WO2013149731A1 - Vorrichtung und verfahren zur mikroskopie - Google Patents

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detection unit
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Nils Langholz
Viktor Drescher
Helmut Lippert
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Carl Zeiss Microscopy GmbH
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Definitions

  • the invention relates in a first aspect to an apparatus for microscopy according to the preamble of claim 1.
  • the invention relates to a method for microscopy according to the preamble of claim 20.
  • a generic device for microscopy has the following components: at least one light source for providing illumination light, a detection unit for detecting light reflected back from a sample, microscope optics for directing illumination light onto the sample, and for guiding light reflected back from the sample Direction of the detection unit and arranged in an illumination beam path excitation mask for providing a structured illumination.
  • a sample is illuminated with illumination light, light reflected back from the sample is detected and the illumination light is spatially structured with an excitation mask.
  • the far-field information is additionally procured and used microscopically.
  • the resulting data sets are offset against each other to obtain a higher total information content from the sample.
  • a confocal image, and a wide-field image is generated alternately.
  • working with different lighting and a triggered data acquisition in most cases, working with different lighting and a triggered data acquisition.
  • CONFIRMATION COPY This requires a quick triggered switching between the lighting and the image acquisition.
  • a grid structure is used to create the confocality.
  • the grid holes work as pinholes.
  • the holes must be surrounded by sufficiently wide webs to avoid crosstalk between the individual pinholes.
  • the web material of the grid has a large surface area in these grid structures, this area must be subsequently blackened in order to prevent the confocal information from being overshadowed.
  • the blackening causes the grid to absorb the light, which in turn can potentially lead to overheating of the grid and thus to poorer imaging properties.
  • This stray light portion deteriorates the signal quality of the confocal image.
  • the device of the abovementioned type is further developed in that the excitation mask is a spatially structured filter which is transparent to light having a first physical property and the light imparts a spatial structuring with a second physical property different from the first physical property.
  • the excitation mask is a spatially structured filter which is transparent to light having a first physical property and the light imparts a spatial structuring with a second physical property different from the first physical property.
  • the method of the abovementioned type is developed according to the invention in that the filter is transparent to light having a first physical property, and that the filter imposes spatial structuring on light having a second physical property different from the first physical property.
  • the filter is transparent to light having a first physical property
  • the filter imposes spatial structuring on light having a second physical property different from the first physical property.
  • a microscopic image is obtained both with the light which is spatially structured, that is to say the second physical property, and also with the light, which has the first physical property, in principle simultaneously a microscopic image can.
  • a spatial structure of the light with the second physical property is considered to be suitable if, in general, it enables an increase in the resolution of the microscope image.
  • the excitation mask for this purpose one or two-dimensional structuring, for example, pinholes or linear or strip-shaped narrow aperture, have. These can be arranged periodically or distributed statistically distributed.
  • the inventive principle can then be realized in principle for transmission geometries as well as for reflection geometries.
  • the excitation mask can for this purpose have chromatically adjustable liquid components, which is achieved as a significant advantage that the entire device basically manages without moving components.
  • the excitation mask has a digital micromirror.
  • the first physical property is a first wavelength of the light and the second physical property is a second wavelength of the light which is different from the first wavelength.
  • the first physical property is a first wavelength range of the light and the second physical property is a second wavelength range of the light that is different from the first wavelength range.
  • the excitation mask is then a spatially structured color filter.
  • the light having the first physical property and the light having the second physical property may be provided from separate light sources.
  • embodiments are particularly preferred in which exactly one light source is present which emits both light with the first physical property and light with the second physical property:
  • the confocality is generated in this invention by finely structured color filters.
  • the far-field information is additionally procured and used.
  • the far field information and the confocal information are generated in particular at the same time.
  • no triggering is necessary. This also makes it possible to double the recording speed compared to the conventional principle.
  • the heat input can be reduced by light absorption.
  • the first physical property is a first polarization of the light and the second physical property is a second polarization of the light different from the first polarization.
  • it may be linear or circularly polarized light.
  • the spatial structuring of the light with the second physical property is expediently selected so that the resolution of the microscopic image recorded with this light is increased.
  • the mechanisms that can be effective in this case are known in principle.
  • the spatial structuring impressed on the light with the second physical property is chosen such that the extraction of a confocal image is possible.
  • the confocal resolution depends essentially on the wavelength, it is expedient to choose the variant in which discrimination takes place by different wavelengths and the first wavelength is greater than the second wavelength.
  • the confocal image is thus preferably recorded with the shorter wavelength, with which the better resolution is possible.
  • the invention can also be realized if the confocal image with the larger wavelength and the wide field image with the smaller wavelength is recorded.
  • the light with the first physical property and with the second physical property can be provided by one and the same light source, so that in principle a single light source can be sufficient for the realization of the invention.
  • the advantages of the invention are achieved in a particular way when light with the first physical property and light with the second physical property can be irradiated simultaneously, because then the wide field image and the image taken with structured illumination, which is in particular a confocal image can be recorded at the same time.
  • the light with the first physical property and light with the second physical property from separate light sources. This is especially contemplated when discriminating across the wavelength.
  • a broadband light source which emits both light with the first physical property and light with the second physical property.
  • the first physical property and the second physical property may also be larger wavelength ranges.
  • white light is used as the light having the first physical property, the light having the second physical property being filtered out of this light.
  • This filtering out of the light with the second physical property is carried out particularly preferably with the excitation mask according to the invention.
  • a beam splitter for separating light with the first physical property and the second physical property is expediently present in front of the detection unit.
  • these can be color beam splitters or polarization beam splitters.
  • any type of two-dimensional image detector or sensor array can be used as the detection unit.
  • two or more sensor arrays can also be present, for example, which can serve to detect the different light components of the light coming from the sample.
  • the light with the first physical property can be detected with a first sensor array and the light with the second physical property can be detected with a second sensor array.
  • suitable means must be provided for separating the light components. be present. In principle, however, it is sufficient if there is a single sensor array with which both light with the first physical property and light with the second physical property can be detected. If the light coming from the sample contains both light components at the same time, suitable means must be present in front of the sensor array for filtering out the respectively desired light.
  • a filter change sweeping device in particular a filter wheel or a filter slide, with a plurality of different filters is present in front of the detector unit and / or after at least one of the light sources.
  • This filter or, where appropriate, " a plurality of filters are expediently color filters or polarization filters.
  • the detection unit can expediently also comprise a multi-channel sensor array, that is to say a sensor array, with which the detection of different colors is possible.
  • the microscopic images are recorded continuously during a z-scan. This means that the distance between the sample and the microscope optics is changed continuously or stepwise. Because the confocal microscope data generated in this process are significantly more sensitive to the z-position than the far-field data, it is advantageous to read the confocal image information at high frequency as much as possible. If, for example, spectral information is still to be recorded for the wide field recordings and for this purpose different color filters are present in front of the detection unit, it is expedient to arrange the different color filters, for example on a filter wheel, so that the confocal information is read out after every other picture. Appropriately, polarization filters can be present to suppress stray light.
