対して０．５～２．０Ｍ濃度のグアニジニウム塩、
    （ｄ）溶液の総量に対して０．１～０．５Ｍ濃度のチオシアン酸塩、及び
    （ｅ）溶液のｐＨを４～６に維持するための緩衝剤、
    （ｆ）水層を分離するための有機溶媒、
    を含む溶液と共にホモジェナイズする工程と、
    　得られたホモジェネートを遠心分離する工程と、
    　遠心分離により生成した、ＲＮＡ含有水層を回収する工程と、
    を含む、前記生物試料からＲＮＡを抽出する方法。
  9. 　フェノール濃度が、（ａ）～（ｅ）の溶液の総量に対して５５～６５容量％である、請求項７又は８に記載の方法。
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