WO2013107632A1 - Cucurbitacees androiques, procedes d'obtention et utilisations de ces cucurbitacees - Google Patents

Cucurbitacees androiques, procedes d'obtention et utilisations de ces cucurbitacees Download PDF

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Christelle Troadec
Adnane Boualem
Danièle HOSEMANS
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Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Vilmorin SA
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    • C12N15/829—Female sterility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y404/00—Carbon-sulfur lyases (4.4)
    • C12Y404/01—Carbon-sulfur lyases (4.4.1)
    • C12Y404/01014—1-Aminocyclopropane-1-carboxylate synthase (4.4.1.14)

Definitions

  • the present invention relates to the field of plant identification and in particular to the identification of the sexual type of plants. It relates to plants whose sexual type is modified, the use of such plants as well as methods for obtaining and detecting said plants.
  • hybrid plants thanks to the phenomenon of heterosis, also called hybrid vigor, generally have a superiority for many characters, compared to the average of their two parents. This superiority can be illustrated for example by a better vigor, a better yield, a greater adaptation to the environment in which the hybrid is cultivated and a great uniformity of the hybrids with respect to their parents. This hybrid vigor is all the more important as parents are genetically distant.
  • Plants with only female flowers are called gynoecious. Plants with only male flowers are called androids. Androecia is a highly desirable agronomic trait, especially in that only male flowers produce more pollen.
  • plants with male flowers and female flowers separated but on the same foot are called monoecious
  • plants with bisexual flowers are called hermaphrodites
  • plants with bisexual flowers and males on the same foot are called andromonoecious.
  • a first technique, implemented in particular for corn, is to use mechanical means to achieve emasculation of plants.
  • this technique is extremely expensive since it requires the emasculation of each plant which we want to avoid self-pollination, for each cross made.
  • Another technique is to achieve a chemical emasculation of plants, blocking the formation of viable pollen.
  • melon Cucumis melo
  • ethrel precursor of ethylene
  • Such chemical agents used to cause transient male sterility, have several disadvantages, such as high cost or high toxicity.
  • the cucurbitaceae family comprises more than 800 plant species in 120 genera in tropical and subtropical regions. This family of plants includes several species of major agronomic interest and are cultivated in temperate regions such as cucumber (Cucumis sativus), melon (Cucumis melo), watermelon (Citrullus lanatus), zucchini and squash (Cucurbita). spp, cucurbita pepo) or pumpkin (Cucurbita maxima) and pumpkin (Cucurbita moschata).
  • loofah Loofah (Luffa acutangula), bitterleaf (Momordica charentia) and gourd (Lagenaria siceraria).
  • Another way to obtain non-self-pollinating plants for the creation of hybrids could be to select exclusively female or exclusively male individuals, if they exist in the species of interest.
  • a technique would prove extremely costly as it would require the cultivation of a very large number of plants, until it is possible to determine the sexual type.
  • the selection of exclusively male individuals in particular is of interest in that it allows to produce only pollen and in large quantities.
  • the pollen thus produced can be used for the pollination of plants with female flowers.
  • some members of the family Cucurbitaceae such plants do not exist, as for example for some plants of the genera Cucumis, Cucurbita, Citrullus, Luffa, Lagenaria and Momordica.
  • plants of melon Cucumis melo, in particular spmelo, sspmelo
  • zucchini and pumpkin Cucurbita pepo
  • watermelon Cicumlus lanatus
  • loofah Limordica charentia
  • gourd Lagenaria siceraria
  • pumpkin Cucurbita maxima
  • pumpkin Cucurbita moschata
  • the inventors have identified and characterized for the first time the gene responsible for the androic sexual phenotype in cucumber (Cucumis sativus), a species for which androecia is found in the natural state.
  • the identified gene codes for 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase8 (ACS8), hereinafter referred to as Cucumis sativus ACS8, CsACS8.
  • Cucurbits have been used as a model for the study of sexual dimorphism for decades.
  • cucumber Cucumis sativus ..
  • sexual determinism is genetically controlled by three loci, F (Female), A (Androecious) and M (Monoecious).
  • the semi-dominant locus F (Female) controls the degree of ceremoniity.
  • the F allele leads to the early appearance of the female phase and therefore the FF plants are gynoecious (totally female).
  • the Androecious locus (a) increases the masculinity and the aaff genotype plants are androic (totally maies).
  • the M (Monoecious) locus is required for selective abortion of male reproductive organs in flower buds determined to develop a carpel.
  • the combination of M-ff alleles allows the development of monoecious plants, the most common sexual type in Cucurbitaceae, from male to female flowers.
  • Gynoecious, hermaphrodite and andromonoecious plants have, respectively, the genotypes MF-, mmF- and M ff.
  • ACC synthase, CsACS1 co-segregates with locus F (Trebitsh et al., 1997) and that monoecious plants have a single copy of this gene.
  • locus A responsible for the transition from the sexual type monoecious to andromonoecious, has recently been revealed by the work of Boualem et al, 2008. This work demonstrated that gene A coded for ACC synthase, CmACS-7, and that the loss of function of this enzyme was the cause of the appearance of andromonoecia. These results were the subject of the patent WO / 2007/125264.
  • the recessive allele g in combination with the allele A, causes the development of unisexual female flowers, or hermaphrodite flowers, when combined with the allele a.
  • the different sexual types are determined by the allelic combinations of the 3 genes F, M and A, while in melons the different sexual types are controlled by only 2 genes, A and G.
  • the gene A , CmACS-7, melon is the orthologue of the M gene, CsACS2, cucumber.
  • the inventors thus identified, for the first time, in plants belonging to the Cucurbitaceae family, a gene responsible for androecia.
  • Said gene is characterized by a non-mutated dominant allele inducing the synthesis of the 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase protein (active ACS8, limiting enzyme of the ethylene biosynthetic pathway), and by a recessive allele mutant inducing the synthesis of a protein ACS8 inactive or having a reduced enzymatic activity.
  • active ACS8 limiting enzyme of the ethylene biosynthetic pathway
  • the Cucurbitaceae according to the present invention having two recessive alleles for the ACS8 androecia gene are androic.
  • the inventors have furthermore demonstrated that two recessive alleles both having an enzyme activity reduced by at least 50% relative to a wild-type ACS8 were sufficient to drive this androic phenotype.
  • the Cucurbitaceae according to the present invention having a mutated recessive ACS8 allele are of interest in that they may be of androic tendency, that is to say have more male flowers than the wild plant.
  • plants according to the present invention whether they are androic or of androic tendency can be used as pollinator.
  • a first subject of the invention relates to a plant, of the family Cucurbitaceae, which plant is: selected from the group comprising the genera Cucumis, Citrullus, Cucurbita, Luffa, Momordica and Lagenaria, excluding the species Cucumis sativus ; and
  • ACS8 ⁇ -aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8
  • the reference carboxylate synthase 8 has an activity of converting S-adenosyl methionine to aminocyclopropane carboxylate and which variant has a lower activity than at least 50%, preferably at least 75% or 90%, more preferably at least 95% or 99% based on said reference 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase, and particularly preferably said variant has zero activity.
  • Another subject of the invention relates to a plant according to the invention, characterized in that it is homozygous for the allele of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8 (ACS8) which is non-coding or coding for a variant. of the reference ACS8 and androic.
  • ACS8 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8
  • Another subject of the invention relates to a seed whose germination leads to a plant as defined according to the invention.
  • Another object of the invention relates to a use of a plant according to the invention as a pollinator.
  • Another subject of the invention relates to an isolated polypeptide corresponding to a variant of a 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8 (ACS8) reference, plant of the family Cucurbitaceae, which 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8 shows an activity of conversion of S-adenosyl methionine to aminocyclopropane carboxylate and which variant has an activity lower by at least 50%, preferably by at least 75% or 90%, more preferably by at least 95%. % or 99% relative to said 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8 reference and particularly preferably, said variant has zero activity.
  • ACS8 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8
  • Another subject of the invention relates to a polynucleotide encoding the polypeptide according to the invention.
  • Another subject of the invention relates to a cell derived from a plant as defined in the present invention.
  • Another subject of the invention relates to a method for producing an androic plant of the cucurbitaceae family, said process comprising the steps of: a) obtaining a plant of the cucurbitaceae family, preferentially selected from the group comprising the genera Cucumis, Citrullus, Cucurbita, Luffa, Momordica and Lagenaria,
  • Another subject of the invention relates to a method for producing an Androic or Androic plant of the family Cucurbitaceae, said process comprising the steps of:
  • a) obtaining a plant of the Cucurbitaceae family which plant is selected from the group comprising the genera Cucumis, Citrullus, Cucurbita, Luffa, Momordica and Lagenaria,
  • Another object of the invention relates moreover to a method for propagating an androic homozygous plant of the invention, comprising the steps of: a) Treatment of androic plants homozygous for the mutated ACS8 allele of the invention, with a compound for inducing an increase in the intracellular concentration of ethylene, for generating female flowers, b) self-pollination of the plants obtained in step a), and c) harvesting of the seeds.
  • Another object of the invention relates to a method for identifying a plant having a nucleic acid sequence encoding the polypeptide according to the invention and comprising the steps of: a) analyzing a sample comprising cells of a plant of the family Cucurbitaceae or extracts thereof so as to identify whether said plant comprises a nucleic acid sequence encoding the polypeptide according to the invention; and
  • Another subject of the invention also relates to a method of selecting an androic plant, said process comprising the steps of: a) analyzing a sample comprising cells of a plant of the family Cucurbitaceae or extracts thereof to identify whether said plant comprises a nucleic acid sequence encoding the polypeptide according to the invention,
  • step b) identifying a plant comprising such a nucleic acid sequence, c) crossing plants having a nucleic acid sequence encoding a polypeptide according to the invention identified in step b), and
  • the invention also relates to a method for selecting a plant having at least two characters of interest, said method comprising the steps of:
  • step b) crossing plants having a nucleic acid sequence encoding a polypeptide according to the invention and still having said first characteristic of interest identified in step b),
  • step d) crossing a plant having at least a first character of interest obtained in step d) with a plant of the family Cucurbitaceae having at least a second character of interest;
  • Another subject of the invention also relates to a method for producing a seed of plant, preferably hybrid, diploid or triploid, comprising the steps of: a. planting a field alternately with androids and / or of androic plants of the invention comprising a first character of interest and sterile gynoecious and / or male plants as defined in the present invention comprising a second characteristic of interest,
  • Another object of the invention relates to a seed, preferably hybrid, of plant obtained by any of the methods of the invention.
  • the germination of this seed leads to a plant having said at least first and second characters of interest described above.
  • Another subject of the invention relates to a plant, of the cucurbitaceae family, selected from the group comprising the genera Cucumis, Citrullus, Cucurbita, Luffa, Momordica and Lagenaria, excluding the species Cucumis sativus, and characterized in that what it is androic.
  • Another subject of the invention relates to a use, for the identification of androic plants of the Cucurbitaceae family, of probes or primers allowing the detection of the polynucleotide according to the invention in a sample comprising cells of such a plant. or extracts from them.
  • a final subject of the invention concerns a use, for the identification of androic plants of the Cucurbitaceae family, of antibodies allowing the detection of the polypeptide according to the invention in a sample comprising cells of such a plant or extracts of these. DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
  • Figure 1 shows the scheme of crosses made to obtain the androic cucumber (Cucumis sativus) population used to determine the gene responsible for androecia.
  • Figure 2 shows the genetic map of the locus of androecia in cucumber made from a population of 230 individuals.
  • FIG. 3 shows the gene structure of the two alleles of the cucumber androecia gene, namely the dominant allele whose nucleic acid sequence codes for a wild-type ACS8 polypeptide sequence and the mutated recessive allele whose nucleic acid sequence encodes a truncated ACS8 polypeptide sequence.
  • FIG. 4 represents the kinetics of appearance of the male flowers, in connection with the experiments carried out in Example 9.
  • Figure 5 shows the kinetics of appearance of female flowers, in connection with the experiments performed in Example 9.
  • a first subject of the invention relates to a plant, of the family Cucurbitaceae, which plant is: selected from the group comprising the genera Cucumis, Citrullus, Cucurbita, Luffa, Momordica and Lagenaria, excluding the species Cucumis sativus ; and
  • ACS8 ⁇ -aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8
  • the reference carboxylate synthase 8 has an activity of converting S-adenosyl methionine to aminocyclopropane.
  • carboxylate and which variant has a lower activity of at least 50%, preferably at least 75% or 90%, more preferably at least 95% or 99% relative to said 1-aminocyclopropane-1-carboxylate Reference synthase 8 and particularly preferably, said variant has zero activity.
  • said activity of conversion of S-adenosyl methionine to aminocyclopropane carboxylate corresponds to a Vmax of less than or equal to 400 nmol.min -1 .mu.g- 1 , preferably less than or equal to 300, and particularly preferably less than or equal to 275. nmol.min ⁇ .mg ⁇ in the presence of a concentration of 5 ⁇ of pyridoxal5'-phosphate (PLP).
  • Another subject of the invention relates to a plant according to the invention, characterized in that it is homozygous for the non-coding or variant variant I-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8 (ACS8) allele. of the reference ACS8 and androic.
  • ACS8 I-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8
  • plant is meant a plant as a whole but also an isolated fragment or part of a plant such as a root derived from said plant, a leaf, a stem, a flower, a fruit, etc.
  • plants of the Cucurbitaceae family is intended to mean dicotyledonous plants of the Cucurbitaceae family and comprising in particular the genera Cucumis, Cucurbita, Citrullus, Lagenaria, Luffa, Momordica, Cyclanthera, Echinocystis, Thladiantha. , Bryona, Trichosanthes, Melothria, Ibervillea, Ecballium, Sechium, Benincasa, Sicyos, Coccinia.
  • said plant is selected from the group consisting of the genera Cucumis, Citrullus, Cucurbita, Luffa, Lagenaria and Momordica.
  • said plant is selected from the group consisting of Cucumis melo, Citrullus lanatus, Cucurbita pepo, Luffa acutangula, Lagenaria siceraria, Momordica charentia, Cucurbita maxima and Cucurbita moschata species.
  • Cucurbitaceae Cucumis melo, Citrullus lanatus, Cucurbita pepo, Luffa acutangula, Lagenaria siceraria, Momordica charentia, Cucurbita maxima and Cucurbita moschata with the androic phenotype have never been identified in the wild.
  • the only phenotypes that have been identified are, for Cucumis melo, the andromonoic, gynoecious, monoecious and hermaphroditic phenotypes; for Citrullus lanatus, the andromonoeconomic and monoecious phenotypes for Cucurbita pepo, the monoecious phenotype for Luffa acutangula, the monoecious, andromonoecious, gynoecious and hermaphroditic phenotypes; for Lagenaria siceraria, the monoecious and andromonoecious phenotypes and for Momordica charentia, the monoecious and gynoecious phenotypes.
  • the phenotypes present are the monoecious, andromonoecious, androic, gynoecious and hermaphrodite phenotypes.
  • the phenotype present is the monoecious phenotype.
  • polypeptide or “protein”, as used in the context of the present invention, refer to any amino acid chain, regardless of their length or their possible post-translational modifications (such as glycosylation, phosphorylation or alkylation). , etc).
  • polypeptide sequence aminocyclopropane carboxylate synthase 8 within the meaning of the present invention refers to the enzyme aminocyclopropane carboxylate synthase 8 transforming S-adenosyl methionine aminocyclopropane carboxylate.
  • This enzyme ACS8 is also known under other names, namely 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8, 1-amino-cyclopropane-1-carboxylate synthase 8, ACC synthase 8, S-adenosyl-L-methionine methylthioadenosine-lyase 8 or ACS8.
  • wild-type allele is meant, in the sense of the present invention, any natural allele coding for a protein which has an enzymatic activity similar or identical to that of the reference ACS8. Wild alleles within the meaning of this The invention provides genomic sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO. 34 and the coding sequences SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 29, SEQ ID No. 32 and SEQ ID No. # 35.
  • reference sequence within the meaning of the present invention is meant for a specific species of plant of the Cucurbitaceae family, the 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase 8 protein encoded by a wild-type allele which has 100% activity. of ACS8.
  • This reference sequence is characterized in that it is encoded by a nucleic acid sequence corresponding to a dominant allele present in the monoecious, andromonoecious, gynoecious and hermaphroditic plants.
  • reference ACS8 sequences for the species Cucumis sativus, Cucumis melo, Citrullus lanatus, Luffa acutangula, Lagenaria siceraria, Momordica charentia and Cucurbita pepo correspond to the sequences SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 12, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 36 respectively.
  • variant of a polypeptide sequence according to the invention is meant a polypeptide sequence which differs from the reference polypeptide sequence by at least one point mutation or which corresponds to a fragment thereof.
  • fragment of a reference polypeptide sequence is meant a polypeptide sequence of reduced length relative to the polypeptide sequence preferably, preferably less than 10% in length, for example at least 25 or 33%, and particularly preferably at least 50%.
  • a variant of a polypeptide sequence according to the invention may be of natural origin, such as a variant resulting from a pre-existing allelic variation in the wild state. Such a variant may also be a non-existing preexisting polypeptide sequence and obtained, for example, by mutagenesis techniques. Preferably, a te! variant is obtained at the end of a stage of utagenesis.
  • the activity of the enzyme ACS8 can be determined simply by those skilled in the art with regard to his general knowledge. By way of example, this activity can be determined by the method incorporated herein by reference described in BOUALEM et al. (2008, Science, Vol 321: p.836-838, A conserved mutation in an ethylene biosynthesis enzyme leads to andromonoecy in melons)
  • variants having the sequences SEQ ID No. 6 and SEQ ID No. 9 of Cucumis sativus mention may be made of the variants having the sequences SEQ ID No. 15 and SEQ ID No. 18 of Cucumis melo.
  • androic plant is meant, in the sense of the present invention, a plant carrying only male flowers. These male (staminate) flowers have only the male reproductive organs and thus produce only pollen, in contrast to female (pistillate) flowers producing only oocytes which will become seeds if they are fertilized. The fact that a plant is androic is called androecia.
  • plant with an androic tendency is understood to mean a heterozygous plant for the mutated allele according to the invention, carrying more male flowers than the same mono ⁇ c or andromonoecious wild plant, not having the mutated allele according to the invention.
  • the plant according to the invention has, in addition, at least a first character of interest such as a higher yield, less water consumption or even earlier flowering.
  • character of interest is meant, in the sense of the present invention, a character expressed by a plant and which gives it specific properties compared to other plants that do not express this character.
  • a character of interest is a character of agronomic interest which may be qualitative or quantitative.
  • the characters of interest within the meaning of the present invention may be, for example, larger and / or more numerous fruits, a higher yield, a lower consumption of water, an earlier flowering, a resistance to certain pathogens, be they viral, bacterial or fungal, or resistance to water stress.
  • alleles involved in the resistance to certain pathogens whether of a viral, bacterial or fungal nature, the Vat allele, which confers aphid resistance.
  • resistance means the ability of a plant or variety to restrict the growth and development of a particular pathogen or pest and / or the damage they cause, in comparison with susceptible varieties under similar environmental and pressure conditions of this pathogen or pest. Resistant plants or varieties may express some symptoms of the disease or some damage in case of strong pathogen or pest pressure.
  • the ISF distinguishes two resistance levels, namely standard or high resistance (HR *) and intermediate or moderate resistance (IR *).
  • Standard or high resistance means the ability of a plant or variety to severely restrict the growth and development of a specified pathogen or pest under normal growing pressure conditions. these, in comparison with susceptible varieties. These plants or varieties may, however, express symptoms or damage under high pressure of this pathogen or pest.
  • Intermediate or moderate resistance (IR *) or “partial resistance” means the ability of a plant or variety to restrict the growth and development of a specified pathogen or pest but may express more symptoms or damage compared to high / standard resistance varieties. Intermediate resistance plants or varieties will exhibit less severe symptoms or damage than those observed on susceptible varieties under similar environmental and / or pathogen or pest pressure conditions.
  • Immunity is meant not to be subject to attack or infection by a pest or a given pathogen.