  • Fig. 1 a first embodiment of a device according to the invention
  • FIG. 2 shows a second embodiment of a device according to the invention.
  • FIG. 1 shows a first exemplary embodiment of a microscopy device according to the invention, which has as essential components a first light source 10, a second light source 20, a microscope optics 30, an excitation mask 40 and a detection unit 50.
  • the light 14 of the first light source 10 has a first wavelength as the first physical property and the light of the second light source 20 has a second wavelength different from the first wavelength as a second physical property.
  • the light 14 of the first light source 10 is coupled via optical means 12 and a beam portions 26 in the excitation beam path and passed through the microscope optics 30 as illumination light on a sample 32.
  • a wide-field measurement is performed.
  • Light 14 reflected back from the sample 32 passes through the excitation mask 40 and also through a beam splitter 16 substantially unhindered and is deflected by a mirror 70 in the direction of the detection unit 50.
  • a filter wheel 60 with different color filters 62, 64 is arranged before the detection unit 50.
  • the color filter 64 should be transparent to light 14 of the first light source 10, so that in the situation shown in FIG. 1, the light 14 of the first light source 10 passes unhindered through the color filter 64 and can be detected in the detection unit 50.
  • the light source 20 provides light 24 having a second wavelength, which is preferably shorter than the wavelength of the light of the first light source 10.
  • the light 24 of the second light source 20 is coupled via optical means 22 and a beam splitter 16 in the excitation beam path.
  • the light 24 is then impressed by the excitation mask 40 in accordance with the essential aspect of the invention by a spatial structure which, for example, is suitable for obtaining a confocal image from the sample 32.
  • the excitation mask 40 is moved in a suitable manner relative to the optical axis of the system. This can be done on the one hand by rotation about an axis 42, as indicated by the arrow 44. In principle, however, a linear movement, indicated by a double arrow 46, possible.
  • Light 24 reflected back therefrom takes substantially the same route via the microscope optics, the beam splitter 26 and the excitation mask 40 and is then at least partially transmitted through the beam splitter 16 and in turn deflected via the mirror 70 in the direction of the detection unit 50.
  • the detection unit 50 preferably consists of a CCD sensor array.
  • a rotational movement of the filter wheel is indicated in Fig. 1 by the arrow 68.
  • FIG. 1 A particularly simple embodiment of a device 100 according to the invention is shown in FIG.
  • this exemplary embodiment has only one light source 10.
  • This light source 10 provides light with both the first and the second wavelength, in principle, a broadband light source 10 can be used for this purpose.
  • the remaining function corresponds to that described with reference to FIG.
  • Essential to the invention is accordingly an excitation mask, which can also be referred to as a grid plate, on which the respective filters are applied with a sufficiently small feature size.
  • these are Color filter and accordingly a color filter disc with color grids.
  • these color filters must have a sufficiently high suppression of the other light component, so that the microscopic information can subsequently be suitably and sufficiently well separated. For example, in the case where the wavelength is used for discrimination, the filters must have a sufficiently high color suppression.
  • finely structured color filters are used to produce the confocality. This eliminates the triggered generation and detection of confocal and far field information.
  • the short-wave light is directed to the excitation mask 40, which is also referred to as a grid plate. It makes sense to use the shorter wavelength for the confocal illumination because the confocal resolution is sensitive to the wavelength and becomes better with shorter wavelengths.
  • the grid plate consists of finely structured color filters whose lateral extent meets the requirements of confocality. The color filters are mutually permeable and impermeable to the shorter wavelength.
  • the transmissive areas are short-pass filters that pass the corresponding spectral range.
  • the non-transmissive areas are correspondingly long-passes that block this wavelength range.
  • the short-wave light strikes the sample 32 after the grid plate through the further imaging optics 30 and is reflected from there back to the excitation mask 40 or grid plate.
  • the short-pass filters In which the surface of the sample 32 is exactly in focus.
  • the long-wavelength light falls directly onto the sample via the imaging optics 30, is reflected there and passes unhindered through the excitation mask 40 on the return path.
  • the short-wave confocal light and the long-wave far-field light are conducted from the excitation mask 40 to the detection unit 50 and detected there.
  • the detection unit 50 includes a two-dimensional sensor array.
  • two color filters 62, 64 are located here on a filter wheel 60.
  • the filter wheel 60 can be rotated about an axis designated by the reference numeral 66 and, depending on the filter wheel position, allows the confocal component or the far-field component of the light to pass through.
  • the two microscopic information are separated, namely, by the first physical property and the second physical property different therefrom, in particular, as in the example shown here, in chromatically separated form.
  • the lateral scanning or scanning over the sample is carried out by moving the grid plate, so the excitation mask 40, perpendicular to the optical axis, similar to a conventional spinning-disc system with Nipkow disc.
  • Grid plate and triggered color filter are designed as rotating discs in this example. But it is also possible to move the color filters linearly in one direction.
  • a structure without any moving parts can be achieved with liquid crystal arrays.
  • the light source which is used for structured illumination ie in particular used to generate a microscopic image
  • has the shortest possible wavelength which as a rule should not be shorter than the far-field wavelength.
  • additional color filters after the lighting fixtures to allow cleanly separated color spectra of the individual excitation wavelengths.
  • Variant 1 confocal excitation with shortwave monochromatic narrowband light.
  • the longer-wavelength light should also be narrow-band and have only a slightly higher wavelength or it may be significantly longer-wave and broadband. Detection takes place with a single-channel sensor array, for example a CCD or CMOS camera.
  • a color filter can be located in front of the detector, which can transmit the short-wave component or the long-wave component, depending on the position.
  • Variant 2 In a modification of variant 1, the detection is effected via a color divider which directs the light onto two sensor arrays.
  • a color divider which directs the light onto two sensor arrays.
  • Variant 3 Instead of two separate sensor arrays, one and the same sensor array is subdivided into two different areas and the color divider directs the light onto the first or the second part. This cost-effective solution allows only a smaller field of view and therefore a smaller resolution.
  • the wide-field illumination can be performed with white light.
  • Variant 4 Instead of the color filter with two color areas in the detection beam path, additional additional areas with bandpass filters can be used to allow a chromatic division of the wide field spectrum. For a complete image not only two single images must be created, but for each color channel an image. In this case, the additional detection of the color information of the sample is advantageously made possible.
  • the color filter can also be structured in such a way that the confocal information is read out every second frame. The color information is read out over several z-sections. Because the far-field information is less sensitive to changes in the focal point compared to the confocal information, this is possible without loss of quality and the microscopic information can be provided very effectively in this variant.
  • a color filter with a plurality of different color fields can also be positioned in front of the sensor array for wide-field detection. The complete color detection is then done individually for each z-cut.
