WO2013178631A1 - Nanoparticules ciblantes pour une application biologique - Google Patents

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Nicolas ATRUX-TALLAU
Thomas Delmas
Mathieu Goutayer
Audrey Royere
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Definitions

  • the present invention relates to targeting nanoparticles for biological application.
  • nanoparticles for the vectorization of active principles is of major interest because they constitute a promising solution for improving the effectiveness of the active ingredients, whether in the cosmetic, dermopharmaceutical or pharmaceutical field.
  • said outer membrane constitutes an aqueous phase (A 2 ), comprising the hydrophilic part of said surfactant;
  • the nanoparticle comprises a core consisting of a lipid phase (L1 or an aqueous phase (A ⁇ .
  • said outer membrane when said core consists of a lipid phase (Li), said outer membrane constitutes an aqueous phase (A 2 ), comprising the hydrophilic part of said surfactant; and
  • said core consists of an aqueous phase (A 1), said outer membrane constituting a lipid phase (L ' 2 ), comprising the lipophilic portion of said surfactant.
  • the water-soluble surfactants are preferably alkoxylated and preferably comprise at least one hydrophilic chain composed of ethylene oxide units (PEO or PEG) or of ethylene oxide and propylene oxide.
  • PEO ethylene oxide units
  • PEG polyethylene oxide units
  • propylene oxide ethylene oxide units
  • the number of such units in the chain ranges from 2 to 500
  • the hydrophobic portion preferably comprising fatty acids having a number of carbon atoms ranging from 6 to 50.
  • the nanoparticle may contain the active agent in the form of a pure liquid, or a solution of the active agent in a liquid solvent, or a dispersion of the active agent in a liquid. It can also be molecularly dispersed in the heart, be in the form of microcrystals or in the form of amorphous aggregates.
  • the nanoparticle is placed in a continuous phase and forms with it a nanoemulsion.
  • nanoemulsion means a composition having at least one lipid phase and at least one aqueous phase, one of the two phases being the dispersed phase and the other the continuous phase, in which the average size of the drops of the dispersed phase is less than 1 ⁇ , advantageously between 10 and 500 nm, and for which the lipids are in a liquid state.
  • lipid a lipid having an affinity with another lipid sufficient to allow solubilization.
  • the solubilizing lipid used is advantageously chosen as a function of the lipids and / or the active substances to be solubilized. It generally has a close chemical structure, in order to ensure the desired solubilization. It can be an oil or a wax. Preferably the solubilizing lipid is solid at room temperature (20 ' ⁇ ) but liquid at body temperature (37 ⁇ ).
  • the solubilizing lipid may also be selected from oils.
  • excipients may be added, either in the composition of the nanoparticle itself, or in the continuous phase if the nanoparticle is contained in a nanoemulsion.
  • excipients may be of different types, and in particular chosen from dyes, flavors, perfumes, stabilizers, preservatives, emulsifiers, thickeners or other active agents, in an appropriate amount.
  • the targeting ligand is a biomolecule selected from the group consisting of peptides, proteins and enzymes.
  • the targeting ligand is a lipidized peptide such as a pamitoyl-peptide, an acetyl-peptide or an undecenoyl-dipeptide.
  • the lipid character comes from the grafting on the peptide of a lipid such as a fatty acid and in particular acetic acid or palmitic acid.
  • the preparation of the lipid phase comprises, in particular, the incorporation of the constituents of the core which will form the lipid phase (L 1).
  • the surfactant is included in the phase in which it is the Typically, a water-soluble surfactant is incorporated into the aqueous phase and a liposoluble surfactant is incorporated into the lipid phase.
  • the targeting ligand and the active agent are also incorporated into one or other of the two phases. depending on their predominantly hydrophilic or lipophilic character.
  • Sonication involves the use of ultrasound, usually using an ultrasonic bath, to agitate particles of a sample, for example to break up molecular aggregates or cell membranes, and in particular to reduce particle size .
  • Obtaining nanoscale particles generally requires the use of more powerful sonicators such as sonotrode sonicators of Hielsher or Ultrasonics type.
  • Microfluidization involves the use of high pressure to force a fluid into micro-channels of particular configuration and emulsify by a mechanism that combines cavitation, shear and impact effects.
  • the present invention also relates to the use of a lipid nanoparticle or an aqueous nanoparticle according to the invention for the preparation of a cosmetic, dermopharmaceutical or pharmaceutical composition.
  • lipid nanoparticle or an aqueous nanoparticle according to the invention for the preparation of a pharmaceutical composition for topical application.
  • Teneliderm® is the targeting ligand, it is a hyaluronic acid lipidized with caproic acid.
  • CD44 is a transmembrane receptor for glycosaminoglycans, including hyaluronic acid, with which it has a high affinity.
  • Teneliderm® is introduced into the fatty phase.

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Description

Nanoparticules ciblantes pour une application biologique
La présente invention concerne des nanoparticules ciblantes pour une application biologique.
A l'heure actuelle, l'utilisation de nanoparticules pour la vectorisation de principes actifs suscite un intérêt majeur car elles constituent une solution prometteuse pour améliorer l'efficacité des principes actifs, que ce soit dans le domaine cosmétique, dermo- pharmaceutique ou pharmaceutique.
Afin d'assurer une délivrance des principes actifs au niveau de leur site d'action biologique, il est nécessaire de cibler les nanoparticules dans lesquelles ils sont encapsulés, vers le site d'intérêt. Dans ce but, il est connu de doter ces nanoparticules de ligands de ciblage, permettant de favoriser l'interaction entre la nanoparticule et le milieu biologique ciblé.
Ces ligands de ciblage sont généralement greffés sur ces nanoparticules, suite à la fabrication de celles-ci, ce qui nécessite une étape de chimie de synthèse en surface des particules et souvent l'utilisation de solvants et/ou des étapes supplémentaires de purification. Cette approche est donc coûteuse en temps, ainsi qu'en ressources matérielles et humaines, et nécessite par ailleurs un contrôle très strict de la qualité du produit final.
De plus, ces nanoparticules possèdent généralement à leur surface une couronne de chaînes de molécules qui peut avoir diverses fonctions et notamment celle de stabiliser les nanoparticules. Ainsi, les ligands de ciblage sont généralement greffés à l'extrémité de ces chaînes, afin d'être exposés à la surface de cette couronne et non enfouis à l'intérieur, ce qui impose des contraintes supplémentaires lors de la fabrication des nanoparticules.
Par conséquent, il serait particulièrement intéressant de pouvoir doter des nanoparticules de propriétés ciblantes sans être contraint de positionner les ligands de ciblage à la surface des nanoparticules par greffage et de disposer d'un procédé plus simple et moins coûteux permettant de préparer de telles nanoparticules ciblantes.
La présente invention a pour but de fournir des nanoparticules dotées de propriétés ciblantes grâce à la présence de ligands de ciblage qui ne sont pas localisés à leur surface. La présente invention a également pour but de fournir un procédé de préparation de ces nanoparticules permettant de les doter de propriétés ciblantes de manière simple et à coût réduit.
Ainsi, la présente invention concerne une nanoparticule comprenant :
- un cœur constitué d'une phase lipidique (Li) ou d'une phase aqueuse (Ai) ; au moins un agent tensioactif comprenant une partie hydrophile et une partie lipophile ;
une membrane interne entourant ledit coeur ;
une membrane externe entourant ladite membrane interne ; et - au moins un ligand de ciblage comprenant une partie lipophile et une partie hydrophile ;
dans laquelle :
lorsque ledit cœur est constitué d'une phase lipidique (L^ :
ladite membrane interne constitue une phase lipidique (L2), comprenant la partie lipophile dudit agent tensioactif ;
ladite membrane externe constitue une phase aqueuse (A2), comprenant la partie hydrophile dudit agent tensioactif ; et
ledit ligand de ciblage est tel que sa partie lipophile est dans ladite phase lipidique (L2) et sa partie hydrophile est de longueur inférieure à l'épaisseur de ladite membrane externe, dans ladite phase aqueuse (A2) ; lorsque ledit cœur est constitué d'une phase aqueuse (Ai) :
ladite membrane interne constitue une phase aqueuse (A'2), comprenant la partie hydrophile dudit agent tensioactif ; et
ladite membrane externe constitue une phase lipidique (L'2), comprenant la partie lipophile dudit agent tensioactif.
La présente invention concerne donc une nanoparticule comprenant :
un cœur constitué d'une phase lipidique (L^ ;
au moins un agent tensioactif comprenant une partie hydrophile et une partie lipophile ;
- une membrane interne entourant ledit coeur et constituant une phase lipidique (L2), comprenant la partie lipophile dudit agent tensioactif ;
une membrane externe entourant ladite membrane interne et constituant une phase aqueuse (A2), comprenant la partie hydrophile dudit agent tensioactif ; et au moins un ligand de ciblage comprenant une partie lipophile et une partie hydrophile, dont ladite partie lipophile est dans ladite phase lipidique (L2) et dont ladite partie hydrophile est de longueur inférieure à l'épaisseur de ladite membrane externe, dans ladite phase aqueuse (A2).
