WO2012141471A2 - 역분화-증진제를 이용한 역분화 만능 줄기세포의 제조방법 - Google Patents

역분화-증진제를 이용한 역분화 만능 줄기세포의 제조방법 Download PDF

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing pluripotent stem cells, and more particularly, protein kinase C inhibitor, histone deacetylase inhibitor, and / or bone formation protein pathway blocker (
  • the present invention relates to a method for producing or preparing dedifferentiated pluripotent stem cells with high efficiency by using a bone morphogenetic protein (BMP) pathway blocker) as a dedifferentiation-enhancer.
  • BMP bone morphogenetic protein
  • the production method according to the present invention includes a method for preparing a differentiated pluripotent stem cells under xenopathogen-free and feeder cell-free conditions.
  • iPS cells refer to cells having pluripotency obtained by dedifferentiation from differentiated cells (eg, somatic cells), and can be differentiated into various organ cells.
  • iPS cells can be obtained by reprogramming cells differentiated by dedifferentiation inducers, thus enabling the generation of patient immunocompatible pluripotent cell lines without somatic cell transfer.
  • iPS cells can be derived from the cells of the patient to avoid immune rejection in clinical applications.
  • iPS cells do not use eggs or embryos, so there is no bioethical controversy or religious criticism.
  • Takahashi, K., and Yamanaka, S. et al. Announced the formation of iPS cells by dedifferentiation using mouse cells (Takahashi, K., and Yamanaka, S. (2006) .Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell 126 , 663-676), Takahashi, K. et al. and Yu, J. et al. reported the formation of iPS cells by dedifferentiation in human cells. (Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., and Yamanaka, S.
  • iPS cells by reprogramming, for example, according to Takahashi, K. et al (2007) Cell 131 , 861-872, from 5 x 10 4 human dermal fibroblasts Only about 10 iPS cells have the problem of low efficiency obtained. In addition, it requires the use of xenopathogens such as fetal bovine serum and the use of animal-derived feeder cells in the process of dedifferentiation. There are limitations in terms of safety in clinical applications.
  • the present inventors conducted various studies to develop a method for producing iPS cells with high efficiency. As a result, it has been found that certain substances, such as protein kinase C inhibitors, histone deacetylase inhibitors, and / or bone morphogenetic protein pathway blockers are active in promoting somatic differentiation of cells so that iPS cells can be produced with high efficiency. It was. In addition, when the protein kinase C inhibitor, histone deacetylase inhibitor, and / or bone morphogenetic protein pathway blocker are used, they are reversed under xenopathogen-free and feeder cell-free conditions. It has been discovered that differentiating pluripotent stem cells can be prepared.
  • certain substances such as protein kinase C inhibitors, histone deacetylase inhibitors, and / or bone morphogenetic protein pathway blockers are active in promoting somatic differentiation of cells so that iPS cells can be produced with high efficiency. It was.
  • human-derived somatic cells into which a gene encoding a reverse differentiation inducing factor has been introduced are selected from the group consisting of protein kinase C inhibitors, histone deacetylase inhibitors, and bone forming protein pathway blockers. Culturing in a medium comprising at least one selected retrodifferentiation-enhancer; And (b) isolating embryonic stem cell-like colonies from the culture obtained from step (a).
  • the dedifferentiation-enhancer is particularly preferably a mixture of a histone deacetylase inhibitor and a bone morphogenetic protein pathway blocker, and the concentration of the dedifferentiation-enhancer is 0.001 to 1000 ⁇ M. It may be in the range of.
  • the culture of step (a) is (i) a medium obtained by adding the reverse differentiation-enhancer to a medium used for introduction of a gene encoding a reverse differentiation inducing factor ("first medium") and performing a first incubation for 3-6 days in, (ii) in the presence of a substrate protein (extracellular matrix protein) other cells, and performing a secondary culture for 1.5 ⁇ 3 days in the first medium, and ( iii) performing a third culture for 15 to 30 days in a medium obtained by adding the anti-differentiation-enhancer to the culture medium for human embryonic stem cell culture (“second medium”).
  • first medium a medium used for introduction of a gene encoding a reverse differentiation inducing factor
  • first medium a medium used for introduction of a gene encoding a reverse differentiation inducing factor
  • second medium a medium obtained by adding the anti-differentiation-enhancer to the culture medium for human embryonic stem cell culture
  • the medium used for introduction of the gene encoding the reverse differentiation inducing factor and / or the medium for culturing human embryonic stem cells may be a non-heterologous infectious agent medium, and the cultures of (i) to (iii) may be free of It may preferably be carried out under feeder cell-free conditions.
  • the method for producing pluripotent stem cells according to the present invention uses protein kinase C inhibitors, histone deacetylase inhibitors, and / or bone morphogenetic protein pathway blockers as dedifferentiation-enhancers, thereby providing pluripotent pluripotent stem cells with high efficiency. It can manufacture. In addition, when the de-differentiation enhancer is used, the whole process of preparing de-differentiated pluripotent stem cells may be performed under xenopathogen-free and feeder cell-free conditions. Therefore, the method for producing pluripotent stem cells according to the present invention can produce pluripotent pluripotent stem cells suitable for clinical use, that is, have high safety.
  • DM bone morphogenetic protein pathway blockers
  • FIG. 2 shows media treated with a combination of protein kinase C inhibitor (Go6983, Go) and histone deacetylase inhibitors (Tricostatin A, TSA);
  • a combination of protein kinase C inhibitor Go6983, Go
  • histone deacetylase inhibitors Tricostatin A, TSA
  • the resulting human dedifferentiated pluripotent stem cells were immunostained using a Tra1-60 antibody which is an undifferentiated label.
  • FIG. 3 shows media treated with a combination of protein kinase C inhibitor (Go6983, Go) and histone deacetylase inhibitors (Tricostatin A, TSA); Or when using a medium treated with protein kinase C inhibitor (Go6983, Go), the expression of the undifferentiated marker markers alkaline phosphate, Oct4, SSEA4, Tra1-60, and Sox2 is measured.
  • induced pluripotent stem cells iPS cells
  • reprogrammed pluripotent stem cells refers to pluripotency by reprogramming (i.e., de-differentiating) differentiated cells. refers to cells induced to have pluripotency).
  • the dedifferentiated pluripotent stem cells may be variously differentiated into organ cells such as brain and heart.
  • Human-derived somatic cells into which a gene encoding a reverse differentiation inducing factor has been introduced are selected from the group consisting of protein kinase C inhibitors, histone deacetylase inhibitors, and bone forming protein pathway blockers. Culturing in a medium comprising a differentiation-enhancing agent; And (b) isolating embryonic stem cell-like colonies from the culture obtained from step (a).
  • the dedifferentiation inducer includes all factors having the function of inducing reprogramming and preferably includes a combination of dedifferentiation inducers known to be involved in reprogramming.
  • the reverse differentiation inducer may be selected from the group consisting of Sox2, Oct3 / 4, Nanog, Klf4, Lin28, and Myc, which are known to induce reprogramming.
  • the amino acid sequence and base sequence of Sox2, Oct3 / 4, Nanog, Klf4, Lin28, and c-Myc are known from GenBank et al.