  • a higher recording speed can also be achieved if a multi-channel sensor array, in particular a three-channel sensor array with the colors yellow, red and blue is used as the sensor array.
  • a cost-effective detection of colors without loss of speed is achieved here.
  • the resolution is reduced because only a fraction of the light sensors are sensitive in the short-wave confocal range.
  • a tunable light source or a color gradient filter arranged after the light source which in principle corresponds to the aforementioned filter change device, can be used to determine the color information.
  • a broadband light source can also be used.
  • This broadband light source is used instead of the short wavelength light source to produce the confocal image.
  • the wide field illumination then also takes place with this light source and the second light source can then be omitted.
  • White LEDs with a peak in the spectrum in the blue or violet range and a broad long-wave spectrum can be used for this purpose, for example.
  • attention must be paid to a good separation of the color information in the detection beam path.
  • excitation masks which are essentially structured color filters and which are moved away to generate the microscopic information with structured illumination via the beam path, in particular in the region of an intermediate image
  • transmitted-light LCDs ie liquid crystal components.
  • These components are in principle also available chromatically adjustable.
  • a major advantage of these variants is to be considered that a system can be constructed completely without moving parts.
  • these liquid crystal components can also be controlled in such a way that the structuring consisting of one- and / or two-dimensional elements is statistically distributed.
  • the inventive principle can also be realized by means of polarized light and polarizing filters. This is possible in particular with rapidly switchable liquid crystal components. Polarized light also offers the possibility to suppress stray light with the help of further polarizers. It has to be taken into account that a microstructure of the sample to be examined can also influence the polarization of the light.

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Description

Vorrichtung und Verfahren zur Mikroskopie
Die Erfindung betrifft in einem ersten Gesichtspunkt eine Vorrichtung zur Mikroskopie nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
In einem zweiten Gesichtspunkt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Mikroskopie nach dem Oberbegriff des Anspruchs 20.
Eine gattungsgemäße Vorrichtung zur Mikroskopie weist folgende Komponenten auf: mindestens eine Lichtquelle zum Bereitstellen von Beleuchtungslicht, eine Detektions- einheit zum Nachweis von von einer Probe zurückgestrahltem Licht, eine Mikroskopoptik zum Leiten von Beleuchtungslicht auf die Probe und zum Leiten von von der Probe zurückgestrahltem Licht in Richtung der Detektionseinheit und eine in einem Beleuchtungsstrahlengang angeordnete Anregungsmaske zum Bereitstellen einer strukturierten Beleuchtung.
Bei einem gattungsgemäßen Verfahren zur Mikroskopie wird eine Probe mit Beleuchtungslicht beleuchtet, von der Probe zurückgestrahltes Licht wird nachgewiesen und das Beleuchtungslicht wird mit einer Anregungsmaske räumlich strukturiert.
Eine gattungsgemäße Vorrichtung und ein gattungsgemäßes Verfahren sind beschrieben in EP 0 882 247 B1.
Bei dem Verfahren der sogenannten korrelativen Apertur wird neben der konfokalen Information zusätzlich die Weitfeldinformation mikroskopisch beschafft und verwendet. Die erhaltenen Datensätze werden miteinander verrechnet, um insgesamt einen höheren Informationsgehalt aus der Probe zu erhalten. Dazu wird abwechselnd ein konfokales Bild, und ein Weitfeldbild erzeugt. Hierzu wird in den meisten Fällen mit unterschiedlichen Beleuchtungen und einer getriggerten Datenerfassung gearbeitet.
BESTÄTIGUNGSKOPIE Dazu ist ein schnelles getriggertes Umschalten zwischen der Beleuchtung und der Bildaufnahme notwendig. Für die Erzeugung der Konfokalität wird zumeist eine Gitterstruktur verwendet. Die Gitterlöcher funktionieren dabei als Pinholes. Die Löcher müssen, um ein Übersprechen zwischen den einzelnen Pinholes zu vermeiden, von ausreichend breiten Stegen umgeben sein. Weil bei diesen Gitterstrukturen das Stegmaterial des Gitters einen großen Flächenanteil aufweist, muss diese Fläche nachträglich geschwärzt werden, um ein Überstrahlen der konfokalen Information zu verhindern. Die Schwärzung führt dazu, dass das Gitter das Licht absorbiert, was wiederum potenziell zu einer Überhitzung des Gitters und damit zu schlechteren Abbildungseigenschaften führen kann. Außerdem wird trotz allem ein größerer Lichtanteil reflektiert. Dieser Streulichtanteil verschlechtert die Signalqualität des konfokalen Bilds.
Als eine A u f g a b e der Erfindung kann angesehen werden, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Mikroskopie anzugeben, bei denen die Generierung der konfokalen Information und der Weitfeldinformation deutlich vereinfacht wird.
Diese Aufgabe wird durch die Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und durch das Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 20 gelöst.
Bevorzugte Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens und vorteilhafte Ausführungsbeispiele der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche und werden außerdem in der folgenden Beschreibung, insbesondere mit den beigefügten Figuren, beschrieben.
Die Vorrichtung der oben genannten Art ist erfindungsgemäß dadurch weitergebildet, dass die Anregungsmaske ein räumlich strukturierter Filter ist, der für Licht mit einer ersten physikalischen Eigenschaft transparent ist und der Licht mit einer von der ersten physikalischen Eigenschaft verschiedenen zweiten physikalischen Eigenschaft eine räumliche Strukturierung aufprägt.
Das Verfahren der oben genannten Art ist erfindungsgemäß dadurch weitergebildet, dass der Filter für Licht mit einer ersten physikalischen Eigenschaft transparent ist und dass der Filter Licht mit einer von der ersten physikalischen Eigenschaft verschiedenen zweiten physikalischen Eigenschaft eine räumliche Strukturierung aufprägt. Als Kerngedanke der Erfindung kann angesehen werden, abweichend vom und hinausgehend über den Stand der Technik, eine Anregungsmaske zu verwenden, die nur Licht mit einer bestimmten Eigenschaft eine räumliche Strukturierung aufprägt und andererseits Licht, welches diese Eigenschaft nicht aufweist, weitgehend unverändert transmittiert und in diesem Sinn für dieses Licht transparent ist.
Hierdurch wird als wesentlicher Vorteil der Erfindung erreicht, dass ein mikroskopisches Bild sowohl mit dem Licht, welches räumlich strukturiert ist, also die zweite physikalische Eigenschaft aufweist, und auch mit dem Licht, welches die erste physikalische Eigenschaft aufweist, prinzipiell gleichzeitig ein mikroskopisches Bild gewonnen werden kann.
Hierdurch können im Prinzip mechanische Komponenten entfallen, was zunächst bei feinmechanischen Apparaturen immer wünschenswert ist. Außerdem kann ein erheblicher Zeitvorteil erzielt werden, weil die, gewünschte mikroskopische Information schneller, nämlich parallel oder gleichzeitig, gewonnen werden kann.
