WO2012160519A2 - Método diagnostico que determina la agresividad y pronostico del cáncer papilar de tiroides - Google Patents

Método diagnostico que determina la agresividad y pronostico del cáncer papilar de tiroides Download PDF

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Alexis KALERGIS PARRA
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a molecular method for determining the aggressiveness of papillary thyroid cancer in an individual suffering from it, which allows differentiating patients with papillary thyroid cancer with benign characteristics from those with aggressive characteristics. In this way, it can be determined whether or not the patient requires radical treatment and, at the same time, it prevents patients with benign tumors from undergoing unnecessary treatments that are of high impact.
  • Thyroid cancer is the most common endocrine neoplasia, with papillary thyroid carcinoma (CPT) being the subtype that accounts for 75-80% of cases (Sherman, SI, Lancet, 2003. 361 (9356): p. 501 - eleven ).
  • CPT papillary thyroid carcinoma
  • the number of cases of CPT has increased significantly, which can be explained in part by the emergence of better detection techniques.
  • numerous studies have warned about an increased incidence of thyroid cancer in the US (Sherman, 2003 and Jemal, A., et al., 2004. CA Cancer J Clin, 2004. 54 (1): p. 8-29) and in France [Leenhardt, L, et al., Eur J Endocrinol, 2004. 150 (2): p.
  • CPT treatment has included complete thyroid resection (total thyroidectomy) associated with radioactive iodine ablation and hormonal suppression with levothyroxine. With this management scheme, survival can reach 85-90% in 20 years (Sherman, 2003).
  • Said type of thyroid cancer is usually detected after thyroid surgery when doing a clinical analysis of the tumor.
  • the parameters that are measured clinically to determine the aggressiveness of a CPT correspond to the histological type, the size of the tumor, the presence of multifocality, compromise of surgical margins, invasion of the peritiroid tissue and lympho-vascular invasion.
  • lymphatic metastases In relation to lympho-vascular invasion, it is known that the presence of lymphatic metastases by CPT is associated with a higher risk of disease recurrence (20-30%), which in turn implies a greater risk of distant metastasis and mortality. in the medium term. For this reason, in the presence of clinically evident lymphatic metastases, it is necessary to perform a cervical lymph node dissection to remove all the involved lymph nodes, which constitutes a large and potentially morbid surgery. On the other hand, cervical recurrence of papillary thyroid cancer is of great relevance since surgical re-exploration has a high impact for patients, both physically, due to its surgical morbidity (Kupferman, ME, et al., Laryngoscope, 2002.
  • markers have been disclosed in the literature that could be useful for detecting aggressive CPT with lymph node metastases, however, there are currently no efficient markers, in terms of reliability and cost.
  • the markers disclosed in the literature correspond to BRAF with T1796A mutation (US2008241 132), increased expression of some proteins, including LIMD2, PTPRC, LTB, CD48 and ABCC3 (US2009068171 and WO2008130887) and CCR7 chemokine receptors (Sancho et al. 2006. J. Endocrinol. 191: 229-238) and CXCR4 (Yasouka et al. 2008. BMC Cancer 8: 274; Wagner et al. 2008. Ann. Surg. Oncol. 15 (S2): abstract 32).
  • Papillary thyroid cancer has the characteristic of being highly efficient and selective to metastasize to lymph nodes. This suggests the participation of a mechanism of cellular chemo-attraction mediated by substances released from lymph nodes, such as chemokines. Chemokines (also called chemokines or chymosins), mediated by the activation of their specific receptors (chemokine receptors), among their multiple functions have the property of directing cells to specific destinations such as lymph nodes. On the other hand, overexpression of chemokine receptors has been described in different neoplasms including breast cancer and melanoma, among others.
  • the metastatic phenotype of papillary thyroid cancer could be, in part, induced by the acquisition of these chemokine receptors during the process of malignant transformation. Because of this, we consider that certain chemokines and / or their receptors have the potential to be effective as markers of aggressiveness in CPT. However, the expression patterns of quimokin receptors are usually specific for different tissues and, therefore, it is not possible to predict or assume what is the normal pattern of expression in a particular tissue and what type of alterations in that pattern, if any, can be found in the case of cancer development aggressive.
  • chemokine receptors in papillary thyroid cancer with the objective, first, to identify and define the expression profile of a large group of chemokine receptors and then determine which or which of them might be appropriate as a marker of aggressiveness in the CPT.
  • the chemokine receptors selected for the study carried out by our group are: CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7 and CXCR4.
  • CPT presenting or not presenting clinical aggressiveness parameters
  • CCR3, CCR7 and CXCR4 receptors are increased in patients with CPT; and within that group of patients the expression of CCR3 is higher in those with clinical aggressiveness parameters.
  • CCR7 and CXCR4 have already been mentioned in the literature as possible markers of aggressiveness in different types of tumors, to our knowledge, CCR3 has never been proposed as a marker of aggressiveness in thyroid cancer or another type of cancer.
  • the increase of its expression correlated with the aggressiveness of the CPT is a novel observation that allows us to propose the use of CCR3 as a marker for the detection of aggressive tumors in patients with CPT.
  • CCR3 can be used by itself as an aggressive marker of the CPT or, also, can be used in combination with other molecular markers.
  • the present invention provides a diagnostic method that allows differentiating a
  • Benign CPT of an aggressive CPT in a patient comprises measuring the expression of CCR3 in a sample of thyroid tissue obtained from the patient under study.
  • CCR3 can be measured on its own or in conjunction with other markers.
  • Other markers that can be quantified for the diagnosis of prognosis of CPT correspond to the CCR7 and CXCR4 chemokine receptors or other markers other than chemokine receptors.
  • the quantification of CCR3 alone or in conjunction with the quantification of other markers makes it possible to compare the results with the standard values of said markers and thus determine whether the tumor analyzed corresponds to a tumor of aggressive or benign characteristics.
  • an overexpression of CCR3 correlates with a tumor with clinical parameters of aggressiveness, such as capsule invasion and metastasis.
  • the invention also relates to a kit that allows to determine the prognosis of a
  • CPT which includes reagents that allow the detection of CCR3 in a sample of thyroid tissue and instructions for use.
  • a kit is provided to determine the prognosis of CPT, which comprises reagents that allow the detection of CCR3 and other markers related to CPT.
  • Other markers that can be quantified for the diagnosis of prognosis of CPT correspond to the CCR7, CXCR4 and / or other types of markers other than the chemokine receptors.
  • the abundance of the CCR3 marker alone or in conjunction with other markers in the thyroid tissue sample can be carried out using techniques such as immunohistochemistry, semi-quantitative PCR, quantitative PCR (real-time PCR), ELISA, western blot, a combination of previous or other appropriate techniques.
  • FIG. 1 Immunohistochemistry for CCR3.
  • the figure shows representative photomicrographs of immunohistochemistry performed on 29 samples of patients with CPT. The expression of CCR3 in normal and tumor tissue is shown and for each of them the specificity control is shown with only the secondary antibody.
  • FIG. 3 Immunohistochemistry for CXCR4.
  • the figure on the left shows the representative photomicrographs of the immunohistochemistry performed on 29 samples of patients with CPT.
  • the expression of CXCR4 in normal tissue and from a tumor biopsy is shown, for each of them the specificity control with only the secondary antibody is shown.
  • FIG. 4 Correlation of CCR3 receptor expression with clinical parameters of tumor aggressiveness.
  • A with and without invasion of the capsule
  • B with and without invasion of adipose tissue
  • C with and without complete tumor resection
  • D with and without vascular invasion
  • E with and without lymphatic metastases.
  • Figure 5 Standardization of primers for ⁇ -actin and CCR3.
  • the figure shows a photograph of the gel obtained for the PCR products of CCR3 and ⁇ -actin in normal (N) and tumor (T) tissue samples.
  • the positive control corresponds to the cDNA of TPC1 cells and the negative control (-) corresponds to a sample without tempering.
  • FIG. 6 Representative amplification curves of real-time PCR.
  • the amplification curves of the CCR3, CCR7 and CXCR4 receptors are observed for a group of control thyroid samples from tumors. In all cases the positive control corresponds to cDNA of TPC-1 cells and the negative control corresponds to a sample without tempering where no amplification was obtained.