  • Human-derived somatic cells into which the gene encoding the dedifferentiation inducing factor has been introduced are known methods, for example, Takahashi, K. et al. (Takahashi, K., et al., (2007) Cell 131 , 861- 872) and / or Yu, J. et al. (Yu, J., et al., (2007). Science, New York, NY). That is, somatic cells isolated from the human body are inoculated in a medium (eg, DMEM medium) containing fetal bovine serum and antibiotics (penicillin / streptomycin), and retrograde differentiation-inducing factors using retroviruses. The gene encoding the gene may be transferred to the human-derived somatic cell.
  • a medium eg, DMEM medium
  • antibiotics penicillin / streptomycin
  • Delivery of the gene encoding the reverse differentiation inducing factor may be carried out by incubation for one day, but generally not limited.
  • the transfer of the gene encoding the differentiation inducing factor is finally differentiated to be performed by using a xenopathogen-free medium without xenopathogen such as fetal bovine serum Preferred in terms of clinical-applicability of pluripotent stem cells. Therefore, the medium used for introduction of the gene encoding the differentiation inducing factor is preferably to use a xenopathogen-free medium, for example MesenGro TM hMSC Medium (StemRD, USA) Can be used.
  • the protein kinase C inhibitor includes all substances having protein kinase C inhibitory activity.
  • the protein kinase C inhibitor is 3- [1- [3- (dimethylamino) propyl] -5-methoxy-1H-indol-3-yl] -4- (1H-indol-3-yl) -1H-pyrrole -2,5-dione (3- [1- [3- (dimethylamino) propyl] -5-methoxy-1H-indol-3-yl] -4- (1H-indol-3-yl) -1H-pyrrole- 2,5-dione, Go6983); 3- (1H-indol-3-yl) -4- [2- (4-methylpiperazin-1-yl) quinazolin-4-yl] pyrrole-2,5-dione (3- (1H-indol- 3-yl)
  • the histone deacetylase inhibitors are N-hydroxy-3- (3-phenylsulfamoylphenyl) acrylamide (N-Hydroxy-3- (3-phenylsulfamoylphenyl) acrylamide, Belinostat, PXD101, PX105684 ); 7- (4- (3-ethynylphenylamino) -7-methoxyquinazolin-6-yloxy) -N-hydroxyheptanamide (7- (4- (3-ethynylphenylamino) -7-methoxyquinazolin-6 -yloxy) -N-hydroxyheptanamide, CUDC-101); [R- (E, E)]-7- [4- (dimethylamino) phenyl] -N-hydroxy-4,6-dimethyl-7-oxo-2,4-heptadieneamide ([R- (E , E)]-7- [4- (dimethyl)
  • the bone morphogenetic protein (BMP) pathway blocker may be noggin; Chordin; Follistatin; And 6- (4- (2-piperidin-1-ylethoxy) phenyl))-3-pyridin-4-ylpyrazolo (1,5-a) pyrimidine (6- (4- (2- piperidin-1-ylethoxy) phenyl))-3-pyridin-4-ylpyrazolo (1,5-a) pyrimidine, dorsomorphin), but is not limited thereto.
  • the pluripotent-differentiating agent is a protein kinase C inhibitor, a histone deacetylase inhibitor, or a bone morphogenetic protein pathway blocker, each alone or in combination of two or more.
  • the combination of a histone deacetylase inhibitor and a bone-forming protein pathway blocker in particular can be used to produce dedifferentiated pluripotent stem cells with high efficiency.
  • the amount of the de-differentiation-enhancing agent, ie, the concentration in the medium may preferably be in the range of 0.001 to 1000 ⁇ M, more preferably 0.01 to 10 ⁇ M. Of course, it may be used beyond the concentration range as necessary.
  • the culture in the presence of said retrodifferentiation-enhancing agent i.e., said culture of step (a) is a medium obtained by adding said retrodifferentiation-enhancing agent to the medium used for the introduction of a gene encoding a desired (i) reversedifferentiation inducing factor ("agent" 1 medium ”) for 3-6 days of primary culture , (ii) in the presence of extracellular matrix protein, secondary culture for 1.5-3 days in said first medium And (iii) performing tertiary culture for 15 to 30 days in a medium obtained by adding the anti-differentiation-enhancer to the culture medium for human embryonic stem cell culture (“second medium”).
  • agent reversedifferentiation inducing factor
  • the primary culture may be performed for 3 to 6 days, for example about 4 days.
  • the medium used for introduction of the gene encoding the differentiation inducing factor is preferably to use a xenopathogen-free medium, for example, may be MesenGro TM hMSC Medium (StemRD, USA) have.
  • Step (ii) is performed using the same medium as the medium used in step (i) in the presence of extracellular protein, and serves to pre-adapt the cells to the subsequent tertiary culture.
  • the extracellular matrix protein may be a coating protein commonly used in cell culture, for example, vitronectin, matrigel (Matrigel, BD Biosciences, USA), cell start (CellStart, Invitrogen, USA), gelatin ( gelatin) can be used without limitation.
  • the secondary culture can be carried out for 1.5 to 3 days, for example about 2 days.
  • the tertiary culture can be carried out for 15-30 days, for example about 18-20 days.
  • the human embryonic stem cell culture medium may be a medium that is commonly used in the maintenance culture of human embryonic stem cells, it is preferable to use a xenopathogen-free medium, for example, knockout And DMEM / F-12 medium containing a genofree serum replacement, glutamax, non-essential amino acids, beta-mercaptoethanol, antibiotics, and basic fibroblast growth factor (bfgf).
  • the basal medium may be a conventional cell culture medium as well as DMEM / F-12 medium, for example, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, GIBCO, USA); MEM (Minimal Essential Medium, GIBCO, USA); BME (Basal Medium Eagle, GIBCO, USA); RPMI 1640 (GIBCO, USA); DMEM / F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10; GIBCO, USA); ⁇ -MEM ( ⁇ -Minimal essential Medium; GIBCO, USA); G-MEM from Glasgow's Minimal Essential Medium, GIBCO, USA; Isocove's Modified Dulbecco's Medium, GIBCO, USA; KnockOut DMEM (GIBCO, USA) and the like.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium, GIBCO, USA
  • MEM Minimal Essential Medium, GIBCO
  • the culture of (i) to (iii) may be particularly preferably performed without using animal-derived support cells, that is, under feeder cell-free conditions.
  • the preparation method of the present invention comprises the step of separating embryonic stem cell-like colonies from the culture obtained from step (a) (ie step (b)).
  • colonies of pluripotent stem cells have a morphologically distinctive shape in which a small, rounded cell with a relatively large nucleus and a small cytoplasm is cultured in culture
  • the ends of the stem cells may be bent with a conventional method such as an alcohol lamp. These can be separated by physical methods using Pasteur pipettes.
  • the retrodifferentiation-enhancer was added to the medium-A to prepare the medium-A1 to the medium-A7, and cultured for 4 days while the medium was exchanged daily with the medium-A1 to the medium-A7 to reverse the differentiation. Induced.