Im Hinblick auf die Anregungsmaske kommt es für die vorliegende Erfindung wesentlich darauf an, dass sie dem Licht mit der zweiten physikalischen Eigenschaft eine geeignete räumliche Struktur aufprägt. Eine räumliche Struktur des Lichts mit der zweiten physikalischen Eigenschaft ist dann als geeignet anzusehen, wenn sie ganz allgemein eine Auflösungssteigerung für das Mikroskopbild ermöglicht.
Prinzipiell kann die Anregungsmaske hierzu ein- oder zweidimensionale Strukturierungen, beispielsweise also Pinholes oder Iinien- oder streifenförmige schmale Blenden, aufweisen. Diese können periodisch angeordnet oder auch statistisch verteilt angeordnet sein.
Das erfindungsgemäße Prinzip kann sodann prinzipiell für Transmissionsgeometrien ebenso verwirklicht werden wie für Reflektionsgeometrien.
Die Anregungsmaske kann hierzu chromatisch einstellbare Flüssigkomponenten aufweisen, wodurch als wesentlicher Vorteil erreicht wird, dass die gesamte Vorrichtung im Prinzip ohne bewegliche Komponenten auskommt.
Für eine Reflexionsgeometrie kann dies auch verwirklicht werden, wenn die Anregungsmaske einen digitalen Mikrospiegel aufweist. Bei einer besonders bevorzugten Variante der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die erste physikalische Eigenschaft eine erste Wellenlänge des Lichts und die zweite physikalische Eigenschaft ist eine von der ersten Wellenlänge verschiedene zweite Wellenlänge des Lichts. Prinzipiell ist auch möglich, dass die erste physikalische Eigenschaft ein erster Wellenlängenbereich des Lichts und die zweite physikalische Eigenschaft ein von dem ersten Wellenlängenbereich verschiedener zweiter Wellenlängenbereich des Lichts ist. Die Anregungsmaske ist dann ein räumlich strukturierter Farbfilter.
Prinzipiell kommt es im Hinblick auf die erste physikalische Eigenschaft des Lichts und die zweite physikalische Eigenschaft des Lichts nur darauf an, dass diese physikalischen Eigenschaften eine adäquate Trennung des Lichts sowohl auf der Anregungs- ais auch auf der Nachweisseite ermöglichen.
Grundsätzlich kann das Licht mit der ersten physikalischen Eigenschaft und das Licht mit der zweiten physikalischen Eigenschaft aus separaten Lichtquellen bereitgestellt werden. Besonders bevorzugt sind aber Ausführungsvarianten, bei denen genau eine Lichtquelle vorhanden ist, die sowohl Licht mit der ersten physikalischen Eigenschaft als auch Licht mit der zweiten physikalischen Eigenschaft aussendet:
Die Konfokalität wird bei dieser Erfindung durch fein strukturierte Farbfilter erzeugt. Wie bei dem Verfahren der sogenannten korrelativen Apertur wird neben der konfokalen Information zusätzlich die Weitfeldinformation beschafft und verwendet. Im Gegensatz zum Verfahren der korrelativen Apertur werden bei der vorliegenden Erfindung die Weitfeldinformation und die konfokale Information insbesondere zeitgleich erzeugt. Je nach Auslegung des Gesamtsystems ist keine Triggerung notwendig. Dadurch besteht außerdem die Möglichkeit, die Aufnahmegeschwindigkeit gegenüber dem herkömmlichen Prinzip zu verdoppeln. Je nach gewählter Variante kann auch der Wärmeeintrag durch Lichtabsorption reduziert werden.
Bei einer weiteren besonders bevorzugten Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die erste physikalische Eigenschaft eine erste Polarisation des Lichts und die zweite physikalische Eigenschaft eine von der ersten Polarisation verschiedene zweite Polarisation des Lichts. Beispielsweise kann es sich um linear oder zirkulär polarisiertes Licht handeln. Die räumliche Strukturierung des Lichts mit der zweiten physikalischen Eigenschaft, beispielsweise also von Licht mit einer bestimmten Wellenlänge oder einer bestimmten Polarisation, wird zweckmäßigerweise so gewählt, dass die Auflösung des mit diesem Licht aufgenommenen mikroskopischen Bilds gesteigert wird. Die Mechanismen, die hierbei wirksam werden können, sind im Prinzip bekannt.
Bei einer besonders bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die dem Licht mit der zweiten physikalischen Eigenschaft aufgeprägte räumliche Strukturierung so gewählt, dass die Extraktion eines konfokalen Bilds möglich ist.
Weil die konfokale Auflösung wesentlich von der Wellenlänge abhängt, kann dabei zweckmäßig die Variante gewählt werden, bei welcher eine Diskriminierung durch verschiedene Wellenlängen erfolgt und die erste Wellenlänge größer ist als die zweite Wellenlänge. Das konfokale Bild wird also bevorzugt mit der kürzeren Wellenlänge aufgenommen, mit welcher die bessere Auflösung möglich ist.
Grundsätzlich kann die Erfindung aber auch verwirklicht werden, wenn das konfokale Bild mit der größeren Wellenlänge und das Weitfeldbild mit der kleineren Wellenlänge aufgenommen wird.
Prinzipiell kann das Licht mit der ersten physikalischen Eigenschaft und mit der zweiten physikalischen Eigenschaft von ein und derselben Lichtquelle bereitgestellt werden, so dass im Grundsatz eine einzige Lichtquelle zur Verwirklichung der Erfindung ausreichend sein kann. Die Vorteile der Erfindung werden in besonderer Weise erreicht, wenn Licht mit der ersten physikalischen Eigenschaft und Licht mit der zweiten physikalischen Eigenschaft gleichzeitig eingestrahlt werden kann, weil dann das Weitfeldbild und das mit strukturierter Beleuchtung aufgenommene Bild, wobei es sich insbesondere um ein konfokales Bild handeln kann, gleichzeitig aufgenommen werden können.
Prinzipiell ist auch möglich, Licht mit der ersten physikalischen Eigenschaft und Licht mit der zweiten physikalischen Eigenschaft aus separaten Lichtquellen bereitzustellen. Das kommt insbesondere in Betracht, wenn eine Diskriminierung über die Wellenlänge erfolgt. Bei dieser Variante kann es bevorzugt sein, wenn mindestens eine der Lichtquellen durchstimmbar ist. Insbesondere ist es zweckmäßig, die Lichtquelle, welche zum Gewinnen des Weitfeldbilds dient, durchstimmbar auszubilden, weil dann auch eine Farbinformation der Probe gewonnen werden kann.
. Prinzipiell ist es auch möglich, eine breitbandige Lichtquelle zu verwenden, die sowohl Licht mit der ersten physikalischen Eigenschaft als auch Licht mit der zweiten physikalischen Eigenschaft aussendet.