Selon un mode de réalisation, la membrane externe constituant une phase aqueuse (A2) possède une épaisseur comprise de 1 à 7 nm, avantageusement de 1 ,5 à 6 nm, de préférence de 2 à 5 nm, et la partie hydrophile du ligand de ciblage située dans la phase aqueuse (A2) possède une longueur comprise de 0,2 à 5 nm, avantageusement de 0,5 à 4 nm, de préférence de 0,5 à 3 nm.
La présente invention concerne également une nanoparticule comprenant :
un cœur constitué d'une phase aqueuse (A^ ;
- au moins un agent tensioactif comprenant une partie hydrophile et une partie lipophile ;
une membrane interne entourant ledit cœur et constituant une phase aqueuse (A'2), comprenant la partie hydrophile dudit agent tensioactif ;
une membrane externe entourant ladite membrane interne et constituant une phase lipidique (L'2), comprenant la partie lipophile dudit agent tensioactif ; et au moins un ligand de ciblage comprenant une partie lipophile et une partie hydrophile.
Ainsi, dans le cas où le cœur est constitué d'une phase lipidique (l_i), la membrane interne constitue une phase lipidique (L2), la membrane externe constitue une phase aqueuse (A2) et la nanoparticule est qualifiée de « nanoparticule lipidique » car elle est essentiellement constituée de lipides.
Dans le cas où le cœur est constitué d'une phase aqueuse (Ai), la membrane interne constitue une phase aqueuse (A'2), la membrane externe constitue une phase lipidique (L'2) et la nanoparticule est qualifiée de « nanoparticule aqueuse » car elle est essentiellement constituée d'eau.
Dans le cadre de la présente description, on entend par « nanoparticule » un assemblage d'atomes dont au moins une des trois dimensions se situe à l'échelle nanométrique. Plus particulièrement, on désigne ici des objets de taille comprise de 10 à 1000 nm.
Selon l'invention, la nanoparticule comprend un cœur constitué d'une phase lipidique (L^ ou d'une phase aqueuse (A^.
Dans le cadre de la présente description, on entend par « phase lipidique » une phase ayant la propriété de solubiliser des composés apolaires, tels que des lipides, des corps gras, des huiles.
Au sens de la présente invention, le terme « lipide » désigne l'ensemble des corps gras ou des substances contenant des acides gras présents dans les graisses d'origine animale et dans les huiles végétales. Ce sont de petites molécules hydrophobes ou amphiphiles principalement constituées de carbone, d'hydrogène et d'oxygène et ayant une densité inférieure à celle de l'eau. Les lipides peuvent se présenter à l'état solide, comme dans les cires, ou liquide, comme dans les huiles.
Par ailleurs, on entend par « phase aqueuse » une phase comprenant de l'eau et ayant la propriété de solubiliser des composés polaires.
La nanoparticule comprend en outre un ou plusieurs agents tensioactifs.
Dans le cadre de la présente description, on entend par « agent tensioactif » une molécule amphiphile présentant deux parties de polarité différente, l'une lipophile et apolaire, l'autre hydrophile et polaire. Un agent tensioactif peut être de type ionique (cationique ou anionique), zwitterionique ou non-ionique.
Au sens de la présente invention, on qualifie d'« hydrophile » une structure chimique ayant une affinité pour l'eau. Si, de plus, cette structure peut se dissoudre dans l'eau, elle est qualifiée d'« hydrosoluble ».
Par ailleurs, on qualifie de « lipophile » une structure chimique ayant une affinité avec les solvants organiques et les lipides (huiles et/ou cires) et évitant d'être en contact avec un solvant polaire, comme l'eau. Un composé lipophile qui est soluble dans les lipides est qualifié de « liposoluble ».
L'agent tensioactif est avantageusement un tensioactif anionique, un tensioactif nonionique, un tensioactif cationique ou un mélange de ceux-ci. La masse moléculaire de l'agent tensioactif est comprise entre 150 g/mol et 10000 g/mol, avantageusement entre 250 g/mol et 1500 g/mol.
Dans le cas où le tensioactif est un tensioactif anionique, il est par exemple choisi parmi les alkylsulfates, alkylsulfonates, alkylarylsulfonates, alkylphosphates alcalins, dialkylsulfosuccinates et les sels d'alcalino-terreux d'acides gras saturés ou non. Ces tensioactifs présentent avantageusement au moins une chaîne hydrocarbonée hydrophobe présentant un nombre d'atomes de carbone supérieur à 5, voire 10 et au moins un groupement anionique hydrophile, tel qu'un sulfate, un sulfonate ou un carboxylate lié à une extrémité de la chaîne hydrophobe.
Dans le cas où le tensioactif est un tensioactif cationique, il est par exemple choisi parmi un sel d'halogénure d'alkylpyridium ou d'alkylammonium comme le chlorure ou le bromure de n-éthyldodecylammonium, le chlorure ou le bromure de cétylammonium (CTAB). Ces tensioactifs présentent avantageusement au moins une chaîne hydrocarbonée hydrophobe présentant un nombre d'atomes de carbone supérieur à 5, voire 10 et au moins un groupement cationique hydrophile, tel qu'un cation d'ammonium quaternaire. Dans le cas où le tensioactif est un tensioactif non-ionique, il est par exemple choisi parmi des dérivés polyoxyéthylénés et/ou polyoxypropylénés des alcools gras, des acides gras, ou des alkylphénols, des arylphénols, ou parmi des alkyls glucosides, des polysorbates, des cocamides, des esters de saccharose.
De préférence, les agents tensioactifs présents dans la nanoparticule sont choisis parmi des tensioactifs non-ioniques comprenant une longue chaîne polymérique de type oxyde de polyéthylène (PEG). Ces chaînes se positionnent à la surface de la nanoparticule et permettent alors de la stabiliser.
Les agents tensioactifs peuvent également être choisis parmi les lipides amphiphiles.
Les lipides amphiphiles comportent une partie hydrophile et une partie lipophile. Ils sont généralement choisis parmi les composés dont la partie lipophile comprend une chaîne saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, ayant de 8 à 30 atomes de carbone. Ils peuvent être choisis parmi les phospholipides, les cholestérols, les lysolipides, les sphingomyélines, les tocophérols, les glucolipides stéarylamines, les cardiolipines d'origine naturelle ou synthétique ; les molécules composées d'un acide gras couplé à un groupement hydrophile par une fonction éther ou ester tels que les esters de sorbitan comme par exemple les monooléates et monolaurates de sorbitan vendus sous les dénominations Span® par la société ICI ; les lipides polymérisés ; les lipides conjugués à de courtes chaînes d'oxyde de polyéthylène (PEG) tels que les tensioactifs non-ioniques vendus sous les dénominations commerciales Tween® par la société ICI Americas, Inc. Et Triton X-100® par la société Union Carbide Corp. ; les esters de sucre tels que les mono- et di-laurates, mono- et di-palmitates, mono- et distéarates de saccharose ; lesdits tensioactifs pouvant être utilisés seuls ou en mélanges tels que Cosbiol® de chez Laserson.
La teneur massique en agent tensioactif est par exemple de 1 à 60%, avantageusement de 5 à 50%, de préférence de 10 à 40% du poids total de la nanoparticule.
Selon l'invention, la nanoparticule comprend en outre une membrane interne entourant ledit cœur :
lorsque ledit cœur est constitué d'une phase lipidique (L^, ladite membrane interne constitue une phase lipidique (L2), comprenant la partie lipophile dudit agent tensioactif ; et
lorsque ledit cœur est constitué d'une phase aqueuse (A^, ladite membrane interne constitue une phase aqueuse (A'2), comprenant la partie hydrophile dudit agent tensioactif. Au sens de la présente invention, le terme « entourer » correspond à l'action de recouvrir totalement. Ce terme peut également être substitué par le terme « encapsuler ».
Ainsi, la membrane interne recouvre la totalité de la surface externe du cœur. La nanoparticule comprend également une membrane externe entourant ladite membrane interne :
lorsque ledit cœur est constitué d'une phase lipidique (Li), ladite membrane externe constitue une phase aqueuse (A2), comprenant la partie hydrophile dudit agent tensioactif ; et
lorsque ledit cœur est constitué d'une phase aqueuse (A^, ladite membrane externe constituant une phase lipidique (L'2), comprenant la partie lipophile dudit agent tensioactif.
La membrane externe recouvre ainsi la totalité de la surface externe de la membrane interne.
La membrane externe pourra également être désignée par « couronne ».
Comme indiqué plus haut, selon un mode de réalisation, lorsque le cœur est constitué d'une phase lipidique (L^, la membrane externe constituant une phase aqueuse (A2) possède une épaisseur comprise de 1 à 7 nm, avantageusement de 1 ,5 à 6 nm, de préférence de 2 à 5 nm.
L'épaisseur de la membrane externe est mesurée par diffraction de neutrons aux petits angles (SANS, Small Angle Neutron Scattering).
