WO2012173344A2 - Ｃｓｐ－ｂ ５'-ｓａｒ 인자를 포함하는 동물세포 발현 벡터 및 이를 이용한 재조합 단백질의 제조방법 - Google Patents

Ｃｓｐ－ｂ ５'-ｓａｒ 인자를 포함하는 동물세포 발현 벡터 및 이를 이용한 재조합 단백질의 제조방법 Download PDF

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    • C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian

Definitions

  • the present invention provides an animal cell expression vector comprising a Cytotoxic Serine Protease-B (CSP-B) cytoplasmic serine protease ⁇ B '5'-SAR (Sca fold Attachment Region) factor and a method for producing a recombinant protein using the vector. It is about.
  • CSP-B Cytotoxic Serine Protease-B
  • cytoplasmic serine protease ⁇ B '5'-SAR Se fold Attachment Region
  • the red blood cell growth factor NESP Novel Erythropoiesis Stimulating Protein
  • Darbepoetin alfa is a protein drug that has been genetically engineered to produce two N-linked sugar chain sites in the native erythropoietin (Egrie and Browne, Br. J. Cancer, 84 Suppl. 1: 3-10 (2001).
  • NESP stimulates hematopoietic stem cells and promotes differentiation into the erythroid system, increasing the production of red blood cells. Since the serum half-life of NESP 'is three times longer than that of conventional recombinant erythropoietin, it can be expected to have an equivalent therapeutic effect at low dose frequency in treating anemia of chronic renal failure patients.
  • trastuzumab an anti-malignant tumor agent
  • HER2 Human Epidermal Growth Factor Receptor 2
  • HER2 It is optional.
  • Overexpression of HER2 has been identified in 25-30% of primary breast cancers, and trastuzumab inhibits tumor cell proliferation in humans overexpressing HER2.
  • the expression rate of foreign genes can vary depending on where they are inserted into animal cell chromosomes. This is because the expression of foreign genes is affected by the structure of chromatin (Zahn-Zabal et al., J. Biotechnol, 87, 29-42 (2001)).
  • chromatin factor which prevents surrounding chromatin from affecting the expression of foreign genes, can overcome the positive ion effect according to these positions, and it is possible to generate a isocell clone that expresses recombinant proteins. Increased opportunities to isolate can shorten the time to manufacture drug-producing cell lines. Attempts have been made to create stable cell lines using chromatin factors that can overcome the positional inhibition of gene expression. Such factors include BE (Boundary Element) and SA / MAR (Scaf fold or Matrix Attachment Region (LCR) and Locus Control Region (LCR).
  • SAR is a 300-3000 bp DNA, also called MAR, known to allow chromatin on chromosomes to bind to proteins in the nuclear matrix and to regulate gene expression (Makrides (Ed.), Gene Transfer and Expression). in Mammalian Cells.Elsevier.Chapter 10 (2003)), can enhance the expression of foreign genes in transgenic cell lines (Poljak et al., Nucleic Acids Res, 22, 4386—4394 (1994); Kalos and Fournier, Mol Cell Biol, 15, 198-207 (2005)).
  • Korean Patent Application No. 2000-0043996 includes a human beta globin MAR in an animal cell expression vector, thereby overcoming a gene expression suppression phenomenon when a foreign gene is introduced into an animal cell.
  • the patent uses human interferon beta MAR and GenBank M62716, which are registered in GenBank M83137, and these three SAR / MARs. Has been described to improve the expression rate of the target protein beta galactosidase ( ⁇ -galactosidase).
  • the patent discloses a study showing that beta globin MAR is superior to interferon beta MAR or CSP-B 3 'SAR.
  • Korean Patent Application No. 2001-0079227 human interferon beta MAR was introduced into an animal cell expression vector to increase expression of foreign genes and to efficiently express recombinant protein.
  • Korean Patent Application No. 200G 0108451 discloses that the beta globin MAR is better than the case where 1 beta globin MAR is included in the animal cell expression vector, thereby improving the expression rate of the target protein.
  • This patent describes the results of a comparative study of MAR copy 1 and 2 copies, and does not describe the comparative study of MAR copy 2 and 3 copies.
  • the present inventors have tried to develop a vector capable of efficiently producing recombinant protein in animal cells. As a result, we found that the recombinant protein can be produced with very high production efficiency when 5'_Scaf fold or Matrix Attachment Region (CS-B) of CSP-B (incorporated) is used in the vector. By doing so, the present invention has been completed.
  • CS-B Matrix Attachment Region
  • the present invention is to provide an expression vector for animal cells.
  • Another object of the present invention is to provide an animal cell transformed by the above-described expression vector.
  • Another object of the present invention to provide a method for producing a recombinant protein.
  • the invention provides an expression vector for animal cells comprising:
  • CSP-B Cytotoxic Serine Protease-B
  • Expression vector for animal cells of the present invention is a 5'-SAR of CSP-B, a promoter that operates in animal cells; And polyadenylation sequences.
  • CSP—B 5′-SAR for use in the present invention preferably comprises a nucleotide sequence registered in GenBank M62717, the exemplary nucleotide sequence of which is described in SEQ ID NO: 1.
  • the 5′-SAR of CSP-B significantly increases the efficiency of production of recombinant proteins in expression vectors.
  • the 5'-SAR of CSP-B may be located upstream or downstream of the nucleotide sequence encoding the protein to be expressed, preferably downstream.
  • CSP-B 5'-SAR improves the expression rate of the target protein in animal cells over conventional CSP-B 3'-SAR and beta globin MAR factors.
  • CSP-B 3 '—SAR and beta globin MAR factor were introduced into the vector expressing the target protein beta galactosidase in CH0 animal cells, SAR Beta galactosidase activity was measured to be 10.0 times, 2.2 times and 8.7 times higher than without factor (Fig. 7). That is, the CSP-B 5'-SAR factor indicates a higher expression rate of the target protein than other factors.
  • CSP-B 5'-SAR factor was confirmed using the target protein as an anti-HER2 antibody. Incorporating a copy of CSP ′ B 5′-SA Factor 2 into the vector and transforming CH0 cells, compared to the absence of the SAR factor, The expression rate was measured relatively high (Table 6 and FIG. 13). When the SAR factor was introduced into the vector, anti-HER2 antibody expression rates of randomly selected clones were high (FIGS. 14 and 15).
  • the 5 ' ⁇ SAR is present in a plurality of copies in the expression vector, in which case the production efficiency of the recombinant protein is increased compared to the case where it is present in one copy. More preferably, 5'-SAR is present in 2 copies in the expression vector. As demonstrated in the examples below, 5 ′ ′ SAR has a better production efficiency of recombinant protein when present in 2 copies than when present in 3 copies in the expression vector.
  • the CSP— B 5′-SAR factor was added to the vector.
  • beta galactosidase activity was measured highest when 2 copies of this SAR factor were continuously introduced (FIG. 8).
  • the number of copies of SAR factors in the vector affects the expression rate of the target protein, and two copies of SAR are most preferred.
  • the plurality of copies may be located consecutively or spaced apart.
  • the plurality of copies are present in series, more preferably in sequence downstream of the nucleotide sequence encoding the protein to be expressed.
  • the (operable) promoter in the animal cell is a CMV (Cytomegalovirus) promoter, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 (Simian Virus 40) promoter, SV40E1 promoter, HSV Tk promoter of Herpes simplex virus, Respiratory syncytial virus (RSV) promoter, EFK elongation factor— 1 alpha, alpha promoter, metallothionine promoter, beta-actin promoter, human IL-2 (inter luekin-2) gene Promoter, promoter of human IFN (interferon) gene, promoter of human IL-4 gene, promoter of human lymphospecific gene or promoter of human Granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) gene, more preferably CMV promoter SV40 promoter, SV40E1 promoter, EF1 alpha promoter, metallothionine promoter
  • GM-CSF Granulocyte
  • the vector of the present invention further comprises a nucleotide sequence encoding a protein to be expressed, preferably hormones, cytokines, antibodies, peptide aptamers, AdNectin, apibody ( af f ibody, US Pat. No. 5,831,012), Avimer, ' Silverman, J. et al, Nature Biotechnology 23 (12): 1556 (2005)) or Kunitz domain, Arnoux B et al , Acta Crystallogr.D Biol.Crystal logr. 58 (Pt 7): 12524 (2002)), and Nixon, AE, Current opinion in drug discovery & development 9 (2): 2618 (2006).
  • the protein to be expressed using the vector of the present invention is EPO (erythropoietin), EP0 analog or anti-HER2 (Human epidermal growth factor receptor 2) antibody.
  • EPO erythropoietin
  • EP0 analogs are NESPs (ovel Erythropoiesis Stimulating Protein, A30N, H32T, P87V, W88N, P90T) or anti-HER2 antibodies.
  • the EP0 analog includes one or more variations in the amino acid sequence of human EP0.
  • EP0 analogs can be produced by mutagenesis through addition, deletion or substitution of amino acid residues, thereby increasing the glycosylation site or You can change its location.
  • EP0 analogs have a greater number of carbohydrate chains than human EP0 and include at least one added glycosylation site.
  • EP0 analogs show higher sialic acid levels than natural occurring human EP0 due to the added glycosylation site, but do not alter protein secondary or tertiary structures important for biological activity.
  • EP0 analogs may have 1, 2 or 3 additional positions for N-glycosylation or 0-glycosylation. For example, when the 69th leucine is replaced with asparagine, it serves as the fourth position of N-glycosylation.
  • EP0 analogs to be expressed in the vector of the present invention are at least one position selected from positions 30, 51, 57, 69, 88, 89, 136 and 138 in the EP0 sequence (eg, the sequence of GenBank M11319). Additional glycosylation sites It was introduced. Most preferably, the EP0 analog is NESP comprising A30N, H32T, P87V, W88N and P90T mutations.
  • the polyadenylation sequence comprises a plastic field hormone terminator, HSV (Herpes simplex virus) derived TK (Thymidine kinase) or SV40 (Simian virus 40) derived polyadenylation sequence.
  • HSV Herpes simplex virus
  • TK Thymidine kinase
  • SV40 Synimian virus 40 derived polyadenylation sequence.
  • Preferred constructs in the vector of the invention are promoter-expressing protein gene-polyadenylation sequences CSP-B 5'-SAR, which operate in animal cells in the order of 5 'to 3', and more preferably the construct Promoter-expressing protein genes that operate in cells—polyadenylation sequences—CSP-B 5′-SAR-CSP-B 5′-SAR.
  • the vector of the present invention may additionally include a selection marker.
  • selection markers include resistance genes for antibiotics acting on eukaryotic cells, preferably neomycin, geneticin (G418) and kanamycin resistant meteors.
  • the vector of the invention is used to express the protein of interest in animal cells.
  • the animal cell is a mammalian, rodent, avian or konpocytic cell, more preferably CHCXChinese hamster ovary, VERO, HeLa cell, WI38, Baby hamster kidney (BHK), COS cell or Mad in—Darby Canine Kidney (MDCK) cell More preferably CHO, VERO, HeLa or MDCK, most preferably CH0 cells.
  • the vector of the present invention comprises a dihydrofolate reductase (DHFR) coding sequence.
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • the present invention provides an animal cell transformed by the expression vector of the present invention described above.
  • the present invention provides a method for producing a recombinant protein comprising the step of culturing the transformed animal cells of the present invention described above.
  • the recombinant protein of the invention comprises the steps of: (i) culturing the transformed animal cell of the present invention; And ( ⁇ ) obtaining a recombinant protein produced in the culture process.
  • the CSP-B 5'-SAR factor used in the present invention is a factor that has not been used in an attempt to improve productivity of recombinant protein for pharmaceuticals by introducing into animal cell expression vectors in the prior art. From the following examples, it can be seen that the introduction of CSP-B 5'-SAR into the vector can improve the expression rate of the protein of interest in animal cells.
  • the introduction of new CSP-B 5'-SAR, which has not previously been used for the production of recombinant proteins, to develop a method of increasing the expression efficiency of the protein of interest can increase the industrial productivity of protein drugs.
  • the vector may be introduced into the cell by various methods. For example, micro-injection (Capecchi, MR, Cell, 22: 479 (1980)), hemopium phosphate precipitation (Graham, FL et al., Virology, 52: 456 (1973)), electroporation (Neumann, E et al., EMBO J., 1: 841 (1982)), liposome-mediated transfection (Wong, TK et al., Gene, 10:87 (1980)), DEAE-dextran treatment (Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188-1190 (1985)), and gene balm (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 9568-9572 (1990)). Can be injected into.
  • micro-injection Capecchi, MR, Cell, 22: 479 (1980)
  • hemopium phosphate precipitation Graham, FL et al., Virology, 52: 456 (1973)
  • the medium that can be used in the present invention may be any medium conventionally used for culturing animal cells, for example, Eagles'MEKEagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130: 432 (1959)). , A -MEKStanner, CP. et al. , Nat. New Biol. 230: 52 (1971)), Iscove's MEMdscove, N. et al. , J. Exp. Med. 147: 923 (1978)), 199 medium (Morgan et al., Proc. Soc. Exp.
  • the vector of the present invention is a vector containing CSP-B 5'-SAR, and has an effect of overcoming the gene expression suppression phenomenon according to the position of the foreign gene introduced into the animal cell, and greatly improves the expression rate of the target protein. Let's do it.
  • the vector of the present invention effectively expresses a recombinant protein for medicine (eg EP0) or an antibody (eg anti-HER2 antibody) in animal cells.
  • a recombinant protein for medicine eg EP0
  • an antibody eg anti-HER2 antibody
  • FIG. 1 is a schematic diagram of the structure of a beta galactosidase expression vector.
  • lacZ is the beta galactosidase gene
  • BGH pA is the polyadenylation sequence of the bovine growth hormone gene
  • TK pA is the polyadenylation sequence of the cymidine kinase gene.
  • Figure 2 is a schematic diagram of the structure of the beta galactosidase expression vector containing one copy of the SAR / MAR factor.