  • Cells obtained from each well by trypsin / EDTA treatment and centrifugation were inoculated into 6 cm culture vessels coated with vitronectin (5 ⁇ g / ml, BD Biosciences, USA) to approximately 5 ⁇ 10 4 cells. Next, the cells were incubated for 2 days with each medium being exchanged for the same daily (ie, medium-A1 to medium-A7).
  • TSA Trichostatin A
  • the group treated with protein kinase C inhibitor, histone deacetylase inhibitor, or BMP pathway inhibitor according to the present invention increased the number of iPS cell colonies by at least two times compared to the control group.
  • the group treated with a histone deacetylase inhibitor (tricostatin A) and a BMP pathway inhibitor (dorsomorphine) simultaneously increased the number of iPS cell colonies by more than 7 times compared to the control group.
  • Example 1 iPS cell colonies in culture medium of Group 5 (Go6983 + TSA) and Group 2 (Go6983) on day 25 were stained using an undifferentiated label, Tra1-60 antibody (Millipore, USA), and also produced. The expression of alkaline differentiation markers, Oct4, SSEA4, Tra1-60, and Sox2, which are undifferentiated marker markers of iPS cell colonies, were measured.
  • the colonies were washed with phosphate buffered saline and then fixed by treating with 4% formaldehyde solution for 10 minutes. This was again washed three times with phosphate buffered saline three times for 10 minutes, and then blocked at room temperature for 1 hour with 10% normal donkey serum solution.
  • the primary antibody mouse Tra1-60 antibody (1: 500, Millipore, USA) was treated at room temperature for 1 hour, washed three times with phosphate buffered saline for 10 minutes, and then the secondary antibody, biotinylated goal anti-mouse IgG antibody ( 1: 100, Vector Laboratory, USA) was added and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • the streptavidin-horseradish peroxydase conjugate (Vector Laboratory, USA) was treated for 30 minutes at room temperature, and then washed three times for 10 minutes with phosphate buffered saline, followed by DAB Peroxidase Substrate Kit (Vector Laboratory, USA).
  • the colonies were washed with phosphate buffered saline in the same manner, and then fixed with 4% formaldehyde solution for 10 minutes, and alkaline phosphatase staining was performed as follows. After washing iPS cell colonies three times for 10 min, 100 ⁇ NBT solution (50 mg / ml nitro blue tetrazolium (Sigma, USA) in a mixed solvent of 70% dimethylformamide and 30% water) and 100 ⁇ XPHOS solution (water 10 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, disodium salt (Sigma, USA) in AP buffer (100 mM Tris pH 8.5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl 2 ) After dilution with 1X, iPS cell colonies were reacted for at least 30 minutes, washed with H 2 O, and observed.
  • 100 ⁇ NBT solution 50 mg / ml nitro blue tetrazolium (
  • immunostaining was performed as follows to measure expression of Oct4, SSEA4, Tra1-60, and Sox2.
  • iPS cell colonies were washed with phosphate buffered saline, and then fixed by treating with 4% formaldehyde solution for 10 minutes.
  • mice anti-Oct4 antibody (Santa Cruz, USA), mouse anti-SSEA4 antibody (Millipore, USA), mouse anti-Tra1-60 antibody (Millipore, USA), mouse anti-Sox2 antibody (Millipore, USA) 1 hour at room temperature, washed three times with phosphate buffered saline for 10 minutes, and then reacted with secondary antibody Alexa-594 goat anti-mouse IgG (1: 200, Invitrogen, USA) for 1 hour at room temperature. After washing three times with phosphate buffered saline three times for 10 minutes, the nuclei were stained using 30 nM 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Invitrogen, USA). Again washed with phosphate buffered saline three times for 10 minutes and observed with a fluorescence microscope.
  • DAPI 6-diamidino-2-phenylindole
  • FIG. 2 The result of staining using an undifferentiated label Tra1-60 antibody (Millipore, USA) is shown in Figure 2, and the undifferentiated marker markers of the iPS cell colonies generated, alkaline phosphatase, Oct4, SSEA4, Tra1-60, and As a result of measuring the expression of Sox2 is shown in FIG. From the results of FIGS. 2 and 3, iPS cells produced according to the present invention showed a positive response to Tra1-60 antibody, and are alkaline microphosphate markers, Oct4, SSEA4, and Tra1-60, which are undifferentiated markers of iPS cells. It can be seen that both, and Sox2 are well expressed.

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Abstract

본 발명은 (a) 역분화 유도 인자를 코딩하는 유전자가 도입된 인간-유래의 체세포를, 프로틴 키나아제 C 저해제, 히스톤 데아세틸라제 저해제, 및 골 형성 단백질 경로 차단제로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 역분화-증진제을 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계; 및 (b) 단계(a)로부터 얻어진 배양물로부터 배아줄기세포-유사 콜로니(embryonic stem cell-like colonies)를 분리하는 단계를 포함하는 역분화 만능 줄기세포(iPS cells)의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 제조방법은 높은 효율로 역분화 만능 줄기세포를 제조할 수 있으며, 또한 무-이종감염물질(xenopathogen-free) 및 무-지지세포(feeder cell-free) 조건하에서 역분화 만능 줄기세포를 제조할 수 있다.

Description

역분화-증진제를 이용한 역분화 만능 줄기세포의 제조방법
본 발명은 역분화 만능 줄기세포의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 프로틴 키나아제 C 저해제(protein kinase C inhibitor), 히스톤 데아세틸라제 저해제(histone deacetylase inhibitor), 및/또는 골 형성 단백질 경로 차단제(bone morphogenetic protein (BMP) pathway blocker)를 역분화-증진제로서 사용하여, 높은 효율로 역분화 만능 줄기세포를 제조(generating or preparing)하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명에 따른 제조방법은 무-이종감염물질(xenopathogen-free) 및 무-지지세포(feeder cell-free) 조건하에서 역분화 만능 줄기세포를 제조하는 방법을 포함한다.
역분화 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPS 세포)는 분화된 세포(예를 들어, 체세포)로부터 역분화되어 얻어진 만능분화능(pluripotency)을 갖는 세포를 지칭하며, 각종 장기 세포로 분화 가능하다. iPS 세포는 역분화 유도인자들에 의해 분화된 세포를 재프로그램화(reprogramming)하여 얻어질 수 있으므로, 체세포 핵치환(somatic cell transfer) 없이 환자 면역 적합성 만능 세포주의 생성이 가능하다. 따라서 iPS 세포는 환자의 세포에서 유래될 수 있어 임상에 적용 시 면역 거부반응을 피할 수 있다. 또한, iPS 세포는 난자나 배아를 사용하지 않기 때문에 생명윤리적 논란이나 종교적 비난이 없는 장점이 있다.