En jouant sur la composition de la phase continue dans laquelle les nanoparticules sont dispersées, en termes de mélange H20/D20, il est possible de mesurer la taille de la nanoparticule d'une part, et la taille de la nanoparticule sans la couronne d'autre part, en annulant le contraste entre la phase continue externe et la couronne. Dès lors, il est possible d'en extraire une mesure de l'épaisseur e de la couronne :
e = R(nanoparticule)— R(nanoparticule sans couronne)
Lorsque la membrane, interne ou externe selon le cas, constitue une phase lipidique (L2) ou (L'2), celle-ci est essentiellement formée par les parties lipophiles des tensioactifs, notamment des tensioactifs liposolubles.
Dans le cadre de la présente description, on entend par « tensioactif liposoluble » un tensioactif dont la partie lipophile est plus longue que la partie hydrophile, lui conférant ainsi un caractère liposoluble.
Selon un mode de réalisation, les tensioactifs liposolubles sont des phospholipides. Les phospholipides sont des lipides amphiphiles possédant un groupe phosphate, notamment les phosphoglycérides. Ils comportent le plus souvent une extrémité hydrophile formée par le groupe phosphate éventuellement substitué qui se positionnera spontanément dans la phase aqueuse (A2) ou (A'2) et deux extrémités hydrophobes formées par des chaînes d'acides gras qui se positionneront spontanément dans la phase lipidique (L2) ou (L'2).
Parmi les phospholipides, on peut citer la phosphatidylcholine, la phosphatidyl éthanolamine, la phosphatidyl inositol, la phosphatidyl sérine et la sphingomyéline.
Lorsque la membrane, interne ou externe selon le cas, constitue une phase aqueuse (A2) ou (A'2), celle-ci est essentiellement formée par les parties hydrophiles des tensioactifs, notamment des tensioactifs hydrosolubles.
Dans le cadre de la présente description, on entend par « tensioactif hydrosoluble » un tensioactif dont la partie hydrophile est plus longue que la partie lipophile, lui conférant ainsi un caractère hydrosoluble.
Les tensioactifs hydrosolubles sont de préférence alkoxylés et comportent de préférence au moins une chaîne hydrophile composée de motifs d'oxyde d'éthylène (PEO ou PEG) ou d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène. De préférence, le nombre de ces motifs dans la chaîne varie de 2 à 500, la partie hydrophobe comprenant de préférence des acides gras possédant un nombre d'atomes de carbone allant de 6 à 50.
A titre d'exemple de tensioactifs, on peut en particulier citer les composés conjugués polyéthylèneglycol/phosphatidyl-éthanolamine (PEG-PE), les éthers d'acide gras et de polyéthylèneglycol tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Brij® (par exemple Brij® 35, 58, 78 ou 98) par la société ICI Americas Inc., les esters d'acide gras et de polyéthylèneglycol tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Myrj® par la société Croda (par exemple Myrj® S 20, 40, 50, ou 100) et les copolymères blocs d'oxyde d'éthylène et d'oxyde de propylène tels que les produits vendus sous les dénominations commerciales Pluronic® par la société BASF AG (par exemple Pluronic® F68, F127, L64, L61 , 10R4, 17R2, 17R4, 25R2 ou 25R4 ) ou les produits vendus sous la dénomination commerciale Synperonic® par la société Unichema Chemie BV (par exemple Synperonic® PE/F68, PE/L61 ou PE/L64).
On peut également mentionner les APG (alkyl polyglycoside), les alkyl polyglycérols et les esters de saccharose.
Selon un mode de réalisation, la partie hydrophile des tensioactifs hydrosolubles est formée de chaînes de polyéthylène glycol (PEG). Ces chaînes de PEG créent une gêne stérique permettant d'éviter la coalescence des nanoparticules et donc de les stabiliser. Par ailleurs, ces composés peuvent conférer un caractère furtif à la nanoparticule en leurrant les défenses immunitaires de l'organisme.
Selon l'invention, la nanoparticule comprend au moins un ligand de ciblage comprenant une partie lipophile et d'une partie hydrophile telles que lorsque ledit cœur est constitué d'une phase lipidique (l_i), ladite partie lipophile est dans la phase lipidique (L2) et ladite partie hydrophile est de longueur inférieure à l'épaisseur de ladite membrane externe, dans la phase aqueuse (A2).
Comme indiqué plus haut, selon un mode de réalisation, lorsque le cœur est constitué d'une phase lipidique (l_i), la partie hydrophile du ligand de ciblage située dans la phase aqueuse (A2) possède une longueur comprise de 0,2 à 5 nm, avantageusement de 0,5 à 4 nm, de préférence de 0,5 à 3 nm.
Dans le cadre de la présente description, on entend par « ligand de ciblage » une molécule possédant une interaction spécifique avec un autre composé, tel qu'un récepteur présent à la surface de la cellule ou du tissu ciblé.
Le terme « spécifique » signifie que le ligand établit une liaison substantiellement plus forte avec la cellule ou le tissu ciblé qu'avec les cellules et tissus non ciblés.
Un ligand de ciblage est par exemple un anticorps, un peptide, un saccharide, un aptamère, un oligonucléotide ou un peptidomimétique.
Le ligand de ciblage pourra également être désigné par les termes « molécule de ciblage » ou « molécule ciblante ».
Dans le cas d'une nanoparticule aqueuse, la partie hydrophile du ligand de ciblage qui est typiquement la partie permettant de cibler les sites biologiques d'intérêt est enfouie dans la membrane interne et donc non exposée à la surface de la nanoparticule.
Dans le cas d'une nanoparticule lipidique, du fait de la longueur de sa partie hydrophile et de l'épaisseur de la membrane externe, l'extrémité externe du ligand de ciblage est située dans la membrane externe et non exposée à la surface de la nanoparticule, contrairement aux nanoparticules dotées de ligands de ciblage connues jusqu'à présent.
En effet, par exemple la demande FR2935001 décrit des émulsions fluorescentes de type huile-dans-eau dont les gouttelettes d'huile sont stabilisées par une couche tensioactive comprenant éventuellement un agent de ciblage. Celui-ci comprend un co- tensioactif de greffage amphiphile dont la partie hydrophile est liée à un ligand biologique, positionné à la surface des gouttelettes.
De manière surprenante, le fait que le ligand de ciblage ne soit pas exposé à la surface de la nanoparticule n'empêche pas le ciblage cellulaire. Le ligand de ciblage permet ainsi aux nanoparticules de l'invention de mieux cibler des sites biologiques d'intérêt que des nanoparticules dépourvues de tels ligands, et ce comme démontré plus loin dans les exemples.
Selon un mode de réalisation, la nanoparticule comprend au moins un agent actif. Dans le cadre de la présente description, on entend par « agent actif » un composé ayant un effet physiologique bénéfique sur l'élément sur lequel il agit. Il vise par exemple à protéger, maintenir en bon état, soigner, guérir, parfumer, aromatiser ou colorer.
L'agent actif est avantageusement un agent cosmétique, dermo-pharmaceutique ou pharmaceutique.
La nanoparticule peut contenir l'agent actif sous forme de liquide pur, ou une solution de l'agent actif dans un solvant liquide, ou une dispersion de l'agent actif dans un liquide. Il peut également être moléculairement dispersé dans le cœur, être sous la forme de microcristaux ou encore sous la forme d'agrégats amorphes.
Au sens de la présente invention, l'expression « moléculairement dispersé dans le cœur » désigne le fait d'être solubilisé sous la forme de molécules isolées dans le cœur.
Un agent actif lipophile sera préférentiellement incorporé dans une nanoparticule lipidique, tandis qu'un agent actif hydrophile sera préférentiellement incorporé dans une nanoparticule aqueuse.
Lorsque l'agent actif est un agent cosmétique, il peut être choisi parmi le hyaluronate de sodium ou d'autres molécules hydratantes/réparatrices, des vitamines, des enzymes, des actifs anti-rides, anti-âge, protecteurs/antiradicalaires, antioxydants, apaisants, adoucissants, anti irritants, tenseurs/lissants, émollients, amincissants, anti capitons, raffermissants, gainants, drainants, anti-inflammatoires, dépigmentants, blanchissants, autobronzants, exfoliants, stimulant le renouvellement cellulaire ou stimulant la microcirculation cutanée, absorbant ou filtrant les UV, antipelliculaires.
Un agent cosmétique est par exemple cité dans la Directive 93/35/CEE du Conseil datée du 14 juin 1993. Ce produit est par exemple une crème, une émulsion, une lotion, un gel et une huile pour la peau (mains, visage, pieds, etc.), un fond de teint (liquide, pâte) une préparation pour bains et douches (sels, mousses, huiles, gels, etc.), un produit de soins capillaires (teintures capillaires et décolorants), un produit de nettoyage (lotions, poudres, shampoings), un produit d'entretien pour la chevelure (lotions, crèmes, huiles), un produit de coiffage (lotions, laques, brillantines), un produit pour le rasage (savons, mousses, lotions, etc.), un produit destiné à être appliqué sur les lèvres, un produit solaire, un produit de bronzage sans soleil, un produit permettant de blanchir la peau, un produit antirides.
Les agents dermo-pharmaceutiques désignent plus particulièrement les agents agissant au niveau de la peau.