  • FIG. 3 is a schematic of the structure of a beta galactosidase expression vector comprising two copies of the SAR factor.
  • FIG. 4 is a schematic representation of the structure of a beta galactosidase expression vector comprising 3 copies of the CSP-B 5′-SAR factor.
  • 5 is a schematic diagram of the structure of the NESP expression vector.
  • FIG. 6 is a schematic of the structure of an NESP expressing vector comprising SAR / MAR factors.
  • Fig. 7 is a graph showing the relative beta galactosidase activity of cells transformed with a vector incorporating one copy of SAR / MAR factor.
  • Fig. 8 is a graph showing the relative beta galactosidase activity of cells transformed with vectors incorporating 1, 2 and 3 copies of SAR factors.
  • NESP erythrocyte stimulating factor
  • FIG. 10 is a graph showing the NESP expression rate of 24 clones randomly selected from cells transformed with pCLS07Al vector without SAR factor.
  • FIG. 11 is a graph showing NESP expression rate of randomly selected 24 ' clones in cells transformed with pCLSlOAlfl vector incorporating CSP-B 5'-SAR factor.
  • 12 is a schematic of the structure of an anti—HER2 antibody expression vector.
  • Figure 13 is a graph showing the relative plasma wherein -HER2 antibody expression in a transformed cell with the vector incorporating two copies of SAR factor.
  • FIG. 14 is a graph showing the expression rate of anti-HER2 antibodies of 19 clones randomly selected from cells transformed with pCLS05H2 vector without SAR factor.
  • FIG. 15 is a graph showing the expression rate of anti-HER2 antibodies of 19 clones randomly selected from cells transformed with the pCLS05H2f2 vector in which two copies of the CSP-B 5'-SAR factor were introduced.
  • Genomics of human natural killer cells (natural killer cells, NK cells and ATCC CRL-2407) to amplify human CSP-B 5'-SAR DNA registered in GenBank M62717 and AL136018 by PCR (Polymerase Chain Reaction) ) DNA was prepared.
  • Genomic DNA was prepared from NK cells using a DNA isolation kit (Dneasy Blood & Tissue Kit, Qiagen, Cat. No. 69504), which was used as a template for 5 'SAR DNA PCR.
  • PCR was performed using Cs5S30 (primitive (attct tcagc acctc cttaa ttttt ctcc; SEQ ID NO: 5) and Cs5S300R primer (ccagg cagcc aaaga tcagt agttg tgttg; SEQ ID NO: 6) as a template of genomic DNA of NK cells.
  • PCR was performed 35 times under conditions of 10 seconds at 98 ° C., 30 seconds at 60 ° C., and 2 minutes 30 seconds at 721 :.
  • this PCR product was cloned into a pGEM-T vector (Promega, Cat. No. A3600) to prepare a pGEMT-CS5S.3.0k vector.
  • 2kCspSF primers tggtt ccttc attgg aaaag gaaaa cac; SEQ ID NO: 7 sequence
  • 2kCspSR primers SEQ ID NO: 7
  • PCR was performed using tccgc tgagg ctgtg cccac agcca cc; Next, PCR was performed using a CspSF primer (ggatc ccatt ctcct tgatg tacta at; SEQ ID NO: 9 sequence) and a CspSR primer (gaatt caaac aactc aatag caaga aac; SEQ ID NO: 10 sequence) as a primary PCR product. . PCR was performed 30 times at 10 ° C. at 98 ° C., 30 seconds at 60 ° C., and 5 minutes at 72 ° C. Secondary PCR products were cloned into pGEM-T vectors to prepare pGEMT-CS3S 1.2k vectors. Preparation of Human Beta-globin MAR Factor
  • Human beta globin MAR registered with GenBank L22754 and NW— 001838021
  • genomic DNA of human G-2 cells was prepared. Genomic DNA was prepared from G-2 cells using a DNA separation kit, which was used as a template for 5 'MAR DNA PCR. Bg5MF-100F-NheI primer (aattg ctagc ttgta ttctg tttcg tgagg caagg ttt; SEQ ID NO: 11 sequence) and Bg5MR-100R—Xhol primer (aattc tcgag ttcct cta tgttg gctca aatgt cct; PCR was performed using SEQ ID NO: 12 sequence).
  • PC06 vector comprising a Cytomegalovirus (CMV) promoter, Multiple Cloning Sites (MCS) and Bovine Growth Hormone (BGH) polyadenylation sequence (pA)
  • CMV Cytomegalovirus
  • MCS Multiple Cloning Sites
  • BGH Bovine Growth Hormone
  • V795-20 was used as a template for the V6—F primer (aagct tggat ccgaa ttcat cgatg gccgg ccggt accct cgagc tgtgc cttct agttg ccagc; SEQ ID NO: 13) and V6 PCR was performed using the R primer (gctag ctaga gcccc agctg gttct tccg; SEQ ID NO : 14 sequence). PCR was performed 30 times at conditions of 10 seconds at 98 ° C, 30 seconds at 60 ° C, and 1 minute at 72 ° C. This PCR product was then cloned into PCDNA3.3—T0P0 vector (Invitrogen) to prepare a pC06 vector. Preparation of the pC04 'Vector
  • PsvApaDraF primer (aaaat tgggc cccac tacgt gctgt ggaat gtgtg tcagt taggg t; SEQ ID NO: 15 sequence) and PsvKzDHR primer (tggtc gaacc atgat ggcgc gaaac gatcc tcatc ctgtc tct); PCR was performed using a pOptiVEC-TOPO vector (Invitrogen, Cat. No.
  • the PC04 'vector was digested with Sphl restriction enzymes, and the next large DNA fragment was self-ligation to prepare pC04 vectors.
  • NhAsElF primer (aattg ctagc atata gcgat cgcgc aggac agctt ccgac agcag ggcca gg; SEQ ID NO: 20 sequence) and BbPsSbNhEIR primer (aattg ctat tag agta gtat taggta ctagta MCS was prepared by PCR using gttga atgag aatat cactg tccca gacac (SEQ ID NO: 21).
  • PCR was carried out for 30 times under conditions of 10 seconds at 98 ° C, 30 seconds at 60 ° C, and 15 seconds at 72 ° C. Next, the PCR product was cloned into the Nhel restriction enzyme site of the pCLS07 vector to prepare a pCLS08 vector.
  • PCR was carried out using galHinF primer (aaUa agctt ctcgc gcaac ctatt ttccc ctcga ac; SEQ ID NO: 22 sequence) and galXhoR primer (aattc tcgag ccgag tttgt cagaa agcag accaa ac; SEQ ID NO: 23 sequence) as a template. And the lacY gene was amplified. PCR was performed 30 times at 10 sec at 98 ° C, 30 sec at 60 ° C, and 3 min 30 sec at 72 ° C. Next, this PCR product was cloned into the Hindlll and Xhol restriction enzyme sites of the pCLS08 vector to prepare a pCLS08Gl vector.
  • MCS between the two Nhel restriction enzyme sites in the pCLS08Gl vector is different.
  • pCLS09Gl vector was prepared by removing the existing MCS between two Nhel restriction enzyme sites of pCLS08Gl vector and cloning the MCS made by PCR.
  • a map of the pCLS09Gl vector is shown in FIG. Example 3: Preparation of Beta Galactosidase Expression Vectors Including SAR / MAR
  • the following experiment was performed to prepare the pCLS09Gltl vector by inserting the CSP-B 3'-SAR factor between the Sbfl and PspOMI restriction enzyme sites of the PCLS09G1 vector.
  • cs3sSbflF primer (aattc ctgca gggga tccca ttctc cttga tgtac taat; SEQ ID NO: 26 sequence) and cs3sPsplR primer (aattg ggccc gaatt caaac aactc aatag caaga aac) using pGEMT-CS3S.1.2k vector as a template; PCR was performed to amplify the CSP-B 3′—SAR factor.
  • the following experiment was performed to prepare the pCLS09Glfl vector by inserting the CSP-B 5 '′ SAR factor between the Sbfl and PspOMI restriction enzyme sites of the PCLS09G1 vector.
  • the cs5sSbflF primer (aattc ctgca gggaa ttcct aaaca gagca at tag gtaag; sequence 28) and the cs5sPsplR primer (aattg ggccc gaatt ccagt gtaaa cgtct tcctt sequence gt) using the pGEMT-CS5S.3.0k vector as a template; PCR using CSP— B 5 ' ⁇ SAR Factors were amplified.
  • PCR was performed 30 times with 10 sec at 98 ° C, 30 sec at 60 ° C, and 2 min 30 sec at 72 ° C.
  • the PCR product was cloned into the Sbfl and PspOMI restriction enzyme sites of the pCLS09Gl vector to prepare a pCLS09Glfl vector.
  • the following experiment was conducted to prepare pCLS09Glgl vector by inserting beta globin MAR factor between the Sbfl and PspOMI restriction enzyme sites of the PCLS09G1 vector.
  • glmSbflF primer aattc ctgca ggttg tattc tgttt cgtga ggcaa ggttt; SEQ ID NO: 30 sequence
  • glmPsplR primer aattg ggccc ttcct cta tgttg gctca aatgt sequence 31
  • PCR was performed to amplify beta globin MAR factor.
  • PCR was carried out 30 times at conditions of 10 seconds at 98 ° C, 30 seconds at 60 ° C, and 3 minutes 20 seconds at 72 ° C. Next, this PCR product was cloned into the Sbfl and PspOMI restriction enzyme sites of the pCLS09Gl vector to prepare a pCLS09Glgl vector. Preparation of the pCLS09Glt2 Vector
  • the following experiment was performed to prepare the pCLS09Glt2 vector by inserting the CSP-B 3'-SAR factor between the PspOMI and Sfil restriction enzyme sites of the pCLS09Gltl vector.
  • cs3sPsp2F primers (aattg ggccc ggatc ccatt ctcct tgatg tacta at; SEQ ID NO: 32 sequence) and cs3sSfi2R primers (aattg gccat gatgg ccgaa ttcaa acaac tcaat agcaa sequence) with pGEMT-CS3S.1.2k vector; PCR was performed to amplify the CSP-B 3 * -SAR factor.
  • PCR was performed 30 times at 10 sec at 98 ° C, 30 sec at 60 ° C, and 2 min 30 sec at 72 ° C.
  • the PCR product was cloned into the PspOMI and Sfil restriction enzyme sites of the PCLS09G1U vector to prepare a pCLS09Glt2 vector.
  • pGEMT a cs5sPsp2F primer (aattg ggccc gaatt cctaa acaga gcaat taggt aag; SEQ ID NO: 34 sequence) and a cs5sSf i2R primer (aattg gccat gatgg ccgaa ttcca gtgta aacgt sequence cttcc; PCR was performed to amplify the CSP-B 5′—SAR factor. PCR was performed 30 times with 10 sec at 98 ° C, 30 sec at 60 ° C, and 2 min 30 sec at 72 ° C.
  • cs5sPsp2F primer (aattg ggccc gaatt cctaa acaga gcaat taggt aag; SEQ ID NO: 34 sequence) and cs5sSf i2R primer (aattg gccat gatgg ccgaa ttcca gtgta aacgt cttcc sequence ttgt; PCR was performed to amplify the CSP-B 5′-SAR factor.
  • the following experiment was performed to prepare the pCLS09Glf3 vector by inserting the CSP-B 5′-SAR factor into the Bglll restriction site between the CMV promoter and bla promoter of the PCLS09Glf2 vector.
  • cs5sBgl3F primer aatta gatct gaatt cctaa acaga gcaat taggt aag; SEQ ID NO: 36 sequence
  • cs5sBgl3R primer aatta gatct gaatt ccagt gtaaa cgtct tcctt gt; PCR was performed to amplify the CSP—B 5′-SAR factor.
  • cs5sBgl3F primer (aatta gatct gaatt cctaa acaga gcaat taggt aag; SEQ ID NO: 36 sequence) and cs5sBgl3R primer (aatta gatct gaatt ccagt gtaaa cgtct tcctt gt; PCR was performed to amplify the CSP-B 5 ′ SAR factor. PCR was performed 30 times at 10 ° C. at 98 ° C., 30 seconds at 60 ° C., and 2 minutes 30 seconds at 72 ° C.
  • P CLS09G1, pCLS09Glfl, and pCLS09Gltl are transformed using the pCLS09Glgl vector
  • CSP-B 5'—SAR, CSP-B 3'-SAR, and beta globin MAR factors were introduced into the vector one by one to determine the effect as follows.
  • CHO DG44 cells Invitrogen, Cat. No. 12609 was transformed.
  • DG44 cells in adherent form were dispensed in 6-well plates at 4 ⁇ 10 5 cells per well. After 24 hours it was confirmed that the cells were completely attached to the bottom of the plate. 500 ⁇ of each Opt i -MEM medium (Gibe Cat. No.
  • DG44 cells were transformed with PCLS09G1, pCLS09Glfl, pCLS09Gltl or pCLS09Glgl vectors and exchanged with media containing 10% FBS and 500 ⁇ g / ml Geneticin (24 hours) after 24 hours. Pools of stable cells were prepared by incubating at 37 ° C., 5% CO 2 conditions for 3 weeks with medium exchange every 3–4 days.
  • Beta-galactosidase activity was confirmed on stable cells transformed using the beta galactosidase assay kit (Stratagen, Cat. No. 200383), and the beta galactosidase activity according to the vector and pCLS09Gl vector were determined. The relative beta galactosidase activity was determined. As shown in Table 1 and FIG. 7, all of the vector incorporating SAR / MAR factor increased beta galactosidase activity compared to the pCLS09Gl vector without SAR / MAR factor. In addition, the beta globin MAR factor was introduced.
  • the pCLS09Glfl vector with the CSP-B 5'-SAR factor showed higher beta galactosidase activity. Therefore, in order to increase the expression rate of the target protein, it is preferable to introduce CSP-B 5'-SAR into the vector.
  • pCLS09Glfl, pCLS09Glf2, P CLS09Glf3 P is the pCLS09Glf4 vector Confirmation of Beta-galactosidase Activity in Transformed Cell Pools
  • the beta galactosidase was higher in the vector introduced with two copies of the SAR factor compared to the vector introduced with one or three copies of the SAR factor.