2006년 8월에 Takahashi, K., 및 Yamanaka, S. 등이 생쥐 세포를 이용한 역분화에 의한 iPS 세포의 형성을 최초로 발표(Takahashi, K., and Yamanaka, S. (2006). Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676)한 이래, Takahashi, K. 등 및 Yu, J. 등은 인간세포를 대상으로 역분화에 의한 iPS 세포의 형성을 보고한 바 있다(Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., and Yamanaka, S. (2007). Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131, 861-872; 및 Yu, J., Vodyanik, M.A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J.L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G.A., Ruotti, V., Stewart, R., et al. (2007). Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science, New York, NY). Takahashi, K. 등은 iPS 세포를 얻기 위해서는 Sox2, Oct3/4, 및 Klf4의 역분화 유도인자가 필수적으로 필요하고 또한, 추가적으로 c-Myc이 iPS 세포의 형성을 촉진하는 역할을 하는 것을 밝혀냈다. 또한, Yu, J. 등은 Sox2, Oct3/4, 및 Nanog의 역분화 유도인자가 iPS 세포를 얻기 위해 필수적으로 필요하며, Lin28이 존재하는 경우 iPS 세포의 형성이 증가하는 것을 밝혀냈다.
한편, 종래의 재프로그램화(reprogramming)에 의한 iPS 세포의 제조방법, 예를 들어, Takahashi, K. et al (2007) Cell 131, 861-872 에 따르면, 5 x 104 개의 인간 피부 섬유아세포로부터 약 10 여개의 iPS 세포만이 얻어지는 낮은 효율의 문제점을 가지고 있다. 또한, 소태아혈청(fetal bovine serum) 등의 이종감염물질(xenopathogen)의 사용을 필요로 하며, 역분화 유도 과정에서 동물 유래의 지지세포(feeder cells)의 사용을 필요로 하므로, iPS 세포를 실제 임상에 적용하는데 있어서 안전성 측면에서 한계가 있다.
본 발명자들은 높은 효율로 iPS 세포를 제조할 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 특정 물질 즉, 프로틴 키나아제 C 저해제, 히스톤 데아세틸라제 저해제, 및/또는 골 형성 단백질 경로 차단제가 체세포의 역분화를 증진하는 활성이 있어, 높은 효율로 iPS 세포를 제조할 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 상기 프로틴 키나아제 C 저해제, 히스톤 데아세틸라제 저해제, 및/또는 골 형성 단백질 경로 차단제를 사용할 경우, 무-이종감염물질(xenopathogen-free) 및 무-지지세포(feeder cell-free) 조건하에서 역분화 만능 줄기세포를 제조할 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 프로틴 키나아제 C 저해제, 히스톤 데아세틸라제 저해제, 및/또는 골 형성 단백질 경로 차단제를 역분화-증진제로서 사용하는, iPS 세포의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, (a) 역분화 유도 인자를 코딩하는 유전자가 도입된 인간-유래의 체세포를, 프로틴 키나아제 C 저해제, 히스톤 데아세틸라제 저해제, 및 골 형성 단백질 경로 차단제로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 역분화-증진제을 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계; 및 (b) 단계(a)로부터 얻어진 배양물로부터 배아줄기세포-유사 콜로니를 분리하는 단계를 포함하는 역분화 만능 줄기세포의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 역분화 만능 줄기세포의 제조방법에 있어서, 상기 역분화-증진제는 히스톤 데아세틸라제 저해제 및 골 형성 단백질 경로 차단제의 혼합물이 특히 바람직하며, 상기 역분화-증진제의 농도는 0.001 내지 1000 μM의 범위일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 단계(a)의 상기 배양은 (i) 역분화 유도 인자를 코딩하는 유전자의 도입에 사용된 배지에 상기 역분화-증진제를 가하여 얻어진 배지("제1 배지") 중에서 3∼6 일 동안 1차 배양을 수행하는 단계, (ii) 세포외기질 단백질(extracellular matrix protein)의 존재하에서, 상기 제1 배지 중에서 1.5∼3 일 동안 2차 배양을 수행하는 단계, 및 (iii) 인간 배아줄기세포 배양용 배지에 상기 역분화-증진제를 가하여 얻어진 배지("제2 배지") 중에서 15∼30 일 동안 3차 배양을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 역분화 유도 인자를 코딩하는 유전자의 도입에 사용된 배지 및/또는 상기 인간 배아줄기세포 배양용 배지는 무-이종감염물질 배지일 수 있으며, 상기 (i) 내지 (iii)의 배양이 무-지지세포(feeder cell-free) 조건하에서 바람직하게 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 역분화 만능 줄기세포의 제조방법은 프로틴 키나아제 C 저해제, 히스톤 데아세틸라제 저해제, 및/또는 골 형성 단백질 경로 차단제를 역분화-증진제로서 사용함으로써, 높은 효율로 역분화 만능 줄기세포를 제조할 수 있다. 또한, 상기 역분화 증진제를 사용할 경우, 역분화 만능 줄기세포의 제조과정 전체를 무-이종감염물질(xenopathogen-free) 및 무-지지세포(feeder cell-free) 조건하에서 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 역분화 만능 줄기세포의 제조방법은 임상에 사용하기에 적합한, 즉 우수한 안전성을 갖는 역분화 만능 줄기세포를 높은 효율로 제조할 수 있다.
도 1은 프로틴 키나아제 C 저해제(Go6983, Go), 히스톤 데아세틸라제 저해제(트리코스타틴 에이, TSA), 골 형성 단백질 경로 차단제(도르소몰핀, DM)을 각각 혹은 조합하여 처리된 배지를 사용하였을 때, 생성되는 인간 역분화 만능 줄기세포의 생성효율(10,000 개의 세포당 얻어진 iPS 세포 콜로니의 수)을 평가한 결과이다.
도 2는 프로틴 키나아제 C 저해제(Go6983, Go) 및 히스톤 데아세틸라제 저해제(트리코스타틴 에이, TSA)를 조합하여 처리된 배지; 또는 프로틴 키나아제 C 저해제(Go6983, Go)를 처리한 배지를 사용하였을 때, 생성되는 인간 역분화 만능 줄기세포를 미분화 표지인 Tra1-60 항체를 이용하여 면역염색한 결과이다.
도 3은 프로틴 키나아제 C 저해제(Go6983, Go) 및 히스톤 데아세틸라제 저해제(트리코스타틴 에이, TSA)를 조합하여 처리된 배지; 또는 프로틴 키나아제 C 저해제(Go6983, Go)를 처리한 배지를 사용하였을 때, 미분화 표지 마커인 알칼린 포스파테이즈, Oct4, SSEA4, Tra1-60, 및 Sox2의 발현을 측정한 결과이다.
본 명세서에서, "역분화 만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cells, iPS 세포)"라 함은 "reprogrammed pluripotent stem cells"로도 지칭되며, 분화된 세포를 재프로그램하여(즉, 역분화시켜) 만능분화능(pluripotency)을 갖도록 유도된 세포를 말한다. 상기 역분화 만능 줄기세포는 뇌, 심장 등의 장기 세포로 다양하게 분화될 수 있다.
본 발명은 (a) 역분화 유도 인자를 코딩하는 유전자가 도입된 인간-유래의 체세포를, 프로틴 키나아제 C 저해제, 히스톤 데아세틸라제 저해제, 및 골 형성 단백질 경로 차단제로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 역분화-증진제을 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계; 및 (b) 단계(a)로부터 얻어진 배양물로부터 배아줄기세포-유사 콜로니를 분리하는 단계를 포함하는 역분화 만능 줄기세포의 제조방법을 제공한다.