Lorsque l'agent actif est un agent pharmaceutique, il est choisi avantageusement parmi les anticoagulants, les anti-thrombogéniques, les agents anti-mitotiques, les agents anti-prolifération, antiadhésion, anti-migration, les promoteurs d'adhésion cellulaire, les facteurs de croissance, les molécules antiparasitaires, les anti-inflammatoires, les angiogéniques, les inhibiteurs de l'angiogenèse, les vitamines, les hormones, les protéines, les antifongiques, les molécules antimicrobiennes, les antiseptiques ou les antibiotiques.
Le ligand de ciblage peut également être un agent actif tel que défini ci-dessus.
De préférence, les nanoparticules ont un diamètre compris de 10 à 1000 nm, avantageusement compris de 20 à 200 nm.
La taille des nanoparticules est mesurée par diffusion de la lumière. On utilise par exemple un Zeta Sizer Nano ZS (Malvern Instrument). Le principe repose sur une mesure du temps caractéristique de diffusion des particules par le mouvement brownien pour en déduire leur taille. Cette méthode est notamment décrite par le fournisseur de l'appareil de mesure utilisé :
http://www.malverninstruments.fr/labfre/products/zetasizer/zetasizer_nano/zetasizer_nano _zs.htm.
Selon un mode de réalisation, les nanoparticules sont des nanoparticules de lipides solides, des micelles ou des liposomes.
Dans le cadre de la présente description, on entend par « nanoparticule de lipides solides » une nanoparticule dans laquelle les lipides sont dans un état solide.
Dans le cadre de la présente description, on entend par « micelle » un agrégat sphéroïdal de molécules amphiphiles possédant une tête polaire hydrophile et une chaîne hydrophobe, qui se forme lorsque la concentration en molécules amphiphiles dépasse un certain seuil, appelé concentration micellaire critique (C.M.C.).
Plus particulièrement, on parle de « micelle directe » si la phase continue dans laquelle se trouve la nanoparticule est polaire telle que l'eau, car les molécules disposent leur partie hydrophile à la surface, et leur partie hydrophobe dans le cœur de la micelle.
En revanche, on parle de « micelle inverse » si la phase continue est apolaire telle que l'huile, car les parties hydrophobes sont à l'extérieur. Les nanoparticules de l'invention sont par exemple des micelles directes.
Dans le cadre de la présente description, on entend par « liposome » une vésicule artificielle formée par des bicouches lipidiques concentriques, emprisonnant entre elles des compartiments aqueux. Les liposomes sont généralement obtenus avec des lipides amphiphiles tels que les phospholipides.
Selon un mode de réalisation, la nanoparticule est placée dans une phase continue et forme avec elle une nanoémulsion. Dans le cadre de la présente description, on entend par « nanoémulsion » une composition présentant au moins une phase lipidique et au moins une phase aqueuse, l'une des deux phases étant la phase dispersée et l'autre la phase continue, dans laquelle la taille moyenne des gouttes de la phase dispersée est inférieure à 1 μηι, avantageusement comprise de 10 à 500 nm, et pour laquelle les lipides sont dans un état liquide.
Dans le cas où la nanoparticule est lipidique, la phase continue est aqueuse et la nanoémulsion est qualifiée de « nanoémulsion directe ».
Dans le cas où la nanoparticule est aqueuse, la phase continue est lipidique et la nanoémulsion est qualifiée de « nanoémulsion inverse ».
La phase continue de la nanoémulsion peut comprendre un agent actif.
Il est ainsi possible d'associer des agents actifs initialement incompatibles, en incorporant par exemple dans une nanoémulsion directe à la fois un agent actif lipophile dans la nanoparticule lipidique, et un agent actif hydrophile dans la phase continue aqueuse.
Dans le cas d'une nanoémulsion directe, la phase lipidique (L^ constituant le cœur pourra comprendre des agents tensioactifs liposolubles solubilisés, éventuellement sous forme de micelles, et la phase continue aqueuse pourra comprendre des agents tensioactifs hydrosolubles solubilisés, éventuellement sous forme de micelles.
Dans le cas d'une nanoémulsion inverse, la phase aqueuse (Ai) constituant le coeur pourra comprendre des agents tensioactifs hydrosolubles solubilisés, éventuellement sous forme de micelles, et la phase continue lipidique pourra comprendre des agents tensioactifs liposolubles solubilisés, éventuellement sous forme de micelles.
Selon un mode de réalisation, la phase lipidique (l_i) et/ou la phase lipidique (L2) ou (L'2) des nanoparticules comprend au moins un agent actif tel que défini plus haut, notamment un agent cosmétique, dermo-pharmaceutique ou pharmaceutique.
L'agent actif peut donc être présent uniquement dans la phase lipidique (L^.
L'agent actif peut également être présent uniquement dans la phase lipidique (L2) ou (L'2).
Enfin, l'agent actif peut être présent dans chacune des deux phases lipidiques (L^ et (L2) ou (L'2), auquel cas il peut être identique ou différent d'une phase à l'autre.
L'agent actif peut être sous forme d'un unique agent actif ou d'un mélange de plusieurs agents actifs.
Selon un mode de réalisation, la phase aqueuse (A^ et/ou la phase aqueuse (A2) ou (A'2) des nanoparticules comprend au moins un agent actif tel que défini plus haut, notamment un agent cosmétique, dermo-pharmaceutique ou pharmaceutique. L'agent actif peut donc être présent uniquement dans la phase aqueuse (Ai).
L'agent actif peut également être présent uniquement dans la phase aqueuse (A2) ou (A'2).
Enfin, l'agent actif peut être présent dans chacune des deux phases aqueuses (Ai) et (A2) ou (A'2), auquel cas il peut être identique ou différent d'une phase à l'autre.
L'agent actif peut être sous forme d'un unique agent actif ou d'un mélange de plusieurs agents actifs.
Selon un mode de réalisation, le ligand de ciblage est également un agent actif tel que défini plus haut. Dans ce cas particulier, l'agent actif est présent à la fois dans la phase lipidique (L2) ou (L'2) et dans la phase aqueuse (A2) ou (A'2), respectivement.
Plus généralement, si l'agent actif possède un caractère amphiphile, sa partie lipophile sera positionnée dans la phase lipidique (L2) ou (L'2) et sa partie hydrophile dans la phase aqueuse (A2) ou (A'2), donc l'agent actif sera présent dans ces deux phases.
Selon un mode de réalisation, la phase lipidique (L^ et/ou la phase lipidique (L2) ou (L'2) comprend au moins un lipide solubilisant.
Le lipide solubilisant peut donc être présent uniquement dans la phase lipidique
Le lipide solubilisant peut également être présent uniquement dans la phase lipidique (L2) ou (L'2).
Enfin, le lipide solubilisant peut être présent dans chacune des deux phases lipidiques (Li) et (L2) ou (L'2), auquel cas il peut être identique ou différent d'une phase à l'autre.
Le lipide solubilisant peut être sous forme d'un unique lipide solubilisant ou d'un mélange de plusieurs lipides solubilisants.
Dans le cadre de la présente description, on entend par « lipide solubilisant » un lipide présentant une affinité avec un autre lipide suffisante pour permettre sa solubilisation.
Le lipide solubilisant utilisé est avantageusement choisi en fonction des lipides et/ou des actifs à solubiliser. Il présente généralement une structure chimique proche, afin d'assurer la solubilisation recherchée. Il peut s'agir d'une huile ou d'une cire. De préférence, le lipide solubilisant est solide à température ambiante (20 'Ό), mais liquide à la température du corps (37 <Ό).
Dans le cas où le lipide à solubiliser est un lipide amphiphile de type phospholipide, le lipide solubilisant peut être choisi parmi des dérivés du glycérol, et en particulier des glycérides obtenues par estérification de glycérol avec des acides gras. Les lipides solubilisants préférés, en particulier pour les phospholipides, sont les glycérides d'acides gras, notamment d'acides gras saturés, et en particulier d'acides gras saturés comprenant de 8 à 18 atomes de carbone, avantageusement de 12 à 18 atomes de carbone. De préférence, il s'agit d'un mélange de différents glycérides (mono-, di- et/ou tri-glycerides).
De préférence, il s'agit de glycérides d'acides gras saturés comprenant de 0% à 20% en poids d'acides gras en C8, de 0% à 20% en poids d'acides gras en C10, de 10% à 70% en poids d'acides gras en C12, de 5% à 30% en poids d'acides gras en C18.
Plus particulièrement, on préfère les mélanges de glycérides semi-synthétiques solides à température ambiante vendus sous la dénomination commercierte Suppocire® NC ou Lipocire™ par la société Gattefossé et approuvé pour l'injection chez l'homme. Les Suppocire® de type N sont obtenues par estérification directe d'acides gras et de glycérol. Il s'agit de glycérides hémi-synthétiques d'acides gras saturés de C8 à C18, donc la composition quali-quantitative est indiquée dans le tableau ci-dessous.
La quantité de lipide solubilisant peut varier largement en fonction de la nature et de la quantité de lipide amphiphile présent dans la ou les phases lipidiques. Généralement, la teneur massique en lipide solubilisant est comprise de 1 % à 99%, avantageusement de 5% à 80%, de préférence de 40% à 75% par rapport au poids total de phase lipidique.
Composition en acides gras du Suppocire® NC de Gattefossé
Figure imgf000014_0001
Le lipide solubilisant peut également être choisi parmi des huiles.
