WO2012143164A1 - Weitfeldmikroskop und verfahren zur weitfeldmikroskopie - Google Patents

Weitfeldmikroskop und verfahren zur weitfeldmikroskopie Download PDF

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WO2012143164A1
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Ralf Wolleschensky
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    • H04N25/71—Charge-coupled device [CCD] sensors; Charge-transfer registers specially adapted for CCD sensors

Definitions

  • the invention relates to a method for far-field microscopy, in particular for high-resolution PAL microscopy, wherein a sample field is imaged onto a detector surface of a detector.
  • the invention equally relates to a wide-field microscope, in particular for high-resolution PAL microscopy, which has a detector which has a radiation-sensitive, spatially resolving detector surface, an imaging optics which images a sample field onto the detector surface of the detector, and a control device, the detection data of the detector reads.
  • PALM Photo Activated Light Microscopy
  • a marking substance which can be activated by means of optical radiation. Only in the activated state can the marker substance then be excited to emit certain fluorescence radiation.
  • radiation of different wavelengths or also radiation of the same wavelength can be used for the activation and the fluorescence excitation.
  • Non-activated molecules of the labeling substance emit no or at least no appreciable fluorescence radiation even after irradiation of excitation radiation. The activation therefore causes a switch and therefore one speaks of a switching signal.
  • the switching signal is applied so that at least a certain proportion of the activated Labeling molecules of adjacent activated molecules are spaced so as to be separately or subsequently separable as measured by the optical resolution of the wide field microscope used.
  • the activated molecules appear largely isolated in the recorded wide field image. For these isolated molecules, one can computationally determine the center of their resolution-limited radiation distribution and determine the position of the molecules with higher accuracy than the wide-field microscope actually allows. This increased resolution by computational focus of the diffraction distribution is also referred to in the English-language literature as "super resolution".
  • the methods used for which the above-mentioned PAL microscopy is only an example, generally use the fact that the probability with which a label molecule is activated by the switching signal is the same for all molecules to isolate individual label molecules. This makes it possible to ensure that the probability of activating marking molecules present in a given surface area of the sample is so small that there are sufficiently large areas in which only distinguishable marking molecules emit fluorescence radiation within the optical resolution of the wide field microscope used.
  • suitable design of the switching for example by suitable choice of the intensity of the switching signal, it is now achieved that as far as possible based on the optical resolution of the wide field microscope isolated marker molecules are activated and subsequently emit fluorescence radiation. Localization is therefore the starting point for high-sensitivity wide-field microscopy and achieves highly accurate localization of individual molecules in the nanometer range in their images.
  • the invention is therefore based on the object of specifying a method for wide field microscopy and a wide field microscope, with which a fast image acquisition for microscopy techniques can be achieved, in which a plurality of individual images of a sample field must be recorded.
  • This object is achieved by a method for wide-field microscopy, in particular for high-resolution PAL microscopy, wherein a sample field is imaged onto a detector surface of a detector, wherein the sample field is imaged in an image field that is smaller than the detector surface, and the image field on the Detector surface is moved so that the same sample field is imaged at different, adjacent layers of the image field to determine information about temporal changes in the sample field.
  • the object is likewise achieved by a wide-field microscope, in particular designed for high-resolution PAL microscopy, which has a detector which has a radiation-sensitive, spatially resolving detector surface, an imaging optics which images a sample field onto the detector surface of the detector, and a control device which has detection data of the
  • the detector optics emits the sample field in an image field which is smaller than the detector surface, and a controllable scanning device, with a position of the image field is displaceable on the detector surface, wherein the control means controls the scanning device so that the same sample field at different, adjacent layers is shown, and based on the read detection data information about temporal changes in the sample field determined.
  • the invention is based on the recognition that an essential time-critical criterion in the recording of individual image series is the duration of the readout of the data.
  • z For example, in PALM, localization of the isolated molecules in a single frame is time-limiting, but close inspection reveals that the duration of this method step can be reduced with increased computational effort.
  • the time-critical exposure time on the camera too, at first glance turns out to be considerably less critical, since the number of available photons per unit of time can be improved by increasing the excitation intensity and choice of suitable molecules, which has a positive effect on the exposure time.
  • read-out of the detector itself which is also referred to in the literature as a camera, but requires an ever-present period of time that can not be avoided.
  • the concept of the invention thus provides that one and the same sample field is imaged onto an image field whose position on the detector surface is adjusted.
  • a detector is used which uses a two-dimensional spatial resolution which is decisive for the optical resolution of the microscope.
  • another significant difference from laser scanning microscopy lies in the fact that one and the same sample field is repeatedly imaged.
  • different sample sections are imaged by scanning.
  • the depicted sample field is displayed in a spatially resolving manner, since the present invention is devoted to wide-field microscopy.
  • the imaging beam path is scanned over the detector surface, so that the same sample field is successively repeatedly, namely at different, adjacent layers of the image field on the detector surface is mapped.
  • This makes it possible in one embodiment of the invention to make several images of the image field on the detector surface before the detector is read out.
  • a read-out process then comprises several images, whereby the duration of the readout per image drops to the corresponding fraction.
  • the readout duration per frame is reduced to a fraction of the readout duration that the detector used has. This is achieved in that the shift of the position with the reading of the detector is tuned so that in a read-out detection data are read out with several different layers of the image field.
  • the position of the image field is shifted stepwise on the detection surface. Only after several shifts the detection data are read out. Each position of the image field is then assigned to a single image of the sample field in the read-out detection data.
  • n-frames are obtained with a read-out.
  • the read duration then drops per frame to the corresponding inverse 1 / n.
  • a sensor is used whose detector surface is partially darkened. While the image field for the extraction of still images in the non-darkened part from one place to the next is pushed on and then on the next place again With this concept, the charges can be shifted from the previously recorded image into the darkened area. From there they can then be transferred to the horizontal shift register for reading. This allows a nearly continuous readout of the detector.
  • a CCD area detector which comprises a horizontal shift register on a readout edge of its detector surface and whose detector surface has a radiation-sensitive part and a part darkened by radiation incidence which lies between the read-out edge and the radiation-sensitive part.
  • the image field is shifted stepwise over the radiation-sensitive part of the detector surface.
  • the detector is further controlled in such a way that charges of a generated individual image are transferred during the recording of the following individual images obtained in the shifted image field in the darkened part before the radiation incidence and then from there into the horizontal shift register.
  • a detector which comprises at least two independently readable detector surface parts.
  • the image field is scrolled on these. If there are two parts of the detector surface, they will be exposed alternately. As a result, one detector surface part can be read while another is being exposed. This also permits a nearly continuous exposure, since the read-out durations are incurred for one detector surface part, while an image is already taken at another detector surface part.
  • a method is preferred in which a detector is used, which comprises a plurality of adjacent, spatially resolving detector surface parts, for each of which independently detection data can be read out.
  • the image field is intermittently placed on changing of the plurality of detector surface parts.
  • the detector surface data is read while the image field is set to another one of the plurality of detector surface parts.
  • Such detectors are z. T. manufactured in CMOS technology and are also referred to as Active Pixel Sensor.
  • the detector In order to separately record the individual images in the different image field positions in the variants mentioned, it is preferable to ensure that as far as possible during the time in which the image field is moved to the next image field position, no radiation is detected by the detector.
  • This can be done for example by a corresponding inactive circuit of a lighting beam path or a lighting beam source.
  • the illumination is synchronized so that no illumination of the sample is made during the shifting of the image field position or the sample is not excited to emit fluorescence radiation or is activated.
  • a shading element or for shading are movable diaphragms, Chopperzier, AOTF or suitable Strahlengangabracede or-deflecting elements such as LCD or DMD elements, etc. in question.
  • a camera whose detector can be switched inactive during the shifting of the image field, so that it does not detect any radiation during the shifting process.
  • the corresponding elements are, of course, suitably controlled in the wide-field microscope by the control device, whereby, of course, a combination of said measures is possible.
  • the image field is continuously moved over the detector surface for high-resolution PAL microscopy. Based on the consideration of the shift, the information about the change in the sample field is determined.
  • the shift of the image field over the detector surface is preferably marked in the image by adjusting a focus of the image according to a modulation which is synchronous with the displacement.
  • the focus adjustment changes the intensity distribution in the image data and allows the actual displacement to be determined directly from the image data.