  • Sensitivity means the inability of a plant or variety to restrict the growth and development of a specific pathogen or pest.
  • the plant according to the invention is characterized in that it is obtained by genetic engineering techniques.
  • the term “genetic engineering” refers to all the techniques for manipulating the genome of a living being in order to modify its genotype and consequently its phenotype.
  • the androic plant according to the invention is characterized in that the method for obtaining said plant is a mutagenesis inducing one or more mutations in the nucleotide sequence of the wild-type allele, resulting in a decrease in the activity of conversion of S-adenosyl methionine to aminocyclopropane carboxylate, this decrease in activity being less than 50%, preferably at least 75% or 90%, more preferably at least 95% or 99% less than relative to the 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8 wild and particularly preferably, the activity becoming zero.
  • Another subject of the invention relates to a seed whose germination leads to a plant according to the invention.
  • seed is meant, within the meaning of the present invention, an organ obtained by the development and maturation of the egg after fertilization, said organ contains the embryo and nutrient reserves necessary for its development during germination .
  • slaughter is understood to mean the phenomenon of passage from the embryo of the ripe seed from a state of life slowed down to an active growth state, by using the reserves contained in the seed, until the obtained seedling is autotrophic.
  • Another object of the invention relates to a use of a plant according to the invention as a pollinator.
  • the term "pollinator (s)” refers to a plant used as a pollen donor, which pollen is used to pollinate female flowers.
  • the term "pollinator” in the sense of the present invention is synonymous with the term “pollinating plant”.
  • the use as a pollinator of the homozygous plant for the mutated allele as defined in the present invention and thus androic allows the production of hybrid or triploid seeds and plants.
  • the absence of female reproductive organs facilitates experiments for the selection and improvement of plants.
  • the use of heterozygous plants for the mutated allele as defined in the present invention, which plant is of androic tendency allows the production of hybrid or triploid seeds and plants.
  • the use of androic plants can mitigate the effects of the desynchronization of male and female flowering.
  • the mutated allele according to the invention can be used in association with genes governing the architecture of the plant and in particular the positioning of the flowers in order to optimize their arrangement on the plant and therefore the dispersion and pollen and the quality of pollination.
  • the use of plants according to the invention makes it possible to increase the yield of the fruits produced on a plot of production.
  • the plants according to the invention producing more pollen than usual polinator plants
  • the producer can reduce the number of male plants polinizers, increase the number of female plants and thus increase the number of fruits harvested on the plot of production.
  • the use of a plant, as defined in the present invention, as pollinator is aimed at obtaining seeds of hybrid plants and hybrid plants, triploid plant seeds and plants producing fruits. seed-free, for example in the production of triploid watermelons.
  • the polinizing plants according to the invention can be used, for example, to pollinate tetraploid watermelon plants, thus producing triploid seeds. These triploid seeds will be planted to give triploid plants, the flowers of which will have to be pollinated, for example by polinizing plants according to the invention, to produce seedless fruits, appreciated by consumers.
  • hybrids are meant, within the meaning of the present invention, any plant belonging to the Cucurbitaceae family resulting from the crossing of two genetically different plants, preferentially, the two plants are two plants of genetically different lines.
  • Another subject of the invention relates to an isolated polypeptide corresponding to a variant of a 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8 (ACS8) reference, plant of the family Cucurbitaceae, which 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8 shows an activity of conversion of S-adenosyl methionine to aminocyclopropane carboxylate and which variant has an activity lower by at least 50%, preferably by at least 75% or 90%, more preferably by at least 95%. % or 99% relative to said 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8 reference and particularly preferably, said variant has zero activity.
  • ACS8 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synth
  • isolated in the sense of the present invention refers to biological material that has been removed from its original environment (the environment in which it is naturally located). For example, a polypeptide naturally occurring in a plant is not isolated. The same polypeptide separated from other adjacent polypeptides within the cell in which it is naturally present is isolated.
  • the polypeptide of the invention has at least 80% identity with the reference polypeptide sequence or a fragment thereof, preferably at least 85% or 90% identity, and particularly preferably preferred at least 95% identity with this sequence.
  • the polypeptide of the invention may be a fragment of the reference polypeptide.
  • Said fragment may be obtained by a nonsense mutation on the nucleotide sequence resulting in the appearance of a STOP codon in this nucleotide sequence or by a shifting mutation, which may in particular cause a shift in the reading frame to reveal a STOP codon in the nucleic acid sequence.
  • percentage identity between two polypeptide sequences is meant the percentage of identical amino acids, between two sequences to be compared, obtained with the best possible alignment of said sequences. This percentage is purely statistical and the differences between the two sequences are randomly distributed throughout the length of the amino acid sequences.
  • best possible alignment or optimal alignment is meant alignment to obtain the highest percentage of identity. Sequence comparisons between two amino acid sequences are usually performed by comparing said sequences after they have been aligned in the best possible alignment; the comparison is then performed on comparison segments so as to identify and compare regions of similarity.
  • the best possible alignment for comparison can be achieved using the global homology algorithm developed by Smith and Waterman (Math App., Vol.2, p: 482, 1981), using the algorithm of Local homology developed by Neddleman and Wunsch (J.
  • the percentage of identity is determined by comparing the two optimally aligned sequences, said sequences may comprise additions or modifications. deletions with respect to the reference sequence so as to obtain the best possible alignment between these two sequences.
  • the identity percentage is calculated by determining the number of identical positions between the two sequences, dividing the number obtained by the total number of positions compared and multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage identity between these two sequences. .
  • amino acid and “amino acids” within the meaning of the present invention correspond to any naturally occurring amino acid or their residues. Amino acids can be identified either by their abbreviation to a single letter, or by their abbreviation to three letters.
  • mutation in the sense of the present invention refers to a permanent change in the sequence of genetic material of a plant cell belonging to the family Cucurbitaceae. Such a mutation may correspond in particular to a substitution, a deletion or an insertion.
  • nonsense mutation is meant, in the sense of the present invention, the substitution, in a sequence of a gene, of a nucleotide by another nucleotide resulting in the appearance of a STOP codon.
  • shifting mutation is meant, within the meaning of the present invention, the insertion or the deletion, in the genomic sequence of a gene, of one or more nucleotides causing a shift of the reading frame, which can in particular lead to at the appearance of a STOP codon.
  • the isolated polypeptide corresponding to a variant of a 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8 (ACS8) reference, having an activity at least 50% lower than said Reference 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8 comprises a sequence having at least 90%, preferably 95% and even more preferably 98% identity with:
  • sequence SEQ ID No. 6 or variants or fragments thereof, in which the amino acid at position 152 and the following ones are deleted, with respect to the sequence SEQ ID No. 3,
  • the isolated polypeptide corresponding to a variant of a 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8 (ACS8) reference, having an activity at least 50% lower than said Reference 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8 comprises a sequence having at least 90%, preferably 95% and even more preferably 98% identity with: the sequence SEQ. ID No. 15 or variants or fragments thereof, wherein the amino acid at position 45 is phenylalanine relative to SEQ ID NO: 12,
  • Another subject of the invention relates to a polynucleotide encoding the polypeptide according to the invention.
  • the polynucleotide according to the invention may be non-coding if it comprises a mutation leading to the disappearance of the initiation codon of the reference polynucleotide.
  • a plant of the family Cucurbitaceae, homozygous for an ACS8 allele corresponding to said polynucleotide is androic, namely that it has only male flowers.
  • the term "homozygous plant” is intended to mean a plant having two polynucleotides encoding ⁇ -aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8 (ACS8) which is non-coding or encoding a polypeptide. corresponding to a variant of the reference ACS8, at the rate of one copy of said polynucleotide per chromosome of the pair of chromosomes.
  • ACS8 ⁇ -aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8
  • a plant of the family Cucurbitaceae, heterozygous for the mutated allele according to the invention has a delay in the appearance of female flowers compared to male flowers compared to wild plants having male flowers. Consequently, plants heterozygous for the mutated allele according to the invention have more male flowers than wild plants.
  • heterozygous plant is meant, in the sense of the present invention, a plant having a single polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention.
  • polynucleotide is intended to mean a single-stranded nucleotide chain or its complement or a double-stranded nucleotide chain which may be of the DNA or RNA type.
  • the polynucleotides of the invention are of the DNA type, in particular of double-stranded DNA.
  • nucleic acid sequence may be used to denote either a polynucleotide or a nucleic acid.
  • nucleic acid sequence encompasses the genetic material itself and is therefore not restricted to information about its sequence.
  • nucleic acid sequence refers to a DNA sequence (for example a cDNA (complementary DNA) or genomic or synthetic DNA) or to an RNA sequence (for example a messenger RNA or else synthetic RNA), as well as DNA or RNA analogs containing unnatural nucleotide analogues, unnatural internucleotide linkages, or both.
  • said nucleotide sequence is a DNA sequence.
  • the nucleotide sequences may have any topological conformation, such as linear or circular.
  • nucleotide refers to both natural nucleotides (Adenine: A, Thymine: T, Guanine: G, Cytosine: C) as well as modified nucleotides that include at least one modification such as (i) an analog of a purine, (ii) a analog of a pyrimidine, or (iii) an analog sugar, such modified nucleotides being described for example in PCT Application No. WO 95/04064.
  • the polynucleotide encoding the polypeptide of the invention comprises a sequence having at least 90%, preferably 95% and even more preferably 98% identity with
  • sequence SEQ ID No. 5 or variants or fragments thereof, in which the nucleotide at position 394 is deleted with respect to the sequence SEQ ID No. 2,
  • sequence SEQ ID No. 8 or variants or fragments thereof, in which the nucleotide at position 173 is an adenine, with respect to the sequence SEQ ID No. 2.
  • the polynucleotide encoding the polypeptide of the invention comprises a sequence having at least 90%, preferably 95% and more preferably 98% identity with
  • sequence SEQ ID No. 14 or variants or fragments thereof, in which the nucleotide at position 133 is a thymine with respect to the sequence SEQ ID No. 11,
  • Another subject of the invention relates to a cell derived from a plant as defined in the present invention.
  • Said plant cell comprises the polypeptide of the invention or the polynucleotide encoding said polypeptide.
  • plant cell is intended to mean protoplasts, gametes producing cells and cells regenerating whole plants.
  • plant cell also refers, without limitation, to cells obtained or isolated from: seeds, suspension cultures, embryos, meristems, leaves, roots, shoots, gametophytes, sporophytes, pollen and microspores.
  • a “plant cell” can refer to a single cell or cell population.
  • a population of plant cells can be pure, that is to say composed of a single type of cell, or composed of different types of cells.
  • a plant cell within the meaning of the present invention may be isolated or included in a plant tissue, a plant organ or a plant in any stage of development.
  • Another subject of the invention relates to a method of identifying a plant having a nucleic acid sequence encoding the polypeptide according to the invention and comprising the steps of:
  • Step a) analysis can be done by methods that are well known to those skilled in the art. These methods may be direct methods for detecting the nucleic acid sequence selected from the group including but not limited to polymerase chain reaction (PCR), In situ hybridization, Northern blot, Southern blot, sequencing, KEYPOINT TM technique or TILLING.
  • PCR polymerase chain reaction
  • In situ hybridization Northern blot
  • Southern blot Southern blot
  • sequencing KEYPOINT TM technique or TILLING.
  • the TILLING method is well known to those skilled in the art; it is described in particular by Me CALLUM et al. (2000, Plant Physiology, Vol 123: 439-442). These methods may also be indirect methods based on the detection of the polypeptide encoded by said nucleic acid sequence and selected from the group comprising, but not limited to, evaluating the activity of said polypeptide, western blot, spectrometry proteomic mass or the iTRAQ method.
  • the identification step b) can be carried out simply by the person skilled in the art with regard to his general knowledge.
  • This step may comprise in particular a plant culture step identified in step a) as comprising the nucleic acid sequence of the invention.
  • the identification method according to the invention is characterized in that said plant of the Cucurbitaceae family has, in addition, at least one first character of interest and in that it further comprises, optionally , a step b ') of selecting a plant always having said at least first character of interest.
  • the method according to the invention is characterized in that it further comprises a preliminary step of mutagenesis of a plant or a plant seed of the Cucurbitaceae family. This step can in particular make it possible to obtain a collection of mutant plants.
  • mutagenesis techniques used for the purposes of the present invention must make it possible to induce mutations in the genome of plant cells.
  • mutagenesis techniques are well known to those skilled in the art and include in particular UV, X-ray or gamma mutagenesis, targeted mutagenesis by the KEYBASE TM technique or chemical mutagenesis, for example ethylmethanesulphonate (EMS; see especially the method described by KOORNBEEF et al., Mutat.Res., Vol 93: 109-123, 1982), meganucleases (endodeoxyribonucleases), zinc finger nucleases, ribozymes.
  • EMS ethylmethanesulphonate
  • the identification of androic plants can be done as follows: seeds of the Cucurbitaceae family are exposed to an agent mutagenic. Plants from these mutated seeds are then self-fertilized to obtain a collection of mutant plants.
  • the DNA of each plant from the previously generated collection is extracted and the nucleic acid sequence of the allele encoding ACS8 is amplified to look for the presence of mutation (s) relative to the sequence of the allele coding for non-mutated ACS8. Plants mutated in the sequence of the ACS8 coding allele are selected.
  • DNA “pools” are then made by mixing the DNA extracted from several plants of the previously generated collection, which makes it possible to reduce the number of mutations detection steps.
  • the target sequences are amplified by PCR using the appropriate nucleic primers.
  • the amplicons thus obtained are heated and then cooled in order to generate DNA heteroduplexes between the DNA of a non-mutated plant on the nucleic acid sequence of the allele coding for ACS8 and the DNA of a plant. mutated on the nucleic acid sequence of the allele encoding ACS8.
  • the heteroduplexes are incubated in the presence of a cutting endonuclease at the level of the mismatches, before being denatured and separated.
  • the separated DNA strands thus obtained are subjected to the mutation detection step (s), by electrophoresis or by HPLC under denaturing conditions (DHPLC) described for example by MC CALLUM et al. (2000, Plant Physiol., Vol 123: 439-442).
  • the method of the invention is characterized in that it further aims at the selection of an androic plant and in that it further comprises the steps of: c) crossing plants with a nucleic acid sequence encoding a polypeptide according to the invention identified in step b); and
  • the method according to the invention further comprises the steps of: e) crossing a plant having at least a first character of interest obtained in step d) with a plant of the family Cucurbitaceae having at least one second characteristic of interest; and
  • the crossing step e) includes a pollen collection step of the plant having at least a first character of interest, a step of contacting this pollen with the female organs of the female flowers or hermaphrodites previously manually, chemically or genetically emasculated, sterile males or any plant having functional female organs and non-functional male organs, plants having at least a second trait of interest, for obtaining seeds and finally a culture step previously obtained plant seeds.
  • the method according to the invention is characterized in that the plant of the Cucurbitaceae family having at least one second characteristic of interest is gynoecious or male sterile.
  • a method for obtaining gynoecious plants may be that described, for example, in PCT Application No. WO 2010/012948.
  • a method for obtaining hermaphroditic plants may be that described, for example, in PCT Application No. WO 2007/125264.
  • gynoecious plant in the sense of the present invention, a plant carrying only female flowers.
  • the female (pistillate) flowers present only the female reproductive organs and therefore produce only oocytes that will become seeds if fertilization occurs, unlike male (staminate) flowers that produce only pollen.
  • the fact that a plant is gynoecious is called gynoecia.
  • the term “hermaphrodite plant” is intended to mean plants whose flowers bear both the male reproductive organs and the female reproductive organs.
  • sterile male plant is meant, in the sense of the present invention, a hermaphroditic plant devoid of male reproductive organs or devoid of male reproductive organs capable of producing pollen and / or viable pollen by a manual emasculation, chemical or genetics.
  • the process according to the invention is characterized in that it is further directed to the production of a plant seed, preferably a hybrid, diploid or triploid seed, and in that it also comprises the steps of: e) planting a field alternately with the androic plants of the invention and / or with androic tendency and gynoecious plants and / or sterile males as defined above;
  • Another subject of the invention relates to a seed, preferably hybrid, diploid or triploid seed of plant obtained according to the process for producing a seed of plant, preferably hybrid, diploid or triploid, according to the invention.
  • Another subject of the invention relates to a method for producing an androic plant of the cucurbitaceae family, said process comprising the steps of: a) obtaining a plant of the cucurbitaceae family, preferably selected from the group comprising the genera Cucumis, Citrullus, Cucurbita, Luffa, Momordica and Lagenaria,
  • the 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8 (ACS8) of said plant is characterized by a nucleic acid sequence having at least 75%, particularly at least 80%, more particularly at least 90%, preferentially at least 95%, more preferably at least 98%, still more preferably at least 99% identity with any one of SEQ ID 10, 19, 22, 25, 28 and 31.
  • step b) of inhibition of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8 makes it possible to obtain an activity that is at least 50% lower, preferably at least 50%. at least 75% or 90%, more preferably at least 95% or 99% based on said 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8 of said plant before inhibition.
  • ACS8 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8
  • Inhibition of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8 is to be taken broadly, and includes the inhibition of the expression, by use of expression inhibitors, of 1-aminocyclopropane-1. carboxylate synthase 8 (ACS8) or the inhibition of the activity, using inhibitors of activity, of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8 (ACS8).
  • expression inhibitor is meant a natural or synthetic compound having the ability to inhibit, or significantly reduce, the expression of a gene at the different levels of expression thereof, including transcription and the translation.
  • Expression inhibitor examples include interfering RNAs (siRNA, miRIMA, shRNA) and antisense oligonucleotides (including antisense DNA and RNA), acting by binding to the gene of interest, and thus preventing the expression of the gene by blocking the translation or by an increase in the degradation of the messenger RNAs.
  • Antisense oligonucleotides measure typically about 15 bases and are complementary to the RNA or DNA of the gene of interest. They can be synthesized and used by methods well known to those skilled in the art. Interfering RNAs are also selected and used by methods well known to those skilled in the art. Ribozymes can also be used to inhibit the expression of a gene of interest.
  • Ribozymes are in fact enzymatic RNA molecules capable of catalyzing the cleavage of RNA.
  • the mechanism of ribozyme action involves sequence-specific hybridization of the ribozyme molecule to the complementary RNA target sequence followed by endonucleolucleotide cleavage. Techniques for obtaining and using such ribozymes are well known to those skilled in the art.
  • the ribozyme-specific cleavage sites in any potential RNA target are initially identified by studying the target RNA, the sites typically comprising the GUA, GUU and GUC sequences.
  • the small RNA sequences typically 15 to 20 ribonucleotides and corresponding to the region of the target RNA comprising the cleavage site, can be evaluated in terms of predicting their structural characteristics (equivalent to a secondary structure ) that can render the oligonucleotide unsuitable.
  • antisense oligonucleotides, the interfering RNAs and the ribozymes that can be used in the context of the invention may be prepared by methods known to those skilled in the art. They include chemical synthesis techniques. Alternatively, antisense RNA molecules and interfering RNAs can be generated by in vitro or in vivo transcription of DNA sequences encoding such RNA molecules. These DNA sequences can be incorporated into a large number of vectors that comprise or may include suitable RNA polymerase promoters such as T7 or SP6 polymerase promoters. Numerous modifications well known to those skilled in the art can be made to the oligonucleotides of the invention to increase their cell stability and half-life.
  • antisense oligonucleotides, interfering RNAs and ribozymes of the invention can be delivered in vivo alone or in combination with a vector.
  • activity inhibitor is meant a compound, natural or otherwise, having the ability to reduce or suppress the activity of a protein.
  • Inhibitors of activity of the invention may be chemical compounds, natural or synthetic, but also biological compounds, significantly inhibiting or reducing the activity of a protein of interest. Such compounds may be molecules binding to said protein (e.g., but not necessarily, at its active site), and thereby blocking its activity. The compounds can also inhibit the activity of the protein by acting on an actor of the signaling pathway of said protein of interest.
  • the activity inhibitor of the invention may also be an aptamer.
  • Aptamers are molecules that represent an alternative to antibodies in terms of molecular recognition. These are oligonucleotide or oligopeptide sequences having the ability to recognize virtually any class of target molecules with high affinity and specificity. Such ligands can be isolated and modified by techniques well known to those skilled in the art.