  • Figure 7. Real-time PCR analysis for chemokine receptors. In the figure, the analysis is shown by 2 ⁇ ⁇ 0 ⁇ using as reference gene 1 8S, in the expression of the CCR3, CXCR4 and CCR7 receptors in the tumor samples compared to the control samples.
  • the present invention describes a diagnostic method that differentiates a benign CPT from an aggressive CPT in a patient, which is based on the measurement of the expression of chemokine receptors in a sample of the patient's thyroid tissue.
  • the method comprises measuring the expression of CCR3 in a sample of thyroid tissue obtained from the patient under study.
  • CCR3 can be measured on its own or in conjunction with other markers.
  • the abundance of the CCR3 marker alone or in conjunction with other markers in the thyroid tissue sample can be carried out using techniques such as immunohistochemistry, semi-quantitative PCR, quantitative PCR (real-time PCR), ELISA, western blot, a combination of previous or other appropriate techniques.
  • the reagents necessary for this will be included in the kits proposed for the measurement of these receptors.
  • this will comprise the anti-CCR3 antibody and optionally, the antibodies selected from the group consisting of the anti-CCR4, anti-CCR5, anti-CCR6, anti-CCR7 and / or anti-antibody antibodies CXCR4.
  • the kit would include the appropriate secondary antibodies.
  • PCR kit In the case of a PCR kit, this would comprise the appropriate splitters for CCR3 and optionally comprise splitters for the amplification of CCR4, CCR5, CCR6, CCR7 and / or CXCR4. In both types of kits you can include all the additional reagents necessary for the analysis of the samples and an instruction that indicates the steps to follow. The reagents used for this type of analysis are indicated in detail in the examples of the present invention.
  • kits for immunohistochemistry corresponds to one comprising a blocking agent to decrease non-specific binding of the primary antibody.
  • the Locking solutions that are included are chosen among Dako, Perkin Elmer, etc.
  • the necessary antibodies are included, such as a-CCR3, a-CCR7 and a-CXCR4, which are labeled with some enzyme, fluorochromes, colloidal gold or others. If the antibodies are labeled with biotin, the DAB amplification reagent is included.
  • primary antibodies and secondary antibodies are included.
  • the primary antibodies comprise a-CCR3, a-CCR7 and a-CXCR4, and others that are deemed appropriate may be included.
  • the secondary antibodies may be corresponding monoclonal or polyclonal for the primary antibodies included in the kit. Secondary antibodies are labeled with either an enzyme, fluorochromes, colloidal gold or others. If the antibodies are labeled with biotin, the DAB amplification reagent is included.
  • the essential component of the kit is the anti-CCR3 antibody and instructions for use. The other components may be included depending on the immunohistochemical technique for which the kit is intended.
  • a CCR3 detection kit by means of RT-PCR comprises the following components: the specific CCR3 splitters, which can be those indicated in table 3 or others obtained from the literature or designed by means of a splitter design software; enzymes necessary for the polymerase chain reaction, where said enzymes correspond to a reverse transcriptase, a DNA polymerase (Taq polymerase); Nuclease-free water and PCR buffers.
  • An instruction manual is included to carry out the detection of CCR3 by means of the kit.
  • QPCR real-time PCR
  • a master mix can be included.
  • Chemokines are a family of small proteins ( ⁇ 8-14 kDa), inducible, secreted and proinflammatory, which act as a chemoattractant for cell migration. Among the various functions they have, they participate in immune response processes, such as the attraction of lymphocytes to lymph nodes or areas of infection. They act primarily by inducing cytoskeleton rearrangement, firm adherence to endothelial cells and directed cell migration. So far, more than 50 types of chemokines have been described and classified into highly conserved subgroups - CXC, CC, C and CX3C - based on the position of the first two cysteine residues adjacent to the N-terminal.
  • chemokine receptors 18 human chemokine receptors have been identified, which have seven transmembrane domains forming part of a subgroup of G-protein coupled receptors.
  • the chemokine receptors are divided into groups depending on the type of chemokine to which they bind; Thus, CCR receptors bind to CC chemokines, CXCR receptors bind to CXC chemokines, and CX3CR1 bind to the only CX3C chemokine (CX3CL1).
  • the leukocyte type that infiltrates a tissue correlates with its pattern of chemokine receptor expression and the relative concentrations of the respective ligands present in a given tissue.
  • the chemokine gradient that attracts infiltrating cells is generated by the various cells of a particular tissue.
  • functional chemokine receptors have also been found in endothelial cells and some epithelial cells, particularly those that have undergone malignant transformation. The influence of chemokines on the metastatic potential and site-specific spread of tumor cells has gained great interest in the study of chemokine and cancer receptors.
  • chemokine receptors have been observed in multiple malignancies including breast cancer, malignant melanoma, lung cancer and epidermoid head and neck cancer among others.
  • breast cancer it has been observed that tumor cells express a pattern of chemokine receptors that have affinity for chemokines expressed in organs to which they frequently metastasize (Muller, A., et al. Nature, 2001 410 (6824): p. 50-6).
  • CXCR4 and CCR7 chemokine receptors were found in cell lines and breast cancer biopsies, which is consistent with the elevated levels of their respective ligands - CXCL12 and CXCL21 - in the sites that frequently metastasize (lymph nodes, lung and liver). Moreover, the CXCR4 blockade inhibited the metastasis of breast cancer cells in an experimental animal model.
  • chemokines induce various processes that favor the initiation and consolidation of metastasis including regulation of angiogenesis, activation of metalloproteases, activation of proliferation, and inhibition of apoptosis.
  • CXCR4 chemokine receptor stimulates the migration of tumor cells and increases their invasion through a recomposed extracellular matrix (Matrigel) and endothelial cell monolayers (Balkwill, F., Semin Cancer Biol, 2004 14 (3): p. 171-9; Koshiba, T., et al., Clin Cancer Res, 2000. 6 (9): p. 3530-5).
  • chemokine CXCL12 promotes the proliferation and survival of cells maintained in sub-optimal conditions, such as cell culture in low serum concentrations in the medium (Scotton, CJ, et al., Cancer Res, 2002. 62 (20): p. 5930-8; Zhou, Y., et al., J Biol Chem, 2002. 277 (51): p. 49481 - 7).
  • This adaptation to adverse conditions induced by chemokines would allow tumor cells to grow in distant sites that would be unfavorable in other conditions.
  • the accumulated evidence supports the importance of chemokine receptors in the metastatic process.
  • the expression patterns of the chemokine receptors are usually specific for different tissues and, therefore, it is not possible to predict or assume what is the normal pattern of expression in a particular tissue and what type of alterations in that pattern, if it is that there are, can be found in the case of the development of aggressive cancer.
  • Example 1 Obtaining thyroid tissue samples
  • Thyroid tissue samples both normal and papillary cancer, were obtained from operated patients undergoing total thyroidectomy by CPT. Extraction surgery was performed with the express consent of the patients. The tissues analyzed during this work were the following: Normal thyroid epithelium and CPT, both tissues were extracted from the same patient.
  • Tissue samples were transported in cold PBS from the pavilion of the clinical hospital of the Pontifical Catholic University of Chile to the Molecular Immunology Laboratory of the Faculty of Biological Sciences of the Pontifical Catholic University of Chile.
  • the tissue was cleaned of adipose tissue remnants and divided into two parts (depending on the sample size) each section with a minimum diameter of 0.4 cm.
  • a part of the tissue was stored at 4 2 C in later RNA, to subsequently extract mRNA to be analyzed by real-time RT-PCR and a second part was fixed in paraformaldehyde to be analyzed by immunohistochemistry.
  • the fresh tissue that was selected to be analyzed by immunohistochemistry was fixed in 3% paraformaldehyde in TBS for 18 hours at 4 2 C.
  • the tissues were dehydrated using an alcohol battery.
  • the tissues were immersed in 70% ethanol three times for 20 min; then in 95% ethanol three times for 20 min; then in 100% ethanol three times for 20 min; and finally the tissues are immersed in Xylol / Ethanol (1: 2) for 30 min, then in Xilol / Ethanol (1: 1) for 30 min, Xylol / Ethanol (2: 1) for 30 min, Xilol 1 00% three times for 30 min, Xylol / paraffin once for 1 hr. (56 2 C), then the cuts are left in 1 00% paraffin overnight at 56 2 C and changes are made to 1 00% paraffin for 1 hr (56-60 2 C).