  • the individual images preferably each correspond to a subset of the fluorescent label molecules in the sample when the wide-field microscopy method or the corresponding microscope is used in PAL microscopy or one of its variants. This can be achieved particularly simply by the fact that the activation or activation takes place synchronously with the displacement of the position of the image field.
  • FIG. 1 is a schematic representation of a wide-field microscope, in particular for PAL
  • Microscopy is designed to be suitable
  • Fig. 2 is a plan view of a detector surface of the microscope of Figure 1 for
  • FIG. 3 shows a representation similar to FIG. 2 for a microscope with a modified detector
  • FIG. 4 shows a time series for illustrating the image recording of the microscope of the FIGURE
  • Fig. 5 is a view similar to Figures 2 and 3 for a further variant of
  • Figures 6-8 are views of a detector or a detector array similar to that of Figure 2 for a further modification of the microscope of Figure 1 and
  • FIG. 9 is a view similar to Figure 7 for a particular operating form of the variant according to Figures 6 to 8.
  • FIG. 1 schematically shows a microscope 1, which images a sample 2 in a wide-field image.
  • the microscope 1 is particularly adapted to detect a temporal change in the sample 2, as required for example in the context of PAL microscopy.
  • the wide-field microscope of Figure 1 or modifications thereof is described below with reference to the PAL microscopy, this is only to be understood as exemplary or preferred embodiments concerning.
  • the wide-field microscope of Figure 1 or its developments and modifications can be used advantageously in the other context, if it is important to determine the temporal change of a sample in the shortest possible time intervals or even continuously.
  • the wide-field microscope 1 has an objective 3, which images the sample 2 onto a camera 4, which contains a detector D.
  • This figure is a known one Far field imaging, ie a sample field detected by the objective 3 on the sample 2, is imaged into an image field which lies on the detector D of the camera 4.
  • the wide-field microscope 1 comprises a scanning device 5, which shifts the position of the image field on the detector D.
  • the scanning device 5 comprises a scanning optics 6, 7, between which there is a scanner 8, which effects a biaxial deflection.
  • the scanner 8 is preferably located in or near a pupil plane.
  • a diaphragm 9 Arranged in front of the scanner 8 in the imaging direction is a diaphragm 9 which lies in an intermediate image plane provided by the scanning optics 6, 7 and thus defines the size and position of the image field on the detector D of the camera 4.
  • To adjust the size and position of the aperture 9 can be made adjustable in size and / or displaced.
  • control unit 10 which is connected via corresponding control lines with these and possibly other components.
  • the control lines are illustrated in FIG. 1 by double-headed lines.
  • the control intervention of the control unit 10 with respect to the scanning device 5 is shown on the scanner 8. This can of course alternatively or additionally also on the diaphragm 9 or a (not shown in the figure) drive for moving and / or make / create the panel 9.
  • the microscope 1 additionally has a radiation source 1 1, which is irradiated via a non-descript beam splitter and the lens 3 to the sample 2.
  • a radiation source 1 which is irradiated via a non-descript beam splitter and the lens 3 to the sample 2.
  • an emission filter 12 is connected in the imaging beam path between the beam splitter and the camera 4.
  • the scanning device 5 ensures that the image field on the camera 4 is significantly smaller than the radiation-detecting surface of the detector D in the camera 4. This is effected by the aperture 9.
  • the diaphragm 9 is variable in order to be able to optimally adapt the image field imaged on the sensor to the requirements (compromise between image field size and speed) or to the various variants explained below.
  • FIG. 2 shows a possible embodiment of the microscope 1 with respect to the detector D of the camera 4. There, a top view of the detector surface 13 is shown. It concerns with Detector D with the detector surface 13, for example, a CCD sensor, which is read via a horizontal shift register 14.
  • FIG. 2 shows nine different image field positions 15.1 - 15.9 of the image field 15. In these layers, successively nine temporally spaced images of the same sample field of the sample 2 are exposed onto the detector surface 13.
  • FIG. 4 shows schematically the time sequence. Over an exposure time b, the detector surface 13 is exposed in each case in the image field positions 15.1, 1 5.2, 15.3, ....
  • the image field 15 is shifted into the respective new image field position, which requires a scan duration s. If the detector surface 13 is occupied by the different image field positions 15.1 - 15.9, the detector signal is read out by detecting the corresponding charges via the shift register 14.
  • Each image field position 15.1 -15.9 thus corresponds to a single image of one and the same sample field of sample 2.
  • the recording of nine individual images thus takes a period of 9 * b plus 9 * s plus the duration of the read-out process.
  • the recording of a single frame thus requires the period of time b plus s plus one ninth of the readout duration for nine individual images per read process. Since the scan time s is much smaller than the read duration, which is the dominating time element in conventional cameras 4, this procedure achieves a considerable acceleration of the single image recording.
  • control unit 10 taking into account the previously effected displacement of the individual image layers, decomposes the total image delivered by the camera 4 into the individual images, in the present example the nine individual images corresponding to the individual image layers 1 5.1 - 15.9.
  • a camera 4 the detector D of which can be switched inactive during the shifting of the image field from one, a frame associated image field position in the next frame associated image field position, so that he does not detect radiation during this time.
  • the scanning device 5 (or in the described embodiment, the scanner 8) causes a stepwise displacement of the image field 1 5 of one of the image field layers 15.1 -15.9 in the next one.
  • the image field layers are 15.1 -15.9 so that they fill the detector surface 13 as completely as possible.
  • FIG. 3 shows a modification of the microscope 1 in which the detector D of the camera 4 enables a nearly continuous signal readout.
  • part of the detector surface 13 is covered by a diaphragm 25.
  • the diaphragm 25 lies on the edge with the shift register 14.
  • the detector surface 13 comprises an active part 26 which detects incident circuitry and a covered part 27 which lies between the shift register 14 and the active part 26.
  • charges can now be continuously shifted to the shift register 14.
  • the control unit 10 now controls the camera 4 or its detector D and the scanning device 5 in such a way that the image field is shifted stepwise over the active part 26.
  • three image field positions 16.4-16.6 are provided.
  • FIG. 3 shows the state after three individual images have first been recorded in the active part 26 corresponding to image field positions 16.1 - 16.3 and then shifted into the darkened part 27. While these are then transferred to the horizontal shift register 14 and read out there, three further image field positions 16.4-16.6 or associated individual images are recorded next.
  • FIG. 3 permits an almost continuous recording of individual images.
  • the scanner 8 only has to be formed as a uniaxial scanner, since the position of the image field only along one axis, namely parallel to the shift register 14 must be moved.
  • FIG. 5 shows a further variant with regard to the camera 4 or its detector D.
  • the latter now has a detector surface 17 which comprises two parts 17a and 17b.
  • the detector sub-surfaces 17a and 17b each have their own readout device, for.
  • the control unit 10 now causes the displacement of the image field between two image field positions 19.1 and 19.2, so that alternately the detector sub-areas 17a and 17b are exposed. While the detector sub-area 17a is being exposed, the detector signal is read out from the detector sub-area 17b via the read-out device, which is realized here by the shift register 18b. The same applies while the detector part surface 17b is exposed.
  • This alternating exposure of the detector sub-areas 17a and 17b also allows almost continuous data acquisition. If the readout duration via the read-out devices of the detector sub-areas 1 7a and 17b lasts longer than the image pick-up for a single image, the development of FIG. 5 can be combined with that of FIG. 2 by exposing each detector sub-area 7a and 17b individually in such a way that Like the detector surface 13 of Figure 2. Also, more than two detector sub-surfaces can be used. Such sensors are u. a. manufactured as CMOS sensors and can be so-called Active Pixel sensors.
  • the frames with synchronized exposure make so that no radiation is absorbed during the displacement of the image field in the new image field position.
  • the image field 15 is continuously moved over the detector surface 13 along a displacement direction 20. During the movement, the detector surface 13 collects radiation.
  • FIG. 7, represents a reference frame 22 which corresponds to the detector surface 13 in the recorded detector data.
  • individual luminous points of the sample field are extended to tracer tracks 21 along the direction of displacement 20.
  • the beginning of such a luminous trace 21 is the time at which a pixel begins to emit fluorescence radiation.