상기 역분화 유도인자는 재프로그램화를 유도할 수 있는 기능을 갖는 모든 인자들을 포함하며, 바람직하게는 재프로그램화에 관여하는 것으로 알려져 있는 역분화 유도인자의 조합을 포함한다. 예를 들어, 상기 역분화 유도인자는 재프로그램화를 유도하는 것으로 알려져 있는 Sox2, Oct3/4, Nanog, Klf4, Lin28, 및 Myc로 이루어진 군으로부터 2종 이상 선택될 수 있다. 상기 Sox2, Oct3/4, Nanog, Klf4, Lin28, 및 c-Myc의 아미노산 서열 및 염기 서열은 GenBank 등에 공지되어 있다.
상기 역분화 유도 인자를 코딩하는 유전자가 도입된 인간-유래의 체세포는 공지의 방법, 예를 들어 Takahashi, K. 등의 방법(Takahashi, K., et al., (2007) Cell 131, 861-872) 및/또는 Yu, J. 등의 방법(Yu, J., et al., (2007). Science, New York, NY)에 따라 얻어질 수 있다. 즉, 인체로부터 분리된 체세포를 소태아혈청(fetal bovine serum) 및 항생물질(페니실린/스트렙토마이신)을 함유하는 배지(예를 들어, DMEM 배지) 중에 접종하고, 레트로바이러스를 이용하여 역분화 유도 인자를 코딩하는 유전자를 상기 인간-유래의 체세포에 전달할 수 있다. 상기 역분화 유도 인자를 코딩하는 유전자의 전달은 통상 1일 동안 배양함으로써 수행될 수 있으나, 크게 제한되는 것은 아니다. 한편, 상기 역분화 유도 인자를 코딩하는 유전자의 전달은 소태아혈청 등과 같은 이종감염물질(xenopathogen)이 없는 무-이종감염물질 배지(xenopathogen-free medium)를 사용하여 수행되는 것이 최종적으로 얻어지는 역분화 만능 줄기세포의 임상-적용성 측면에서 바람직하다. 따라서, 상기 역분화 유도 인자를 코딩하는 유전자의 도입에 사용된 배지는 무-이종감염물질 배지(xenopathogen-free medium)를 사용하는 것이 바람직하며, 예를 들어 MesenGroTMhMSC Medium (StemRD, USA)를 사용할 수 있다.
본 발명의 역분화 만능 줄기세포의 제조방법에 있어서, 상기 프로틴 키나아제 C 저해제(protein kinase C inhibitor)는 프로틴 키나아제 C 저해 활성을 갖는 모든 물질을 포함한다. 상기 프로틴 키나아제 C 저해제는 3-[1-[3-(디메틸아미노)프로필]-5-메톡시-1H-인돌-3-일]-4-(1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온(3-[1-[3-(dimethylamino)propyl]-5-methoxy-1H-indol-3-yl]-4-(1H-indol-3-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione, Go6983); 3-(1H-인돌-3-일)-4-[2-(4-메틸피페라진-1-일)퀴나졸린-4-일]피롤-2,5-디온(3-(1H-indol-3-yl)-4-[2-(4-methylpiperazin-1-yl)quinazolin-4-yl]pyrrole-2,5-dione, Sotrastaurin, AEB 071); 3-{1-[3-(아미디노티오)프로필]-1H-인돌-3-일}-3-(1-메틸-1H-인돌-3-일)말레이미드 메탄 술포네이트(3-{1-[3-(amidinothio)propyl]-1H-indol-3-yl}-3-(1-methyl-1H-indol-3-yl)maleimide methane sulfonate, Ro-31-8220); 13-히드록시옥타데카디에논산(13-hydroxyoctadecadienoic acid); 2-[1-(3-디메틸아미노프로필)인돌-3-일]-3-(인돌-3-일) 말레이미드(2-[1-(3-dimethylaminopropyl)indol-3-yl]-3-(indol-3-yl) maleimide, GF 109203X, Go6850); 13-((디메틸아미노)메틸)-10,11,14,15-테트라히드로-4,9:16,21-디메테노-1H,13H-디벤조(E,K)피롤(3,4-H)(1,4,13)옥사디아자시클로헥사데센-1,3(2H)-디온(13-((dimethylamino)methyl)-10,11,14,15-tetrahydro-4,9:16,21-dimetheno-1H,13H-dibenzo(E,K)pyrrolo(3,4-H)(1,4,13)oxadiazacyclohexadecene-1,3(2H)-dione, LY-333531, Ruboxistaurin, PKC beta inhinitor); 2,6-디아미노-N-([1-(1-옥소트리데실)-2-피페리딘일]메틸)헥산아미드(2,6-diamino-N-([1-(1-oxotridecyl)-2-piperidinyl]methyl)hexanamide, NPC 15437); 및 4'-데메틸아미노-4'-히드록시스타우로스포린(4'-demethylamino-4'-hydroxystaurosporine, RK-286C)으로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 히스톤 데아세틸라제 저해제(histone deacetylase inhibitor)는 N-히드록시-3-(3-페닐설파모일페닐)아크릴아미드(N-Hydroxy-3-(3-phenylsulfamoylphenyl)acrylamide, Belinostat, PXD101, PX105684); 7-(4-(3-에티닐페닐아미노)-7-메톡시퀴나졸린-6-일옥시)-N-히드록시헵탄아미드(7-(4-(3-ethynylphenylamino)-7-methoxyquinazolin-6-yloxy)-N-hydroxyheptanamide, CUDC-101); [R-(E,E)]-7-[4-(디메틸아미노)페닐]-N-히드록시-4,6-디메틸-7-옥소-2,4-헵타디엔아미드([R-(E,E)]-7-[4-(dimethylamino)phenyl]-N-hydroxy-4,6-dimethyl-7-oxo-2,4-heptadienamide, Trichostatin A, TSA); N-히드록시-N'-페닐옥탄디아미드(N-hydroxy-N'-phenyloctanediamide, Vorinostat, SAHA, Zolinza, MK-0683); 발프로익산 또는 그의 염(valproic acid or its salt); 소듐 부티레이트(Sodium butyrate); 3-(2-부틸-1-(2-(디에틸아미노)에틸)-1H-벤조[d]이미다졸-5-일)-N-히드록시아크릴아미드(3-(2-butyl-1-(2-(diethylamino)ethyl)-1H-benzo[d]imidazol-5-yl)-N-hydroxyacrylamide, SB939); N-히드록시-N'-3-피리디닐옥탄디아미드(N-hydroxy-N'-3-pyridinyloctanediamide, Pyroxamide, NSC 696085); 3-(디메틸아미노메틸)-N-[2-[4-(히드록시카바모일)페녹시]에틸]-1-벤조퓨란-2-카르복사미드(3-(dimethylaminomethyl)-N-[2-[4-(hydroxycarbamoyl)phenoxy]ethyl]-1-benzofuran-2-carboxamide, PCI-24781, CRA-02478); N-[[4-[[(2-아미노페닐)아미노]카르보닐]페닐]메틸]카르바믹산 3-피리디닐메틸 에스테르(N-[[4-[[(2-aminophenyl)amino]carbonyl]phenyl]methyl]carbamic acid 3-pyridinylmethyl