  • the tissues in liquid paraffin are transferred to Lewkart plates for the formation of the tacos. Once the paraffin has cooled, it solidifies and the cuts are embedded inside it.
  • the tacos are used to cut the tissues in the microtome (Leica, RM2235). 5 ⁇ thick cuts were obtained that were deposited on silanized slides (Marienfeld) stored at 4 ° C until use. Prior to immunohistochemistry, the cuts must be deparaffinized and rehydrated. The samples were immersed in 1% xylol twice for 10 min; then in 100% ethanol twice for 10 min; 95% ethanol twice for 2 min; 70% ethanol twice for 2 min; and finally they were rehydrated in distilled water for 5 min and TBS for 5 min.
  • the rehydrated cuts were submerged in AC buffer (citric acid buffer) pH 6 (41 mL 10mM sodium citrate, 9 mL 0.1 M citric acid, 450 mL H 2 0 distilled ) for 10 min at maximum power in a microwave oven. Then it cooled to room temperature with cold buffer AC and washed three times with distilled H 2 0. Subsequently, the endogenous peroxidic activity was blocked with 3% H 2 0 2 in TBS for 15 min and washed three times with TBS for 5 min. Tissue cuts were blocked to decrease binding.
  • AC buffer citric acid buffer
  • pH 6 41 mL 10mM sodium citrate, 9 mL 0.1 M citric acid, 450 mL H 2 0 distilled
  • the endogenous peroxidic activity was blocked with 3% H 2 0 2 in TBS for 15 min and washed three times with TBS for 5 min. Tissue cuts were blocked to decrease binding.
  • the block consisted of incubating the cuts in blocking solution (Dako, catalog No. X0909) 1 hour at room temperature. Incubation with the primary antibody was performed in blocking solution overnight at 4 ° C.
  • the primary antibodies that were used in the immunohistochemistry were: rat monoclonal a-CCR3 (1: 1000, RyD Systems, MAB1 55 ), human monoclonal a-CCR7 (1: 250, RyD Systems) and human monoclonal a-CXCR4 (1: 250, RyD Systems, MAB173).
  • the cuts were washed three times with TBS-T for 5 minutes. The corresponding blotted secondary antibody was then added to the sections and incubated for 1 hour at room temperature.
  • the cuts were washed three times with TBS-T for 5 minutes and then the cuts were incubated with ABC for 45 minutes.
  • the cuts were washed three times with TBS-T for 5 minutes.
  • the development was carried out in a dark box using the DAB amplification reagent (SIGMA, catalog number D5905). Incubation with DAB may take 30 seconds to 20 min. Subsequently, the development was stopped by washing the cuts with distilled water. To identify the cell nuclei in the samples, it was stained with hematoxylin for 2 seconds and washed with drinking water.
  • the cuts were dehydrated (70% ethanol twice each time for 3 minutes; 95% ethanol twice each time for 3 minutes; 1% ethanol twice each time for 3 minutes; 100% xllol twice for 3 minutes) and they rode with entellán.
  • the mounting medium was dried, the samples were observed under a microscope (OLYMPUS BX4) and 4 photos of each tissue (control and tumor) of each patient were taken, using an Infinlty 2 camera attached to the microscope; the conditions under which the photographs were taken, exposure time, aperture of the diaphragm and lamp temperature were adjusted and stored, so that all photographs were taken in the same conditions.
  • the immunohlstochemical analysis was performed using the Image - pro plus version 6.0 program (Media Cybernetlc Inc.). This software allows to count the cores with or without coffee brand. In this way, it is possible to qualitatively identify the brand of each image and This is normalized by the number of nuclei observed, thus obtaining a percentage of labeled cells.
  • Example 4 RNA extraction and real-time RT-PCR from biopsies of patients with papillary thyroid cancer.
  • the biopsy of the thyroid lobe presenting the tumor was considered tissue with CPT and the biopsy of the contralateral lobe was considered as tissue. control.
  • the RNA was obtained using the commercial klt RNeasy Plus mlnl, following the manufacturer's instructions.
  • the complementary DNA was prepared.
  • 1 ⁇ _ of random prlmers (1 ⁇ g / 1 ⁇ _) was added, and nuclease-free water up to a volume of 5 ⁇ _ was brought to 70 2 C for 5 minutes in thermoclocker (PCR Sprint Thermal Cycler, from Termo Electron Corporation).
  • One mlx was prepared containing: 4 ⁇ _ of Improm II 5x (Reaction Buffer), 1.2 ⁇ _ MgCI 2 (1.5 mM), 1 ⁇ _ dNTPs mlx (0.5 mM), 0.5 ⁇ _ Inhibitor RNAse, 1 ⁇ _ Improm II RT 0.25 units (Reverse Transcrlptase enzyme), 7.3 ⁇ _ of nuclease-free water.
  • Peripheral blood mononuclear cell mRNA (PBMC) was used as a positive control. Samples were incubated at 25 2 C for 5 minutes and 42 2 C for 1 hour. The product was stored at - 20 2 C.
  • the specific transcripts of CCR3 and CXCR3 were amplified with the cDNA obtained with Taq pollmerase.
  • one mlx was prepared, which contained 2.5 ⁇ _ of 1 0X PCR reaction buffer, 1.25 ⁇ _ of mixture of 1 0 ⁇ splitters each (table 1, the sequences of the cleaners for CCR3 CCR7 and CXCR4 were obtained from the literature. The splitters for 1 8S and ⁇ -actlna were designed using AmplifX software.), 0.5 ⁇ _ of MgCI 2 1.5 mM, 0.5 ⁇ _ mixture of 0.2 mM dNTPs and 1 ⁇ _ of Taq pollmerase.
  • each reaction included a positive control, which corresponds to TPC-I cDNA or PBMC cDNA, and a control without tempering that corresponds to the mlx of reaction plus nuclease-free water instead of cDNA.
  • PCR reactions were performed using a denaturation cycle at 95 2 C for 3 minutes, 40 amplification cycles (denaturation at 95 2 C for 20 seconds, alignment temperature corresponding to the splitters for 20 seconds and extension at 72 2 C for 20 seconds) and a final extension cycle at 72 2 C for 5 minutes, in the thermal cycler (PCR Sprint Thermal Cycler, from Termo Electron Corporation).
  • Table 3 Splitters used for real-time PCR.
  • 2% agarose gels (Invitrogen) were prepared in TBE buffer pH 8.3 (Promega). The PCR products were mixed with the required volume of Blue I I buffer (6x) before being loaded into the gel. The electrophoresis was performed in a BioJSP agarose electrophoresis chamber, at a constant potential difference of 1 50 V, using a Bio-Rad power source (model 200 / 2.0). The gel was stained with a solution of SYBR safe DNA (Invitrogen) and the bands corresponding to the products were visualized and photographed on a UV transilluminator (Vilber Lourmat).
  • the mRNA was successfully isolated from patient samples and in turn the cDNA was obtained to perform real-time RT-PCR.
  • a unique amplification product is obtained for the transcripts of our genes of interest.
  • a product of the expected size is obtained for each gene analyzed (table 2).
  • the dissociation curve was performed for a cycle of 95 ° C for one min, and a temperature increase from 60 ° C to 95 ° C for 0.6 sec each temperature.
  • the standardization of the QPCR shows a unique product in the dissociation curve and an amplification approximately between cycles 1 8 and 38, depending on the gene under study (Fig. 1 .5).