  • Another subject of the invention also relates to a plant or a seed obtained by this process according to the invention.
  • said androic plant of the family Cucurbitaceae is not from the species Cucumis sativus.
  • Another subject of the invention relates to a method for producing an Androic or Androic plant of the family Cucurbitaceae, said process comprising the steps of:
  • a) obtaining a plant of the Cucurbitaceae family which plant is selected from the group comprising the genera Cucumis, Citrullus, Cucurbita, Luffa, Momordica and Lagenaria,
  • said variant of the 1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8 (ACS8) reference highlighted in step b) is characterized by a nucleic acid sequence having at least 75%, particularly at at least 80%, more preferably at least 90%, preferably at least 95%, more preferably at least 98%, even more preferably at least 99% identity with any of SEQ ID 10, 19, 22, 25 , 28, 31 and 33, but not exactly the same as this.
  • Another subject of the invention also relates to a plant or a seed obtained by this process according to the invention.
  • said androic plant of the family Cucurbitaceae is not from the species Cucumis sativus.
  • Another subject of the invention relates to a method of selecting a plant having at least two characters of interest, said method comprising the steps of:
  • step b) crossing plants having a nucleic acid sequence encoding a polypeptide according to the invention and still having said first characteristic of interest identified in step b),
  • step d) crossing a plant having at least a first character of interest obtained in step d) with a plant of the family Cucurbitaceae having at least a second character of interest;
  • Another subject of the invention also relates to a plant or a seed obtained by this process according to the invention.
  • the said plant of the cucurbitaceae family of step d) does not come from the species Cucumis sativus.
  • Another object of the invention relates moreover to a method for propagating an androic homozygous plant of the invention, comprising the steps of: a) treating androic plants homozygous for the mutated ACS8 allele of the invention, with a compound making it possible to induce an increase in the intracellular concentration of ethylene, for generating female flowers, b) self-pollination of the plants obtained in step a), and c) harvesting of the seeds.
  • Ethephon or ethrel, is a plant growth factor well known to those skilled in the art.
  • ACC or 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid plays an important role in the biosynthesis of ethylene and is synthesized by ACC synthetase enzyme from methionine, and then converted to ethylene by ACC oxidase.
  • Homozygous androic plants for the mutated ACS8 allele of the invention comprise a polypeptide or polynucleotide of the invention.
  • the seeds obtained by such a method are de facto androic, and include a polypeptide or polynucleotide of the invention.
  • Another subject of the invention also relates to a plant or a seed obtained by this process according to the invention.
  • said androic plant of the family Cucurbitaceae is not from the species Cucumis sativus.
  • Another subject of the invention also relates to a method for producing a plant seed, preferably a hybrid, diploid or triploid seed, comprising the steps of: at. planting a field alternately with androids and / or of androic plants of the invention comprising a first character of interest and sterile gynoecious and / or male plants as defined in the present invention comprising a second character of interest;
  • an androic plant with an andro tendency of the invention carries a mutated allele ACS8 of the invention or is heterozygous for the mutated allele of ⁇ -aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8 (ACS8) non-coding or coding for a variant of the reference ACS8.
  • Said androic plant has more male flowers than the same monoecious or andromonoecious wild plant that does not have said mutated allele.
  • said seed is homozygous for the mutated ACS8 allele of the invention, and thus comprises a polypeptide and / or a polynucleotide of the invention.
  • said seed of the family Cucurbitaceae does not come from the species Cucumis sativus.
  • Another subject of the invention relates to a plant, of the cucurbitaceae family, selected from the group comprising the genera Cucumis, Citrullus, Cucurbita, Luffa, Momordica and Lagenaria, excluding the species Cucumis sativus, and characterized in that what it is androic.
  • probes or primers allowing the detection of the polynucleotide according to the invention in a sample comprising cells of such a plant or extracts from them.
  • probe is intended to mean a nucleic acid sequence having a hybridization specificity under determined conditions for forming a hybridization complex with a target nucleic acid sequence and emitting a signal when hybridization of the probe to the target nucleic acid sequence.
  • the term "primer” is intended to mean a nucleic acid sequence which is capable of being a point of initiation of the synthesis of a nucleic acid sequence, along a strand of complementary nucleic acid, under conditions catalyzing said synthesis. Such conditions include the presence of the four nucleotide bases and a polymerization agent such as a DNA polymerase, in a buffer solution and at an appropriate temperature.
  • probes or primers advantageously correspond to polynucleotides of at least 15 nucleic acids, preferably at least 20 nucleic acids.
  • these probes or primers have a sequence identical to or complementary to a sequence encoding an ACS8 of a plant belonging to the family Cucurbitaceae.
  • sequences SEQ ID No. 4 and SEQ ID No. 7 of Cucumis sativus and SEQ ID No. 13 and SEQ ID No. 16 of Cucumis melo mention may be made of the sequences SEQ ID No. 4 and SEQ ID No. 7 of Cucumis sativus and SEQ ID No. 13 and SEQ ID No. 16 of Cucumis melo.
  • Another subject of the invention concerns a use, for the selection of androic plants of the Cucurbitaceae family, of antibodies allowing the detection of the polypeptide according to the invention in a sample comprising cells of such a plant or extracts of them.
  • antibody is intended to mean, in particular, polyclonal or monoclonal antibodies or fragments (for example the F (ab) ' 2 , F (ab)) fragments or recognizing the target polypeptide or polypeptide fragment. according to the invention.
  • BC1 backcross progeny 1
  • Example 2 Primary Location of the Region Containing the Androgen Gene
  • the purpose of this step is the identification of molecular markers that segregate specifically with androecia.
  • the idea is to group the DNA of the monoecious BC1 individuals and the DNA of the androic BC1 individuals. This technique is called BSA, Bulk Segregant Analysis, (Michelmore, RW et al.) Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: A rapid method to detect markers in specifies genomic regions by using segregating populations. Acad Sci USA 88: 9828-9832, 1991) or mixed segregation analysis.
  • Anchorage of AFLP markers was facilitated by the availability of the cucumber genome sequence.
  • the positioning of the AFLP markers enabled us to measure the physical distance between the two AFLP markers (Pst65xMse52 and Pst74xMsel7) surrounding the Androecy locus. This distance is 781kilobases (kb) and contains 62 genes.
  • the CsACS8 gene encodes an ACC synthase, the key enzyme in the ethylene biosynthetic pathway. From a genetic point of view, the physical distance between this CsACS8 gene and other AFLP markers (Figure 2) is consistent with the relationship between physical distance and genetic distance described for cucumber. In Cucurbitaceae such as cucumber and melon, ethylene has been described as the major determination of the floral sex type. In view of these different points, the CsACS8 gene is considered a very good candidate gene.
  • the CsACS8 gene can be the gene responsible for Androecia
  • the CsACS8 gene composed of 4 exons and 3 introns, encodes a protein of 441 amino acids.
  • the CsACS8 gene has a deletion of a base in the 3rd exon of the gene. This deletion changes the protein reading frame and causes the appearance of the STOP 20 amino acid codon after the deletion thus resulting in a protein of 151 amino acids (FIG. 3).
  • Example 5 Functional Validation of the CsACS8 Gene
  • TILLING EMS mutant
  • Example 6 Functional Validation of the CsACS8 Gene in Zucchini (Cucurbita oepo) In order to study whether the ACS8 gene also controls androecia in others
  • Cucurbitaceae as cucumber and melon, we study its role in sexual determinism in zucchini, a cucurbitaceae for which the existence of androecia in its natural state has never been postponed. To do this, we seek to identify the homologous sequence of the cucumber CsACS8 gene and CmACS8 of melon in the zucchini: CpACS8.
  • Example 8 Determination of the transformation activity of S-adenosyl methionine to aminocyclopropane carboxylate by I-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase 8 (ACS8)
  • ACS8 The enzymatic activity of ACS8 is measured in vitro by spectrophotometrically monitoring at 265 nm the formation of 5'-methylthioadenosine (MTA) following the introduction of S-adenosyl methionine, deaminase and various concentrations of PLP. (pyridoxal5'-phosphate).
  • MTA 5'-methylthioadenosine
  • Bacterial strains, plasmids and reaction products Bacterial strains, plasmids and reaction products:
  • the bacterial strain Escherichia coli BL21 (DE3) pLYSS is used for the expression of the enzyme.
  • the cloning vector used is the plasmid pET15b (NOVAGEN) which carries the T7 promoter and includes ampicillin resistance.
  • S-Adenosyl Methionine (SAM), Pyridoxal 5'phosphate (PLP) and 5'Adenylic Acid Deaminase from Aspergillus (deaminase) can be obtained from SIGMA. Expression of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate svnthase 8 (ACS8) in
  • the reference ACS8s derived from SEQ ID No. 3 and No. 12 or recombinant and from SEQ ID No. 6, No. 9, No. 15 and No. 18 were cloned into the vector Petl5b, which vector was used. to transform Escherichia coli BL21 (DE3) pLYSS bacteria according to the conditions provided by the manufacturer.
  • a Histidine tag associated with each of the ACS8 Due to the presence of a Histidine tag associated with each of the ACS8, they are purified using a nickel column (IMi-IDA 15 ml) previously equilibrated with TRIS to PH8 (50mM) and NaCl (500mM). . After passing the solution containing recombinant ACS8 to be purified, the column is then washed with TRIS to PH8 (50 mM) and NaCl (500 mM) supplemented with imidazole (10 mM) until no protein is more detectable at the output .
  • IMi-IDA 15 ml previously equilibrated with TRIS to PH8 (50mM) and NaCl (500mM).
  • the ACS8 are then eluted with the same buffer solution supplemented with 100mM imidazole and dialyzed (50mM KPhos at pH 8.5) before being concentrated (MILLIPORE AMICON ULTRA DEVICE, 5000MWC0).
  • the concentrated (20mg / ml) portion of ACS8 is aliquoted and stored with glycerol at -45 ° C. Purification of the protein is followed by capillary electrophoresis (EXPERION DEVICE - BIO RAD) with a PRO260 chip.
  • adenosine deaminase 5 g of lyophilized deaminase powder (SIGMA) are resuspended in a beaker with 90 ml of cold water to which 47 ml of acetone are added. The solution is stirred for 5 minutes at 4 ° C. and then centrifuged for 1 minute at 2000 g. The pellet is mixed with 33 ml of water, stirred for 5 minutes and centrifuged again for 5 minutes at 2000 g. The pellet is discarded and the supernatant is added with 10 ml of ethanol. The solution is stirred for 5 minutes at 4 ° C. and then centrifuged. The supernatant is supplemented with 20 ml of ethanol.
  • SIGMA lyophilized deaminase powder
  • the solution is gently stirred for 3 hours at 4 ° C.
  • the solution is centrifuged for 5 minutes at 7000 g and the pellet is resuspended with 6 ml of water.
  • the solution is dialyzed (sodium acetate solution, 5mM, pH5.3) for at least 24 hours and then concentrated (MILLIPORE AMICON ULTRA DEVICE, 5000MWC0) and finally aliquoted into glycerol (5mg / ml) in order to be stored at -45 ° C.
  • the enzymatic activity of the various ACS 8 is determined by following the formation of 5'-methylthioadenosine (MTA) at 265 nm in differential spectroscopy on a Uvikon 940 spectrophotometer (BIOTEK-KONTRON): the measurements are made during the incubation of S adenosyl methionine (60 ⁇ g) in 100mM of KPhos buffer (0.2ml, PH8.5) and deaminase (8 ⁇ g) in the presence or absence of pyridoxal5'-phosphate (0 to 300 ⁇ ). The measurements are made in the quartz cuvettes of the spectrophotometer for 3 minutes at 25 ° C. after the addition of purified enzyme (1 to 2 ⁇ g).
  • MTA 5'-methylthioadenosine
  • BIOTEK-KONTRON Uvikon 940 spectrophotometer
  • the conversion of MTA to inosine derivative is monitored at 265 nm. And the activity specific is expressed in nanomoles of MTA formed per minute and per mg of protein. More particularly, the activity of the sequences SEQ ID No. 6, No. 9 (Cucumis sativus), No. 15 and No. 18 (Cucumis melo) is expressed as a percentage of activity with respect to the sequences SEQ ID No. 3 ( Cucumis sativus) and SEQ ID NO: 12 (Cucumis melo). An identical protocol is used to determine the Vm and Km.
  • the inventors have studied the kinetics of appearance of the male flowers for the mutant S295F (10 homozygous plants and 10 plants heterozygous for the mutation) and for the mutant L45F (10 homozygous plants and 10 plants heterozygous for the mutation).
  • a plant is used as a control (10 plants):
  • the plants are transplanted into fields and then, every morning, they are examined in order to count the number of new male flowers:
  • the inventors have also studied the kinetics of the appearance of female flowers for the mutant S295F (10 plants homozygous for the mutation) and for the mutant L45F (10 homozygous plants and 10 plants heterozygous for the mutation).
  • a plant is used as a control (10 plants):
  • Example 10 Inheritability of the trait The inventors wished to study the transmission of the androic phenotype from one generation to another. However, by the nature of the plants, it is obviously impossible to fertilize an andro plant by itself or by another androic plant.
  • the inventors determined the biochemical characteristics of the different isoforms of the enzyme ACS8 in the presence of 5 or 100pm of PLP. It should be noted that the concentration of PLP present in the cell would be of the order of 5 ⁇ .
  • the mutant isoforms of cucumber both having a frame shift resulting in the expression of a protein of 151 (SEQ ID No. 6) or 57 amino acids (SEQ ID No. 9) instead of 440, do not show any enzymatic activity.

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Description

CUCURBITACEES ANDROÏQUES, PROCEDES D'OBTENTION ET UTILISATIONS DE
CES CUCURBITACEES
Cette demande de brevet revendique la priorité de la demande de brevet français n°12 00149 déposée le 16 janvier 2012, qui est incorporée ici par référence.
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de l'identification de plantes et en particulier à l'identification du type sexuel de plantes. Elle est relative à des plantes dont le type sexuel est modifié, à l'utilisation de telles plantes ainsi qu'à des procédés d'obtention et de détection desdites plantes.
ART ANTERIEUR
La création de plantes hybrides est d'un grand intérêt en agronomie et en agriculture. En effet, les plantes hybrides, grâce au phénomène d'hétérosis, appelé également vigueur hybride, présentent généralement une supériorité pour de nombreux caractères, par rapport à la moyenne de leurs deux parents. Cette supériorité peut s'illustrer par exemple par une meilleure vigueur, un meilleur rendement, une plus grande adaptation au milieu dans lequel l'hybride est cultivé et une grande uniformité des hybrides par rapport à leurs parents. Cette vigueur hybride est d'autant plus importante que les parents sont éloignés génétiquement.
La création de lignées stables, futurs parents de l'hybride, est un passage obligé pour la création de variétés hybrides homogènes et reproductibles exprimant le plus d'hétérosis. Il est donc nécessaire de créer des lignées présentant le matériel génétique le plus homozygote possible, dites « lignées pures », produites par autofécondation par exemple, et se combinant de la meilleure manière, puis de croiser deux individus de ces lignées pour obtenir un hybride. Lors du croisement de ces lignées entre elles, il est indispensable de pouvoir choisir le sens du croisement effectué et d'éviter l'autopollinisation des plantes qui conduirait à des plantes ne présentant pas la vigueur hybride recherchée. La création d'hybrides nécessite donc d'obtenir des plantes non capables d'autopollinisation, c'est-à-dire présentant soit uniquement des fleurs femelles, soit uniquement des fleurs mâles.
Les plantes ne présentant que des fleurs femelles sont appelées gynoïques. Les plantes ne présentant que des fleurs mâles sont appelées androïques. L'androécie est un caractère agronomique très recherché, notamment en ce que des fleurs uniquement mâles produisent plus de pollen.
Par ailleurs, les plantes présentant des fleurs mâles et des fleurs femelles séparées mais sur un même pied sont appelées monoïques, les plantes présentant des fleurs bisexuées sont appelées hermaphrodites et les plantes présentant des fleurs bisexuées et mâles sur un même pied sont appelées andromonoïques. Dans le cas où des plants présentent le type sexuel floral monoïque, andromonoïque ou hermaphrodite, il est nécessaire, par exemple, dans le cadre d'un programme d'amélioration de plantes, voire dans le cas d'une production, notamment de plante hybrides, de séparer les fleurs mâles des fleurs femelles d'un même plant ou d'émasculer manuellement ou chimiquement les plants hermaphrodites pour éviter l'autopollinisation.
Une première technique, mise en œuvre notamment pour le maïs, consiste à utiliser des moyens mécaniques pour réaliser une émasculation des plantes. Cependant, cette technique s'avère extrêmement coûteuse puisqu'elle nécessite l'émasculation de chaque plante dont on veut éviter l'autopollinisation, pour chaque croisement effectué.
Une autre technique consiste à réaliser une émasculation chimique des plantes, bloquant la formation de pollen viable. Ainsi, chez le melon (Cucumis melo), le traitement de plantes monoïques par de l'éthrel (précurseur de l'éthylène) entraîne la disparition temporaire des fleurs mâles. De tels agents chimiques, utilisés pour provoquer une stérilité mâle transitoire, présentent plusieurs inconvénients, comme un coût élevé ou une grande toxicité.
Les techniques mécaniques ou chimiques de contrôle du type floral décrites ci- dessus s'avèrent donc très coûteuses et imparfaites, d'autant que de très nombreux croisements sont nécessaires pour obtenir des plantes hybrides présentant des caractères recherchés et donc un intérêt à être produites et commercialisées.
Pour faciliter la création d'hybrides, il existe donc un besoin pour un système qui permettrait de contrôler le développement du type floral d'une plante de la famille des Cucurbitacées et d'obtenir une plante d'un type floral déterminé. La famille des cucurbitacées comporte plus de 800 espèces végétales réparties en 120 genres dans les régions tropicales et subtropicales. Cette famille de plantes inclut plusieurs espèces d'intérêt agronomique majeures et qui sont cultivées dans les régions tempérées telles que le concombre (Cucumis sativus), le melon (Cucumis melo), la pastèque (Citrullus lanatus), la courgette et la courge (Cucurbita spp, cucurbita pepo) ou encore le potiron (Cucurbita maxima) et le potimarron (Cucurbita moschata). Parmi les autres espèces d'intérêt agronomique présentes surtout dans les régions tropicales et sub-tropicales, il y a la luffa (Luffa acutangula), la margose (Momordica charentia) ou encore la gourde (Lagenaria siceraria).
Une autre voie pour obtenir des plants non capables d'autopollinisation pour la création d'hybrides pourrait consister en une sélection d'individus exclusivement femelles ou exclusivement mâles, s'ils existent dans la ou les espèce(s) d'intérêt. Cependant, une telle technique s'avérerait extrêmement coûteuse elle aussi puisqu'elle nécessiterait la culture d'un nombre très important de plantes, jusqu'au moment où il est possible de déterminer le type sexuel. La sélection d'individus exclusivement mâles notamment présente un intérêt en ce qu'elle permet de ne produire que du pollen et en grande quantité. Le pollen ainsi produit peut être utilisé pour la pollinisation de plantes aux fleurs femelles. De plus, chez certains membres de la famille des Cucurbitacées, de telles plantes n'existent pas, comme par exemple pour certaines des plantes des genres Cucumis, Cucurbita, Citrullus, Luffa, Lagenaria et Momordica. En particulier, des plantes de melon (Cucumis melo, notamment spmelo, sspmelo), de courgette et de citrouille (Cucurbita pepo), de pastèque (Citrullus lanatus) ou encore de luffa (Luffa acutangula), de margose (Momordica charentia), de gourde (Lagenaria siceraria), de potiron (Cucurbita maxima) ou de potimarron (Cucurbita moschata) androïques n'ont jamais été identifiées.
Il existe donc un besoin pour un procédé qui permettrait de créer des plantes androïques de la famille des Cucurbitacées n'existant pas à l'état naturel. Ce procédé devrait permettre d'identifier les plantes androïques sans avoir à attendre la floraison desdites plantes. En outre, ce procédé devrait permettre d'identifier des plantes particulièrement utiles, pour la réalisation d'hybrides notamment, comme cela a été précisé ci-dessus.