  • the increase in the expression rate of the target protein by the SAR factor depends on the number of copies of the SAR factor, and by introducing two copies of the SAR factor into the vector, It was found that increasing the expression of the protein to the maximum.
  • the following experiment was performed to clone 582 bp of erythropoietin genes registered in GenBank M11319 (human fetal liver genomic erythropoietin gene) and GenBank NM000799 (human erythropoietin mRNA).
  • GenBank M11319 human fetal liver genomic erythropoietin gene
  • GenBank NM000799 human erythropoietin mRNA.
  • an IE1ATGF primer atggg ggtgc acgaa tgtcc tgcct; SEQ ID NO: 38 sequence
  • an IE1TGAR primer teat c tgtcc ctgt cctgc aggcc t;
  • PCR was performed using SEQ ID NO: 39 Sequence. PCR was performed 40 times under conditions of 10 seconds at 98 ° C, 30 seconds at 58 ° C, and 1 minute at 72 ° C. Next, this PCR product was cloned into pGEM 'T vector.
  • the erythropoietin gene cloned into the pGEM-T vector was used as a template for M13R primer (gaaac agcta tgacc atg; SEQ ID NO: 40 sequence) and IAlglR primer (ctcat tcaag ctgca tgttt catta cagcc PCR was performed using cgtcg tgat; SEQ ID NO: 41), M13F primer (caggg ttttc ccagt cacga; SEQ ID NO: 42) and IAlglF primer (atcac gacgg gctgt aatga acat gcagc ttgaa tgag; SEQ ID NO: 43) PCR was performed using.
  • PCR was performed 30 times with 10 sec at 98 ° C., 30 sec at 60 ° C, and 40 sec at 72 ° C. Next, these two PCR products were linked by duplicate PCR and cloned into Ndel and Sphl restriction sites of the pGEM-T vector.
  • A30N, H32T cloned in the pGEM-T vector to mutate the genes of the A30N, H32T analogs into the genes of the A30N, H32T, P87V, W88N and P90T analogs, and to attach the Kozak sequence (gccacc) before the translation initiation codon.
  • PCR was performed using the M13R primer and IA1G2R primer (cacat gcagc tgcag tgtct cattc acctg ggaag agttg ac; SEQ ID NO: 44 sequence) with the gene of the analog as a template, M13F primer and IA1G2F primer (gtcaa ctctt cccag gtgaa tgaga cactg cag PCR was performed using tg (SEQ ID NO: 45 Sequence). PCR was performed 30 times with 10 seconds at 98 ° C, 30 seconds at 60 ° C, and 40 seconds at 72 ° C.
  • the IElKzATGHinF primer (aatta agctt gccac catgg gggtg cacga atgtc ctgcc t; SEQ ID NO: 46 sequence) and IElTGAXhoR primer (aattc tcgag tcatc tgtcc cctgt cctgc aggcc t; sequence 47 sequence)
  • Duplicate PCR was performed. PCR was performed 30 times with 10 sec at 98 ° C, 30 sec at 60 ° C, and 50 sec at 72 ° C.
  • the following experiment was conducted to prepare a pCLSlOAl vector by inserting an MCS for introducing SAR or MAR factors into the Nhel restriction enzyme site of a pCLS07Al vector capable of expressing NESP in animal cells.
  • the NhAsflF primer (aattg ctagc atata ggcgc gccaa cttga ttagg gtgat ggttc acgta g; the 48th sequence sequence) and the NhClPaPsflR primer (aattg ctagc atata atcga ttata tttg tgtg tttttc gtt MCS was obtained after PCR using aga (SEQ ID NO: 49).
  • PCR was performed 30 times at 10 sec at 98 ° C, 30 sec at 60 ° C, and 15 sec at 72 ° C. This PCR product was cloned into the Nhel restriction enzyme site of the pCLS07Al vector to prepare a pCLS10Al vector.
  • Preparation of pCLSlOAltl Vectors The following experiment was performed to prepare the pCLSlOAltl vector by inserting the CSP-B 3'-SAR factor between the Ascl and PspOMI restriction enzyme sites of the pCLSlOAl vector.
  • cs3sAsclF primer (aattg gcgcg ccgga tccca ttctc cttga tgtac taat; sequence listing 150 lines) and cs3sPsplR primer (aattg ggccc gaatt caaac aactc aatag caaga aac; PCR was performed to amplify the CSP-B 3'-SAR factor. PCR was performed 30 times with 10 sec at 98 ° C, 30 sec at 60 ° C, and 2 min 30 sec at 72 ° C.
  • PCR was performed using cs5sAsclF primer (aattg gcgcg ccgaa ttcct aaaca gagca at tag gtaag; SEQ ID NO: 52 sequence) and cs5sPsplR primer (aattg ggccc gaatt ccagt gtaaa cgtct tcctt gt; SEQ ID NO: 53 sequence) as a vector -B 5 '-SAR factor was amplified. PCR was performed 30 times with 10 sec at 98 ° C, 30 sec at 60 ° C, and 2 min 30 sec at 72 ° C.
  • PCLS07Al, pCLSlOAlfl, or pCLSlOAltl vector containing NESP and SAR factors were transformed into DG44 cells, screened with geneticin-containing media, and cell pools were obtained by EL ISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) method. Expression rate was confirmed. As shown in Table 3 and FIG. 9, it was confirmed that the expression level increased when the SAR factor was introduced, and especially when the CSP-B 5'-SAR factor was introduced downstream of the NESP gene. It was confirmed that the expression rate of NESP increased 11.2 times than that.
  • the frequency of positive clones was about 40% when no SAR factor was introduced and 3'-SAR factor was introduced, and increased to 59% when 5'-SAR factor was introduced. That is, the introduction of 5'-SAR factor was found to overcome the gene expression suppression phenomenon according to the position of the foreign gene to form more clones expressing the target gene NESP.
  • VID F primer aagct tcctc agcat cgatg gccgg ccgga tccct gtgcc ttcta gttgc cagcc atctg t; SEQ ID NO: 54 sequence
  • V1_R primer tagag cccca gctgg ttctt tccgc ctcag
  • PCR was performed 30 times with 10 sec at 98 ° C, 30 sec at 60 ° C, and 1 min at 72 ° C. This PCR product was then cloned into a PCDNA3.3—T0P0 vector to prepare a pCOl vector. Preparation of the pC02 Vector
  • V2_F primer gaatt ctgta caggt acccc tgcag gctcg agctg tgcct tctag ttgcc agcca tctgt; sequence listing sequence 56
  • V2 ′ R primer tagag cccca gctgg ttctt tccg ctcag; PCR was performed using 57 sequences). PCR was performed 30 times at 10 ° C.
  • pC03 vector containing neomycin resistance gene ampicillin resistance gene, CMV promoter, first MCS, BGH pA, CMV promoter second MCS and BGH pA included in pC02 vector in order, was performed.
  • the pCOl vector was digested with Dralll and Agel restriction enzymes to obtain large DNA fragments.
  • the PcmvAgeF primer (aatct gaccg gtgtt aggcg ttttg cgctg cttcg eg; SEQ ID NO: 58 sequence) and BGHNheDraR primer (Uact acact acgtg gat eg agcta gctag agccc cagct ggttc tttcc g) PCR was performed and the PCR product was digested with Dralll and Agel restriction enzymes.
  • PCR was performed 30 times with conditions of 10 seconds at 98 ° C, 30 seconds at 60 ° C, and 1 minute at 72 ° C.
  • the pC03 vector was prepared by ligating the DNA fragment cut from the pCOl vector with Dralll and Agel restriction enzymes and the PCR product.
  • PCR was performed using ps04 vector as a template using PsvApaDraF primer and TKNheNdeR primer. At 98 ° C PCR was performed 30 times in 10 seconds, 30 seconds at 60 ° C, and 1 minute 30 seconds at 72 ° C.
  • the PCR product and the pC03 vector were digested with Dralll and Nhel restriction enzymes respectively, and two large DNA fragments obtained were ligated to prepare a pCLS05 vector.
  • HlssF primer ctctt cttgg tagca acagc tacag gtgtc cactc cgagg tccaa ctggt cgaaa gcggt gga; SEQ ID NO: 60 sequence
  • HlTGAXhoR primer aattc.
  • PCR was performed using Listing 61 to amplify the heavy chain ' gene with a portion of the signal sequence, and the PCR product was used as a template for the HlssEcoF primer (aattg aattc gccac catgg gatgg agctg tatca tcctc ttctt ggtag caaca gctac PCR was performed using agg: SEQ ID NO: 62 sequence) and HlTGAXhoR primer (SEQ ID NO: 61 sequence) to amplify the heavy chain gene having the Kozak sequence and the signal sequence.
  • HlssEcoF primer aattg aattc gccac catgg gatgg agctg tatca tcctc tttt ggtag caaca gctac PCR was performed using agg: SEQ ID NO: 62 sequence
  • HlTGAXhoR primer SEQ ID NO
  • PCR was performed 30 times at 10 sec at 98 ° C, 30 sec at 60 ° C, and 1 min 30 sec at 72 ° C.
  • the PCR product was cloned into a pGEM-T vector, digested with EcoRI and Xhol restriction enzymes to obtain a transgene with a Kozak and signal sequence, and then cloned into the EcoRI and Xhol restriction enzyme sites of the pCLS05 vector and the pCLS05Hl vector.
  • H2ssF primer ctctt cttgg tagca acagc tacag gtgtc cactc cgata tccag atgac ccaga gtccc tct; SEQ ID NO: 63 sequence
  • H2TGABam primer aattg gatcc tcaac actct cccct gttga agctc; PCR was performed using SEQ ID NO: 64 sequence to amplify the light chain gene having a portion of the signal sequence, and the PCR product was used as a template for H2ssHinF primer (aatta agctt gccac catgg gat g agctg tatca tcctc tttttttttttt
  • PCR was performed 30 times with 10 sec at 98 ° C, 30 sec at 60 ° C, and 1 min at 72 ° C.
  • the PCR product was cloned into pGEM-T vector, cleaved with Hindi II and BamHI restriction enzymes to obtain a light chain gene with Kozak and signal sequences, and then cloned into the Hindi II and BamHI restriction sites of the pCLS05Hl vector.
  • pCLS05H2 vector was prepared. A map of the pCLS05H2 vector is shown in FIG. 12A.
  • Example 9 Preparation of Anti—HER2 Antibody Expression Vectors Including SAR
  • the following experiment was performed to prepare a P CLS05H2f2 vector by introducing two copies of the CSP-B 5'-SAR factor between the heavy chain gene and the dhfr gene of the pCLS05H2 vector capable of expressing an anti-HER2 antibody in an animal cell.
  • the pCLS05H2f2 vector was prepared by digesting the PCLS05H2 vector and the pCLS09Glf2 vector with Xhol and BssHII restriction enzymes respectively and ligating two large DNA fragments obtained therefrom.
  • a map of the pCLS05H2f2 vector is shown in Figure 12b.
  • the pCLS05H2 vector containing the gene of the anti-HER2 antibody, which is the protein of interest, and the pCLS05H2f2 vector containing the antibody gene and the SAR factor, respectively, were transformed into DG44 cells, screened with geneticin-containing medium, and cell pools were obtained.
  • the expression rate of -HER2 antibody was confirmed. As shown in Table 6 and FIG. 13, it was confirmed that the expression rate of the anti-HE 2 antibody was 30 times higher than the case where no two copies of the SAR factor were introduced. . Containing SAR factors When using the P CLS05H2f2 vector, geneticin resistance was observed and the number of surviving cells was relatively high.

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Abstract

본 발명은 (a) CSP-B(Cytotoxic Serine Protease-B)의 5'-SAR(Scaffold or Matrix Attachment Region); (b) 동물세포에서 작동하는(operable) 프로모터; 및 (c) 폴리아데닐화 서열을 포함하는 동물세포용 발현 벡터, 그리고 이를 이용하여 재조합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 벡터는 CSP-B 5'-SAR을 포함하는 벡터로, 동물세포에 도입한 외래 유전자의 위치에 따른 유전자 발현 억제 현상을 극복하는 효과를 가지며, 목적 단백질의 발현율을 크게 향상시킨다. 본 발명의 벡터는 의약품용 재조합 단백질 또는 항체를 동물세포에서 효과적으로 발현시킨다. 본 발명의 벡터 및 이를 이용한 재조합 단백질의 제조방법은 의약품의 산업적 대량 생산에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
C S P - B 5 '-S AR 인자를 포함하는 동물세포 발현 백터 및 이를 이용한 재조합 단백질의 제조방법
【기술 분야】
본 발명은 CSP-B(Cytotoxic Serine Protease-B, 세포독성 세린 프로테아제ᅳ B) 5'-SAR(Sca fold Attachment Region) 인자를 포함하는 동물세포 발현 백터 및 상기 백터를 이용하여 재조합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
【배경 기술】
CHOCChinese Hamster Ovary) 세포와 같은 동물세포에 재조합 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 도입하면 임상적 치료를 위한 단백질 의약품을 생산할 수 있다.
적혈구증식인자인 NESP(Novel Erythropoiesis Stimulating Protein)는 다베포에틴 알파 (Darbepoet in alfa)라고도 불리우며, 천연형 에리스로포이에틴 (erythropoietin)에 2 개의 N-연결 당쇄 부위가 생성되도록 유전자 조작이 된 단백질 의약품이다 (Egrie and Browne, Br. J. Cancer, 84 Suppl. 1:3-10(2001)). NESP 는 조혈모세포를 자극하고 적혈구계로의 분화를 촉진하여 적혈구의 생성을 증가시킨다. NESP '의 혈청 반감기는 기존의 재조합 에리스로포이에틴보다 3배나 길기 때문에 만성신부전 환자의 빈혈치료에서 적은 투여 빈도로 동등한 치료효과를 기대할 수 있다.