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Abstract

La presente invención provee un método de diagnóstico que permite diferenciar un CPT benigno de un CPT agresivo en un paciente. El método comprende la medición de la expresión de CCR3 en una muestra de tejido tiroideo obtenida del paciente en estudio. CCR3 puede medirse por si solo o en conjunto con otros marcadores. Otros marcadores que pueden cuantificarse para el diagnóstico de pronóstico de CPT corresponden a los receptores de quimokinas CCR7 y CXCR4 u otro tipo de marcadores distintos de receptores de quimokinas. La cuantificación de CCR3 por si sola o en conjunto con la cuantificación de otros marcadores permite comparar los resultados con los valores estándar de dichos marcadores y así determinar si el tumor analizado corresponde a un tumor de características agresivas o benignas. Específicamente, una sobreexpresión de CCR3 se correlaciona con un tumor con parámetros clínicos de agresividad, tal como invasión de la cápsula y metástasis. La invención también provee se refiere a un kit que permite determinar el pronóstico de un CPT, el cual comprende reactivos que permiten la detección de CCR3 en una muestra de tejido tiroideo e instrucciones de uso. En otra modalidad de la invención, se provee un kit para determinar el pronóstico de CPT, el cual comprende reactivos que permiten la detección de CCR3 y de otros marcadores relacionados al CPT. Otros marcadores que pueden cuantificarse para el diagnóstico de pronóstico de CPT corresponden a los receptores de quimokinas CCR7, CXCR4 y/u otro tipo de marcadores distintos de los receptores de quimokinas.

Description

METODO DIAGNOSTICO QUE DETERMINA LA AGRESIVIDAD Y PRONOSTICO DEL
CANCER PAPILAR DE TIROIDES
Campo de la Invención:
La presente invención se refiere a un método molecular para determinar la agresividad del cáncer papilar de tiroides en un individuo que lo padece, lo cual permite diferenciar pacientes con cáncer papilar de tiroides con características benignas de aquellos con características agresivas. De esta manera, se puede determinar si el paciente requiere o no un tratamiento radical y, al mismo tiempo, se evita que pacientes con tumores benignos sean sometidos a tratamientos no necesarios que son de alto impacto.
Antecedentes de la Invención:
El cáncer de tiroides es la neoplasia endocrina más frecuente, siendo el carcinoma papilar de tiroides (CPT) el subtipo que representa el 75 - 80% de los casos (Sherman, S.I., Lancet, 2003. 361 (9356): p. 501 -1 1 ). En los últimos años, el número de casos de CPT ha aumentado en forma muy significativa, lo cual puede ser explicado en parte por la aparición de mejores técnicas de detección. Sin embargo, numerosos estudios han alertado acerca de un aumento de la incidencia de cáncer tiroideo en los EEUU (Sherman, 2003 y Jemal, A., et al., 2004. CA Cáncer J Clin, 2004. 54(1 ): p. 8-29) y en Francia [Leenhardt, L, et al., Eur J Endocrinol, 2004. 150(2): p. 133-9 y Leenhardt, L et al. Thyroid, 2004. 14(12): p. 1 056-60). En Chile también se ha reportado un aumento progresivo de las tiroidectomías por cáncer de tiroides, llegando a quintuplicarse los casos entre 1 992 y 2003 (Fardella, C, et al., Rev Med Chi, 2005).
Clásicamente, el tratamiento del CPT ha incluido la resección completa de la tiroides (tiroidectomía total) asociado a la ablación con yodo radioactivo y la supresión hormonal con levotiroxina. Con este esquema de manejo la supervivencia puede llegar a 85- 90% a 20 años (Sherman, 2003). A pesar de la evolución generalmente benigna del CPT, existe un subgrupo de pacientes que presenta una forma de CPT más agresiva que hace necesario un tratamiento más radical. Dicho tipo de cáncer de tiroides, normalmente es detectado luego de la cirugía de tiroides al hacer un análisis clínico del tumor. Los parámetros que se miden clínicamente para determinar la agresividad de un CPT corresponden al tipo histológico, el tamaño del tumor, la presencia de multifocalidad, compromiso de márgenes quirúrgicos, invasión al tejido peritiroideo e invasión linfo-vascular. En relación a la invasión linfo-vascular, se conoce que la presencia de metástasis linfáticas por CPT se asocia a mayor riesgo de recurrencia de la enfermedad (20 - 30%), lo que a su vez implica mayor riesgo de metástasis a distancia y mortalidad a mediano plazo. Por este motivo, en presencia de metástasis linfáticas clínicamente evidentes, resulta necesario realizar una disección ganglionar cervical para remover todos los nodulos linfáticos comprometidos, lo cual constituye una cirugía de gran envergadura y potencialmente mórbida. Por otra parte, la recurrencia cervical del cáncer papilar de tiroides es de gran relevancia dado que la re-exploración quirúrgica tiene alto impacto para los pacientes, tanto física, por su morbilidad quirúrgica (Kupferman, M. E. , et al., Laryngoscope, 2002. 1 12(7 Pt 1 ) : p. 1209-12; Kim, M.K., et al., Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 2004. 130(1 0): p. 1214- 6), como psicológica por lo que implica la persistencia de una enfermedad rebelde al tratamiento (Esnaola, N.F., et al., Surgery, 2001 . 130(6) : p. 921 -30). Dado que el CPT es una patología de alta prevalencia en nuestra población, resulta fundamental contar con métodos de evaluación que permitan identificar, antes de ser sometidos a una terapia definitiva, a este subgrupo de pacientes que presentan una forma más agresiva de la enfermedad, de manera de optimizar su manejo y tratamiento, y al mismo tiempo evitar que pacientes de bajo riesgo sean sometidos a tratamientos innecesarios y de tan alto impacto.
La identificación de pacientes con CPT que presentan tumores agresivos con riesgo de metástasis linfáticas, tradicionalmente se ha llevado a cabo analizando factores clínicos patológicos del tumor, tales como tipo histológico, tamaño tumoral, multifocalidad, invasión a tejido peritiroideo, invasión linfo-vascular y compromiso de márgenes quirúrgicos. Para el examen de varios de estos factores se hace necesaria una cirugía. Sin embargo, factores moleculares, tales como la presencia de biomarcadores en muestras de tejido de tumor tiroideo pueden entregar información de pronóstico más objetiva al patólogo y al médico tratante. Además, un análisis de ese tipo no requiere de una cirugía, sino que puede ser realizado en una muestra de tejido tiroideo obtenida de una biopsia con aguja. Dicho procedimiento se lleva a cabo con una aguja muy delgada que se introduce dentro de la tiroides y se extrae una muestra de células y líquido de esta glándula por aspiración.
En la literatura se han divulgado algunos marcadores que podrían ser útiles para detectar CPT agresivos con metástasis en los nodulos linfáticos, sin embargo, en la actualidad no se cuenta con marcadores eficientes, en cuanto a confiabilidad y costo. Los marcadores divulgados en la literatura corresponden a BRAF con mutación T1796A (US2008241 132), expresión aumentada de algunas proteínas entre las que se encuentran LIMD2, PTPRC, LTB, CD48 y ABCC3 (US2009068171 y WO2008130887) y los receptores de quimokinas CCR7 (Sancho et al. 2006. J. Endocrinol. 191 :229-238) y CXCR4 (Yasouka et al. 2008. BMC Cáncer 8:274; Wagner et al. 2008. Ann. Surg. Oncol. 15 (S2): abstract 32).
El cáncer papilar de tiroides posee la característica de ser altamente eficiente y selectivo para dar metástasis hacia los linfonodos. Esto sugiere la participación de un mecanismo de quimo-atracción celular mediado por sustancias liberadas desde los linfonodos, tal como quimokinas. Las quimokinas (también llamadas quimoquinas o quimosinas), mediadas por la activación de sus receptores específicos (receptores de quimokinas), entre sus múltiples funciones tienen la propiedad de dirigir células a destinos específicos como los linfonodos. Por otra parte, la sobre-expresión de receptores de quimokinas ha sido descrita en distintas neoplasias incluyendo el cáncer de mama y melanoma, entre otros. Entonces, el fenotipo metastático del cáncer papilar de tiroides podría ser, en parte, inducido por la adquisición de estos receptores de quimokinas durante el proceso de transformación maligna. Debido a esto, consideramos que ciertas quimokinas y/o sus receptores, tienen el potencial de ser efectivas como marcadores de agresividad en CPT. Sin embargo, los patrones de expresión de los receptores de quimokinas suelen ser específicos para distintos tejidos y, entonces, no es posible predecir o suponer cual es el patrón normal de expresión en un tejido particular y qué tipo de alteraciones en dicho patrón, si es que las hay, pueden encontrarse en el caso del desarrollo de un cáncer agresivo. Por lo tanto, nuestro trabajo consistió en el estudio de la expresión de receptores de quimokinas en el cáncer papilar de tiroides con el objetivo, primero, de identificar y definir el perfil de expresión de un grupo amplio de receptores de quimiokinas y, luego, determinar cuál o cuáles de ellos podría ser apropiado como marcador de agresividad en el CPT. Los receptores de quimokinas seleccionados para el estudio llevado a cabo por nuestro grupo son : CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7 y CXCR4.