SOMMAIRE DE L'INVENTION
Dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont identifié et caractérisé pour la première fois le gène responsable du phénotype sexuel androïque chez le concombre (Cucumis sativus), espèce pour laquelle l'androécie se retrouve à l'état naturel. Le gène identifié code pour la 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase8 (ACS8), notée par la suite Cucumis sativus ACS8, CsACS8.
Par la suite, les inventeurs ont identifié la mutation dans le gène CsACS8 responsable de l'androécie chez le concombre.
Chez le melon, l'androécie n'existe pas à l'état naturel. Les inventeurs ont induit des mutations dans le gène orthologue de CsACS8 chez le melon et ont ainsi créé des plants de melon androïques.
Les cucurbitacées ont servi de modèle pour l'étude du dimorphisme sexuel pendant des décennies. Chez le concombre (Cucumis sativus ..), une plante monoïque, le déterminisme sexuel est génétiquement contrôlé par trois loci, F(Female), A (Androecious) et M (Monoecious). Le locus semi-dominant F (Female) contrôle le degré de féminité. L'allèle F entraine la précocité d'apparition de la phase femelle et par conséquent les plantes FF sont gynoïques (totalement femelles). Le locus Androecious (a) accroît la masculinité et les plantes de génotype aaff sont androïques (totalement maies). Le locus M (Monoecious) est requis pour l'avortement sélectif des organes reproducteurs mâles dans les bourgeons floraux déterminés à développer un carpelle. La combinaison des allèles M-ff permet le développement de plantes monoïques, type sexuel le plus répandue chez les cucurbitacées, partant des fleurs maies et femelles. Les plantes gynoïques, hermaphrodites et andromonoïques (fleurs maies et hermaphrodites) présentent, respectivement, les génotypes M-F-, mmF- et M ff. A l'aide d'une approche gène candidat, il a été montré qu'une ACC synthase, CsACSl, co-ségrégait avec le locus F (Trebitsh et al., 1997) et que les plantes monoïques possèdent une seule copie de ce gène tandis que les plantes gynoïques possèdent une copie supplémentaire, le gène CsACSIG. Grâce à une combinaison d'approche gène candidat, clonage positionnel et génétique d'association, Boualem et al., (2009) et Li et al., (2009) ont démontré que le locus M correspondait à l'ACC synthase CsACS2 et que la perte de d'activité de cette enzyme entraînait la transition de la monœcie à l'andromonoécie.
Chez le melon, une autre cucurbitacée modèle, le déterminisme sexuel est contrôlé par deux loci, le locus A (andromonoecious) et le locus G (gynoecious). Les melons de génotype A-G- sont de type monoïques (fleurs maies et femelles) tandis que les plantes andromonoïques (fleurs maies et hermaphrodites) portent les allèles aaG-. Les plantes gynoïques (fleurs uniquement femelles) sont AAgg et les hermaphrodites (fleurs uniquement hermaphrodites) sont de génotype aagg. Contrairement au concombre, chez le melon, il n'a jamais été décrit de plante androïque ne portant que des fleurs maies. La nature du locus A, responsable de la transition du type sexuel monoïque vers andromonoïque, a récemment été révélée par les travaux de Boualem et al, 2008. Ces travaux ont démontré que le gène A codait pour une ACC synthase, CmACS-7, et que la perte de fonction de cette enzyme était la cause de l'apparition de l'andromonoécie. Ces résultats ont fait l'objet du brevet WO/2007/125264. L'allèle récessif g, en combinaison avec l'allèle A, entraine le développement de fleurs unisexuées femelles, ou de fleurs hermaphrodites, lorsqu'il est combiné à l'allèle a. Récemment, les travaux de Martin et al., 2009 ont mis en évidence que l'allèle g était dû à l'insertion d'un transposon de type hAT à proximité du facteur de transcription à doigt de zinc C2H2, nommé CmWIPl. L'insertion de cet élément transposable inhibe, via des mécanismes épigénétiques, l'expression du facteur de transcription CmWIPl. L'identification de mutations induites à l'EMS dans ce facteur de transcription, mutations qui convertissent des plantes monoïques en plantes gynoïques, confirme que le gène G est CmWIPl. Ces travaux ont fait l'objet du brevet WO/2010/012948. D'après les résultats décrits ci-dessus, les mécanismes de détermination sexuelle chez le concombre et le melon présentent plusieurs différences.
Premièrement, chez le concombre les différents types sexuels sont déterminés par les combinaisons alléliques des 3 gènes F, M et A, tandis que chez le melon les différents types sexuels sont contrôlés par seulement 2 gènes, A et G. Pour information, le gène A, CmACS-7, du melon est l'orthologue du gène M, CsACS2, du concombre.
Deuxièmement, le caractère gynoïque est contrôlé, chez le concombre, par le gène F, une ACC synthase, alors que chez le melon, ce caractère est contrôlé par CmWIPl, un facteur de transcription à doigt de zinc de type C2H2. Troisièmement, l'androécie décrite chez le concombre est contrôle par le gène
A du concombre (différent du gène A du melon) tandis que chez le melon, ce type sexuel n'a jamais été décrit ou rapporté comme existant dans des populations de melon.
Les inventeurs ont donc identifié, pour la première fois, chez les plantes appartenant à la famille des Cucurbitacées, un gène responsable de l'androécie.
Ledit gène est caractérisé par un allèle dominant non muté induisant la synthèse de la protéine 1-aminocyclopropane-l-carboxylique synthase (ACS8 active, enzyme limitante de la voie de la biosynthèse de l'éthylène), et par un allèle récessif muté induisant la synthèse d'une protéine ACS8 inactive ou ayant une activité enzymatique réduite.
Les Cucurbitacées selon la présente invention présentant deux allèles récessifs pour le gène de l'androécie ACS8 sont androïques. Les inventeurs ont en outre démontré que deux allèles récessifs présentant tous deux une activité enzymatique réduite d'au moins 50% par rapport à une ACS8 sauvage était suffisante pour entraîner ce phénotype androïque.
De telles plantes androïques, ne présentant donc que des fleurs mâles peuvent être utilisées pour la création d'hybrides ainsi que pour l'amélioration des espèces de Cucurbitacées.
Les Cucurbitacées selon la présente invention présentant un allèle ACS8 récessif muté présentent un intérêt en ce qu'elles peuvent être à tendance androïque, c'est-à-dire avoir plus de fleurs mâles que la plante sauvage.
Les plantes selon la présente invention, qu'elles soient androïques ou à tendance androïques peuvent être utilisées comme pollinisateur.
Un premier objet de l'invention concerne une plante, de la famille des Cucurbitacées, laquelle plante est : sélectionnée dans le groupe comprenant les genres Cucumis, Citrullus, Cucurbita, Luffa, Momordica et Lagenaria, à l'exclusion de l'espèce Cucumis sativus ; et
caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un allèle de ΙΊ- aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 (ACS8) non codant ou codant pour un polypeptide correspondant à un variant de l'ACS8 de référence pour ladite plante, laquelle 1-aminocyclopropane-l- carboxylate synthase 8 de référence présente une activité de transformation de ia S-adénosyl méthionine en aminocyclopropane carboxylate et lequel variant présente une activité inférieure d'au moins 50% de préférence d'au moins 75% ou 90%, de manière encore préférée d'au moins 95% ou 99% par rapport à ladite 1- aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 de référence et de manière particulièrement préférée, ledit variant présente une activité nulle.
Un autre objet de l'invention concerne une plante, selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle est homozygote pour l'allèle de l'l-aminocyclopropane-1- carboxylate synthase 8 (ACS8) non codant ou codant pour un variant de l'ACS8 de référence et androïque.
Un autre objet de l'invention concerne une graine dont la germination conduit à une plante telle que définie selon l'invention.
Un autre objet de l'invention concerne une utilisation d'une plante selon l'invention en tant que pollinisateur.
Un autre objet de l'invention concerne un polypeptide isolé correspondant à un variant d'une 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 (ACS8) de référence, de plante de la famille des Cucurbitacées, laquelle 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 présente une activité de transformation de la S-adénosyl méthionine en aminocyclopropane carboxylate et lequel variant présente une activité inférieure d'au moins 50%, de préférence d'au moins 75% ou 90%, de manière encore préférée d'au moins 95% ou 99% par rapport à ladite 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 de référence et de manière particulièrement préférée, ledit variant présente une activité nulle.
Un autre objet de l'invention concerne un polynucléotide codant pour le polypeptide selon l'invention.
Un autre objet de l'invention concerne une cellule issue d'une plante telle que définie dans la présente invention.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de production d'une plante androïque de la famille des cucurbitacées, ledit procédé comprenant les étapes de : a) Obtention d'une plante de la famille des cucurbitacées, préférentiellement sélectionnée dans le groupe comprenant les genres Cucumis, Citrullus, Cucurbita, Luffa, Momordica et Lagenaria,
b) Inhibition de la 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 (ACS8) de ladite plante.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de production d'une plante androïque ou à tendance androïque de la famille des Cucurbitacées, ledit procédé comprenant les étapes de :
a) Obtention d'une plante de la famille des Cucurbitacées, laquelle plante est sélectionnée dans le groupe comprenant les genres Cucumis, Citrullus, Cucurbita, Luffa, Momordica et Lagenaria,
b) Mise en évidence de la présence d'au moins un allèle de ΙΊ- aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 (ACS8) non codant ou codant pour un polypeptide correspondant à un variant de l'ACS8 de référence pour ladite plante, c) Etude de l'activité de transformation de la S-adénosyl méthionine en aminocyclopropane carboxylate de ΙΊ- aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 codée par ledit allèle,
d) Sélection d'une plante présentant une activité de transformation de la S-adénosyl méthionine en aminocyclopropane carboxylate et lequel variant présente une activité inférieure d'au moins 50% de préférence d'au moins 75% ou 90%, de manière encore préférée d'au moins 95% ou 99% par rapport à ladite 1-aminocyclopropane-l- carboxylate synthase 8 de référence et de manière particulièrement préférée, ledit variant présente une activité nulle. Un autre objet de l'invention concerne par ailleurs un procédé de propagation d'une plante homozygote androïque de l'invention, comprenant les étapes de : a) Traitement de plantes androïques homozygotes pour l'allèle muté ACS8 de l'invention, avec un composé permettant d'induire une augmentation de la concentration intracellulaire en éthylène, pour générer des fleurs femelles, b) Autopollinisation des plants obtenues à l'étape a), et c) Récolte des graines.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé d'identification d'une plante possédant une séquence d'acide nucléique codant pour le polypeptide selon l'invention et comprenant les étapes de : a) Analyse d'un échantillon comprenant des cellules d'une plante de la famille des Cucurbitacées ou des extraits de celle-ci de sorte à identifier si ladite plante comprend une séquence d'acide nucléique codant pour le polypeptide selon l'invention ; et
b) Identification d'une plante comprenant une telle séquence d'acide nucléique.
Maintenant, un autre objet de l'invention concerne également un procédé de sélection d'une plante androïque, ledit procédé comprenant les étapes de: a) analyse d'un échantillon comprenant des cellules d'une plante de la famille des Cucurbitacées ou des extraits de celle-ci de sorte à identifier si ladite plante comprend une séquence d'acide nucléique codant pour le polypeptide selon l'invention,
b) identification d'une plante comprenant une telle séquence d'acide nucléique, c) croisement de plantes présentant une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention identifiées à l'étape b), et
d) sélection d'une plante homozygote pour ladite séquence d'acide nucléique.
L'invention concerne aussi un procédé de sélection d'une plante présentant au moins deux caractères d'intérêt, ledit procédé comprenant les étapes de :
a) analyse d'un échantillon comprenant des cellules d'une plante de la famille des Cucurbitacées présentant un premier caractère d'intérêt ou des extraits de celle-ci de sorte à identifier si ladite plante comprend une séquence d'acide nucléique codant pour le polypeptide selon l'invention, et
b) identification d'une plante comprenant une telle séquence d'acide nucléique et présentant toujours ledit premier caractère d'intérêt,
c) croisement de plantes présentant une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention et présentant toujours ledit premier caractère d'intérêt identifiées à l'étape b),
d) sélection d'une plante et présentant toujours ledit premier caractère d'intérêt et homozygote pour ladite séquence d'acide nucléique,
e) croisement d'une plante présentant au moins un premier caractère d'intérêt obtenue à l'étape d) avec une plante de la famille des Cucurbitacées présentant au moins un second caractère d'intérêt ; et
f) sélection d'une plante présentant lesdits au moins premier et second caractères d'intérêts. Un autre objet de l'invention concerne également un procédé de production d'une graine de plante, préférentiellement hybride, diploïde ou triploïde, comprenant les étapes de : a. planter un champ alternativement avec les plantes androïques et/ou à tendance androïque de l'invention comprenant un premier caractère d'intérêt et des plantes gynoïques et/ou mâles stériles telles que définies dans la présente invention comprenant un deuxième caractère d'intérêt,
b. récolter les fruits des plantes obtenus après pollinisation, et c. extraire les graines desdits fruits.
Un autre objet de l'invention concerne une graine, préférentiellement hybride, de plante obtenue par l'un quelconque des procédés de l'invention. De préférence, la germination de cette graine conduit à une plante présentant lesdits au moins premier et second caractères d'intérêts décrits précédemment. Un autre objet de l'invention concerne une plante, de la famille des cucurbitacées, sélectionnée dans le groupe comprenant les genres Cucumis, Citrullus, Cucurbita, Luffa, Momordica et Lagenaria, à l'exclusion de l'espèce Cucumis sativus, et caractérisée en ce qu'elle est androïque.
Un autre objet de l'invention concerne une utilisation, pour l'identification de plantes androïques de la famille des Cucurbitacées, de sondes ou d'amorces permettant la détection du polynucléotide selon l'invention dans un échantillon comprenant des cellules d'une telle plante ou des extraits de celles-ci.
Un dernier objet de l'invention concerne une utilisation, pour l'identification de plantes androïques de la famille des Cucurbitacées, d'anticorps permettant la détection du polypeptide selon l'invention dans un échantillon comprenant des cellules d'une telle plante ou des extraits de celles-ci. DESCRIPTION DES DESSINS
La Figure 1 représente le schéma des croisements réalisés pour obtenir la population de concombre {Cucumis sativus) androïques utilisés pour déterminer le gène responsable de l'androécie.
La Figure 2 représente la carte génétique du locus de l'androécie chez le concombre réalisée à partir d'une population de 230 individus.
La Figure 3 représente la structure génique des deux allèles du gène de l'androécie chez le concombre, à savoir l'allèle dominant dont la séquence d'acide nucléique code pour une séquence polypeptidique d'ACS8 sauvage et l'allèle récessif muté dont la séquence d'acide nucléique code pour une séquence polypeptidique d'ACS8 tronquée.
La Figure 4 représente la cinétique d'apparition des fleurs maies, en lien avec les expérimentations réalisées à l'exemple 9.
La Figure 5 représente la cinétique d'apparition des fleurs femelles, en lien avec les expérimentations réalisées à l'exemple 9.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Un premier objet de l'invention concerne une plante, de la famille des Cucurbitacées, laquelle plante est : sélectionnée dans le groupe comprenant les genres Cucumis, Citrullus, Cucurbita, Luffa, Momordica et Lagenaria, à l'exclusion de l'espèce Cucumis sativus ; et
caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un allèle de ΙΊ- aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 (ACS8) non codant ou codant pour un polypeptide correspondant à un variant de l'ACS8 de référence pour ladite plante, laquelle 1-aminocyclopropane-l- carboxylate synthase 8 de référence présente une activité de transformation de la S-adénosyl méthionine en aminocyclopropane carboxylate et lequel variant présente une activité inférieure d'au moins 50% de préférence d'au moins 75% ou 90%, de manière encore préférée d'au moins 95% ou 99% par rapport à ladite 1- aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 de référence et de manière particulièrement préférée, ledit variant présente une activité nulle.
Avantageusement, ladite activité de transformation de la S-adénosyl méthionine en aminocyclopropane carboxylate correspond à une Vmax inférieure ou égale à 400 nmol.min^.mg"1, de préférence inférieure ou égale à 300 et de manière particulièrement préférée inférieure ou égale à 275 nmol.min^.mg^ en présence d'une concentration de 5 μΜ de pyridoxal5'-phosphate (PLP).
Un autre objet de l'invention concerne une plante, selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle est homozygote pour l'allèle de l'I-aminocyclopropane-l- carboxylate synthase 8 (ACS8) non codant ou codant pour un variant de l'ACS8 de référence et androïque.
Par « plante », on entend une plante dans son ensemble mais aussi un fragment ou une partie de plante isolé(e) tel qu'une racine issue de ladite plante, une feuille, une tige, une fleur, un fruit, etc.
Par "plantes de la famille des Cucurbitacées", on entend, au sens de la présente invention, les plantes dicotylédones de la famille des Cucurbitacées et comprenant notamment les genres Cucumis, Cucurbita, Citrullus, Lagenaria, Luffa, Momordica, Cyclanthera, Echinocystis, Thladiantha, Bryona, Trichosanthes, Melothria, Ibervillea, Ecballium, Sechium, Benincasa, Sicyos, Coccinia.
De manière préférée, ladite plante est choisie dans le groupe consistant en les genres Cucumis, Citrullus, Cucurbita, Luffa, Lagenaria et Momordica.
De manière encore préférée, ladite plante est choisie dans le groupe consistant en les espèces Cucumis melo, Citrullus lanatus, Cucurbita pepo, Luffa acutangula, Lagenaria siceraria, Momordica charentia, Cucurbita maxima et Cucurbita moschata Les Cucurbitacées Cucumis melo, Citrullus lanatus, Cucurbita pepo, Luffa acutangula, Lagenaria siceraria, Momordica charentia, Cucurbita maxima et Cucurbita moschata avec le phénotype androïque n'ont jamais été identifiées à l'état sauvage. Les seuls phénotypes qui ont été identifiés sont, pour Cucumis melo, les phénotypes andromonoïque, gynoïque, monoïque et hermaphrodite; pour Citrullus lanatus, les phénotypes andromonoïque et monoïque pour Cucurbita pepo, le phénotype monoïque, pour Luffa acutangula, les phénotypes monoïque, andromonoïque, gynoïque et hermaphrodite ; pour Lagenaria siceraria, les phénotypes monoïque et andromonoïque et pour Momordica charentia, les phénotypes monoïque et gynoïque. Chez Cucumis sativus, les phénotypes présents sont les phénotypes monoïque, andromonoïque, androïque, gynoïque et hermaphrodite. Chez Cucurbita maxima et Cucurbita moschata, le phénotype présent est le phénotype monoïque.
Une telle plante est susceptible d'être obtenue par le procédé de sélection d'une plante androïque décrit par la suite. Les termes "polypeptide" ou "protéine", au sens de la présente invention, font référence à toute chaîne d'acides aminés, quelque soit leur longueur ou leurs éventuelles modifications post-traductionnelles (telles que la glycosylation, la phosphorylation, l'alkylation, etc).
La séquence polypeptidique aminocyclopropane carboxylate synthase 8 (ACS8) au sens de la présente invention fait référence à l'enzyme aminocyclopropane carboxylate synthase 8 transformant la S-adénosyl méthionine en aminocyclopropane carboxylate.
Cette enzyme ACS8 est également connue sous d'autres dénominations, à savoir 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8, 1-amino-cyclopropane-l- carboxylate synthase 8, ACC synthase 8, S-adenosyl-L-methionine methylthioadenosine-lyase 8 ou encore ACS8.