항악성종양제인 트라스투주맙 (Trastuzumab)은 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조된 인간화 단일클론항체 (h飄 anized monoclonal antibody)로서 세포 표면에 있는 인간 표피증식인자 수용체 2(Human Epidermal growth factor Receptor 2， HER2)에 선택적으로 작용한다. 원발성 유방암의 25- 30%에서 HER2 의 과발현이 확인되고 있으며， 트라스투주맙은 HER2 가 과발현된 인간의 종양세포 증식을 억제한다.
외래 유전자는 동물세포 염색체의 어느 위치에 삽입되는가에 따라서 그 발현율이 달라질 수 있는데， 주변의 조절 인자들 혹은 크로마틴 (chromatin)의 구조에 의해서 외래 유전자의 발현이 영향을 받기 때문이다 (Zahn-Zabal et al. , J. Biotechnol, 87， 29-42 (2001)).
주위의 크로마틴이 외래 유전자의 발현에 영향을 주지 않도록 하는 크로마틴 인자를 사용하면 이러한 위치에 따른 유전자 발현 억제 현상 (posit ion effect)을 극복할 수 있고, 재조합 단백질을 고발현하는 등물세포 클론을 분리할 수 있는 기회를 높여서 의약품 생산 세포주를 제조하는 시간을 단축할 수 있다. 위치에 따른 유전자 발현 억제 현상을 극복할 수 있는 크로마틴 인자를 사용하여 안정적 세포주 (stable cell line)를 만들려는 시도가 이루어지고 있으며， 그러한 인자에는 BE(Boundary Element), SA /MAR(Scaf fold or Matrix Attachment Region) 및 LCR(Locus Control Region) 등이 있다.
SAR 는 MAR 라고도 불리우는 300-3000 bp 길이의 DNA 이고， 염색체 상의 크로마틴이 세포핵 매트릭스 (nuclear matrix)의 단백질과 결합하게 하고 유전자의 발현을 조절한다고 알려져 있으며 (Makrides (Ed.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. Elsevier. Chapter 10 (2003)), 형질전환 세포주에서 외래 유전자의 발현을 향상시킬 수 있다 (Poljak et al. , Nucleic Acids Res, 22, 4386—4394 (1994)； Kalos and Fournier, Mol . Cell. Biol, 15, 198-207 (2005)).
ᅳ Zahn-Zabal 등은 닭 라이소자임 (chicken lysozyme) 5 '-MAR 를 루시퍼라제 (lucif erase) 발현 백터에 도입하고 이 백터로 CH0 세포를 형질전환하여 안정적 세포 (stable cell)를 만들었다 (Zahn— Zabal et al . , J. Biotechnol, 87, 29-42 (2001)). MAR 를 포함하지 않은 백터로 형질전환한 안정적 세포와 비교했을 때， 라이소자임 5' -MAR 를 포함한 백터로 형질전환한 안정적 세포는 더 높은 루시퍼라제 발현율을 나타내었다. 또한， 라이소자임 5' MAR 를 1 카피 포함한 백터의 경우보다 MAR 를 2 카피 포함한 백터의 경우 더 높은 루시퍼라제 발현율을 나타내었다. 이러한 결과는 동물세포 발현 백터에 MAR를 도입하여 목적 단백질의 발현율을 높일 수 있음을 보여준다.
대한민국 특허 출원번호 제 2000—0043996 호에서는 동물세포 발현 백터에 인간 베타 글로빈 (human -globin) MAR 를 포함시켜서， 동물세포에 외래 유전자를 도입할 때 발생하는 유전자 발현 억제 현상을 극복하였다. 이 특허에는 인간 베타 글로빈 MAR 이외에, GenBank M83137 에 둥록되어 있는 인간 인터페론 베타 (human interferonᅳ β ) MAR 와 GenBank M62716 에 등록되어 있는 인간 CSP— B 3'-SAR 가 사용되었고， 이 세 가지 SAR/MAR 가 목적 단백질인 베타 갈락토시다제 (β-galactosidase)의 발현율을 향상시킴을 기술하였다. 또한， 이 특허에는 베타 글로빈 MAR 가 인터페론 베타 MAR 또는 CSP-B 3' SAR 보다 효과가 우수하다는 연구 결과가 공지되어 있다.
대한민국 특허 출원번호 제 2001-0079227 호에서는 동물세포 발현 백터에 인간 인터페론 베타 MAR 를 도입하여 외래 유전자의 발현을 증가시키고 효율적으로 재조합 단백질을 발현시켰다. 또한， 대한민국 특허 출원번호 제 200그 0108451 호에서는 동물세포 발현 백터에 인간 베타 글로빈 MAR를 2 카피 포함시켜서 베타 글로빈 MAR가 1 카피일 경우보다 더 우수하게 목적 단백질의 발현율을 향상시킴을 기술하였다. 이 특허에는 MAR 인자 1 카피와 2 카피의 비교 연구 결과가 기술되어 있고， MAR 인자 2 카피와 3 카피의 비교 연구 내용이 기재되어 있지 않다.
Hanson 과 Ley 는 약 70 kb 의 인간 염색체 14qll.2 조혈 세린 프로테아제 유전자 군 (hematopoiet ic serine protease gene cluster)에서 CSP-B 5' -SAR와 3' -SAR를 찾아내어 염기서열을 밝히고， 이들 SAR가 세포의 핵에서 유래하는 스캐폴드 (scaffold)와 결합하는 것을 생체외 실험 (//7 y/ ro)에서 확인하였다 (Hanson and Ley, Blood, 79， 610-618 (1992)).
CSP-B 5' -SAR 와 3' -SAR 꾀 염기서열은 각각 GenBank M62717 과 M62716 에 등록되어 있고， 그 길이는 각각 2429 bp 와 1233 bp 로써 CSP—B 5'-SAR 가 3'-SAR 에 비하여 2 배 정도 더 길다. GenBank AL 136018 에는 인간 염색체 14 지놈 (genome)의 염기서열이 등록되어 있으며， 이 서열 상에서 CSP-B 단백질을 암호화하는 유전자의 번역 개시 코돈 (codon)과 그 상위 (upstream)에 있는 5'-SAR사이의 길이는 1195 bp 이고， CSP-B 단백질을 암호화하는 유전자의 번역 종결 코돈과 그 하위 (downstream)에 있는 3'— SAR 사이의 길이는 4543 bp이다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다 .
【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
본 발명자들은 동물세포에서 재조합 단백질을 효율적으로 생산할 수 있는 백터를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, CSP-B(Cytotoxic Serine Protease— B)의 5'_SAR(Scaf fold or Matrix Attachment Region)를 백터에 포함시켜 (incorporated) 사용하는 경우에 매우 우수한 생산효율로 재조합 단백질을 생산할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다,
따라서 본 발명은 동물세포용 발현 백터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상술한 발현 백터에 의해 형질전환된 동물세포를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 재조합 단백질의 제조방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 다음을 포함하는 동물세포용 발현 백터를 제공한다:
(a) CSP-B( Cytotoxic Serine Protease-B)의 5'-SAR(Scaf fold or Matrix Attachment Region);
(b) 동물세포에서 작동하는 (operable) 프로모터; 및
(c) 폴리아데닐화 서열. 본 발명자들은 동물세포에서 재조합 단백질을 효율적으로 생산할 수 있는 백터를 개발하고자 노력하였다. 그 결과， CSP-B Cytotoxic Serine Protease-B)의 5' -SAR(Scaf fold or Matrix Attachment Region)를 백터에 포함시켜 (incorporated) 사용하는 경우에 매우 우수한 생산효율로 재조합 단백질을 생산할 수 있음을 규명하였다.
본 발명의 동물세포용 발현 백터는 CSP-B의 5'-SAR, 동물세포에서 작동하는 프로모터 ; 및 폴리아데닐화 서열을 포함한다.
본 발명의 가장 큰 특징은 CSP-B의 5'-SAR이 포함된 백터를 이용하는 것이다. 본 발명에서 이용되는 CSP— B 5'-SAR는 바람직하게는 GenBank M62717에 등록되어 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며， 서열목록 제 1서열에 그 예시적인 뉴클레오타이드 서열이 기재되어 있다.
CSP-B의 5'— SAR은 발현 백터에서 재조합 단백질의 생산 효율을 크게 증가시킨다.
CSP— B의 5'-SAR은 발현시키고자 하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 업스트림 또는 다운스트림에 위치할 수 있으며， 바람직하게는 다운스트림에 위치한다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이 , CSP-B 5'-SAR는 종래의 CSP—B 3'-SAR 및 베타 글로빈 MAR 인자보다 동물세포에서 목적 단백질의 발현율을 향상시킨다. 예를 들어， CH0 동물세포에서 목적 단백질인 베타 갈락토시다제를 발현시키는 백터에 CSP-B 5'-SAR, CSP-B 3 '—SAR 및 베타 글로빈 MAR 인자를 1 카피씩 도입한 경우, SAR 인자를 도입하지 않은 경우보다 베타 갈락토시다제 활성이 각각 10.0배， 2.2배 및 8.7배 높게 측정되었다 (도 7). 즉， CSP-B 5'-SAR 인자는 다른 인자들보다 상대적으로 우수한 목적 단백질의 발현율을 나타낸다.
또한， 목적 단백질을 NESP로 하여 SAR 인자의 효과를 확인하였을 때 유사한 결과가 도출되었다. CSP-B 5'-SAR와 CSP— B 3'— SAR 인자를 백터에 도입하고 CH0 세포를 형질전환한 경우， SAR 인자를 도입하지 않은 경우보다 NESP의 발현율이 각각 11.2배 및 3.2배 높게 측정되었다 (표 3 및 도 9). 백터에 CSP-B 5'-SAR 인자를 도입하였을 때, 그 형질전환 세포에서 NESP를 발현하는 양성 클론 (positive clone)의 형성 빈도가 증가하였고， 무작위로 선택한 클론들의 NESP 발현율 역시 증가하였다 (표 4, 표 5， 도 10 및 도 11).
목적 단백질을 항ᅳ HER2 항체로 하여 CSP— B 5'-SAR 인자의 효과를 확인하였다. CSPᅳ B 5'-SA 인자 2 카피를 백터에 도입하고 CH0 세포를 형질전환한 경우， SAR 인자를 도입하지 않은 경우보다 항 -HER2 항체의 발현율이 상대적으로 높게 측정되었다 (표 6 및 도 13). 백터에 SAR 인자를 도입하였을 때, 무작위로 선택한 클론들의 항 -HER2 항체 발현율이 높게 나타났다 (도 14 및 도 15).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 5'ᅳ SAR는 발현 백터에서 복수 개의 카피로 존재하며， 이 경우 1 카피로 존재하는 경우보다 재조합 단백질의 생산 효율을 증가시킨다. 보다 바람직하게는， 5'-SAR는 발현 백터에서 2 카피로 존재한다. 하기의 실시예에서 입증된 바와 같이 , 5'ᅳ SAR는 발현 백터에서 3 카피로 존재하는 경우보다 2 카피로 존재하는 경우에 재조합 단백질의 생산 효율이 보다 우수하다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이， CSP— B 5'-SAR 인자를 백터에 1
2 및 3 카피 도입하여 카피 수에 따른 효과를 확인한 결과, 이 SAR 인자를 연속적으로 2 카피 도입했을 때 베타 갈락토시다제 활성이 가장 높게 측정되었다 (도 8). 즉， 백터 내 SAR 인자의 카피 수가 목적 단백질의 발현율에 영향을 주며 2 카피의 SAR가 가장 바람직하다고 볼 수 있다.
5'— SAR가 발현 백터에서 복수 개의 카피로 존재하는 경우， 상기 복수 개의 카피는 연속적 또는 이격되어 위치할 수 있다. 바람직하게는， 상기 복수 개의 카피는 연속적으로 존재하며, 보다 바람직하게는 발현시키고자 하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 다운스트림에 연속적으로 존재한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 상기 동물세포에서 작동하는 (operable) 프로모터는 CMV(Cytomegalovirus) 프로모터， 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터， SV40(Simian Virus 40) 프로모터， SV40E1 프로모터， HSV(Herpes simplex virus)의 tk 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터， EFK elongation factor— 1 alpha) 알파 프로모터， 메탈로티오닌 프로모터， 베타 -액틴 프로모터， 인간 IL-2( inter luekin-2) 유전자의 프로모터， 인간 IFN(interferon) 유전자의 프로모터， 인간 IL— 4 유전자의 프로모터， 인간 림포특신 유전자의 프로모터 또는 인간 GM-CSF(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor) 유전자의 프로모터이고, 보다 바람직하게는 CMV 프로모테 SV40 프로모터， SV40E1 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터 또는 베타 -액틴 프로모터이고, 가장 바람직하게는 CMV프로모터이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 백터는 발현하고자 하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가적으로 포함하며 바람직하게는 호르몬, 사이토카인, 항체， 펩타이드 앱타머， 어드넥틴 (AdNectin), 어피바디 (af f ibody, 미국 특허 제 5, 831,012호)， 아비머 (Avimer, 'Silverman, J. et al , Nature Biotechnology 23(12) :1556(2005)) 또는 쿠니쪼 도메인 (Kunitz domain, Arnoux B et al . , Acta Crystallogr. D Biol. Crystal logr. 58(Pt 7) :12524(2002))， 및 Nixon, AE, Current opinion in drug discovery & development 9(2) :2618(2006))이다. 보다 바람직하게는 본 발명의 백터를 이용하여 발현하고자 하는 단백질은 EPO(erythropoietin), EP0 유사체 또는 항- HER2( Human epidermal growth factor receptor 2) 항체이다. 가장 바람직하게는 EPO, EP0 유사체로서 NESP( ovel Erythropoiesis Stimulating Protein, A30N, H32T, P87V, W88N, P90T) 또는 항ᅳ HER2 항체이다.