ester, Entinostat, MS-275, SNDX-275, MS-27-275); N-(2-아미노페닐)-4-[[(4-피리딘-3-일피리미딘-2-일)아미노]메틸]벤젠아미드(N-(2-aminophenyl)-4-[[(4-pyridin-3-ylpyrimidin-2-yl)amino]methyl]benzamide, Mocetinostat, MGCD0103); 3-[5-(3-(3-플루오로페닐)-3-옥소프로펜-1-일)-1-메틸-1H-피롤-2-일]-N-히드록시-2-프로펜아미드(3-[5-(3-(3-Fluorophenyl)-3-oxopropen-1-yl)-1-methyl-1H-pyrrol-2-yl]-N-hydroxy-2-propenamide, MC1568); N-히드록시-3-[4-[2-(2-메틸-1H-인돌-3-일)에틸아미노메틸]페닐]-2(E)-프로펜아미드(N-hydroxy-3-[4-[2-(2-methyl-1H-indol-3-yl)ethylaminomethyl]phenyl]-2(E)-propenamide, Panobinostat, LBH-589, NVP-LBH589, LBH589); 3-[4-[N-(2-히드록시에틸)-N-[2-(1H-indol-3-일)에틸]아미노메틸]페닐]-2(E)-프로페노히드록사믹산(3-[4-[N-(2-hydroxyethyl)-N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]aminomethyl]phenyl]-2(E)-propenohydroxamic acid, Dacinostat, LAQ824, NVP-LAQ824); N-히드록시-2-(4-((((1-메틸-1H-인돌-3-일)메틸)아미노)메틸)피페리딘-1-일)피리미딘-5-카르복사미드(N-hydroxy-2-(4-((((1-methyl-1H-indol-3-yl)methyl)amino)methyl)piperidin-1-yl)pyrimidine-5-carboxamide, JNJ-26481585); {6-[(디에틸아미노)메틸]나프탈렌-2-일}메틸 [4-(히드록시카르바모일)페닐]카르바메이트({6-[(diethylamino)methyl]naphthalen-2-yl}methyl [4-(hydroxycarbamoyl)phenyl]carbamate, Givinostat, Gavinostat, ITF2357, ITF 2357); 및 4-(4-클로로-2-메틸페녹시)-N-히드록시부탄아미드(4-(4-Chloro-2-methylphenoxy)-N-hydroxybutanamide, Droxinostat)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 골 형성 단백질 경로 차단제제(bone morphogenetic protein (BMP) pathway blocker)는 노긴(noggin); 코르딘(chordin); 폴리스타틴(follistatin); 및 6-(4-(2-피페리딘-1-일에톡시)페닐))-3-피리딘-4-일피라졸로(1,5-a)피리미딘(6-(4-(2-piperidin-1-ylethoxy)phenyl))-3-pyridin-4-ylpyrazolo(1,5-a)pyrimidine, dorsomorphin)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 역분화 만능 줄기세포의 제조방법에 있어서, 상기 역분화-증진제는 프로틴 키나아제 C 저해제, 히스톤 데아세틸라제 저해제, 골 형성 단백질 경로 차단제를 각각 단독으로 사용하거나, 혹은 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있으며, 특히 바람직하게는 히스톤 데아세틸라제 저해제 및 골 형성 단백질 경로 차단제를 조합하여 사용하는 것이 높은 효율로 역분화 만능 줄기세포를 제조할 수 있다.
상기 역분화-증진제의 사용량 즉, 배지 중의 농도는 바람직하게는 0.001 내지 1000 μM, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 10 μM의 범위일 수 있다. 물론, 필요에 따라 상기 농도 범위를 초과하여 사용될 수도 있다.
상기 역분화-증진제 존재하에서의 배양, 즉 단계(a)의 상기 배양은 바람직하는 (i) 역분화 유도 인자를 코딩하는 유전자의 도입에 사용된 배지에 상기 역분화-증진제를 가하여 얻어진 배지("제1 배지") 중에서 3∼6 일 동안 1차 배양을 수행하는 단계, (ii) 세포외기질 단백질(extracellular matrix protein)의 존재하에서, 상기 제1 배지 중에서 1.5∼3 일 동안 2차 배양을 수행하는 단계, 및 (iii) 인간 배아줄기세포 배양용 배지에 상기 역분화-증진제를 가하여 얻어진 배지("제2 배지") 중에서 15∼30 일 동안 3차 배양을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 단계(i)에서, 상기 1차 배양은 3∼6 일 동안, 예를 들어 약 4일 동안 수행될 수 있다. 상기 역분화 유도 인자를 코딩하는 유전자의 도입에 사용된 배지는 무-이종감염물질 배지(xenopathogen-free medium)를 사용하는 것이 바람직하며, 예를 들어, MesenGroTMhMSC Medium (StemRD, USA)일 수 있다.
상기 단계(ii)는 세포외기질 단백질(extracellular protein)의 존재하에서 단계(i)에서 사용된 배지와 동일한 배지를 사용하여 수행하는 단계로서, 이어지는 3차 배양에 세포를 미리 적응시키는 역할을 한다. 상기 세포외기질 단백질로는 세포 배양에 통상적으로 사용되는 코팅용 단백질, 예를 들어 비트로넥틴(vitronectin), 매트리젤(Matrigel, BD Biosciences, USA), 셀스타트(CellStart, Invitrogen, USA), 젤라틴(gelatin) 등을 제한없이 사용할 수 있다. 상기 2차 배양은 1.5∼3 일 동안, 예를 들어 약 2일 동안 수행될 수 있다.
상기 단계(iii)에서, 상기 3차 배양은 15∼30 일 동안, 예를 들어 약 18∼20일 동안 수행될 수 있다. 상기 인간 배아줄기세포 배양용 배지는 인간 배아줄기세포의 유지배양시 통상적으로 사용되는 배지일 수 있으나, 무-이종감염물질 배지(xenopathogen-free medium)를 사용하는 것이 바람직하며, 예를 들어 넉아웃 제노프리 혈청 대체물, 글루타맥스, 비필수 아미노산, 베타-머캅토에탄올, 항생제, 및 bfgf(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 DMEM/F-12 배지일 수 있다. 상기 기본 배지(basal medium)는 DMEM/F-12 배지 뿐만 아니라 통상의 세포배양용 배지일 수 있으며, 예를 들면, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, GIBCO, USA); MEM (Minimal Essential Medium, GIBCO, USA); BME (Basal Medium Eagle, GIBCO, USA); RPMI 1640 (GIBCO, USA); DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10; GIBCO, USA); α-MEM(α-Minimal essential Medium; GIBCO, USA); G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium, GIBCO, USA); IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium, GIBCO, USA); KnockOut DMEM (GIBCO, USA) 등일 수 있다.