Al estudiar la expresión de distintos receptores de quimokinas en pacientes con
CPT que presentan o no presentan parámetros clínicos de agresividad, hemos determinado que la expresión de los receptores CCR3, CCR7 y CXCR4 se encuentra aumentada en pacientes con CPT; y dentro de ese grupo de pacientes la expresión de CCR3 es más alta en aquellos que presentan parámetros clínicos de agresividad. Si bien, CCR7 y CXCR4 ya han sido mencionados en la literatura como posibles marcadores de agresividad en distintos tipos de tumores, de nuestro conocimiento, CCR3 nunca ha sido propuesto como marcador de agresividad en cáncer de tiroides u otro tipo de cáncer. El aumento de su expresión correlacionado con la agresividad del CPT es una observación novedosa que permite proponer el uso de CCR3 como marcador para la detección de tumores agresivos en pacientes con CPT. Este marcador, al diferenciar los tumores de CPT agresivos de los benignos, hace posible evitar un tratamiento de gran impacto en pacientes que no lo requieren. CCR3 puede ser usado por sí solo como marcador de agresividad del CPT o, también, puede utilizarse en combinación con otros marcadores moleculares.
Resumen de la Invención:
La presente invención provee un método de diagnóstico que permite diferenciar un
CPT benigno de un CPT agresivo en un paciente. El método comprende la medición de la expresión de CCR3 en una muestra de tejido tiroideo obtenida del paciente en estudio. CCR3 puede medirse por sí solo o en conjunto con otros marcadores. Otros marcadores que pueden cuantificarse para el diagnóstico de pronóstico de CPT corresponden a los receptores de quimokinas CCR7 y CXCR4 u otro tipo de marcadores distinto de receptores de quimokinas. La cuantificación de CCR3 por sí sola o en conjunto con la cuantificación de otros marcadores permite comparar los resultados con los valores estándar de dichos marcadores y así determinar si el tumor analizado corresponde a un tumor de características agresivas o benignas. Específicamente, una sobreexpresión de CCR3 se correlaciona con un tumor con parámetros clínicos de agresividad, tal como invasión de la cápsula y metástasis.
La invención también se refiere a un kit que permite determinar el pronóstico de un
CPT, el cual comprende reactivos que permiten la detección de CCR3 en una muestra de tejido tiroideo e instrucciones de uso. En otra modalidad de la invención, se provee un kit para determinar el pronóstico de CPT, el cual comprende reactivos que permiten la detección de CCR3 y de otros marcadores relacionados al CPT. Otros marcadores que pueden cuantificarse para el diagnóstico de pronóstico de CPT corresponden a los receptores de quimokinas CCR7, CXCR4 y/u otro tipo de marcadores distintos de los receptores de quimokinas.
La abundancia del marcador CCR3 por si sólo o en conjunto con otro marcadores en la muestra de tejido tiroideo puede llevarse a cabo utilizando técnicas como inmunohistoquímica, PCR semicuantitativo, PCR cuantitativo (PCR de tiempo real), ELISA, western blot, una combinación de las anteriores u otras técnicas apropiadas.
Descripción de las Figuras:
Figura 1. Inmunohistoquímica para CCR3. La figura muestra microfotografías representativas de la inmunohistoquímica realizada en 29 muestras de pacientes con CPT. Se muestra la expresión de CCR3 en tejido normal y proveniente de tumor y para cada uno de ellos se muestra el control de especificidad con sólo el anticuerpo secundario. Figura 2. Análisis de la expresión del receptor CCR3 en muestras de CPT. La figura muestra la expresión relativa del receptor CCR3 (n=29) en muestras de tejido de CPT (tumor, barra negra) en relación a su tejido control (normal, barra blanca). * P<0.001 Análisis estadístico Wilcoxon signed-rank test.
Figura 3. Inmunohistoquímica para CXCR4. La figura de la izquierda muestra las microfotografías representativas de la inmunohistoquímica realizada en 29 muestras de pacientes con CPT. Se muestra la expresión de CXCR4 en tejido normal y proveniente de una biopsia de tumor, para cada uno de ellos se muestra el control de especificidad con sólo el anticuerpo secundario. El gráfico de la derecha muestra la expresión relativa del receptor CXCR4 (n=29) en muestras de tejido de CPT (tumor, barra negra) en relación a su tejido control (normal, barra blanca). * P<0.001 Análisis estadístico Wilcoxon signed-rank test.
Figura 4. Correlación de la expresión del receptor CCR3 con parámetros clínicos de agresividad tumoral. La figura muestra la expresión relativa del receptor CCR3 (n=29) en muestras de tejido de CPT. A, con y sin invasión a la cápsula; B, con y sin invasión al tejido adiposo; C, con y sin resección completa del tumor; D, con y sin invasión vascular y E, con y sin metástasis linfáticas.
Figura 5. Estandarización de primers para β-actina y CCR3. La figura muestra una fotografía del gel obtenido para los productos de PCR de CCR3 y β-actina en muestras de tejido normal (N) y tumoral (T). El control positivo corresponde al ADNc de células TPC1 y el control negativo (-) corresponde a una muestra sin templado.
Figura 6. Curvas de amplificación representativas de PCR en tiempo real. Se observan las curvas de amplificación de los receptores CCR3, CCR7 y CXCR4, para un grupo de muestras de tiroides controles y procedentes de tumores. En todos los casos el control positivo corresponde a ADNc de células TPC-1 y el control negativo corresponde a una muestra sin templado donde no se obtuvo amplificado. Figura 7. Análisis de PCR en tiempo real para los receptores de quimiokinas. En la figura se muestra el análisis mediante 2 ~ΔΔ0Τ utilizando como gen de referencia 1 8S, en la expresión de los receptores CCR3, CXCR4 y CCR7 en las muestras tumorales comparadas con las muestras controles.
Descripción detallada de la invención:
La presente invención describe un método de diagnóstico que permite diferenciar un CPT benigno de un CPT agresivo en un paciente, el cual se basa en la medición de la expresión de receptores de quimokinas en una muestra de tejido tiroideo del paciente. En una modalidad preferida, el método comprende la medición de la expresión de CCR3 en una muestra de tejido tiroideo obtenida del paciente en estudio. CCR3 puede medirse por sí solo o en conjunto con otros marcadores.
La abundancia del marcador CCR3 por si sólo o en conjunto con otro marcadores en la muestra de tejido tiroideo puede llevarse a cabo utilizando técnicas como inmunohistoquímica, PCR semicuantitativo, PCR cuantitativo (PCR de tiempo real), ELISA, western blot, una combinación de las anteriores u otras técnicas apropiadas. En los kits propuestos para la medición de estos receptores se incluirán los reactivos necesarios para ello. En el caso del kit que se basa en inmunohistoquímica, este comprenderá el anticuerpo anti-CCR3 y opcionalmente, los anticuerpos seleccionados del grupo compuesto por los anticuerpos anti-CCR4, anti-CCR5, anti-CCR6, anti-CCR7 y/o anti-CXCR4. Además, el kit incluiría los anticuerpos secundarios apropiados. En el caso de un kit para PCR, este comprendería los partidores apropiados para CCR3 y opcionalmente comprendería partidores para la amplificación de CCR4, CCR5, CCR6, CCR7 y/o CXCR4. En ambos tipos de kits se pueden incluir todos los reactivos adicionales necesarios para el análisis de las muestras y un instructivo que indique los pasos a seguir. Los reactivos utilizados para este tipo de análisis se encuentran indicados en detalle en los ejemplos de la presente invención.