상기 EP0 유사체는 인간 EP0의 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상이 변이된 것을 포함한다. EP0 유사체는 아미노산 잔기의 추가 (addition), 삭제 (deletion) 또는 치환 (subst itut ion)을 통해 변이를 생성 (mutagenesis)함으로써 제작할 수 있으며 , 이를 통해 당쇄화 (glycosylation) 위치 (site)를 증가시키거나 그 위치를 바꿀 수 있다. EP0 유사체는 인간 EP0 보다 많은 수의 탄수화물 사슬 (carbohydrate chain)을 가지며, 적어도 하나 이상의 추가된 당쇄화 위치를 포함한다. 또한, EP0 유사체는 추가된 당쇄화 위치에 의해 자연 (natural occurring) 인간 EP0 보다 높은 시알산 (sialic acid) 레벨을 나타내지만 그로 인해 생물학적 활성에 중요한 단백질 2차 또는 3차 구조가 변하지는 않는다. EP0 유사체는 N-당쇄화 (N-glycosylation) 또는 0—당쇄화 (0- glycosylation)에 대한 추가적인 위치를 1， 2 또는 3군데 가질 수 있다. 예를 들면 69번째 루신 (leucine)이 아스파라긴 (asparagine)으로 치환되면 이것이 N-당쇄화의 4번째 위치로서의 역할을 하게 된다.
본 발명의 백터에서 발현하고자 하는 EP0 유사체의 예는， EP0 서열 (예컨대， GenBank M11319의 서열)에서 30， 51， 57, 69， 88， 89， 136 및 138번 위치에서 선택되는 최소 하나의 위치에 추가적인 당쇄화 위치가 도입된 것이다. 가장 바람직하게는， EP0 유사체는 A30N, H32T, P87V, W88N 및 P90T 변이를 포함하는 NESP이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 폴리아데닐화 서열은 소성장 호르몬 터미네이터， HSV(Herpes simplex virus) 유래 TK( Thymidine kinase) 또는 SV40(Simian virus 40) 유래 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 본 발명의 백터에서 바람직한 컨스트럭트는 5'에서 3'의 순서로， 동물세포에서 작동하는 프로모터 -발현 단백질 유전자-폴리아데닐화 서열ᅳ CSP-B 5'-SAR이며， 보다 바람직한 컨스트력트는 동물세포에서 작동하는 프로모터 -발현 단백질 유전자—폴리아데닐화 서열 -CSP-B 5'-SAR-CSP-B 5'- SAR아다.
본 발명의 백터는 선택마커를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 선택마커의 예는 진핵세포에 작용하는 항생제에 대한 내성 유전자를 포함하고， 바람직하게는 네오마이신， 제네티신 (G418) 및 카나마이신에 대한 내성 유성자이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 백터는 동물세포에서 목적 단백질을 발현하는 데 이용된다. 상기 동물세포는 포유류， 설치류, 조류 또는 곤층세포이며， 보다 바람직하게는 CHCXChinese hamster ovary) , VERO, HeLa 세포， WI38, BHK(Baby hamster kidney), COS 세포 또는 MDCK(Mad in— Darby Canine Kidney) 세포를 포함하고， 보다 더 바람직하게는 CHO, VERO, HeLa 또는 MDCK이고， 가장 바람직하게는 CH0 세포이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 백터는 디히드로폴레이트 환원효소 (dihydrofolate reductase: DHFR) 코딩 서열을 포함한다. 상기 서열은 백터의 증폭에 유용하다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 상술한 본 발명의 발현 백터에 의해 형질전환된 동물세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 상술한 본 발명의 형질전환된 동물세포를 배양하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 재조합 단백질의 제조방법은 (i) 본 발명의 형질전환된 동물세포를 배양하는 단계; 및 (Π) 상기 배양과정에서 생산된 재조합 단백질을 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 사용한 CSP-B 5'-SAR 인자는， 종래 기술에서 동물세포 발현 백터에 도입하여 의약품용 재조합 단백질의 생산성을 향상시키려는 시도에 사용되지 않았던 인자이다. 하기의 실시예로부터， CSP-B 5'-SAR를 백터에 도입하면 동물세포에서 목적 단백질의 발현율을 향상시킬 수 있음을 알 수 있다. 재조합 단백질의 생산을 위해서 기존에 사용하지 않았던 새로운 CSP— B 5'-SAR를 백터에 도입하여 목적 단백질의 발현 효율을 보다 높일 수 있는 방법을 개발한다면 단백질 의약품의 산업적 생산성을 증대시킬 수 있다.
종래 기술에서 CSP-B 5'-SAR를 동물세포 발현 백터에 도입하여 의약품용 재조합 단백질의 생산성을 향상시키려는 시도는 보고되지 않았다. 또한 SAR를 백터에 1 카피， 2 카피, 혹은 3 카피 도입하여 이 백터로 동물세포를 형질전환하였을 때， 몇 카피의 SAR를 포함하는 백터를 사용하는 것이 재조합 단백질의 생산성을 가장 높일 수 있는가에 대해서도 연구되지 않았다. 또한 SAR 인자의 위치에 따른 목적 유전자의 발현율 증대 효과에 대한 상세한 선행연구 결과가 공개되어 있지 않다.
본 발명의 발현 백터를 세포에 도입하여 형질전환된 동물세포를 제조하는 경우, 다양한 방법으로 백터를 세포에 도입시킬 수 있다. 예를 들어， 미세 주입법 (Capecchi， M.R.， Cell, 22:479(1980)), 칼슴 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al. , Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al . , EMBO J. , 1：841(1982)) , 리포좀 -매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al . , Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol. , 5： 1188-1190(1985)) , 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al . , Proc. Natl. Acad. Sci. , 87 :9568-9572 (1990)) 등에 의해 백터를 동물 세포 내로 주입할 수 있다.
형질전환된 동물세포의 배양은 당업계에 공지된 다양한 방법을 프로토콜을 이용하여 실시할 수 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하며, 예를 들어， Eagles' s MEKEagle' s minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959))， a -MEKStanner , CP. et al . , Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEMdscove, N. et al . , J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al. , Proc. Soc. Exp. Bio. Med. , 73:1(1950)), CMRL 1066， RPMI 1640(Moore et al . , J. Awer. Med. Assoc. 199:519(1967))， F12(Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963))， DMEM(Dulbecco 1 s modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al . , Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 흔합물 (Barnes, D. et al . , Anal. Biochem. 102:255(1980))， Way- mouth's MB752/l(Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A(McCoy, T.A.， et al .， Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G. et al . , In Vitro 14:11(1978)) 등이 이용될 수 있다. 동물세포 배양 및 배지에 대한 설명은， R. Ian Freshney , Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, Alan R Liss, Inc. , New York에 상세하게 기재되어 있으며， 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명의 백터는 CSP-B 5'-SAR 을 포함하는 백터로， 동물세포에 도입한 외래 유전자의 위치에 따른 유전자 발현 억제 현상을 극복하는 효과를 가지며， 목적 단백질의 발현율을 크게 향상시킨다.
(b) 본 발명의 백터는 의약품용 재조합 단백질 (예컨대， EP0) 또는 항체 (예컨대， 항 -HER2 항체)를 동물세포에서 효과적으로 발현시킨다.
(c) 본 발명의 백터 및 이를 이용한 재조합 단백질의 제조방법은 의약품의 산업적 대량 생산에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1 은 베타 갈락토시다제 발현 백터의 구조에 대한 개략도이다. lacZ 는 베타 갈락토시다제 유전자， BGH pA 는 소 성장호르몬 유전자의 폴리아데닐화 서열 및 TK pA는 싸이미딘 카이나아제 유전자의 폴리아데닐화 서열이다. 도 2 는 SAR/MAR 인자를 1 카피 포함하는 베타 갈락토시다제 발현 백터의 구조에 대한 개략도이다.
도 3 은 SAR 인자를 2 카피 포함하는 베타 갈락토시다제 발현 백터의 구조에 대한 개략도이다.
도 4 는 CSP-B 5'-SAR 인자를 3 카피 포함하는 베타 갈락토시다제 발현 백터의 구조에 대한 개략도이다.
도 5는 NESP 발현 백터의 구조에 대한 개략도이다.
도 6 은 SAR/MAR 인자를 포함하는 NESP 발현 백터의 구조에 대한 개략도이다.
도 7 은 SAR/MAR 인자를 1 카피 도입한 백터로 형질전환한 세포의 상대적 베타 갈락토시다제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 8 은 SAR 인자를 1， 2 및 3 카피 도입한 백터로 형질전환한 세포의 상대적 베타 갈락토시다제 활성을 나타낸 그래프이다.
도 9 는 SAR 인자를 도입한 백터로 형질전환한 세포의 상대적 NESP (적혈구 자극인자) 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 10 은 SAR 인자를 도입하지 않은 pCLS07Al 백터로 형질전환한 세포에서 무작위 선택한 24개 클론의 NESP 발현율을 나타낸 그래프이다. 도 11 은 CSP-B 5'-SAR 인자를 도입한 pCLSlOAlfl 벡터로 형질전환한 세포에서 무작위 선택한 24'개 클론의 NESP 발현율을 나타낸 그래프이다. 도 12는 항— HER2 항체 발현 백터의 구조에 대한 개략도이다.' 도 13 은 SAR 인자를 2 카피 도입한 백터로 형질전환한 세포의 상대적 항 -HER2 항체 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 14 는 SAR 인자를 도입하지 않은 pCLS05H2 백터로 형질전환한 세포에서 무작위 선택한 19 개 클론의 항 -HER2 항체 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 15 는 CSP-B 5'-SAR 인자를 2 카피 도입한 pCLS05H2f2 백터로 형질전환한 세포에서 무작위 선택한 19 개 클론의 항 -HER2 항체 발현율을 나타낸 그래프이다. 【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】 이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
실시예 1: SAR/MAR인자의 준비
인간 CSP-B ff-SAR및 3'-SAR 인자의 준비
GenBank M62717 및 AL136018 에 등록된 인간 CSP-B 5'-SAR DNA 를 PCR(Polymerase Chain Reaction)로 증폭하기 위하여， 인간 자연 살상 세포 (natural killer 세포， NK 세포 및 ATCC CRL-2407)의 지노믹 (genomic) DNA 를 준비하였다. DNA 분리 키트 (Dneasy Blood & Tissue Kit, Qiagen, Cat. No. 69504)를 사용하여 NK 세포로부터 지노믹 DNA 를 준비하였고, 이것을 5' SAR DNA PCR의 주형으로 사용하였다.
NK 세포의 지노믹 DNA 를 주형으로 Cs5S30( 프라이머 (attct tcagc acctc cttaa ttttt ctccc; 서열목록 제 5서열) 및 Cs5S300R 프라이머 (ccagg cagcc aaaga tcagt agttg tgttg; 서열목록 제 6 서열)를 사용하여 PCR 을 수행하였다. 98°C에서 10 초， 60°C에서 30 초， 그리고 721：에서 2 분 30초의 조건으로 35회 반복하여 PCR을 수행하였다.
다음으로， 이 PCR 산물을 pGEM-T 백터 (Promega, Cat. No. A3600)에 클로닝하여 pGEMT-CS5S.3.0k 백터를 제조하였다.
GenBank M62716 및 AL136018 에 등록된 인간 CSP-B 3'-SAR DNA 를 준비하기 위하여， NK 세포의 지노믹 DNA 를 주형으로 2kCspSF 프라이머 (tggtt ccttc attgg aaaag gaaaa cac; 서열목록 제 7 서열) 및 2kCspSR 프라이머 (tccgc tgagg ctgtg cccac agcca cc; 서열목록 제 8 서열)를 사용하여 PCR 을 수행하였다. 다음으로， 1 차 PCR 산물을 주형으로 CspSF 프라이머 (ggatc ccatt ctcct tgatg tacta at; 서열목록 제 9 서열) 및 CspSR 프라이머 (gaatt caaac aactc aatag caaga aac; 서열목록 제 10 서열)를 사용하여 PCR 을 수행하였다. 98°C에서 10 초, 60°C에서 30초， 그리고 72°C에서 5분의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 2 차 PCR 산물을 pGEM-T 백터에 클로닝하여 pGEMT-CS3S · 1.2k 백터를 제조하였다. 인간 베타 글로빈 MAR 인자의 준비
GenBank L22754 와 NW— 001838021 에 등록된 인간 베타 글로빈 MAR
DNA를 PCR로 증폭하기 위하여 , 인간 G— 2 세포의 지노믹 DNA를 준비하였다. DNA 분리 키트를 사용하여 G— 2 세포로부터 지노믹 DNA 를 준비하였고, 이것을 5' MAR DNA PCR 의 주형으로 사용하였다. G-2 세포의 지노믹 DNA 를 주형으로 Bg5MF-100F-NheI 프라이머 (aattg ctagc ttgta ttctg tttcg tgagg caagg ttt; 서열목록 제 11 서열) 및 Bg5MR-100R— Xhol 프라이머 (aattc tcgag ttcct ctcta tgttg gctca aatgt cct； 서열목록 제 12 서열)를 사용하여 PCR 을 수행하였다. 98°C에서 10 초, 60°C에서 30 초， 그리고 72°C에서 3 분 20 초의 조건으로 30 회 반복하여 PCR 을 수행하였다. 다음으로， 이 PCR 산물을 pcDNA3.3-T0P0 백터 (Invitrogen, Cat. No. K8300- 01)에 클로닝하여 pCDNA3.3-Bg5M 백터를 제조하였다. 실시예 2: 베타 갈락토시다제 발현 백터의 제조
pC06 백터의 제조
사이토메갈로바이러스 (Cytomegalovirus, CMV) 프로모터， 다수 제한효소 클로닝 부위 (Multiple Cloning Sites, MCS) 및 소 성장 호르몬 (Bovine Growth Hormone, BGH) 폴리아데닐레이션 서열 (polyadenylation sequence, pA)을 순서대로 포함하는 pC06 백터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저, pcDNA3.1(-) 백터 (Invitrogen, Cat. No. V795— 20)를 주형으로 V6— F 프라이머 (aagct tggat ccgaa ttcat cgatg gccgg ccggt accct cgagc tgtgc cttct agttg ccagc; 서열목록 제 13 서열) 및 V6ᅳ R 프라이머 (gctag ctaga gcccc agctg gttct ttccg; 서열목록 게 . 14 서열)를 사용하여 PCR 을 수행하였다. 98°C에서 10 초， 60°C에서 30 초， 그리고 72°C에서 1 분의 조건으로 30 회 반복하여 PCR 을 수행하였다. 다음으로， 이 PCR 산물을 PCDNA3.3— T0P0 백터 (Invitrogen)에 클로닝하여 pC06 백터를 제조하였다. pC04' 백터의 제조
SV40(Simian Virus 40) 프로모터, 코작 서열 (Kozak sequence , gccatc) , i¾ r(dihydrofolate reductase) 유전자 및 TK(herpes simplex virus thymidine kinase) pA 를 순서대로 포함하는 pC04' 백터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저， pcDNA3.3 백터를 주형으로 PsvApaDraF 프라이머 (aaaat tgggc cccac tacgt gctgt ggaat gtgtg tcagt taggg t; 서열목록 제 15 서열) 및 PsvKzDHR 프라이머 (tggtc gaacc atgat ggcgc gaaac gatcc tcatc ctgtc tct; 서열목록 제 16 서열)를 사용하여 PCR을 수행하였고， pOptiVEC-TOPO 백터 (Invitrogen, Cat. No. 12744-017)를 주형으로 DHKzPsvF 프라이머 (ggatc gtttc gcgcc atcat ggttc gacca ttgaa ctgca tcg; 서열목록 제 17서열) 및 TKNheNdeR프라이머 (tgtgt gcata tggct agcga taaca atttc acaca ggaaa cag; 서열목록 제 18 서열)를 사용하여 PCR 을 수행하였다. 98°C에서 10 초， 60°C에서 30 초， 그리고 72°C에서 1 분의 조건으로 30 회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로， 이 두가지 PCR 산물을 중복 (over lapping) PCR 을 통해 연결하고， pGEM_T 백터의 Apal 및 Ndel 제한효소 부위에 클로닝하여 pC04' 백터를 제조하였다. pC04 백터의 제조
PC04' 백터가 포함하는 SV40 프로모터에서 72 bp(ggtgt ggaaa gtccc caggc tcccc agcag gcaga agtat gcaaa gcatg catct caatt agtca gcaac ca; 서열목록 제 19 서열)의 인핸서 (enhancer) 1 개를 제거 (SV40dEl 프로모터 )한 PC04 백터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저， PC04' 백터를 Sphl 제한효소로 절단하고, 다음으로 큰 DNA 절편을 자가 라이게이션 (self-ligation)시켜 pC04 백터를 제조하였다.