Grundsätzlich kann es sich bei der ersten physikalischen Eigenschaft und der zweiten physikalischen Eigenschaft auch um größere Wellenlängenbereiche handeln. Bei einer besonders einfachen und bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird beispielsweise als Licht mit der ersten physikalischen Eigenschaft Weißlicht verwendet, wobei aus diesem Licht das Licht mit der zweiten physikalischen Eigenschaft herausgefiltert ist. Dieses Herausfiltern des Lichts mit der zweiten physikalischen Eigenschaft, also des Lichts, welches der räumlichen Strukturierung unterworfen wird, erfolgt dabei besonders bevorzugt mit der erfindungsgemäß vorhandenen Anregungsmaske.
Wenn Licht mit der ersten physikalischen Eigenschaft und der zweiten physikalischen Eigenschaft gleichzeitig auf die Anregungsmaske gestrahlt wird und deshalb das Weitfeldbild und das Bild mit strukturierter Beleuchtung gleichzeitig gewonnen werden, müssen zum Auftrennen der jeweiligen Lichtanteile vor dem Detektor geeignete Maßnahmen getroffen werden.
Zweckmäßig ist deshalb vor der Detektionseinheit ein Strahlteiler zum Auftrennen von Licht mit der ersten physikalischen Eigenschaft und der zweiten physikalischen Eigenschaft vorhanden. Je nach Eigenschaft, welche zur Unterscheidung dienen soll, kann es sich dabei um Farbstrahlteiler oder Polarisationsstrahlteiler handeln. Als Detektionseinheit kann grundsätzlich jede Art von zweidimensionalem Bilddetektor oder Sensor-Array eingesetzt werden.
Prinzipiell können auch beispielsweise zwei oder mehrere Sensor-Arrays vorhanden sein, welche zum Nachweis der unterschiedlichen Lichtanteile des von der Probe kommenden Lichts dienen können. Beispielsweise kann mit einem ersten Sensor- Array das Licht mit der ersten physikalischen Eigenschaft und mit einem zweiten Sensor-Array das Licht mit der zweiten physikalischen Eigenschaft nachgewiesen werden. Hier müssen wieder geeignete Mittel zum Auftrennen der Lichtanteile vor- handen sein. Grundsätzlich ist es aber ausreichend, wenn ein einziges Sensor-Array vorhanden ist, mit dem sowohl Licht mit der ersten physikalischen Eigenschaft als auch Licht mit der zweiten physikalischen Eigenschaft nachgewiesen werden kann. Wenn das von der Probe kommende Licht gleichzeitig beide Lichtanteile enthält, müssen vor dem Sensor-Array geeignete Mittel zum Herausfiltern des jeweils gewünschten Lichts vorhanden sein.
Besonders vorteilhaft ist es deshalb, wenn vor der Detektoreinheit und/oder nach mindestens einer der Lichtquellen eine Filterwechseieinrichtung, insbesondere ein Filterrad oder ein Filterschieber, mit einer Mehrzahl von verschiedenen Filtern vorhanden ist. Bei diesem Filter oder gegebenenfalls bei" einer Mehrzahl von Filtern handelt es sich zweckmäßigerweise um Farbfilter oder Polarisationsfilter.
Alternativ zum Einsatz von mehreren Sensor-Arrays kann auch ein einziges Sensor- Array unterteilt werden und ein erster Bereich des Sensor-Arrays zum Nachweis von Licht mit der ersten physikalischen Eigenschaft und ein zweiter Bereich des Sensor- Arrays zum Nachweis von Licht mit der zweiten physikalischen Eigenschaft verwendet werden.
Falls für bestimmte Untersuchungen auch eine Farbinformation des Weitfeldbilds gewünscht ist, kann die Detektionseinheit zweckmäßig auch ein mehrkanaliges Sensor-Array, also ein Sensor-Array, mit dem die Detektion verschiedener Farben möglich ist, umfassen.
Bei weiteren bevorzugten Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die mikroskopischen Aufnahmen kontinuierlich während eines z-Scans aufgenommen. Das bedeutet, dass der Abstand der Probe zur Mikroskopoptik kontinuierlich oder schrittweise zeitlich verändert wird. Weil die dabei generierten konfokalen Mikroskopdaten deutlich empfindlicher von der z-Position abhängen, als die Weitfelddaten, ist es von Vorteil, die konfokale Bildinformation möglichst mit hoher Frequenz auszulesen. Wenn beispielsweise außerdem noch eine spektrale Information für die Weitfeldaufnahmen aufgenommen werden soll und hierzu verschiedene Farbfilter vor der Detektionseinheit vorhanden sind, ist es zweckmäßig, die verschiedenen Farbfilter so, beispielsweise auf einem Filterrad anzuordnen, dass nach jedem zweiten Bild die konfokale Information ausgelesen wird. Zweckmäßig können zum Unterdrücken von Streulicht Polarisationsfilter vorhanden sein.
Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden im Folgenden mit Bezug auf die beigefügten Figuren beschrieben.
Hierin zeigt:
Fig. 1 : ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung und
Fig. 2: ein zweites Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Gleiche und gleich wirkende Komponenten sind in den Figuren in der Regel mit denselben Bezugszeichen gekennzeichnet.
In Fig. 1 ist ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Mikroskopie gezeigt, welche als wesentliche Komponenten eine erste Lichtquelle 10, eine zweite Lichtquelle 20, eine Mikroskopoptik 30, eine Anregungsmaske 40 und eine Detektionseinheit 50 aufweist.
Im gezeigten Ausführungsbeispiel weist das Licht 14 der ersten Lichtquelle 10 eine erste Wellenlänge als erste physikalische Eigenschaft auf und das Licht der zweiten Lichtquelle 20 weist eine von der ersten Wellenlänge verschiedene zweite Wellenlänge als zweite physikalische Eigenschaft auf. Das Licht 14 der ersten Lichtquelle 10 wird über optische Mittel 12 und einen Strahlteile 26 in den Anregungsstrahlengang eingekoppelt und über die Mikroskopoptik 30 als Beleuchtungslicht auf eine Probe 32 geleitet. Mithilfe des Lichts 14 der ersten Lichtquelle 10 wird eine Weitfeldmessung durchgeführt. Von der Probe 32 zurückgestrahltes Licht 14 tritt im Wesentlichen ungehindert durch die Anregungsmaske 40 und auch durch einen Strahlteiler 16 hindurch und wird über einen Spiegel 70 in Richtung der Detektionseinheit 50 umgelenkt.