Les huiles utilisées présentent de préférence une balance hydrophile-lipophile (HLB) inférieure à 8 et encore plus préférentiellement comprise entre 3 et 6. Avantageusement, les huiles sont utilisées sans modification chimique ou physique préalablement à la formation de l'émulsion.
Selon les applications envisagées, les huiles peuvent être choisies parmi les huiles biocompatibles, et en particulier parmi les huiles d'origine naturelle (végétale ou animale) ou synthétique. Parmi de telles huiles, on peut notamment citer les huiles d'origine naturelle végétale parmi lesquelles figurent notamment les huiles de soja, de lin, de palme, d'arachides, d'olives, de pépin de raisins et de tournesol ; les huiles synthétiques parmi lesquelles figurent notamment les triglycérides, les diglycérides et les monoglycérides. Ces huiles peuvent être de premières expressions, raffinées ou inter- estérifiées.
Divers excipients peuvent être ajoutés, soit dans la composition de la nanoparticule elle-même, soit dans la phase continue si la nanoparticule est contenue dans une nanoémulsion. Ces excipients peuvent être de différente nature, et notamment choisis parmi des colorants, des arômes, des parfums, des stabilisants, des conservateurs, des émulsifiants, des épaississants ou d'autres agents actifs, en quantité appropriée.
De préférence, dans le cas d'une nanoémulsion directe, les parfums seront ajoutés dans la phase lipidique (L^ et les colorants dans la phase continue aqueuse.
Le ligand de ciblage de la nanoparticule selon l'invention doit être capable de venir se positionner de lui-même à l'interface des membranes interne et externe des nanoparticules, et doit pour cela posséder un certain caractère amphiphile.
Le ligand de ciblage est de préférence choisi parmi les composés de formule (I) :
A-Y-B (I)
dans laquelle :
A est la partie lipophile ;
- Y est un groupement chimique apte à relier A et B par des liaisons covalentes ; et
B est la partie hydrophile.
La partie lipophile A du ligand de ciblage lui permet de s'ancrer dans la phase lipidique (L2) ou (L'2) de la nanoparticule. Elle peut notamment comprendre une chaîne alkyle Ci6-Ci8, linéaire ou ramifiée, saturée ou insaturée.
Selon un mode de réalisation, les liaisons covalentes résultant de la présence du groupement Y et assurant la fixation de A à B sont issues de la réaction entre une fonction chimique initialement portée par A avant sa réaction avec B et une fonction chimique complémentaire portée par B avant leur réaction avec A. A titre d'exemple non limitatif et non exhaustif, on peut notamment citer les liaisons covalentes résultant de la réaction :
d'une aminé et d'un ester activé, par exemple par un groupement N- succinimidyle conduisant à la formation de liaisons amide ;
d'une oxyamine et d'un aldéhyde conduisant à la formation de liaisons oxyme ; et
d'un maléimide et d'un thiol conduisant à la formation de liaisons thioéther. La partie hydrophile B du ligand de ciblage lui permet de s'ancrer dans la phase aqueuse (A2) ou (A'2) de la nanoparticule.
Dans le cas d'une nanoparticule lipidique, la longueur de la partie hydrophile B est telle que l'extrémité du ligand de ciblage est située dans la membrane externe et non au- delà de la surface de cette membrane.
Le caractère amphiphile du ligand de ciblage peut être évalué à l'aide de sa valeur de LogP.
De préférence, le ligand de ciblage possède une valeur de LogP comprise de -4 à 4, avantageusement comprise de -2,5 à 2,5, et préférentiellement comprise de -1 ,5 à 1 ,5.
La valeur de LogP est généralement mesurée par la méthode dite « du flacon agitée ». Cette méthode consiste à solubiliser une quantité connue de soluté dans un volume connu d'octanol et d'eau. La solution biphasique est alors agitée jusqu'à l'équilibre (t>1 h), puis la distribution du soluté est mesurée dans chaque solvant. Généralement, cette quantification des concentrations de soluté dans chaque phase est réalisée par spectroscopie UV/Visible. Le log P est alors obtenu par la formule suivante :
Log P = log(concentration soluté dans octanol/concentration soluté dans eau) Le ligand de ciblage est par exemple un sucre, une biomolécule, un polymère ou un biopolymère. Ces molécules peuvent également être « lipidisées », c'est-à-dire dotées d'un caractère plus lipophile grâce au greffage d'une chaîne carbonée. Cette chaîne carbonée est de type C2 à C18, avantageusement C6 à C18.
Dans le cadre de la présente description, on désigne par « sucre » toute une famille de molécules chimiques proches du saccharose, appartenant à la classe des glucides. On peut citer notamment le saccharose, le glucose et le fructose.
Dans le cadre de la présente description, on entend par « biomolécule » une molécule qui participe au processus métabolique et à l'entretien d'un organisme vivant, par exemple les glucides, les lipides, les protéines, l'eau et les acides nucléiques. Elles sont donc principalement composées de carbone, d'hydrogène, d'oxygène, d'azote, de soufre et de phosphore. On parle aussi de biomolécules pour des molécules identiques à celles trouvées dans le vivant, mais obtenues par d'autres moyens.
On entend ainsi par « biopolymère » un polymère qui est également une biomolécule.
Avantageusement, le ligand de ciblage est une biomolécule choisi dans le groupe constitué des peptides, des protéines et des enzymes.
Selon une variante, le ligand de ciblage est un peptide lipidisé tel qu'un pamitoyl- peptide, un acétyl-peptide ou un undécénoyl-dipeptide. Ainsi, dans le cas des peptides lipidisés, le caractère lipidique provient du greffage sur le peptide d'un lipide tel qu'un acide gras et en particulier l'acide acétique ou l'acide palmitique.
Selon une autre variante, le ligand de ciblage est un polysaccharide tel que l'acide hyaluronique, le chitosane ou le dextrane.
Avantageusement, le ligand n'est pas greffé, couplé, conjugué, ou lié d'une quelconque manière à un autre composé.
Dans le cadre de la présente description, on entend par « composé (X) greffé à un composé (Y) » le fait que le composé (X) possède un ou plusieurs groupes chimiques ayant interagi avec un ou plusieurs groupes chimiques du composé (Y), ce qui a donc conduit à l'établissement de liaisons, par exemple covalentes, entre le composé (X) et le composé (Y). Cet établissement de liaisons peut ainsi être qualifié de greffage, de couplage ou de conjugaison.
Avantageusement, le ligand de ciblage est un agent actif cosmétique tel que défini plus haut.
De préférence, le ligand de ciblage est choisi parmi les molécules répertoriées dans la nomenclature internationale des ingrédients cosmétiques (INCI).
Selon un mode de réalisation, le ligand de ciblage d'une nanoparticule lipidique est le palmitoyl pentapeptide-3 (ou palmitoyl-KTTKS) ou l'asiaticoside.
Selon un autre mode de réalisation, le ligand de ciblage d'une nanoparticule aqueuse est l'asiaticoside ou de l'acide hyaluronique modifié (lipidisé) par l'acide caproïque (Teneliderm®).
La présente invention concerne également un procédé de préparation d'une nanoparticule selon l'invention, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
- préparation d'une phase lipidique et d'une phase aqueuse, l'une au moins des deux phases comprenant un agent tensioactif, l'une au moins des deux phases comprenant un ligand de ciblage, et éventuellement l'une au moins des deux phases comprenant un agent actif ;
émulsification de ladite phase lipidique et de ladite phase aqueuse conduisant à la formation de nanoparticules ; et
récupération des nanoparticules formées.
La phase lipidique et la phase aqueuse sont préparées par simple mélange des différents constituants pour chacune des phases.
L'agent actif peut être incorporé dans l'une ou les deux phases.
Le ligand de ciblage est incorporé dans l'une ou les deux phases et, grâce à son caractère amphiphile, vient se positionner de lui-même à l'interface entre les membranes interne et externe. Sa partie lipophile est donc située dans la phase lipidique (L2) ou (L'2) et sa partie hydrophile est située dans la phase aqueuse (A2) ou (A'2).
Dans le cas d'une nanoparticule lipidique, l'extrémité externe du ligand de ciblage est située dans la membrane externe, du fait de la longueur de sa partie hydrophile et de l'épaisseur de la membrane externe.
Plus particulièrement, dans le cas d'une nanoparticule lipidique, la préparation de la phase lipidique comprend notamment l'incorporation des constituants du cœur qui formeront la phase lipidique (L^. L'agent tensioactif est compris dans la phase dans laquelle il est le plus soluble. Typiquement, un agent tensioactif hydrosoluble est incorporé dans la phase aqueuse et un agent tensioactif liposoluble est incorporé dans la phase lipidique. Le ligand de ciblage et l'agent actif sont également incorporés dans l'une ou l'autre des deux phases en fonction de leur caractère principalement hydrophile ou lipophile.
L'étape d'émulsification, qui implique le mélange de ces deux phases, permet alors aux différents constituants de se positionner afin de former le cœur et les membranes interne et externe de la nanoparticule lipidique. Notamment, les parties hydrophiles de l'agent tensioactif et du ligand de ciblage se positionnent dans la phase aqueuse (A2) qui constituera la membrane externe, et leurs parties lipophiles se positionnent dans la phase lipidique (L2) qui constituera la membrane interne.