  • the end of a trace of light marks the point in time at which the emission of fluorescence radiation ends at the point in question. Since the individual luminous pixels (which are also referred to as "candlesticks" in PAL microscopy) are sufficiently isolated in the high-resolution measuring methods of interest here, so that the luminous traces 21 generally do not overlap, it is simply possible to leave the tracer tracks 21 to generate individual luminous dots 24, which correspond to those points in the reference frame 22 to which the luminous dot illuminated.This status of the image processing is shown in FIG.
  • these luminous dots 24 must now be corrected with regard to the continuous displacement of the image field 15.
  • This z. B. considered by the controller that the reference frame 22 corresponds in the horizontal direction of a time axis, which is due to the displacement of the image field 15. It can thus indicate the relative coordinate in the image field 15 due to the known shift of the image field 15 for each horizontal coordinate, ie the position in the image field at which the luminous point in question 24 appeared for the first time.
  • the location of the luminous dots 24 provides two information in the reference frame 22. On the one hand, the position of the respective luminous point in the image field 15 is obtained independently of its displacement.
  • the scaling in the horizontal axis can thus be obtained from the reference frame 22 in a particularly simple manner.
  • the modulation of the focus parameter for example the detection point image ashing function, is preferably to be carried out in such a way that it is just detectable in the tracer track 21. As a result, an excessive expansion and ultimately a loss of resolution is avoided as far as possible.

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Abstract

Bei einem Verfahren zur Weitfeldmikroskopie, insbesondere zur hochauflösenden PAL-Mikroskopie, wobei ein Probenfeld auf eine Detektorfläche (13) eines Detektors (D) abgebildet wird, ist vorgesehen, daß das Probenfeld in ein Bildfeld (15) abgebildet wird, das kleiner ist als die Detektorfläche (13), und das Bildfeld (15) auf der Detektorfläche (13) verschoben wird, so daß dasselbe Probenfeld bei verschiedenen, nebeneinander liegenden Lagen (15.1 -15.9) des Bildfeldes abgebildet wird, um Informationen über Veränderungen im Probenfeld zu ermitteln.

Description

Weitfeldmikroskop und Verfahren zur Weitfeldmikroskopie
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Weitfeldmikroskopie, insbesondere zur hochauflösenden PAL-Mikroskopie, wobei ein Probenfeld auf eine Detektorfläche eines Detektors abgebildet wird. Die Erfindung bezieht sich gleichermaßen auf ein Weitfeldmikroskop, insbesondere zur hochauflösenden PAL-Mikroskopie, das einen Detektor, der eine strahlungsempfindliche, ortsauflösende Detektorfläche hat, eine Abbildungsoptik, die ein Probenfeld auf die Detektorfläche des Detektors abbildet, und eine Steuereinrichtung aufweist, die Detektionsdaten des Detektors ausliest.
Für die Weitfeldmikroskopie sind grundsätzlich die physikalischen Gesetze der optischen Abbildung auflösungsbestimmend. Man spricht bekanntermaßen auch von der Beugungsgrenze. Seit einiger Zeit werden verschiedene Verfahren zur Überwindung dieser Beugungsgrenze in der Mikroskopie, insbesondere der Lumineszenz- oder Fluoreszenzmikroskopie (Lumineszenz wird hier, wie allgemein üblich, als Oberbegriff für Phosphoreszenz und Fluoreszenz verstanden) entwickelt und angewendet.
Ein Verfahren, das eine Auflösung jenseits der Beugungsgrenze erreicht, ist beispielsweise aus der WO 2006/127692 bekannt. Dort werden ein gattungsgemäßes Verfahren und ein gattungsgemäßes Mikroskop beschrieben. Das als PALM (Photo Activated Light Microscopy) abgekürzte Verfahren verwendet eine Markierungssubstanz, welche mittels optischer Strahlung aktiviert werden kann. Nur im aktivierten Zustand kann die Markierungssubstanz dann zur Abgabe von bestimmter Fluoreszenzstrahlung angeregt werden. Für die Aktivierung und die Fluoreszenzanregung können je nach Substanz Strahlungen verschiedener Wellenlängen oder auch Strahlung ein und derselben Wellenlänge verwendet werden. Nicht aktivierte Moleküle der Markierungssubstanz senden auch nach Einstrahlung von Anregungsstrahlung keine oder zumindest keine merkliche Fluoreszenzstrahlung ab. Die Aktivierung bewirkt deshalb ein Umschalten und man spricht deshalb von einem Umschaltsignal. Im PALM-Verfahren wird das Umschaltsignal so aufgebracht, daß zumindest ein gewisser Anteil der aktivierten Markierungsmoleküle von benachbarten aktivierten Molekülen so beabstandet sind, daß sie gemessen an der optischen Auflösung des verwendeten Weitfeldmikroskops getrennt oder nachträglich trennbar sind. Die aktivierten Moleküle erscheinen im aufgenommenen Weitfeldbild weitgehend isoliert. Für diese isolierten Moleküle kann man rechnerisch das Zentrum deren auflösungsbegrenzt bedingter Strahlenverteilung ermitteln und die Lage der Moleküle mit höherer Genauigkeit bestimmen, als es das verwendete Weitfeldmikroskop eigentlich zuläßt. Diese gesteigerte Auflösung durch rechnerische Schwerpunktbestimmung der Beugungsverteilung wird in der englischsprachigen Fachliteratur auch als „super resolution" bezeichnet.
Die verwendeten Verfahren, für das die oben erwähnte PAL-Mikroskopie nur ein Beispiel ist, nutzen zum Isolieren einzelner Markierungsmoleküle in der Regel die Tatsache, daß die Wahrscheinlichkeit, mit der ein Markierungsmolekül durch das Umschaltsignal aktiviert wird, für alle Moleküle gleich ist. Dadurch kann dafür gesorgt werden, daß die Wahrscheinlichkeit, in einem gegebenen Flächenbereich der Probe vorhandene Markierungsmoleküle zu aktivieren, so gering ist, daß es ausreichend große Bereiche gibt, in denen innerhalb der optischen Auflösung des verwendeten Weitfeldmikroskops nur unterscheidbare Markierungsmoleküle Fluoreszenzstrahlung emittieren. Durch passende Gestaltung der Umschaltung, beispielsweise durch passende Wahl der Intensität des Umschaltsignals, wird nun erreicht, daß möglichst nur bezogen auf die optische Auflösung des Weitfeldmikroskops isoliert liegende Markierungsmoleküle aktiviert werden und nachfolgend Fluoreszenzstrahlung aussenden. Die Ortsbestimmung erfolgt deshalb als Ausgangsbasis einer hochempfindlichen Weitfeldmikroskopie und erreicht in deren Bildern eine hochgenaue Lokalisierung einzelner Moleküle im Nanometerbereich.
Da in einem einzelnen Bild nur eine Untermenge der Moleküle der Probe im fluoreszierenden Zustand ist, wird das Verfahren sehr oft wiederholt, so daß verschiedene stochastische Untermengen der Markierungsmoleküle fluoreszieren. Die verschiedenen Varianten dieser Mikroskopie, welche auch mit den Kürzeln PALM, STORM, D-STORM, etc. bezeichnet werden, unterscheiden sich hauptsächlich in der Wahl der Markierungsmoleküle (Fluorophore) und in der Art der Umschaltung.
Um eine zu untersuchende Probe möglichst komplett wiederzugeben, erfordert das Prinzip, nur eine Untermenge der Moleküle der Probe in den fluoreszierenden Zustand zu bringen, viele Einzelbilder (typisch 5000 bis 20.000) der Probe aufzunehmen, um möglichst viele verschiedene Untermengen der Fluorophore und damit möglichst viele unterschiedliche Einzelbilder zu gewinnen. Diese Grundvoraussetzung der hochauflösenden Weitfeldmikroskopie führt nachteiliger Weise zu relativ langen Aufnahmedauern für ein Gesamtbild.
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Weitfeldmikroskopie und ein Weitfeldmikroskop anzugeben, mit dem eine schnelle Bildgewinnung für Mikroskopietechniken erreicht werden kann, bei denen eine Vielzahl von Einzelbildern eines Probenfeldes aufgenommen werden muß.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst mit einem Verfahren zur Weitfeldmikroskopie, insbesondere zur hochauflösenden PAL-Mikroskopie, wobei ein Probenfeld auf eine Detektorfläche eines Detektors abgebildet wird, wobei das Probenfeld in ein Bildfeld abgebildet wird, das kleiner ist als die Detektorfläche, und das Bildfeld auf der Detektorfläche verschoben wird, so daß dasselbe Probenfeld bei verschiedenen, nebeneinander liegenden Lagen des Bildfeldes abgebildet wird, um Informationen über zeitliche Veränderungen im Probenfeld zu ermitteln.