Un ejemplo de kit para inmunohistoquímica corresponde a uno que comprende un agente de bloqueo para disminuir la unión inespecífica del anticuerpo primario. Las soluciones de bloqueo que se incluyen se escogen entre Dako, Perkin Elmer, etc. Además, en el caso de inmunohistoquímica directa, se incluye los anticuerpos necesarios, tales como a-CCR3, a-CCR7 y a-CXCR4, los cuales se encuentran marcados ya sea con alguna enzima, fluorocromos, oro coloidal u otros. Si los anticuerpos están marcados con biotina, se incluye el reactivo de amplificación DAB. En el caso de un kit para inmunohistoquímica indirecta, se incluyen anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios. Los anticuerpos primarios comprenden a-CCR3, a-CCR7 y a-CXCR4, pudiéndose incluir otros que se consideren apropiados. Los anticuerpos secundarios pueden ser monoclonales o policlonales correspondientes para los anticuerpos primarios incluidos en el kit. Los anticuerpos secundarios se encuentran marcados ya sea con alguna enzima, fluorocromos, oro coloidal u otros. Si los anticuerpos están marcados con biotina, se incluye el reactivo de amplificación DAB. El componente esencial del kit es el anticuerpo anti-CCR3 y las instrucciones de uso. Los demás componentes pueden incluirse dependiendo de la técnica de inmunohistoquímica para la cual se destina el kit.
Un kit de detección de CCR3 por medio de RT-PCR comprende los siguientes componentes: los partidores específicos para CCR3, que pueden ser los indicados en la tabla 3 u otros obtenidos de la literatura o diseñados por medio de un software de diseño de partidores; enzimas necesarias para la reacción en cadena de la polimerasa, donde dichas enzimas corresponden a una transcriptasa reversa, una DNA polimerasa (Taq polimerasa); agua libre de nucleasas y buffers para PCR. Se incluye un manual de instrucciones de uso para llevar a cabo la detección de CCR3 por medio del kit. En el caso de QPCR (PCR en tiempo real) se puede incluir un master mix.
Las quimiokinas son una familia de proteínas pequeñas (~8-14 kDa), inducibles, secretadas y proinflamatorias, que actúan como quimoatrayente para la migración celular. Entre las diversas funciones que tienen, ellas participan en procesos de la respuesta inmune, como la atracción de linfocitos hacia los nodulos linfáticos o zonas de infección. Actúan primordialmente induciendo reordenamiento del citoesqueleto, adhesión firme a células endotellales y migración celular dirigida. Hasta ahora se han descrito más de 50 tipos de quimiokinas y se clasifican en subgrupos altamente conservados - CXC, CC, C y CX3C - basado en la posición de los dos primeros residuos de cisteína adyacente al N- terminal. Por otra parte, se han identificado 18 receptores de quimiokinas humanas, los que presentan siete dominios transmembrana formando parte de un subgrupo de receptores acoplados a proteína G. Los receptores de quimokinas se dividen en grupos dependiendo del tipo de quimiokina al que se unen; es así que los receptores CCR se unen a quimiokinas CC, los receptores CXCR se unen a quimiokinas CXC, y los CX3CR1 se unen a la única quimiocina CX3C (CX3CL1 ).
Desde el punto de vista de la inflamación, el tipo leucocito que infiltra un tejido se correlaciona con su patrón de expresión de receptores de quimiokinas y las concentraciones relativas de los respectivos ligandos presentes en un tejido determinado. La gradiente de quimiokinas que atrae células que infiltran es generada por las diversas células de un tejido particular. Aunque originalmente fueron identificados en leucocitos, los receptores de quimiokinas funcionales también se han encontrado en células endoteliales y algunas células epiteliales, particularmente aquellas que han sufrido transformación maligna. La influencia de las quimiokinas en el potencial metastático y diseminación sitio-específica de células tumorales ha cobrado gran interés en el estudio de receptores de quimiokinas y cáncer. En relación a esto, estudios recientes han demostrado la expresión de receptores de quimiokinas en múltiples neoplasias incluyendo el cáncer de mama, melanoma maligno , cáncer de pulmón y cáncer epidermoide de cabeza y cuello entre otros. Además, específicamente en el cáncer de mama, se ha observado que células tumorales expresan un patrón de receptores de quimiokinas que tienen afinidad por las quimiokinas expresadas en órganos a los cuales frecuentemente dan metástasis (Muller, A., et al.. Nature, 2001 . 410(6824): p. 50-6). En ese estudio se encontró alta expresión de los receptores de quimiokinas CXCR4 y CCR7 en líneas celulares y biopsias de cáncer de mama, lo cual es consistente con los niveles elevados de sus respectivos ligandos - CXCL12 y CXCL21 - en los sitios en que frecuentemente da metástasis (linfonodos, pulmón e hígado). Más aún, el bloqueo de CXCR4 inhibió la metástasis de células de cáncer de mama en un modelo experimental animal.
Aparte de la destinación celular, las quimiokinas inducen variados procesos que favorecen la iniciación y consolidación de la metástasis incluyendo la regulación de la angiogénesis, la activación de metaloproteasas, activación de la proliferación, y la inhibición de la apoptosis. Por ejemplo, se ha demostrado que la activación del receptor de quimokina CXCR4 estimula la migración de células tumorales y aumenta su invasión a través de una matriz extracelular recompuesta (Matrigel) y monocapas de células endoteliales (Balkwill, F., Semin Cáncer Biol, 2004. 14(3): p. 171 -9; Koshiba, T., et al., Clin Cáncer Res, 2000. 6(9): p. 3530-5). Por otra parte, en numerosos tipos de cáncer, incluyendo el glioma, el melanoma, ovario y riñon, la quimokina CXCL12 promueve la proliferación y supervivencia de células mantenidas en condiciones sub-optimas, como es el cultivo celular en bajas concentraciones de suero en el medio (Scotton, C.J., et al., Cáncer Res, 2002. 62(20) : p. 5930-8; Zhou, Y., et al., J Biol Chem, 2002. 277(51 ) : p. 49481 -7). Esta adaptación a condiciones adversas inducidas por quimiokinas permitiría que células tumorales crezcan en sitios distantes que en otras condiciones les serían desfavorables. Así, la evidencia acumulada, tanto clínica como experimental, apoya la importancia de los receptores de quimiokinas en el proceso metastático. Sin embargo, los patrones de expresión de los receptores de quimokinas suelen ser específicos para distintos tejidos y, entonces, no es posible predecir o suponer cual es el patrón normal de expresión en un tejido particular y qué tipo de alteraciones en dicho patrón, si es que las hay, pueden encontrarse en el caso del desarrollo de un cáncer agresivo. En nuestro desarrollo, enfocamos el análisis en la expresión de receptores de quimokinas CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7 y CXCR4. Ejemplo 1 : Obtención de muestras de tejido tiroideo
Las muestras de tejido tiroideo, tanto normal como de cáncer papilar, fueron obtenidas de pacientes operados sometidos a tiroidectomía total por CPT. La cirugía de extracción se realizó previo consentimiento expreso de los pacientes. Los tejidos analizados durante este trabajo fueron los siguientes: Epitelio tiroideo normal y CPT, ambos tejidos fueron extraídos del mismo paciente.
Las muestras de tejido fueron transportadas en PBS frío desde el pabellón del hospital clínico de la Pontificia Universidad Católica de Chile al Laboratorio de Inmunología Molecular de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Pontificia Universidad Católica de Chile. El tejido fue limpiado de restos de tejido adiposo y se dividió en dos partes (dependiendo del tamaño de la muestra) cada sección con un diámetro mínimo de 0,4 cm. Una parte del tejido se guardó a 42C en RNA later, para posteriormente extraer ARNm para ser analizado por RT-PCR en tiempo real y una segunda parte se fijó en paraformaldehido para ser analizado el tejido por inmunohistoquímica.
Tabla 1. Características de los pacientes analizados por medio de inmunohistoquímica.
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Ejemplo 2: Detección de receptores de quimokinas en muestras de tejido tiroideo utilizando inmunohistoquímica
a) Procesamiento de muestras.
El tejido fresco que se seleccionó para ser analizado por inmunohistoquímica se fijó en paraformaldehido al 3% en TBS por 18 horas a 42C. Los tejidos se deshidrataron usando una batería de alcoholes.