PCLS07 백터의 제조
pC06 백터의 BGH pA 와 SV40 프로모터 사이에 SV40dEl 프로모터， 코작 서열， dhfr유전자 및 TK pA가 삽입된 pCLS07 백터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저， pC04 백터를 주형으로 PsvApaDraF 프라이머 및 TKNheNdeR프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 98°C에서 10 초, 60°C에서 30 초， 그리고 72°C에서 1 분 20 초의 조건으로 30 회 반복하여 PCR 을 수행하였다. 다음으로， 이 PCR 산물과 pC06 백터를 Dralll 및 Nhel 제한효소로 각각 절단하고， 여기에서 얻은 두 개의 큰 DNA 절편을 라이게이션 시켜서 pCLS07 백터를 제조하였다. pCLS08 백터의 제조
PCLS07 백터의 Nhel 제한효소 부위에 MCS 를 삽입하여 pCLS08 백터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, pGEM-T 백터에 클로닝되어 있는 에리스로포이에틴 유전자를 주형으로 NhAsElF 프라이머 (aattg ctagc atata gcgat cgcgc aggac agctt ccgac agcag ggcca gg; 서열목록 제 20 서열) 및 BbPsSbNhEIR 프라이머 (aattg ctagc atata cctgc aggta tatgg gccca t tag ctgag gttga atgag aatat cactg tccca gacac; 서열목록 제 21서열)를 사용하여 PCR을 수행하여 MCS를 제조하였다. 98°C에서 10 초， 60°C에서 30 초, 그리고 72°C에서 15 초의 조건으로 30 회 반복하여 PCR 을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물을 pCLS07 백터의 Nhel 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS08 백터를 제조하였다.
PCLS08G1 백터의 제조
PCLS08 백터의 Hindlll 와 Xhol 제한효소 부위 사이에 lacZ 및 lacY 유전자를 삽입하여 PCLS08G1 백터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저， pSV— β-Galactosidase 백터 (Promega, Cat. No.
TB094)를 주형으로 galHinF 프라이머 (aaUa agctt ctcgc gcaac ctatt ttccc ctcga ac; 서열목록 제 22 서열) 및 galXhoR 프라이머 (aattc tcgag ccgag tttgt cagaa agcag accaa ac; 서열목록 제 23 서열)를 사용하여 PCR 올 수행하여 lacZ 및 lacY 유전자를 증폭하였다. 98°C에서 10 초， 60°C에서 30 초， 그리고 72°C에서 3 분 30 초의 조건으로 30 회 반복하여 PCR 을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물을 pCLS08 백터의 Hindlll 및 Xhol 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS08Gl 백터를 제조하였다.
PCLS09G1 백터의 제조
pCLS08Gl 백터의 두 Nhel 제한효소 부위 사이에 있는 MCS 를 다른
MCS 로 바꾸어서 pCLS09Gl 백터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, pGEM-T 백터에 클로닝되어 있는 에리스로포이에틴 유전자를 주형으로 NhSbElF 프라이머 (aattg ctagc at at a cctgc aggtt gaatg agaat atcac tgtcc cagac a; 서열목록 제 24 서열 )와 NhAsSfPsEIR 프라이머 (aattg ctagc atata gcgat cgcta tatgg ccatg atggc catat agggc ccagg acagc ttccg acagc agggc c ggc； 서열목톡 제 25 서열)를 사용하여 PCR 을 수행하여 새로운 MCS 를 제조하였다. 98°C에서 10 초， 60°C에서 30초, 그리고 72°C에서 15초의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로， pCLS08Gl 백터의 두 Nhel 제한효소 부위 사이에 있는 기존의 MCS 를 제거하고 여기에 PCR 로 새톱게 만든 MCS 를 클로닝하여 pCLS09Gl 백터를 제조하였다. pCLS09Gl 백터의 맵 (map)은 도 1에 나타내었다. 실시예 3: SAR/MAR를 포함하는 베타 갈락토시다제 발현 백터의 제조
pCLS09Gltl 백터의 제조
PCLS09G1 백터의 Sbfl 및 PspOMI 제한효소 부위 사이에 CSP-B 3'-SAR 인자를 삽입하여 pCLS09Gltl 백터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저， pGEMT-CS3S.1.2k 백터를 주형으로 cs3sSbflF 프라이머 (aattc ctgca gggga tccca ttctc cttga tgtac taat； 서열목록 제 26 서열) 및 cs3sPsplR 프라이머 (aattg ggccc gaatt caaac aactc aatag caaga aac; 서열목록 제 27서열)를 사용하여 PCR을 수행하여 CSP-B 3'— SAR 인자를 증폭하였다. 98°C에서 10 초， 60°C에서 30 초， 그리고 72°C에서 2 분 30 초의 조건으로 30 회 반복하여 PCR 을 수행하였다. 다음으로， 이 PCR 산물을 pCLS09Gl 백터의 Sbfl 및 PspOMI 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS09Gltl 백터를 제조하였다. pCLS09Glfl 백터의 제조
PCLS09G1 백터의 Sbfl 및 PspOMI 제한효소 부위 사이에 CSP— B 5'ᅳ SAR 인자를 삽입하여 pCLS09Glfl 백터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저， pGEMT-CS5S.3.0k 백터를 주형으로 cs5sSbflF 프라이머 (aattc ctgca gggaa ttcct aaaca gagca at tag gtaag; 서열목톡 제 28 서열) 및 cs5sPsplR 프라이머 (aattg ggccc gaatt ccagt gtaaa cgtct tcctt gt; 서열목록 제 29 서열)를 사용하여 PCR 을 수행하여 CSP— B 5'ᅳ SAR 인자를 증폭하였다. 98°C에서 10 초, 60°C에서 30 초， 그리고 72°C에서 2 분 30 초의 조건으로 30 회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로， 이 PCR 산물을 pCLS09Gl 백터의 Sbfl 및 PspOMI 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS09Glfl 백터를 제조하였다. pCLS09Glgl 백터의 제조
PCLS09G1 백터의 Sbfl 및 PspOMI 제한효소 부위 사이에 베타 글로빈 MAR 인자를 삽입하여 pCLS09Glgl 백터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저， pcDNA3.3-Bg5M 백터를 주형으로 glmSbflF 프라이머 (aattc ctgca ggttg tattc tgttt cgtga ggcaa ggttt； 서열목록 제 30 서열) 및 glmPsplR 프라이머 (aattg ggccc ttcct ctcta tgttg gctca aatgt cct; 서열목록 제 31 서열)를 사용하여 PCR을 수행하여 베타 글로빈 MAR 인자를 증폭하였다. 98°C에서 10 초, 60°C에서 30 초, 그리고 72°C에서 3 분 20 초의 조건으로 30 회 반복하여 PCR 을 수행하였다. 다음으로， 이 PCR산물을 pCLS09Gl 백터의 Sbfl 및 PspOMI 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS09Glgl 백터를 제조하였다. pCLS09Glt2 백터의 제조
pCLS09Gltl 백터의 PspOMI 및 Sfil 제한효소 부위 사이에 CSP-B 3'- SAR 인자를 삽입하여 pCLS09Glt2 백터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저， pGEMT-CS3S.1.2k 백터를 주형으로 cs3sPsp2F 프라이머 (aattg ggccc ggatc ccatt ctcct tgatg tacta at; 서열목록 제 32 서열) 및 cs3sSfi2R 프라이머 (aattg gccat gatgg ccgaa ttcaa acaac tcaat agcaa gaaac; 서열목록 제 33서열)를 사용하여 PCR을 수행하여 CSP-B 3*-SAR 인자를 증폭하였다. 98°C에서 10 초, 60°C에서 30 초， 그리고 72°C에서 2 분 30 초의 조건으로 30 회 반복하여 PCR 을 수행하였다. 다음으로， 이 PCR 산물을 PCLS09G1U 백터의 PspOMI 및 Sfil 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS09Glt2 백터를 제조하였다.
PCLS09Glf2 백터의 제조 pCLS09Glfl 백터의 PspOMI 및 Sfil 제한효소 부위 사이에 CSP-B 5'- SAR 인자를 삽입하여 pCLS09Glf2 백터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, pGEMT— CS5S.3.0k 백터를 주형으로 cs5sPsp2F 프라이머 (aattg ggccc gaatt cctaa acaga gcaat taggt aag; 서열목록 제 34 서열) 및 cs5sSf i2R 프라이머 (aattg gccat gatgg ccgaa ttcca gtgta aacgt cttcc ttgt; 서열목록 제 35서열)를 사용하여 PCR을 수행하여 CSP-B 5'— SAR 인자를 증폭하였다. 98°C에서 10 초， 60°C에서 30 초, 그리고 72°C에서 2 분 30 초의 조건으로 30 회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR산물을 pCLS09Glfl 백터의 PspOMI 및 Sfil 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS09Glf2 백터를 제조하였다. pCLS09Gltf 백터의 제.조
pCLS09Gltl 백터의 PspOMI 및 Sfil 제한효소 부위 사이에 CSP-B 5'- SAR 인자를 삽입하여 pCLS09Gltf 백터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저， pGEMT-CS5S.3.0k 백터를 주형으로 cs5sPsp2F 프라이머 (aattg ggccc gaatt cctaa acaga gcaat taggt aag; 서열목록 제 34 서열) 및 cs5sSf i2R 프라이머 (aattg gccat gatgg ccgaa ttcca gtgta aacgt cttcc ttgt; 서열목록 제 35 서열)를 사용하여 PCR 을 수행하여 CSP-B 5'- SAR 인자를 증폭하였다. 981：에서 10 초， 60°C에서 30 초, 그리고 72°C에서 2 분 30 초의 조건으로 30 회 반복하여 PCR 을 수행하였다. 다음으로， 이 PCR 산물을 pCLS09Gltl 백터의 PspOMI 및 Sfil 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS09Gltf 백터를 제조하였다.