Vor der Detektionseinheit 50 ist ein Filterrad 60 mit verschiedenen Farbfiltern 62, 64 angeordnet. Im gezeigten Beispiel soll der Farbfilter 64 für Licht 14 der ersten Lichtquelle 10 transparent sein, so dass in der in Fig. 1 gezeigten Situation das Licht 14 der ersten Lichtquelle 10 ungehindert durch den Farbfilter 64 hindurchtritt und in der Detektionseinheit 50 nachgewiesen werden kann. Die Lichtquelle 20 liefert Licht 24 mit einer zweiten Wellenlänge, die bevorzugt kürzer ist als die Wellenlänge des Lichts der ersten Lichtquelle 10. Das Licht 24 der zweiten Lichtquelle 20 wird über optische Mittel 22 und einen Strahlteiler 16 in den Anregungsstrahlengang eingekoppelt. Im Unterschied zum Licht 14 der ersten Lichtquelle 10 wird dem Licht 24 aber dann gemäß dem wesentlichen Gesichtspunkt der Erfindung durch die Anregungsmaske 40 eine räumliche Struktur aufgeprägt, welche beispielsweise geeignet ist, von der Probe 32 ein konfokales Bild zu erhalten. Hierzu wird die Anregungsmaske 40 in geeigneter Weise relativ zur optischen Achse des Systems bewegt. Dies kann einerseits erfolgen durch Rotation um eine Achse 42, wie durch den Pfeil 44 angedeutet. Prinzipiell ist aber auch eine Linearbewegung, angedeutet durch einen Doppelpfeil 46, möglich.
Das Licht 24, dem durch die Anregungsmaske 40 eine räumliche Struktur aufgeprägt wurde, gelangt über den Strahlteiler 26 und die Mikroskopoptik 30 auf die Probe 32. Von dort zurückreflektiertes Licht 24 nimmt im Wesentlichen denselben Weg über die Mikroskopoptik, den Strahlteiler 26 und die Anregungsmaske 40 zurück und wird sodann wenigstens teilweise durch den Strahlteiler 16 transmittiert und wiederum über den Spiegel 70 in Richtung der Detektionseinheit 50 umgelenkt. Wenn der Farbfilter 62 des Filterrads 60 im Strahlteiler positioniert ist, tritt das Licht 24 der zweiten Lichtquelle durch diesen Farbfilter hindurch und kann in der Detektionseinheit nachgewiesen werden. Die Detektionseinheit 50 besteht im gezeigten Ausführungsbeispiel bevorzugt aus einem CCD-Sensor-Array.
Eine Drehbewegung des Filterrads ist in Fig. 1 durch den Pfeil 68 angedeutet.
Ein besonders einfaches Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung 100 ist in Fig. 2 gezeigt. Im Unterschied zu der in Fig. 1 dargestellten Variante kommt dieses Ausführungsbeispiel mit nur einer Lichtquelle 10 aus. Diese Lichtquelle 10 liefert Licht sowohl mit der ersten als auch mit der zweiten Wellenlänge, wobei prinzipiell hierzu eine breitbandige Lichtquelle 10 verwendet werden kann. Die übrige Funktion entspricht derjenigen, die mit Bezug auf Fig. 1 beschrieben wurde.
Wesentlich für die Erfindung ist demgemäß eine Anregungsmaske, die auch als Gitterplatte bezeichnet werden kann, auf der die jeweiligen Filter mit einer genügend kleinen Strukturgröße aufgebracht werden. Insbesondere handelt es sich dabei um Farbfilter und demgemäß um eine Farbfilterscheibe mit Farbgittern. Diese Farbfilter müssen, damit die mikroskopische Information im Weiteren geeignet und hinreichend gut getrennt werden können, außerdem eine hinreichend hohe Unterdrückung der jeweils anderen Lichtkomponente aufweisen. Beispielsweise müssen in dem Fall, dass die Wellenlänge zur Diskriminierung verwendet wird, die Filter eine genügend hohe Farbunterdrückung aufweisen.
Anstelle eines Gitters werden fein strukturierte Farbfilter zur Erzeugung der Konfoka- lität verwendet. Dadurch kann die getriggerte Erzeugung und Detektion von konfokaler und Weitfeldinformation entfallen.
Je nach Variante kann zusätzlich sehr einfach die Farbinformation ausgelesen werden.
Durch einen geringen zusätzlichen konstruktiven Aufwand ist es außerdem möglich, die konfokale Information und die Weitfeldinformation zeitgleich auszulesen. Dadurch kann die Aufnahmegeschwindigkeit im Prinzip verdoppelt werden.
Das kurzwellige Licht wird auf die Anregungsmaske 40, die auch als Gitterplatte bezeichnet wird, gelenkt. Sinnvollerweise wird für die konfokale Beleuchtung die kürzere Wellenlänge gewählt, weil die konfokale Auflösung empfindlich von der Wellenlänge abhängt und mit kürzeren Wellenlängen besser wird. Die Gitterplatte besteht aus fein strukturierten Farbfiltern, deren laterale Ausdehnung den Anforderungen der Konfokalität entspricht. Die Farbfilter sind wechselseitig für die kürzere Wellenlänge durchlässig und undurchlässig. Die durchlässigen Bereiche sind Kurzpassfilter, die den entsprechenden Spektralbereich durchlassen. Die nicht durchlässigen Bereiche sind entsprechend Langpässe, welche diesen Wellenlängenbereich blockieren.
Das kurzwellige Licht trifft nach der Gitterplatte durch die weiteren abbildenden Optiken 30 auf die Probe 32 und wird von dort zurück zur Anregungsmaske 40 oder Gitterplatte reflektiert. Gemäß dem konfokalen Prinzip geht nur der Teil des Lichts durch die Kurzpassfilter, bei dem sich die Oberfläche der Probe 32 genau im Brennpunkt befindet. Das langwellige Licht fällt über die Abbildungsoptiken 30 direkt auf die Probe, wird dort reflektiert und tritt auf dem Rückweg ungehindert durch die Anregungsmaske 40 wieder hindurch.
Das kurzwellige konfokale Licht und das langwellige Weitfeldlicht werden von der Anregungsmaske 40 aus zur Detektionseinheit 50 geleitet und dort detektiert. Im gezeigten Beispiel beinhaltet die Detektionseinheit 50 ein zweidimensionales Sensor- Array. In der Basisvariante befinden sich hier auf einem Filterrad 60 zwei Farbfilter 62, 64. Das Filterrad 60 lässt sich um eine mit dem Bezugszeichen 66 gekennzeichnete Achse drehen und lässt je nach Filterradstellung den konfokalen Anteil oder den Weitfeldanteil des Lichts hindurch. Das wird durch den Kerngedanken der Erfindung ermöglicht, dass die beiden mikroskopischen Informationen getrennt, nämlich, durch die erste physikalische Eigenschaft und die davon verschiedene zweite physikalische Eigenschaft, insbesondere, wie im hier gezeigten Beispiel, chromatisch getrennt, vorliegen.
Durch eine Synchronisierung von getriggertem Farbfilter und Bildaufnahme ist es möglich, nacheinander die Weitfeld Information und die konfokale Information mit einem Sensor-Array zu detektieren.