Brevemente, los tejidos fueron sumergidos en etanol al 70% tres veces por 20 min; luego en etanol al 95% tres veces por 20 min; después en etanol al 100% tres veces por 20 min; y finalmente los tejidos se sumergen en Xilol/Etanol (1 :2) por 30 min, luego en Xilol/Etanol (1 :1 ) por 30 min, Xilol/Etanol (2:1 ) por 30 min, Xilol 1 00% tres veces por 30 min, Xilol/parafina una vez por 1 hr. (562C), luego los cortes se dejan en parafina al 1 00% toda la noche a 562C y se realizan cambios a parafina 1 00% por 1 hr (56-602C). Los tejidos en parafina líquida son traspasados a placas Lewkart para la formación de los tacos. Una vez fría la parafina, ésta se solidifica y los cortes quedan embebidos dentro de ésta. Los tacos se usan para cortar los tejidos en el micrótomo (Leica, RM2235). Se obtuvieron cortes de 5 μιη de espesor que fueron depositados en portaobjetos silanizados (Marienfeld) guardados a 4 °C hasta su utilización. Previamente a la inmunohistoquímica los cortes deben ser desparafinados y rehidratados. Las muestras se sumergieron en xilol al 1 00% dos veces por 10 min; luego en etanol 100% dos veces por 10 min; etanol 95% dos veces por 2 min; etanol 70% dos veces por 2 min ; y finalmente se rehidrataron en agua destilada por 5 min y TBS por 5 min. Para recuperar los epítopos perdidos de los antígenos debido al paso por parafina, los cortes rehidratados se sumergieron en buffer AC (buffer ácido cítrico) pH 6 (41 mL citrato de sodio 10mM, 9 mL ácido cítrico 0.1 M, 450 mL H20 destilada) por 10 min a máxima potencia en un horno microondas. Luego se enfrió a temperatura ambiente con buffer AC frío y se lavó tres veces con H20 destilada. Posteriormente se procedió a bloquear la actividad peroxidásica endógena con H202 al 3% en TBS por 15 min y se lavó tres veces con TBS por 5 min. Los cortes de tejido fueron bloqueados para disminuir la unión ¡nespecífica del anticuerpo primarlo: El bloqueo consistió en Incubar los cortes en solución de bloqueo (Dako, n ° catálogo X0909) 1 hora a temperatura ambiente. La Incubación con el anticuerpo primario se realizó en solución de bloqueo durante toda la noche a 4 °C.. Los anticuerpos primarios que se utilizaron en la ¡nmunohistoquímlca fueron: a-CCR3 monoclonal de rata (1 :1000, RyD Systems, MAB1 55), a-CCR7 monoclonal humano (1 :250, RyD Systems) y a-CXCR4 monoclonal humano (1 :250, RyD Systems, MAB173). Posteriormente, los cortes fueron lavados tres veces con TBS-T por 5 minutos. Luego a los cortes se les agregó el anticuerpo secundarlo blotinllado correspondiente y se Incubaron por 1 hora a temperatura ambiente. Los cortes fueron lavados tres veces con TBS-T por 5 minutos y a continuación los cortes dése Incubaron con ABC por 45 minutos. Se lavaron los cortes tres veces con TBS-T por 5 minutos. El revelado se llevó a cabo en una caja oscura utilizando el reactivo de amplificación DAB (SIGMA, número de catálogo D5905). La incubación con DAB puede demorar entre 30 segundos a 20 min. Posteriormente se detuvo el revelado lavando los cortes con agua destilada. Para Identificar los núcleos celulares en las muestras, se tlñó con hematoxilina durante 2 segundos y se lavó con agua potable. Finalmente, los cortes fueron deshidratados (etanol 70% dos veces cada vez por 3 minutos; etanol 95% dos veces cada vez por 3 minutos; etanol 1 00% dos veces cada vez por 3 minutos; xllol 100% dos veces por 3 minutos) y se montaron con entellán. Una vez secado el medio de montaje, las muestras se observaron en microscopio (OLYMPUS BX4) y se tomaron 4 fotos de cada tejido (control y tumor) de cada paciente, usando una cámara Infinlty 2 acoplada al microscopio; las condiciones bajo las que se tomaron las fotografías, tiempo de exposición, apertura del diafragma y temperatura de la lámpara fueron ajustadas y guardadas, de manera tal que todas las fotografías se tomaron en las mismas condiciones.
El análisis de la inmunohlstoquímica se realizó usando el programa Image - pro plus versión 6.0 (Media Cybernetlc Inc.). Este software permite contar los núcleos con o sin marca café. De esta forma, es posible Identificar cualitativamente la marca de cada imagen y ésta se normaliza por el número de núcleos observados, obteniéndose así el un porcentaje de células marcadas.
b) Resultados de expresión de receptores de quimokinas en tejido tiroideo de acuerdo al análisis inmunohistoquímico
Los resultados del análisis por inmunohistoquímica de tejidos de pacientes con CPT muestran que los receptores CCR4, CCR5 y CCR6 no tienen diferencias significativas de expresión entre las muestras de tiroides normal y de tejido tumoral. Por otra parte, los receptores CCR3, CCR7 y CXCR4 se encuentran sobreexpresados en las muestras de tejido tumoral con respecto al epitelio tiroideo normal (tabla 2) (Figs. 1 y 2). CCR3 se encuentra sobreexpresado en el 100% de los pacientes con CPT estudiados, mientras que CCR7 se encuentra sobreexpresado en un 60% de los pacientes estudiados y CXCR4 en un 80% de los pacientes. Los resultados obtenidos con CCR7 y CXCR4 confirman los ya descritos en la literatura respecto de un aumento en su expresión en el CPT. Sin embargo, sorprenden los datos obtenidos con CCR3 que muestran que el 1 00% de los pacientes con CPT tienen una expresión aumentada en el tejido tumoral. Esto hace a CCR3 un excelente marcador para diferenciar tejido normal de tejido tumoral en cáncer de tiroides.
Tabla 2. Resultados de marcación de receptores de quimokinas por inmunohistoquímica en muestras de pacientes con CPT.
RECEPTOR NQ Pacientes % Positivos Intensidad
CCR3 30 100 ++++
CCR4 8 <10 -
CCR5 8 <10 -
CCR6 8 <10 -
CCR7 30 60 ++
CXCR4 30 80 +++ Ejemplo 3: Correlación entre parámetros clínicos de agresividad y expresión del receptor de quimokinas CCR3
Para poder determinar la relevancia de la sobreexpresión del receptor CCR3 en el tejido tumoral, realizamos una correlación entre los parámetros clínicos que sugieren la agresividad y progresión de la enfermedad y los niveles de expresión de del receptor. Entre los parámetros clínicos seleccionados se encuentran: la invasión de la cápsula, la invasión al tejido adiposo y la presencia o ausencia de borde del tumor (resección completa del tumor), parámetros sugerentes de que las células tumorales son capaces de invadir en forma local los tejidos adyacentes a la tiroides. Además, se analizaron parámetros que sugieren que las células tiene la capacidad de diseminarse en tejidos distantes como: la invasión vascular y la metástasis a los nodulos linfáticos. El análisis de estos parámetros indica que el receptor CCR3 aumenta en aquellos tumores que presentan parámetros de mayor agresividad (Fig. 3A y 3E). Se observa un patrón similar con el receptor CXCR4, lo cual confirma resultados previos, ya publicados por nuestro grupo. Sin embargo, en el análisis de los otros receptores de quimokinas no se encontró ninguna relación entre su nivel de expresión y los parámetros clínicos de agresividad. La observación respecto de la relación entre el aumento de expresión de CCR3 y una mayor agresividad del tumor, es novedosa y no podría haberse deducido de manera obvia a partir de la literatura disponible.
Ejemplo 4: Extracción de RNA y RT-PCR en tiempo real de biopsias de pacientes con cáncer papilar de tiroides.
a) Extracción de ARN total y obtención del ADNc
Con el fin de evaluar el segundo objetivo específico de este proyecto, se realizó la extracción de ARN total de 1 9 muestras de tejido tiroideo obtenidas de pacientes con CPT sometidos a tiroidectomía. La biopsia del lóbulo de la tiroides que presentaba el tumor se consideró tejido con CPT y la biopsia del lóbulo contralateral se consideró como tejido control. La obtención del ARN se realizó utilizando el klt comercial RNeasy Plus mlnl, siguiendo las Instrucciones del fabricante.