Par allèle "sauvage", on entend, au sens de la présente invention, tout allèle naturel codant pour une protéine qui présente une activité enzymatique semblable ou identique à celle de l'ACS8 de référence. Les allèles sauvages au sens de la présente invention correspondent aux séquences génomiques SEQ ID N°l, SEQ ID N°10, SEQ ID N°19, SEQ ID N°22, SEQ ID N°25, SEQ ID N°28, SEQ ID N°31, SEQ ID N°34 et aux séquences codantes SEQ ID N°2, SEQ ID N°ll, SEQ ID N°20, SEQ ID N°23, SEQ ID N°26, SEQ ID N°29, SEQ ID N°32 et SEQ ID N°35. Par "séquence de référence" au sens de la présente invention, on entend pour une espèce déterminée de plante de la famille des Cucurbitacées, la protéine 1-aminocyclopropane-l-carboxylique synthase 8 codée par un allèle sauvage qui présente 100% d'activité de l'ACS8. Cette séquence de référence est caractérisée en ce qu'elle est codée par une séquence d'acide nucléique correspondant à un allèle dominant présent dans les plantes monoïques, andromonoïques, gynoïques et hermaphrodites.
A titre d'exemple, des séquences ACS8 de référence pour les espèces Cucumis sativus, Cucumis melo, Citrullus lanatus, Luffa acutangula, Lagenaria siceraria, Momordica charentia et Cucurbita pepo correspondent aux séquences SEQ ID N°3, SEQ ID N°12, SEQ ID N°21, SEQ ID N°24, SEQ ID N°27, SEQ ID N°30, SEQ ID N°33 et SEQ ID N°36 respectivement. Par "variant" d'une séquence polypeptidique selon l'invention, on entend une séquence polypeptidique qui diffère de la séquence polypeptidique de référence par au moins une mutation ponctuelle ou qui correspond à un fragment de celle-ci.
Par "fragment" d'une séquence polypeptidique de référence, on entend une séquence polypeptidique d'une longueur réduite par rapport à la séquence polypeptidique de préférence, de préférence d'une longueur inférieure d'au moins 10%, à titre d'exemple d'au moins 25 ou 33%, et de manière particulièrement préférée d'au moins 50%.
Un variant d'une séquence polypeptidique selon l'invention peut être d'origine naturelle, tel qu'un variant issu d'une variation allélique préexistant à l'état sauvage. Un tel variant peut être également une séquence polypeptidique non préexistante naturellement et obtenue, par exemple, par des techniques de mutagenèse. De préférence, un te! variant est obtenu à l'issue d'une étape de utagénèse. L'activité de l'enzyme ACS8 peut être déterminée simplement par l'homme du métier au regard de ses connaissances générales. A titre d'exemple, cette activité pourra être déterminée par la méthode incorporée ici par référence décrite dans BOUALEM et al. (2008, Science, Vol. 321 : p.836-838, A conservée! mutation in an ethylene biosynthesis enzyme leads to andromonoecy in melons)
A titre d'exemple de tels variants, on peut citer les variants présentant les séquences SEQ ID n° 6 et SEQ ID N°9 de Cucumis sativus, les variants présentant les séquences SEQ ID n" 15 et SEQ ID N°18 de Cucumis melo.
Par "plante androïque", on entend, au sens de la présente invention, une plante portant uniquement des fleurs mâles. Lesdites fleurs mâles (staminées) présentent uniquement les organes reproducteurs mâles et ne produisent donc que du pollen contrairement aux fleurs femelles (pistillées) produisant uniquement des ovocytes qui deviendront des graines s'ils sont fécondés. Le fait, pour une plante, d'être androïque s'appelle l'androécie. Par "plante à tendance androïque", on entend, au sens de la présente invention, une plante hétérozygote pour l'allèle muté selon l'invention, portant plus de fleurs mâles que la même plante sauvage monoïque ou andromonoïque, n'ayant pas l'allèle muté selon l'invention.
Selon un mode de réalisation préféré, la plante selon l'invention présente, en outre, au moins un premier caractère d'intérêt tel qu'un rendement plus élevé, une moindre consommation d'eau ou encore une floraison plus précoce.
Par "caractère d'intérêt" on entend, au sens de la présente invention, un caractère exprimé par une plante et qui lui confère des propriétés spécifiques par rapport aux autres plantes qui n'expriment pas ce caractère. Préférentiellement, pour les besoins de la présente invention, un caractère d'intérêt est un caractère d'intérêt agronomique qui peut être qualitatif ou quantitatif.
Les caractères d'intérêt au sens de la présente invention peuvent être par exemple des fruits plus gros et/ou plus nombreux, un rendement plus élevé, une moindre consommation d'eau, une floraison plus précoce, une résistance à certains pathogènes, qu'ils soient de nature virale, bactérienne ou fongique ou encore une résistance à un stress hydrique.
A titre d'exemples de caractères d'intérêt, on peut citer en tant qu'allèles impliqués dans la résistance à certains pathogènes, qu'ils soient de nature virale, bactérienne ou fongique, l'allèle Vat, qui confère la résistance au puceron Aphis gossypii, l'allèle P -W, qui confère la résistance à l'oïdium Podosphaera xanthi, l'allèle récessif nsv, qui correspond à une mutation unique dans le facteur d'initiation de la traduction elF4E, l'allèle Cys qui confère une résistance au cucurbit yellow stuning virus , les allèles Foml, Fom 2 et Fom 1.2 qui confèrent la résistance à fusarium oxysporum, ou encore les allèles gf, Or, et wf qui participent respectivement à la couleur de la chair du melon, vert, orange et blanc, tels que cités dans la publication Cucurbit Genetics Coopérative Report 28-29: 142-163 (2005-2006).
Les notions de "résistance", "immunité" et "sensibilité" sont définies par l'ISF (International Seed Fédération). Ainsi, par "Résistance", on entend la capacité d'une plante ou d'une variété à restreindre la croissance et le développement d'un pathogène ou d'un ravageur déterminé et/ou les dommages qu'ils occasionnent, en comparaison avec des variétés sensibles et dans des conditions similaires, environnementales et de pression de ce pathogène ou de ce ravageur. Les plantes ou variétés résistantes peuvent exprimer quelques symptômes de la maladie ou quelques dommages en cas de forte pression du pathogène ou du ravageur.
L'ISF distingue deux niveaux de résistance, à savoir la résistance standard ou haute (HR*) et la résistance intermédiaire ou modérée (IR*).
Par "résistance standard ou haute (HR*)", on entend la capacité d'une plante ou d'une variété à restreindre fortement la croissance et le développement d'un pathogène ou d'un ravageur déterminé dans des conditions de pression normales de ceux-ci, en comparaison avec des variétés sensibles. Ces plantes ou variétés peuvent, cependant, exprimer des symptômes ou des dommages en cas de forte pression de ce pathogène ou de ce ravageur. Par "résistance intermédiaire ou modérée (IR*)" ou encore par "résistance partielle", on entend la capacité d'une plante ou d'une variété à restreindre la croissance et le développement d'un pathogène ou d'un ravageur déterminé mais pouvant exprimer plus de symptômes ou de dommages en comparaison avec des variétés de résistance haute/standard. Les plantes ou variétés de résistance intermédiaire montreront des symptômes ou des dommages moins sévères que ceux observés sur des variétés sensibles, en conditions similaires, environnementales et/ou de pression du pathogène ou du ravageur.
Par "Immunité", on entend le fait de ne pas être sujet à l'attaque ou à l'infection par un ravageur ou un pathogène donné.
Par "Sensibilité", on entend l'incapacité d'une plante ou d'une variété à restreindre la croissance et le développement d'un pathogène ou d'un ravageur déterminé.
Selon un mode de réalisation préféré, la plante selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle est obtenue par des techniques de génie génétique.
Par "génie génétique", on entend, au sens de la présente invention, l'ensemble des techniques de manipulation du génome d'un être vivant afin de modifier son génotype et par conséquent son phénotype.
De manière préférée, la plante androïque selon l'invention est caractérisée en ce que la méthode d'obtention de ladite plante est une mutagénèse induisant une ou plusieurs mutations dans la séquence nucléotidique de l'allèle sauvage, entraînant une diminution de l'activité de transformation de la S-adénosyl méthionine en aminocyclopropane carboxylate, cette diminution d'activité étant inférieure d'au moins 50% de préférence d'au moins 75% ou 90%, de manière encore préférée d'au moins 95% ou 99% par rapport à la 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 sauvage et de manière particulièrement préférée, l'activité devenant nulle. Un autre objet de l'invention concerne une graine dont la germination conduit à une plante selon l'invention.
Par "graine", on entend, au sens de la présente invention, un organe, obtenu par le développement et la maturation de l'ovule après fécondation, ledit organe renferme l'embryon et des réserves nutritives nécessaires pour son développement lors de la germination.
Par "germination", on entend, au sens de la présente invention, le phénomène de passage de l'embryon de la graine mûre d'un état de vie ralentie à un état de croissance active, en utilisant les réserves contenues dans la graine, jusqu'à ce que la plantule obtenue soit autotrophe.
L'homme du métier sera à même, au regard de ses connaissances générales, de déterminer les conditions optimales pour la germination desdites graines et la culture des plantules obtenues.
Un autre objet de l'invention concerne une utilisation d'une plante selon l'invention en tant que pollinisateur.
Le terme "pollinisateur(s)", au sens de la présente invention, fait référence à une plante utilisée comme donneur de pollen, lequel pollen est utilisé pour polliniser des fleurs femelles. Le terme "pollinisateur" au sens de la présente invention est synonyme du terme "plante pollinisatrice". L'utilisation en tant que pollinisateur de la plante homozygote pour l'allèle muté tel que défini dans la présente invention et donc androïque permet la production de graines et plantes hybrides ou encore triploïdes. En outre, l'absence d'organes reproducteurs femelles facilite les expérimentations pour la sélection et l'amélioration des plantes. L'utilisation des plantes hétérozygotes pour l'allèle muté tel que défini dans la présente invention, lesquelles plante étant à tendance androïque permet la production de graines et plantes hybrides ou encore triploïdes. En outre, les plantes androïques produisant plus de fleurs mâles pendant une période plus longue, et ces fleurs mâles produisant plus de pollen, l'utilisation de plantes androïques permet d'atténuer les effets de la désynchronisation des floraisons mâles et femelles. Par ailleurs, l'allèle muté selon l'invention peut être utilisé en association avec des gènes régissant l'architecture de la plante et notamment le positionnement des fleurs dans le but d'optimiser leur disposition sur la plante et donc la dispersion et du pollen et la qualité de la pollinisation.
Enfin, l'utilisation de plantes selon l'invention permet d'augmenter le rendement des fruits produits sur une parcelle de production. En effet, les plantes selon l'invention produisant plus de pollen que des plantes polinisatrices habituelles, le producteur pourra diminuer le nombre de plantes maies polinisatrices, augmenter le nombre de plantes femelles et donc augmenter le nombre de fruits récoltés sur la parcelle de production. De manière préférée, l'utilisation d'une plante, telle que définie dans la présente invention, en tant que pollinisateur vise à l'obtention de graines de plantes hybrides et de plantes hybrides, de graines de plante triploïdes et des plantes produisant des fruits sans graines qui en sont issues, par exemple dans la production de pastèques triploïdes. Dans ce dernier cas, les plantes polinisatrices selon l'invention peuvent être utilisées par exemple pour polliniser des plantes de pastèques tétraploïdes, produisant ainsi des graines triploïdes. Ces graines triploïdes seront plantées pour donner des plantes triploïdes, dont les fleurs devront être pollinisées, par exemple par des plantes polinisatrices selon l'invention, afin de produire des fruits sans pépins, appréciés des consommateurs.
Par "hybrides", on entend, au sens de la présente invention, toute plante appartenant à la famille des Cucurbitacées issue du croisement de deux plantes génétiquement différentes, préférentiellement, les deux plantes sont deux plantes de lignées génétiquement différentes. Un autre objet de l'invention concerne un polypeptide isolé correspondant à un variant d'une 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 (ACS8) de référence, de plante de la famille des Cucurbitacées, laquelle 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 présente une activité de transformation de la S-adénosyl méthionine en aminocyclopropane carboxylate et lequel variant présente une activité inférieure d'au moins 50% , de préférence d'au moins 75% ou 90%, de manière encore préférée d'au moins 95% ou 99% par rapport à ladite 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 de référence et de manière particulièrement préférée, ledit variant présente une activité nulle.
Le terme "isolé" au sens de la présente invention désigne un matériel biologique qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement). Par exemple, un polypeptide présent à l'état naturel dans une plante n'est pas isolé. Le même polypeptide séparé des autres polypeptides adjacents au sein de la cellule dans laquelle il est naturellement présent est isolé.
De manière préférée, le polypeptide de l'invention présente au moins 80% d'identité avec la séquence du polypeptide de référence ou un fragment de celui-ci, de préférence au moins 85% ou 90% d'identité, et de manière particulièrement préférée au moins 95% d'identité avec cette séquence.
Autrement, le polypeptide de l'invention peut être un fragment du polypeptide de référence. Ledit fragment peut être obtenu par une mutation non-sens sur la séquence nucléotidique entraînant l'apparition d'un codon STOP dans cette séquence nucléotidique ou par une mutation décalante, laquelle peut notamment entraîner un décalage du cadre de lecture faisant apparaître un codon STOP dans la séquence d'acide nucléique.
Par "pourcentage d'identité entre deux séquences polypeptidiques", on entend le pourcentage d'acides aminés identiques, entre deux séquences devant être comparées, obtenu avec le meilleur alignement possible desdites séquences. Ce pourcentage est purement statistique et les différences entre les deux séquences sont réparties aléatoirement sur toute la longueur des séquences d'acides aminés.
Par "meilleur alignement possible ou alignement optimal", on entend l'alignement permettant d'obtenir le pourcentage d'identité le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides aminés sont habituellement réalisées en comparant lesdites séquences après que celles-ci aient été alignées selon le meilleur alignement possible ; la comparaison est alors réalisée sur des segments de comparaison de façon à identifier et comparer des régions de similarité. Le meilleur alignement possible pour effectuer une comparaison peut être réalisé en utilisant l'algorithme d'homologie globale développé par Smith et Waterman (Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981), en utilisant l'algorithme d'homologie locale développé par Neddleman et Wunsch (J. Mol. Biol., vol.48, p:443, 1970), en utilisant la méthode de similarité développé par Pearson et Lipman (Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988), en utilisant des programmes d'ordinateur basés sur de tels algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl USA), en utilisant les algorithmes d'alignement multiples MUSCLE (Edgar, Robert C, Nucleic Acids Research, vol. 32, p:1792, 2004). Pour obtenir le meilleur alignement possible, on utilisera de préférence le programme BLAST avec la matrice BLOSUM 62 ou la matrice PAM 30. Le pourcentage d'identité est déterminé en comparant les deux séquences alignées de façon optimale, lesdites séquences pourront comprendre des additions ou des délétions au regard de la séquence de référence de sorte d'obtenir le meilleur alignement possible entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques entre les deux séquences, en divisant le nombre obtenu par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.
Les termes "acide aminé" et "acides aminés" au sens de la présente invention correspondent à tout acide aminé présent naturellement ou à leurs résidus. Les acides aminés peuvent être identifiés soit par leur abréviation à une seule lettre, soit par leur abréviation à trois lettres. (Asp D acide aspartique; Ile I isoleucine; Thr T thréonine; Leu L leucine ; Ser S serine ; Tyr Y tyrosine; Glu E acide glutamique; Phe F phénylalanine; Pro P proline; His H histidine; Gly G glycine; Lys K lysine; Ala A alanine; Arg R arginine; Cys C cystéine; Trp W tryptophane; Val V valine; Gin Q glutamine; Met M méthionine; Asn N asparagine). Selon la présente invention, les acides aminés naturels peuvent être remplacés par des acides aminés chimiquement modifiés.
Le terme "mutation", au sens de la présente invention, fait référence à un changement permanent dans la séquence du matériel génétique d'une cellule de plante appartenant à la famille des Cucurbitacées. Une telle mutation peut correspondre notamment à une substitution, une délétion ou encore à une insertion. Par "mutation non-sens", on entend, au sens de la présente invention, la substitution, dans une séquence d'un gène, d'un nucléotide par un autre nucléotide entraînant l'apparition d'un codon STOP.
Par "mutation décalante", on entend, au sens de la présente invention, l'insertion ou la délétion, dans la séquence génomique d'un gène, d'un ou plusieurs nucléotides entraînant un décalage du cadre de lecture, lequel pouvant notamment conduire à l'apparition d'un codon STOP.
De manière préférée, pour l'espèce Cucumis sativus, le polypeptide isolé correspondant à un variant d'une 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 (ACS8) de référence, présentant une activité inférieure d'au moins 50% par rapport à ladite 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 de référence, comprend une séquence ayant au moins 90%, de manière préférée 95% et de manière encore préférée 98% d'identité avec :
- la séquence SEQ ID N°6 ou des variants ou fragments de celle-ci, dans laquelle l'acide aminé à la position 152 et les suivants sont délétés, par rapport à la séquence SEQ ID N°3,
ou - la séquence SEQ ID N°9 ou des variants ou fragments de celle-ci, dans laquelle l'acide aminé à la position 58 et les suivants sont délétés, par rapport à la séquence SEQ ID N°3.
De manière préférée, pour l'espèce Cucumis melo, le polypeptide isolé correspondant à un variant d'une 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 (ACS8) de référence, présentant une activité inférieure d'au moins 50% par rapport à ladite 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 de référence, comprend une séquence ayant au moins 90%, de manière préférée 95% et de manière encore préférée 98% d'identité avec : - la séquence SEQ. ID N°15 ou des variants ou fragments de celle-ci, dans laquelle l'acide aminé en position 45 est une phénylalanine par rapport à la séquence SEQ ID N°12,
ou
- la séquence SEQ ID N°18 ou des variants ou fragments de celle-ci, dans laquelle l'acide aminé en position 295 est une phénylalanine, par rapport à la séquence SEQ ID N°12.
Un autre objet de l'invention concerne un polynucléotide codant pour le polypeptide selon l'invention. Le polynucléotide selon l'invention peut être non codant s'il comprend une mutation entrainant la disparition du codon d'initiation du polynucléotide de référence.
Une plante, de la famille des Cucurbitacées, homozygote pour un allèle d'ACS8 correspondant audit polynucléotide est androïque, à savoir qu'elle présente uniquement des fleurs mâles.
Par "plante homozygote", on entend, au sens de la présente invention une plante possédant deux polynuciéotides codant pour Γ'1-aminocyciopropane-l- carboxylate synthase 8 (ACS8) non codant ou codant pour un polypeptide correspondant à un variant de l'ACS8 de référence, à raison d'une copie dudit polynucléotide par chromosome de la paire de chromosomes.
Une plante, de la famille des cucurbitacées, hétérozygote pour l'allèle muté selon l'invention présente un retard d'apparition des fleurs femelles par rapport aux fleurs mâles comparé aux plantes sauvages ayant des fleurs mâles. Par conséquent, les plantes hétérozygotes pour l'allèle muté selon l'invention présentent plus de fleurs mâles que les plantes sauvages.
Par "plante hétérozygote", on entend, au sens de la présente invention, une plante possédant un seul polynucléotide codant pour le polypeptide de la présente invention.
Par "polynucléotide", on entend, au sens de la présente invention, une chaîne nucléotidique simple brin ou son complémentaire ou une chaîne nucléotidique double brin pouvant être de type ADN ou ARN. De préférence, les polynucléotides de l'invention sont de type ADN, notamment d'ADN double brin. Aux fins de la présente description, l'expression "séquence d'acide nucléique" peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression "séquence d'acide nucléique" englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
Le terme "séquence d'acide nucléique" se réfère à une séquence d'ADN (par exemple un ADNc (ADN complémentaire) ou de l'ADN génomique ou synthétique) ou à une séquence d'ARN (par exemple un ARN messager ou encore de l'ARN synthétique), aussi bien qu'à des analogues d'ADN ou ARN contenant des analogues de nucléotides non naturels, des liens internucléotidiques non naturels ou encore les deux. De manière préférée, ladite séquence nucléotidique est une séquence ADN. Les séquences nucléotidiques peuvent présenter toute conformation topologique, telle que linéaire ou circulaire.
Le terme "nucléotide" désigne à la fois les nucléotides naturels (Adénine : A, Thymine : T, Guanine : G, Cytosine : C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (i) un analogue d'une purine, (ii) un analogue d'une pyrimidine, ou (iii) un sucre analogue, de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N° WO 95/04064.