Das laterale Scannen oder Rastern über die Probe erfolgt durch Verfahren der Gitterplatte, also der Anregungsmaske 40, senkrecht zur optischen Achse, ähnlich wie bei einem herkömmlichen Spinning-Disc-System mit Nipkow-Scheibe.
Gitterplatte und getriggerter Farbfilter sind in diesem Beispiel als rotierende Scheiben ausgeführt. Es ist aber auch möglich, die Farbfilter linear in einer Richtung zu bewegen.
Ein Aufbau ganz ohne bewegliche Teile kann mit Flüssigkristall Arrays erreicht werden.
Besonders vorteilhaft ist auch, wenn die Lichtquelle, welche zur strukturierten Beleuchtung verwendet wird, insbesondere also zur Generierung eines mikroskopischen Bilds eingesetzt wird, eine möglichst kurze Wellenlänge aufweisen, die in der Regel nicht kürzer sein sollte, als die Weitfeldwellenlänge. Zweckmäßig sind außerdem zusätzliche Farbfilter nach den Beleuchtungskörpern, um sauber getrennte Farbspektren der einzelnen Anregungswellenlängen zu ermöglichen.
Möglich sind außerdem folgende Varianten:
Variante 1 : Konfokale Anregung mit kurzwelligem monochromatischem schmalban- digem Licht. Je nach Auslegung der Optik gegenüber chromatischen Aberrationen sollte das langwelligere Licht ebenfalls schmalbandig sein und nur eine geringfügig höhere Wellenlänge haben oder es kann deutlich langwelliger und breitbandiger sein. Der Nachweis erfolgt mit einem einkanaligen Sensor-Array, beispielsweise einer CCD- oder CMOS-Kamera.
Vor dem Detektor kann sich ein Farbfilter befinden, der je nach Stellung den kurzwelligen Anteil oder den langwelligen Anteil hindurchlassen kann.
Variante 2: Bei einer Abwandlung der Variante 1 erfolgt die Detektion über einen Farbteiler, der das Licht auf zwei Sensor-Arrays lenkt. Hier ist vorteilhafterweise keine Triggerung notwendig.
Variante 3: Anstelle von zwei separaten Sensor-Arrays wird ein und dasselbe Sensor-Array in zwei verschiedene Bereiche unterteilt und der Farbteiler lenkt das Licht auf den ersten beziehungsweise den zweiten Teil. Diese kostengünstige Lösung ermöglicht nur ein kleineres Bildfeld und deshalb eine kleinere Auflösung.
Prinzipiell kann die Weitfeldbeleuchtung mit Weißlicht durchgeführt werden.
Weitere Variationsmöglichkeiten erhält man durch Kombination der jeweils vorgeschlagenen Beleuchtungen.
Variante 4: Anstelle des Farbfilters mit zwei Farbbereichen im Detektionsstrahlen- gang können weitere zusätzliche Bereiche mit Bandpässen verwendet werden, um eine chromatische Aufteilung des Weitfeldspektrums zu erlauben. Für ein komplettes Bild müssen dann nicht nur zwei Einzelbilder erzeugt werden, sondern für jeden Farbkanal ein Bild. Hierbei wird vorteilhafterweise die zusätzliche Erfassung der Farbinformation der Probe ermöglicht. Der Farbfilter kann prinzipiell auch so strukturiert sein, dass bei jedem zweiten Einzelbild die konfokale Information ausgelesen wird. Das Auslesen der Farbinformation erfolgt dabei über mehrere z-Schnitte hinweg. Weil die Weitfeldinformation im Vergleich zur konfokalen Information unempfindlicher gegenüber Änderungen des Brennpunkts ist, ist das ohne Qualitätseinbußen möglich und die mikroskopische Information kann bei dieser Variante sehr effektiv bereitgestellt werden.
Alternativ oder zusätzlich kann auch ein Farbfilter mit mehreren unterschiedlichen Farbfeldern vor das Sensor-Array für die Weitfelddetektion positioniert werden. Die komplette Farbdetektion erfolgt dann für jeden z-Schnitt einzeln. Eine höhere Aufnahmegeschwindigkeit kann außerdem erzielt werden, wenn als Sensor-Array ein mehrkanaliges Sensor-Array, insbesondere ein dreikanaliges Sensor-Array mit den Farben gelb, rot und blau verwendet wird. Als Vorteil wird hier eine kostengünstige Detektion der Farben ohne Geschwindigkeitsverlust erreicht. Allerdings ist die Auflösung verringert, weil nur ein Bruchteil der Lichtsensoren im kurzwelligen konfokalen Bereich empfindlich ist.
Dies kann prinzipiell vermieden werden, wenn für die konfokale mikroskopische Information eine separate Kamera verwendet wird.
Anstelle der Weitfeldbeleuchtung kann insbesondere auch eine durchstimmbare Lichtquelle oder ein nach der Lichtquelle angeordneter Farbverlaufsfilter, welcher im Prinzip der zuvor erwähnten Filterwechseleinrichtung entspricht, zur Bestimmung der Farbinformation verwendet werden.
Sodann kann anstelle von zwei Lichtquellen auch eine breitbandige Lichtquelle verwendet werden. Dies ist eine besonders einfache Variante der vorliegenden Erfindung. Diese breitbandige Lichtquelle wird anstelle der kurzwelligen Lichtquelle zur Erzeugung des konfokalen Bilds verwendet. Die Weitfeldbeleuchtung erfolgt dann ebenfalls mit dieser Lichtquelle und die zweite Lichtquelle kann dann entfallen. Weiße LEDs mit einem Peak im Spektrum im blauen oder violetten Bereich und einem breiten langwelligen Spektrum können beispielsweise hierzu verwendet werden. Zweckmäßigerweise ist bei dieser Variante auf eine gute Trennung der Farbinformation im Detektionsstrahlengang zu achten. Anstelle von Anregungsmasken, die im Wesentlichen strukturierte Farbfilter sind und die zum Generieren der mikroskopischen Information mit strukturierter Beleuchtung über den Strahlengang, insbesondere im Bereich eines Zwischenbilds, hinwegbewegt werden, können auch Durchlicht-LCDs, also Flüssigkristallkomponenten, verwendet werden. Diese Komponenten sind prinzipiell auch chromatisch einstellbar erhältlich. Als wesentlicher Vorteil dieser Varianten ist anzusehen, dass ein System völlig ohne bewegliche Teile aufgebaut werden kann. Diese Flüssigkristallkomponenten können insbesondere auch so angesteuert werden, dass die Strukturierung, bestehend aus ein- und/oder zweidimensionalen Elementen, statistisch verteilt ist.