Die Aufgabe wird gleichermaßen gelöst durch ein Weitfeldmikroskop, insbesondere ausgebildet zur hochauflösenden PAL-Mikroskopie, das einen Detektor, der eine strahlungsempfindliche, ortsauflösende Detektorfläche hat, eine Abbildungsoptik, die ein Probenfeld auf die Detektorfläche des Detektors abbildet, und eine Steuereinrichtung aufweist, welche Detektionsdaten des Detektors ausliest, wobei die Abbildungsoptik das Probenfeld in ein Bildfeld abbildet, das kleiner ist als die Detektorfläche, und eine steuerbare Scaneinrichtung umfaßt, mit der eine Lage des Bildfeldes auf der Detektorfläche verschiebbar ist, wobei die Steuereinrichtung die Scaneinrichtung so ansteuert, daß dasselbe Probenfeld bei verschiedenen, nebeneinanderliegenden Lagen abgebildet ist, und basierend auf den ausgelesenen Detektionsdaten eine Information über zeitliche Veränderungen im Probenfeld ermittelt.
Die Erfindung geht von der Erkenntnis aus, daß ein wesentliches zeitkritisches Kriterium bei der Aufnahme von Einzelbildserien die Dauer des Auslesens der Daten ist. Zwar könnte man in erster Betrachtung davon ausgehen, daß z. B. bei PALM auch die Lokalisierung der isolierten Moleküle in einem Einzelbild zeitbegrenzend ist, jedoch ergibt eine genaue Betrachtung, daß die Zeitdauer dieses Verfahrensschrittes mit gesteigertem Rechenaufwand gesenkt werden kann. Auch die auf den ersten Blick ebenfalls zeitkritische Belichtungsdauer auf der Kamera erweist sich bei genauer Überlegung als wesentlich unkritischer, da durch Erhöhung der Anregungsintensität und Wahl geeigneter Moleküle die Anzahl der verfügbaren Photonen pro Zeiteinheit verbessert werden kann, was sich positiv auf die Belichtungszeit auswirkt. Der Auslesevorgang des Detektors selbst, der in der Literatur auch als Kamera bezeichnet wird, erfordert jedoch eine stets vorhandene Zeitdauer, die nicht vermieden werden kann.
Das Konzept der Erfindung sieht also vor, daß ein und dasselbe Probenfeld auf ein Bildfeld abgebildet wir, dessen Lage auf der Detektorfläche verstellt wird. Anders als in der bekannten Laser-Scanning-Mikroskopie wird dabei ein Detektor verwendet, der eine zweidimensionale Ortsauflösung verwendet, welche bestimmend für die optische Auflösung des Mikroskops ist. Natürlich liegt ein weiterer, wesentlicher Unterschied zur Laser-Scanning-Mikroskopie auch darin, daß ein und dasselbe Probenfeld wiederholt abgebildet wird. In der Laser-Scanning- Mikroskopie werden hingegen verschiedene Probenabschnitte durch Scannen abgebildet. Das abgebildete Probenfeld wird darüber hinaus ortsauflösend abgebildet, da die vorliegende Erfindung sich der Weitfeldmikroskopie widmet.
Es ist deshalb vorgesehen, daß der Abbildungsstrahlengang über die Detektorfläche gescannt wird, so daß dasselbe Probenfeld nacheinander mehrmals, und zwar bei verschiedenen, nebeneinander liegenden Lagen des Bildfeldes auf die Detektorfläche abgebildet wird. Dies erlaubt es in einer Ausführungsform der Erfindung mehrere Abbildungen des Bildfeldes auf der Detektorfläche vorzunehmen, bevor der Detektor ausgelesen wird. Ein Ausleseprozeß umfaßt dann mehrere Bilder, wodurch die Zeitdauer des Auslesens pro Bild auf den entsprechenden Bruchteil sinkt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird deshalb die Auslesedauer pro Einzelbild auf einen Bruchteil der Auslesedauer reduziert, welche der verwendete Detektor aufweist. Dies wird dadurch erreicht, daß die Verschiebung der Lage mit dem Auslesen des Detektors so abgestimmt wird, daß in einem Auslesevorgang Detektionsdaten mit mehreren verschiedenen Lagen des Bildfeldes ausgelesen werden.
Besonders bevorzugt wird die Lage des Bildfeldes schrittweise auf der Detektionsfläche verschoben. Erst nach mehreren Verschiebungen werden die Detektionsdaten ausgelesen. In den ausgelesenen Detektionsdaten wird dann jede Lage des Bildfeldes einem Einzelbild des Probenfeldes zugeordnet.
Verwendet man n-verschiedene Lagen, werden mit einem Auslesevorgang n-Einzelbilder erhalten. Die Auslesedauer sinkt dann pro Einzelbild auf den entsprechenden Kehrwert 1 /n.
In einer Alternative wird ein Sensor verwendet, dessen Detektorfläche teilweise abgedunkelt ist. Während das Bildfeld zur Gewinnung von Einzelbildern im nicht abgedunkelten Teil von einer Stelle zur nächsten weitergeschoben wird und dann auf der nächsten Stelle wiederum ein Einzelbild aufgenommen wird, können bei diesem Konzept die Ladungen vom zuvor aufgenommenen Bild in den abgedunkelten Bereich verschoben werden. Von dort können sie dann zur Auslesung am horizontalen Schieberegister transferiert werden. Dies erlaubt ein nahezu kontinuierliches Auslesen des Detektors.
Für diese Ausgestaltung ist es bevorzugt, als Detektor einen CCD-Flächendetektor zu verwenden, der an einem Ausleserand seiner Detektorfläche ein horizontales Schieberegister umfaßt und dessen Detektorfläche einen strahlungsempfindlichen Teil und einen vor Strahlungseinfall abgedunkelten Teil aufweist, welcher zwischen dem Ausleserand und dem strahlungsempfindlichen Teil liegt. Zur Aufnahme von Einzelbildern wird das Bildfeld schrittweise über den strahlungsempfindlichen Teil der Detektorfläche verschoben. Der Detektor wird weiter so angesteuert, daß Ladungen eines erzeugten Einzelbildes noch während der Aufnahme folgender, bei verschobenem Bildfeld gewonnener Einzelbilder im vor Strahlungseinfall abgedunkelten Teil und dann von dort in das horizontale Schieberegister transferiert werden.
In einem dritten Konzept wird ein Detektor verwendet, der mindestens zwei eigenständig auslesbare Detektorflächenteile umfaßt. Auf diese wird rollierend das Bildfeld gestellt. Bei zwei Detektorflächenteilen werden diese alternierend belichtet. Dadurch kann ein Detektorflächenteil ausgelesen werden, während ein anderes gerade belichtet wird. Dies erlaubt ebenfalls eine nahezu kontinuierliche Belichtung, da die Auslesedauern für ein Detektorflächenteil anfallen, während an einem anderen Detektorflächenteil bereits ein Bild aufgenommen wird.
Für diese Ausführungsform ist ein Verfahren bevorzugt, bei dem ein Detektor verwendet wird, der mehrere, nebeneinander liegende, ortsauflösende Detektorflächenteile umfaßt, für die jeweils eigenständig Detektionsdaten auslesbar sind. Das Bildfeld wird intermittierend auf wechselnde der mehreren Detektorflächenteile gestellt. Für jedes Detektorflächenteil werden die Detektorflächendaten ausgelesen, während das Bildfeld auf einen anderen der mehreren Detektorflächenteile gestellt ist. Solche Detektoren sind z. T. in CMOS-Technologie hergestellt und werden auch als Active Pixel Sensor bezeichnet.