De préférence, le ligand n'est pas greffé, couplé, conjugué, ou lié d'une quelconque manière à un autre composé, au moment de son incorporation dans l'une ou les deux phases.
Le procédé selon l'invention ne comprend donc pas d'étape de greffage du ligand de ciblage, que ce soit avant ou après l'étape d'émulsification. Il n'y a pas d'impuretés formées au cours du procédé et l'obtention des nanoparticules lipidiques ne nécessite donc pas d'étape supplémentaire de purification.
Ce procédé est donc plus simple et moins coûteux à mettre en œuvre par rapport aux procédés de l'état de la technique.
Selon un mode de réalisation, l'étape d'émulsification est précédée d'une étape de pré-émulsification comprenant le mélange des deux phases aqueuse et lipidique par agitation mécanique.
Cette étape de pré-émulsification consiste à mélanger grossièrement la phase lipidique et la phase aqueuse, par agitation mécanique, par exemple à l'aide d'un agitateur de type rotor-stator. Elle permet de réaliser une première émulsification rapide, conduisant à une dispersion quasi-homogène. L'absence de particules solides et/ou semi-solides de taille supérieure au millimètre est évaluée de manière visuelle.
De préférence, l'étape d'émulsification des deux phases est effectuée par un procédé de haute énergie choisi parmi la sonication, l'homogénéisation haute pression (pression appliquée entre 100 et 2000 Pa, avantageusement entre 500 et 1500Pa) et la microfluidisation.
La sonication consiste à utiliser des ultrasons, généralement à l'aide d'un bain à ultrasons, pour agiter des particules d'un échantillon, par exemple pour rompre des agrégats moléculaires ou les membranes cellulaires, et permet notamment de réduire la taille des particules. L'obtention de particules de taille nanométrique requiert généralement l'utilisation de sonicateurs plus puissants tels que des sonicateurs à sonotrode de type Hielsher ou Ultrasonics.
L'homogénéisation haute pression consiste à faire subir aux particules des effets de changement de pression, d'accélération, de cisaillement et d'impact, conduisant à la réduction de leur taille.
La microfluidisation consiste à utiliser une forte pression pour forcer un fluide à entrer dans des micro-canaux de configuration particulière et à y générer une émulsification par un mécanisme combinant des effets de cavitation, de cisaillement et d'impact.
La présente invention concerne également l'utilisation d'une nanoparticule lipidique ou d'une nanoparticule aqueuse selon l'invention pour la vectorisation d'un ou plusieurs agents actifs, notamment cosmétiques, dermo-pharmaceutiques ou pharmaceutiques.
Dans le cadre de la présente description, on entend par « vectorisation d'agents actifs » l'encapsulation et la délivrance d'agents actifs par un véhicule biocompatible capté par une cible sur laquelle doit agir biologiquement l'agent actif.
La présente invention concerne également l'utilisation d'une nanoparticule lipidique ou d'une nanoparticule aqueuse selon l'invention pour la préparation d'une composition cosmétique, dermo-pharmaceutique ou pharmaceutique.
Plus particulièrement, elle concerne l'utilisation d'une nanoparticule lipidique ou d'une nanoparticule aqueuse selon l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique pour application topique.
Enfin, la présente invention concerne une composition cosmétique, dermo- pharmaceutique ou pharmaceutique, comprenant au moins une nanoparticule lipidique ou une nanoparticule aqueuse selon l'invention, éventuellement en association avec un véhicule cosmétiquement, dermo-pharmaceutiquement ou pharmaceutiquement acceptable.
Plus particulièrement, elle concerne une composition cosmétique comprenant au moins une nanoparticule lipidique ou une nanoparticule aqueuse selon l'invention, éventuellement en association avec un véhicule cosmétiquement acceptable.
Plus particulièrement, elle concerne une composition pharmaceutique comprenant au moins une nanoparticule lipidique ou une nanoparticule aqueuse selon l'invention, éventuellement en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
L'invention sera mieux comprise à la lecture qui va suivre, donnée uniquement à titre d'exemple, et faite en se référant aux dessins annexés, sur lesquels :
la Figure 1 est une vue à grande échelle, en coupe suivant un plan vertical médian d'une nanoémulsion directe comprenant une nanoparticule lipidique selon l'invention et trois agents actifs différents ;
la Figure 2 est un graphe représentant l'intensité de la fluorescence émise par cellule pour une lignée cellulaire de fibroblastes 3T3 mise en présence de nanoémulsions dépourvues de ligand de ciblage, appelées N50, et de nanoémulsions selon l'invention, dotées du palmitoyl-KTTKS, appelées Pal ;
la Figure 3 est un graphe représentant l'intensité de la fluorescence émise par cellule pour une lignée cellulaire de kératinocytes HaCaT mise en présence de nanoémulsions N50 et de nanoémulsions Pal ;
la Figure 4 est un graphe représentant l'intensité de la fluorescence émise par cellule pour des cellules humaines primaires de fibroblastes mises en présence de nanoémulsions N50 et de nanoémulsions Pal ; et
la Figure 5 est un graphe représentant l'intensité de la fluorescence émise par cellule pour des cellules humaines primaires de mélanocytes mises en présence de nanoémulsions N50 et de nanoémulsions Pal.
Sur la Figure 1 , une nanoparticule lipidique selon l'invention comprend :
un cœur constitué d'une phase lipidique (L^ ;
une membrane interne constituant une phase lipidique (L2) et comprenant les parties lipophiles 2 et 3 du tensioactif liposoluble 4 et du tensioactif hydrosoluble 5 respectivement ;
une membrane externe constituant une phase aqueuse (A2) et comprenant les parties hydrophiles 6 et 7 du tensioactif liposoluble 4 et du tensioactif hydrosoluble 5 respectivement ; et
un ligand de ciblage 8 positionné tel que sa partie lipophile 9 est dans la phase lipidique (L2) et sa partie hydrophile 10 dans la phase aqueuse (A2). Trois agents actifs sont incorporés à la nanoémulsion qui contient la nanoparticule lipidique : l'agent actif hydrophile 1 1 se trouve dans la phase aqueuse continue C, l'agent actif lipophile 12 se trouve dans la phase lipidique (l_i) et l'agent actif amphiphile 13 se trouve à l'interface des phases lipidique (L2) et aqueuse (A2).
EXEMPLES
Exemple 1 : Préparation de nanoémulsions directes de ciblage par le palmitoyl-KTTKS
Le Tableau ci-après indique la composition de la phase aqueuse et de la phase lipidique des nanoémulsions.
Figure imgf000021_0001
A. Préparation de la phase aqueuse
La phase aqueuse a été préparée en solubilisant le tensioactif Myrj S40, préalablement pesé, dans l'eau par agitation de la dispersion à l'aide d'un agitateur magnétique, à 200 tours/min, pendant 10 min, à 45 °C.
B. Préparation de la phase lipidique
La phase lipidique a été préparée en chauffant le mélange de l'huile avec la lipocire (lipides solides) et le Phospholipon jusqu'à dissolution complète de la cire et des phospholipides. Le ligand de ciblage palmitoyl-KTTKS a ensuite été ajouté et la dispersion a été mélangée grâce à un agitateur magnétique, à 200 tours/min, pendant 15 min, à 45 °C, jusqu'à obtention d'une solution translucide homogène.
C. Pré-émulsification avec mélange des phases
La phase aqueuse a été ajoutée à la phase lipidique. Le tout a été mélangé à l'aide d'un agitateur Ultra Turrax T25 (IKA Labortechnik), à une puissance de 20% du maximum de l'appareil, pendant 5 min, jusqu'à obtention d'une dispersion laiteuse quasi- homogène. L'absence de particules solides et/ou semi-solides de taille supérieure au millimètre a été évaluée de manière visuelle.
D. Préparation des nanoémulsions ciblantes par ultrasonication
L'émulsion grossière préalablement obtenue a ensuite été ultrasoniquée. Plus précisément, l'émulsion grossière a été divisée en cinq parties, chacune versée dans un bêcher de 100 mL. La sonotrode de la sonde à ultrasons (AV505 Ultrasonic processor, SONICS avec une sonotrode bicylindrique de 3 mm) a été introduite dans le premier bêcher et l'émulsion a été soumise à des cycles de sonication (10s ON / 30s OFF) pendant 20 min à une puissance de 25% du maximum de l'appareil. Le bêcher a été placé dans un bain d'eau à température ambiante au cours de la sonication afin d'éviter toute élévation trop importante de la température pouvant conduire à la dégradation de molécules thermosensibles comme le ligand de ciblage, les agents actifs ou encore les conservateurs.
Les nanoémulsions ainsi préparées ont une taille moyenne de 50 nm. L'indice de polydispersité est de 0,170.
La taille et la polydispersité des populations de nanoémulsions ont été mesurées par diffusion de la lumière sur un Zeta Sizer Nano ZS (Malvern Instrument). Un échantillon de nanoémulsion a été dilué à 0,1 % dans de l'eau pure et placé dans une cuvette. La cuvette a alors été placée dans l'instrument et une mesure en intensité a été faite en triplicat.