Das erfindungsgemäße Prinzip kann auch mithilfe von polarisiertem Licht und Polfiltern verwirklicht werden. Das ist insbesondere mit schnell schaltbaren Flüssigkristallkomponenten möglich. Polarisiertes Licht bietet außerdem die Möglichkeit, Streulicht mithilfe von weiteren Polfiltern zu unterdrücken. Zu berücksichtigen ist dabei, dass eine Mikrostruktur der zu untersuchenden Probe ebenfalls die Polarisation des Lichts beeinflussen kann.
Außerdem ist es grundsätzlich möglich, das hier beschriebene Prinzip auch in Reflexion statt in Transmission umzusetzen. Das gilt insbesondere für die Variante mit einem DLP-Projektionssystem (Digital Light Processing = DLP). Mit diesen Komponenten kann eine sehr genaue und schnelle Erzeugung und ein rascher Wechsel der Anregungsmaske bewerkstelligt werden.
Bezugszeichenliste
10 erste Lichtquelle
12 erste optische Mittel
14 Licht der ersten Lichtquelle 0 zweite Lichtquelle
2 zweite optische Mittel
4 Licht der zweiten Lichtquelle 0 Mikroskopoptik
2 Probe
0 Anregungsmaske
2 Drehachse der Anregungsmaske4 Drehpfeil
6 Doppelpfeil
0 Detektionseinheit
0 Filterrad
2 erster Farbfilter
4 zweiter Farbfilter
6 optische Achse
8 Rotationspfeil
0 Spiegel
00 Vorrichtung

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Vorrichtung zur Mikroskopie,
mit mindestens einer Lichtquelle (10, 20) zum Bereitstellen von Beleuchtungslicht,
mit einer Detektionseinheit (50) zum Nachweis von von einer Probe (32) zurückgestrahltem Licht,
mit einer Mikroskopoptik (30) zum Leiten von Beleuchtungslicht auf die Probe (32) und zum Leiten von von der Probe (32) zurückgestrahltem Licht in Richtung der Detektionseinheit (50) und
mit einer in einem Beleuchtungsstrahlengang angeordneten Anregungsmaske (40) zum Bereitstellen einer strukturierten Beleuchtung,
dadurch g e k e n n z e i c h n e t ,
dass die Anregungsmaske (40) ein räumlich strukturierter Filter ist,
der für Licht (14) mit einer ersten physikalischen Eigenschaft transparent ist und
der Licht (24) mit einer von der ersten physikalischen Eigenschaft verschiedenen zweiten physikalischen Eigenschaft eine räumliche Strukturierung aufprägt.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 ,
dadurch g e k e n n z e i c h n e t ,
dass die Anregungsmaske (40) ein- oder zweidimensionale Strukturierungen . aufweist. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Anregungsmaske (40) chromatisch einstellbare Flüssigkristallkomponenten aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Anregungsmaske (40) ein Reflexions- oder ein Transmissionsfilter ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Anregungsmaske (40) einen digitalen Mikrospiegel aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet,
dass genau eine Lichtquelle vorhanden ist, die sowohl Licht (14) mit der ersten physikalischen Eigenschaft als auch
Licht (24) mit der zweiten physikalischen Eigenschaft aussendet.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichn et ,
dass die erste physikalische Eigenschaft eine erste Wellenlänge oder ein erster Wellenlängenbereich des Lichts und
dass die zweite physikalische Eigenschaft eine von der ersten Wellenlänge verschiedene zweite Wellenlänge des Lichts oder ein von dem ersten Wellenlängenbereich verschiedener zweiter Wellenlängenbereich des Lichts ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet,
dass die erste physikalische Eigenschaft eine erste Polarisation des Lichts und die zweite physikalische Eigenschaft eine von der ersten Polarisation verschiedene zweite Polarisation des Lichts ist.
9. Vorrichtung nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet,
dass die erste Wellenlänge größer ist als die zweite Wellenlänge.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9,
dadurch gekennzeichnet,
dass mindestens eine der Lichtquellen (20) durchstimmbar ist.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10,
dadurch gekennzeichnet,
dass mindestens eine der Lichtquellen (20) breitbandig ist.
12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11,
dadurch gekennzeichnet,
dass vor der Detektionseinheit (50) und/oder nach mindestens einer der Lichtquellen eine Filterwechseleinrichtung, insbesondere ein Filterrad (60), mit einer Mehrzahl von verschiedenen Filtern (62, 64) vorhanden ist.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Filter Farbfilter sind.
14. Vorrichtung nach Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Filter Polarisationsfilter sind.
15. Vorrichtung nach Anspruch 13,
dadurch gekennzeichnet,
dass die verschiedenen Farbfilter (62, 64) so an der Filterwechseleinrichtung angeordnet sind, dass nach jedem zweiten Bild eine konfokale Information ausgelesen werden kann. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15,
dadurch gekennzeichnet,
dass vor der Detektionseinheit (50) ein Strahlteiler zum Auftrennen von Licht (14) mit der ersten physikalischen Eigenschaft und Licht (24) mit der zweiten physikalischen Eigenschaft vorhanden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 16,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Strahlteiler ein Farbstrahlteiler oder ein Polarisationsstrahlteiler ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 17,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Detektionseinheit (50) mindestens ein Sensorarray, insbesondere eine CCD- oder eine CMOS-Kamera, aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 18,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Detektionseinheit (50) mindestens ein mehrkanaliges Sensorarray aufweist.
Verfahren zur Mikroskopie,
bei dem eine Probe (32) mit Beleuchtungslicht beleuchtet wird,
bei dem von der Probe (32) zurückgestrahltes Licht nachgewiesen wird, bei dem das Beleuchtungslicht mit einer Anregungsmaske (40) räumlich strukturiert wird und
bei dem als Anregungsmaske (40) ein räumlich strukturierter Filter verwendet wird,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Filter für Licht (14) mit einer ersten physikalischen Eigenschaft transparent ist und
dass der Filter Licht (24) mit einer von der ersten physikalischen Eigenschaft verschiedenen zweiten physikalischen Eigenschaft eine räumliche Strukturierung aufprägt.
21. Verfahren nach Anspruch 20,
dadurch gekennzeichnet,
dass die dem Licht (24) mit der zweiten physikalischen Eigenschaft aufgeprägte räumliche Strukturierung die Extraktion eines konfokalen Bilds ermöglicht.
22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21,
dadurch gekennzeichnet,
dass mit dem Licht (14) mit der ersten physikalischen Eigenschaft ein Weitfeldbild aufgenommen wird.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22,
dadurch gekenn zeichn et,
dass ein Scanning in z-Richtung durchgeführt wird.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 23,
dadurch gekennzeichnet,
dass ein erster Bereich eines Sensorarrays zum Nachweis von Licht (14) mit der ersten physikalischen Eigenschaft verwendet wird und
dass ein zweiter Bereich des Sensorarrays zum Nachweis von Licht (24) mit . der zweiten physikalischen Eigenschaft verwendet wird.
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