PCLS09GH3 백터의 제조
PCLS09Glf2 백터의 CMV프로모터 및 bla프로모터 사이에 있는 Bglll 제한효소 부위에 CSP-B 5'— SAR 인자를 삽입하여 pCLS09Glf3 백터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저， pGEMT-CS5S.3.0k 백터를 주형으로 cs5sBgl3F 프라이머 (aatta gatct gaatt cctaa acaga gcaat taggt aag; 서열목록 제 36서열) 및 cs5sBgl3R프라이머 (aatta gatct gaatt ccagt gtaaa cgtct tcctt gt； 서열목록 제 37 서열)를 사용하여 PCR 을 수행하여 CSP— B 5'-SAR 인자를 증폭하였다. 98°C에서 10， 60°C에서 30초， 그리고 72°C에서 2 분 30초의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로， 이 PCR 산물을 pCLS09GH2 백터의 Bgill 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS09Glf3 백터를 제조하였다. PCLS09Glf4 백터의 제조
pCLS09Glfl 백터의 CMV프로모터 및 bla프로모터 사이에 있는 Bglll 제한효소 부위에 CSP-B 5'-SAR 인자를 삽입하여 SAR 가 목적 유전자인 lacZ 및 lacY 유전자의 양쪽에 위치하는 pCLS09Glf4 백터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저， pGEMT-CS5S.3.0k 백터를 주형으로 cs5sBgl3F 프라이머 (aatta gatct gaatt cctaa acaga gcaat taggt aag; 서열목록 제 36 서열) 및 cs5sBgl3R 프라이머 (aatta gatct gaatt ccagt gtaaa cgtct tcctt gt； 서열목톡 제 37 서열)를 사용하여 PCR 을 수행하여 CSP-B 5' SAR 인자를 증폭하였다. 98°C에서 10 초， 60°C에서 30 초， 그리고 72°C에서 2분 30초의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로， 이 PCR 산물을 pCLS09Glfl 백터의 Bglll 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS09Glf4 백터를 제조하였다. 실시예 4: SAR/MAR도입 백터를 사용한 베타 갈락토시다제 발현
PCLS09G1, pCLS09Glfl, pCLS09Gltl 드는 pCLS09Glgl 백터를 사용한 형질전환
CSP-B 5'— SAR, CSP-B 3'-SAR, 및 베타 글로빈 MAR 인자를 백터에 1 카피씩 도입하여 다음과 같이 그 효과를 알아보기 위하여， 다음과 같은 방법으로 CHO DG44세포 (Invitrogen, Cat. No. 12609)를 형질전환하였다. 부착배양 형태의 DG44 세포를 6-웰 플레이트에 웰당 4 X 105 세포로 분주하였다. 24 시간 후 세포가 플레이트 바닥에 완전히 부착된 것을 확인하였다. Opt i -MEM 배지 (Gibe으 Cat. No. 31985— 070)를 멸균된 tube 3 개에 각각 500 μϊ 씩 분주한 후 미리 준비한 pCLS09Gl, pCLS09Glfl, pCLS09Gltl 및 pCLS09Glgl 백터를 2 씩 흔합하고 약하게 피펫팅 하였^ Opt i -MEM 배지를 멸균된 tube 3 개에 각각 500 ^씩 분주하였다. 여기에 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Cat. No. 11668ᅳ 027)을 10 jd 씩 취하여 흔합하고 약하게 피펫팅 한 다음 상온에서 5 분간 방치하였다. DNA 와 시약 용액을 흔합하여 상온에서 20 분간 방치하고, 이 흔합액을 각 DNA 당 준비한 6-웰 플레이트의 웰에 넣고 잘 흔합하였다.
PCLS09G1, pCLS09Glfl, pCLS09Gltl 5E^ pCLS09Glgl 백터로 형질전환한 세포 풀 (pool)의 베타 갈락토시다제 활성 확인
PCLS09G1 , pCLS09Glfl, pCLS09Gltl 또는 pCLS09Glgl 백터로 DG44 세포를 형질전환하고 24 시간 후 10% FBS 와 500 μg/ml 제네티신 (Geneticin)이 포함된 배지로 교환하였다. 3—4 일에 한 번씩 배지를 교환하며 3 주 동안 37°C, 5% C02 조건에서 배양하여 안정적 세포의 풀을 제조하였다.
베타 갈락토시다제 분석 키트 (Stratagen, Cat. No. 200383)를 사용하여 형질전환한 안정적 세포에 대한 베타 갈락토시다제 활성을 확인하고， 백터에 따른 베타 갈락토시다제 활성과 pCLS09Gl 백터를 기준으로 한 상대적 (relative) 베타 갈락토시다제 활성을 구하였다. 표 1 및 도 7 에 나타낸 바와 같이， SAR/MAR 인자가 도입되지 않은 pCLS09Gl 백터에 비해 SAR/MAR 인자를 도입한 백터는 모두 베타 갈락토시다제 활성이 증가하였다ᅳ 또한， 베타 글로빈 MAR 인자를 도입한 pCLS09Glgl 백터에 비하여 CSP— B 5'-SAR 인자를 도입한 pCLS09Glfl 백터의 경우 더 높은 베타 갈락토시다제 활성 증가를 보였다. 따라서， 목적 단백질의 발현율 증가를 위하여 백터에 CSP— B 5'-SAR를 도입하는 것이 바람직하다.
【표 1】
Figure imgf000022_0001
pCLS09Glfl, pCLS09Glf2, PCLS09Glf3 포는 pCLS09Glf4 백터로 형질전환한세포 풀의 베타 갈락토시다제활성 확인
CSP-B 5'-SAR 인자가 목적 단백질의 발현율을 증가시킨다는 것을 확인하고， 백터에 도입하는 SAR 인자의 카피 수에 따라서 목적 단백질의 발현율 증가가 어떻게 달라지는지 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다, p(XS09Glfl, pCLS09Glf2, PCLS09Glf3 또는 pCLS09Glf4 백터로 DG44 세포를 형질전환하고 제네티신 배지로 선별하여 세포 풀을 얻었다. 형질전환한 안정적 세포에 대한 베타 갈락토시다제 활성을 확인하고， 백터에 따른 베타 갈락토시다제 활성을 구하였다. 표 2과 도 8에 나타낸 바와 같이, SAR 인자를 1 카피 또는 3 카피 도입한 백터에 비하여 SAR 인자를 2 카피 도입한 백터가 더 높은 베타 갈락토시다제 활성을 보였다. 즉, SAR 인자에 의한 목적 단백질의 발현율 증가는 SAR 인자의 카피 수에 따라 달라지고， SAR 인자를 백터에 2 카피 도입함으로써 목적 단백질의 발현율을 최대로 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
【표 2】
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
실시예 5: ESP 발현 백터의 제조
에리스로포이에틴 유전자의 준비
GenBank M11319 (human fetal liver genomic erythropoietin gene) 및 GenBank NM000799(human erythropoietin mRNA)에 등록되어 있는 582 bp 의 에리스로포이에틴 유전자를 클로닝하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저， Human liver Marathon-Ready cDNA library(BD, Cat. No. 740그 1)를 주형으로 IE1ATGF 프라이머 (atggg ggtgc acgaa tgtcc tgcct； 서열목록 제 38 서열) 및 IE1TGAR 프라이머 (teat c tgtcc cctgt cctgc aggcc t; 서열목록 제 39서열)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 98°C에서 10 초， 58°C에서 30 초， 그리고 72°C에서 1 분의 조건으로 40 회 반복하여 PCR 을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR산물을 pGEMᅳ T 백터에 클로닝하였다.
NESP 유전자의 제조
대한민국 특허 출원번호 제 1995-0701453 호의 청구항 3 에 명시된 에리스로포이에틴 유사체 NESKA30N, H32T, P87V, W88N, P90T)의 유전자를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저， A30N 및 H32T 유사체의 유전자를 제조하기 위하여, pGEM-T 백터에 클로닝되어 있는 에리스로포이에틴 유전자를 주형으로 M13R 프라이머 (gaaac agcta tgacc atg; 서열목록 제 40 서열) 및 IAlglR 프라이머 (ctcat tcaag ctgca tgttt catta cagcc cgtcg tgat; 서열목록 제 41 서열)를 사용하여 PCR 을 수행하였고, M13F 프라이머 (caggg ttttc ccagt cacga; 서열목록 제 42서열) 및 IAlglF 프라이머 (atcac gacgg gctgt aatga aacat gcagc ttgaa tgag; 서열목록 제 43 서열)를 사용하여 PCR 을 수행하였다. 98°C에서 10 초， 60°C에서 30 초, 그리고 72°C에서 40 초의 조건으로 30 회 반복하여 PCR 을 수행하였다. 다음으로， 이 두가지 PCR산물을 중복 PCR을 통해 연결하고， pGEM-T 백터의 Ndel 및 Sphl 제한효소 부위에 클로닝하였다.
A30N, H32T 유사체의 유전자를 A30N, H32T, P87V, W88N 및 P90T 유사체의 유전자로 돌연변이화 시키고 번역 개시 코돈 (codon) 앞에 코작 서열 (gccacc)을 붙이기 위하여， pGEM-T 백터에 클로닝되어 있는 A30N, H32T 유사체의 유전자를 주형으로 M13R 프라이머 및 IA1G2R 프라이머 (cacat gcagc tgcag tgtct cattc acctg ggaag agttg ac; 서열목록 제 44 서열)를 사용하여 PCR 을 수행하였고， M13F 프라이머 및 IA1G2F 프라이머 (gtcaa ctctt cccag gtgaa tgaga cactg cagct gcatg tg; 서열목록 제 45 서열)를 사용하여 PCR 을 수행하였다. 98°C에서 10 초, 60°C에서 30 초， 그리고 72°C에서 40 초의 조건으로 30 회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로， 이 두가지 PCR 산물을 주형으로 IElKzATGHinF 프라이머 (aatta agctt gccac catgg gggtg cacga atgtc ctgcc t; 서열목록 제 46 서열)와 IElTGAXhoR 프라이머 (aattc tcgag tcatc tgtcc cctgt cctgc aggcc t； 서열목록 제 47 서열)를 사용하여 중복 PCR 을 수행하였다. 98°C에서 10 초， 60°C에서 30초， 그리고 72°C에서 50초의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다.
PCLS07A1 백터의 제조
상기 NESP 유전자의 PCR 산물을 pCLS07 백터의 MCS 중 Hindlll 및 Xhol 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS07Al 백터를 제조하였다. 실시예 6: SAR를 포함하는 NESP 발현 백터의 제조
pCLSlOAl 백터의 제조
NESP 를 동물세포에서 발현할 수 있는 pCLS07Al 백터의 Nhel 제한효소 부위에 SAR 또는 MAR 인자를 도입하기 위한 MCS 를 삽입하여 pCLSlOAl 백터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저， PCDNA3.K-) 백터를 주형으로 NhAsflF 프라이머 (aattg ctagc atata ggcgc gccaa cttga ttagg gtgat ggttc acgta g; 서열목톡 제 48 서열) 및 NhClPaPsflR 프라이머 (aattg ctagc atata atcga ttata tttaa ttaaa tatag ggccc ttgag tgttg ttcca gtttg gaaca aga; 서열목록 제 49 서열)를 사용하여 PCR 을 수행한 후 MCS 를 얻었다. 98°C에서 10 초， 60°C에서 30초， 그리고 72°C에서 15초의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 이 PCR 산물을 pCLS07Al 백터의 Nhel 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLSlOAl 백터를 제조하였다. pCLSlOAltl 백터의 제조 pCLSlOAl 백터의 Ascl 및 PspOMI 제한효소 부위 사이에 CSP-B 3' -SAR 인자를 삽입하여 pCLSlOAltl 백터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저， pGEMT-CS3S.1.2k 백터를 주형으로 cs3sAsclF 프라이머 (aattg gcgcg ccgga tccca ttctc cttga tgtac taat； 서열목록 거 150 서.열) 및 cs3sPsplR 프라이머 (aattg ggccc gaatt caaac aactc aatag caaga aac; 서열목록 제 51서열)를 사용하여 PCR을 수행하여 CSP-B 3'-SAR 인자를 증폭하였다. 98°C에서 10 초， 60°C에서 30 초, 그리고 72°C에서 2 분 30 초의 조건으로 30 회 반복하여 PCR 을 수행하였다. 다음으로， 이 PCR 산물을 pCLSlOAl 백터의 Ascl 및 PspOMI 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLSlOAltl 백터를 제조하였다. pCLSlOAlfl 백터의 제조
pCLSlOAl 백터의 Ascl 및 PspOMI 제한효소 부위 사이에 CSP-B 5'-SAR 인자를 삽입하여 pCLSlOAlfl 백터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저， pGEMTᅳ CS5S.3.0k . 백터를 주형으로 cs5sAsclF 프라이머 (aattg gcgcg ccgaa ttcct aaaca gagca at tag gtaag; 서열목록 제 52 서열) 및 cs5sPsplR 프라이머 (aattg ggccc gaatt ccagt gtaaa cgtct tcctt gt; 서열목록 제 53 서열)를 사용하여 PCR 을 수행하여 CSP-B 5'— SAR 인자를 증폭하였다. 98°C에서 10 초， 60°C에서 30 초， 그리고 72°C에서 2 분 30 초의 조건으로 30 회 반복하여 PCR 을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물을 pCLSlOAl 백터의 Ascl 및 PspOMI 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLSlOAlfl 백터를 제조하였다. 실시예 7: SAR도입 백터를 사용한 NESP발현
pCLS07Al, pCLSlOAlfl pCLSlOAltl 백터로 형질전환한 DG44 세포 풀의
NESP 발현율 확인
베타 갈락토시다제 활성 실험을 통해 확인한 SAR 인자의 효과가 다른 재조합 단백질의 발현에도 적용되는가를 알아보기 위하여， 목적 단백질인
NESP와 SAR 인자를 포함하는 pCLS07Al, pCLSlOAlfl 또는 pCLSlOAltl 백터를 DG44 세포에 형질전환하고 제네티신 포함 배지로 선별한 후 세포풀을 얻어서 EL ISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 방법으로 NESP 의 발현율을 확인하였다. 표 3 및 도 9 에 나타낸 바와 같이, SAR 인자가 도입된 경우 발현량이 증가하는 것을 확.인하였으며， 특히 CSP-B 5'-SAR 인자를 NESP 유전자의 하위 (downstream)에 도입한 경우 도입하지 않은 경우보다 NESP의 발현율이 11.2배 증가하는 것을 확인하였다.
【표 3】
Figure imgf000027_0001
NESP를 발현하는 양성 클론의 형성 빈도 확인
외래 유전자의 위치에 따론 유전자 발현 억제 현상을 극복할 수 있는 SAR 인자의 효과를 확인하기 위하여， pCLS07Al, pCLSlOAltl 또는 pCLSlOAlfl 백터를 DG44 세포에 형질전환한 후 96-¾ 플레이트를 사용해서 단일 콜로니 (single colony)를 만들었다. 현미경 관찰을 통해 각 백터의 콜로니 형성 빈도를 확인하고， 배양액을 채취하여 발현율을 측정하여 각 백터마다 NESP 를 발현하는 양성 클론 형성 빈도를 구하였다. 표 4 및 표 5 에 나타낸 바와 같이， SAR 인자 미도입시 82%의 콜로니 형성 빈도가 나타났고, CSP— B 5'-SAR 인자 도입시 90%, 3'-SAR 인자 도입시 50%의 웰에서 콜로니가 형성되었다. 또한 양성 클론의 빈도는 SAR 인자 미도입시 및 3'-SAR 인자 도입시 약 40% 정도로 나타났으며， 5'-SAR 인자 도입시 59%로 증가하였다. 즉, 5'-SAR 인자 도입시 외래 유전자의 위치에 따른 유전자 발현 억제 현상이 극복되어 목적 유전자인 NESP 를 발현하는 클론이 더 많이 형성됨을 확인할 수 있었다.