De manière préférée, pour l'espèce Cucumis sativus, le polynucléotide codant pour le polypeptide de l'invention comprend une séquence ayant au moins 90%, de manière préférée 95% et de manière encore préférée 98% d'identité avec
- la séquence SEQ ID N°5 ou des variants ou fragments de celle-ci, dans laquelle le nucléotide en position 394 est délété par rapport à la séquence SEQ ID N°2,
ou
- avec la séquence SEQ ID N°8 ou des variants ou fragments de celle-ci, dans laquelle le nucléotide à la position 173 est une adénine, par rapport à la séquence SEQ ID N°2.
De manière préférée, pour l'espèce Cucumis melo, le polynucléotide codant pour le polypeptide de l'invention comprend une séquence ayant au moins 90%, de manière préférée 95% et de manière encore préférée 98% d'identité avec
- la séquence SEQ ID N°14 ou des variants ou fragments de celle-ci, dans laquelle le nucléotide en position 133 est une thymine par rapport à la séquence SEQ ID N°ll,
ou
- avec la séquence SEQ ID N°17 ou des variants ou fragments de celle-ci, dans laquelle le nucléotide à la position 884 est une thymine, par rapport à la séquence SEQ ID N°ll.
Un autre objet de l'invention concerne une cellule issue d'une plante telle que définie dans la présente invention.
Ladite cellule de plante comprend le polypeptide de l'invention ou le polynucléotide codant pour ledit polypeptide. Par "cellule de plante", on entend, au sens de la présente invention, les protoplastes, les gamètes produisant des cellules et les cellules régénérant des plantes complètes. Le terme "cellule de plante" fait également référence, sans limitations, aux cellules obtenues ou isolées de : graines, cultures en suspension, embryons, méristèmes, feuilles, racines, pousses, gamétophytes, sporophytes, pollen et microspores. Une "cellule de plante" peut faire référence à une seule cellule ou une population de cellules. Une population de cellules de plantes peut être pure, c'est-à- dire composée d'un seul type de cellule, ou bien composée de différents types de cellules. Une cellule de plante au sens de la présente invention peut être isolée ou comprise dans un tissu de plante, un organe de plante ou une plante quelque soit son stade de développement.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé d'identification d'une plante possédant une séquence d'acide nucléique codant pour le polypeptide selon l'invention et comprenant les étapes de :
a) Analyse d'un échantillon comprenant des cellules d'une plante de la famille des Cucurbitacées ou des extraits de celle-ci de sorte à identifier si ladite plante comprend une séquence d'acide nucléique codant pour le polypeptide selon l'invention ; et
b) Identification d'une plante comprenant une telle séquence d'acide nucléique.
L'étape a) d'analyse peut se faire par des méthodes qui sont bien connues de l'homme du métier. Ces méthodes peuvent être des méthodes directes de détection de la séquence d'acide nucléique choisie dans le groupe comprenant, mais non limité à la réaction de polymérisation en chaîne (PCR), l'hybridation In situ, le Northern blot, le Southern blot, le séquençage, la technique KEYPOINT™ ou encore le TILLING.
Le procédé de TILLING est bien connu de l'homme du métier ; il est décrit notamment par Me CALLUM et al. (2000, Plant Physiology, Vol. 123 : 439-442). Ces méthodes peuvent également être des méthodes indirectes basées sur la détection du polypeptide codé par ladite séquence d'acide nucléique et choisies dans le groupe comprenant, mais non limité à, l'évaluation de l'activité dudit polypeptide, le western blot, la spectrométrie de masse protéomique ou la méthode iTRAQ. L'étape b) d'identification peut être réalisée simplement par l'homme du métier au regard de ses connaissances générales.
Cette étape peut comprendre notamment une étape de culture des plantes identifiées à l'étape a) comme comprenant la séquence d'acide nucléique de l'invention. Selon un mode de réalisation préféré, le procédé d'identification selon l'invention est caractérisé en ce que ladite plante de la famille des Cucurbitacées présente en outre au moins un premier caractère d'intérêt et en ce qu'il comprend en outre, éventuellement, une étape b') de sélection d'une plante présentant toujours ledit au moins premier caractère d'intérêt. Selon un mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape préalable de mutagénèse d'une plante ou d'une graine de plante de la famille des Cucurbitacées. Cette étape peut notamment permettre d'obtenir une collection de plantes mutantes.
Les techniques de mutagénèse utilisées pour les besoins de la présente invention doivent permettre d'induire des mutations dans le génome des cellules de plantes. De telles techniques de mutagénèse sont bien connues de l'homme du métier et incluent notamment la mutagénèse par UV, par rayons X ou gamma, la mutagénèse ciblée par la technique KEYBASE™ ou encore la mutagénèse chimique, par exemple l'éthylméthanesulfonate (EMS ; voir notamment la méthode décrite par KOORNBEEF et al., Mutat.Res., Vol. 93 : 109-123, 1982), les méganucléases (endodésoxyribonucléases), les nucléases à doigts de zinc, les ribozymes.
A titre d'exemple, l'identification de plantes androïques peut se faire de la façon suivante : des graines de la famille des Cucurbitacées sont exposées à un agent mutagène. Les plantes issues de ces graines mutées sont ensuite autofécondées afin d'obtenir une collection de plantes mutantes.
Puis, l'ADN de chaque plante de la collection précédemment générée est extrait et la séquence d'acide nucléique de l'allèle codant pour l'ACS8 est amplifiée pour rechercher la présence de mutation(s) par rapport à la séquence de l'allèle codant pour l'ACS8 non muté. Les plantes mutées dans la séquence de l'allèle codant pour l'ACS8 sont sélectionnées.
Des "pool" d'ADN sont ensuite réalisés par mélange de l'ADN extrait de plusieurs plantes de la collection générée précédemment, ce qui permet de réduire le nombre d'étapes de détection de mutations. Les séquences cibles sont amplifiées par PCR en utilisant les amorces nucléiques appropriées. Les amplicons ainsi obtenus sont chauffés puis refroidis afin de générer des hétéroduplexes d'ADN entre l'ADN d'une plante non mutée sur la séquence d'acide nucléique de l'allèle codant pour l'ACS8 et l'ADN d'une plante mutée sur la séquence d'acide nucléique de l'allèle codant pour l'ACS8. Les hétéroduplexes sont incubés en présence d'une endonucléase coupant au niveau des mésappariements, avant d'être dénaturés et séparés. Les brins d'ADN séparés ainsi obtenus sont soumis à l'étape de détection de mutation(s), par électrophorèse ou encore par HPLC en conditions dénaturantes (DHPLC) décrite par exemple par MC CALLUM et al. (2000, Plant Physiol., Vol. 123 : 439-442).
Enfin, les plantes mutées dans la séquence de l'allèle codant pour l'ACS8 et qui sont androïques sont sélectionnées.
Selon un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention est caractérisé en ce qu'il vise en outre à la sélection d'une plante androïque et en ce qu'il comprend en outre les étapes de : c) croisement de plantes présentant une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention identifiées à l'étape b) ; et
d) sélection d'une plantes homozygote pour ladite séquence d'acide nucléique. Avantageusement, le procédé selon l'invention comprend en outre les étapes de : e) croisement d'une plante présentant au moins un premier caractère d'intérêt obtenue à l'étape d) avec une plante de la famille des Cucurbitacées présentant au moins un second caractère d'intérêt ; et
f) sélection d'une plante présentant lesdits au moins premier et second caractères d'intérêts.
Dans le détail, l'étape e) de croisement inclut une étape de récolte du pollen de la plante présentant au moins un premier caractère d'intérêt, une étape de mise en contact de ce pollen avec les organes femelles des fleurs femelles ou hermaphrodites préalablement émasculées manuellement, chimiquement ou génétiquement, mâles stériles ou toute plante présentant des organes femelles fonctionnels et des organes mâles non fonctionnels, de plantes possédant au moins un second caractère d'intérêt, pour l'obtention de graines et, enfin, une étape de culture des graines de plantes précédemment obtenues.
Selon un mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que la plante de la famille des Cucurbitacées présentant au moins un second caractère d'intérêt est gynoïque ou mâle stérile. Une méthode d'obtention de plantes gynoïques peut être celle décrite par exemple dans la demande PCT N° WO 2010/012948. Une méthode d'obtention de plantes hermaphrodites peut être celle décrite par exemple dans la demande PCT N°WO 2007/125264.
Par "plante gynoïque", on entend, au sens de la présente invention, une plante portant uniquement des fleurs femelles. Lesdites fleurs femelles (pistillées) présentent uniquement les organes reproducteurs femelles et ne produisent donc que des ovocytes qui deviendront des graines s'il y a fécondation contrairement aux fleurs mâles (staminées) produisent uniquement du pollen. Le fait, pour une plante, d'être gynoïque s'appelle la gynoécie. Par "plante hermaphrodite", on entend, au sens de la présente invention, des plantes dont les fleurs portent à la fois les organes reproducteurs mâles et les organes reproducteurs femelles.
Par "plante mâle stérile", on entend, au sens de la présente invention, une plante hermaphrodite dépourvue d'organes reproducteurs mâles ou dépourvue d'organes reproducteurs mâles capables de produire du pollen et/ou du pollen viable par une émasculation manuelle, chimique ou génétique.
Selon un mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il vise en outre à la production d'une graine de plante, de préférence hybride, diploïde ou triploïde, et en ce qu'il comprend en outre les étapes de : e) Planter un champ alternativement avec les plantes androïques de l'invention et/ou à tendance androïque et des plantes gynoïques et/ou mâles stériles telles que définies précédemment ;
f) Récolter les fruits des plantes gynoïques et/ou mâles stériles obtenus après pollinisation ; et
g) Extraire les graines desdits fruits.
Un autre objet de l'invention concerne une graine, de préférence hybride, diploïde ou triploïde, de plante obtenue selon le procédé de production d'une graine de plante, de préférence hybride, diploïde ou triploïde, selon l'invention.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de production d'une plante androïque de la famille des cucurbitacées, ledit procédé comprenant les étapes de : a) Obtention d'une plante de la famille des cucurbitacées, préférentiellement sélectionnée dans le groupe comprenant les genres Cucumis, Citrullus, Cucurbita, Luffa, Momordica et Lagenaria,
b) Inhibition de la 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 (ACS8) de ladite plante. Selon l'invention, la 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 (ACS8) de ladite plante est caractérisée par une séquence d'acides nucléiques possédant au moins 75%, particulièrement au moins 80%, plus particulièrement au moins 90%, préférentiellement au moins 95%, plus préférentiellement au moins 98%, encore plus préférentiellement au moins 99% d'identité avec l'une quelconque des séquences SEQ ID 10, 19, 22, 25, 28 et 31.
Dans un mode de réalisation de l'invention, l'étape b) d'inhibition de la 1- aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 (ACS8) permet d'obtenir une activité inférieure d'au moins 50% de préférence d'au moins 75% ou 90%, de manière encore préférée d'au moins 95% ou 99% par rapport à ladite 1-aminocyclopropane-l- carboxylate synthase 8 de ladite plante avant inhibition.
L'inhibition de 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 (ACS8) doit être prise au sens large, et comprend l'inhibition de l'expression, par utilisation d'inhibiteurs de l'expression, de 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 (ACS8) ou l'inhibition de l'activité, par utilisation d'inhibiteurs de l'activité, de 1- aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 (ACS8). L'utilisation d'inhibiteurs de l'expression ou de l'activité de 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 (ACS8).
On entend par inhibiteur de l'expression un composé naturel ou synthétique ayant la capacité d'inhiber, ou de diminuer de manière significative, l'expression d'un gène, aux différents niveaux d'expression de celui-ci, notamment la transcription et la traduction.
Des exemples d'inhibiteur de l'expression comprennent notamment des ARN interférents (siRNA, miRIMA, shRNA) et des oligonucléotides anti-sens (comprenant des ADN et ARN anti-sens), agissant en en se liant au gène d'intérêt, et empêchant ainsi l'expression du gène par blocage de la traduction ou par une augmentation de la dégradation des ARN messagers. Les oligonucléotides anti-sens mesurent généralement environ 15 bases et sont complémentaires à l'ARN ou l'ADN du gène d'intérêt. Ils peuvent être synthétisés et utilisés par des méthodes bien connues de l'homme du métier. Les ARN interférents sont aussi sélectionnés et utilisés par des méthodes bien connues de l'homme du métier. Les ribozymes peuvent aussi être utilisés pour inhiber l'expression d'un gène d'intérêt. Les ribozymes sont en effet des molécules d'ARN enzymatiques capables de catalyser le clivage de l'ARN. Le mécanisme d'action du ribozyme implique une hybridation séquence-spécifique de la molécule de ribozyme à la séquence cible d'ARN qui lui est complémentaire, suivie d'un clivage endonucléolitique. Les techniques d'obtention et d'utilisation de tels ribozymes sont bien connues de l'homme du métier. Les sites de clivages spécifiques aux ribozymes dans n'importe quelle cible ARN potentielle sont initialement identifiés par étude de l'ARN cible, les sites comprenant typiquement les séquences GUA, GUU et GUC. Une fois identifiées, les petites séquences d'ARN, mesurant généralement 15 à 20 ribonucléotides et correspondant à la région de l'ARN cible comprenant le site de clivage, peuvent être évaluées en termes de prédiction de leurs caractéristiques structurales (équivalentes à une structure secondaire) qui peuvent rendre l'oligonucléotide inadapté.
Les oligonucléotides anti-sens, les ARN interférents et les ribozymes utilisables dans le cadre de l'invention peuvent être préparés par des méthodes connues de l'homme du métier. Elles incluent les techniques de synthèse chimique. Alternativement, les molécules d'ARN anti-sens et les ARN interférents peuvent être générés par une transcription in vitro ou in vivo de séquences d'ADN codant pour de tels molécules d'ARN. Ces séquences d'ADN peuvent être incorporées dans un grand nombre de vecteurs qui comprennent ou peuvent comprendre des promoteurs d'ARN polymérase adaptés tels que les promoteurs de polymérase T7 ou SP6. De nombreuses modifications bien connues de l'homme du métier peuvent être apportées aux oligonucléotides de l'invention, pour augmenter leur stabilité cellulaire et leur demi- vie.
Les oligonucléotides anti-sens, les ARN interférents et les ribozymes de l'invention peuvent être délivrés in vivo seuls ou en association à un vecteur. On entend par inhibiteur de l'activité un composé, naturel ou non, ayant la capacité de réduire ou de supprimer l'activité d'une protéine.
Les inhibiteurs d'activité de l'invention peuvent être des composés chimiques, naturels ou de synthèse, mais aussi des composés biologiques, inhibant ou réduisant de manière significative l'activité d'une protéine d'intérêt. De tels composés peuvent être des molécules se liant à ladite protéine (par exemple, mais pas nécessairement, sur son site actif), et bloquant ainsi son activité. Les composés peuvent aussi inhiber l'activité de la protéine en agissant sur un acteur de la voie de signalisation de ladite protéine d'intérêt.
L'inhibiteur d'activité de l'invention peut aussi être un aptamère. Les aptamères sont des molécules qui représentent une alternative aux anticorps en termes de reconnaissance moléculaire. Ce sont des séquences d'oligonucléotides ou d'oligopeptides ayant la capacité de reconnaître virtuellement n'importe quelle classe de molécules cibles avec une haute affinité et spécificité. De tels ligands peuvent être isolés et modifiés par des techniques bien connues de l'homme du métier.
Naturellement, un autre objet de l'invention porte également sur une plante ou une graine obtenue par ce procédé selon l'invention.
De préférence, ladite plante androïque de la famille des cucurbitacées n'est pas issue de l'espèce Cucumis sativus.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de production d'une plante androïque ou à tendance androïque de la famille des Cucurbitacées, ledit procédé comprenant les étapes de :
a) Obtention d'une plante de la famille des Cucurbitacées, laquelle plante est sélectionnée dans le groupe comprenant les genres Cucumis,Citrullus, Cucurbita, Luffa, Momordica etLagenaria,
b) Mise en évidence de la présence d'au moins un allèle de ΙΊ- aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 (ACS8) non codant ou codant pour un polypeptide correspondant à un variant de TACS8 de référence pour ladite plante,
c) Etude de l'activité de transformation de la S-adénosyl méthionine en aminocyclopropane carboxylate de ΙΊ- aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 codée par ledit allèle,
d) Sélection d'une plante présentant une activité de transformation de la S-adénosyl méthionine en aminocyclopropane carboxylate et lequel variant présente une activité inférieure d'au moins 50% de préférence d'au moins 75% ou 90%, de manière encore préférée d'au moins 95% ou 99% par rapport à ladite 1-aminocyclopropane-l- carboxylate synthase 8 de référence et de manière particulièrement préférée, ledit variant présente une activité nulle.
Selon l'invention, ledit variant de l'1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 (ACS8) de référence mis en évidence à l'étape b) est caractérisé par une séquence d'acides nucléiques possédant au moins 75%, particulièrement au moins 80%, plus particulièrement au moins 90%, préférentiellement au moins 95%, plus préférentiellement au moins 98%, encore plus préférentiellement au moins 99% d'identité avec l'une quelconque des séquences SEQ ID 10, 19, 22, 25, 28, 31 et 33, mais non parfaitement identique à celle-ci.
Naturellement, un autre objet de l'invention porte également sur une plante ou une graine obtenue par ce procédé selon l'invention.
De préférence, ladite plante androïque de la famille des cucurbitacées n'est pas issue de l'espèce Cucumis sativus. Un autre objet de l'invention porte sur un procédé de sélection d'une plante présentant au moins deux caractères d'intérêt, ledit procédé comprenant les étapes de :
a) analyse d'un échantillon comprenant des cellules d'une plante de la famille des Cucurbitacées présentant un premier caractère d'intérêt ou des extraits de celle-ci de sorte à identifier si ladite plante comprend une séquence d'acide nucléique codant pour le polypeptide selon l'invention ; et
b) identification d'une plante comprenant une telle séquence d'acide nucléique et présentant toujours ledit premier caractère d'intérêt,
c) croisement de plantes présentant une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention et présentant toujours ledit premier caractère d'intérêt identifiées à l'étape b),
d) sélection d'une plante et présentant toujours ledit premier caractère d'intérêt et homozygote pour ladite séquence d'acide nucléique,
e) croisement d'une plante présentant au moins un premier caractère d'intérêt obtenue à l'étape d) avec une plante de la famille des Cucurbitacées présentant au moins un second caractère d'intérêt ; et
f) sélection d'une plante présentant lesdits au moins premier et second caractères d'intérêts.
Naturellement, un autre objet de l'invention porte également sur une plante ou une graine obtenue par ce procédé selon l'invention.
De préférence, lesdite plante de la famille des cucurbitacées de l'étape d) n'est pas issue de l'espèce Cucumis sativus. Un autre objet de l'invention concerne par ailleurs un procédé de propagation d'une plante homozygote androïque de l'invention, comprenant les étapes de : a) traitement de plantes androïques homozygotes pour l'allèle muté ACS8 de l'invention, avec un composé permettant d'induire une augmentation de la concentration intracellulaire en éthylène, pour générer des fleurs femelles, b) Autopollinisation des plants obtenues à l'étape a), et c) récolte des graines.
L'homme du métier est à même d'identifier simplement, et au regard de ses connaissances générales, des composés permettant d'induire une augmentation de la concentration intracellulaire en éthylène. A titre d'exemple de tels composés, on peut citer l'éthéphon et l'ACC.
L'éthéphon, ou ethrel, est un facteur de croissance végétal bien connu de l'homme du métier.
L'ACC ou acide 1-aminocyclopropane-l-carboxylique joue un rôle important dans la biosynthèse de l'éthylène et est synthétisée par l'enzyme ACC synthétase à partir de la méthionine, puis converti en éthylène par l'ACC oxydase.
Les plantes androïques homozygotes pour l'allèle muté ACS8 de l'invention comprennent un polypeptide ou polynucléotide de l'invention.
Les graines obtenues par un tel procédé sont de facto androïques, et comprennent un polypeptide ou polynucléotide de l'invention.