Um in den genannten Varianten die Einzelbilder in den verschiedenen Bildfeldlagen getrennt aufzunehmen, ist es zu bevorzugen, dafür zu sorgen, daß während der Zeitdauer, in der das Bildfeld in die nächste Bildfeldlage gerückt wird, möglichst keine Strahlung vom Detektor detektiert wird. Dies kann beispielsweise durch eine entsprechende Inaktivschaltung eines Beleuchtungsstrahlenganges oder einer Beleuchtungsstrahlenquelle erfolgen. Die Beleuchtung wird so synchronisiert, daß während des Verschiebens der Bildfeldlage keine Beleuchtung der Probe vorgenommen wird bzw. die Probe nicht zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt oder aktiviert wird. Alternativ oder zusätzlich ist es möglich, ein entsprechendes Abschattungselement im Abbildungsstrahlengang vorzusehen, das während der Verschiebung des Bildfeldes von einer Bildfeldlage in die nächste den Strahlengang abschattet. Als Abschattungselement bzw. für die Abschattung kommen bewegliche Blenden, Chopperräder, AOTF oder geeignete strahlengangabschaltende oder -umlenkende Elemente wie LCD- oder DMD-Elemente etc. in Frage. Als dritte Option kann man eine Kamera verwenden, deren Detektor während des Verschiebens des Bildfeldes inaktiv geschaltet werden kann, so daß er während des Verschiebevorgangs keine Strahlung detektiert. Die entsprechenden Elemente werden natürlich im Weitfeldmikroskop geeignet von der Steuereinrichtung angesteuert, wobei selbstverständlich auch eine Kombination der genannten Maßnahmen möglich ist.
In einer letzten Variante ist es schließlich möglich, das Bildfeld kontinuierlich über die Detektorfläche zu verschieben. Die Bilder der detektierten Moleküle werden dabei durch die Scanbewegung verwischt. Unter Kenntnis der Scanbewegung kann jedoch die Intensitätsverteilung für die erforderliche Bildauswertung wieder rekonstruiert werden.
In dieser Gestaltung wird zur hochauflösenden PAL-Mikroskopie das Bildfeld kontinuierlich über die Detektorfläche verschoben. Auf Basis unter der Berücksichtigung der Verschiebung wird die Information über die Veränderung im Probenfeld ermittelt.
Die Verschiebung des Bildfeldes über die Detektorfläche wird vorzugsweise im Bild markiert, indem ein Fokus der Abbildung gemäß einer Modulation, die synchron zur Verschiebung ist, verstellt wird. Die Fokusverstellung ändert die Intensitätsverteilung in den Bilddaten und erlaubt die aktuelle Verschiebung aus den Bilddaten direkt zu ermitteln.
Die Einzelbilder entsprechen vorzugsweise jeweils einer Untermenge der fluoreszierenden Markierungsmoleküle in der Probe, wenn das Weitfeldmikroskopieverfahren bzw. das entsprechende Mikroskop in der PAL-Mikroskopie oder einer ihrer Spielarten verwendet wird. Dies kann besonders einfach dadurch erreicht werden, daß die Anregung bzw. Aktivierung synchron zur Verschiebung der Lage des Bildfeldes erfolgt.
Soweit in dieser Beschreibung Verfahrensmerkmale geschildert werden, können bzw. werden diese Merkmale im entsprechenden Weitfeldmikroskop durch eine geeignete Aktion der Steuereinrichtung realisiert. Die Offenbarung eines Verfahrensmerkmals gelte deshalb gleichermaßen auch als Offenbarung eines entsprechenden gegenständlichen Vorrichtungsmerkmales im Sinne einer entsprechenden funktionellen Definition bzw. Eigenschaft der Steuereinrichtung. Umgekehrt ist natürlich auch die Offenbarung eines funktionellen Merkmales der Steuereinrichtung gleichermaßen als Offenbarung eines entsprechenden Verfahrensmerkmals anzusehen.
Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine Schemadarstellung eines Weitfeldmikroskops, das insbesondere zur PAL-
Mikroskopie geeignet ausgebildet ist,
Fig. 2 eine Draufsicht auf eine Detektorfläche des Mikroskops der Figur 1 zur
Veranschaulichung der Weitfeld-Bildaufnahme,
Fig. 3 eine Darstellung ähnlich der Figur 2 für ein Mikroskop mit modifiziertem Detektor, Fig. 4 eine Zeitreihe zur Veranschaulichung der Bildaufnahme des Mikroskops der Figur
1 mit einem Detektor der Bauweise der Figur 2,
Fig. 5 eine Darstellung ähnlich den Figuren 2 und 3 für eine weitere Variante des
Detektors des Mikroskops der Figur 1 ,
Figuren 6-8 Ansichten auf einen Detektor bzw. ein Detektorfeld ähnlich dem der Figur 2 für eine weitere Abwandlung des Mikroskops der Figur 1 und
Fig. 9 eine Darstellung ähnlich der Figur 7 für eine besondere Betriebsform der Variante gemäß Figuren 6 bis 8.
Figur 1 zeigt schematisch ein Mikroskop 1 , das eine Probe 2 in einer Weitfeldabbildung abbildet. Das Mikroskop 1 ist besonders dazu ausgebildet, eine zeitliche Veränderung in der Probe 2 zu erfassen, wie es beispielsweise im Rahmen der PAL-Mikroskopie erforderlich ist. Soweit das Weitfeldmikroskop der Figur 1 oder Abwandlungen davon nachfolgend mit Bezug auf die PAL-Mikroskopie beschrieben wird, ist dies lediglich exemplarisch bzw. bevorzugte Ausführungsformen betreffend zu verstehen. Das Weitfeldmikroskop der Figur 1 bzw. dessen Weiterbildungen und Abwandlungen kann auch im anderen Zusammenhang vorteilhaft eingesetzt werden, wenn es darauf ankommt, die zeitliche Veränderung einer Probe in möglichst geringen zeitlichen Abständen oder sogar kontinuierlich zu ermitteln.
Das Weitfeldmikroskop 1 weist ein Objektiv 3 auf, das die Probe 2 auf eine Kamera 4 abbildet, welche einen Detektor D enthält. Es handelt sich bei dieser Abbildung um eine bekannte Weitfeldabbildung, d. h. ein vom Objektiv 3 auf der Probe 2 erfaßtes Probenfeld wird in ein Bildfeld abgebildet, das auf dem Detektor D der Kamera 4 liegt.
Das Weitfeldmikroskop 1 umfaßt eine Scaneinrichtung 5, welche die Lage des Bildfeldes auf dem Detektor D verschiebt. In der gezeigten Bauweise umfaßt die Scaneinrichtung 5 eine Scanoptik 6, 7, zwischen der sich ein Scanner 8 befindet, der eine zweiachsige Ablenkung bewirkt. Der Scanner 8 befindet sich dabei vorzugsweise in oder nahe einer Pupillenebene. Dem Scanner 8 in Abbildungsrichtung vorgeordnet ist eine Blende 9, die in einer von der Scanoptik 6, 7 bereitgestellten Zwischenbildebene liegt und damit die Größe und Lage des Bildfeldes auf dem Detektor D der Kamera 4 definiert. Zum Einstellen von Größe und Lage kann die Blende 9 in ihrer Größe verstellbar und/oder verschieblich ausgebildet sein.
Der Betrieb der Scaneinrichtung 5 und auch der Kamera 4 wird von einem Steuergerät 10 gesteuert, das über entsprechende Steuerleitungen mit diesen und ggf. weiteren Bauteilen verbunden ist. Die Steuerleitungen sind in der Figur 1 durch Linien mit Doppelpfeil veranschaulicht. In der Schemadarstellung der Figur 1 ist der Steuereingriff des Steuergerätes 10 bezüglich der Scaneinrichtung 5 am Scanner 8 eingezeichnet. Dies kann natürlich alternativ oder zusätzlich auch an der Blende 9 bzw. einem (in der Figur nicht darstellten) Antrieb zum Verschieben und/oder Großem/erstellen der Blende 9 erfolgen.
Zur Ausführung der PAL-Mikroskopie weist das Mikroskop 1 zusätzlich noch eine Strahlungsquelle 1 1 auf, die über einen nicht näher bezeichneten Strahlteiler und das Objektiv 3 auf die Probe 2 eingestrahlt wird. Um Rückreflexe der Beleuchtungsstrahlung zur Kamera 4 abzublocken, ist zwischen dem Strahlteiler und der Kamera 4 ein Emissionsfilter 12 in den Abbildungsstrahlengang geschaltet.