A partir de 1 μg del ARN obtenido se preparó el ADN complementarlo (ADNc). Se agregó 1 μΙ_ de random prlmers (1 μg/1 μΙ_), y agua libre de nucleasas hasta un volumen de 5 μΙ_, se llevó a 702C por 5 minutos en termoclclador (PCR Sprint Termal Cycler, de Termo Electron Corporation). Se preparó un mlx que contenía: 4 μΙ_ de Improm I I 5x (Buffer de reacción), 1 ,2 μΙ_ MgCI2 (1 ,5 m M), 1 μΙ_ dNTPs mlx (0,5 mM), 0,5 μΙ_ Inhibidor de RNAsa, 1 μΙ_ Improm I I RT 0,25 unidades (enzima Transcrlptasa Reversa), 7,3 μΙ_ de agua libre de nucleasas. Se utilizó ARNm de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) como control positivo. Las muestras se Incubaron a 25 2C por 5 minutos y a 42 2C por 1 hora. El producto se guardó a - 20 2C.
b) Amplificaciones de transcritos mediante RT-PCR
Para estandarizar la técnica, se amplificó los transcritos específicos de CCR3 y CXCR3 con el ADNc obtenido con Taq pollmerasa. En cada reacción se preparó un mlx, el cual contenía 2,5 μΙ_ de tampón de reacción de PCR 1 0X, 1 ,25 μΙ_ de mezcla de partidores 1 0 μΜ cada uno (tabla 1 , las secuencias de los partidores para CCR3 CCR7 y CXCR4 se obtuvieron de la literatura. Los partidores para 1 8S y β-actlna fueron diseñados utilizando el software AmplifX.), 0,5 μΙ_ de MgCI2 1 ,5 mM, 0,5 μΙ_ mezcla de dNTPs 0,2 mM y 1 μΙ_ de Taq pollmerasa. En la reacción de amplificación se utiliza 2μΙ_ de ADNc por cada reacción y se le agregó agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 25 μΙ_. En cada reacción se Incluyó un control positivo, que corresponde a ADNc de TPC-I o ADNc de PBMC, y un control sin templado que corresponde al mlx de reacción más agua libre de nucleasas en lugar de ADNc. Todas las reacciones de PCR se realizaron usando un ciclo de denaturación a 95 2C por 3 minutos, 40 ciclos de amplificación (denaturación a 95 2C por 20 segundos, temperatura de alineamiento correspondiente a los partidores por 20 segundos y extensión a 72 2C por 20 segundos) y un ciclo de extensión final a 722C por 5 minutos, en el termoclclador (PCR Sprint Termal Cycler, de Termo Electron Corporation). Tabla 3. Partidores utilizados para PCR en tiempo real.
Figure imgf000018_0001
c) Electroforesis en gel de agarosa
Para visualizar el resultado de los productos del PCR se prepararon geles de agarosa 2% (Invitrogen) en tampón TBE pH 8.3 (Promega). Los productos de PCR se mezclaron con el volumen requerido de tampón Blue I I (6x) antes de ser cargadas en el gel. La electroforesis se realizó en una cámara de electroforesis de agarosa BioJSP, a una diferencia de potencial constante de 1 50 V, usando una fuente de poder Bio-Rad (modelo 200/2.0). El gel fue teñido con una solución de SYBR safe DNA (Invitrogen) y las bandas correspondientes a los productos se visualizaron y se fotografiaron sobre un transiluminador UV (Vilber Lourmat).
Utilizando el método antes descrito se logró aislar exitosamente el RNAm de las muestras de pacientes y a su vez se obtuvo el ADNc para realizar el RT-PCR en tiempo real. En la fig. 1 .5 se observa que en el PCR de las muestras de pacientes se obtiene un producto único de amplificación para los transcritos de nuestros genes de interés. Además, se obtiene un producto del tamaño esperado para cada gen analizado (tabla 2).
d) PCR en tiempo real (QPCR)
Para el PCR en tiempo real se preparó una mezcla con volumen final de 20 ul con
SYBR-Green QPCR Master Mix, para lo cual se tomaron 2 μί de cDNA y fueron puestos en 18 ul de mezcla de reacción de PCR, que contiene 10 ul de Master Mix, 0,2 μί de cada primer (sense y antisense) (1 00 nM de cada uno) y 7,6 μί de agua libre de nucleasas. La reacción de PCR se inició con 1 0 min de denaturación a 95°C, seguido de 40 ciclos de 95°C de denaturación por 20 seg, 58°C de annealing por 20 seg y 72°C de extensión por 20 seg. La detección de la fluorescencia se realizó al final de cada ciclo. La curva de disociación se realizó por un ciclo de 95°C por un min, y un incremento de temperatura desde 60°C a 95°C por 0,6 seg cada temperatura La estandarización del QPCR muestra un producto único en la curva de disociación y una amplificación aproximadamente entre los ciclos 1 8 y 38, dependiendo del gen en estudio (Fig. 1 .5).
Para poder determinar los umbrales de ciclos (CT) de cada amplificado, se realizó una curva estándar con diluciones seriadas conocidas y se analizaron los datos mediante el método del 2 "ΔΔ0Τ, con lo cual se comparó la expresión de nuestros genes de interés en los tejidos control y tumor en relación al gen de referencia 18S (Fig. 1 .6). Los resultados obtenidos del análisis del QPCR para los receptores de quimiokinas estudiados en 19 muestras de pacientes mostraron un aumento significativo del RNA en el tejido proveniente de CPT, en relación al tejido control del paciente.

Claims

PLIEGO DE REIVINDICACIONES
1 . Uso de la medición de expresión de receptores de quimokina para determinar el pronóstico de un cáncer papilar de tiroides CARACTERIZADO porque comprende cuantificar, en una muestra de tejido tumoral de un paciente, la expresión del receptor de quimokina CCR3 y donde la sobreexpresión de CCR3 respecto de un valor de referencia indica que el tumor tiene características agresivas.
2. Método in vitro para determinar pronóstico de un cáncer papilar de tiroides, CARACTERIZADO porque comprende cuantificar, en una muestra de tejido tumoral de un paciente, la expresión del receptor de quimokina CCR3 y donde la sobreexpresión de CCR3 respecto de un valor de referencia indica que el tumor tiene características agresivas.
3. Método de acuerdo a la reivindicación 2 CARACTERIZADO porque la muestra de tejido tumoral corresponde a una biopsia con aguja o biopsia de la pieza quirúrgica.
4. Método de acuerdo a la reivindicación 2 CARACTERIZADO porque la expresión de CCR3 se cuantifica utilizando técnicas seleccionadas de inmunohistoquímica, PCR semicuantitativo y/o PCR cuantitativo (de tiempo real).
5. Método de acuerdo a la reivindicación 2 CARACTERIZADO porque, además de cuantificar la expresión de CCR3, se cuantifica la expresión de otros receptores de quimokinas y/o de otras moléculas marcadoras de prognosis de cáncer de tiroides.
6. Método de acuerdo a la reivindicación 5 CARACTERIZADO porque los receptores de quimokinas adicionales cuantificados se seleccionan del grupo compuesto por CXCR4 y CCR7.
7. Kit para determinar pronóstico de cáncer papilar de tiroides CARACTERIZADO porque comprende reactivos e instrucciones de uso para cuantificar los niveles de expresión de CCR3 en una muestra de tejido tiroideo.
8. Kit para determinar pronóstico de cáncer papilar de tiroides de acuerdo a la reivindicación 7 CARACTERIZADO porque los reactivos incluidos que permiten cuantificar los niveles de expresión de CCR3 son aquellos apropiados para inmunohistoquímica, PCR semicuantitativo y/o PCR cuantitativo (de tiempo real).
9. Kit de diagnóstico de acuerdo a la reivindicación 7 CARACTERIZADO porque comprende, además, reactivos para cuantificar los niveles de expresión de otros receptores de quimokinas y/o otras moléculas marcadoras de pronóstico de cáncer de tiroides.
10. Kit de diagnóstico de acuerdo a la reivindicación 7 CARACTERIZADO porque comprende reactivos para cuantificar los niveles de expresión de CXCR4 y/o CCR7.
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