Naturellement, un autre objet de l'invention porte également sur une plante ou une graine obtenue par ce procédé selon l'invention.
De préférence, ladite plante androïque de la famille des cucurbitacées n'est pas issue de l'espèce Cucumis sativus.
Un autre objet de l'invention concerne également un procédé de production d'une graine de plante, de préférence hybride, diploïde ou triploïde, comprenant les étapes de : a. planter un champ alternativement avec les plantes androïques et/ou à tendance androïque de l'invention comprenant un premier caractère d'intérêt et des plantes gynoïques et/ou mâles stériles telles que définies dans la présente invention comprenant un deuxième caractère d'intérêt ;
b. récolter les fruits des plantes obtenus après pollinisation, et c. extraire les graines desdits fruits.
Selon l'invention, une plante androïque ou à tendance androïque de l'invention porte un allèle muté ACS8 de l'invention ou est hétérozygote pour l'allèle muté de ΙΊ- aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 (ACS8) non codant ou codant pour un variant de l'ACS8 de référence. Ladite plante à tendance androïque porte plus de fleurs mâles que la même plante sauvage monoïque ou andromonoïque n'ayant pas ledit allèle muté.
De préférence, ladite graine est homozygote pour l'allèle muté ACS8 de l'invention, et comprend ainsi un polypeptide et/ou un polynucléotide de l'invention.
De préférence, ladite graine de la famille des cucurbitacées n'est pas issue de l'espèce Cucumis sativus.
Un autre objet de l'invention concerne une plante, de la famille des cucurbitacées, sélectionnée dans le groupe comprenant les genres Cucumis, Citrullus, Cucurbita, Luffa, Momordica et Lagenaria, à l'exclusion de l'espèce Cucumis sativus, et caractérisée en ce qu'elle est androïque.
Un autre objet de l'invention concerne une utilisation, pour la sélection de plantes androïques de la famille des Cucurbitacées, de sondes ou d'amorces permettant la détection du polynucléotide selon l'invention dans un échantillon comprenant des celluïes d'une telle plante ou des extraits de celles-ci. Par "sonde" on entend, au sens de la présente invention, une séquence d'acide nucléique possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec une séquence d'acide nucléique cible et émettant un signal lors de l'hybridation de la sonde sur la séquence d'acide nucléique cible.
Par "amorce" on entend, au sens de la présente invention une séquence d'acide nucléique qui est capable d'être un point d'initiation de la synthèse d'une séquence d'acide nucléique, le long d'un brin d'acide nucléique complémentaire, dans des conditions catalysant ladite synthèse. De telles conditions incluent la présence des quatre bases nucléotidiques et d'un agent de polymérisation tel qu'une DNA polymérase, dans une solution tampon et avec une température appropriés.
L'homme du métier sera à même d'identifier simplement de telles sondes ou amorces au regard de ses connaissances générales. De telles sondes ou amorces correspondent avantageusement à des polynucléotides d'au moins 15 acides nucléiques, de préférence d'au moins 20 acides nucléiques.
Avantageusement encore, ces sondes ou amorces présentent une séquence identique ou complémentaire à une séquence codant pour une ACS8 d'une plante appartenant à la famille des Cucurbitacées. A titre d'exemple de telles séquences, on peut citer les séquences SEQ ID N° 4 et SEQ ID N° 7 de Cucumis sativus et SEQ ID N°13 et SEQ ID N°16 de Cucumis melo.
Un autre objet de l'invention concerne une utilisation, pour la sélection de plantes androïques de la famille des Cucurbitacées, d'anticorps permettant la détection du polypeptide selon l'invention dans un échantillon comprenant des cellules d'une telle plante ou des extraits de celles-ci.
Par "anticorps" on entend, au sens de la présente invention, notamment des anticorps polyclonaux ou monoclonaux ou des fragments (par exemple les fragments F(ab)'2, F(ab)) ou reconnaissant le polypeptide ou le fragment de polypeptide cible selon l'invention. Tableau des séquences
SEQ ID N° Type Désignation
1 Polynucléotide Séquence génomique d'ACS8 sauvage de Cucumis sativus
2 Polynucléotide Séquence codante d'ACS8 sauvage de Cucumis sativus
3 Polypeptide Séquence protéique d'ACS8 sauvage de Cucumis sativus
4 Polynucléotide Séquence génomique du variant délété d'ACS8 de Cucumis sativus
5 Polynucléotide Séquence codante du variant délété d'ACS8 de Cucumis sativus
6 Polypeptide Séquence protéique du variant délété d'ACS8 de Cucumis sativus
7 Polynucléotide Séquence génomique du variant
W58- STOP d'ACS8 de Cucumis sativus
8 Polynucléotide Séquence codante du variant
W58- STOP d'ACS8 de Cucumis sativus
9 Polypeptide Séquence protéique d'ACS8 du variant W58- STOP de de Cucumi ssativus
10 Polynucléotide Séquence génomique d'ACS8 sauvage de Cucumis melo
11 Polynucléotide Séquence codante d'ACS8 sauvage de Cucumis melo
12 Polypeptide Séquence protéique d'ACS8 sauvage de Cucumis melo
13 Polynucléotide Séquence génomique du variant
L45->F d'ACS8 de Cucumis melo
14 Polynucléotide Séquence codante du variant
L45->F d'ACS8 de Cucumis melo
15 Polypeptide Séquence protéique d'ACS8 du variant L45- F de de Cucumis melo
16 Polynucléotide Séquence génomique du variant
S295- F d'ACS8 de Cucumis melo
17 Polynucléotide Séquence codante du variant
S295->F d'ACS8 de Cucumis melo
18 Polypeptide Séquence protéique d'ACS8 du variant S295- F de de Cucumis melo
19 Polynucléotide Séquence génomique d'ACS8 sauvage de Citrullus lanatus
20 Polynucléotide Séquence codante d'ACS8 sauvage de Citrullus lanatus 21 Polypeptide Séquence protéique d'ACS8 sauvage de Citrullus lanatus
22 Polynucléotide Séquence génomique d'ACS8 sauvage de Luffa acutangula
23 Polynucléotide Séquence codante d'ACS8 sauvage de Luffa acutangula
24 Polypeptide Séquence protéique d'ACS8 sauvage de Luffa acutangula
25 Polynucléotide Séquence génomique d'ACS8 sauvage de Lagenaria siceraria
26 Polynucléotide Séquence codante d'ACS8 sauvage de Lagenaria siceraria
27 Polypeptide Séquence protéique d'ACS8 sauvage de Lagenaria siceraria
28 Polynucléotide Séquence génomique d'ACS8 sauvage de Momordica charentia
29 Polynucléotide Séquence codante d'ACS8 sauvage de Momordica charentia
30 Polypeptide Séquence protéique d'ACS8 sauvage de Momordica charentia
31 Polynucléotide Séquence génomique incomplète d'ACS8 sauvage de Cucurbita pepo
32 Polynucléotide Séquence codante incomplète d'ACS8 sauvage de Cucurbita pepo
33 Polypeptide Séquence protéique incomplète d'ACS8 sauvage de Cuurbita pepo
34 Polynucléotide Séquence génomique d'ACS8 sauvage de Citrullus lanatus
35 Polynucléotide Séquence codante d'ACS8 sauvage de Citrullus lanatus
36 Polypeptide Séquence protéique d'ACS8 sauvage de Citrullus lanatus
Les exemples qui suivent sont fournis à titre, d'illustration et ne sauraient limiter la portée de la présente invention.
EXEMPLES Exemple 1 : population de cartographie
Pour cartographier génétiquement le gène A responsable de l'androécie chez le concombre (Cucumis sativus), espèce pour laquelle l'androécie existe à l'état naturel, nous avons exploité une population en ségrégation pour ce phénotype. Le gène étant un gène récessif nous avons exploité une population backcross (BC). Pour cela des plantes de concombre monoïques (fleur mâles et fleurs femelles sur la même plante) ont été croisées avec des plantes androïques (uniquement fleurs mâles). La descendance Fl a été recroisée avec le parent androïque pour produire la descendance backcross 1 (BC1) (Figure 1). La descendance BC1 sera pour 50% monoïque et 50% androïque. 260 plantes issues du BC1 ont été phénotypées et ont servi à l'extraction d'ADN génomique.
Exemple 2 : Localisation primaire de la région contenant le gène de l'androécie Le but de cette étape est l'identification de marqueurs moléculaires qui ségrégent spécifiquement avec l'androécie. Pour identifier ces marqueurs, l'idée est de regrouper l'ADN des individus BC1 monoïques et l'ADN des individus BC1 androïques. Cette technique est appelée BSA, Bulk Segregant Analysis, (Michelmore, R.W. et al. Identification of markers linked to disease-resistance gènes by bulked segregant analysis: A rapid method to detect markers in spécifie genomic régions by using segregating populations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 9828-9832, 1991) ou analyse de ségrégation en mélange. Suivant cette stratégie, nous avons produit 4 bulks de 7 individus différents (2 bulks d'ADN de plantes androïques et 2 bulks d'ADN de plantes monoïques). Les bulks d'ADN issus de plantes de même type sexuel ont donné les même résultats et par conséquent la recherche de marqueur moléculaire AFLP (Vos, P. et al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research.Vol21, 21: 4407-4414,1995) a été réalisé avec seulement 2 bulks d'ADN (1 bulk androïque, 1 bulk monoïque).
Suite au criblage de l'intégralité des 1024 combinaisons AFLP possibles nous avons obtenu 52 combinaisons AFLP polymorphes entre les deux bulks (monoïque et androïque). Les 52 AFLP ont été utilisées pour génotyper 50 plantes individuelles. A l'issue de ce travail, nous avons identifié 7 marqueurs AFLP qui co-ségrégent ou qui sont très fortement liés au phénotype androécie. Les 7 marqueurs AFLP ont été utilisés pour construire la carte génétique de première intention du locus Androecy (Figure 2). Exemple 3 : Ancrage des marqueurs AFLP sur la séquence du génome du concombre et développement de la carte génétique fine de la région du gène de l'androécie
L'ancrage des marqueurs AFLP a été facilité par la disponibilité de la séquence du génome de concombre. Le positionnement des marqueurs AFLP nous a permis de mesurer la distance physique entre les deux marqueurs AFLP (Pst65xMse52 et Pst74xMsel7) encadrant le locus Androecy. Cette distance est de 781kilobases (kb) est contient 62 gènes.
Afin de réduire au maximum l'intervalle physique, nous avons développé de nouveaux marqueurs moléculaires tous les 50 kb dans une région de 1 Mégabase (Mb) centrée sur le locus Androecy. Tous ces marqueurs sont développés dans des régions intergéniques. Grâce à cette approche, nous avons identifié les marqueurs génétiques A82xA87 et A48xA50 qui nous ont permis de cribler une population BCl de 1717 individus dans le but de trouver de nouveaux recombinants génétiques dans la région du locus Androecy.
Suite à l'identification des nouveaux marqueurs génétiques et de la recherche de recombinants, nous avons développé la carte génétique fine du locus Androecy.
Cette approche ne nous a pas permis d'identifier directement le gène responsable de l'androécie. Cependant, les recombinants délimitent l'intervalle génétique responsable de l'androécie à 53.5 kb contenant 7 gènes prédits.
Exemple 4 : Identification du gène candidat du polymorphisme responsable de l'androécie et génétique d'association
Parmi les 7 gènes dans l'intervalle génétique de confiance, le gène CsACS8 code pour une ACC synthase, enzyme clef de la voie de biosynthèse de l'éthylène. Du point de vue génétique, la distance physique entre ce gène CsACS8 et les autres marqueurs AFLP (Figure 2) est compatible avec la relation distance physique / distance génétique décrite pour le concombre. De plus chez les Cucurbitacées comme le concombre et le melon, l'éthylène a été décrit comme l'hormone végétale à effet majeure sur la détermination du type sexuel floral. Au vue de ces différents points, le gène CsACS8 est considéré comme un très bon gène candidat.
Afin de vérifier si le gène CsACS8 peut être le gène responsable de l'Androécie, nous avons séquencé ce gène chez les parents de la population de cartographie, le parent androïque et le parent monoïque. Chez le parent monoïque portant l'allèle dominant A, le gène CsACS8, composé de 4 exons et 3 introns, code pour une protéine de 441 acides aminés. Chez le parent androïque, le gène CsACS8 présente une délétion d'une base dans le 3ème exon du gène. Cette délétion change le cadre de lecture protéique et entraine l'apparition du codon STOP 20 acides aminés après la délétion aboutissant ainsi à une protéine de 151 acides aminés (Figure 3).
Pour consolider les données de cartographie génétique, nous avons réalisé une étude de génétique d'association entre le phénotype androïque et la délétion d'I paire de bases dans le gène CsACS8 sur 28 accessions de concombre (2 androïques, 2 gynoïques, 6 andromonoïques, 9 monoïques et 9 hermaphrodites). Le séquençage de CsACS8 chez ces 28 accessions a mis en évidence une association parfaite entre la délétion d'I paire de bases et l'androécie, autrement dit les 2 accessions androïques portent la délétion alors que toutes les autres accessions quelques soit le type sexuel ne présentent pas la délétion.
Exemple 5 : Validation fonctionnelle du gène CsACS8 Au laboratoire, nous disposons d'une population TILLING (mutants EMS) concombre de 3360 familles réalisée à partir de la variété Beit alpha. Cette variété de concombre est monoïque et porte donc des fleurs maies et femelles. Sur cette population TILLING, nous avons recherché des mutations induites par l'EMS sur la totalité de la séquence codante du gène CsACS8. Dans la population TI LLING Beit Alpha, nous avons identifié 9 mutations: 7 silencieuses et 1 changement d'acide aminé P437L et 1 mutant STOP. Les plantes homozygotes mutantes pour la mutation STOP ne développent que des fleurs mâles et sont donc devenues androïques. Les mutants P437L sont en cours de phénotypage. Afin d'étudier si le gène CsACS8 contrôle aussi l'androécie chez d'autres Cucurbitacées, nous avons étudié son rôle dans le déterminisme sexuel chez le melon, une cucurbitacée pour laquelle l'existence de l'androécie à l'état naturel n'a jamais été reportée. Pour ce faire, nous avons identifié la séquence de l'homologue du gène CsACS8 chez le melon : CmACS8.
En exploitant notre population TILLING melon, nous avons identifié 12 familles mutées dans le gène CmACS8. Parmi ces 12 mutations, 5 sont introniques, 4 silencieuses, et 3 entraînent un changement d'acide aminé (L45F, G72E et S295F). La mutation G72E affecte un acide aminé située dans une région protéique variable alors que les mutations L45F et S295F affectent des acides aminés dans des régions protéiques hautement conservées chez toutes les plantes.
Sachant que l'accession de melon utilisée comme parent de la population TILLING est monoïque (fleur maie et fleur femelle sur la même plante), les trois familles de melon portant des mutations changement d'acide aminé dans le gène CmACS8 ont été phenotypées pour leur type sexuel. Les plantes homozygotes pour la mutation G72E portent des fleurs maies et femelles (plante monoïque) et par conséquent n'ont pas été affectées dans leur déterminisme sexuel. Au contraire, les plantes homozygotes mutantes L45F et S295F ne produisent que des fleurs mâles et sont donc devenues androïques. Grâce à ces mutants, nous avons pu créer un type sexuel, l'androécie, qui n'a jamais été décrit chez le melon.
Ces résultats valident le fait que le gène de l'androécie identifié chez le concombre contrôle aussi l'androécie chez le melon, une autre cucurbitacée.
Exemple 6 : Validation fonctionnelle du gène CsACS8 chez la courgette {Cucurbita oepo) Afin d'étudier si le gène ACS8 contrôle aussi l'androécie chez d'autres
Cucurbitacées que le concombre et le melon, nous étudions son rôle dans le déterminisme sexuel chez la courgette, une cucurbitacée pour laquelle l'existence de l'androécie à l'état naturel n'a jamais été reportée. Pour ce faire, nous cherchons à identifier la séquence de l'homologue du gène CsACS8 du concombre et CmACS8 du melon chez la courgette : CpACS8.
En exploitant notre population TILLING courgette, nous cherchons à identifier des plantes mutées dans le gène Cp/\CS8présentant la caractéristique d'être androïques. Des analyses plus fines sont en cours pour déterminer la nature de la mutation responsable de l'androécie chez les courgettes.
Exemple 7 : Validation fonctionnelle du gène CsACS8 chez la pastèque [Citrullus lanatus)
Afin d'étudier si le gène ACS8 contrôle aussi l'androécie chez d'autres Cucurbitacées que le concombre et le melon, nous étudions son rôle dans le déterminisme sexuel chez la pastèque, une cucurbitacée pour laquelle l'existence de l'androécie à l'état naturel n'a jamais été reportée. Pour ce faire, nous cherchons à identifier la séquence de l'homologue du gène CsACS8 du concombre et CmACS8 du melon chez la pastèque : CIACS8. En exploitant notre population TILLING pastèque, nous cherchons à identifier des plantes mutées dans le gène CIACS8 présentant la caractéristique d'être androïques. Des analyses plus fines sont en cours pour déterminer la nature de la mutation responsable de l'androécie chez les pastèques.
Exemple 8 : Dosage de l'activité de transformation de la S-adénosyl méthionine en aminocvclopropane carboxylate par l'I-aminocvclopropane-l- carboxylate synthase 8 (ACS8)
L'activité enzymatique de l'ACS8 est mesurée in vitro en suivant, par spectrophotométrie à 265 nm, la formation de 5'-methylthioadenosine (MTA) après la mise en présence de S-adénosyl méthionine, de déaminase et de différentes concentrations de PLP (pyridoxal5'-phosphate).
Souches bactériennes, plasmides et produits de réaction :
La souche bactérienne Escherichia coli BL21(DE3)pLYSS est utilisée pour l'expression de l'enzyme. Le vecteur de clonage utilisé est le plasmide pET15b (NOVAGEN) qui porte le promoteur T7 et comprend la résistance à l'ampicilline. La S- adénosyl Methionine (SAM), le Pyridoxal 5'phosphate (PLP) et la 5'Adenylic Acid Deaminase d'Aspergillus (déaminase) peuvent être obtenus auprès de de la société SIGMA. Expression de la 1-aminocvclopropane-l-carboxylate svnthase 8 (ACS8) dans
E.coli
Les ACS8 de référence issues de SEQ ID N° 3 et N°12 ou recombinantes et issues de SEQ ID N°6, N°9, N°15 et N°18 ont été clonées dans le vecteur Petl5b, lequel vecteur a été utilisé pour transformer les bactéries Escherichia coli BL21(DE3)pLYSS selon les conditions fournis par le fabricant.
Ces bactéries Escherichia coli BL21(DE3)pLYSS transformée avec le construit portant la 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 (ACS8) sont incubées dans 25 ml de milieu LURIA-BERTANI (tryptone lOg/L, extrait de levure 5g/L, NaCI lOg/L) additionné d'ampicilline et de chloramphénicol (50 μg/ml chacun) durant une nuit à 37°C. Cette pré-culture est utilisée pour inoculer 2 litres du même milieu additionné d'ampicilline (50 μg/ml) et les cellules sont cultivées à 37°C dans un incubateur sous agitation (180 t/mn) jusqu'à une Densité Optique (DO=600nm) de 0.6. De l'IPTG est additionné (0.5mM) afin d'induire l'expression protéique durant une nouvelle phase de culture de 5 heures à 25°C. Les cellules sont centrifugée et gardée durant la nuit à - 45°C. Les cellules sont alors re-suspendues dans 15 ml de TrisNaCI (50mM, pH7.9, 500mM, respectivement) puis soumises à sonication sur glace en présence inhibiteur de protéase (phenylmethanesulfonyl fluoride), leupeptine, pepstatine et aprotinine, 10μg/ml chacune). Les débris cellulaires sont enlevés lors d'une nouvelle étape de centrifugation à 13.000 g durant 15 minutes et le surnageant est immédiatement utilisé pour la purification enzymatique.