Im Mikroskop 1 sorgt die Scaneinrichtung 5 dafür, daß das Bildfeld auf der Kamera 4 deutlich kleiner ist, als die strahlungsdetektierende Fläche des Detektors D in der Kamera 4. Dies wird durch die Blende 9 bewirkt. Alternativ ist es auch möglich, den Abbildungsstrahlengang grundsätzlich so abzubilden, daß das vom Objektiv 3 erfaßte Probenfeld auf ein Bildfeld abgebildet wird, daß kleiner ist als die Detektorfläche.
Optional ist die Blende 9 variabel, um das auf den Sensor abgebildete Bildfeld optimal an die Erfordernisse (Kompromiss zwischen Bildfeldgröße und Geschwindigkeit) anpassen zu können, bzw. an die verschiedenen im Folgenden erläuterten Varianten.
Figur 2 zeigt eine mögliche Ausführungsform des Mikroskops 1 bezüglich des Detektors D der Kamera 4. Dort ist eine Draufsicht auf die Detektorfläche 13 dargestellt. Es handelt sich beim Detektor D mit der Detektorfläche 13 beispielsweise um einen CCD-Sensor, der über ein horizontales Schieberegister 14 ausgelesen wird.
Da der Auslesevorgang, mit dem die Ladungen vom CCD-Sensor über das Schieberegister 14 in Detektorsignale umgewandelt werden, welche von der Kamera 4 an das Steuergerät 1 0 geliefert werden, für die Aufnahme einer zeitlichen Veränderung in der Probe 2 eine kritische Zeitdauer ist, bewirkt das Steuergerät 10 am Mikroskop 1 einen Betrieb, in dem die Lage des Bildfeldes 15 über die Detektorfläche 13 verschoben ist. Figur 2 zeigt neun verschiedene Bildfeldlagen 15.1 -15.9 des Bildfeldes 15. In diesen Lagen werden nacheinander neun zeitlich beabstandete Bilder ein und desselben Probenfeldes der Probe 2 auf die Detektorfläche 13 belichtet. Figur 4 zeigt schematisch den zeitlichen Ablauf. Über eine Belichtungsdauer b wird die Detektorfläche 13 jeweils in den Bildfeldlagen 15.1 , 1 5.2, 15.3, ... belichtet. Zwischen den Belichtungen in diesen Bildfeldlagen wird das Bildfeld 15 in die jeweils neue Bildfeldlage verschoben, was eine Scandauer s bedingt. Wurde die Detektorfläche 13 mit den verschiedenen Bildfeldlagen 15.1 -15.9 belegt, wird das Detektorsignal ausgelesen, indem die entsprechenden Ladungen über das Schieberegister 14 erfaßt werden.
Jede Bildfeldlage 15.1 -15.9 entspricht somit einem Einzelbild ein und desselben Probenfeldes der Probe 2. Die Aufnahme von neun Einzelbildern nimmt somit eine Zeitdauer von 9*b plus 9*s plus die Dauer des Auslesevorgangs in Anspruch. Die Aufnahme eines einzelnen Einzelbildes benötigt also bei neun Einzelbildern pro Auslesevorgang die Zeitdauer b plus s plus ein Neuntel der Auslesedauer. Da die Scandauer s sehr viel kleiner ist, als die Auslesedauer, welche bei üblichen Kameras 4 das dominierende Zeitelement ist, erreicht man durch dieses Vorgehen eine beträchtliche Beschleunigung der Einzelbildaufnahme.
Die Verwendung von 9 Bildfeldlagen ist natürlich für dieses Prinzip nicht zwingend erforderlich, sondern rein exemplarisch zu verstehen. Auch ist es nicht zwingend erforderlich, daß, wie in Figur 2 dargestellt ist, die Einzelbildlagen durch einen kleinen Spalt beabstandet sind. Es ist vielmehr zu bevorzugen, die Einzelbildlagen möglichst dicht aneinander zu setzen, wobei mitunter auch überlappende Einzelbildlagen zulässig sein können.
Bei der Auswertung der Detektorsignale zerlegt das Steuergerät 10 unter Berücksichtigung der zuvor bewirkten Verschiebung der Einzelbildlagen das von der Kamera 4 gelieferte Gesamtbild in die Einzelbilder, im vorliegenden Beispiel die neun Einzelbilder, die den Einzelbildlagen 1 5.1 - 15.9 entsprechen.
Um die Einzelbilder in den verschiedenen Bildfeldlagen 1 5.1 -1 5.9 möglichst getrennt aufzunehmen, ist es zu bevorzugen, dafür zu sorgen, daß während des Scandauer s, also während der Zeitdauer, in der das Bildfeld 15 in die nächste Bildfeldlage gerückt wird, möglichst keine Strahlung an der Detektorfläche 13 detektiert wird. In der PAL-Mikroskopie oder damit verwandten oder ähnlichen hochauflösenden Mikroskopieverfahren kann dies durch eine Synchronisierung mit der Beleuchtung aus der Strahlungsquelle 1 1 erfolgen. Die Beleuchtung wird dann so synchronisiert, daß während des Verschiebens der Bildfeldlage keine Fluoreszenzstrahlung angeregt oder die Probe 2 nicht zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung aktiviert ist. Alternativ oder zusätzlich ist es möglich, ein entsprechendes Abschattungselement im Abbildungsstrahlengang vorzusehen, das während der Verschiebung des Bildfeldes von einer Bildfeldlage in die nächste der Strahlengang abschattet. Hierzu kommen bewegliche Blenden, Chopperräder oder geeignet den Strahlengang abschaltende oder umlenkende Elemente wie LCD- oder DMD-Elemente etc. in Frage. Auch ist es möglich, eine Kamera 4 zu verwenden, deren Detektor D während des Verschiebens des Bildfeldes von einer, einem Einzelbild zugeordneten Bildfeldlage in die dem nächsten Einzelbild zugeordnete Bildfeldlage inaktiv geschaltet werden kann, so daß er währenddessen keine Strahlung detektiert.
Es sind aber auch Anwendungen möglich, bei denen das Verschieben des Bildfeldes 15 von einer Bildfeldlage in die nächste so schnell geschieht, daß währenddessen aufgenommene Strahlung die Einzelbilder nicht unzulässig verfälschen. Dann muß keine Vorkehrung getroffen werden, während dieses Scan-Schrittes die Kamera 4 bzw. deren Detektor D abzudunkeln oder abzuschalten.
Die Scaneinrichtung 5 (bzw. im beschriebenen Ausführungsbeispiel der Scanner 8) bewirkt eine schrittweise Verschiebung des Bildfeldes 1 5 von einer der Bildfeldlagen 15.1 -15.9 in die jeweils nächste. Durch diese intermittierende Arbeitsweise liegen die Bildfeldlagen 15.1 -15.9 so, daß sie die Detektorfläche 13 möglichst vollständig füllen.
Figur 3 zeigt eine Abwandlung des Mikroskops 1 , bei der Detektor D der Kamera 4 eine nahezu kontinuierliche Signalauslesung ermöglicht. Dazu ist ein Teil der Detektorfläche 13 durch eine Blende 25 abgedeckt. Die Blende 25 liegt dabei an dem Rand mit dem Schieberegister 14. Dadurch umfaßt die Detektorfläche 13 einen aktiven Teil 26, der einfallende Schaltung detektiert, und einen abgedeckten Teil 27, welcher zwischen dem Schieberegister 14 und dem aktiven Teil 26 liegt. Durch diesen abgedeckten Teil 27 können nun kontinuierlich Ladungen zum Schieberegister 14 hin verschoben werden. Das Steuergerät 1 0 steuert nun die Kamera 4 bzw. deren Detektor D und die Scaneinrichtung 5 so an, daß das Bildfeld schrittweise über den aktiven Teil 26 verschoben wird. Im vorliegenden Beispiel sind drei Bildfeldlagen 16.4-16.6 vorgesehen. Sobald der Scanvorgang abgeschlossen ist, werden in den Bildfeldlagen gewonnene Ladungen, die wiederum Einzelbildern entsprechen, in den abgedeckten Teil 27 des Sensors verschoben. Dies geht sehr viel rascher, als das Auslesen am horizontalen Schieberegister 14. Nun können am aktiven Teil 26 wiederum Einzelbilder in drei Bildfeldlagen erfaßt werden. Währenddessen werden die zuvor erfaßten Ladungen der Einzelbilder zum horizontalen Schieberegister 14 verschoben und dort ausgelesen. Figur 3 zeigt den Zustand, nachdem zuerst drei Einzelbilder entsprechend Bildfeldlagen 16.1 -16.3 im aktiven Teil 26 aufgenommen und dann in den abgedunkelten Teil 27 verschoben wurden. Während diese dann zum horizontalen Schieberegister 14 transferiert und dort ausgelesen werden, werden als nächstes drei weitere Bildfeldlagen 16.4-16.6 bzw. damit verbundene Einzelbilder aufgenommen.