Exemple 2 : Préparation de nanoémulsions directes de ciblage par la Centella asiatica
Le Tableau ci-après indique la composition de la phase aqueuse et de la phase lipidique des nanoémulsions.
Figure imgf000023_0001
A. Préparation de la phase aqueuse
La phase aqueuse a été préparée en solubilisant le tensioactif Myrj S40 et les conservateurs, préalablement pesés, dans l'eau par agitation de la dispersion à l'aide d'un agitateur à pâles, à 800 tours/min, pendant 30 min, à 45^.
B. Préparation de la phase lipidique
La phase lipidique a été préparée en chauffant le mélange de l'huile avec la lipocire (lipides solides) et le Phospholipon (phospholipides) jusqu'à dissolution complète de la cire et des phospholipides. L'agent actif (Nimbin), le ligand de ciblage (Centella asiatica) et l'antioxydant (vitamine E acétate) ont ensuite été ajoutés et la dispersion a été mélangée grâce à un agitateur à pâles, à 800 tours/min, pendant 45 min, à 45 °C, jusqu'à obtention d'une solution translucide homogène.
C. Pré-émulsification avec mélange des phases
La phase aqueuse a été ajoutée à la phase lipidique. Le tout a été mélangé à l'aide d'un agitateur rotor-stator (Greerko) à une puissance de 60% du maximum de l'appareil, pendant 20 min pour 5 L, jusqu'à obtention d'une dispersion laiteuse quasi- homogène. L'absence de particules solides et/ou semi-solides de taille supérieure au millimètre a été évaluée de manière visuelle. D. Préparation des nanoémulsions ciblantes par homogénéisation haute pression
L'émulsion grossière préalablement obtenue a ensuite été passée pendant 4 h dans l'Homogénéisateur (Panda Plus, GEA NIRO SOAVI) afin de réduire la taille des gouttes d'émulsion. Plus précisément, l'émulsion grossière a été introduite dans le réservoir de l'appareil sous agitation pour éviter le crémage de l'émulsion grossière et sous contrôle de la température (T = 45^ ± 5°C) grâce à un échangeur thermique à eau, pour éviter l'augmentation trop importante de la température de l'émulsion qui pourrait conduire à la dégradation de certaines molécules thermosensibles comme le ligand de ciblage, les agents actifs ou encore les conservateurs. La pression a été fixée à 1000 bars.
Les nanoémulsions ainsi préparées ont une taille moyenne de 80 nm. L'indice de polydispersité est de 0,180.
La taille et la polydispersité des populations de nanoémulsions ont été mesurées par diffusion de la lumière sur un Zeta Sizer Nano ZS (Malvern Instrument). Un échantillon de nanoémulsion a été dilué à 0,1 % dans de l'eau pure et placé dans une cuvette. La cuvette a alors été placée dans l'instrument et une mesure en intensité a été faite en triplicate.
Exemple 3 : Préparation de nanoémulsions inverses de ciblage par la Centella asiatica Le Tableau ci-après indique la composition de la phase aqueuse et de la phase lipidique des nanoémulsions.
Masse %masse dans
Composé
(mg) produit final
Eau déminéralisée 0,1 19 5,95
Glycérol 0,050 2,50
Phase
Tris 0,010 0,50
aqueuse
Chlorure de sodium 0,001 0,05
Asiaticoside 0,005 0,25
Parleam 1 ,565 78,25
Phase
Arlacel P135 0,200 10,00
lipidique
Plurol Diisostéarique 0,050 2,50 Dans un récipient approprié, on a préparé la phase huileuse par homogénéisation à 50 'C de l'huile et de l'agent stabilisant.
Dans un second récipient approprié, on a préparé la phase aqueuse par homogénéisation à température ambiante des éventuels additifs dans l'eau ainsi que les divers adjuvants hydrophiles facultatifs (agent osmotique, épaississant, conservateur...).
On ajoute la phase aqueuse à la phase lipidique soit manuellement, soit par agitation magnétique ou à turbine. Les deux phases sont mélangées grossièrement puis le mélange est homogénéisé par ultrasons à l'aide de dispositifs tels que le sonificateur AV505® (Sonics, Newtown) pour les volumes inférieurs à 200 g ou l'IUP "l OOOhd (Hielsher, Allemagne) pour les volumes plus importants. Durant la sonication, le récipient contenant la dispersion est thermostaté.
Les nanoémulsions ainsi préparées ont une taille moyenne inférieure à 50 nm. Elles sont stables et transparentes.
La taille des populations de nanoémulsions a été mesurée par diffusion quasi- élastique de la lumière sur un Zetasizer nano ZS (Malvern Instrument).
Exemple 4 : Préparation de nanoémulsions inverses de ciblage par le Teneliderm®
Le Tableau ci-après indique la composition de la phase aqueuse et de la phase lipidique des nanoémulsions.
Figure imgf000025_0001
Le Teneliderm® est le ligand de ciblage, c'est un acide hyaluronique lipidisé avec de l'acide caproïque. Le CD44 est un récepteur transmembranaire aux glycosaminoglycanes dont l'acide hyaluronique, avec qui il a une forte affinité. Le Teneliderm® est introduit dans la phase grasse.
Dans deux récipients appropriés, on a préparé séparément les phases huileuse (phase continue) et aqueuse (phase dispersée) et chauffé à 50 °C. On ajoute la phase dispersée à la phase continue manuellement. Les deux phases sont mélangées grossièrement puis le mélange est homogénéisé par ultrasons à l'aide de dispositifs tels que le sonificateur AV505® (Sonics, Newtown) pour les volumes inférieurs à 200 g.
La puissance délivrés est de 25%, le temps de sonication est de 5 minutes (Puise on : 10s, puise off : 30s), le nombre de joules délivrés est de 37 500 J.
Durant la sonication, le récipient contenant la dispersion est plongé dans un bain d'eau. Le diamètre moyen de la phase dispersée est déterminé par diffusion quasi- élastique de la lumière (Zetasizer nano ZS, Malvern Instrument). Les tailles obtenues sont inférieures à 150 nm.
Exemple 5 : Préparation de nanoémulsions inverses de ciblage par le Teneliderm®
Le Tableau ci-après indique la composition de la phase aqueuse et de la phase lipidique des nanoémulsions.
Figure imgf000026_0001
Le Teneliderm® est le ligand de ciblage, c'est un acide hyaluronique lipidisé avec de l'acide caproïque. Le CD44 est un récepteur transmembranaire aux glycosaminoglycanes dont l'acide hyaluronique, avec qui il a une forte affinité. Le Teneliderm® est introduit dans la phase grasse.
Dans deux récipients appropriés, on a préparé séparément la phase huileuse (phase continue) et aqueuse (phase dispersée) et chauffé à 50 °C.
On ajoute la phase dispersée à la phase continue manuellement. Les deux phases sont mélangées grossièrement puis le mélange est homogénéisé par ultrasons à l'aide de dispositifs tels que le sonificateur AV505® (Sonics, Newtown) pour les volumes inférieurs à 200 g. La puissance délivrés est de 25%, le temps de sonication est de 5 minutes (Puise on : 10s, puise off : 30s), le nombre de joules délivrés est de 37 500 J.
Durant la sonication, le récipient contenant la dispersion est plongé dans un bain d'eau. Le diamètre moyen de la phase dispersée est déterminé par diffusion quasi- élastique de la lumière (Zetasizer nano ZS, Malvern Instrument). Les tailles obtenues sont inférieures à 150 nm.
Exemple 6 : Evaluation de nanoémulsions directes ciblantes comprenant du palmitoyl- KTTKS
Afin d'évaluer la capacité ciblante des nanoémulsions de l'Exemple 1 , des nanoémulsions identiques ont été préparées à l'échelle du laboratoire (volumes plus faibles) et des fluorophores (Dil) ont été incorporés pour pouvoir effectuer des mesures de fluorescence. Préparation des nanoémulsions
Le Tableau ci-après indique la composition de la phase aqueuse et de la phase lipidique des nanoémulsions.
Figure imgf000027_0001
A. Préparation de la phase aqueuse
La phase aqueuse a été préparée en solubilisant le tensioactif Myrj S40, dissous dans du tampon phosphate salin (PBS) 1 X, dans l'eau.
B. Préparation de la phase lipidique
La phase lipidique a été préparée en mélangeant de l'huile de soja (Soybean oil,
Sigma Aldrich), de la paraffine (Semi-synthetic glycerides, Suppocire NC, Gattefossé, France), des phospholipides de graine de soja (Phospholipon 75, Lipoid, Allemagne) et 0.1 % en masse de fluorophore Dil (1 ,1 '-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate, Sigma Aldrich). La phase lipidique ainsi préparée contient 16% en masse de phospholipides et 84% en masse de lipides. C. Préparation des nanoémulsions ciblantes par ultrasonication
20% de la phase lipidique ont été dispersés dans 80% de la phase aqueuse, conduisant à un mélange possédant un ratio phospholipides/Myrj S40 de 0,18 et un ratio Myrj S40/(huile + cire) de 0,55.
L'émulsification du mélange a ensuite été réalisée avec une sonde ultrasonique de 3 mm, suivant des cycles de sonication (10s ON / 30s OFF) pendant 10 min.