상기 (i) 내지 (iii)의 배양은 동물유래의 지지세포를 사용하지 않고, 즉 무-지지세포(feeder cell-free) 조건하에서 특히 바람직하게 수행될 수 있다.
본 발명의 제조방법은 단계(a)로부터 얻어진 배양물로부터 배아줄기세포-유사 콜로니를 분리하는 단계[즉, 단계(b)]를 포함한다.
역분화 만능 줄기세포의 콜로니는 배양물 중에서 핵이 상대적으로 크면서 세포질은 적은 작고 둥근 세포들이 뭉쳐있는 형태의 형태학적으로 구분되는 모양을 가지고 있으므로, 통상의 방법 예를 들어 알콜램프로 끝을 구부린 파스퇴르 파이펫을 이용한 물리적인 방법으로 이들을 분리할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1.
2개의 6 웰 플레이트에 MesenGroTMhMSC Medium (StemRD, USA)(배지-A)를 가하고, 인간 체세포인 지방기질세포(Adipose-derived stromal cell; ADSC)(Lonza, USA)를 한 웰당 1.5x105 cells가 되도록 접종한 후, Takahashi, K. 등의 방법(Takahashi, K. et al (2007) Cell 131, 861-872)에 따라 레트로바이러스를 이용하여 4종의 역분화 유도 인자를 코딩하는 유전자(Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)를 전달하였다(1일 동안 배양). 다음 표 1에 나타낸 바와 같이 역분화-증진제를 배지-A에 첨가하여 배지-A1 내지 배지-A7을 준비하고, 배지-A1 내지 배지-A7로 매일 배지를 교환하면서 4일 동안 배양하여 역분화를 유도하였다.
각 웰에 트립신/EDTA 처리 및 원심분리하여 각 웰로부터 얻어진 세포를, 비트로넥틴(vitronectin)(5 ㎍/ml, BD Biosciences, USA)으로 도포한 6 cm 배양용기에 약 5x104 cells 가 되도록 접종한 다음, 2일 동안 동일한 매일 각각의 배지(즉, 배지-A1 내지 배지-A7)로 교환하면서 배양하였다.
이후, 15% (v/v) 넉아웃 제노프리 혈청 대체물(KnockOut SR XenoFree; GIBCO, USA), 1x 글루타맥스(GIBCO, USA), 1% (v/v) 비필수 아미노산(GIBCO, USA), 0.1mM 베타-머캅토에탄올(GIBCO), 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신(GIBCO, USA), 8 ng/ml bfgf(basic fibroblast growth factor)(차바이오앤디오스텍, Korea)로 보충된 DMEM/F-12 (GIBCO, USA)[배지-B]에 역분화-증진제를 첨가하여 준비한 배지-B1 내지 배지-B7(표 1 참조)로 각 웰의 배지를 매일 교체하면서 20일 동안 배양하였다.
표 1
처리군 배지 배지 역분화-증진제
제1군 배지-A1 배지-B1 무처리(대조군)
제2군 배지-A2 배지-B2 Go 5 μM
제3군 배지-A3 배지-B3 TSA 10 nM
제4군 배지-A4 배지-B4 DM 1 μM
제5군 배지-A5 배지-B5 Go 5 μM + TSA 10 nM
제6군 배지-A6 배지-B6 Go 5 μM + DM 1 μM
제7군 배지-A7 배지-B7 TSA 10 nM + DM 1 μM
- Go: 3-[1-[3-(디메틸아미노)프로필]-5-메톡시-1H-인돌-3-일]-4-(1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온)(Go6983)
- TSA: 트리코스타틴 에이(Trichostatin A)
- DM: 도르소몰핀(dorsomorphin)
역분화 유도 인자 전달 후, 약 배양 20일 째에 iPS 세포 콜로니가 각 웰에서 형성되는 것을 관찰할 수 있었으며, 배양 25일 째에 배아줄기세포-유사 콜로니(hESC-like colonies)를 계수하였다. 10,000 개의 세포당 얻어진 iPS 세포 콜로니의 수를 측정한 결과는 도 1과 같다. 도 1의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 프로틴 키나아제 C 저해제, 히스톤 디아세틸라제 저해제, 또는 BMP 경로 저해제를 처리한 군은 대조군에 비해 iPS 세포 콜로니 수가 적어도 2배 이상 증가하였다. 특히, 히스톤 디아세틸라제 저해제(트리코스타틴 에이) 및 BMP 경로 저해제(도르소몰핀)을 동시에 처리한 군은 대조군에 비해 iPS 세포 콜로니 수가 7배 이상으로 현저하게 증가하였다.
시험예 1. iPS 세포의 확인
실시예 1에서, 제5군(Go6983 + TSA) 및 제2군(Go6983)의 배양 25일째 배양액 중의 iPS 세포 콜로니를 미분화 표지인 Tra1-60 항체(Millipore, USA)를 이용하여 염색하였으며, 또한 생성된 iPS 세포 콜로니들의 미분화 표지 마커인 알칼린 포스파테이즈, Oct4, SSEA4, Tra1-60, 및 Sox2의 발현을 측정하였다.
즉, 배양 25일째에 콜로니들을 인산완충식염수로 세척한 후 4% 포름알데하이드 용액을 10분간 처리하여 고정하였다. 이를 다시 인산완충식염수로 10분씩 3회 세척한 후, 10% 정상 당나귀 혈청(normal donkey serum) 용액으로 상온에서 1시간 블록킹(blocking)하였다. 일차항체인 mouse Tra1-60 항체를(1:500, Millipore, USA) 실온에서 1시간 동안 처리한 후, 인산완충식염수로 10분씩 3회 세척한 다음, 이차항체인 biotinylated goal anti-mouse IgG 항체(1:100, Vector Laboratory, USA)를 넣고 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 인산완충식염수로 10분씩 3회 세척한 후, streptavidin-horseradish peroxydase conjugate (Vector Laboratory, USA)를 실온에서 30분 동안 처리하고, 다시 인산완충식염수로 10분씩 3회 세척한 후 DAB Peroxidase Substrate Kit(Vector Laboratory, USA)를 이용하여 발색시켰다.
또한, 동일한 방법으로 콜로니들을 인산완충식염수로 세척한 후, 4% 포름알데하이드 용액을 10분 동안 처리하여 고정한 후, 알칼린 포스파테이즈 염색을 다음과 같이 시행하였다. iPS 세포 콜로니들을 10분씩 3회 세척한 후, 100X NBT 용액 (디메틸포름아미드 70% 및 물 30%의 혼합용매 중 50 mg/ml의 니트로 블루 테트라졸리움(Sigma, USA))과 100x XPHOS 용액(물 중의 10 mg/ml의 5-브로모-4-클로로-3-인돌일 포스페이트, 2나트륨염(Sigma, USA))을 AP buffer(100 mM Tris pH 8.5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2)를 이용하여 1X로 희석하여 iPS 세포 콜로니들을 30분 이상 반응시킨 후 H2O로 씻어주고 관찰하였다.