Die Weiterbildung gemäß Figur 3 erlaubt eine nahezu kontinuierliche Aufnahme von Einzelbildern. Ein weiterer Vorteil dieser Variante besteht darin, daß der Scanner 8 lediglich als einachsiger Scanner ausgebildet werden muß, da die Lage des Bildfeldes nur entlang einer Achse, nämlich parallel zum Schieberegister 14 verschoben werden muß.
Ansonsten gelten die anhand der Figur 2 geschilderten Merkmale auch für die Detektor- bzw. Kameraabwandlung gemäß Figur 3.
Figur 5 zeigt eine weitere Variante hinsichtlich der Kamera 4 bzw. deren Detektor D. Dieser weist nun eine Detektorfläche 17 auf, die zwei Teile 1 7a und 17b umfaßt. Die Detektorteilflächen 17a und 17b verfügen jeweils über eine eigene Ausleseeinrichtung, z. B. ein eigenes Schieberegister 18a und 1 8b, können also unabhängig voneinander ausgelesen werden. Das Steuergerät 10 bewirkt nun die Verschiebung des Bildfeldes zwischen zwei Bildfeldlagen 19.1 und 19.2, so daß wechselnd die Detektorteilflächen 17a und 17b belichtet werden. Während die Detektorteilfläche 17a belichtet wird, wird von der Detektorteilfläche 17b über die Ausleseeinrichtung, die hier durch das Schieberegister 1 8b realisiert ist, das Detektorsignal ausgelesen. Analoges gilt während die Detektorteilfläche 17b belichtet wird. Diese alternierende Belichtung der Detektorteilflächen 17a und 17b erlaubt ebenfalls eine nahezu kontinuierliche Datenaufnahme. Falls die Auslesedauer über die Ausleseeinrichtungen der Detektorteilflächen 1 7a und 17b länger dauert, als die Bildaufnahme für ein Einzelbild, kann die Weiterbildung der Figur 5 mit der der Figur 2 kombiniert werden, indem jede Detektorteilfläche 7a und 17b für sich in der Weise belichtet wird, wie die Detektorfläche 13 der Figur 2. Auch können mehr als zwei Detektorteilflächen verwendet werden. Solche Sensoren werden u. a. als CMOS-Sensoren hergestellt und können sog. Active Pixel Sensoren sein.
Wie eingangs geschildert, ist es möglich die Einzelbilder mit synchronisierter Belichtung (durch Abschalten der Beleuchtung oder Blockieren des Beleuchtungsstrahlenganges, durch Blockieren des Abbildungsstrahlenganges oder durch Deaktivieren des Detektors) vorzunehmen, so daß während der Verschiebung des Bildfeldes in die neue Bildfeldlage keine Strahlung aufgenommen wird. Es kann jedoch, wie nachfolgend anhand der Figuren 6 bis 9 beschrieben wird, auch mit einer bewußt kontinuierlichen Verschiebung des Bildfeldes unter laufender Belichtung gearbeitet werden. Dies zeigt schematisch die Figur 6.
Das Bildfeld 15 wird kontinuierlich über die Detektorfläche 13 längs einer Verschieberichtung 20 verschoben. Während des Verschiebens sammelt die Detektorfläche 13 Strahlung auf. Das damit erhaltene Bild zeigt schematisch die Figur 7, welche einen Bezugsrahmen 22 darstellt, der der Detektorfläche 13 in den aufgenommen Detektordaten entspricht.
Im Bezugsrahmen 22 sind einzelne leuchtende Punkte des Probenfeldes zu Leuchtspuren 21 längs der Verschieberichtung 20 ausgedehnt. Der Anfang einer solchen Leuchtspur 21 ist der Zeitpunkt, zu dem ein Bildpunkt beginnt, Fluoreszenzstrahlung auszusenden. Das Ende einer Leuchtspur markiert den Zeitpunkt, zu dem am fraglichen Punkt die Aussendung von Fluoreszenzstrahlung endet. Da die einzelnen leuchtenden Bildpunkte (die in der PAL- Mikroskopie auch als „Leuchter" bezeichnet werden) in den hier interessierenden hochauflösenden Meßverfahren ausreichend vereinzelt sind, so daß das die Leuchtspuren 21 in der Regel nicht überlappen, ist es einfach möglich, aus den Leuchtspuren 21 einzelne Leuchtpunkte 24 zu generieren, die denjenigen Stellen im Bezugsrahmen 22 entsprechen, zu denen der Leuchtpunkt aufleuchtete. Diesen Status der Bildverarbeitung zeigt Figur 8.
In einem nächsten Schritt müssen nun diese Leuchtpunkte 24 hinsichtlich der kontinuierlichen Verschiebung des Bildfeldes 15 korrigiert werden. Dabei wird z. B. vom Steuergerät berücksichtigt, daß der Bezugsrahmen 22 in horizontaler Richtung einer Zeitachse entspricht, welche durch die Verschiebung des Bildfeldes 15 bedingt ist. Es kann somit aufgrund der bekannten Verschiebung des Bildfeldes 15 für jede horizontale Koordinate die Relativkoordinate im Bildfeld 15 angeben, d. h. die Stelle im Bildfeld, an der der fragliche Leuchtpunkt 24 das erste Mal erschien. Die Lage der Leuchtpunkte 24 liefert im Bezugsrahmen 22 zwei Informationen. Zum einen erhält man die Lage des jeweiligen leuchtenden Punktes im Bildfeld 15 unabhängig von dessen Verschiebung. Zum anderen gewinnt man eine Information über den Zeitpunkt zu dem der Punkt aufleuchtete, auch wenn diese Information für manche Varianten der PAL-Mikroskopie nicht erforderlich ist. Wesentlich für die zeitliche Skalierung des Bezugsrahmens 22 ist eine Kenntnis über die Verschiebung des Bildfeldes 15. Falls hier zum Beispiel Nichtlinearitäten der Scanbewegung oder eine mangelnde Auflösung einer Messung der Scanbewegung problematisch sind, wird zusätzlich eine periodische Modulation eines Fokusparameters der Abbildung des Probenfeldes auf das Bildfeld vorgenommen werden. Damit wird im Ergebnis die Detektionspunktverwaschungsverteilung moduliert, so daß ein leuchtender Punkt einen unterschiedlich großen Durchmesser hat. Die Leuchtspur 21 weist damit aufgeweitete Bereiche 23 und nicht-aufgeweitete Bereiche 24 auf, die mit der Modulation des Fokusparameters übereinstimmen. Bei bekannter Modulation läßt sich damit aus dem Bezugsrahmen 22 besonders einfach die Skalierung in der horizontalen Achse gewinnen. Die Modulation des Fokusparameters, beispielsweise der Detektionspunktbildverwaschungsfunktion, ist dabei bevorzugt so auszuführen, daß sie gerade noch in der Leuchtspur 21 detektierbar ist. Dadurch ist ein zu starkes Aufweiten und letztlich ein Auflösungsverlust möglichst vermieden.