【표 4】
Figure imgf000027_0002
pCLSlOAltl CSP-B 3'-SA 240 119 50
【표 5]
Figure imgf000028_0001
단일 클론의 NESP 발현율 확인
NESP 의 발현이 확인된 96-웰 플레이트 상의 양성 클론 증 임의로 백터당 24 개를 골라 24-웰 플레이트로 계대한 후 배양액을 채취하여 발현율올 측정하였다. 도 10 과 도 11 에 나타낸 바와 같이 , CSP-B 5' SAR 인자를 도입한 백터의 경우 임의로 선택한 24 개의 양성 클론 중 10 /zg/m£ 이상의 발현율을 나타내는 고발현 클론이 13 개 나타났고， SAR 인자 미도입 백터의 경우 5 개 나타났다. 즉， 백터에 5' SAR 인자를 도입시 고발현 클론의 출현 빈도수가 증가하는 것을 확인하였다. 실시예 8: 항 -HER2 항체 발현 백터의 제조
pCOl 백터의 제조
네오마이신 저항 유전자, 암피실린 저항 유전자, CMV 프로모테 MCS, 및 BGH pA 를 순서대로 포함하는 pCOl 백터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, PCDNA3.K-) 백터를 주형으로 VIᅳ F 프라이머 (aagct tcctc agcat cgatg gccgg ccgga tccct gtgcc ttcta gttgc cagcc atctg t; 서열목록 제 54 서열) 및 V1_R 프라이머 (tagag cccca gctgg ttctt tccgc ctcag; 서열목톡 제 55 서열)를 사용하여 PCR 을 수행하였다. 98°C에서 10 초， 60°C에서 30 초， 그리고 72°C에서 1 분의 조건으로 30 회 반복하여 PCR 을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물을 PCDNA3.3— T0P0 백터에 클로닝하여 pCOl 백터를 제조하였다. pC02 백터의 제조
CMV 프로모터， pCOl 백터의 MCS 와 다른 MCS 및 BGH pA 를 순서대로 포함하는 pC02 백터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저， pcDNA3.1(-) 백터를 주형으로 V2_F 프라이머 (gaatt ctgta caggt acccc tgcag gctcg agctg tgcct tctag ttgcc agcca tctgt； 서열목록 제 56 서열) 및 V2ᅳ R 프라이머 (tagag cccca gctgg ttctt tccgc ctcag; 서열목록 제 57 서열)를 사용하여 PCR 을 수행하였다. 98°C에서 10 초， 60°C에서 30초， 그리고 72°C에서 1분의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. 다음으로， 이 PCR 산물을 pcDNA3.3-TOP0 백터에 클로닝하여 pC02 백터를 제조하였다. pC03 백터의 제조
pCOl 백터에 포함된 네오마이신 저항 유전자, 암피실린 저항 유전자, CMV 프로모터， 첫번째 MCS, BGH pA, pC02 백터에 포함된 CMV 프로모터 두번째 MCS 및 BGH pA 를 순서대로 포함하는 pC03 백터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저， pCOl 백터를 Dralll 및 Agel 제한효소로 절단하고 큰 DNA 절편을 얻었다. 다음으로 pC02 백터를 주형으로 PcmvAgeF 프라이머 (aatct gaccg gtgtt aggcg ttttg cgctg cttcg eg; 서열목록 제 58 서열) 및 BGHNheDraR프라이머 (Uact acact acgtg gat eg agcta gctag agccc cagct ggttc tttcc g; 서열목록 제 59 서열)를 사용하여 PCR 올 수행하고 이 PCR 산물을 Dralll 및 Agel 제한효소로 절단하였다. 98°C에서 10 초, 60°C에서 30 초, 그리고 72°C에서 1 분의 조건으로 30 회 반복하여 PCR 을 수행하였다. 마지막으로， pCOl 백터를 Dralll 및 Agel 제한효소로 절단한 DNA 절편과 이 PCR 산물을 라이게이션 시켜서 pC03 백터를 제조하였다.
PCLS05 백터의 제조
140pC03 백터의 BGH pA 와 SV40 프로모터 사이에 SV40dEl 프로모터, 코작 서열， dhfr 유전자 및 TK pA가 삽입된 pCLS05 백터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저， pC04 백터를 주형으로 PsvApaDraF 프라이머 및 TKNheNdeR 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 98°C에서 10 초， 60°C에서 30 초, 그리고 72°C에서 1 분 30 초의 조건으로 30 회 반복하여 PCR 을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물과 pC03 백터를 Dralll 및 Nhel 제한효소로 각각 절단하고, 여기에서 얻은 두 개의 큰 DNA 절편을 라이게이션 시켜서 pCLS05 백터를 제조하였다.
PCLS05H1 백터의 제조
PCLS05 백터의 EcoRI 및 Xhol 제한효소 부위 사이에 항ᅳ HER2 항체 중쇄 (heavy chain) 유전자를 삽입하여 pCLS05Hl 백터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 먼저, 합성한 항 -HER2 항체 유전자를 주형으로 HlssF 프라이머 (ctctt cttgg tagca acagc tacag gtgtc cactc cgagg tccaa ctggt cgaaa gcggt gga; 서열목록 제 60 서열)와 HlTGAXhoR 프라이머 (aattc . tcgag tcatt taccc ggaga caggg agagg ctctt； 서열목록 제 61 서열)를 사용하여 PCR 을 수행하여 시그날 서열 (signal sequence)의 일부가 있는 중쇄 '유전자를 증폭하고, 이 PCR 산물을 주형으로 HlssEcoF 프라이머 (aattg aattc gccac catgg gatgg agctg tatca tcctc ttctt ggtag caaca gctac agg; 서열목록 제 62 서열)와 HlTGAXhoR 프라이머 (서열목록 제 61 서열)를 사용하여 PCR 을 수행하여 코작 서열과 시그날 서열이 있는 중쇄 유전자를 증폭하였다. 98°C에서 10 초， 60°C에서 30 초， 그리고 72°C에서 1 분 30 초의 조건으로 30 회 반복하여 PCR 을 수행하였다. 다음으로, 이 PCR 산물을 pGEM-T 백터에 클로닝하고, EcoRI 및 Xhol 제한효소로 절단하여 코작 서열과 시그날 서열이 있는 증쇄 유전자를 얻은 후， pCLS05 백터의 EcoRI 및 Xhol 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS05Hl 백터를 제조하였다. pCLS05H2 백터의 제조 -
PCLS05H1 백터의 Hindi II 및 BamHI 제한효소 부위 사이에 항 -HER2 항체 경쇄 (light chain) 유전자를 삽입하여 pCLS05H2 백터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저, 합성한 항 -HER2 항체 유전자를 주형으로 H2ssF 프라이머 (ctctt cttgg tagca acagc tacag gtgtc cactc cgata tccag atgac ccaga gtccc tct； 서열목록 제 63 서열)와 H2TGABam 프라이머 (aattg gatcc tcaac actct cccct gttga agctc tttgt; 서열목록 제 64 서열)를 사용하여 PCR 을 수행하여 시그날 서열의 일부가 있는 경쇄 유전자를 증폭하고， 이 PCR 산물을 주형으로 H2ssHinF 프라이머 (aatta agctt gccac catgg gat g agctg tatca tcctc ttctt ggtag caaca gctac agg; 서열목록 제 65 서열)와 H2TGABamR 프라이머 (서열목록 제 64 서열)를 사용하여 PCR 을 수행하여 코작 서열과 시그날 서열이 있는 경쇄 유전자를 증폭하였다. 98°C에서 10 초， 60°C에서 30 초, 그리고 72°C에서 1 분의 조건으로 30 회 반복하여 PCR 을 수행하였다. 다음으로， 이 PCR 산물을 pGEM— T 백터에 클로닝하고， Hindi II 및 BamHI 제한효소로 절단하여 코작 서열과 시그날 서열이 있는 경쇄 유전자를 얻은 후, pCLS05Hl 백터의 Hindi II 및 BamHI 제한효소 부위에 클로닝하여 pCLS05H2 백터를 제조하였다. pCLS05H2 백터의 맵은 도 12a에 나타내었다. 실시예 9 ： SAR를 포함하는 항— HER2 항체 발현 백터의 제조
pCLS05H2f2 백터의 제조
항 -HER2 항체를 동물세포에서 발현할 수 있는 pCLS05H2 백터의 중쇄 유전자와 dhfr 유전자 사이에 CSP-B 5'-SAR 인자를 2 카피 도입하여 PCLS05H2f2 백터를 제조하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. PCLS05H2 백터 및 pCLS09Glf2 백터를 Xhol 및 BssHII 제한효소로 각각 절단하고 여기에서 얻은 두 개의 큰 DNA 절편을 라이게이션 시켜서 pCLS05H2f2 백터를 제조하였다. pCLS05H2f2 백터의 맵은 도 12b 에 나타내었다. 실시예 10 ： SAR도입 백터를 사용한 항 -HER2 항체 발현
PCLS05H2포는 pCLS05H2f2 백터로 형질전환한 DG44 세포 풀의 항 -HER2 항체 발현율 확인
목적 단백질인 항 -HER2 항체의 유전자를 포함하는 pCLS05H2 백터와 항체 유전자 및 SAR 인자를 포함하는 pCLS05H2f2 백터를 각각 DG44 세포에 형질전환하고 제네티신 포함 배지로 선별한 후 세포 풀을 얻어서 ELISA 방법으로 항 -HER2 항체의 발현율을 확인하였다. 표 6 및 도 13 에 나타낸 바와 같이, SAR 인자를 2 카피 도입한 경우 도입하지 않은 경우보다 항ᅳ HE 2 항체의 발현율이 30 배 높은 것을 확인하였다. . SAR 인자를 포함하는 PCLS05H2f2 백터를 사용했을 때 제네티신에 저항성을 나타내며 살아남은 세포의 개수가 상대적으로 많았다.
【표 6】
Figure imgf000032_0001
단일 클론의 항 -HER2 항체 발현율 확인
항ᅳ HER2 항체의 발현이 확인된 96-웰 폴레이트 상의 양성 클론을 임의로 골라 24-웰 플레이트로 계대한 후 배양액을 채취하여 발현율을 측정하였다. 도 14 와 도 15 에 나타낸 바와 같이， CSP— B 5'-SAR 인자를 2 카피 도입한 백터의 경우 임의로 선택한 19 개의 양성 클론 중 5 siglxwl 이상의 발현율을 나타내는 고발현 클론이 10 개 나타났고， SAR 인자 미도입 백터의 경우 6 개 나타났다. 즉， 백터에 5'— SAR 인자를 도입시 상대적으로 재조합 단백질을 고발현하는 클론의 출현 빈도수가 증가하는 것올 확인하였다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
다음을 포함하는 동물세포용 발현 백터:
(a) CSP-B(Cytotoxic Serine Protease-B)의 5'-SAR(Scaf fold or Matrix Attachment Region);
(b) 동물세포에서 작동하는 (operable) 프로모터; 및
(c) 폴리아데닐화 서열.
【청구항 2】
제 1 항에 있어세 상기 백터는 발현하고자 하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 동물세포용 발현 백터 .
【청구항 3】
제 1 항에 있어서 , 상기 5'-SAR 는 2 카피 (copies)로 존재하는 것을 특징으로 하는 동물세포용 발현 백터.
【청구항 4]
제 1 항에 있어서， 상기 동물세포에서 작동하는 (operable) 프로모터는 CMVCCyt omega lovirus) 프로모터， 아데노바이러스 후기 프로모터 백시니아 바.이러스 7.5K 프로모터， SV40(Simian Virus 40) 프로모터， SV40E1 프로모터， HSV(Herpes simplex virus)의 tk 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터， EFKelongat ion factor-1 alpha) 알파 프로모터， 메탈로티오닌 프로모터, 베타ᅳ액틴 프로모터， 인간 IL-2( inter luekin-2) 유전자의 프로모터， 인간 IFN( interferon) 유전자의 프로모터， 인간 IL-4( inter luekin-4) 유전자의 프로모터， 인간 림포록신 유전자의 프로모터 또는 인간 GM-CSF( Granulocyte macrophage colony- stimulating factor) 유전자의 프로모터인 것을 특징으로 하는 동물세포용 발현 백터.
【청구항 5】
제 1 항에 있어서， 상기 폴리아데닐화 서열은 소성장 호르몬 (Bovine Growth Hormone) , HSV(Herpes sim lex virus) 유래 TK(Thymidine Kinase) 또는 SV40(Simian virus 40) 유래 폴리 아데닐화 서열인 것을 특징으로 하는 동물세포용 발현 백터 .
【청구항 6】
제 1 항에 있어서， 상기 동물세포는 CHO Chinese hamster ovary) ,
VERO, HeLa 세포， WI38, BHK(Baby hamster kidney), COS 세포 또는 MDC (Madin-Darby Canine Kidney) 세포인 것을 특징으로 하는 동물세포용 발현 백터.
【청구항 7]
제 2 항에 있어서， 상기 단백질은 호르몬， 사이토카인， 항체， 펩타이드 앱타머 , 어드넥틴 (AdNectin), 어피바디 (af f ibody)， 아비머 (Avimer) 또는 쿠니 S 도메인 (Kunitz domain)인 것을 특징으로 하는 동물세포용 발현 백터.
【청구항 8]
제 7 항에 있어서， 상기 단백질은 EPO(erythropoietin), EP0 유사체 또는 항一 HER2(Human epidermal growth factor receptor 2) 항체인 것을 특징으로 하는 동물세포용 발현 백터.
【청구항 9]
상기 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 발현 백터에 의해 형질전환된 동물세포.
【청구항 10】
상기 제 9 항의 형질전환된 동물세포를 배양하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 제조방법.
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