Purification des ACS8
Du fait de la présence d'une étiquette Histidine associée à chacune des ACS8, celles-ci sont purifiées en utilisant une colonne au nickel (IMi-IDA 15 ml) préalablement équilibrée avec du TRIS à PH8 (50mM) et du NaCI (500mM). Après passage de la solution contenant de l'ACS8 recombinante à purifier, la colonne est ensuite lavée avec du TRIS à PH8 (50mM) et du NaCI (500mM) additionnés d'imidazole (lOmM) jusqu'à ce qu'aucune protéine ne soit plus détectable en sortie. Les ACS8 sont alors éluées avec la même solution tampon additionnée d'imidazole à 100mM, puis dialysés (KPhos 50mM à PH8.5) avant d'être concentrées (MILLIPORE AMICON ULTRA DEVICE, 5000MWC0). La fraction concentrée (20mg/ml) de ACS8 est aliquotée et stockée avec du glycerol à -45°C. La purification de la protéine est suivie d'une électrophorèse capillaire (EXPERION DEVICE - BIO RAD) avec une puce PRO260.
Purification de l'Adenosine deaminase : 5 g de poudre de déaminase lyophilisée (SIGMA) sont resuspendus dans un bêcher avec 90ml d'eau froide auxquels sont ajoutés 47 ml d'acétone. La solution est agitée 5 minutes à 4°C puis centrifugée 1 minute à 2000g. Le culot est mixé à 33 ml d'eau, agité 5 minutes et de nouveau centrifugé, 5 minutes à 2000g. Le culot est jeté et le surnageant est additionné de 10 ml d'éthanol. La solution est agitée 5 minutes à 4°C puis centrifugée. Le surnageant est additionné de 20 ml d'éthanol. La solution est doucement agitée durant 3 heures à 4°C. La solution est centrifugée 5 minutes à 7000g et le culot est resuspendu avec 6ml d'eau. La solution est dialysée (solution d'acétate de sodium, 5mM, pH5.3) durant au moins 24 heures puis concentrée (MILLIPORE AMICON ULTRA DEVICE, 5000MWC0) et enfin aliquotée dans du glycérol (5mg/ml) afin d'être stockée à -45°C.
Activité enzymatique :
L'activité enzymatique des différentes ACS 8 est déterminée en suivant la formation de 5'-methylthioadenosine (MTA) à 265 nm en spectroscopie différentielle sur un spectrophotomètre Uvikon 940 (BIOTEK-KONTRON) : les mesures sont réalisées lors de l'incubation de S-adénosyl méthionine (60 μg) dans lOOmM de tampon KPhos (0.2ml, PH8.5) et de déaminase (8 μg) en présence ou en absence de pyridoxal5'- phosphate (0 à 300 μΜ). Les mesures sont faites dans les cuvettes de quartz du spectrophotomètre durant 3 minutes à 25°C après l'addition d'enzyme purifiée (1 à 2 μg). La conversion de MTA en dérivé inosine est suivie à 265 nm. Et l'activité spécifique est exprimée en nanomoles de MTA formée par minute et par mg de protéine. Plus particulièrement, l'activité des séquences SEQ ID N°6, N°9 (Cucumis sativus), N°15 et N°18 (Cucumis melo) est exprimée en pourcentage d'activité par rapport aux séquences SEQ ID N°3 (Cucumis sativus) et SEQ ID N°12 (Cucumis melo). Un protocole identique est utilisé pour déterminer les Vm et Km.
Exemple 9 : Etude de la cinétique d'apparition des fleurs mâles et femelles pour des plantes portant la mutation de l'invention
Les inventeurs ont étudié les cinétiques d'apparition des fleurs maies pour le mutant S295F (10 plantes homozygotes et 10 plantes hétérozygotes pour la mutation) et pour le mutant L45F (10 plantes homozygotes et 10 plantes hétérozygotes pour la mutation). Une plante est utilisée comme contrôle (10 plantes):
Les plantes sont transplantées en champs, puis, chaque matin, elles sont examinées afin de compter le nombre de nouvelles fleurs mâles :
Mutant Mutant Mutant
Mutant L45F Contrôle S295F S295F L45F
Homozygote Hétérozygote Homozygote Hétérozygote
Jour 1 0,2 0,4 0 0,1 0
Jour 2 0 0,3 0,8 0,3 0,9
Jour 3 1,0 0,3 0,8 1,0 0,7
Jour 4 0,7 1,2 1,3 1,6 0,9
Jour 5 1,9 1,6 0,9 0,9 1,6
Jour 6 2,2 2,6 1,8 1,3 1,4
Jour 7 0,7 0,7 1,4 0,9 0,7
Jour 8 0,9 0,5 0,9 0,6 0,4
Jour 9 1,9 1,1 1,6 1,6 1,6
Jour 10 1,6 1,6 1,6 1,7 1,0
Jour 11 1,4 1,9 1,6 1,7 0,7
Jour 12 1,9 0,8 1,0 1,7 1,1
Jour 13 1,6 1,4 0,7 1,3 1,9
Jour 14 0,9 0,9 0,8 1,2 0,6
Jour 15 1,1 1,5 2,1 2,3 1,1
Jour 16 5,3 3,3 5,2 4,8 3,3
Jour 17 3,3 4,7 3,8 4,4 2,1
Jour 18 4,7 4,4 4,2 4,1 3,0 Jour 19 5,0 4,5 6,1 4,6 4,0
Jour 20 7,9 6,5 7,7 7,1 3,3
Jour 21 12,0 7,7 10,0 9,6 3,9
Jour 22 6,4 4,4 9,5 9,4 4,0
Jour 23 11,1 8,0 9,5 10,5 3,1
Jour 24 14,3 10,9 11,8 11,9 4,6
Jour 25 13,8 7,5 12,4 13,8 4,6
Jour 26 14,1 8,9 22,8 13,5 6,0
Jour 27 19,4 10,5 18,5 13,4 7,0
Jour 28 30,0 19,3 25,6 24,0 12,7
Jour 29 41,1 22,3 34,6 28,8 11,7
Jour 30 35,4 25,5 31,5 29,9 14,3
Jour 31 45,6 25,8 45,0 30,3 15,9
Jour 32 43,2 25,6 41,3 35,4 17,0
Jour 33 57,2 27,4 46,4 34,6 17,3
Jour 34 70,4 34,2 54,7 41,8 25,1
Jour 35 64,7 33,6 52,2 37,9 19,4
Jour 36 71,8 31,2 60,6 39,7 18,6
Les résultats obtenus sont présentés dans la figure 4.
Les deux mutations S295F et L45F, quand présentes de manière homozygotes et hétérozygotes dans les plantes favorisent l'apparition de fleurs mâles.
Les inventeurs ont par ailleurs étudié les cinétiques d'apparition des fleurs femelles pour le mutant S295F (10 plantes homozygotes pour la mutation) et pour le mutant L45F (10 plantes homozygotes et 10 plantes hétérozygotes pour la mutation). Une plante est utilisée comme contrôle (10 plantes):
Mutant Mutant Mutant Mutant S295F L45F Contrôle S295F L45F Contrôle Homozygote Homozygote Homozygote Homozygote
Jour 1 0 0 0 Jour 19 0 0 0
Jour 2 0 0 0 Jour 20 0 0 0
Jour 3 0 0 0 Jour 21 0 0 0
Jour 4 0 0 0 Jour 22 0 0 0
Jour 5 0 0 0 Jour 23 0 0 0
Jour 6 0 0 0 Jour 24 0 0 0,1
Jour 7 0 0 0 Jour 25 0 0 0,2
Jour 8 0 0 0 Jour 26 0 0 0,1
Jour 9 0 0 0 Jour 27 0 0 0 Jour 10 0 0 0 Jour 28 0 0 0,7
Jour 11 0 0 0 Jour 29 0 0 0,4
Jour 12 0 0 0 Jour 30 0 0 0,4
Jour 13 0 0 0 Jour 31 0 0 0,4
Jour 14 0 0 0 Jour 32 0 0 0
Jour 15 0 0 0 Jour 33 0 0 1,4
Jour 16 0 0 0 Jour 34 0 0 4
Jour 17 0 0 0,2 Jour 35 0 0,1 2,4
Jour 18 0 0 0,2 Jour 36 0 0,1 1
Les résultats obtenus sont présentés dans la figure 5.
Les deux mutations S295F et L45F, quand présentes de manière homozygotes dans les plantes empêchent l'apparition de fleurs femelles.
Exemple 10 : Héritabilité du trait Les inventeurs ont souhaité étudier la transmission du phénotype androïque d'une génération à l'autre. Toutefois, de par la nature même des plantes, il est bien évidemment impossible de réaliser la fécondation d'une plante androïque par elle- même ou par une autre plante androïque.
Les inventeurs ont alors traité les plantes avec de l'éthrel, un régulateur de croissance connu pour induire des fleurs femelles chez les cucurbitacées. Les plantes ainsi traitées ont brièvement produit des fleurs femelles, suffisamment pour que qu'elles puissent être fécondées et produire des fruits. Les graines issues de ces fruits ont été plantées pour produire des plantes dont le phénotype est androïque : le phénotype androïque de la présente invention est donc héritable. Exemple 11 : détermination de l'activité enzvmatique des différentes isoformes de l'enzyme ACS8
Les inventeurs ont déterminés les caractéristiques biochimiques des différentes isoformes de l'enzyme ACS8 en présence de 5 ou de lOOpm de PLP. Il convient de noter que la concentration de PLP présente dans la cellule serait de l'ordre de 5μιτι.
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau qui suit. PLP 100μm PLP 5μπι
SEQ Vmax Vmax
Enzyme
ID N° Km (μΜ) (nmol.min" Κπι (μΜ) (nmol.min" l.mg 1) '•mg-')
3 CsACS8 25 ±6 576 ± 35 20 ±6 500 ± 35
6 Csacs8 ND ND ND ND
9 Csacs8_W58STOP ND ND ND ND
12 CmACS8 20 ± 5 607 ± 55 20 ± 5 587 ± 51
15 Cmacs8_L45F 25 ± 4 60 ± 20 23 ± 4 75 ± 20
Pas
Cmacs8_G72E 15 ± 5 600 ± 50 17 ± 5 575 ± 50 listé
18 Cmacs8_S295F 15 ± 5 400 ± 100 16 ± 5 275 ± 100
Les résultats montrent que l'activité de l'isoforme sauvage d'ACS8 chez le concombre (SEQ ID n°3) et chez le melon (SEQ ID n°12) ont une activité enzymatique comparable quel que soit les concentrations en substrat.
Les isoformes mutantes du concombre, présentant toutes deux un décalage du cadre de lecture aboutissant à l'expression d'une protéine de 151 (SEQ ID n°6) ou de 57 acides aminés (SEQ ID n°9) au lieu de 440, ne montrent elles aucune activité enzymatique.
Les isoformes mutantes du melon, mis à part l'isoforme G72E, présentent par contre une activité réduite par rapport à l'activité de l'isoforme sauvage. Plus spécifiquement, les isoformes L45F et S295F montrent une réduction de l'ordre de 90 et 50% respectivement de l'activité enzymatique par rapport à celle de l'isoforme sauvage.
Finalement, ces résultats démontrent qu'un isoforme présentant une activité enzymatique réduite d'au moins 50% par rapport à l'isoforme sauvage présente un phénotype androïque.

Claims

REVENDICATIONS
Une plante, de la famille des Cucurbitacées, laquelle plante est :
sélectionnée dans le groupe comprenant les genres Cucumis, Citrullus, Cucurbita, Luffa, Momordica et Lagenaria, à l'exclusion de l'espèce Cucumis sativus ; et
caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un allèle de ΙΊ- aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 (ACS8) non codant ou codant pour un polypeptide correspondant à un variant de l'ACS8 de référence pour ladite plante, laquelle 1-aminocyclopropane-l- carboxylate synthase 8 de référence est codée par une séquence d'acide nucléique correspondant à un allèle dominant d'ACS8 et présente une activité de transformation de la S-adénosyl méthionine en aminocyclopropane carboxylate et lequel variant présente une activité inférieure d'au moins 50% de préférence d'au moins 75% ou 90%, de manière encore préférée d'au moins 95% ou 99% par rapport à ladite 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 de référence et de manière particulièrement préférée, ledit variant présente une activité nulle.
La plante, selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est homozygote pour l'allèle de Γΐ-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 (ACS8) non codant ou codant pour un variant de l'ACS8 de référence et en ce qu'elle est, androïque.
La plante, selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle présente, en outre, au moins un premier caractère d'intérêt exprimé par ladite plante et qui lui confère des propriétés spécifiques par rapport aux autres plantes qui n'expriment pas ce caractère, tel qu'un rendement plus élevé, une moindre consommation d'eau ou encore une floraison plus précoce.
4. La plante, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par des techniques de génie génétique.
5. Une graine dont la germination conduit à une plante telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 4.
6. Un polypeptide isolé correspondant à un variant d'une 1-aminocyclopropane-l- carboxylate synthase 8 (ACS8) de référence, de plante de la famille des Cucurbitacées, laquelle 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 de référence présente une activité de transformation de la S-adénosyl méthionine en aminocyclopropane carboxylate et lequel variant présente une activité inférieure d'au moins 50%, de préférence d'au moins 75% ou 90%, de manière encore préférée d'au moins 95% ou 99% par rapport à ladite 1- aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 de référence et de manière particulièrement préférée, ledit variant présente une activité nulle.
7. Un polynucléotide codant pour un polypeptide tel que défini à la revendication 6.
8. Une cellule issue d'une plante telle que définie à l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle comprend un polypeptide selon la revendication 6 ou un polynucléotide selon la revendication 7.
9. Un procédé d'identification d'une plante possédant une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide tel que défini à la revendication 6 et comprenant les étapes de :
a) Analyse d'un échantillon comprenant des cellules d'une plante de la famille des Cucurbitacées ou des extraits de celle-ci de sorte à identifier si ladite plante comprend une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide tel que défini à la revendication 7 ; et
b) Identification d'une plante comprenant une telle séquence d'acide nucléique.
10. Le procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite plante de la famille des Cucurbitacées présente en outre au moins un premier caractère d'intérêt et en ce qu'il comprend en outre, éventuellement, une étape b') de sélection d'une plante présentant toujours ledit au moins premier caractère d'intérêt.
11. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape préalable de mutagénèse d'une plante ou d'une graine de plante de la famille des Cucurbitacées.
12. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce qu'il vise à la sélection d'une plante androïque et en ce qu'il comprend en plus des étapes :
a) Analyse d'un échantillon comprenant des cellules d'une plante de la famille des Cucurbitacées ou des extraits de celle-ci de sorte à identifier si ladite plante comprend une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide tel que défini à la revendication 6 ; et
b) Identification d'une plante comprenant une telle séquence d'acide nucléique,
les étapes de :
c) croisement de plantes présentant une séquence d' nucléique codant pour un polypeptide tel que défini à la revendication 6, et d) sélection d'une plante homozygote pour ladite séquence d'acide nucléique.
13. Un procédé selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes de :
e) croisement d'une plante présentant au moins un premier caractère d'intérêt obtenue à l'étape d) avec une plante de la famille des Cucurbitacées présentant au moins un second caractère d'intérêt ; et
f) sélection d'une plante présentant lesdits au moins premier et second caractères d'intérêts.
14. Un procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que la plante de la famille des Cucurbitacées présentant au moins un second caractère d'intérêt est gynoïque ou mâle stérile.
15. Un procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce que ledit procédé d'identification d'une plante telle que définie à la revendication 9 et de sélection d'une plante androïque et vise en outre à la production d'une graine de plante hybride et en ce qu'il comprend, outre les étapes a), b), c), d), e) et f), les étapes de :
g) Planter un champ alternativement avec les plantes androïques telles que définies à l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou à tendance androïque, laquelle plante à tendance androïque est hétérozygote pour l'allèle muté de Π-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 (ACS8) non codant ou codant pour un variant de l'ACS8 de référence et laquelle plante à tendance androïque porte plus de fleurs mâles que la même plante sauvage monoïque ou andromonoïque n'ayant pas ledit allèle muté, et des plantes gynoïques et/ou mâles stériles telles que définies à la revendication 14 ;
h) Récolter les fruits des plantes gynoïques et/ou mâles stériles obtenus après pollinisation ; et i) Extraire les graines desdits fruits.
16. Une graine, de préférence hybride, de plante obtenue selon le procédé de la revendication 15 dont la germination conduit à une plante telle que définie à l'étape f) de la revendication 13 et caractérisée en ce qu'elle comprend un polypeptide selon la revendication 6 ou un polynucléotide selon la revendication 7.
17. Une plante, de la famille des cucurbitacées, sélectionnée dans le groupe comprenant les genres Cucumis, Citrullus, Cucurbita, Luffa, Momordica et Lagenaria, à l'exclusion de l'espèce Cucumis sativus, susceptible d'être obtenue par un procédé selon la revendication 15, et caractérisée en ce qu'elle est androïque.
18. Utilisation, pour la sélection de plantes androïques de la famille des Cucurbitacées, de sondes ou d'amorces permettant la détection d'un polynucléotide tel que défini à la revendication 7 dans un échantillon comprenant des cellules d'une telle plante ou des extraits de celles-ci.
19. Utilisation, pour la sélection de plantes androïques de la famille des Cucurbitacées, d'anticorps permettant la détection d'un polypeptide tel que défini à la revendication 6 dans un échantillon comprenant des cellules d'une telle plante ou des extraits de celles-ci.
20. Un procédé de production d'une plante androïque de ia famiiie des cucurbitacées, ledit procédé comprenant les étapes de : a) Obtention d'une plante de la famille des cucurbitacées, préférentiellement sélectionnée dans le groupe comprenant les genres Cucumis,Citrullus, Cucurbita, Luffa, Momordica et Lagenaria,
b) Inhibition de la 1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 (ACS8) de ladite plante.
21. Un procédé de production d'une plante androïque ou à tendance androïque de la famille des Cucurbitacées, ledit procédé comprenant les étapes de :
a) Obtention d'une plante de la famille des Cucurbitacées, laquelle plante est sélectionnée dans le groupe comprenant les genres Cucumis,Citrullus, Cucurbita, Luffa, Momordica et Lagenaria,
b) Mise en évidence de la présence d'au moins un allèle de ΙΊ- aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 (ACS8) non codant ou codant pour un polypeptide selon la revendication 6,
c) Etude de l'activité de transformation de la S-adénosyl méthionine en aminocyclopropane carboxylate de ΙΊ- aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 codée par ledit allèle,
d) Sélection d'une plante présentant une activité de transformation de la S-adénosyl méthionine en aminocyclopropane carboxylate et lequel variant présente une activité inférieure d'au moins 50% de préférence d'au moins 75% ou 90%, de manière encore préférée d'au moins 95% ou 99% par rapport à ladite 1-aminocyclopropane-l- carboxylate synthase 8 de référence et de manière particulièrement préférée, iedit variant présente une activité nulle.
22. Un procédé de propagation d'une plante homozygote androïque, comprenant les étapes de :
a) traitement de plantes androïques homozygotes pour un allèle de l'1-aminocyclopropane-l-carboxylate synthase 8 (ACS8) non codant ou codant pour un polypeptide selon la revendication 6, avec de l'éthéphon pour générer des fleurs femelles,
b) Autopollinisation des plants obtenues à l'étape a), et c) récolte des graines.
23. Un procédé de production d'une graine de plante hybride, diploïde ou triploïde, comprenant les étapes de :
a. planter un champ alternativement avec les plantes androïques et/ou à tendance androïque , laquelle plante à tendance androïque est hétérozygote pour l'allèle muté de l'l-aminocyclopropane-1- carboxylate synthase 8 (ACS8) non codant ou codant pour un variant de l'ACS8 de référence et laquelle plante à tendance androïque porte plus de fleurs mâles que la même plante sauvage monoïque ou andromonoïque n'ayant pas ledit allèle muté, comprenant un premier caractère d'intérêt et des plantes gynoïques et/ou mâles stériles comprenant un deuxième caractère d'intérêt ; b. récolter les fruits des plantes obtenus après pollinisation, et c. extraire les graines desdits fruits.
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