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zur Weitfeldmikroskopie, insbesondere zur hochauflösenden PAL-Mikroskopie, wobei ein Probenfeld auf eine strahlungsempfindliche Detektorfläche (13) eines ortsauflösenden Detektors (D) abgebildet wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Probenfeld in ein Bildfeld (1 5) abgebildet wird, das kleiner ist als die Detektorfläche (13), und das Bildfeld (15) auf der Detektorfläche (13) verschoben wird, so daß dasselbe Probenfeld bei verschiedenen, nebeneinander liegenden Lagen (15.1 -15.9) des Bildfeldes abgebildet wird, um Informationen über Veränderungen im Probenfeld zu ermitteln.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß dasselbe Probenfeld zeitlich nacheinander bei verschiedenen, nebeneinander liegenden Lagen (15.1 -15.9) des Bildfeldes abgebildet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Detektor (D) verwendet wird, der mehrere, nebeneinander liegende Detektorflächenteile (17a, 17b) umfaßt, für die jeweils eigenständig Detektionsdaten auslesbar sind, daß das Bildfeld (19) intermittierend auf wechselnde der mehreren Detektorflächenteilen (17a, 17b) gestellt wird und für jeden Detektorflächenteil (17a, 17b) die Detektionsdaten ausgelesen werden, während das Bildfeld (19) auf einen anderen der mehreren Detektorflächenteile (17b, 17a) gestellt ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Verschiebung der Lage mit dem Auslesen des Detektors (D) so abgestimmt wird, daß in einem Auslesevorgang Detektionsdaten mit mehreren verschiedenen Lagen (15.1 -15.9) des Bildfelds (1 5) ausgelesen werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Lage des Bildfelds (15) schrittweise auf der Detektorfläche (13) verschoben wird, und erst nach mehreren Verschiebungen die Detektionsdaten ausgelesen werden und in den ausgelesenen Detektionsdaten jede Lage (15.1 -15.9) des Bildfelds (15) einem Einzelbild des Probenfeldes zugeordnet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Detektor (D) ein CCD- Flächendetektor verwendet wird, der an einem Ausleserand seiner Detektorfläche (13) ein horizontales Schieberegister (14) umfaßt und dessen Detektorfläche einen strahlungsempfindlichen Teil (26) und einen vor Strahlungseinfall abgedunkelten Teil (27), der zwischen dem Ausleserand und dem strahlungsempfindlichen Teil (26) liegt, aufweist, und daß zur Aufnahme von Einzelbildern das Bildfeld (15) schrittweise über den strahlungsempfindlichen Teil der Detektorfläche (26) verschoben wird und der Detektor (D) so angesteuert wird, daß Ladungen der erzeugten Einzelbilder noch während der Aufnahme weiterer, bei verschobenem Bildfeld gewonnener Einzelbilder zuerst in den vor Strahlungseinfall abgedunkelten Teil (27) und dann von dort in das horizontale Schieberegister (14) transferiert werden.
7. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß während des Verschiebens des Bildfeldes (15, 16) von einer Lage in die nächste eine Beleuchtung der Probe (2) und/oder die Transmission der Abbildung und/oder die Strahlungsempfindlichkeit des Detektors (D) deaktiviert wird.
8. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Probe (2) zur hochauflösenden PAL-Mikroskopie angeregt wird und diese Anregung synchron zur Verschiebung der Lage des Bildfeldes (15, 16, 19) erfolgt.
9. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß zur hochauflösenden PAL- Mikroskopie das Bildfeld (15) kontinuierlich über die Detektorfläche (13) verschoben und auf
Basis der Verschiebung die Information über die Veränderung im Probenfeld ermittelt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß beim Abbilden des Probenfeldes ein Fokus der Abbildung gemäß einer Modulation, die synchron zur Verschiebung ist, verstellt wird.
1 1 . Weitfeldmikroskop, insbesondere zur hochauflösenden PAL-Mikroskopie, das einen ortsauflösenden Detektor (D), der eine strahlungsempfindliche, Detektorfläche (13) hat, eine Abbildungsoptik, die ein Probenfeld auf die Detektorfläche (13) des Detektors (D) abbildet, und eine Steuereinrichtung (10) aufweist, die Detektionsdaten des Detektors (D) ausliest, dadurch gekennzeichnet, daß die Abbildungsoptik das Probenfeld in ein Bildfeld (15) abbildet, das kleiner ist als die Detektorfläche (13), und eine steuerbare Scaneinrichtung (5) umfaßt, mit der eine Lage des Bildfeldes (15) auf der Detektorfläche (13) verschiebbar ist, wobei die Steuereinrichtung (1 0) die Scaneinrichtung (5) so ansteuert, daß dasselbe Probenfeld bei verschiedenen, nebeneinander liegenden Lagen (15.1 -15.9) des Bildfeldes (15) abgebildet ist, und basierend auf den ausgelesenen Detektionsdaten eine Information über Veränderungen im Probenfeld ermittelt.
12. Weitfeldmikroskop nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Steuereinrichtung (10) die Scaneinrichtung (5) so ansteuert, daß dasselbe Probenfeld zeitlich nacheinander bei verschiedenen, nebeneinander liegenden Lagen (15.1 -15.9) des Bildfeldes (15) abgebildet ist.
13. Weitfeldmikroskop nach Anspruch 1 1 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Detektor (D) mehrere, nebeneinander liegende Detektorflächenteile (17a, 17b) umfaßt, für die jeweils eigenständig Detektionsdaten auslesbar sind, daß die Steuereinrichtung (1 0) die Scaneinrichtung (5) so ansteuert, daß diese das Bildfeld (19) intermittierend auf wechselnde der mehreren Detektorflächenteilen (17a, 1 7b) stellt, und die Steuereinrichtung (10) für jeden Detektorflächenteil (17a, 17b) die Detektionsdaten ausliest, während das Bildfeld (19) auf einen anderen der mehreren Detektorflächenteile (17b, 17a) gestellt ist.
14. Weitfeldmikroskop nach Anspruch 1 1 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Steuereinrichtung (10) die Scaneinrichtung (5) so ansteuert und den Detektor (D) so ausliest, daß in einem Auslesevorgang ausgelesene Detektionsdaten mehrere verschiedene Lagen (15.1 -15.9) des Bildfelds (1 5) zugeordnet sind.
15. Weitfeldmikroskop nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Steuereinrichtung (1 0) die Scaneinrichtung (5) so ansteuert, daß diese die Lage des Bildfelds
(15) schrittweise auf der Detektorfläche (13) verschiebt, und die Steuereinrichtung (10) erst nach mehreren Verschiebungen die Detektionsdaten ausliest und in den ausgelesenen Detektionsdaten jede Lage (15.1 -15.9) des Bildfeldes (15) einem Einzelbilder des Probenfeldes zuordnet.
16. Weitfeldmikroskop nach Anspruch 12 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Detektor (D) als CCD- Flächendetektor ausgebildet ist, der an einem Ausleserand seiner Detektorfläche (13) ein horizontales Schieberegister (14) umfaßt und dessen Detektorfläche (13) einen strahlungsempfindlichen Teil (26) und einen vor Strahlungseinfall abgedunkelten Teil (27), der zwischen dem Ausleserand und dem strahlungsempfindlichen Teil (26) liegt, aufweist, und daß die Steuereinrichtung (10) die Scaneinrichtung (5) so ansteuert, daß diese zur Aufnahme von Einzelbildern das Bildfeld (16) schrittweise über den strahlungsempfindlichen Teil (26) der Detektorfläche (13) verschiebt, und den Detektor (D) so ansteuert, daß Ladungen der erzeugten Einzelbilder noch während der Aufnahme weiterer, bei verschobenem Bildfeld (16) gewonnener Einzelbilder zuerst in den vor Strahlungseinfall abgedunkelten Teil (27) und dann von dort in das horizontale Schieberegister (14) transferiert werden.
17. Weitfeldmikroskop nach einem der Ansprüche 1 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß Mittel zum Deaktivieren einer Probenbeleuchtung und/oder der Transmission des Abbildungsstrahlenganges und/oder des Detektors (D) vorgesehen sind und daß die Scaneinrichtung (10) diese Mittel aktiv hält, während die Lage des Bildfeldes (15, 16, 19) verschoben wird.
18. Weitfeldmikroskop nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß zur hochauflösenden PAL-Mikroskopie die Scaneinrichtung (10) das Bildfeld (15) kontinuierlich über die Detektorfläche (13) verschiebt und die Steuereinrichtung (10) auf Basis der Verschiebung die Information über die Veränderung im Probenfeld ermittelt.
19. Weitfeldmikroskop nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Abbildungsoptik eine unter Steuerung der Steuereinrichtung (10) verstellbare Fokussiereinnchtung (2) aufweist und daß die Steuereinrichtung (10) die Fokussiereinrichtung (2) gemäß einer Modulation, die synchron zur Verschiebung ist, verstellt.
20. Weitfeldmikroskop nach einem der Ansprüche 1 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Mikroskop (2) Probenanregungsmittel (1 1 ) zur hochauflösenden PAL-Mikroskopie aufweist und daß die Steuereinrichtung (10) die Probenanregungsmittel (1 1 ) und die Scaneinrichtung (5) in einen zueinander synchronen Betrieb steuert.
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