Les nanoémulsions ainsi préparées ont une taille moyenne de 50 nm.
Les suspensions de nanoémulsions ont ensuite été dialysées contre 500 mL de PBS 1 X pendant une nuit. Puis, elles ont été récupérées, diluées à une teneur de 10% en masse, filtrées à travers des pores de 0,2 μηι et enfin conservées à 4°C jusqu'à leur utilisation.
Evaluation de la capacité de ciblage
La capacité de ciblage des nanoémulsions a été évaluée en comparant leur adhésion à différentes cellules ciblées par le palmitoyl-KTTKS et celle de nanoémulsions simples, de même taille, mais ne possédant aucun ligand de ciblage.
L'adhésion a pu être évaluée par des mesures de fluorescence sur des cellules, permettant ainsi de quantifier l'interaction entre nanoémulsions et cellules.
Plus particulièrement, l'adhésion des nanoémulsions a été testée sur une lignée cellulaire de fibroblastes 3T3, une lignée cellulaire de kératinocytes HaCaT, des cellules humaines primaires de mélanocytes et des cellules humaines primaires de fibroblastes.
A. Culture cellulaire
Les cellules et les réactifs utilisés pour la culture cellulaire ont été fournis par Life Technologies (Villebon sur Yvette, France). Des fibroblastes du derme humain (HDFa) provenant d'une femme de 37 ans, et des kéranocytes issus d'une lignée cellulaire de HaCaT fournie par le Deutsches Krebsforschungszentrum (Cell Line Service, Eppelheim, Germany), ont été cultivées en milieu de type Dulbecco's Modified Eagle Médium (DMEM), avec 10% en volume de sérum de fœtus bovin inactivé par la chaleur, 50 UI/mL de pénicilline et 50 μg mL de streptomycine. Les cellules ont été incubées à 37°C, dans une atmosphère à 5% de C02, saturée en humidité.
Les passages de HaCaT ont été réalisés avant que les cellules atteignent 100% de confluence. Plus précisément, le milieu de culture a été enlevé des boîtes de culture, les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS 1 X ne contenant ni calcium ni magnésium, puis 2 ml_ d'une solution de trypsine/EDTA ont été ajoutés et les boîtes ont été remises dans l'incubateur pendant 3 min. Elles ont été gardées à température ambiante jusqu'à ce que les cellules soient rondes et détachées du fond des boîtes. De la solution de DMEM-FCS a été ajoutée afin d'inhiber l'activité de la trypsine et les cellules restantes ont été décollées par trituration. Les cellules ont été centrifugées pendant 7 min à 300 g. (g = 9,81 m.s"2) et la pastille obtenue a été mise en suspension dans 1 mL de DMEM-FCS pour la numération et l'ensemencement.
Les passages de HDFa ont été réalisés lorsque les cellules ont atteint de 80% à 90% de confluence, de façon similaire aux kératinocytes. En revanche, l'activité de la trypsine a été inhibée en ajoutant à la suspension de cellules un volume égal de solution de graine de soja purifiée, inhibitrice de la trypsine.
B. Evaluation de l'adsorption cellulaire des nanoémulsions
La capacité des nanoémulsions à s'adsorber sur les cellules a été évaluée comme une fonction de la quantité de ligand encapsulé. Les cellules ont été ensemencées dans huit chambres positionnées sur une lame de verre de microscope LabTek (Fisher Scientific, lllkirsh, France) et placées dans un incubateur pendant 48 h afin de récupérer suite aux passages de la culture cellulaire. Le milieu de culture a ensuite été replacé avec 250 μg ml de suspension de nanoémulsions et incubé pendant 1 h à 37 %, à 5% de C02. Les cellules ont ensuite été lavées deux fois avec 200 μ\- de PBS "I X pendant 10 min, fixées avec 200 μ\- d'une solution de 4%(w/v) de paraformaldéhyde dans du PBS 1 X pendant 10 min et enfin lavées avec 200 μ\- de PBS 1 X. Enfin, la lame de verre a été séparée des chambres plastiques et montée avec du Fluoroshield™ with DAPI (Sigma- Aldrich, St Quentin Fallavier, France) pour pouvoir observer la fluorescence au microscope (Nikon Eclipse E600) équipé de filtres Dil (G2A filters set, Ex 510-560 nm, DM 575 nm, BA 590 nm) (Nikon, Champigny sur Marne, France) et de filtres DAPI.
Les images optiques et fluorescentes ont été enregistrées avec une caméra CCD (Cascade 512B, Photometrics, Tucson, AZ, USA) en utilisant le logiciel MetaVue (Molecular Devices, Roper Scientific, Evry, France) dans une configuration d'acquisition identique (par exemple avec un gain de 5MHz et un temps d'exposition de 100 ms) afin de pouvoir faire des comparaisons d'images.
L'intensité de la fluorescence émise par cellule a été mesurée pour les différents ensembles cellulaires préparés, en présence de nanoémulsions de contrôle N50, ne possédant pas de ligand de ciblage, et des nanoémulsions Pal dotées de palmitoyI-KTTS (Figures 2-5).
Les résultats présentés sur les Figures 2-5 montrent que l'adhésion des nanoémulsions ciblantes est supérieure à celle des nanoémulsions de contrôle. L'intensité de la fluorescence émise dans la cas des nanoémulsions ciblantes est au moins deux fois plus importante que celle mesurée dans le cas des nanoémulsions de contrôle.
Ces observations démontrent ainsi une efficacité de ciblage cellulaire grâce à la présence du ligand de ciblage, en dépit de sa localisation au sein de la membrane externe des nanoémulsions.

Claims

REVENDICATIONS
Nanoparticule comprenant :
un cœur constitué d'une phase lipidique (l_i) ou d'une phase aqueuse (Ai) ; au moins un agent tensioactif comprenant une partie hydrophile et une partie lipophile ;
une membrane interne entourant ledit coeur ;
une membrane externe entourant ladite membrane interne ; et
au moins un ligand de ciblage comprenant une partie lipophile et une partie hydrophile ;
dans laquelle :
lorsque ledit cœur est constitué d'une phase lipidique (L^ :
ladite membrane interne constitue une phase lipidique (L2), comprenant la partie lipophile dudit agent tensioactif ;
ladite membrane externe constitue une phase aqueuse (A2), comprenant la partie hydrophile dudit agent tensioactif ; et
ledit ligand de ciblage est tel que sa partie lipophile est dans ladite phase lipidique (L2) et sa partie hydrophile est de longueur inférieure à l'épaisseur de ladite membrane externe, dans ladite phase aqueuse (A2) ; lorsque ledit cœur est constitué d'une phase aqueuse (Ai) :
ladite membrane interne constitue une phase aqueuse (A'2), comprenant la partie hydrophile dudit agent tensioactif ; et
ladite membrane externe constitue une phase lipidique (L'2), comprenant la partie lipophile dudit agent tensioactif.
Nanoparticule selon la revendication 1 , dans laquelle la membrane externe constituant une phase aqueuse (A2) possède une épaisseur comprise de 1 à 7 nm, avantageusement de 1 ,5 à 6 nm, de préférence de 2 à 5 nm, et la partie hydrophile du ligand de ciblage située dans la phase aqueuse (A2) possède une longueur comprise de 0,2 à 5 nm, avantageusement de 0,5 à 4 nm, de préférence de 0,5 à 3 nm.
Nanoparticule selon la revendication 1 ou 2, comprenant au moins un agent actif. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ayant un diamètre compris de 10 à 1000 nm, avantageusement compris de 20 à 200 nm.
5. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle les agents tensioactifs comprennent des chaînes de polyéthylène glycol (PEG).
6. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle le ligand de ciblage est choisi parmi les composés de formule (I) :
A-Y-B (I)
dans laquelle :
A est la partie lipophile ;
Y est un groupement chimique apte à relier A et B par des liaisons covalentes ; et
B est la partie hydrophile.
7. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle le ligand de ciblage est un sucre, une biomolécule, un polymère ou un biopolymère.
8. Nanoparticule selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle le ligand de ciblage est le palmitoyl pentapeptide-3,l'asiaticoside ou l'acide hyaluronique lipidisé par l'acide caproïque.
9. Nanoémulsion comprenant au moins une nanoparticule selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 et une phase continue entourant ladite nanoparticule.
10. Procédé de préparation d'une nanoparticule selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, comprenant les étapes suivantes :
préparation d'une phase lipidique et d'une phase aqueuse, l'une au moins des deux phases comprenant un agent tensioactif, l'une au moins des deux phases comprenant un ligand de ciblage, et éventuellement l'une au moins des deux phases comprenant un agent actif ;
émulsification de ladite phase lipidique et de ladite phase aqueuse conduisant à la formation de nanoparticules ; et
récupération des nanoparticules formées.
1 1 . Utilisation d'une nanoparticule selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour la vectorisation d'un ou plusieurs agents actifs, notamment cosmétiques, dermo-pharmaceutiques ou pharmaceutiques.
12. Composition cosmétique, dermo-pharmaceutique ou pharmaceutique comprenant au moins une nanoparticule selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.
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