또한, Oct4, SSEA4, Tra1-60, 및 Sox2의 발현을 측정하기 위하여 면역염색을 다음과 같이 시행하였다. 먼저 iPS 세포 콜로니들을 인산완충식염수로 씻어준 후 4% 포름알데하이드 용액을 10분간 처리하여 고정하였다. 일차항체들인 mouse anti-Oct4 항체(Santa Cruz, USA), mouse anti-SSEA4 항체(Millipore, USA), mouse anti-Tra1-60 항체(Millipore, USA), mouse anti-Sox2 항체(Millipore, USA)들과 실온에서 1시간 동안 반응시키고, 인산완충식염수로 10분씩 3회 세척한 후 이차항체인 Alexa-594 goat anti-mouse IgG (1:200, Invitrogen, USA)와 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 인산완충식염수로 10분씩 3회 세척한 후, 30 nM 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)(Invitrogen, USA)를 이용하여 핵을 염색하였다. 다시 인산완충식염수로 10분씩 3회 세척한 후 형광현미경으로 관찰하였다
미분화 표지인 Tra1-60 항체(Millipore, USA)를 이용하여 염색한 결과는 도 2와 같으며, 생성된 iPS 세포 콜로니들의 미분화 표지 마커인 알칼린 포스파테이즈, Oct4, SSEA4, Tra1-60, 및 Sox2의 발현을 측정한 결과는 도 3과 같다. 상기 도 2 및 3의 결과로부터, 본 발명에 따라 생성된 iPS 세포는 Tra1-60 항체에 대하여 양성반응을 나타내었으며, iPS 세포의 미분화 표지 마커인 알칼린 포스파테이즈, Oct4, SSEA4, Tra1-60, 및 Sox2 모두를 잘 발현하고 있음을 알 수 있다.

Claims (11)

  1. (a) 역분화 유도 인자를 코딩하는 유전자가 도입된 인간-유래의 체세포를, 프로틴 키나아제 C 저해제, 히스톤 데아세틸라제 저해제, 및 골 형성 단백질 경로 차단제로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 역분화-증진제을 포함하는 배지 중에서 배양하는 단계; 및
    (b) 단계(a)로부터 얻어진 배양물로부터 배아줄기세포-유사 콜로니(embryonic stem cell-like colonies)를 분리하는 단계
    를 포함하는 역분화 만능 줄기세포(iPS cells)의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로틴 키나아제 C 저해제가 3-[1-[3-(디메틸아미노)프로필]-5-메톡시-1H-인돌-3-일]-4-(1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온; 3-(1H-인돌-3-일)-4-[2-(4-메틸피페라진-1-일)퀴나졸린-4-일]피롤-2,5-디온; 3-{1-[3-(아미디노티오)프로필]-1H-인돌-3-일}-3-(1-메틸-1H-인돌-3-일)말레이미드 메탄 술포네이트; 13-히드록시옥타데카디에논산; 2-[1-(3-디메틸아미노프로필)인돌-3-일]-3-(인돌-3-일) 말레이미드; 13-((디메틸아미노)메틸)-10,11,14,15-테트라히드로-4,9:16,21-디메테노-1H,13H-디벤조(E,K)피롤(3,4-H)(1,4,13)옥사디아자시클로헥사데센-1,3(2H)-디온; 2,6-디아미노-N-([1-(1-옥소트리데실)-2-피페리딘일]메틸)헥산아미드; 및 4'-데메틸아미노-4'-히드록시스타우로스포린으로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 히스톤 데아세틸라제 저해제가 N-히드록시-3-(3-페닐설파모일페닐)아크릴아미드; 7-(4-(3-에티닐페닐아미노)-7-메톡시퀴나졸린-6-일옥시)-N-히드록시헵탄아미드; [R-(E,E)]-7-[4-(디메틸아미노)페닐]-N-히드록시-4,6-디메틸-7-옥소-2,4-헵타디엔아미드; N-히드록시-N'-페닐옥탄디아미드; 발프로익산 또는 그의 염; 소듐 부티레이트; 3-(2-부틸-1-(2-(디에틸아미노)에틸)-1H-벤조[d]이미다졸-5-일)-N-히드록시아크릴아미드; N-히드록시-N'-3-피리디닐옥탄디아미드; 3-(디메틸아미노메틸)-N-[2-[4-(히드록시카바모일)페녹시]에틸]-1-벤조퓨란-2-카르복사미드; N-[[4-[[(2-아미노페닐)아미노]카르보닐]페닐]메틸]카르바믹산 3-피리디닐메틸 에스테르; N-(2-아미노페닐)-4-[[(4-피리딘-3-일피리미딘-2-일)아미노]메틸]벤젠아미드; 3-[5-(3-(3-플루오로페닐)-3-옥소프로펜-1-일)-1-메틸-1H-피롤-2-일]-N-히드록시-2-프로펜아미드; N-히드록시-3-[4-[2-(2-메틸-1H-인돌-3-일)에틸아미노메틸]페닐]-2(E)-프로펜아미드; 3-[4-[N-(2-히드록시에틸)-N-[2-(1H-indol-3-일)에틸]아미노메틸]페닐]-2(E)-프로페노히드록사믹산; N-히드록시-2-(4-((((1-메틸-1H-인돌-3-일)메틸)아미노)메틸)피페리딘-1-일)피리미딘-5-카르복사미드; {6-[(디에틸아미노)메틸]나프탈렌-2-일}메틸 [4-(히드록시카르바모일)페닐]카르바메이트; 및 4-(4-클로로-2-메틸페녹시)-N-히드록시부탄아미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 골 형성 단백질 경로 차단제가 노긴; 코르딘; 폴리스타틴; 및 6-(4-(2-피페리딘-1-일에톡시)페닐))-3-피리딘-4-일피라졸로(1,5-a)피리미딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 역분화-증진제가 히스톤 데아세틸라제 저해제 및 골 형성 단백질 경로 차단제의 혼합물인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 역분화-증진제의 농도가 0.001 내지 1000 μM의 범위인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(a)의 상기 배양이 (i) 역분화 유도 인자를 코딩하는 유전자의 도입에 사용된 배지에 상기 역분화-증진제를 가하여 얻어진 배지("제1 배지") 중에서 3∼6 일 동안 1차 배양을 수행하는 단계, (ii) 세포외기질 단백질(extracellular matrix protein)의 존재하에서, 상기 제1 배지 중에서 1.5∼3 일 동안 2차 배양을 수행하는 단계, 및 (iii) 인간 배아줄기세포 배양용 배지에 상기 역분화-증진제를 가하여 얻어진 배지("제2 배지") 중에서 15∼30 일 동안 3차 배양을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 역분화 유도 인자를 코딩하는 유전자의 도입에 사용된 배지가 무-이종감염물질 배지(xenopathogen-free medium)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 인간 배아줄기세포 배양용 배지가 무-이종감염물질 배지(xenopathogen-free medium)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제10항에 있어서, 상기 인간 배아줄기세포 배양용 배지가 넉아웃 제노프리 혈청 대체물, 글루타맥스, 비필수 아미노산, 베타-머캅토에탄올, 항생제, 및 bfgf(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 DMEM/F-12 배지인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 (i) 내지 (iii)의 배양이 무-지지세포(feeder cell-free) 조건하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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